автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Аппаратурно-методологические аспекты анализа сложных полимерных объектов и их фрагментов комплексными хроматографическими методами

На правах рукописи

КРАСИКОВ ВАЛЕРИЙ ДМИТРИЕВИЧ

АППАРАТУРНО-МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АНАЛИЗА СЛОЖНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ ОБЪЕКТОВ И ИХ ФРАГМЕНТОВ КОМПЛЕКСНЫМИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ.

05.11.11 — хроматография и хроматографические приборы

Автореферат диссертации на соискание степени доктора химических наук

Санкт-Петербург

2006 г.

Работа выполнена в Институте высокомолекулярных соединений Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Курганов Александр Алексеевич

доктор химических наук,

профессор Чалых Анатолий Евгеньевич

доктор химических наук,

профессор Варламов Валерий Петрович

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений

им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук

Защита состоится " 14 " марта 2006 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.246.03 в в Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, Ленинский пр., д. 31, Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук;

Отзывы на автореферат (заверенные печатью) просим высылать по адресу: 119991, Москва, Ленинский пр., д. 31, Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 002.246.03.

Автореферат разослан " " февраля 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук ¿Ы^^ Л.Н. Коломиец

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Хроматография является одним го наиболее эффективных, высокочувствительных методов анализа как высокомолекулярных, так и низкомолекулярных соединений. Последние годы характеризуются бурным развитием приборно-методического комплекса для жидкостной хроматографии (ЖХ). В настоящее время достаточно хорошо известны основные принципы создания оборудования и приборов, позволяющих проводить разделения сложных смесей синтетических и природных соединений методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Тем не менее, разработка некоторых отдельных узлов для жидкостных хроматографов высокого давления и их оптимизация является до сих пор актуальной задачей отечественного приборостроения. Особое место в разработке методов ВЭЖХ занимают хроматографические сорбенты и колонки. Развитие способов синтеза, размола и фракционирования различных видов сорбентов, их модификация, а также создание отечественных высокоэффективных хроматографических колонок является аюуальной задачей отечественного приборостроения и расширения методических возможностей ЖХ.

Разработка приборно-методического комплекса для ВЭЖХ идет по пути развития не только колоночной, но и планарной (тонкослойной — ТСХ) хроматографии. Создание инструментальной высокоэффективной количественной ТСХ входит в число важнейших задач развития современных хроматографических методов.

Значительная часть работы посвящена разработке модели, позволяющей создать новые подходы к применению колоночной эксклюзионной (гель-проникающей) и планарной (эксклюзионной и адсорбционной) хроматографии сложных полимерных систем, прежде всего — сополимеров. В настоящее время эксклюзионная жидкостная хроматография (ЭЖХ) является одним из основных методов определения молекулярных характеристик синтетических и природных полимеров и их фрагментов. Метод ЭЖХ позволяет фракционировать макромолекулы в соответствии с их размерами (молекулярными массами). Теоретические основы метода и принципы его практического применения для линейных гибкоцепных полимеров (традиционные объекты) хорошо известны. Поэтому, в настоящее время ЭЖХ, войдя в число классических методов исследований макромолекул таких, как оптические и гидродинамические методы, широко используется для определения молекулярно-массовых распределений (ММР) и средних молекулярных масс (СММ) гомополимеров. Однако наиболее интересной и трудноразрешимой проблемой является развитие теории и практики ЖХ в применении к таким сложным (нетрадиционным) полимерным объектам, как сополимеры и полиэлектролиты. Представляется, что такие задачи могут быть решены на основе создания адекватной модели анализа сложных полимерных систем различными разновидностями метода ЖХ, учитывающей специфические особенности изучаемых объектов. Исследования в этой области входит в число задач настоящей работы.

В последнее десятилетие значительно повысился уровень технического оснащения и развития химической, фармацевтической и медицинской промышленности, что привело не Только к повышению требований к метрологическим характеристикам приборов, но и стандартизации и валидации методик анализа. Развитие широко используемого в этих областях метода планарной хроматографии проводилось как при разработке высокоэффективной ТСХ синтетических полимеров и их фрагментов, так и природных и синтетических низкомолекулярных компонентов белков — аминокислот (АК)\ Кроме того, внедрение валидных методов ТСХ-анализа в практику крупнотоннажного микробиологического синтеза АК является важнейшей задачей современной биотехнологии.

Цель работы заключалась в разработке приборно-методологического комплекса для анализа синтетических и природных соединений методами высокоэффективной жидкостной колоночной, тонкослойной и газовой хроматографии и применении его для анализа синтетических высокомолекулярных соединений (сополимеров, полиэлектролитов и их фрагментов), биополимеров и полученных микробиологическим синтезом белковых АК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- оптимизировать отечественные жидкостные хроматографы высокого давления для реализации высокоэффективного механизма разделения;

- разработать новые типы колонок и сорбентов на основе МПС с линейной молекулярно-массовой калибровочной зависимостью для ВЭЖХ и микросферических сорбентов с большим объемом пор;

- разработать новые способы размола и фракционирования сорбентов на основе кремнеземов (силикагелей и МПС) с целью максимального повышения выхода фракций, удовлетворяющих требованиям ВЭЖХ;

- разработать методы получения узкодисперсных по ММР стандартов для эксклюзионной жидкостной хроматографии;

- сконструировать и создать оборудование и приборы для инструментальной высокоэффективной количественной ТСХ (планарной хроматографии);

- в соответствии с правилами валидации разработать условия разделения и количественного определения промышленных АК методом ТСХ и определить метрологические характеристики разработанных методик.

С помощью разработанного приборного комплекса установить закономерности влияния химической и композиционной структуры блок-сополимеров (БС) на их гидродинамическое поведение в разбавленных растворах и разработать методы определения их молекулярных характеристик комплексными хроматографическими методами; разработать метод высокоэффективной ЭЖХ полиамидокислот (ПАК); разработать варианты одно- и двумерной планарной хроматографии (ПХ) незаменимых аминокислот; использовать разработанные методы для количественного анализа продуктов биосинтеза свободных аминокислот в культуральных жидкостях (КЖ) промышленных штаммов-продуцентов. * Здесь и далее имеется в виду АК, имеющие Ь-конфигуращпо

Научная новизна. Создан приборно-методологический комплекс для высокоэффективной жидкостной колоночной и тонкослойной хроматографии сложных полимеров и их фрагментов, включающий в себя:

- оптимизированные жидкостные хроматографы высокого давления; аналитические и препаративные хроматографические колонки (в том числе, аксиального сжатия) и предколонки для ВЭЖХ; новые методы размола кремнеземных сорбентов; хроматографические колонки с линейной молекулярно-массовой калибровочной зависимостью на основе макропористых стекол для эксклюзионной хроматографии полимеров; узкодисперсные полистирольные стандарты; сферические силикатные сорбенты с большим (до 2 см3/г) объемом пор; способы повышения гидролитической стойкости кремнеземов и способы их модификации;

- оборудование и приборы для высокоэффективной количественной ТСХ с установлением метрологических характеристик методик проведения количественных измерений с помощью ТСХ.

Предложен способ определения молекулярно-массового распределения блок-сополимеров с учетом гетерогенности их состава. На основе предложенной модели разработаны методы анализа молекулярных параметров — СММ, ММР и распределения состава по молекулярной массе (РСМ) блок-сополимеров методами мультидетекгорной ЭЖХ и ТСХ; ЭЖХ-ТСХ и пиролитической газовой хроматографии (ПГХ); ЭЖХ-ТСХ и озонолиза.

На основе данных ВЭЖХ выявлены основные особенности анионной литий-органической сополимеризации двух-, трех- и мультиблочных сополимеров и ряд относительной активности "живущих" анионных цепей в неполярных растворителях; особенности взаимодействия "долгоживущих" активных центров в катионной виниловой полимеризации.

Разработаны методы высокоэффективной эксклюзионной хроматографии полиамидокислот и обращенно-фазовой градиентной ЖХ для определения чистоты их мономеров; изучено влияние чистоты исходных мономеров на молекулярные характеристики полиамидокислот.

Разработаны ТСХ-методы прямого разделения многокомпонентных смесей (>20) свободных аминокислот, ,в том числе, и получаемых отечественной микробиологической промышленностью, а также побочных продуктов, образующихся в процессе их биосинтеза.

Практическая значимость. Создано промышленное производство разработанного приборного комплекса для планарной хроматографии, позволяющего резко расширить практические возможности этого метода и способствовать его широкому внедрению в практику научно-исследовательских, экспертных и заводских лабораторий.

Разработаны методы одно- и двумерной планарной хроматографии свободных аминокислот. Создан экспресс-метод диагностики наследственных заболеваний обмена человека (фенилкетонурии и др. аминоацидурий) с помощью планарной хроматографии. Эти методы количественной ТСХ применены для анализа конечных и промежуточных продуктов крупнотоннажного микробиологического синтеза промышленных

аминокислот; установлены основные параметры, позволяющие регулировать процессы биосинтеза аминокислот.

Разработано и выпускается хроматографическое оборудование для ВЭЖХ: клапанные коробки с лейкосапфировыми плунжерами и клапанными парами для аналитических и препаративных насосов высокого давления; аналитические и препаративные краны-дозаторы для ВЭЖХ, рефрактометрические и фотометрические детекторы с проточными кварцевыми кюветами; хроматографические аналитические и препаративные (в т.ч. аксиального сжатия) колонки (в т.ч. из бислойных титан-циркониевых коррозионностойких сплавов); фильтры из пористого титана (т-Нпе/оА-Нпе); капилляры и другие аксессуары.

Впервые разработан способ размола кремнеземов методом электрогидравлического удара, позволивший получать максимальное (до 70%) количество целевых фракций сорбента без изменения объема пор для ВЭЖХ.

Впервые созданы сорбенты на основе МПС с линейной молекулярно-массовой калибровочной зависимостью для эксклюзионной ВЭЖХ. Разработаны новые типы сферических сорбентов с большим (до 2 см3/г) объемом пор с повышенной гидролитической стойкостью.

Разработанные методы ВЭЖХ для получения молекулярных характеристик сложныхполимерныхобъектовдаютвозможностьрегулироватьреологические и физико-химические параметры в крупнотоннажных производствах ряда продуктов органического синтеза (в частности, таких эластомеров, как различные виды резин на основе полистирол-полибутадиеновых (ПС-ПБ) каучуков и полипиромеллитимида — важнейшего термостойкого высокопрочного электроизоляционного полимера).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методологические и аппаратурные основы использования комплексных хроматографических методов анализа сложных полимерных объектов и их фрагментов.

2. Приборно-методический комплекс для анализа природных и синтетических полимеров и их фрагментов методом высокоэффективной жидкостной и планарной хроматографии, включающий: способы размола кремнеземных сорбентов методом электрогидравлического удара; узкодисперсные стандарты для эксклюзионной жидкостной хроматографии; сорбенты и хроматографичекие колошей с линейной молекулярно-массовой калибровочной зависимостью; сферические сорбенты с большим объемом пор и повышенной гидролитической стойкостью; приборы и оборудование для планарной хроматографии — высокоэффективной количественной, инструментальной ТСХ.

3. Методы расчета молекулярных характеристик блок-сополимеров с учетом гетерогенности их состава по данным жидкостной хроматографии и сопутствующих методов, основанные на модели, устанавливающей связь гидродинамических объемов сополимеров с гидродинамическими объемами составляющих их гомополимеров.

4.Результаты исследования молекулярных и композиционных характеристик блок-сополимеров, позволившие оптимизировать условия синтеза гомополимеров и БС заданной "архитектуры" методами анионной, катионной и радикальной сополимеризации.

5. Методы анализа молекулярных характеристик полиамидокислот и их фрагментов, в том числе, влияние чистоты исходных мономеров для синтеза ПАК на эти характеристики.

6. Методы анализа свободных белковых аминокислот в режиме одномерной и двумерной планарной хроматографии. Результаты разработки методов аналитического контроля незаменимых аминокислот, полученных в процессе промышленного микробиологического синтеза.

Апробация работы. Результаты работы представлены на 24 Всесоюзных, Российских и Международных конференциях и симпозиумах. Основное содержание работы опубликовано в 93 печатных работах, из них в 33 статьях в отечественных и зарубежных изданиях, 55 расширенных тезисах конференций и симпозиумов, 4 авторских свидетельствах и патентах, 1 монографии.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литераторы. Работа изложена на страницах, содержит fcy таблиц, -у Sg рисунков; список литературы наименовании.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Приборно-методический комплекс для ВЭЖХ.

Хроматографический комплекс для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проведена оптимизация и модернизация хроматографа (разработаны отдельные узлы): клапанные коробки высокого давления, краны-дозаторы (переключатели), фильтрующие титановые in-line/off-line элементы из пористого титана; рефрактометрические и фотометрические детекторы, хроматографические (в том числе бислойные) колонки, колонки аксиального сжатия, гидравлические коммуникации из нержавеющей стали, титана и титан-циркония, титановые устройства высокого давления для программированного градиентного смешивания элюентов.

Проведенная модернизация позволила сократить экстраколоночное размывание, что дало возможность уменьшить на треть "приборное уширение" хроматографа (суммарную дисперсию хроматографического пика, равную сумме эффектов размывания в колонке и внеколоночного размывания) и тем самым повысить эффективность хроматографического оборудования при анализе полимеров, мономеров и сопутствующих веществ, в том числе, и в режиме градиентной адсорбционной и обращенно-фазовой хроматографии.

Оптимальные характеристики сорбентов (особенно для анализа белков) не представлялось возможности реализовать, если использовать обычные хроматографические колонки (стеклянные или из нержавеющей стали). Нами был предложен новый тип колонок, изготавливаемый из титан-циркониевых

сплавов. Испытания колонок, проводившиеся с кислотами и щелочами, а также дополнительные испытания сплава в трифторуксусной кислоте (ТФУ) показали высокую коррозионную стойкость изделий (трубка из нержавеющей стали (1Х18Н9Т), подвергшаяся таким же испытаниям (1 месяц в ТФУ) разрушалась при легких механических воздействиях).

Упаковку хроматографических колонок сорбентом проводили суспензионным методом для частиц dp < 10+1(2) мкм. В результате были созданы колонки, отвечающие требованиям ВЭЖХ, с величинами приведенных высот, эквивалентных теоретической тарелке h = 2-3,5 dp при величинах приведенных скоростей элюции v = 3-5 см1.

Разработка полимерных стандартов для ЭЖХ. Узкодисперсные охарактеризованные полимерные стандарты в широком диапазоне ММ являются важной составной частью автоматизированного хроматографического комплекса по определению ММР полимеров. Обычно в ЭЖХ для калибровки используются узкодисперсные ПС-стандарты фирмы "Waters", США. Следует отметить, что аналогичные по качеству стандарты в настоящее время в России не выпускаются. Поэтому была проведена разработка методов синтеза ПС-стандартов для ЭЖХ.

Исследовано влияние примесей в мономере ирастворителе, а также влияние температуры синтеза и концентрации инициатора на ширину ММР образцов. С помощью ЭЖХ-анализа показано, что такие примеси, как бензальдегид (до 810"3 вес.%), фенилацетилен (до 3,5 102 вес.%) и а-метилстирол (до 910 2 вес.%) приводят к увеличению полидисперсности образцов приблизительно на 20%. Показано также, что увеличение конверсии стирола от 35 до 100% повышает полидисперсность ПС приблизительно на 15%. Причиной последнего эффекта, по-видимому, является увеличение микровязкости системы с ростом конверсии. Однако, процесс синтеза может дополнительно осложняться "передачей на мономер", что особенно сказывается при попытке получить образцы с ММ > 5105.

В результате проведенных исследований были разработаны методы синтеза ПС-стандартов в полупромышленном масштабе в широком диапазоне ММ.

Метод озонолиза полидиеновых блоков в БС.

В разработанном приборно-методологическом хроматографическом комплексе для анализа сложных полимерных систем важную информацию можно получить, применяя метод озонолиза. Использование озонолиза, селективно разрушающего один из компонентов сополимера, позволяет получать дополнительные сведения о молекулярной структуре компонентов БС, механизме и кинетике сополимеризации, а также получить данные, подтверждающие правильность предложенной модели сегрегированной конформации блоков гомополимеров в БС. Этот метод разработан и применен при озонолизе ПБ блока сополимеров на основе стирола (Ст) и бутадиена (Бу). Метод основывается на количественном выделении ПС при проведении деструкции только ПБ блока. Известно, что кроме преимущественного присоединения озона к двойным связям в ПБ могут происходить и побочные

процессы, которые хотя и протекают с гораздо меньшими скоростями, приводят к разрушению бензольного кольца в ПС. Однако, контроль времени озонолиза и проведение реакции в среде четыреххлористого углерода при 254° К приводили к присоединению озона только по двойным связям.

Хроматографические сорбенты для ВЭЖХ.

Приготовление узкодисперсных фракций сорбентов и высокоэффективных хроматографических колонок для ВЭЖХ.

Важным направлением создания приборно-методологического комплекса является развитие способов приготовления сорбентов для ВЭЖХ и хроматографических колонок на их основе.

Для современной высокоскоростной и высокоэффективной ЖХ оптимальными являются узкодисперсные фракции сорбента с диаметром частиц (с!р) равным 5; 7; 10; 15 ± 1,0/1,5/2,0 мкм. Поэтому при использовании кремнеземных сорбентов пришлось решать проблему эффективного и целенаправленного размола.

Были разработаны и/или оптимизированы различные методы размола и фракционирования кремнеземов на отечественном и импортном оборудовании. Так, впервые в хроматографической практике был применен метод размола электрогидроударом (ЭГУ) - высоковольтным разрядом в жидкой электропроводящей среде, позволяющий получать практически однородные частицы с выходом целевых фракций до 70% (в обычных методах этот выход составляет не более 10%) без изменения пористой структуры матрицы кремнезема (рис. 1, 2).

Рис. 1. Зависимость среднего диаметра зерна (с1р) при дроблении методом ЭГУ от числа импульсов N и от объема (V) измельчаемого материала приИ = 310* импульсов: о, • - силикагель КСК; А -МПС, 20 нм; 0 - МПС, 70 нм; □ - МПС, 200 нм.

1 г J ч ы-ю'3

Рис. 2. Порограммы МПС- со средним диаметром пор 20 и 200 нм: 1 — исходное МПС; 2 — МПС, размолотое с помощью ЭГУ;

3 — МПС, размолотое механически; 4 — исходное МПС ; 5 -МПС, размолотое с помощью ЭГУ;

6 - МПС, размолотое механически. Данные получены совместно с Е. В. Чубаровой (ИВС РАН) [6].

Новые высокоэффективные сорбенты для ВЭЖХ синтетических полимеров и биополимеров и их фрагментов. Интенсивное развитие ВЭЖХ, связанное с усложнением задач химического анализа, а также бурным развитием биотехнологии, потребовало создания новых отечественных сорбентов на основе пористых кремнеземов — в частности, МПС и сферических силикагелей.

Сорбенты - МПС (в том числе, и химически модифицированные органическими, элементоорганическими и неорганическими соединениями) могут быть приготовлены с узким распределением пор по размерам и широким диапазоном радиусов пор (гр = 10(К5000 А).

Методы изготовления таких сорбентов включают в себя термообработку исходных отливок стекла (например, ДВ-1: БЮ2 - 66%, В2Оэ- 27%, Ка20 -7%, А1203 - 1%) в режимах, обеспечивающих заданный размер пор, дробление с выделением фракций 100-500 мкм, последовательную кислотно-щелочную обработку.

МПС обладают более узким (рис. 3) по сравнению с силикагелями или полимерными сорбентами распределением пор по размерам и практически не содержат микропор.

Рис. 3. Сравнительные дифферен-

lAK/dritO*

( AS/S), %

циальные (а) и интегральные (б) распределения пор по размерам в МПС (1) и силикагеле (2). Доля микропор в МПС и силикагеле составляет <10% и >40%, соответственно (б).

/ООО /400

Таблица 1. Сравнение характеристик катионно-обменного сорбента МПС-диол-сульфопропил с лучшими зарубежными аналогами

Сорбент С, мг-экв/мл СБ, мг/мл а, % МСУ

МПС-диол-сульфопропил 0,22 66 98 +

(ИВС РАН), Россия

Mono S (Фармация), Швеция 0,16 50 90 -

TSK-SP (Тойо Сода), Япония 0,06 25 91 -

TSK-CM (Тойо Сода), Япония 0,12 30 98

Последнее оказывается решающим фактором приготовления модифицированных сорбентов на основе МПС с высокой степенью обратимости сорбции белков (табл. 1) и высокой гидролитической стабильностью (табл. 2), где Р — относительная доля адсорбционно-акгивных силанольных гидроксилов после гидролиза при 1=50° С в течение 15 дней; С — обменная емкость; СБ — емкость по белку; а — выход десорбции; МСУ (механическая стабильность упаковки).

Таблица 2. Сравнительная гидролитическая стабильность сорбентов для обращенно-фазовой ВЭЖХ биополимеров.

Сорбент Р

рН-1,7 рН-11,1

МПС-300-С4 (ИВС РАН) 0,62 0,66

МПС-400-С4 (ИВС РАН) 0,70 0,76

Нуклеосил-300-С4 (Махерей Нагель, Германия) 0,05 0,10

Нуклеосил-500-С4 (Махерей Нагель, Германия) 0,03 0,09

Для достижения максимальной степени модификации были разработаны литий-органические методы модификации поверхности кремнеземов: свободные силанольные гидроксилы на поверхности МПС замещают атомами хлора, затем, используя литий-органические соединения, замещают атом хлора на нужный радикал и, наконец, оставшиеся по тем или иным причинам после первой реакщш силанольные гидроксилы связывают дополнительной обработкой триметилхлорсиланом с использованием в качестве акцепторов НС1 пиридина или гексаметилдисилазана. Использование литий-органических модификаторов дает возможность, в отличие от обычно применяемого для модификации промышленных силикагелей метода обработки поверхности органосиланами, значительно увеличить емкость сорбента.

На рис. 4, 5, 6 приведены примеры использования таких колонок, заполненных модифицированными МПС, в обращенно-фазовой, ионообменной и эксклюзионной хроматографии белков, а также в скоростной эксклюзионной хроматографии полистиролов (рис. 7)

Из совокупного рассмотрения результатов следует, что МПС являются перспективными сорбентами для ВЭЖХ, успешно конкурируют с лучшими мировыми аналогами, а по некоторым характеристикам превосходят эти аналоги.

Рис. 4. Обращенно-фазовая ВЭЖХ белков (1 - химотрипсиноген А, 2 — лизоцим, 3 — лактальбумин, 4 — цитохром С, 5 — рибонуклеаза А) на МПС-270-С4 (10 мкм). Колонка 50x4 мм, скорость потока 1 мл/мин, линейный градиент В в А за 15 мин: А - 10% СН3СК+0,1% ТФУ, В - 90% СН3СЫ+0,1% ТФУ Стрелкой отмечен ввод пробы.

Рис. 5. Сравнительный скоростной анализ белков методом ионобменной ВЭЖХ: (1 - лизоцим, 2 - химотрипсиноген, 3 — цитохром С, 4 - трипсиноген) на сорбенте Mono S, Фармация (а) и на МПС-350-диол-сульфопропил, колонка 50x4 мм (б). Линейный градиент от 0 до 50% В в А: А

- 0,002 М Na2HP04 (рН = 6,7), В - 1,0 М NaCl в А.

Рис. 6. Эксклюзионная микропрепаративная хроматография смеси белков на МПС-300-сибиол. Колонка 300x8 мм, скорость потока 0,2 мл/мин: 1-ферритин (440000 Да), 2- альдолаза (140000 Да), 3- овальбумин (45000 Да), 4- химотрипсиноген (24000 Да), 5- рибонуклеаза (11000 Да), 6- азид натрия (65 Да).

Рис. 7. Эксклюзионная ВЭЖХ: скоростное разделение смеси узкодисперсных полистиролов на линейном сорбенте на основе МПС. Колонка 300x0,4 мм, элюент

— метилэтилкетон, скорость потока — 0,5мл/ мин: 1- 0,078; 2- 0,180; 3- 2,02; 4- 4,9; 5-13; 634,5; 7- 51,8; 8- 100; 9- 196; 10- 402; 11- 830; 12- 3103 кДа. Время анализа 6 мин.

Кремнеземный сорбент с линейной молекулярно-массовой калибровочной зависшюстъю. Основной этап интерпретации экспериментальных данных эксклюзионной ЖХ в ММР анализируемых полимеров состоит в нахождении калибровочной зависимости К, = f(M), где Kd = (VR - V) / Vp, причем VR - удерживаемый объем полимера, V - "мертвый" объем колонки и Vp - объем пор сорбента в колонке.

Разработанные узкопористые МПС с большим выбором радиусов пор были использованы для создания сорбентов с линейной молекулярно-массовой зависимостью для ЭЖХ с широким мультимодальным диапазоном пор.

Возможности метода ЭЖХ в определении молекулярных характеристик полимеров существенно расширяются при наличии линейной зависимости удерживаемого объема (V.) от логарифма молекулярной массы (lgM.) полимера. В отличие от нелинейной, такая связь позволяет рассматривать хроматограмму как зеркальное отображение ММР анализируемого образца в логарифмическом масштабе. В результате упрощается и ускоряется обработка хроматографических данных и появляется возможность калибровки хроматографической системы (в той области ММ, где отсутствуют охарактеризованные по ММ полимерные стандарты), что улучшает интерпретацию хроматограммы в ММР.

Для получения хроматографической системы, удовлетворяющей этим условиям, создавался сорбент с мультимодальным распределением пор по размерам (рис. 8).

Функцию распределения пор по размерам vj/(r) в сорбенте, обеспечивающую линейную зависимость VR. от lgM., в наперед заданном диапазоне ММ, рассчитывали согласно следующему уравнению:

А - В lgM. = jKd • (R/r) ■ \|/(r)dr , (1)

где Kd ■ (R/r) — обобщенная универсальная калибровка, справедливая для всех сорбентов с жесткой структурой пор. Искомая функция \j/(r) представлялась в виде суперпозиции N унимодальных функций f.(r), R=(M[r)])1/3, М -молекулярная масса, [rj] — характеристическая вязкость, связанная с ММ уравнением Марка-Куна-Хаувинка (М-К-Х): [д]=КМа.

Рис. 8. Калибровочная зависимость унимодальных f (г) сорбентов и линейная калибровочная зависимость lgM.= f(VR.), полученная на их основе: 1 - КСС-3 60 Ä; 2 - МПС - 500Ä; 3 - МПС-1000А, 4 -МПС-2000А, 5 - линейный сорбент Л-3 с мультимодальным распределением пор по размерам.

-----------

ч \ \

40 50 60 70 v*£

На рис. 9а приведены калибровочные молекулярно-массовые зависимости Уш = узкодисперсных ПС стандартов для систем колонок, заполненных

сорбентом с линейной калибровкой (суперпозиция трех унимодальных сорбентов, рис. 96) и сорбентом с нелинейной калибровкой.

Рис.9а. Пример линейной (1) и нелинейной калибровочной зависимости (2).

, отн.еЗ.

1000

3000

5000 т,ны

Рис.9б. Дифференциальное распределение пор по размерам ("линейный" сорбент).

Преимущество сорбента с линейной калибровкой, повышающей точность ЭЖХ-анализа, молено видеть на примере хроматограмм образцов, представляющих смесь блок-сополимеров ПС и полиметилметакрилата (ПММА) с двухблочной и трехблочной структурой, полученных на системах колонок с линейной и нелинейной калибровками (рис. 10). Хроматограммы, полученные на колонках с линейной калибровкой, четко фиксируют наличие различных структур. В то же время, несмотря на примерно одинаковую эффективность обеих использованных систем, нелинейная система не способна визуально разрешить данную двухкомпонентную смесь из-за слабой селективности в диапазоне 8.104 < М < 4.105, хотя в остальных диапазонах она не уступает селективности линейной системы (рис. 9а).

Рис. 10. Хроматограммы смеси БС: ПС-ПММА и ПС-ПММА-ПС, полученные на линейной (А) и нелинейной системах (Б) колонок (рис. 9а).

Микросферический сшикагель с большим объемом пор. В ВЭЖХ предпочтительно использовать сферические частицы строго заданного размера с максимально большим объемом пор. Большинство коммерческих силикагелей имеет Упор=0,7-И ,2 см3/г. С целью получения микросферических силикагелей с повышенным объемом пор был разработан метод получения строго сферических силикагелей (микросферические силикагели "БС (8Ю2-БО)) с высокой удельной поверхностью (до 500м2/г), механической прочностью (до 600 бар) и удельным объемом пор (Упор ~ 1,2-^2,2 см3/г), основанный на быстрой поликонденсации кремневой кислоты, диспергированной в виде микросфер в полимерной фазе - пропоксилированном триметилпропаноле с ММ~5х103 Да (ТМР-56, Чехия) или лапроле с ММ и 3,5 ■ 103 Да (Л-3503, Россия), (рис.11).

Изучено влияние режимов синтеза на физические характеристики микросферических силикагелей (рис. 12). Разработаны методы сухой и влажной кислотно-термической обработки органогелей, позволяющие сделать более прочной матрицу силикагеля, устранить большую часть микропор с формированием пор большого объема (рис. 13). Предложенный способ удаления микропор (с увеличением объема пор) в матрице сорбента можно применить и для коммерческих силикагелей.

Рис.11 Микрофотография силикагелей "БС'. Увеличение: хЗОООО. Сканирующий электронный микроскоп ШОЬ-35 (Япония).

Влияние поровой структуры (объем пор и распределение пор по размерам) на хроматографическое поведение сорбента изучали сравнительными испытаниями колонок, упакованных различными коммерческими силикагелями и микросферическим силикагелем БО (рис. 14), где Ь — высота эквивалентной теоретической тарелки; V - приведенная скорость подачи элюента.

Исследования микросферических сорбентов показали, что увеличение пористости сорбента приводит к увеличению эффективности хроматографических колонок, некоторому увеличению их проницаемости, а также значительному возрастанию емкости по наносимому образцу.

Рис. 12. Зависимость уд ельного объема пор (Ур) от концентрации исходного силиката натрия С5Ю и времени (1) выдерживания ("созревания") микросферического силикагеля БО.

V., см5/г

I час

Сад*.г/л

Рис.13. Ртутная порометрия и распределение частиц по радиусам пор исходного (1) прошедшего влажную термообработку (2) микросферического силикагеля Бв (2) в процессе которой уменьшается доля микропор с соответственным увеличением объема пор (□) и доли частиц с макропорами

Рис. 14. Зависимость Ь=Г(у) для колонок с сорбентами : 1- Бв (ИВС РАН), 2 - ЕиговрЬег-ЮО (Кпаиег, Германия); 3 - МПС-300 (Ленхром, Россия); 4 -ПсЬгозогЬ-БЫОО; 5 - Берагог^х (Теввек, Чехия).

Кремнеземы с повышенной гидролитической стабильностью.

Повышение гидролитической стабильности кремнеземов реализовывали двумя способами: использованием сорбентов с модификацией самой химической матрицы кремнезема (табл.2) и химической модификацией поверхности солями металлов - (КА1(804)2-7Н20).

Рис.15. Абсолютное количество (рЧЮ2)

вымытого Si02 из слоя сорбента

после

пропускания определенных объемов (V) подвижной фазы (буфер рН 10.4: МеОН=1:2 по объему); 1 - коммерческий силикагель С18; 2 - нативный МПС-300; 3 -МПС-300-С4; 4 - модифицированный силикагель С18.

Рис.16. Уменьшение числа эквивалентных теоретических тарелок на хроматографических колонках (15х4,6)мм, упакованных коммерческим Si02-C-18 (1), МПС-300-С4 (2) и модифицированным Si02 С-18 (3) от объема пропущенного буфера и рН раствора.

Разработанная методика получения на поверхности силикагеля адсорбционного слоя алюмосиликатов резко повышает гидролитическую

стабильность кремнеземных сорбентов (рис. 15), что в свою очередь приводит к повышенному сроку службы хроматографических колонок (рис. 16)

Приборно-методический комплекс для ВЭТСХ.

Хроматографический комплекс для количественной высокоэффективной

тонкослойной хроматографии.

Впервые в России разработан и запущен в производство полный комплекс оборудования для ПХ, включающий: хроматографические камеры, камеры для проявления методом опрыскивания из коррозионной стойких материалов (спрей-камера), камеры для проявления методом погружения пластин в раствор обнаруживающего реагента, камеры для проявления в парах йода; мелкодиспергирующие пульверизаторы двух видов для опрыскивания хроматограмм, тарированные капилляры с устройством для нанесения проб, столики с электроподогревом для нанесения растворов образцов на пластины, ультрафиолетовый осветитель - УФО-254, ультрафиолетовый осветитель для двух режимов работы - УФ-кабинет 254/365, видеоденситометр-флюориметр марки "ДенСкан" для количественной обработки хроматограмм в видимой и УФ-области спектра (растровый денситометр основанный на современных цифровых технологиях).

Количественная оценка пятна проводится по двум его характеристикам: по площади пятна и его "объему" в трехмерном пространстве, где в качестве третьей координаты используется яркость (интенсивность окраски) пятна, рис. 17. Объемы являются более точной, чем площади, количественной

Рис. 17. Вид пространственного распределения яркости в области хроматографического пятна. A;j- значение уровня яркости точки пятна; ЕГ — значение уровня яркости точки на базовой поверхности.

Созданное оригинальное программное обеспечение "Dens" денситометра позволяет проводить быструю автоматическую обработку изображения планарных хроматограмм, используя для построения калибровочной зависимости линейную интерполяцию калибровочных точек, линейную аппроксимацию более, чем через две точки и квадратичную интерполяцию; корректировать влияние неравномерности освещения и передачи оптической системы, используя апроксимацию поверхностей одинаковой яркости полиномами третьей степени (сплайнами); определять оптимальные размеры локальной области измерения и оптимальное положение базовой поверхности; определять границы каждого пятна с вычислением (путем интегрирования внутри этих границ) количественной характеристики яркости и объема пятна (денситометрический сигнал).

Проведено математическое описание процедуры вычисления результата косвенного измерения. Показано, что причины возникновения погрешности

характеристикой веществ в пятнах.

яркость ПлощадьБ

Базовая поворкность

■1

при косвенном измерении в видеоденситометре можно разбить на три группы: а) флуктуации отдельных результатов прямых измерений яркостей пикселей исходного изображения; б) ошибки, возникающие из-за неверного определения положения базовой поверхности, и в) ошибки калибровки.

Выбор оптимальных условий проведения ТСХ-анализа с последующим количественным определением методом денситометрии.

Разработку методологии проведения количественной ТСХ сложных смесей органических соединений, соответствующей валидным методам физико-химического анализа, и установление метрологических характеристик проводили на примере анализа свободных АК. Выбор этих объектов был обусловлен несколькими причинами — сложностью хроматографического анализа (аминокислоты проявляют свойства цвиттер-ионов), важностью их для медико-диагностических целей и практической значимостью этих природных низкомолекулярных органических соединений.

Проведены исследования, связанные с поиском оптимальных условий проведения цветной реакции на хроматограммах (проявление) при обработке последних одним из основных обнаруживающих агентов в ТСХ — раствором нингидринового реактива (НГ) методом погружения. На хроматограммах модельных растворов АК, принадлежащих к различным классам (фенилаланин, лизин, глутаминовая кислота, серин, валин), проведено изучение величины Денситометрический сигнал7Шум (S/N) от: а) времени проявления (рис. 18); б) температуры проведения цветной реакции (рис. 19); в) времени проведения цветной реакции (рис. 20). Методики, разработанные на базе этих условий, соответствуют правилам валидации, поскольку величины S/N находятся в пределах от 10 до 60, что позволяет надежно проводить количественные измерения.

Согласно этим же правилам, в каждом конкретном случае необходимо выяснить, насколько стабильна окраска пятен исследуемых веществ на ТСХ пластинах, в частности, для АК это устойчивость их "нингидриновых комплексов" во времени после проведения цветной реакции (рис. 21).

Рис. 18. Зависимость величины S/N от времени пребывания хроматограммы в

КЮВеТе С раСТВОрОМ НГ: (условия проведения

цветной реакции: Т - 60°С, время - 30 мин.) * — ЛИЗИН; Д - серии и валин; ♦ - глутаминовая кислота; ■ - фенилаланин.

1см.

О 2 4 в. > 10 12 14 16 1» 20 22 24 26 28 30 32

* Термин "Денситометрический сигнал" означает разность между интенсивностью отраженного света определенной длины волны от поверхности пластины, не содержащей и содержащей пятно анализируемого вещества.

S/N

j T,C

10 20 30 40 50r 60' 70

90 100

IV2000 .----

1500 1000 500 О

I........

!

2 3 4 5 6 7 8 9 10». час

Рис. 19. Зависимость величины S/N от температуры проведения цветной реакции.

Экспозиция хроматограммы в кювете с раствором реактива -20 сек., время проведения цветной реакции - 30 мин.;

1 — лизин; 2 — серии, глутаминовая кислота,

валин; 3 — фенилаланин.

Рис. 20. Зависимость величины S/N от времени проведения цветной реакции.

Экспозиция хроматограммы в кювете с раствором НГ реактива

- 20 сек., т - 60°С; ♦ — лизин; А - серии, валин, глутаминовая кислота; • — фенил ал анин;

Рис. 21. Зависимость денситоме-триического сигнала АК от времени, прошедшего после проведения цветной реакции на хроматограмме: ♦ — лизин; □ - серин и валин; А—глутаминовая кислота; 0— фенилаланин.

Разработка валидированных методик с метрологическими характеристиками количественного определения АК с помощью видеоденситометрии (Табл. 3) дала возможность в дальнейшем использовать этот метод для определения аминокислот в КЖ в процессе их получения микробиологическим синтезом.

Таблица 3. Сравнительные характеристики определения промышленных аминокислот методами ВЭТСХ, ВЭЖХ и аминокислотного анализатора

№ АК ВЭТСХ ( п=5; Р=0,95) ВЭЖХ ( п=5; Р=0,95) Коэфф. корреляции г АА, г/л

Линейный диапазон, мкг Предел обнаружения, мкг г/л °Л г/л е%

1 Серин 0,03-0,3 0,01 12.0 2,2 12,1 2,6 0,9874 12,2

2 Гомосерин 0,04-0,3 0,01 43,2 2.8 44,0 2,1 0,9843 44,5

3 Треонин 0,04-0,3 0,015 47.6 1,9 46,9 3,3 0,9831 47,0

4 Триптофан 0,1-1,0 0,05 3,7 2,1 4.0 2,4 0,9910 3,9

5 Фенилаланин 0,015-0,2 0,01 10.3 2Д 10.0 1,5 0.9907 9,8

6 Лизин 0,05-0,4 0,015 51,3 2,5 51,1 2,0 0,9795 52,0

7 Аргинин 0,02-0,25 0,01 6,3 2,9 6,4 2,1 0,9807 6,2

8 Орнитин 0,05-0,4 0.02 48,4 1.9 49.4 2.6 0,9985 48,9

9 Валин 0,04-0,08 0,02 15,0 3.1 15.2 3,4 0,9818 3.9

10 Лейцин 0,04-0,08 0,02 11,4 2,2 11,3 1,6 0,9920 11,2

е - относительная погрешность определения аминокислот в КЖ

АА - аминокислотным анализатор, среднее арифметическое рультатов двух независимых измерений.

Высокоэффективная жидкостная хроматография сополимеров и их фрагментов.

Особенностью метода ЭЖХ является то, что процесс разделения макромолекул определяется равновесными параметрами и основан на энтропийном эффекте. Макромолекулы избирательно распределяются между фазами хроматографической системы с коэффициентом межфазного распределения Kd. Величина последнего зависит от соотношения радиуса пор сорбента (г) и гидродинамического радиуса макромолекул (R~M[r|]1/3, Kd=f(R/r); Rs, как фракционирующий параметр является универсальным, не зависящим от химической природы анализируемого полимера (сополимера). В результате этого в ЭЖХ реализуется универсальная калибровочная зависимость Бенуа, основанная натом, чторазделение какгомополимеров, таки сополимеров происходит в соответствии с их гидродинамическими размерами (объемами - Vh). Предложенная концепция позволяет предположить, что для ряда исследованных сополимеров двух- и трехблочного типа в разбавленном растворе характерна сегрегированная конформация компонентов (блоков).

Анализ молекулярной неоднородности БС с помощью ВЭЖХ. Расчет молекулярно-массового распределения блок-сополимеров с помощью двухдетекторной ЭЖХ-ТСХ и в сочетании с пиролитической газовой хроматографией (ПГХ). В случае сегрегированной конформации макромолекул двухблочного сополимера для среднеквадратичных радиусов инерции БС (<R2>B) и компонентов 1 и 2 (<R2>1, <R2>2) имеем:

<R2>B = <R2> +<R2>2 (2) Выразив молекулярную массу (ММ) компонентов БС через ММ БС (МБ) и соответствующие весовые доли компонентов (Р) и использовав уравнения Флори-Фокса; (М-К-Х); Птицына-Эйзнера и принцип УКЗ Бенуа, а также учтя, что параметры Флори для исследованных в данной работе БС ф (е)Б = ф (е), s ф (е)2 в интервале констант а от а/ до а2, получим:

МБ {К,2/3 Р2/3(а'+1> МБ2а'/3+ К22/3-(1- РУ2/3>№+,> -Мб2^/3 }3/2 = [г|]ст'Мст (3), где Kj, aj, К2, а2 — константы М-К-Х для компонентов 1 и 2, соответственно, [ц]с1, Мсг - характеристическая вязкость и ММ полимера стандарта.

В работе проведена проверка указанного подхода при расчете средних ММ охарактеризованных модельных БС полистирол-полиметилметакрилат (ПС-ПММА) состава (1 : 1) в растворителях разного термодинамического качества по отношению к компонентам БС с использованием формулы (3). Показано, что при задании трех значений ММ: 104, 105 и 106 дальтон, которые определяют наиболее достоверный диапазон констант М-К-Х для гомополимеров в различных растворителях, расхождение заданных и рассчитанных средних ММ не превышало 10%.

В рамках предлагаемого подхода были разработаны два способа определения ММР БС с учетом РСМ: метод сочетания ЭЖХ с другими хроматографическими методами — ПГХ и ТСХ и метод двухдетекторной ЭЖХ и ТСХ.

В первом из этих методов использовали ПГХ для определения состава фракций БС, полученных при помощи микропрепаративной ЭЖХ. Для определения состава фракций методом ПГХ требуется лишь несколько мкг вещества, что позволило получить данные по 30-40 фракциям и тем самым дало достаточно точные результаты по распределению состава как по удерживаемым объемам, так и по ММ.

ТСХ применяли для анализа содержания примесей гомополимеров, катализатора и т. д. в образцах БС. Кроме того, использование адсорбционной ТСХ (как метода фракционирования по составу) позволило получать данные о ширине распределения по составу исследуемого образца БС и его фракций, рис. 22.

л

Рис. 22. Типичная адсорбционная ТСХ

гомополимеров и блок-сополимеров полистирола

и полибутадиена: 1 - ПС; 2 - ПС-ПБ,; 3 - ПС-ПБ1+Ц;

4 - ПБ-ПС-ПБ; 5 - ПБ;

Элюент: толуол - циклогексан (5:1).

Таблица 4. Средние молекулярные характеристики БС, полученные из данных ЭЖХ, ТСХ, ПГХ и осмометрии (п—3).

№ Блок-сополимеры Раство- лс-нг3 -ю-3 М.-10"3 ма/мя

ритель

1. ПС-ПММА-ПС толуол 129±8 400±21 130±8 3,08

« « ДМФ С( 410±9 132±7 3,11

2. ПС-ПММА-ПС толуол 220±11 460±20 223±3 2,06

с< с< ДМФ 465±20 230±9 2,02

3. ПС-ПБ толуол 475±25 620±25 473±23 1,31

« и ТГФ 631±33 482±21 1,30

4. ПС-ПБ толуол 100±8 110±6 102±4 1,08

м « ТГФ 109±5 100±4 1,09

5. ПИ-П-а-МСт-ПИ толуол 189±16 255±4 185±5 1,38

6. ПС-ПАН ДМФ - 352±7 76±3 5,10

(С (С сс - 163±7 51±3 3,30

ПИ — полиизопрен, П-а-МСт — поли-а-металстирол, ПАН — полиакрилонитрил; ДМФ — диметилформамид, ТГФ — тетрагидрофуран.

Расчет ММР БС включает две стадии. Вначале хроматограмма корректируется с учетом различной чувствительности детектора к компонентам БС, то есть:

ю (V) = h (V) / [cij- Pj + а2 (1 - Pj)], (4)

где h (V) — оридината нормированной хроматограммы ( J h (V) dV =1), со (V) - исправленная нормированная ордината, at и а2 — коэффициенты чувствительности детектора к компонентам 1 и 2 в размерностях, например, мольных экстинций или инкрементов показателя преломления. На второй стадии осуществляется построение калибровочной зависимости lgME=f(V).

В табл. 4 представлены молекулярные характеристики различных БС, рассчитанные по данным ЭЖХ и ПГХ. Из данных таблицы видно хорошее соответствие рассчитанных из ЭЖХ-данных Мп с результатами независимых измерений. При этом сравниваемые величины коррелируют для всех исследованных систем полимер-адсорбент-растворитель.

На рис. 23а в качестве примера приведены ММР и РСМ для блок-сополимера ПИ — П-а-МС - ПИ. Пунктиром дано ММР гомополимера П-а-МС, из которого был получен блок-сополимер.

Рис. 23. Анализ блок-сополимера ПИ - П-а-МС - ПИ (образец 5, таб.4)

а - интегральные ММР гомополимера П-а-МС (1), блок-сополимера (2); функция РСМ (3); б — контактная фотография тонкослойной хромато граммы.

Элюент: хлороформ - ДМФА (18:2); 1 — ПИ; 2 — неозон Д; 3 — блок-сополимер; 4— дифенилпарафенилендиамин; 5—П-а-МС.

П-а-МС,% )Ю0

Рис. 24. а-Дифференциальные ММР ПС (1), ПММА (2), блок-сополимера (3) и кривая РСМ (4); б - кривая композиционной неоднородности блок-сополимера ПС-ПММА-ПС (образец 1,табл. 5).

Из представленных данных легко построить кривые распределения по каждому из блоков, а в случае предполагаемой нами гомогенности ЭЖХ фракций по составу — кривые композиционной неоднородности. На рис. 24

приведены указанные выше зависимости для блок-сополимера ПС — ПММА — ПС (образец 1, табл. 4), для которого с помощью ТСХ была подтверждена гомогенность отобранных для ПГХ фракций.

Однако, способ определения ММР БС путем сочетания ЭЖХ и ПГХ является трудоемким и длительным, т.к. процесс отбора фракций сополимера с последующим определением среднего состава с помощью ПГХ занимает в десятки раз больше времени, чем собственно ЭЖХ-анализ. Более перспективным для определения РСМ и ММР является применение в ЭЖХ двух детекторов, один из которых (рефрактометр, Р) регистрирует, например, концентрацию всего БС, а второй (спектрофотометр, <р) избирательно регистрирует концентрацию только одного из его компонентов. Расчет ММР БС и в этом случае проводили по уравнению (3) с предварительным исправлением хроматограмм, используя уравнение (4), корректирующее хроматограмму с учетом различной чувствительности детекторов к компонентам сополимера. Функцию РСМ рассчитывают, непосредственно из хроматограмм БС, зарегистрированных двумя детекторами. С этой целью для данного удерживаемого объема записывают следующую систему уравнений, связывающих высоты хроматограмм, зарегистрированных рефрактометрическим hp и спекгрофотометрическим h^ детекторами с концентрациями компонентов БС.

hp = a,p'c. + a2pc2' . (5) h<p = cVci + oy с2 .

где а1Р, а2р9 а, , a2ifi - постоянные детекторов (удельные чувствительности) к компонентам

Поскольку Р = СДС1 + С2), из уравнения (4) можно рассчитать состав Р для любого удерживаемого объема как функцию высот хроматографических пиков. В частном случае отсутствия чувствительности спектрофотометрического детектора к одному из блоков (а 7(р = 0) искомое соотношение имеет вид:

(-£-" 1 И (6)

Ф 2ф • 2Р

Коэффициенты чувствительности детекторов к компонентам БС, входящие в уравнения (4-6), определяются при хроматографироваиии соответствующих гомополимеров и построении зависимости площади пиков от концентрации вводимой пробы. В линейном диапазоне работы детекторов эти зависимости выражаются линейной функцией.

В табл. 5 приведено сравнение значений СММ ряда БС, рассчитанных по данным двухдетекторной ЭЖХ, при сочетании ЭЖХ и ПГХ, а также Мп , определенные мембранной осмометрией. Здесь и далее коррекция на "приборное уширение" была проведена только для узкодисперсных образцов.

Расчет ММР блок-сополимеров с учетом КН в ЭЖХ-фракилях. Обычно фракции макромолекул БС, соответствующие данному удерживаемому объему Уи, имеют распределение по составу Р, задаваемое некоторой функцией f(P), вид которой зависит от способа получения БС. В этом случае

ММ БС определяется как средняя по составу (при данном а именно

МБ= £(Р)МБ(Р)с1Р, (7)

где МБ (Р) — ММ БС, рассчитываемая по формуле (3). В частном случае, (Р) = 8 (Р-Р) (5 (Р-Р) - дельта функция Дирака), т.е. когда состав БС однороден во фракциях МБ = МБ (Р), ММ БС можно определять, непосредственно пользуясь описанными выше способами.

Таблица 5. Средние ММ БС, полученные из данных ЭЖХ (ТСХ) и ПГХ, двухдетекторной ЭЖХ (ТСХ) и осмометрии (п=3).

№ Блок-сополимер Двухдетекторная ЭЖХ ЭЖХ и ПГХ Осмо-метрия

Ми. Ю-3 Mn. Ю-3 Мой . Ю-3 Mn. Ю-3 Mh. Ю-3

1 ПС-ПММА-ПС 420±21 137±8 400±25 130±10 129±10

2 ПС-ПММА-ПС 454±19 218±11 460±19 223±12 220±15

3 ПС-ПММА 195±12 102±6 203±18 98±6 112±9

4 ПС-ПММА 279±15 132±6 271±14 112±7 126±10

5 ПС-ПБ 590±31 453±12 620±17 473±12 475±19

6 ПС-ПБ 95±5 94±5 110±6 102±4 100±7

7 ПС-ПБ-ПС 230±11 187±6 209±9 175±11 216±12

8 ПБ-ПС-ПБ 109±7 100±6 110±4 98±7 104±8

Для определения функции f(P) необходимо использовать наряду с ЭЖХ адсорбционную жидкостную хроматографию, чувствительную к составу сополимера, как в режиме "off-line" (например, адсорбционная ТСХ), так и в режиме "on-line" (так называемая "ортогональная" хроматография). Обычно же из данных двухдетекторной ЭЖХ (или при анализе состава ЭЖХ-фракций с помощью ПГХ) определяют лишь средний состав Р этих фракций, соответствующий данному удерживаемому объему:

Р = Р f(P) dP (8)

Таким образом, оценив предварительно функцию f(P), можно избежать погрешности в определении ММ, которая будет тем больше, чем сильнее отличие реальной функции f(P) от дельта функции.

В качестве функции f(P) удобно использовать кусочно-постоянную функцию вида:

f(P) = / 1/d, Ре [P-d/2, P+d/2] С. 0, при остальных Р Данная функция имеет симметричный вид и характеризует равную вероятность наличия одинаковых_по размеру макромолекул БС, имеющих состав больше Р и меньше Р. Важно отметить, что представление f(P) не только видом (9), но и любым другим распределением не приведет к значительной погрешности в определении ММР БС.

Показано, что для проанализированных в данной работе БС можно использовать дельта функцию для учета РСМ. Были проведены расчеты предельной теоретической погрешности е(У, где ер = | МБ - МБ (Р) | / МБ (Р). Указанные расчеты были проведены путем численного интегрирования выражения для ер. Установлено, что величина ер зависит от соотношения констант М-К-Х для компонентов. На рис. 25 приведены данные такого расчета для исследованных нами БС на основе Ст и Бу, Ст и ММА. Эти БС выбраны по следующей причине: экспериментально установлено, что калибровочные зависимости для ПС и ПБ в ТГФ сильно различаются между собой, тогда как для ПС и ПММА практически совпадают. С другой стороны, установлено, что максимальный разброс по составу в ЭЖХ-фракциях наблюдается именно для БС на основе Ст и ММА. Калибровочные зависимости для компонентов других исследованных БС (например, поли-а-метилстирола (П-а-МСт), полидиметоксиэтилена (ПДМЭ), поливинилбензилового эфира (ПВБЭ)) занимают промежуточное положение между калибровками для компонентов БС на основе Ст и Бу или Ст и ММА.

Из рис. 25 видно, что для указанных БС максимальная возможная ошибка не превышает 1%. Учитывая тот факт, что реальные отклонения состава в ЭЖХ-фракциях в БС ПС-ПБ и ПС-Г1ММА (установленные при помощи ТСХ) составляют с1 = 0,1 ис1 = 0,6, соответственно, можно считать, что реальная ошибка в расчете ММ при использовании в качестве функции Г(Р) дельта функции пренебрежимо мала по сравнению с погрешностью, присущей самому методу.

Рис. 25. Зависимость ср от с! для БС ПС-ПБ (а) и ПС-ПММА (б).

Кпб^пс = !'28 ' аас

= 0,71 , яПБ = 0,78 ,

Кп.\1МА/Кпс = 1,368 ,

, = 0,67. Элюент

ПММА '

- ТГФ, 295 К.

Исследование БС стирола и бутадиена методами ВЭЖХ. ТСХ и озонолиза. Изучение ММР БС и их отдельных компонентов принципиально важно в случае использования для их синтеза метода "живущих" цепей, очень чувствительного к условиям полимеризации, а также к природе инициатора и растворителя. Особенно информативны сведения о характере ММР отдельных компонентов БС в том случае, когда используется одновременное введение обоих мономеров. Разработанный метод сочетания ВЭЖХ и озонолиза позволил получить подобные сведения.

Таблица 6. Основные молекулярные характеристики исследованных

БС и их компонентов (п=3).

№ Полимер Мсо. 10-3 Мп. 10-3 Мш / Мп Условия синтеза

1 2 ПС-ПБ ПС* 552±21,0 101±5,0 338±14,0 14±0,6 1,63 7,21 Н-БЛ, ЦГ, 333 К

3 4 ПБ-ПС ПС* 95±5,0 9±0,6 94±3,0 3±0,1 1,01 3,00 втор-БЛ, ЦГ, 333 К

5 6 7 ПС исх ПС-ПБ ПС* 101±6,0 159±8,0 98±5,0 92±6,0 143±10,0 89±6,0 1,10 1Д1 1,10 втор-БЛ, Б, 333 К

8 9 10 ПС исх ПС-ПБ ПС* 18±1,0 114±3,0 18±0,5 17±0,9 107±4,0 16±1,0 1,06 1,07 1,13 втор-БЛ, Б, 303 К

11 12 13 14 ПС исх ПС-ПБ, ПС-ПБ[+И ПС* 65±4,0 191±6,0 219±4,0 69±5,0 60±4,0 159±9,0 186±16,0 62±5,0 1,08 1,20 1,18 1,11 втор-БЛ, ЦГ, 333 К

15 16 17 18 ПБ,-ПС ПС* ПБГПС-ПБп ПС* 51±3,0 27±1,3 65±2,0 27±1,9 41±1,3 19±1,0 61±5,0 19±1,7 1,24 1,42 1,07 1,42 втор-БЛ, ЦГ, 333 К

19 ПС 96±4,0 94±3,0 1,02 ОБЛ, ЦГ, 333 К

№1-4 синтезированы методом одновременной загрузки мономеров, № 5-19 методом последовательной загрузки мономеров; ПС*— ПС, выделенный после озонолиза БС, ОБЛ — олигобутадиешилитий, ЦГ — циклогексан, Б — бензол.

Основные молекулярные характеристики некоторых исследованных БС представлены в табл. 6. При синтезе этих сополимеров стояла задача создания БС с узкими ММР как самих БС, так и составляющих их компонентов. Из опубликованных данных следует, что при ыштезе с последовательной загрузкой мономеров, как правило, получали узкодисперсные БС, независимо от применяемого катализатора и порядка добавления мономеров. При одновременной загрузке мономеров ситуация оказалась более сложной. Узкодисперсные БС в этом случае были получены при использовании в качестве инициатора более реакционноспособного вторичного бутиллития (втор-БЛ). Причина уширения ММР связана с большей степенью ассоциации н-бутиллития (н-БЛ) в углеводородной среде по сравнению с втор-БЛ (первый - гексамерен, второй - тетрамерен) и, кроме того, процесс полимеризации под действием н-БЛ характеризуется определенным индукционным периодом, что приводило к повышенной полидисперсности полибутадиениллитиевых (ПБЛ) цепей.

Самостоятельный интерес представляет ММР ПС в БС, полученного при одновременной загрузке мономеров. Общей причиной уширения ММР этих образцов ПС является возможность внедрения отдельных молекул Бу в ПС-блок при завершении полимеризации основной массы Бу. Последнее приводит к образованию микроблоков ПС, что и проявляется при озонировании.

В результате было установлено, что для получения БС с узким ММР каждого из блоков необходимо не только проводить синтез методом последовательного введения мономеров, но и соблюдать определенную последовательность синтеза блоков (образцы 6, 9, 15, табл. 6). В ЦГ повышенную полидисперсность получали, когда в качестве инициатора полимеризации Ст использовали высокомолекулярный ПБЛ. При использовании же олигобутил-лития (ОБЛ) со степенью полимеризации 8 получали узкодисперсных! ПС.

По-видимому, фактором, определяющим полндисперсностъ, является скорость обмена между различными ассоциированными и мономерными формами растущих цепей, различающихся активностью в актах роста цепей. Отличия в скоростях перехода между различными формами растущих цепей проявляются тем больше, чем больше различие в их ММ. Можно полагать, что скорость таких обменов в ЦГ заметно шоке, чем скорость присоединения стирола к активным центрам. Подтверждением данной точки зрения служат данные на рис. 26, где показано изменение ММР ПС-блока с глубиной превращения стирола в ПС по мере его присоединения к ПБЛ и полистироллитию (ПСЛ).

Наличие в системе нескольких типов активных центров наглядно проявляется на начальной стадии процесса синтеза. При введении в данную инициирующую систему сильного электродонора (Д) (например, тетраметилэтилендиамина - ТМЭД) нарушается избирательное связывание на начальных ступенях сополимеризащш молекул Бу из-за образования комплексов между активными центрами и ТМЭД. Вследствие этого в системе образуется большое число активных центров различных типов. При помощи такого приема удалось получить мультибл очные и статистические сополимеры на основе Ст и Бу. На рис. 27 изображены хроматограммы таких сополимеров, отличающихся конверсией реакции сополимеризащш при постоянной температуре и температурой реакщш при постоянной конверсии. Видно, что в этих условиях общим следствием понижения температуры является

Рис. 26. Хроматограммы

БС

ПБ-ПС, различающихся глубиной ПОЛНМеризащш ПС-блока. Пунктиром обозначены хроматограммы, зарегистрированные спектрофотометрнческнм детектором (а); хроматограммы ПС-блока, выделенного после озонолиза соответствующих БС (б).

уменьшение числа обменов между ассоциированными (Мх1л)у и мономерными (Мх1л) формами (как "свободными", так и "закомплексованными" сильным электродонором (Мх1л Д)) растущих цепей; и наоборот, при повышении конверсии происходит сглаживание различий между различными типами активных центров. В результате проведенных исследований, главным образом на основании данных ЭЖХ, удалось выявить определенный ряд активности литий органических агентов (Мп1л) в неполярной среде: (Мп1л)т< (М 1л-Д)т

< М Li Д < М Li

п ^ п

Рис. 27. а) Влияние температуры на молекулярные характеристикипродуктов, образующихсяв системе Бу-Ст (1: 1) -ОБЛ-ТМЭД при суммарной конверсии мономеров 10% и молярном соотношении ТМЭД: ОБЛ = 0,01. б) Влияние конверсии на молекулярные характеристики продуктов, полученных в системе Бу-Ст (1:1)- ОБЛ-ТМЭД при 231 К.

Применение В ЭЖХ для исследования молекулярных, композииионных и "архитектруных" характеристик БС. На примере БС, отличающихся структурой - неполярный-полярный (ПС-ПММА) и полярный-полярный (ПДМЭ-ПВБЭ) мономер, рассмотрены особенности проведения ЭЖХ и те особенности синтеза БС, которые можно получить из данных ЭЖХ.

Показано, что синтез БС на основе Ст и ММА методом свободнорадикальной полимеризации с использованием инициирующих систем полистирилалюминий (ПСА1) — органические перекиси — сильный электродонор (например, пиридин (ПД)) позволяет получать БС с заданной "архитектурой" (АВ, ABA -где А- ПС) (рис. 10).

Поскольку указанные инициирующие системы могут быть использованы в широком температурном интервале, выбор соответствующих температурных условий и соотношения [ПД:ПСА1] позволяет регулировать протекание реакции по механизму обрыва либо преимущественно по типу рекомбинации (с образованием структуры ABA): ПС-ПММА- + ПС-ПММА- -> ПС-ПММА-ПС, либо по механизму диспропорционирования (с образованием структуры АВ): ПС-ПММА + ПС-ПММА- -» 2 (ПС-ПММА).

Метод двухдетекторной ЭЖХ был применен для решения следующих задач в области синтеза БС методами катионной полимеризации, а именно, последовательной сополимеризацией двух мономеров типа виниловых эфиров и взаимодействием макроионов ("блок-сополимеризация"): а) определение молекулярных и композиционных характеристик; б) выяснение реакционноспособности и устойчивости активных центров полимеризации; в) исследование особенностей процесса синтеза исходных гомополимеров и БС методом катионной полимеризации.

Решение поставленных задач потребовало нахождения констант М-К-X для исходных гомополимеров поливинилбензилового эфира (ПВБЭ) и полидиметоксиэтилена (ПДМЭ). Так, были получены следующие зависимости

в ТГФ при 295 К: [ri]nBE3= 6,55 10 5 М0-83 и [ц] = 3,5010"5 М0'86. Полученные данные указывают на образование БС ПДМЭ-Г1ВБЭ с довольно высокой ММ (до МБ ~ 5 104). В настоящей работе удалось провести и изучить реакцию взаимодействия "живущего" ПС с макрокатионами ПДМЭ и получить таким образом БС довольно высокой ММ. Эти результаты подтверждают предположение о повышенной стабильности активного центра при полимеризации ДМЭ.

Особенности ЭЖХ промышленных полимеров и сополимеров. В данном разделе обобщен опыт применения ЭЖХ для анализа промышленных полимеров и сополимеров. Рассмотрены методы подготовки и очистки промышленных образцов, выбора и подготовки элюента, приведены примеры по хроматографическому подавлению "побочных" пиков в промышленных образцах.

Проанализирован ряд промышленных БС на основе Ст и Бу. Так, исследованы линейные БС строения ПС-ПБ, а также получаемые на их основе образцы термоэластопластов ДСТ-30, выпускаемые Воронежским заводом СК им. С.В.Лебедева. Последние представляют собой БС типа ПС-ПБ-х-ПБ-ПС, где х - сшивающий агент (фенилбензоат). Показано, что образцы ДСТ-30 представляют собой трехкомпонентную смесь, состоящую из гомополимера ПС, двухблочного сополимера ПС-ПБ и трехблочного сополимера ПС-ПБ-х-ПБ-ПС (рис. 28). Молекулярные и некоторые структурные характеристики исследованных образцов представлены в табл. 7.

Рис. 28. а)Хроматограм-мы БС ПС-ПБ - 1 и полученного на его основе ДСТ-30 — 2; б) Интегральные ММР и функции РСМ термоэластопластов №49 и №52 (табл. 7).

Сопоставление данных табл. 7 с физико-механическими и реологическими характеристиками БС показывает, что наиболее прочные образцы ДСТ-30 состоят из более высокомолекулярных компонентов, причем содержание трехблочного сополимера в них меньше, а гомополистирола больше, чем в других образцах. На рис. 286 приведены в качестве примера интегральные ММР и функции РСМ для двух значительно различающихся по прочности образцов № 49 и 52. Видно, что трехступенчатые интегральные ММР для этих образцов значительно различаются, тогда как кривые РСМ практически совпадают.

Таблица 7. Молекулярные и структурные характеристики термоэлаС' то пластов ДСТ-30 и его компонентов.

№ Гомо-ПС 2-х бл.БС 3-х бл.БС Содержание связан. Ст, % Доля компонентов в БС, %

М\у ю-3 Мп ю-3 Млу ю-3 Мп ю-3 Мш ю-3 Мп ю-3 Гомо-ПС 2-х бл. 3-х бл.

47 19 18 78 73 135 125 28,2 18,8 28,8 52,4

48 19 18 50 47 117 110 31,6 9,9 32,4 57,8

49 24 22 71 67 141 132 29,3 18,7 24,8 56,6

50 12 11 46 43 93 87 28,7 9,5 27,9 63,1

51 15 14 51 49 100 91 30,2 9,6 35,7 54,7

52 16 15 50 48 84 79 31,7 9,3 25,0 65,7

Высокоэффективная эксклюзионная жидкостная хроматография

полиамидокислот.

В настоящее время стоит задача повышения качества полипиромеллитимида важнейшего термостойкого, высокопрочного, электроизоляционного полимера. Вследствие плохой растворимости полиимидов основную информацию об их молекулярных характеристиках получают при исследовании форполимеров полиамидокислот (ПАК). Сложность разработки методов ВЭЖХ анализа ММР ПАК связана со следующими проблемами: из-за полиэлектролитных эффектов гидродинамические размеры макромолекул очень чувствительны к различным примесям, макромолекулы ПАК крайне нестабильны в разбавленных растворах; в процессе поли конденсации ПАК не происходит разделения фаз, поэтому ПАК всегда получают в виде раствора, который может содержать часть не вступивших в реакцию компонентов; проведение хроматографических исследований осложняется наличием полиэлектролитного набухания, ионной эксклюзии и адсорбционного взаимодействия с адсорбентами.

Для расчета молекулярных параметров ПАК было применено уравнение (10), устанавливающее связь между константами К^ и а в уравнении Марка-Куна-Хаувинка: -[г)]=КМа.

Кц =е(е,х>4^)(^0/М0)(,+а) (10)

где ®(е'х) - пщродинамический параметр Флори, 8- параметр объемного взаимодействия, х- параметр протекания клубка, А - длина статистического сегмента макромолекул (для ПАК-ПМ А ~ 32 А), М0 -ММ мономера (для ПАК М0 =: 418), Х0 - длина мономерного звена (А,0=15,9 А). Показана хорошая корреляция теоретической зависимости (10) с экспериментальными данными

для ПАК в различных растворителях, полученных методами светорассеяния и ЖХ. При выводе этого уравнения было учтено, что особенностью гидродинамического поведения макромолекул ПАК в условиях подавления полиэлектролитного набухания (реализуемого в режиме ВЭЖХ) в разбавленных растворах является негауссовость макромолекулярных клубков и изменение их проницаемости с ростом ММ. Такая особенность поведения ПАК приводит к существованию двух пар констант в уравнении (10). Так, в разработанном для ВЭЖХ ПАК-ПМ сложном элюенте на основе ДМФА, в котором были подавлены полиэлекгролитное набухание и ионная эксклюзия, были найдены следующие константы (на основании вискозиметрических, хромато графических данных и мембранной осмометрии): К =0,257- 10"3дл/г, а=0,80 (для ММПАК лежащих в диапазоне 2-104<М<6-104) и 1^=0,513-Ю"3 дл/г, а—0,1Ъ (для области 6-104<М<2,25-105).

Рис. 29. Совмещение хроматограм-мы стандартной смеси карбоновых кислот в метанольном (—) и аце-тонитрильном градиентах (—). 1

— пиромеллнтовая, 2 — прениювая, 3 — трн-меллитовая, 4 - фталидная, 5 - фталевая, 6

— диметилфталевая, 7 — 4,6-днметил изо фталевая. Элюент: "А" - 10% метанол (ацето-нитрил) в фосфатном буфере; "В" - 90% метанол (ацетоннтрил) в фосфатном буфере..

Для выяснения влияния микропримесей в мономерах на молекулярные характеристики при синтезе ПАК на основе пиромеллитового диангидрпда (ПМДА) и диаминдифенилового эфира (ДАДФЭ), так называемых ПАК-ПМ, впервые разработаны методы обращенно-фазовой градиентной хроматографии и ПХ (рис. 29,30), был проанализирован ряд промышленных образцов мономеров для ПАК-ПМ и оценена их чистота (рис. 30).

2 3 п.80 4 6 6

а)

1 г

6)

Рис. 30. Идентификация возможных примесей в промышленных ДАДФЭ с помощью ТСХ. а) контактная фотография ДАДФЭ п. 80 и некоторых реперов: 1

— п-шггрофенол; 2 — п-аминофенол; 3 - хлоранилин; 4 - дишггрофенол; 5

- диннтрохлорбензол; 6 - 3, 4, 4', 5'-тетрааминодифениловыи эфир.

б) фотография хроматограммы: 1 - п-аминофенол; 2 - смесь ДАДФЭ п. 80 и ампнофенола; 3, 4 - ДАДФЭ п. 80 Элюент: "А", обнар. - флуорескамин

Анализы показывают, что почти все образцы содержат примеси, которые могут существенно влиять на молекулярные характеристики и реологические свойства ПАК-ПМ (табл. 8). Из рис. 31 видно, что с увеличением суммарного относительного содержания микропримесей в ДАДФЭ от 0,6 до 2,4% величина М№ ПАК-ПМ, полученная на основе данных образцов мономеров, уменьшается с 260000 до 78000 Да, т.е. более чем в 3 раза.

Рис. 31. Хроматограммы лаков ПАК ПМ (1,2), полученных на основе ДАДФЭ № 1, №7 (табл.8). Калибровочная зависимость колонки для ПАК (3).

Таким образом, приведенные данные показывают перспективность применения разработанных методов ВЭЖХ для экспрессного определения молекулярных параметров ПАК.

Таблица 8. Молекулярные и физико-химические характеристики лаков ПАК-ПМ* на основе промышленных образцов ДАДФЭ с различным содержанием микропримесей.

№ об раз -ца № образца ДА ДФЭ Общее содержание примесей Характеристики промышленных лаков ПАК-ПМ

К' а Кл -103 (дл/г) [г)]рассч. (до/г) [тягомер, (дл/г) А/т.Ю Л/,-10

1 1 0,6 0,52 0,67 0,75 3,8 4,2 260 102 2,6

2 2 0,9 0,52 0,67 0,75 2,44 — 190 86 2,2

3** 2 0,9 0,44 0,75 0,375 0,54 0,61 17 6 2,7

4 3 0,9 0,42 0,77 0,3 3,6 — 215 98 2,2

5 4 1,1 0,42 0,77 0,3 1,6 — — — —

6 5 1,3 0,42 0,77 0,3 2,6 2,56 136 59 2,3

7 6 1,5 0,42 0,77 0,3 2,03 — 169 73 2,3

8 7 1,4 0,52 0,67 0,75 2,3 — 176 85 2,1

9*ч> 7 1,4 0,44 0,75 0,375 0,48 0,64 15 6 2,5

10 8 1,8 0,52 0,67 0,75 2,54 2,64 — — — .

11* 8 1,8 0,44 0,75 0,375 1,03 1,04 41 19 2,1

12 9 2,4 0,39 0,8 0,26 2,04 1,95 78 35 2,2 ,

* Использование ПМДА, синтезированных в ИВС РАН; К' -константа Хаггинса ** Использование ПМДА промышленного производства.

Планарная хроматография.

Планарная хроматография сложных полимерных систем.

Для исследования сополимеров со сложной молекулярной и композиционной неоднородностью применяли ВЭЖХ-методы ортогонального (перекрестного) фракционирования как способом on-line (мультидетекторная ЖХ с использованием различных типов колонок), так и методами off-line (сочетание ЖХ, ТСХ, ПГХ, а также сочетание хроматографических (ЭЖХ) и нехроматографических (озонолиз) методов). Наиболее удобной для этих целей оказалась высокоэффективная ТСХ, т. к. она позволила провести как первичную диагностику (показать, является ли исследуемый образец смесью гомополимеров и/или сополимером), так и определять гетерогенность по ММ и составу (например, рис. 22, 23).

Разделение БС разной структуры А-Б, А-Б-А с числом сегментов макромолекулярных цепей NA и NB по ММ и КН реализовывали методами адсорбционной и эксклюзионной ТСХ (АТСХ, ЭТСХ) путем варьирования свободной энергии взаимодействия (-AF) сегментов (-8А, -8В) с поверхностью адсорбента и реализации режима критической ТСХ (КТСХ)*, когда Rf полимера не зависит от его ММ. При -8А, и -8В меньше критической энергии (-8^) для соответствующих гомополимеров А и В, БС не адсорбируется и движется по слою ТСХ-пластинки в соответствии с законами ЭЖХ. В противном случае (-£А, -£в> -8^) БС адсорбируется на старте пластинки. Подобрав состав элюента таким образом, когда -8Д для одного из блоков больше -8^, а для другого -8В меньше -8 , можно создать условия, когда для некоторого состава БС (%БС = £,кр\ где = NA/(NA+NB)) макромолекулы с £>£,кр будут преимущественно находится внутри пор, а с - вне пор.

Таким образом, были реализованы механизмы разделения БС по составу (рис. 32), что в свою очередь позволило рассчитать ММР, РСМ и КН исследованных БС.

Рис. 32. а) АТСХ, б) КТСХ, в) ЭТСХ для ПММА; г)ЭТСХ ПС-блоков БС ПС-ПММА в условиях КТСХ для ПММА. Элюент: а) бензол-гексан-ацетон (7:3:6,2); б), г) бензол-гексан-ацетон (7:3:7) (насыщение 1 час); в) МЭК (насыщение 1 час); а) и в): ПММА (1-6) с ММхЮ3: 400, 265, 185, 107, 82, 27, соответственно; б)(1-3) ПММА ММхЮ3: 107,400,27; (4-7) ПС ММхЮ3: 51, 20, 10, 4 г)(1-2) БС ПС-ПММА; (3-4) ПММА ММхЮ"3: 400, 27; (5-6) ПС ММхЮ3:51,200.

а

б

в

г

* Первые работы по единой теории адсорбции макромолекул были проведены Б.Г.Беленьким с сотр.: Б.Г.Беленький, Э.С.Ганкина, М.Б.Тенников, Л.З.Виленчик. ДАН СССР,.1976. №231. С. 1147

Планарная хроматография аминокислот.

Особенностью метода планарной хроматографии является возможность проведения многомерной хроматографии. На рис.33 показан один из разработанных нами методов двухмерной хроматографии, впервые позволивший получить прямое разделение 20 белковых АК без дополнительной дериватизации.

Рис. 33. Разделение стандартной смеси 20 аминокислот.

Направление А: элюент "А" (бинарное элюирование 1,=60 мм, \=62 мм).пропанол-2 - ацетон - 25% водный аммиак - вода [(19,0-27,0):(20,0-26,0):(3,0-6,5):(6,0-10,0), v/v].

Направление Б: элюент "Б" (бинарное элюирование 1,=60 мм, 12=80 мм).хлороформ - этанол -лед.укс. кислота - вода [(23,0-27,0):(13,5-16,0):(4,5-6,5):(1,3-3,5), v/v],

-TT •Т. . аММКНОЯМСЛ. К.1Ч т --■■■ о-про

ЦИС+- % ампенм } ФШ0- про

Анализ аминокислот в биологических жидкостях. Избыточное количество некоторых АК у новорожденных детей является причиной наследственных дефектов обмена (НДО) веществ, которые при отсутствии лечения могут привести к тяжелой инвалидности или смерти. Объекты анализа — биожидкости, которые могут содержать более 20 АК. На основе разработанных хроматографических систем (рис. 33) впервые были разработаны подвижные фазы "Б" и "В", позволившие создать метод экспресс-диагностики врожденных ацидурий (фенилкетонурия и др. аминоацидурии) при разделении АК в плазме крови или в моче методом ПХ (рис. 34,35).

Рис. 34. Хроматограмма плазмы крови при диагностике фенилкетонурии, тирозиноза, гиперпролинемии I и II.

1 — плазма крови больного человека; 2 — стандартная смесь 23 аминокислот; 3 — плазма крови здорового человека. ВЭТСХ-пластинки "Сорбфил". Элюент "Б":хлороформ-96% этанол - лед. уксус, кислота - вода [(52,5-54,0):(26,0-27,5):(8,9-9,6):(3,5-4,2), v/v].

Рис. 35. Хроматограмма разделения АК

при диагностике НДО: аргишшемия,

орнитинемия, интолерантность к лизину. 1 — плазма крови больного человека; 2 — стандартная смесь 23 аминокислот; 3 - плазма крови здорового человека. Элюент "В": пропанол-1 — 25% водный аммиак - вода [(3,3-4,1):(0,9-1,5):(7,5-9,0), v/v]. ВЭТСХ-пластинки "Сорбфил".

Хроматографическое определение свободных аминокислот в процессах микробиологического синтеза. АК являются одним из наиболее важных продуктов промышленной биотехнологии как в "тоннажном", так и в стоимостном выражении, поэтому на разработку методов анализа всегда обращали особое внимание. В настоящей работе ПХ была использована как основной инструментальный метод исследования, а ВЭЖХ - как сравнительный. В последнем случае проводили разделение в смеси ацетонитрил-вода (2 : 8, v/v) и спектрофотометрическое детектирование комплексов АК с катионами меди (И) при 235 нм.

Изучение пригодности (валидности) метода ПХ для количественного определения аминокислот в КЖ промышленных штаммов-продлщентов. Согласно нормативам GLP (Good Laboratory Practice) неотъемлемой частью современного количественного анализа является валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает, в частности, контроль воспроизводимости результатов и метрологическую оценку результатов. Данные по результатам зависимости денситометрического сигнала от содержания АК, внутрилабораторной воспроизводимости и метрологическая оценка методик хроматоденситометрии приведены в таблицах 9, 10, 11.

Из данных представленных в табл. 3 видно, что линейная зависимость сохраняется во всем изученном диапазоне, показана хорошая внутрилабораторная воспроизводимость результатов. Метрологическая оценка разработанных методик свидетельствует о том, что относительная погрешность определения АК (е) составляет 1,47 — 4,6% (табл. 11). Согласно нормативно-технической документации (НТД), принятой на предприятиях микробиологической промышленности России, эта величина не должна превышать 5,5%.

* Метрологическая оценка сравнительного метода ВЭЖХ показывает, что величины е варьируются в интервале от 1,6 до 3,2%.

Таблица 9. Зависимость денситометрического сигнала от содержания АК в хроматографических зонах.

Аминокислота (АК) Отношение денсгаометри- ческий сигнал/шум S/N Диапазон содержания АК в хроматографической зоне, мкг Уравнение г

Серии 35-40 0,03 - 0,30 у=Ю, 52х+0,12 0,9058

Глутаминовая кислота 35-40 0,02 - 0,25 у=0,37х+0,09 0,9988

Лизин 50-55 0,015 - 0,200 у=0,76х+0.31 0,9972

Фенилаланин 30-35 0,10-1,00 у=0,32х+0,24 0,9975

Валин 35-40 0,04 - 0,40 у=0,51х+0,58 0,9981

п=5; Р=0,95 Использовали стандартные растворы АК, принадлежащим к пяти различным классам

Таблица 10. Внутрилабораторная воспроизводимость результатов анализа стандартных растворов аминокислот, выполненных в течение одного дня (I)

С - содержание аминокислоты в хроматографической зоне, е - относительная погрешность определения АК. Содержание каждой аминокислоты в пятне находится в линейной области денситометрического сигнала (табл. 3). п=5, Р=0,95.

Таблица 11. Метрологическая оценка методик количественного определения аминокислот различных классов в КЖ с использованием метода ПХ.

АК f х, г/л Хср.> г/л S2 S Sx ч> Р,% КВД ДХ е, %

Серин 4 5,0 5,04 0,0271 0,1643 0,0741 95 2,78 0,2048 4,61

Глутаминовая кислота 4 20,0 20,18 0,0573 0,2383 0,1070 95 2,78 0,2975 1,47

Лизин 4 35,0 35,06 0,2452 0,4951 0,2220 95 2,78 0,2975 1,47

Фенил алаш гн 4 15,0 15,04 0,0533 0,2302 0,1032 95 2,78 0,2889 1,91

Валин 4 30,0 29,82 0,4714 0,6865 0.3078 95 2,78 0,8558 2,86

X - концентрация раствора, полученного при растворении определенного количества АК в г (точная навеска 110"5 г) в 1 л сливной "нулевой" КЖ, т. е. не содержащей штамм-продуцент.

и через пять дней (II).

Аминокислота (АК) с, мкг е, % с, мкг е, %

I II I II

Серин 0.05 о;ю 0,15 4.1 3,6 3.2 5,0 4,8 4,0 0,20 0,25 2,0 2,0 2,8 2,6

Глутаминовая кислота 0,05 0,10 0,15 5,0 4,2 3,5 5,3 5,3 4,0 0,20 0,25 3,2 3,0 3,8 3,2

Лизин 0,02 0,04 0,06 3,1 2,7 2,0 3,3 2,2 4,0 0,10 0,15 2,0 1,6 3,1 2,3

Фенилаланин 0,10 0,15 0,20 4,5 4.0 3.1 5,2 4,9 4,6 0,30 0,35 2,5 2,0 4,0

Валин 0,10 0,15 0,20 4,5 4.0 3.1 5,0 4,9 4,6 0.30 0,35 2,5 2,0 4,2 3,4

Количественное определение АК в КЖ. АК различных классов: ароматические, основные, неполярные и оксиаминокислоты имеют для каждого вида схожие метаболические пути биосинтеза, приводящие к появлению кроме целевых продуктов сопутствующих АК и побочных соединений. Так, например, анализ КЖ штамма-продуцента триптофана (ароматические АК), показал наличие в ней помимо триптофана следующих аминокислот: фенилаланина, тирозина, лейцина, изолейцина, треонина, валина, гистидина, серина, лизина, гпутаминовой кислоты и аспарапша. Наличие такого количества примесей осложнило задачу полного разделения четырех аминокислот: фенилаланина, триптофана, смеси лейцина и изолейцина в системе "Г" пропанол-2 — 25%-водный аммиак (7:3, у/у). Для избирательного детектирования триптофанаиспользовалимодифицированный реактив Эрлиха: 0,5% этанольный раствор 4-диметиламинобензальдегида, содержащий 5% - концентрированной Н2804. Установлено, что устойчивость окраски пятен на хроматограммах при хранении в темноте сохраняется более 1 года, предел обнаружения составляет 0,05 мкг (табл. 2).

В свою очередь, при выделении фенилаланина в качестве основного продукта, на основании данных аминокислотного анализатора, показано, что фенилаланину сопутствуют следующие побочные продукты: глицин, аланин, тутаминовая кислота, треонин, валин, лейцин, тирозин, триптофан, а также тирамин и триптамин. Для разделения была использована специальная элюирующая система "Б", которая позволила не только отделить пятно фенилаланина (предел обнаружения — 0,009 мкг) от пятен сопутствующих компонентов, но и получить индивидуальные пятна валина, лейцина, триптофана и тирозина. Таким образом, проблема разделения "критической тройки": фенилаланин, тирозин, и триптофан была впервые решена в одномерном варианте.

Для отделения оксиаминокислот (серина, гомосерина и треонина) от метаболитов, присутствующих в КЖ использовали элюенты "А", "Б" и новую подвижную фазу "Д": пропанол-2 — этилацетат — 25% водный аммиак - вода (20:20:1,5:2,5 у/у). Предел обнаружения серина, гомосерина и треонина составляют 0,01; 0,01 и 0,015 мкг, соответственно.

В случае анализа основных АК - (лизина, аргинина и орнитина в промышленных образцах КЖ для четкого хроматографического отделения пятен: лизина (предел обнаружения-0,015 мкг), аргинина (предел обнаружения — 0,01 мкг) и орнитина (предел обнаружения — 0,01 мкг) от сопутствующих в КЖ аминокислот были разработаны специальные элюирующие системы "В" и "Г".

Разработанные методики были аттестованы и включены в НТД этих заводов в качестве унифицированных методик количественного определения в КЖ лизина, гомосерина и треонина (ПО "Прогресс", г. Стегаюгорск) и аргинина и орнитина (ПО "Бердский биохимический завод", г. Бердск).

Хроматографическое определение неполярных АК валина и лейцина осложняется примесью гомолейцина, образующейся в результате дисбаланса в работе ферментных систем рекомбинатных штаммов-продуцентов. Она

должна быть не больше 0,1%, поскольку в процессе выделения гомолейцин сокристаллизуется с целевыми продуктами, что существенно осложняет их очистку. Для разделения целевых продуктов от других АК, содержащихся в КЖ, была использована подвижная фаза "Д" с бинарным элюированием. Проведенные эксперименты показали, что метод ВЭТСХ позволяет обнаружить в образце до 5,0 мг/л гомолейцина на фоне 50-75 г/л валина и 15-20 г/л лейцина; предел обнаружения - 0,02 мкг.

Для подавления биосинтеза гомолейцина в процессе получения лейцина с помощью методов генной инженерии были сконструированы новые штаммы-продуценты с более высокими уровнями накопления лейцина. Однако при анализе КЖ этих продуцентов (элюент "Б") было обнаружено пятно неизвестного соединения с подвижностью выше, чем у лейцина и ниже, чем у гомолейцина. По своей подвижности пятно неизвестного соединения совпадало с удерживанием фенилаланина. Для разделения пятен гомолейцина и неизвестного соединения была использована схема многократного элюирования в изократическом режиме. Так, было проведено 10 ступеней элюирования lj=55 мм ... 110=85 мм, а А1=3,0 мм. В этих условиях удалось осуществить разделение пятен гомолейцина и неизвестного соединения.

При регистрации спектров поглощения неизвестного вещества в УФ области спектра in situ (денситометр "Camag TLC Scanner II") обнаружено, что неидентифицированное соединение обладало УФ спектром, характерным для фенилаланина. Для дополнительной идентификации проведено выделение его из КЖ с помощью колоночной хроматографии и получен ЯМР-'Н спектр фенилаланина, который был также аналогичен спектру стандарта.

Результаты определения основных, ароматических, неполярных и оксиаминокислот, полученные методами ПХ, ВЭЖХ, а также с помощью аминокислотного анализатора хорошо коррелируют друг с другом (табл. 3).

Анализ оснований Шиффа — одного из возможных источников потерь при биосинтезе промы пшенных аминокислот. При биосинтезе АК величины pH ферментационных растворов находятся в интервале от 6,3 до 7,2. В этих условиях возможно образование оснований Шиффа - продуктов конденсации аминогрупп АК с карбонильными группами Сахаров, присутствующих в КЖ. Известно, что основания Шиффа в водных растворах устойчивы в области величин pH 5,5-7,5, поэтому подкисление КЖ, использование подвижных фаз, а также растворов обнаруживающих реагентов, содержащих кислотные или основные ингредиенты, приводит к распаду оснований Шиффа в КЖ. Проведенное хроматографирование модельной смеси (элюент: пропанол-2 - вода, 70 : 30, v/v), состоящей из D-глюкозы и четырех АК (валина, фенилаланина, лизина и серина), после инкубации в течение 3 суток в ферментере при 35-37°С и элюирования показало, что 6,3±0,4% валина, 5,8±0,5% серина, 6,6±0,4% фенилаланина и 11,8±0,4 лизина (п=6, Р=0,95) находятся в связанной сахаром форме в виде основания Шиффа.

На примере нескольких партий сливных КЖ штамма-продуцента валина, выращенного на гаюкозных средах, установлено, что к моменту окончания процесса ферментации от 3,5 до 6,5% целевого продукта находилось в виде

основания Шиффа.

На основании полученных результатов даны рекомендации ПО "Прогресс" (г. Степногорск) о необходимости подкисления сливных КЖ штаммов-продуцентов АК перед проведением выделения и включение этой операции в НТД.

Анализ отходов производства аминокислот. Вследствие того, что объемы КЖ в процессе биохимического синтеза АК очень большие (80-100 м3), даже незначительное сокращение потерь АК в разбавленных отходах (промывные воды посевных аппаратов, ферментеров, выпарных установок и прочего оборудования, разнообразные стоки с ионообменных колонн, конденсаты со стадий упаривания элюатов и т.п.) производства, является важной задачей биохимических производств.

Было проведено определение содержания лизина и треонина в разбавленных стоках методами хроматоденситометрии (ПО "Прогресс"). Благодаря высокой чувствительности метода (предел обнаружения 0,015 мкг) удается достоверно и за короткое время определить АК в разбавленных стоках, которые были сконцентрированы и введены в цикл регенерации.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1 .Разработаны методологические и аппаратурные основы использования комплекса хроматографических методов, позволяющие анализировать сложные полимерные объекты и их фрагменты, в том числе сополимеры, с определением молекулярных и композиционных характеристик методами планарной и двухдетекторной эксклюзионной хроматографии; планарной, эксклюзионной и пиролитической газовой хроматографии; блок-сополимеры с ненасыщеными связями в основной цепи - сочетанием планарной, эксклюзионной жидкостной хроматографиии и озонолиза.

2.Создан комплекс для жидкостной колоночной хроматографии высокого давления, включающий оптимизированные жидкостные хроматографы, высокоэффективные хроматографические колонки с линейной калибровочной зависимостью для эксклюзионной хроматографии в диапазоне молекулярных масс 103-И О7 дальтон и микро сферическими силикагелями с большим объемом пор (до 2 см3/г) и повышенной гидролитической стабильностью, позволяющий анализировать сложные синтетические и природные соединения.

3.Разработан электрогидродинамический способ размола кремнеземов, позволяющий получать хроматографические сорбенты с высоким выходом целевых фракций без изменения пористой структуры.

4.Проведенные комплексные хроматографические исследования молекулярных и композиционных характеристик блок-сополимеров позволили установить:

- условия синтеза узкодисперсных полистирольных стандартов для эксклюзионной хроматографии и узкодисперсных блок-сополимеров стирола и бутадиена;

- повышение активности "живущих" анионных цепей в неполярных растворителях в ряду ассоциированной, закомплексованной сильным электронодонором и мономерной форм, позволяющее регулировать полидисперсность и молекулярно-массовое распределение конечных полимеров;

- условия получения блок-сополимеров стирола и метилметакрилата с заданнохт "архитектурой" путем регулирования процесса радикальной полимеризации и обрыва цепи по тагу рекомбинации или по механизму диспропорционирования;

- повышенную устойчивость активных центров при катионной полимеризации диметоксиэтилена и винилбензилового эфира, приводящую к получению блок-сополимеров высокой молекулярной массы.

5.Сформулированные закономерности эксклюзионной хроматографии полиамидокислот ПАК-ПМ, учитывающие полиэлектролитное набухание, ионную эксклюзию и изменение проницаемости макромолекулярных клубков, позволяют определять и рассчитывать молекулярные характеристики полиамидокислотметодом ЭЖХ. Впервые разработанные методы градиентной хроматографии позволили определять микропримеси в мономерах ПАК-ПМ и их влияние на молекулярные массы полученных из этих мономеров полиамидокислот.

6.Выявлены основные факторы, определяющие эффективность количественного анализа белковых аминокислот методом хроматоденситометрии:

- найдены условия прямого разделения 23 свободных аминокислот методами двумерной и одномерной планарной хроматографии;

- создан способ разделения и количественного анализа аминокислот в биологических жидкостях для диагностики наследственных заболеваний; разработаны методы контроля процесса биохимического синтеза аминокислот на отечественных микробиологических производствах с использованием созданного комплекса планарной хроматографии.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Davigjan А., Nikolaev N., Sgonnik V., Belenkii В., Nesterov V., Krasikov V., Erussalimsky В. Subkatalitische Effekte in Systemen Isopren/ Oligoisoprenilithium N,N,N',N'- Tetramethylendiamin // Makromol. Chem. -1978. -№179. -S. 2155-2160.

2. Нестеров B.B., Красиков В.Д., Чубарова E.B., Туркова Л.Д., Ганкина Э.С., Беленький Б.Г. Определение методом гель-проникающей хроматографии молекулярно-массового распределения и распределения состава по молекулярной массе блок-сополимеров // Высокомолекулярные соединения. 1978. сер.А. Т.20. № 10. С. 2320-2335.

3. Davidjaan N., Nikolaev N., Sgonnik V., Krasikov V., Belenkii В., Erussalimskii B. Subkatalitische Effekte im Systemen Isopren Organolithium /

Elektronendonator, 1,2-Dimethoxyethan // Makromol. Chem. 1981. №182. S. 917-920.

4. Erussalimsky В., Belenkii В., Davidjan A., Nesterov V., Krasikov V., NikolaevV.,SgoniùkV.,SergutinV.SubcataliticefiFectsintheanionic polymerization processes // Abstracts of the 27 th Intern. Symp. on Macromolecules./ Strasbourg, 1981. V. 1. P. A182-A185.

5. Нестеров B.B., Красиков В.Д., Чубарова E.B. Иследование блок-сополимеров методом двухдетекторной хроматографии ГПХ и озонолиза // Всесоюзный симпозиум по молекулярной житкостной хроматографии : Сб. науч. докл./Черноголовка, 1982. С. 7.

6. Нестеров В.В., Чубарова Е.В., Красиков В.Д., Вензель Б.И., Лупал С.Д., Беленький Б.Г. Влияние объёма пор и методика дробления на хроматографические свойства макропористых стёкол //Журнал аналитической химии. 1982. т. 37. №9. С. 1665-1669.

7. Нестеров В.В., Красиков В.Д., Чубарова Е.В., Беленький Б.Г. Исследование блок-сополимеров методом гель-проникающей хроматографии //Высокомолекулярные соединения. 1982. т. 24. № 6. С. 1330-1335.

8. Нестеров В.В., Замойская Л.В., Красиков В.Д., Мартьянова Г.П. Исследование блок-сополимеров полистирола-полиметилметакрилата с помощью высокоэффективной гель-проникающей хроматографии // Высокомолекулярные соединения. 1983. Т. 25. №12. С. 2561-2567.

9. Нестеров В.В., Красиков В.Д., Згонник В.Н., Меленевская Е.Ю., Кошелева И.В., Беленький Б.Г. Исследование блок-сополимеров полистирола и полибутадиена методом гель-проникающей хроматографии и озонолпза // Высокомолекулярные соединения. 1983. Т. 25. № 12. С .2568-2574.

10. Ерусалимский Б.Л., Давидян A.A., Николаев Н.И., Згонник В.Н., Беленький Б.Г., Нестеров В.В., Красиков В.Д., Кононенко И.Л. Полимеризация в системе бутадиен-стирол под действием литий-органических активных центров в присутствии субкаталитических количеств тетраметилэтилендиамина // Высокомолекулярные соединения. 1983. Т. 25. №10. С. 2121-2125.

11. Красиков В.Д., Нестеров В.В., Жданов С.П., Вензель Б.И., Виленчик Л. 3., Куренбин О.И., Жмакина Т.П., Беленький Б.Г. Кремнезёмный сорбент для гель-проникающей хроматографии с линейной калибровочной зависимостью // Высокомолекулярные соединения. 1984. Б-26. №3. С. 163-167.

12. Красиков В.Д., Згонник В.Н., Меленевская Е.Ю., Нестеров В.В. О роли ассоциированных форм полибутадиениллтиевых цепей в процессах гомо- и сополимеризации // IV Международный симпозиум по гомогенному катализу: Сб. науч. докл. / Ленинград, 1984. Т. 3. С. 61-62.

13. Красиков В.Д, Нестеров В.В. Исследование молекулярных характеристик блок-сополимеров полиметоксиэтиленаполпвинилбензилово го эфира с помощью ВЭЖХ // III Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии: Сб. науч. докл. / Рига, 1984. С. 89.

14. Stepanov V.V., Barantseva A.R., Krasikov V.D., Nesterov V.V., Skorokhodov S.S. Untersuchung des Verhaltens von Poly (dimethoxyethylen) bei

der Copolymerisation mit Vinylether (E) // Acta Polymerica. 1985. В 36. № 11. S. 605-609.

15. Stepaiiov V. V., Barantseva A.R., Krasikov V.D., Nesterov V. V. Die Reaction von Polysteren-Makroanionen mit Poly (dimethoxy-ethylen)-Makrokationen (E) // Acta Polymerica. 1985. В 36. №11. S. 609-612.

16. Кудрявцев В. В., Склизкова В. П., Виленчик Л. 3., Котон М. М., Беленький Б. Г., Нестеров В. В., Красиков В. Д. Хроматографическое исследование процессов синтеза и старения полиамидокислоты в условиях неэквивалентности функциональных групп // Известия Академии наук СССР. Сер. хим.. 1986. № 2. С. 356-360.

17. Skorokhodov S. S., Stepanov V. V., Nesterov V. V., Krasikov V. D. Synthesis of Poly (cis-1, 2-dimethoxyethylene of very high molecylar weight // Acta Polymerica. 1986. B. 37. №9. P. 583-587.

18. Krasikov V. D., Zgonnik V. N., Melenevskaya E. Yu., Nesterov V. V. The significance of associated forms of poly (dienyllithium) chains in homo- and copolymerizat // Matereal of IV International Symp. of Gomogen Catalisis, Gardon 8 Breach Science Pube., Inc. /New York, 1986. V. 3. P. 1047-1054.

19. Krasikov V.D., Nesterov V.V, Belenkii B.G. Application of HPLC for investigation of Blok, Random and Multiblok Butadiene and Styrene Copolymers // Abstracts of the international confirense "New Advances in Liguid Chromatography". / Balaton-Ste'plak, Hungary, 1986. P. 51.

20. Nesterov V.V., Kurenbin 0.1., Krasikov V.D., Belenkii B.G. Determination of Molecular-Weght Distribution and Averege Molecular Weghts of Blok Copolumers by Gel-Permiation Chromatography // Talanta. 1987. V. 34. № 1. P. 161-165.

21. Красиков В.Д., Старцев В.М., Чугунова Н.Ф., Морозова Н.И., Нестеров В.В., Огарёва В.А. Об изменениях реологических свойств и молекулярной массы полиамидокислоты в процессе её термической имидизации // Высокомолекулярные соединеня. 1987. Т. 24А. № 3. С. 458.

22. Сигов О.В., Зеленова О.А., Нестеров В.В., Красиков В.Д., Чубарова Е.В., Афанасьев Ф.П., Соколов М.И. Определение молекулярно-массового распределения бутадиен-стирольных термоэластопластов методом двухдетекторной гель-проникающей хроматографии // НТИС "Промышленность синтетического каучука". 1987. №3. С. 15-17.

23. Красиков В.Д., Нестеров В.В., Виленчик Л.З., Беленький Б.Г., Кудрявцев В.В., Склизкова В.П., Бельникевич Н.Г., Котон М.М., Пиляева В.Ф. Высокоэффективная эксклюзионная жидкостная хроматография полиамидокислот // Журнал прикладной химии. 1988. №9. С. 2080-2085.

24. Krasikov V.D., Macko Т., Berek D. Changes of Composition of Adsorbed Lagers on Solid-Application on HPLC Column Testing // Abstracts of the IUPAC International Symp. on Surface Chemistry, Adsorption and Chromotography./ Moscow. 1988. P. 14.

25. Нестеров B.B., Красиков В.Д., Беленький Б.Г., Зшнник В.Н., Ерусалимский Б.Л. Применение метода высокоэффективной эксклюзивной

хроматографии к исследованию блок-статистических и мультиблочных сополимеров // Высокомолекулярные соединения! 1989. Т. 31 А. № 1. С. 204-208.

26. ВиленчикЛ.З.,БудговВ.П.,НестеровВ.В.,КрасиковВ.Д.,Бельникевич

H.Г., Беленький Б.Г. Корреляция между вязкостными константами уравнений Хаггинса и Марка-Куна-Хаувшпса и ее использование для анализа полимеров // Высокомолекулярные соединения. 1989. Т. 31. №2. С. 114-116.

27. Нестеров В.В., Мальцев В.Г., Красиков В.Д., Беленький Б.Г. Новые хроматографические колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии синтетических полимеров и биополимеров // Журнал физической химии. 1991. Т. 65. №10. С.2717-2723.

28. Krasnoselskaya I.G., Krasikov V.D., Vinogradova L.V., Baranovskaya

I.A., Klenin S.I., Eiyssalimsky B.L. Molecular Structure of Branched Polymers Formed in the Anionic Polymerization of Acrylonitrile in the Presence of Catalytic Amounts of 2-Vinylpyridine // Macromolecular Reports. 1991. A 28 (suppi, 2). P. 121-128.

29. АбилевС.К., Вайсбург А.Ф., ДегтярьВ.Г., ЕжоваИ.Е., Лукина Г.П., Тарасов А.П., Дегтерев Е.В., Крылов В.М., Новицкий А.П., Полубенцева М. И., Малахова И. И., Красиков В. Д. Видеоденситометр "Денсискан-Г' для количественной тонкослойной хроматографии // Биотехнология. 1993. № 5. С. 44-47.

30. Малахова И.И., Тяглов Б.В., Дегтерев Е.В., Красиков В.Д. Тонкослойная хроматография основных аминокислот в применении к экспресс - диагностике фенилкетонурии и других аминоацидурий // VI Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии: Сб. науч. докл./ Москва, 1993. С. 13.

31. Дегтерев Е.В., Деггярь В.Г., Вайсбург А.Ф., Красиков В.Д., Крылов

B. М., Малахова И.И., Тарасов А.П., Тяглов Б.В. Количественное определение L-тршггофана методом хроматоденситометрии пластинок // Химико фармацевтический журнал. 1994. №4. С. 52-55.

32. Degtiar W.G., Tyaglov B.V., Degterev E.V., Krylov V.M., Malakhova I.I., Krasikov V.D. Quantitative analysis of L-Lysine, L-Threonine, L-Homosire and Cobalamines in Fermentation Broths // Jornal of Planar Chromatography. 1994. Vol. 7. P. 54-57.

33. Malakhova I.I., Belenkii B.G., Gankina E.S., Krasikov V.D. Separation of blok copolymers in TLC by using exclusion (gel-permeation) adsorption of extraction-precipitative mechanisms // Abstracts of the Eighteenth Intemation Symposium on Column Liquid Chromatography./ Minnesota, 1994. P. 137-138:

34. Малахова И.И., Тяглов Б.В., Дегтерев E.B., Красиков В.Д. Количественная тонкослойная хроматография аминокислот//Между народный симпозиум "Хроматография и спектроскопия в анализе объктов окружающей среды и токсикологии" / ISCSE' 96 /: Сб. науч. докл. / Санкт-Петербург, 1996.

C. 184.

35. Degterev E.V., Degtiar W.G., Polanuer В.М., Tyaglov B.V., Krylov V.M., Malakhova 1.1., Krasikov V.D. Quantitative Analisis of L-Triptophan in

Fermentation Broths // Jornal of Planar Chromatography. 1996. V. 9. P. 35-38.

36. Malakhova I.I., Tyaglov B.V., Degterev E.V., Krasikov V.D., Degtiar W.G. Quantitative Thin-Layer Chromatography of lndastrial Amino Acids //Jomal of Planar Chromatography. 1996. Y. 9, P. 375-378.

37. Малахова И.И., Красиков В.Д., Дегтерев E.B., Кузнецов Э.В., Тяглов Б.В. Тонкослойная хроматография свободных аминокислот. Подбор условий для разделения L-лизина, L-гомосерина и L-треонина // Биотехнология. 1996. № 11. С. 27-32.

38. Буриков Э. А., Гусятинер М.М., Кузнецов Э.В., Иванов C.B., Полануер Б.М., Тарасов А.П., Тягаов Б.В., Дегтерев Е.В., Шабайкина М.Г., Малахова И.И., Красиков В.Д. Сравнение методов хроматографического определения L-серина в ферментативных растворах // Биотехнология. 1996. № 9. С. SI-SX

39. Красиков В.Д., Малахова И.И., Герасимов A.B. Денситометры на основе сканирующих устройств для тонкослойной хроматографии и электрофореза // Всероссийская конференция "Химический анализ веществ и материалов": Сб. науч. докл. / Москва, 2000. С. 3.

40. Малахова И.И., Красиков В.Д. Количественная ТСХ свободных аминокислот и их ДНС-проговодных в образцах животного происхождения // VIII Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу: Сб. науч. докл. / Москва, 2001. С. 31.

41. Красиков В.Д. Высокоэффективная количественная тонкослойная хроматография // Всероссийский симпозиум "Современные проблемы хроматографии": Сб. науч. докл. / Москва, 2002. С. 11.

42. РашидоваС.Ш., ЗалялиеваC.B., Шпигун O.A., Красиков В. Д., Кабулов Б.Д. Гидролитически стабильные цирконилсодержащие микросферические силикагели для ВЭЖХ // Международный симпозиум "Разделение и концентрирование в аналитической химии": Сб. науч. докл. / Краснодар,

2002. С. 104.

43. Малахова И.И., Красиков В.Д. Современная высокоэффективная тонкослойная хроматография // Лабораторный журнал. 2002. №1. С. 30-31

44. Degterev E.V., Tyaglov B.V., Malakhova I.I., Krasikov V.D. Quantitative Analysis of L-Serine in Cultural Fluids // Abstracts of the International confirence "Planar Chromatography 2002". / Heviz, 2002. P. 197-204.

45. Красиков В.Д. Современная тонкослойная хроматография // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: Сб. науч. докл. / Казань,

2003. С.521.

46. Беленький Б.Г., Гурковская Е.А., Коган Ю.Д., Красиков В.Д., Тонкослойная хроматография в России //100 лет хроматографии. Москва, 2003. С. 61-99.

47. Дегтерев Е.В., Тяглов Б.В., Красиков В.Д., Малахова И.И., Гаевский А. В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе биологически активных веществ // 100 лет хроматографии. Москва, 2003. С. 233-268.

48. Красиков В.Д. Современная планарная хроматография // Журнал аналитической химии. 2003. Т. 58. № 8. С. 792-807.

49. Krasikov V.D., Malakhova I.I., Degterev E.V., Tyaglov B.V. Planar Chromatography of Free Industrial Amino Acids // Jornal of Planar Chromatography. 2004. V. 17. P. 113-122.

50. Красиков В.Д., Малахова И.И. Метод планарной хроматографии в количественном определении свободных аминокислот в ферментационных растворах промышленных штамм-продуцентов // Журнал прикладной химии. 2004. Т. 77. Вып. 6. С. 919-928.

51. Тяшов Б.В., Дегтерев Е.В., Заика А.И., Сизова И.А., Малахова И.И., Красиков В.Д. Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография в промышленной биотехнологии // Всероссийский симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы": Сб. науч. докл. / Москва, 2004. С.68.

52. Красиков В.Д., Малахова И.И., Тяглов Б.В. Особенности разделения и концентрирования органических соединений методом • планарной хроматографии // II Международный симпозиум "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии": Сб.науч. докл. / Краснодар, 2005. С. 194-195.

53. Красиков В.Д., Малахова И.И., Беленький Б.Г. Жидкостная хроматография "сложных" полимерных веществ // II Международный симпозиум "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии": Сб. науч. докл. / Краснодар, 2005. С. 193-194.

54. Красиков В. Д. Основы планарной хроматографии. Санкт-Петербург: Химиздат, 2005. 232 с.

ПАТЕНТЫ

1. А. С. 1037938 // Композиция для жидкостной хроматографии полимеров. // Красиков В.Д., Вштенчик JI.3., Куренбин О.И., Жмакина Т.П., Нестеров В.В., Беленький Б.Г., Жданов С.П., Вензель Б.И. // Б.И. №32, 1983.

2. А. С. 1453320 // Способ хроматографического анализа ароматических аминов. // Красиков В.Д., Нестеров В.В., Виленчик Л.З., Беленький Б.Г., Склизкова В.П., Кудрявцев В.В., Котон М.М. // Б.И. №3, 1989.

3. Патент РФ № 2078342 // Способ разделения аминокислот в биологических жидкостях. // Тяшов Б.В., Дегтерев Е.В., Малахова И.И., Красиков В.Д. Помазанов В.В. // Б.И. №12, 1997.

4. Патент РФ № 2095808 // Способ разделения и детектирования аминокислот. // Малахова И.И., Красиков В.Д., Тяглов Б.В., Дегтерев Е.В. // Б.И. №3, 1989.

Использованные сокращения:

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ТСХ - тонкослойная хроматография

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография

ЭЖХ - эксклюзионная жидкостная хроматография

ПГХ — пиролитическая газовая хроматография

ПХ — планарная хроматография

ММ — молекулярные массы

ММР — молекулярно - массовое распределение

СММ - средняя молекулярная масса

РСМ — распределение состава по молекулярной массе

АК — аминокислоты

ПАК — полиам идо кислоты

ПАК-ПМ - ПАК, синтезированные на основе ПМДА

ПМДА — пиромеллитовый диангидрид

МПС - макропористые стекла

БС — блок-сополимеры

ЭГУ — электрогидроудар

М-К-Х — константы уравнения Марка-Куна-Хаувинка

ПС - полистирол

ПБ — полибутадиен

ПММА — полиметилметакрилат

ТГФ — тетрагидрофуран

БЛ — бутиллий

ПБЛ — полибутадиениллитий

ЦГ - циклогексан

ОБЛ — олигобутадиениллитий

ПСЛ — полистиролий

ТМЭД — тетраметилэтилендиам1ш

ПСА1 — полистиролалюминий

ПДМЭ — полидиметоксиэтилен

ПВБЭ - поливинилбензиловый эфир

ДМЭ — диметоксиэтилен

ДМФ — диметилфармамид

ПМДА — шфомеллитовый диангидрид

ДАДФЭ — диаминдифениловый эфир

НДО — наследственные дефекты обмена

КЖ — ьультуральные жидкости

НТД — нормативно-техническая документация

Подписано в печать 01 февраля 2006г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 234 Типография "Радиус +"

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Хроматографические методы исследования сополимеров.

2.1.1. Особенности эксклюзионной жидкостной хроматографии полимеров.

2.1.2. Универсальная калибровочная зависимость в эксклюзионной жидкостной хроматографии.

2.1.3. Структура макромолекул блок-сополимеров в разбавленных растворах.

2.1.4. Исследование сополимеров методами жидкостной хроматографии.

2.2. Планарная хроматография аминокислот.

2.2.1. Выбор хроматографического метода для разделения аминокислот.

2.2.2. Выбор условий для разделения аминокислот в тонких слоях силикагеля.

2.2.3. Окрашивание хроматограмм.

2.2.4. Количественная обработка результатов методом денситометрии.

2.2.5. Валидация хроматографческих методов анализа.

3. Приборно-методический комплекс для ВЭЖХ.

3.1. Хроматографический комплекс для высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3.1.1. Высокоэффективные хроматографические колонки для ВЭЖХ синтетических и природных полимеров. Колонки высокого давления для ВЭЖХ.

3.1.2. Упаковка хроматографических колонок.

3.1.3. Оценка эффективности хроматографических колонок.

3.1.4. Хроматографические сорбенты для ВЭЖХ сополимеров.

3.1.4.1. Выбор сорбента для ВЭЖХ сополимеров.

3.1.4.2. Кремнеземные сорбенты для ВЭЖХ на основе макропористых стекол.

3.1.4.3. Размол и фракционирование кремнеземных сорбентов.

3.1.4.4. Кремнеземный сорбент для ВЭЖХ с линейной молекулярно-массовой зависимостью.

3.1.4.5. Микросферический силикагель с большим объемом пор.

3.1.4.6. Повышение гидролитической стабильности кремнеземных сорбентов.

3.1.5. Хроматографические колонки для ВЭЖХ синтетических полимеров и биополимеров на основе МПС.

3.1.6. Полимерные стандарты для ВЭЖХ.

3.1.7. Пиролитическая газовая хроматография.

3.1.8. Озонолиз непредельных органических соединений в блок-сополимерах.

3.2. Приборно-методический комплекс для высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

3.2.1. Хроматографический комплекс для количественной тонкослойной хроматографии (ТСХ).

3.2.2. Выбор оптимальных условий проведения ТСХ-анализа с последующим количественным определением методом денситометрии.

3.2.3. Анализ погрешностей в планарной хроматографии (денситометрия и видеоденситометрия).

4. Анализ молекулярной неоднородности блок-сополимеров с помощью эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ).

4.1. Расчет молекулярно-массового распределения (ММР) блок-сополимеров с помощью ЭЖХ.

4.2. К вопросу о погрешностях определения ММР блок-сополимеров с помощью ЭЖХ.

4.3. Определение ММР и функции распределения состава по молекулярной массе (РСМ) блок-сополимеров сочетанием методов ЭЖХ, ПГХ и ТСХ.

4.4. Определение ММР и функции РСМ блок-сополимеров методом двухдетекторной ЭЖХ.

4.5. Исследование блок-сополимеров стирола и бутадиена методами ВЭЖХ и озонолиза.

4.6. Применение двухдетекторной ВЭЖХ для исследования молекулярных, композиционных и архитектурных параметров блок-сополимеров.

4.7. Применение ВЭЖХ к исследованию мультиблочных сополимеров бутадиен-стирол, полученные анионной сополимеризацией в присутствии сильных электроннодонорв.

4.8. Особенности эксклюзионной жидкостной хроматографии промышленных полимеров и сополимеров.

5. Высокоэффективная эксклюзионная жидкостная хроматография полиамидокислот.

5.1. Особенности гидродинамического поведения полиамидокислот в разбавленных растворах.

5.2. Влияние микропримесей в мономерах на молекулярные характеристики полиамидокислот.

5.3. Исследование процессов синтеза и старения полиамидокислоты в условиях неэквивалентности функциональных групп.

6. Планарная хроматография.

6.1. Планарная хроматография сложных полимерных систем.

6.2. Прямое разделение многокомпонентных смесей аминокислот сочетанием вариантов двумерной и одномерной тонкослойной хроматографии (ТСХ).

6.3. Анализ аминокислот в биологических жидкостях.

6.4. Изучение применимости метода ТСХ для количественного определения аминокислот в культуральных жидкостях промышленных штаммов-продуцентов.

6.5. Анализ аминокислот в культуральных жидкостях.

6.5.1. Анализ оксиаминокислот серина, гомосерина и треонина, а также сопутствующих им в КЖ аминокислот.

Выбор условий разделения и количественное определение серина и сопутствующих ему аминокислот в КЖ штамма-продуцента серина.

6.5.2. Анализ гомосерина и сопутствующих аминокислот в КЖ штамма-продуцента гомосерина.

6.5.3. Количественное определение треонина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот.

6.5.4. Количественное определение ароматических аминокислот-триптофана и фенилаланина в образцах КЖ.

6.5.4.1. Разработка методов количественного определения триптофана.

6.5.4.2. Анализ фенилаланина в культуральных жидкостях.

6.5.5. Анализ основных аминокислот - лизина, аргинина и орнитина в промышленных образцах КЖ.

6.5.5.1. Применение методов хроматоденситометрии и ВЭЖХ для определения содержания лизина в КЖ.

6.5.6. Количественное определение аргинина, орнитина и с опутствующих им аминокислот в КЖ штамма-продуцента аргинина.

6.5.7. Количественное определение неполярных аминокислот валина и лейцина в КЖ штамма-продуцента валина.

6.5.7.1. Анализ валина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот.

6.5.7.2. Количественный анализ лейцина и сопутствующих ему соединений КЖ штамма-продуцента лейцина.

6.5.8. Основания Шиффа - один из возможных источников потерь при биосинтезе промышленных аминокислот.

6.5.9. Анализ отходов производства аминокислот.

7. Выводы.

8. Литература.

Использованные сокращения:

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ТСХ - тонкослойная хроматография

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография

ЭЖХ - эксклюзионная жидкостная хроматография

ПГХ - пиролитическая газовая хроматография

УКЗ - универсальная калибровочная зависимость Бенуа

ПХ - планарная хроматография

ММ - молекулярные массы

ММР - молекулярно - массовое распределение

СММ - средняя молекулярная масса

РСМ - распределение состава по молекулярной массе

КН - композиционная неоднородность

• АК - аминокислоты ПАК - полиаминокислоты

ПАК-ПМ - ПАК, синтезированные на основе ПМДА

МПС - макропористые стекла

БС - блок-сополимеры

ПС - полистирол

ПБ - полибутадиен

ПММА - полиметилметакрилат

ТГФ - тетрагидрофуран

БЛ - бутиллий

ПБЛ - полибутадиениллитий

ЦТ - циклогексан

ОБЛ - олигобутиллий

ПСЛ - полистириллитий

ТМЭД - тетраметилэтилендиамин

ПСА1 - полистиролалюминий

ПДМЭ - полидиметоксиэтилен

ПВБЭ - поливинилбензиловый эфир ДМЭ - диметоксиэтилен

ДМФ - диметилформамид

ПМДА - пиромеллитовый диангидрид

ДАДФЭ - диаминдифениловый эфир

НДО - наследственные дефекты обмена

КЖ - культуральные жидкости

ЭГУ - электрогидроудар

НТД - нормативно-техническая документация

КЖ - культуральные жидкости

Наука движется толчками, в зависимости от успехов, делаемых методикой. С каждым шагом методики вперед мы как бы поднимаемся ступенью выше, с которой открывается нам более широкий горизонт с невидимыми ранее предметами", - так высоко оценивал И. П. Павлов значение экспериментальных методов в научных исследованиях. Вышесказанное прекрасно иллюстрируется на примере хроматографии, открытой в начале прошлого века русским ученым М. С. Цветом [1]. Успешное развитие таких новых направлений, как молекулярное биология, биоорганическая и медицинская химия, контроль производственных процессов, готовой продукции и на этой основе дальнейшее развитие химической, нефтехимической и фармацевтической промышленности, получение особо чистых веществ (включая биополимеры и биологически активные вещества) стало возможным, прежде всего, в результате широкого использования жидкостной хроматографии (ЖХ).

ЖХ является в настоящее время одним из наиболее эффективных и универсальных физико-химических методов анализа и фракционирования синтетических и природных соединений. Стремительный поворот в развитии этого метода (часто называемый "революцией" в ЖХ [2]) начался с 70-х годов, когда Гиддингс показал [3], что к этому виду хроматографии применим теоретический аппарат газовой хроматографии, хорошо развитый к этому времени. Тонкослойная хроматография (ТСХ), являющаяся разновидностью ЖХ на открытом слое сорбента, хотя и была открыта в 1938 г. [4], широкое распространение тоже получила в 60-х годах после работ Шталя [5] и Кирхнера [6].

Успехи в области анализа и фракционирования природных и синтетических полимеров связаны с открытием в это же время Поратом и Флодиным [7] гель-проникающей хроматографии (ГПХ), или, как сейчас более называют, эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ). Для анализа синтетических полимеров ЭЖХ была введена в практику исследовательских и промышленных лабораторий в 1964 году Муром [8]. В 1968 году Б. Г. Беленький [9] и Иногаки [10] одновременно предложили использовать ТСХ для анализа полимеров.

Бурное развитие этих методов обусловлено несколькими причинами. Во-первых, метод ЭЖХ является более экспрессным и простым по сравнению с традиционными методами анализа молекулярных характеристик полимеров [11-18] и позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. Во-вторых, доступность серийных жидкостных хроматографов дало возможность широкого использования метода ЭЖХ [18-36]. Кроме того, ЭЖХ обладает преимуществами над другими видами жидкостной хроматографии, так благодаря особенности механизма разделения, определяемого чисто энтропийными взаимодействиями в системе полимер-растворитель-инертное макропористое тело (сорбент), ЭЖХ применяется для фракционирования по размерам молекул, независимо (при надлежащем выборе рабочих параметров) от их химического строения. Это положение, впервые сформулированное и экспериментально проверенное Бенуа с сотр. [25], используется для интерпретации данных ЭЖХ в молекулярно-массовые распределения (ММР) полимеров. В третьих, разработка теоретических и экспериментальных основ по высокоэффективной ТСХ [21, 22, 37] и основных приборов и оборудования для проведения количественной ТСХ [38, 39], позволили выдвинуть этот метод в число современных, инструментальных методов исследования высокомолекулярных, природных и синтетических соединений и их фрагментов [40]. Кроме того, работы ряда исследователей показали, что в ТСХ можно реализовать не только адсорбционном (АТСХ), осадительном (преципитационном) (ОТСХ), экстракционном (ЭТСХ), но и эксклюзионном (ЭТСХ) вариантах [18, 21, 22, 41-45].

В настоящее время ЭЖХ является вполне установившимся методом определения ММР гомополимеров, войдя в число классических методов исследования макромолекул, таких как светорассеяние, осмотические методы и гидродинамические методы [11-20]. Определение ММР для так называемых "сложных" полимерных систем - прежде всего, сополимеров и полиэлектролитов является более трудоемкой задачей. Основной причиной этого является сосуществование для сополимеров двух видов неоднородности макромолекул: по молекулярной массе (ММ) и по их составу [24, 25, 27-29, 46, 47]. Анализ молекулярных характеристик полиэлектролитов методом ЖХ осложняется полиэлектролитным набуханием макромолекул, ионной эксклюзией, повышенной адсорбционной активностью и протекаемостью макромолекулярных клубков в разбавленных растворах (реализуемых в ЖХ) [48, 50].

Проблемы определения ММР гомополимеров и сополимеров не являются фундаментально различными. Однако, различные физико-химические методы по-разному детектируют флуктуации в составе сополимера и могут оказаться малопригодным для получения точной информации о ММР и композиционной неоднородности (КН) образцов. Так, например, такие широко применяющиеся методы определения брутто-состава, как микроструктурный анализ и спектроскопия ЯМР высокого разрешения [46, 51], не дают детального представления о КН сополимеров. Фракционирование по составу осложняется соосаждением или сорастворением одного или нескольких компонентов [52, 53], что делает метод непригодным для этой цели. Были достигнуты определенные успехи в исследовании сополимеров методами светорассеяния (с использованием нескольких растворителей) [6, 8, 29, 32, 33] и равновесной седиментации в градиенте плотности [12, 54, 55]. Необходимо отметить, что эти методы длительны и трудоемки, зачастую обладают низкой чувствительностью и сложностью количественной интерпретации результатов [11-13, 47, 51, 54, 55].

В одной из работ в области анализа сополимеров [51] указывается, что легче установить форму равновесного седиментационного профиля, исходя из знания КН образца, чем решить обратную задачу. Положение осложняется еще и тем, что КН блок-сополимеров не может быть описана при помощи теории аддиционной полимеризации [51, 55-57].

В связи с возрастающим практическим интересом к использованию сополимеров все больше возникает необходимость разработки простых, экспрессных и точных методов определения их ММР и КН как главных параметров, позволяющих установить связь конечных свойств полимерного материала и технологии его переработки с кинетикой и механизмом сополимеризации. Указанная задача может быть решена посредством определения ММР гомополимеров хроматографическими методами.

Метод ЭЖХ позволяет решить задачу определения ММР и распределения состава по молекулярной массе (РСМ) сополимеров. Эта задача может быть решена как с помощью ЭЖХ, так и при использовании других хроматографических методов с присущей им экспрессностью. Необходимо помнить, что полученная на основании данных ЭЖХ функция РСМ не дает полную информацию о неоднородности составах. [24, 25]. Тем не менее, рассчитываемое на основе ЭЖХ истинное ММР блок-сополимеров с учетом РСМ является ценным как с точки зрения детальной информации о сополимеризации, так и свойств полимерных материалов.

В последнее десятилетие значительно повысился уровень развития и технического оснащения и развития химической, фармацевтической и медицинской промышленностей, что привело не только к повышению требований к техническим характеристикам приборов, но и стандартизации и валидации методик анализа. Поэтому потребовалось расширить диапазон используемого в этих областях метода планарной хроматографии -количественной, инструментальной, высокоэффективной ТСХ, не только для анализа синтетических полимеров и их фрагментов, но и природных и синтетических низкомолекулярных компонентов белков - аминокислот (АК). Развитие ТСХ важно и для внедрения современных валидных методов анализа в практику промышленного, крупнотоннажного микробиологического синтеза АК.

Аминокислоты являются основным строительным материалом для синтеза специфических тканевых белков, ферментов, пептидных гормонов и других физиологически активных соединений. Часть аминокислот (аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, глутамин, глутаминовая кислота, пролин, серии, тирозин и цистеин) синтезируются в организме человека. Это, так называемые, заменимые аминокислоты. Другие, относящиеся к незаменимым аминокислотам (аргинин, валин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин и гистидин), организмом не синтезируются и поступают внутрь организма с пищей.

Аминокислотам принадлежит большая роль в современной фармакологии. Они имеют большое функциональное значение не только как структурные элементы белков и других эндогенных соединений. Некоторые из них выступают в качестве нейромедиаторных веществ (глутаминовая и аспарагиновая кислоты, глицин, таурин, у-аминомасляная кислота и др.). Фенилаланин и тирозин являются предшественниками в биосинтезе дофамина, норадреналина и адреналина; триптофан - предшественником серотонина, а гистидин - предшественником гистамина. Производными аминокислот являются энкифалины, эндорфины, динорфины и другие нейропептиды.

Некоторые аминокислоты (глутаминовая, у-аминомасляная, глицин, ме-тионин, гистидин, цистеин и таурин) нашли самостоятельное применение в качестве лекарственных средств, синтезируемых с помощью аминокислот. Например, даралгин (тирозил-р-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин) применяется в качестве лечебного средства при обострениях язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки; каптоприл - 1-[(28)-3-меркапто-2-метилпропионил]-Ь-пролин используется для лечения гипертонической болезни и застойной сердечной недостаточности; тимоген (глутамил-триптофан)-иммуностимулятор [58].

Специальное значение имеют смеси аминокислот, используемые в качестве средств для парентерального питания. К другим областям применения аминокислот можно отнести использование их в качестве пищевых [59-61] и кормовых добавок [62]. В настоящее время, как и ранее, чистые аминокислоты получают и получали с помощью микробиологического синтеза [59-60]. Актуальной задачей для современного здравоохранения является диагностика аминоацидурий, наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена аминокислот. Анализ АК, их количества и качества, ответственных за возникновение различных отклонений в организме, является одним из наиболее информативных подходов в клинической и лабораторной диагностике [63].

При производстве чистых АК разработка процесса микробиологического синтеза включает в себя ряд ступеней, которые можно разделить на четыре группы:

1. Создание штаммов-продуцентов аминокислот с использованием методов классической генетики и селекции, а также генной инженерии.

2. Выбор условий их культивирования с учетом физиологических особенностей микроорганизмов, доступности сырья, уменьшения времени процесса ферментации, повышения накопления целевого продукта при одновременном снижении накопления побочных веществ.

3. Выбор методов выделения и очистки основного продукта, а в некоторых случаях и побочных продуктов, представляющих интерес.

4. Исследование стоков и выбросов, образующихся в результате не только процесса культивирования, но и очистки.

На всех этих этапах методы аналитического контроля играют первостепенную роль.

КЖ штаммов-продуцентов аминокислот представляют собой сложные смеси, содержащие компоненты исходной питательной среды; продукты их модификации, образующиеся в процессе стерилизации; клетки микроорганизмов, их фрагменты; высокомолекулярные соединения (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т.д.); низкомолекулярные соединения (аминокислоты, олигонуклеотиды, углеводы, окси- и кетокислоты и т. д.); продукты неэнзиматических процессов, протекающих при ферментации (пигменты, основания Шиффа и т. д.); а также неорганические соединения, главным образом различные соли, входящие в состав питательных сред. Анализ КЖ дополнительно усложняется тем, что на фоне водной матрицы общее содержание органических веществ может достигать 30%.

Вследствие того, что объекты для определения содержания АК (биологические и культуральные жидкости, фармацевтические препараты и т. п.) достаточно сложны и анализировать их с помощью таких физико-химических методов, как спектрофотометрия, спектрофлуореметрия, ЯМР и др. практически невозможно [64-65]. Ферметативные методы анализа также не всегда обеспечивают получение достоверных результатов [66]. Частичное разделение объектов анализа на группы с помощью отгонки, экстракции и высаливания приводит к увеличению времени, стоимости анализа и зачастую к малодостоверным результатам [65]. Вследствие этого при анализе аминокислот большое значение приобретают хроматографические методы, которые обеспечивают частичное фракционирование исследуемой пробы непосредственно в процессе анализа [65]. Кроме того, при использовании хроматографических методов, как правило, удается добиться не только отделения аминокислот от сопутствующих компонентов, обладающих близкими свойствами и характеристиками, но и их количественного определения.

Основными требованиями, предъявляемыми к хроматографическим методам для анализа АК, на наш взгляд, являются следующие: простота, экспрессность, надежность, достоверность, дешевизна.

Возвращаясь к вопросу о достоверности и надежности метода, следует отметить, что требования, предъявляемые к аналитической хроматографии, например, в биохимии и биотехнологии существенно различаются. Так, в биохимии подходящим считается метод, обеспечивающий погрешность не более 15% и точность (правильность) 90% [67]. Аналогичные требования предъявляются к хроматографическим методам на стадии создания штаммов-продуцентов аминокислот. Однако, на этапе оптимизации процесса ферментации необходима более высокая точность анализа - погрешность не должна превышать 3%. То же самое требование предъявляется к аналитической хроматографии при разработке стадии выделения и очистки основной аминокислоты, поскольку погрешность, составляющая 10-15%, может привести к выпуску препарата недостаточной чистоты или чрезмерно высоким потерям на этой стадии, что неприемлемо в условиях крупнотоннажного производства.

С данным этапом развития хроматографии тесно связаны и наши исследования, обобщенные в настоящей диссертации.Задача анализа сложных полимерных систем, их фрагментов и низкомолекулярных фрагментов белков АК хроматографическими методами была решена в результате создания приборно-методологического комплекса на базе отечественных приборов и оборудования. Приборно-методологический комплекс включает в себя: модернизированные и оптимизированные жидкостные хроматографы, хроматографические колонки, созданные на основе макропористых стекол (совместная разработка ИХС РАН и ИБС РАН) и сферических силикагелей с большим объемом пор, комплекс приемов и методов подготовки проб, размола и фракционирования различных видов силикатных сорбентов, их модификация и повышение гидролитической стабильности, упаковки высокоэффективных хроматографических колонок (в том числе и с линейной молекулярно-массовой калибровочной зависимостью разных диапазонах ММ), создания отечественных полистирольных стандартов для ЭЖХ, разработки приемов оптимизации хроматографического процесса; оборудование и приборы для высокоэффективной ТСХ. Целью данной работы являются: исследования возможности применения высокоэффективной ЖХ для анализа ММР и РСМ сополимеров в широком диапазоне ММ и состава, а также определение ММР полиамидокислот на хроматографических колонках, упакованных кремнеземными сорбентами; разработки методов количественной, высокоэффективной ТСХ для анализа природных, синтетических и белковых аминокислот. Экспериментальные, теоретические и конструкторские разработки и исследования проводились в следующих направления:

- создание приборно-методологического комплекса для анализа полимеров и сополимеров методом ВЭЖХ;

- разработка методов ЭЖХ блок-сополимеров как самостоятельно (двух-детекторная ЭЖХ), так и с привлечением других хроматографических методов;

- исследование возможности сочетания ВЭЖХ и озонолиза для анализа блок-сополимеров на основе стирола и диенов;

- изучение особенностей синтеза блок-сополимеров методами ионной и радикальной полимеризации на примере образцов полистирола (ПС) и полибутадиена (ПБ), ПС и полиметилметакрилата (ПММА), полидиметоксиэтилена (ПДМЭ) и поливинилбензилового эфира (ПВБЭ).

- разработки способов определения молекулярных характеристик полиэлектролитов (полиамидокислот - ПАК) методом ЖХ и установлении степени влияния примесей в мономерах для ПАК на эти параметры;

- создание приборно-методологического комплекса анализа синтетических и природных полимеров методами планарной хроматографии (ПХ) -высокоэффективной, количественной, инструментальной ТСХ.

- разработке методик количественного анализа свободных аминокислотных метаболитов в культуральных жидкостях (КЖ) промышленных штаммов-продуцентов с помощью метода ПХ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Оптимизированный хроматографический приборный комплекс для анализа полимеров, включающая: высокоэффективный жидкостной хроматограф с рефрактометрическим и спектрофотометрическим детекторами, высокоэффективные хроматографические колонки для

2 7 эксклюзионной хроматографии в диапазоне молекулярных масс 10-10' дальтон с линейной молекулярно-массовой калибровочной зависимостью.

2. Методика расчета ММР блок-сополимеров с учетом гетерогенности их состава. Два способа определения ММР и РСМ с определением среднего состава ЭЖХ-фракций: а) двухдетекторная ЭЖХ, б) сочетание ЭЖХ с ПГХ.

3. Метод анализа ММР сополимера и его компонентов, основанный на сочетании ЭЖХ и озонолиза (для блок-сополимеров, содержащих в качестве одного из компонентов полимеры с ненасыщенными связями в основной цепи).

4. Исследования молекулярных и композиционных характеристик блок-сополимеров методом ЭЖХ, позволившие установить: а) условия синтеза узкодисперсных ПС-стандартов для ЭЖХ и узкодисперсных блок-сополимеров ПС и ПБ (в том числе с узкими по ММР составляющими блок-сополимер блоками); б) ряд относительной активности живущих анионных цепей в неполярных растворителях - в ассоциированной, мономерной и закомплексованной сильным электронодонором формах; в) условия получения блок-сополимеров ПС и ПММА с заданной "архитектурой" - ПС-ПММА и ПС-ПММА-ПС; г) особенности взаимодействия "долгоживущих" активных центров в катионной виниловой полимеризации - реакции последовательной сополимеризации полиметоксиэтилена и винилбензилового эфира и реакции полиметоксиэтилена с макроанионом полистирола.

5. Методы анализа свободных белковых АК в режиме одномерной и двумерной планарной хроматографии. Результаты разработки методов аналитического контроля незаменимых аминокислот, полученных в процессе промышленного микробиологического синтеза.

Данные результаты исследований, вошедшие в диссертацию, получены автором на протяжении ряда лет работы в Институте высокомолекулярных соединений РАН и отражены в 93 публикациях, указанных в списке цитируемой литературы.

Работа изложена на 299 страницах, содержит 158 рисунков, 69 таблиц и список цитированной литературы, включающий 467 ссылок.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны методологические и аппаратурные основы использования комплекса хроматографических методов, позволяющие анализировать сложные полимерные объекты и их фрагменты, в том числе сополимеры, с определением молекулярных и композиционных характеристик методам планарной и двухдетекторной эксклюзионной хроматографии; планарной, эксклюзионной и пиролитической газовой хроматографии; блок-сополимеры с ненасыщеными связями в основной цепи - сочетанием планарной, эксклюзионной жидкостной хроматографиии и озонолиза.

2. Создан комплекс для жидкостной колоночной хроматографии высокого давления, включающий оптимизированные жидкостные хроматографы, высокоэффективные хроматографические колонки с линейной калибровочной зависимостью для эксклюзионной хроматографии в

3 7 диапазоне молекулярны масс 10410' дальтон и микросферическими о силикагелями с большим объемом пор (до 2 см /г) и повышенной гидролитической стабильностью, позволяющий анализировать сложные синтетические и природные соединения.

3. Разработан электрогидродинамический способ размола кремнеземов позволяющий получать хроматографические сорбенты с высоким выходом целевых фракций без изменения пористой структуры.

4. Проведенные комплексные хроматографические исследования молекулярных и композиционных характеристик блок-сополимеров позволили установить:

- условия синтеза узкодисперсных полистирольных стандартов для эксклюзионной хроматографии и узкодисперсных блок-сополимеров стирол и бутадиена;

- повышение активности "живущих" анионных цепей в неполярных растворителях в ряду ассоциированной, закомплексованной сильным электронодонором и мономерной форм, позволяющее регулировать полидисперсность и молекулярно-массовое распределение конечных полимеров;

- условия получения блок-сополимеров стирола и метилметакрилата с заданной "архитектурой" путем регулирования процесса радикальной полимеризации и обрыва цепи по типу рекомбинации или по механизму диспропорционирования;

- повышенную устойчивость активных центров при катионной полимеризации диметоксиэтилена и винилбензилового эфира, приводящую к получению блок-сополимеров высокой молекулярной массы.

5. Сформулированные закономерности эксклюзионной хроматографии полиамидокислот ПАК-ПМ, учитывающие полиэлектролитное набухание, ионную эксклюзию и изменение проницаемости макромолекулярных клубков, позволяют определять и рассчитывать молекулярные характеристики полиамидокислот методом ЭЖХ. Впервые разработанные методы градиентной хроматографии позволили определять микропримеси в мономерах ПАК-ПМ и их влияние на молекулярные массы полученных из этих мономеров полиамидокислот.

6. Выявлены основные факторы, определяющие эффективность количественного анализа белковых аминокислот методом хромато денситометрии:

- найдены условия прямого разделения 23 свободных аминокислот методами двумерной и одномерной планарной хроматографии;

- создан способ разделения и количественного анализа аминокислот в биологических жидкостях для диагностики наследственных заболеваний; разработаны методы контроля процесса биохимического синтеза аминокислот на отечественных микробиологических производствах с использованием созданного комплекса планарной хроматографии.

1. Цвет М.С. О новой категории адсорбционных явлений и о применении их для биохимического анализа // Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Отд. биологии. 1903. Т.14. С. 20-29.

2. Done J., Konnedy G.F., Knox J.H. Revolution in liquid chromatography // Nature. 1972. V.237. № 5350. P. 7781-7786.

3. Giddings J.C. Liquid chromatography with operating conditions analogous to those of gas chromatography // Anal. Chem. 1963. V. 35. № 13. P. 2215-2216.

4. Измайлов A.A., Шрайбер М.С. Капельно-хроматографический метод анализа и его применение в фармации // Фармация. 1938. № 3. С. 1-3.

5. Stahl Е. Dunnshiht-chromatographie. Ein Laboratoriumshandbuch. Berlin: Springer, 1962. 534 s.

6. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. M.: Мир. 1981. Т. 1, 2.621 с.

7. Porath J., Flodin P. Gel Filtration: A method for Desalting and Group Separation//Nature. 1959. V.183. № 1657. P. 1657-1659.

8. Moore J.C. Gel Permeation Chromatography: I. A New Method for Molecular Weight Diatribution of High Polymers // J. Polymer Sci. 1964. V. 2A. P. 835-843.

9. Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Туркова JI.Д. и др. II 2-я школа по методам очистки и оценки чистоты мономеров и полимеров: Сб. науч. докл. / Черноголовка, 1968. С. 216-267.

10. Inagaki Н., Matsuda Н., Kamiyamama. Determination of Compositional Heterogeneity in Copolymers by Thin Layer Chromatography. I. Preliminary Results for Sterine-Acrylate Comolymers // Macromolecules. 1968. V. 1. P. 520525.

11. Новейшие исследования полимеров / Под ред. Ки Б. М.: Мир, 1966.396 с.

12. Шатенштейн А.И. и др. Практическое руководство по определению молекулярных весов и молекулярновесового распределения полимеров. М.: Химия, 1964. 12 с.

13. Тагер А. Физикохимия полимеров. М.: Химия, 1978. 400 с.

14. Okala М, Matsuda Н. Determination of number-average and weight-average molecular weight of Polymer Sample from diffusion and sedemintation velocity measurement in theta solvent // J. Appl. Polymer Sci. 1983. V. 28. № 7. P. 2325-2339.

15. Beumouna M., Benoit H. Scattering from copolymers solution at finite concentration // J. Polymer Sci., Polym. Fhys. Ed. 1983. V. 21. № 7. P. 1225-1242.

16. Бреслер C.E., Ерусалимский Б.Л. Физика и химия макромолекул. М.-Л.: Наука, 1965. 100 с.

17. Polymer Molecular Weight Methods / Ed. by Ezrin M., Washington, 1973. 18 p.

18. Беленький Б.Г. Жидкостная хроматография полимеров, биополимеров и их фрагментов: Дис. .докт. хим. наук. JI, 1974. 453 с.

19. Dawkins J.V. High performance Gel Permeation Chromatography of Polymers // Pure and Appl. Chem. 1982. V.54. № 2. P. 281-292.

20. Giddings J.C. Dynamics of chromatography. N.-Y.: Dekker, 1965. 28 p.

21. Беленький Б.Г., Виленчик JI.3. Хроматография полимеров. М.: Химия, 1978. 102 с.

22. Belenkii B.G., Vilenchik L.Z. Modern Liquid chromatography of macromolecules. Amsterdam: Elsevier, 1983. 149 p.

23. Пери С., Амос P., Брюер П. Практическое руководство по жидкостной хроматографии. М.: Мир, 1974. 108 с.

24. Бомба К. Эксклюзионная хроматография. В кн.: Современное состояние жидкостной хроматографии / Под ред. Киркленда Дж. М.: Мир, 1974. 179 с.

25. Benoit П., Grubisic Z., Rempp P., Decker D., Zillox J.G. Etude par chromatographic en phase liquide de polystyrenes lineaires et ramifies de structures Conmees // J. Chim. Phys. 1966. V. 63. № \\.\2. P. 1507-1514.

26. Энгелъгард X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир, 1980.204 с.

27. Yau W.W., Kirkland J.J., Bly D.D. Modern Size-exclusion Liquid Chromatography. N.-Y.: John Wiley & Sons, 1979. 404 p.

28. Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. N.-Y.: Awiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, 1979.283 р.

29. Нефедов ПЛ., Лавренко ПЛ. Транспортные методы в аналитической химии полимеров. JI.: Химия, 1979, 47 с.

30. Стыкин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия. 1986. 288 с.

31. Хроматографический анализ окружающей среды / Под ред. БерезкинаВ. Г. М.: Химия. 1979. 608 с.

32. Шпигун О.А., Золотое Ю.А. Ионная хроматография и ее применение в анализе вод. М.: Изд. Московского ун-та, 1990. 193 с.

33. Сокодынский К.И., Бражников В.В., Волков С. А. и др. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. С. 225-273.

34. Основы аналитической химии / Под ред. Золотова Ю.А. / Кн. 1. Общие вопросы. Методы разделения. М.: Высшая школа, 1999. С. 254-255.

35. Другое Ю.С., Родин А.А. Экологическая аналитическая химия. СПб.: Анатолия, 2002. С. 133-227.

36. Отто М. Современные методы аналитической химии. М.: Техносфера, 2004. Т. 2. С. 8-110.

37. Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. М. 1999. Т. 1,2. 753с.

38. Волынец М.П. Количественная тонкослойная хроматография в неорганическом анализе. М.: Наука, 1993. 240 с.

39. Березкин В.Г., Бычков А. С. Количественная тонкослойная хроматография. Инструментальные методы. М.: Химия, 1984. 184 с.

40. Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. СПб.: Химиздат, 2005. 232 с.

41. Kotaka Т., Whit J.L. Thin-Layer Chromatographic separation of Butadiene-Styrene Copolymers on the Basis of Composition and Molecular Weight // Macromolecules. 1974. V. 7. P. 106-116.

42. Kotaka Т., Uda Т., Tanaka Т., Inagaki H. Determination of Compositional Heterogeneity of Styrene-Methyl Methacrylate Block Copolymers // Die Macromoleculare Chemie. 1975. № 176. P. 1273-1288.

43. Taga Т., Inagaki H. The Separation and Characterization of Side Chain Polymers in Cellulose-Styrene Graft Copolymers // Die Angewandte Macromoleculare Chemie. 1973. № 33. P. 129-142.

44. Walochij J., Miyamoto Т., Inagaki H. Determination of Compositional Heterogeneties for Aery lonitrile-Styrene Copolymers by Thin-Layer Chromatography // Bull. Inst. Chem. Res. 1973. V. 56. № 2. P. 80-88.

45. Rempp P., Benoit H. Determination of Copolymer weight // Rubber Chem. & Technology. 1968. V. 41. № 1. P. 245-264.

46. A. C. № 495604 // Способ жидкостной хроматографии // Нефедов П.П., Лазарева М.А., Кудрявцев В.В. и др.// Б.И. №46, 1975.

47. А. С. № 994980 // Способ жидкостной хроматографии полиамидокислот//Кевер Е.Е., Ганкина Э.С., Беленький Б.Г. и др. // Б.И. №5, 1983.

48. Molou G.E. Fractionation of Copolymers. In: Characterisation of Macromolecular Structure / Ed. by Mclntire D. Washington: National Academy of Sciences, 1968. 245 p.

49. Мягченков В.А., Френкель С.Я. Неоднородность сополимеров по составу // Успехи химии. 1968. Т. 37. № 12. С. 2247-2259.

50. Френкель С.Я. Введение в статистическую теорию полимеризации. М.: Наука, 1965.97 с.

51. Inagaki H., Tanaka Т. Characterisation of Copolymers by TLC, GPC, and other methods 11 Pure and Appl. Chem. 1982. V. 54. № 2. P. 309-322.

52. Ries G., Gallot P. Fractionation of Copolymers. In: Fractionation of Synthetic Polymers / Ed. by TungL.H. N.-Y.: Marcel Dekker, 1977. 271 p.

53. Цветков B.H., Эскин B.E., Френкель С.Я. Структура макромолекул в растворах. М.: Наука, 1964. 459 с.

54. Эскин В.Е. Светорассеяние как метод исследования полимеров // Успехи физ. наук. 1964. Т. 82. № 4. С. 649-706.

55. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2000. Т. 1. 539 с.

56. Дебабов В.Г. Биотехнология. М.: Наука, 1994. 425 с.

57. Марков В.Л., Варшавский А. Е. Наука и высокие технологии в России на рубеже третьего тысячелетия. М.: Наука, 2001. 635 с.

58. Давени Т., Грей Я. Аминокислоты и белки. М.: Мир, 1976. 340 с.

59. Кленова И.Ф., Яременко Н. А. Ветеринарные препараты в России. М.: Сельхозиздат, 2000. 544 с.

60. Краснополъская ЕД, Цукерман Г.Л. Методические рекомендации по выявлению наследственных дефектов обмена. М.: Медицина, 1990. С. 1421.

61. Rabinow P. A Story of Biotechnology. N.-Y.: Proquest Academic Research Library, 1999. 784 p.

62. Martin F. Biotechnology from University to Industry. N.-Y.: Plenum Press, 1985.947 p.

63. Лившиц B.A. Основы биотехнологии. M.: Наука, 1991. 512 с.

64. Hartmann С., Massart D. L., McDowall В. D. Validation of bioanalytical techniques // J. Pharm. Biomed. Analysis. 1994. V. 12. P. 1337-1345.

65. Casassa E.F. Equilibrium distribution of flexible polymer chains between a macroscopic solution and small voids // J. Polym. Sci. 1967. V. 85. P. 773-778.

66. Casassa E.F., Tagani I. An equilibrium theory for exclusion chromatography of branched and linear polymer chains // Macromolecules. 1969. V. 2. № l.P. 14-26.

67. Casassa E.F. Theoretical model for peak migration in gel parmiation chromatography 11 J. Phys. Chem. 1971. V. 75. № 26. P. 3929-3939.

68. Kubin M. Calibration of size-exclusion chromatography systems with disperse standards // J. Lig. Chrom. 1984. V. 7. № 1. P. 41-68.

69. Беленький Б.Г., Виленчик Л.З., Нестеров B.B., Шапкина Т.И. Особенности калибровочной зависимости Бенуа в гель-проникающей хроматографии полимеров на макропористых набухающих сорбентах // Высокомол. соед. 1973. Т. А15. № 11. С. 2614-2615.

70. Dondos A., Rempp P., Benoit Н. Gel Permiation Chromatographic Investigations on Random and Block Copolymers // Makromolek. Chemie. 1974. V. 175. P.1659-1663.

71. BelenkiiB.G., VilenchikL.Z., Nesterov V.V., Kolegov V.F., FrenkelS.Ya. Reculiarities, in gel-permiation chromatography of flexiblechain polymers on macroporous swelling sorbents // J. Chromatogr. 1975. V. 107. P. 233-238.

72. Виленчик ЯЗ., Беленький Б.Г., Нестеров В.В., Колегов В.К, Френкель С.Я. Особенности гель-проникающей хроматографии гибкоцепных полимеров на набухающих сорбентах // Высокомол. соед. 1975. Т. А17. № 4. С. 726-730.

73. Lecaertier I., Ahdebert R., Quevoron С. Theoretical study of chromatographic separations performed with crosslinked organic polymers // J. Chromatogr. 1976. V. 121. P. 173-183.

74. White I.L., Salladay D.G., Quisenberry D.O., Maclean D.L. Gel-Permeation and Thin-Layer Chromatographic Characterization Solutions Properties of Butadiene and Styrene Homopolymers and Copolymers // J. Appl. Polym. Sci. 1972. V. 16. № 11. P. 2811-2827.

75. Dawkins J. V. Gel Permiation Chromatography of Polymere: Use of Unpertubed Dimensions for Celibration // J. Macromolec. Sci. 1968. V. 82. № 4. P. 623-639.

76. Urvin J.R., Girolamo M. Molecular Weight Distribution of Block Copolymers by Gel Permiation Chromatography // Aust. J. Chem. 1972. V. 25. № 9. P. 1869-1875.

77. Florry P.J. Principles of Polymer Chemistry Ithaca: Cornell Univ. Press, 1953.610 р.

78. Рафиков С.P., Павлова СЛ., Твердохлебова И.И. Методы определения молекулярных весов и полидисперсности высокомолекулярных соединений. М.: изд. АН СССР, 1963. 281 с.

79. Grubisic Z., Rempp P., Benoit H. A universal calibration for gel-permiation// J. Polum. Sci. 1967. V. 85. P. 753-759.

80. МоравецГ. Макромолекулы в растворе. М.: Мир, 1967. 102 с.

81. Птщын О.Б., Эйзнер Ю.Е. Гидродинамика растворов полимеров. II. Гидродинамические свойства макромолекул в хороших растворителях // Ж. техн. физ. 1959. Т. 29. № 9 С. 1117-1134.

82. Эйзнер Ю.Е. Гидродинамические свойства линейных макромолекул: Дис. . канд. физ.-мат. наук. JL, 1962. 142 с.

83. Rudin A., Wagner R.A. Solvent and Concentration Dependence of Hydrodynamic Volumes and GPC Elution Volumes // J. Appl. Polym. Sci. 1976. V. 20. №6. P. 1483-1490.

84. РабекЯ. Экспериментальные методы в химии полимеров. М.: Мир, 1983.26 с.

85. Zimm В.Н., Stockmaer W.H., Fixman М. Excluded Volume in Polymer Chains //J. Chem. Phys. 1953. V. 10. P. 1716-1723.

86. Fixman M. Excluded Volume in Polymer Chains // J. Phys. Soc. Japan. 1958. V. 13. № 1. P. 78-86.

87. Виленчик JT.3., Жмакина Т.П., Беленький Б.Г. Общая универсальная калибровочная зависимость в эксклюзионной хроматографии полимеров // Высокомол. соед. 1984. Т. А26. № 2. С. 416-418.

88. Yamakawa Н., Kurata М. Theory of Dilute Polymer Solutions (I.) Chain Configuration and Light Scattering // J. Phys. Soc. Japan. 1958. V. 13. № 1. P. 7886.

89. Froelich D., Benoit H. Etude de Dimensions Moleculaires de Different Types de Copolymeres en Fonction de la Qualite du Solvant // Macromol. Chem. 1966. V. 92. P. 224-239.

90. Zimm B.H. Application of the Methods of Molecular Distribution to Solutions of Large Molecules // J. Chem. Phys. 1964. V. 14. № 3. P. 164-179.

91. Stockmaer W.H. Chain Dimensions near the Flory Temperatures // J. Polymer Sei. 1955. V. 15. P. 595-598.

92. Kotaka Т., Ohnuma H., Inagaki H. Thermodynamic and Conformational Properties of Styrene-Methyl Methacrylate Block Copolymers in Dilute Solutions. (II.) Behaviour in Theta Solvents // Polymer. 1969. V. 10. № 7. P. 517-529.

93. Сарибан A.A., Бирштейн T.M., Скеорцое A.M. Изучение структуры и свойств трехблочных сополимеров в растворе методом «машинного эксперимента» //Высокомол. соед. 1977. Т. А19. № 8. С. 1728-1735.

94. Сарибан A.A., Бирштейн Т.М., Скеорцое A.M. Структура сополимеров в растворе и иерархия взаимодействий в полимерных цепях // Высокомол. соед. 1977. Т. А19. № И. С. 2582-2592.

95. Kotaka Т., Тапака Т., Onhumi Н., Murakami Y., Inagaki Н. Dilute Solution Properties of Styrene-Methyl Mehtacrylate Copolymers with Different Architecture // Polym. J. 1970. V. 1. № 2. P. 245-259.

96. Kotaka Т., Marakami Y., Inagaki H. Dilute Solutions Properties of Styrene-Methyl Mehtacrylate Random Copolymers // J. Phys. Chem. 1968. V. 72. № 3. P. 829-841.

97. Inagaki H., Miyamoto T. Preparation of Block Copolymers of ABA-Type and its Behaviour in Dilute Solution // Macromol. Chem. 1965. B. 87. S. 166-179.

98. Inagaki H. Intrachain Iteraction and Molecular Shape of Block Copolymer in Dilute Solution // Macromol. Chem. 1965. B. 86. S. 289-293.

99. Тапака Т., Kotaka Т., Ban K, Inagaki H. Conformation of Block Copolymers in Dilute Solution. The Molecular Dimension. Block Architecture Relationships // Macromolecules. 1977. V. 10. № 5. P. 960-967.

100. Kotaka Т., Тапака Т., Inagaki H. Conformation of Block Copolymers in Dilute Solution. Monte Carlo Calculation and Light Scattering Studies on Diblock Copolymer Systems // Macromolecules. 1976. V. 9. № 4. P. 561-568.

101. Роговина Л.З., Слонимский ГЛ. Конформации блок-сополимеров в разбавленных растворах // Успехи химии. 1977. Т. 46. № 10. С. 1871-1895.

102. Бреслер С.Е., Пырков Л.М., Френкель С.Я., Лайус Л.А., Кленин С.И. Молекулярная конформация, гидродинамические свойства и механические свойства 4:5 блок-сополимеров стирола и изопрена // Высокомол. соед. 1962. Т. 4. № 2. С. 250-255.

103. Dondos A., Rempp P., Benoit H. Investigation on Conformation of Block and Random Copolymers in Dilute Solution // Macromol. Chem. 1969. B. 130. № io. S. 233-242.

104. Dondos A. Conformation segreger et conformation "statistique" dans les copolymers a trios sequences PMM-PS-PMM en solution diluee. I. Etude viscosimetrique //Macromol. Chem. 1971. B. 147(b). № 7. s. 123-134.

105. PrudHomme J., Roovers J.E.L., Bywater S. Solution Properties of Isoprene- Styrene Block Copolymers // Europ. Polym. J. 1972. V. 8. № 7. P. 901910.

106. Plaute J.P., Ho-Due N., Prud Homme J. Etude comparative de laviscosité Intrinsèque des copolymers bi et trisequences du styrene et de e isoprene // Europ. Polym. J. 1973. V. 9. P. 77-83.

107. Ho-Due N., Prud Homme J. Characterization of Styrene-Isopren Block Copolymers by Gel-Permiation Chromatography // Macromolecules. 1973. V. 6. №3. P. 472-474.

108. Ношей А., Мак-Грант Дж. Блок-сополимеры. M.: Мир, 1980. 98 с.

109. Bondanecky M., Kovar J. Viscosity of Polymer Solutions / Ed. by JenkisA.D. Amsterdam-Oxford-New York: Elsevier, 1982. P. 119-120.

110. Бреслер C.E., Пырков Л.М., Френкель С.Я. Равновесная седиментация в градиенте плотности // Высокомол. соед. 1960. Т. 2. № 2. С. 216-220.

111. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров. М.: Наука, 1973.350 с.

112. Эскин В.Е., Короткина О.З. О поведении дифильных сополимеров //Высокомол. соед. 1970. T. А12. № 10. С. 2216-2232.

113. Эскин В.Е., Григорьева А.И., Барановская И.А., Рудковская Г.Д. Конформационные свойства блок-сополимеров стирола с винилпирролидоном в растворе // Высокомол. соед. 1978. T. А20. № 1. С. 5561.

114. Ito К., Yamashita Y. Complete Characterization of Microstructure of Styrene-Methyl Methacrylate and Vinylidene Chloride-Vinyl Acetate Copolymers to high conversion by NMR // J. Polym. Sci. 1968. V. 6. P. 227-232.

115. Ануфриева E.B. Люминисцентный метод исследования полимеров. В кн.: Олейник Э.Ф., Бучаченко А.Л., Ануфриева E.B. М.: Знание, 1975. С. 3562.

116. Громова P.A. Структура и структурные превращения макромолекул статистических и блок-сополимеров в растворе: Дис. .канд. физ.-мат. наук. Л., 1985. 150 с.

117. Donos A. Benoit Н. Influence de la nature du solvent et de la temperature sur les dimensions non perturbees des copolymers statistiques PS-PMM // Makrom. Chem. 1968. V. 118. S. 165-176.

118. Dondos A., Rempp P., Benoit H. Segregation and Conformstional Transition in Triblock Copolymere: Part 2. Light-Seattering Studies // Polymer. 1972. V. 13. №3. P. 97-103.

119. Михайлов H.B. О структурной совместимости полимеров // Высокомол. соед. 1971. Т. А13. № 3. С. 395-409.

120. Тагер A.A. Термодинамическая устойчивость систем полимер-растворитель и полимер-полимер // Высокомол. соед. 1972. Т. А14. № 12. С. 2690-2706.

121. Тагер A.A., Адамова JI.B. Термодинамика совместимости компонентов в блок-сополимерах. В кн.: Синтез и свойства блок-сополимеров. Киев: Наукова думка, 1983. С. 54-70.

122. Кулезнев В.Н., Крохина JI.C. Структура и свойства смесей полимеров в растворе // Успехи химии. 1973. Т. 42. № 7. С. 1278-1309.

123. Krause S. Microphase Separation in Block Copolymers. Zeroth Approximation // J. Polym. Sei. 1969. Part A-2. V. 7. № 1. P. 249-252.

124. Krause S. Microphase Separation in Block Copolymers. Zeroth Approximation Including Surface Free Energies I // Macromolecules. 1970. V. 3. № 1. P. 84-86.

125. Krause S. Dilute Solution Properties of Styrene-Merhyl Methacrylate Block Copolymers // J. Phys. Chem. 1964. V. 68. № 7. P. 1948-1955.

126. Krause S. Microphase Separation in Block Copolymers // Macromolecules. 1972. V. 7. P. 251-259.

127. Krause S. Microphase Separation in Block Copolymers. Zeroth Approximation Including Surface Free Energies II // Macromolecules. 1970. V. 3. № l.P. 88-89.

128. Дубкова JI.B., Павлова С.А., Пономарева М.А. Свойства растворов поли(акрилат-ариленсульфоксидных)блок-сополимеров // Высокомол. соед. 1983. Т. А25. № 7. С. 1536-1543.

129. Allen G., Gee G., Nicholson J. P. The Miscibility of Polymers: I. Phase equilibria in Systems containing two Polymers and a Mutual Solvent // Polymer. 1960 V. l.№ l.P. 56-62.

130. Hyde A. Tanner A.G. Light-Scattering Experiments on PolymerPolymer Systems //J. Collod & Interface Sei. 1968. V. 28. № 2. P. 179-184.

131. Бектуров E.A. Тройные полимерные системы в растворах. Алма-Ата: Наука, 1975. 168 с.

132. Kilb R.W., Bueche A.M. Solution and Fractionation Properties of Graft Polymers // J. Polym Sei. 1958. V. 28. №117. P. 285-294.

133. PrudHome J., Bywater S. Light-Scattering Studies on Polystyrene-Polyisoprene Block Copolymers // Macromolecyles. 1971. V. 4. № 5. P. 543-548.

134. Urwin J.R., Steam J.M. Solution Properties of Block Copolymers of Styrene and Methyl Methacrylate. Part I. The Preparation, Isolation and Purification of the Block Copolymers // Makromol. Chem. 1964. B. 78. S. 194203.

135. Urwin J.R., Steam J.M. Solution Properties of Block Copolymers of Styrene and Methyl Methacrylate. Part II. Viscosity. Osmotic Pressure and Light Scattering Studies // Makromol. Chem. 1964. B. 78. S. 204-215.

136. Urwin J.R., Gramond D.N. The effect of Heterogeneity in Composition on the Determination of Molecular Weight Distribution of Block Copolymere by Gel Permiation Chromatography // Aust. J. Chem. 1969. V. 22. P. 543-548.

137. Urwin J.R., Gramond D.N Intramolecular Phase Transition of Block Copolymere in Solution from Viscosity-Temperature Studies // Makromol. Chem. 1971. B. 150. S. 179-188.

138. Girolamo M., Urwin J. R. Thermodynamic Parameters Osmotic Studies on Solutions of Block Copolymers of Polyisoprene and Polystyrene // Europ. Polym. J. 1972. V. 8. № 2. P. 299-311.

139. Girolamo M., Urwin J. R. The Configuration of Block Copolymers of Polyisoprene and Polystyrene. II. Molecular Dimensions // Europ. Polym. J. 1972. V. 8.№ 10. P.l 159-1170.

140. Girolamo M., Urwin J. R. Anomalous Viscosity Behaviour of Block Copolymers as a Function of the Temperature for two Sequence or AB-Type Poly(Isoprene:Styrene) // Europ. Polym. J. 1971. V. 7. № 6. P. 693-698.

141. Utracki L. A., Shima R., Fetters L. J. Solution Properties of Polystyrene-Polybutadiene Block Copolymers // J. Polym. Sei. 1968. V. A2. № 6. P. 2051-2066.

142. Ануфриева E.B. Поляризованная люминесценция макромолекул с люминисцирующими метками и молекулярное движение в растворах полимеров: Дисс. .докт. физ.-мат. наук. JL, 1973. 410 с.

143. Dondos A. Observation d'une anomalie dans la variation, en function de la temperature, de la viscosité intrinsique de copolymers greffes // Makromol. Chem. 1966. B. 99. S. 275-278.

144. Dondos A. Configuration des copolymers greffes en solution: transition d'une frome "segregee" a une forme statistique // Europ. Polym. J. 1969. V. 5. № 6. P. 767-779.

145. Dondos A. Investigation of Conformation of Styrene- Methylstyrene Block Copolymers in Dilute Solution // J. Polym. Sei. 1971. V.9 №12. P.817-875.

146. Михайлов Т.Н., Бурштейн JI.JI., Кленин С.И., Малиновская В.П., Черкасов А.Н., Шибаев JI.A. Исследование дипольных моментов блок-сополимеров метилметакрилат-стирол // Высокомол. соед. 1968. Т. А10. № 3. С.556-560.

147. Бурштейн JI.JI. Диэлектрическая поляризация полимеров в растворе: Дис. .докт. физ.-мат. наук. Л., 1982. 486 с.

148. Готлиб Ю.Я. Некоторые закономерности релаксационного поведения растворов полимеров. В сб.: Релаксационные явления в полимерах. Л.: Химия, 1972. С. 7-24.

149. Desbene P.L., Desmazieres В., Yver В. Analysis of monomethyl-and dimethylsiloxane polymers and copolymers (fimctionalized by supercritical-fluid chromatography // J. of Chromatography A. 1998. V. 813. № 1. P. 121-134.

150. Verhelst V., Vandereecken P. Analysis of organosilicone copolymers by gradient polymer elution chromatography with evaporative light scattering detection // J. of Chromatography A 2000.V. 817. № 1-2. P. 269-277.

151. Karlsson A. Porsch B. Sundelof L.-O., Hillang I. Ion-exclusion controlled size-exclusion chromatography of methacrylic acid-methyl methacrylate copolymers // J. of Chromatography. 2000. V. 872. № 1-2. P. 91-99.

152. Lukyanchikov G.V., Prudskova T.N., Prudskov B.M., Kireev V.V. Combined Use of Refractometric and Ultraviolet Detectors in the Analysis of Copolymers by Gel-Permeation Chromatography // Polymer Science, series B. 1997. № 24.

153. Wang F.C.-Y. Compositionand structure analysis of styrene-maleic anhydride copolymer by pyrolysis-gas chromatography // J. of Chromatography A. 1997. V. 765. № 1-2. P. 279-285.

154. Kollroser M, Trathnigg B., Feichtenhofer S. Quantitation in liquid chromatography of polymers: size-exclusion chromatography with dual detection // J. of Chromatography A. 1997. V. 786. № 1. P. 75-84.

155. Laguna M.T.R., Medrano R., Plana M.P., Tarazona M.P. Polymer characterization by size-exclusion chromatography with multiple detection // J. of Chromatography A. 2001. V. 919. № 1. P. 13-19.

156. Inagaki H., Kotaka T., Min T.-I. Separation and Characterization of Block and Graft Copolymers by Thin-Layer Chromatography // Pure & Appl. Chem. 1976. V. 46. P. 61-70.

157. Belenkii B.G., Gankina E.S., Nefedov P.P., Kuznetsova M.A., Valchiknina M.D. Use of combined chromatography methods including Thin-Layer Chromatography for the analysis of Complex Polymer System // J. Chromatogr. 1973. V. 77. P. 209-217.

158. Bly D.D. Resolution and Fractionation in Gel Permiation Chromatigraphy // J. Polym. Sei. Part C. 1968. V. 21. P. 13-21.

159. Stejskal J., Kratochvil P. Distribution of the Chemical Composition of Block and Graft Copolymers Assuming Gamma Distribution of Molecular Weight of the Precursor Blocks // Polym.J. 1982. V. 14. № 8. P. 603-627.

160. Hoffman M., Urban H. Molecular und chemishi Uneinheitlichkeit von Copolymeren aus Triibungstitrationen von GPC-eludten // Macromol. Chem. 1977. B. 178. S. 2683-2696.

161. Mori S. Determination of the composition of Copolymers as a Function of Molecular Weight by Pyrolysis Gas Chromatography-Size-Exclusion Chromatography // J. Chromatogr. 1980. V. 194. P. 163-173.

162. Rynyon J.R., Barnes D.E., Rudd J.F., Tung L.H. Multiple Detectors for Molecular Weight and Composition Analysis of Copolymers by Gel Permiation Chromatography // J. Appl. Polym. Sei. 1969. V. 13. № 12. P. 2359-2369.

163. Cantow H.I., Probst I., Stojanov C. Zur Ermittlung der Moleculargewichts Verteilung und der Verteilung der chemishen Zussmmensetzung bei Styral/Butadien Kautschuken // Kant. Gummi Kunst. 1968. B.21.S. 609-615.

164. Adame H.E. Composition of Butadiene Styrene Copolymers by Gel Permiation Chromatography // Separ. Sei. 1971. V. 6. P. 153-174.

165. Ownes E.G., Cobler I.G. II 4-th International Seminar on GPC: Preprints / 1967. P. 160-166.

166. Bartosilwicz R.L. Gel Permiation Chromatography in the Analysis of Surface Coating Vehicles // J. Polym. Sei. 1968. Part C. V. 21. P. 329-339.

167. Terry S.L., Rodrigner F. Measurement of Functional group and molecular weight interrelations by GPC/IR // J. Polym. Sei. 1968. V. 21C. P. 191197.

168. Goldwasser J.M. Rudin A. Analysis of Block and Statistical Copolymers by Gel Permiation Chromatography: Estimation of Mark-Hauwink Constants I I J. Liquid Chrom. 1983. V. 6. № 13. P. 2433-2463.

169. Mori S., Suzuki T. Problems in Determining Compositional Heterogeneity of Copolymers by Size-Exclusion Chromatography and UV-RI detection System//J. Liquid Chrom. 1981. V.4. № 10. P. 1685-1696.

170. Stojanov C., Shiras Z.H., Audu T.O.K. Determination of Chemical Heterogeneity of Copolymers by Gel Permiation Chromatography. 1978. V.ll. P. 63-69.

171. Mori S. Determination of Composition and Molecular Weight Distribution of Poly(vinyl chloride-vinyl acetate) Copolymer by Gel Permiation Chromatography and Infrared Spectroscopy // J. Chromatogr. 1978. V.157. P. 7588.

172. Mirabella F.M., Barrel Ir.E., Johnson J.F. A Rapid Technique for Measuring Copolymer Composition as a Function of Molecular Weight using GPC and IR//J. Appl. Polym. Sei. 1975. V. 19. P. 2131-2139.

173. Belenkii B.G., Gankina E.S., Nefedov P.P., Lazareva M.A., Savitskaya T.S., Valchikhina M.D. Use of combined chromatographic method including thin-layer chromatography for analysis of complex polymer system // J. Chromatogr. 1975. V. 108. P. 61-78.

174. Chang F.S.C. Molecular weight Analysis of Block Copolymers by Gel Permiation Chromatography // J. Chromatogr. 1971. V. 55. №1. P. 67-71.

175. Chang F.S.C. GPC Analysis of Block Copolymers. In: Polymer Molecular Weight Methods / Ed. by Ezrin M. Washington, 1973. P. 154-164.

176. Gramond D.N., Hammond, Urwin J.R. Molecular Weight of poly(isoprene:styrene) by gel permiation chromatography // Europ. Polym. J. 1968. V. 4. №4. P. 451-456.

177. Bressau R. Liquid Chromatography of Polymers avd Related Materials / Ed. by Cazes J. N.Y: Marcel Dekker, 1980. P. 73.

178. Inagaki H., Kavai S. Anwendung des ultrazentrifugen Methode ven Archibald bei Untersuchung verdünnter Polymereosung. IV. Molecular gewichtsbestimmung von Polystyrol und Polymethylmetacrylate in butanon // Macromol. Chem. 1964. B. 79. S. 42-53.

179. Goldwasser J.M., Rudin A., Elsdon W.L. Characterization of Copolymers and Polymer Mixtures by Gel Permiation Chromatography // J. Liquid Chrom. 1982. V. 5. № 12. P. 2253-2257.

180. Ivan B., Laszlo-Hedvig Z, Kelen T., Tudos F. GPC Study of Ethylene-Propylene Copolymers Combined with Viscometry and IR Spectroscopy // Polym. Bull. 1982. V. 8. P. 311-317.

181. Ambler M.E. Universal Calibration in GPC: A New Approach for the Calculation of Molecular Weights//J. Polym. Sci. 1973. V.ll. № 1. P. 191-201.

182. Ogawa Т., Inaba T. Gel permiation Chromatography of Ethylene-Propylene Copolymerization Products // J. Appl. Polym. Sci. 1977. V. 21. № 11. P. 2979-2990.

183. Grubisic-Gallot Z., Picot M., Gramain Ph. Characterization of Homopolymers and Copolymers by the Coupling of Permiation Chromatography and Automatic Viscometry//J. Appl. Polym. Sci. 1972. V. 16. P. 2931-2945.

184. Sarwar G., Botting H. G. Analysis of nutritionally important amino acids in food and physiological fluids // Journal of Chromatography. 1993. V. 615. P. 1-22.

185. Watanebe K., Dansako H., Asada N., Sekai M. Effects of chemical modification of arginine residues outside the active site cleft of ricin // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. V 58. № 4. P. 716-721.

186. ГитонЖ., Гийемен К. Количественная газовая хроматография. М.: Мир, 1991. 520 с.

187. Husek P., Liebich Н. М. Organic and amino acids profiling by direct treatment of deprotenized plasma with ethyl chlorformiate // Journal of Chromatography. 1994. V. 656. P. 37-43.

188. Husek P. Amino and long-chain fatty acids esterified by action of alkyl chloroformiates and analyzed by capillary gas chromatography // Journal of Chromatography. 1993. V. 615. P. 334-338.

189. Husek P. Capillary GC analysis of biogenic amines, their precursors and cataboltes after fast derivatization with ethyl chlorformiate // Journal Microcol. Sep. 1993. V.5.P. 101-103.

190. Husek P. Simultananeus profile analysis of plasma amino and organic acids by capillary gas chromatography // Journal of Chromatography. 1995. V. 669. P. 352-357.

191. Дегтерев E. В., Резник А. И. Состояние аналитического контроля биосинтеза L-лизина // Микробиологическая промышленность. 1979. Вып. 3. С. 41-42.

192. Дегтерев Е. В. Аналитический контроль в исследованиях биосинтеза аминокислот и их производных II Микробиологический и энзиматический синтез аминокислот: Сб. науч. докл. / Пущино, 1980. С. 1516.

193. Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: Мир, 1988. 643 с.

194. Bhushan R., Sherma J. Amino Acids // Handbook of Thin Layer Chromatography. Chromatographic Sci. Series. 1996. V. 60. P. 990.

195. Tyihak E., Minksovics E. Trend in overpressured Thin layer chromatography // J. Planar. Chromatogr. 1991. V. 4. P. 288-294.

196. Planar Chromatography 2002. Modern Thin-Layer Chromatography. Camag. Muttenz. 2002. 40 p.

197. Fenimore D. С., Davis С. M. HPTLC // Anal. Chem. 1998. V. 53. P.253.

198. Grinberg N. G. Modern Thin-Layer Chromatography. London, N.-Y.: Marcel Dekker, 1990. 490p.211. FDA. Bull. 1994. 546 p.

199. Camag Bibliography. Service. 1981. № 2. P. 2-5.

200. Kelker H. Dunnschicht order Saulenflussigkeits Chromatographic Nachr. // Chem. Tech. Lab. 1983. S. 786-794.

201. Красиков В.Д., Малахова И.И., Новицкий А.П., Полубенцева М.И. Видеоденситометр для тонкослойной хроматографии "ДенСкан-04" // Количественная ВЭТСХ. Проблемы и их решения: Материалы 2й школы-семинара/ Санкт-Петербург, 2002. С. 1-12.

202. Camag Bibliography Service . Version 104. 2001.217. "Merck". Catalog 2000-2001. Darmstadt, 2000.218. "Ленхром". Оборудование для TCX. Каталог. Санкт-Петербург,2001.

203. Niederviesser A., Pattaki G., Brenner М. Separation DNFB-derivatives of some amino acids on silica gel plates // Experientia. 1961. V. 17. P. 145-154.

204. Seilier N., Weihmann J. Prepatation separation and identification off amino acids // Experientia. 1964. V. 20. P. 559-566.

205. Gray W.R., Howtley B.S. Derivatization of free amino group of 9 amino acids with 5 methyl amino naphthalene- 1-sulfonyl chloride and separation on silica gel // Biochem. J. 1963. V. 89. P. 59-64.

206. Inglis A.S., Nicholls P. W. Separation and identification some amino acids modifaied by phenyl isothiocyanate on silica gel plates // Journal of Chromatography. 1973. V. 79. P. 344-350.

207. Brenner M, Niedervieser A. The simple tegunique for separation of amino acids // Experientia, 1960. V. 16. P. 378-386.

208. Niedervieser A., Brenner M., Pattaki J. TLC of different amino acids on silica gel layers // Hebv. Chim. Acta. 1961. V. 44. P. 2022-2031.

209. Niedervieser A., Pattaki J. Separation amino acids and peptides on silica gel // J. Chim. Acta. 1969. V. 14. P. 378-390.

210. Chemel K. Thin-layer chromatography on silica gel // Coll. Czech. Chem. Comm. 1972. V. 37. P. 3034-3040.

211. Chmel K. Thin-layer chromatography 22 amino acids on silica gel and RP layers // Coll. Czech. Chem. Comun. 1972. V. 37. P. 3612-3621.

212. Shellard I.J., Jolliffe G.H. The separation of alanine, valine, phenylalanine and lysine on silica gel G // Journal of Chromatography. 1967. V. 19. P. 32-39.

213. Rokkens T. Determination 7 amino acids on silica gel. TLC-plates // J. Clin. Lab. Invest. 1964. V. 16. P.149-161.

214. Pattaki J. Thin-layer chromatography of 8 a-amino acids o silica gel G using mobile phases 11 Journal of Chromatography. 1964. V. 16.P.541-549.

215. Nurmberg E. Investigation 20 amino acids on silica gel "G" // Arch. Pharm. 1959. V. 292. P. 610-617.

216. Mutschiev E., Rochenelmeyer E. Inproved procedure for the separation threonine, serine and phenylalanine by thin-layer chromatography 11 Arch. Pharm. 1959. V. 292. P. 449-457.

217. Dianastein T., EhrahadH. HZ. Phys. Chim. 1961. V. 320. P. 131-140.

218. Hogger C.G. Separation of the main protein amino acid by step gradient //Helv. Chim. Acta. 1961. V. 44. P. 173-181.

219. Geiss F., Klose A. Stepwise gradient separation of biogenic amines and amino acids using personal OPLC instrument // Z. Anal. Chim. 1965. V. 219. P. 321-329.

220. Rossetti W.Z. Separation amino acids and peptides from Hedyotic nudicanlis//Anal. Chim. 1967. V. 221. P. 397-404.

221. Shellard I. J., Jolliffe G.H. Thin-layer chromatography 9 amino acids on silica gel // Journal of Chromatography. 1968. V. 38. P. 253-265.

222. Tyihak E.H. Stepwise gradient determination of toxie ingredient nistidine and histamine in medical material 11 Journal of Chromatography. 1970. V. 49. P. 349-356.

223. SeydelH, Voigh R. Optimization of mobile phase composition in TLC for rapid and economic determination of amino acids and shot peptides in medicine // Pharmazie. 1969. V. 24. P. 531-539.

224. Ploechl E. Simultaneous determination of tryptophan, thyptamiul and some their derivatives by TLC and HPLC methods // Clin. Chim. Acta. 1968. V. 21. P. 271-281.

225. Wollenweber P. Thin-layer chromatography separation of several amino acid on silica gel // Journal of Chromatography. 1962. V. 9. P. 369-376.

226. Squibb R.L. Thin-layer chromatographic separation and quantitative determination of several free aminoacids of avian eiver // Nature. 1963. V. 199. P. 1216-1218.

227. Squibb R.L. Miscellaneous an inproved technique for the preparation and scanning of thin-layer chromatograms // Nature. 1963. V. 198. P. 317-320.

228. Bhushan R. Amino acids and their derivatives // Hand Book of Thin-Layer Chromatography. Chromatographic Sci. Series. / Ed. by Sherma J., FriedB. N.-Y, 1991. V. 55. P. 353-387.

229. Bhushan R. Peptides and proteins 11 Hand Book of Thin-Layer Chromatography. Chromatographic Sci. Series. / Ed. by Sherma J., Fried B. N.-Y., 1991. V. 55. P. 388-389.

230. Bhushan R. TLC of PTH-derivatives of amino acids // J. Liquid Chromatogr. 1987. V. 10. P. 3497-3528.

231. Bhushan R. TLC of PTH-derivatives of amino acids on silica gel impregnated with metal ions // Anal. Letters. 1988. V. 21. P. 1075-1084.

232. Bhushan R., Mahesh V.K., Malli P. V. Improved TLC-systems for rapid resolution of PTH-amino acids // Biomed. Chromatogr. 1989. V. 3. P. 43-55.

233. Bhushan R., Reddy G.P. TLC resolution of 18 PTH-amino acids, using three solvent systems // J. Planar. Chromatogr. 1989. V. 2. P. 79-82.

234. Bhushan R., Reddy G.P. TLC of PTH and Dansyl derivatives of amino acids // Biomed Chromatogr. 1989. V. 3. P. 233-240.

235. Bhushan R. Some effective solvent systems for rapid resolution of DPH-amino acids by TLC // Chromatographia. 1998. V. 25. P. 435-456.

236. Bhushan R., Ali I. TLC resolution of enantiomeric mixtures of amino acids // Chromatographia. 1987. V. 23. P. 280-285.

237. Bhushan R., Martens J. Direct resolutions of enantiomers by impregnated TLC //Biomed. Chromatogr. 1997. V. 11. P. 141-152.

238. Дегтерее Е.В., Подгорноеа Т.П. Количественное определение треонина в культуральной жидкости методом ТСХ // Микробиологическая промышленность. 1976. Вып. 2 /133. С. 28-30.

239. Дегтерее Е.В. Пути совершенстования аналитического контроля производства аминокислот // Сборник научных трудов. / ВНИХФИ. Москва, 1985. С. 5-12.

240. Warner М. Analytical biotechnology // Anal. Chem. 1988. V. 60. № 14. P. 847-850.

241. Carr S.A., Hemling M.E., Roberts G.D. Integration of mass spectrometry in analytical biotechnology // Anal. Chem. 1991. V 63. № 24. P. 2802-2824.

242. MacCarthy P, Klusman R.W., Rice J.A. Water analysis // Anal. Chem. 2000. V. 72. № 12. P. 525-585.

243. Anderson D.J., Vanlent F. Clinical chemistry // Anal. Chem. 1995. V. 67. № 11. P. 377-378.

244. Gilpin R.K., Pachla L.A. Pharmacutical and related drugs // Anal Chem. 1997. V. 69. № 12. P. 295-313.

245. Brettell T.A., Safer stain R. Forensic science // Anal. Chem. 1995. V. 67. № 12. P. 273-294.

246. Clement R.E., Eiceman G.A., Koester C.J. Environmental analysis // Anal. Chem. 1999. V. 71. № 12. P. 221-255.

247. Fox D.L. Air pollution // Anal. Chem. 1995. V. 67. № 12. P. 183-198.

248. Shoneich С., Rabell S.R., Williams T.D. Separation and analysis of peptides and proteins // Anal. Chem. 1996. V. 68. № 12. P. 155-181.

249. Chang S.K.S., Holm E. Food // Anal. Chem. 2000. V. 68. № 12. P. 27153.

250. Sherma J. Pesticides // Anal. Chem. 2000. V. 72. № 12. P. 1-20.

251. KinterM. Mass spectrometry // Anal. Chem. 1996. V. 68. № 12. P 493497.

252. Blaser W.W., LapackM.A. Process analytical chemistry // Anal. Chem. 1998. V. 70. № 12. P. 47-74.

253. Xu Y Capillary electrophoresis // Anal. Chem. 1998. V. 70. № 12. P. 467-483.

254. Anderson D.J. High performance liquid chromatography //Anal. Chem. 1995. V. 67. № 12. P. 475-489.

255. Хроматография. Практическое приложение метода / Под ред. ХефтманаЭ. М.: Мир, 1986. Т. 1. 536 с.

256. Сверхкритическая флуидная хроматография / Под ред. Смита Р. М.: Мир, 1991.

257. Препаративная жидкостная хроматография / Под ред. Бидлингмейра Б. М.: Мир, 1990. 390 с.

258. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.315 с.

259. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / Под ред. Хенмен А. Москва: "Мир", 1988. 649 с.

260. Шатц В.Д, Сахарова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории, методология, применение в лекарственной химии. Рига: Зинатс, 1988. 336 с.

261. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 463 с.

262. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Г. II Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии / Под ред. Березкина В. Г. М.: Мир, 1980. Т. 1.295 с.

263. Количественный анализ хроматографическими методами / Под ред. Березкина В. Г. М.: Мир, 1990. 319 с.

264. High Performance Liquid Chromatography in Biotechnology / Ed. by Hancock W. S. N.-Y.: Willey John and Sons, Inc., 1990. 564 p.

265. Analytical Capillary Electrophoresis and HPLC in Biotechnology / Ed. by Horvat C. N.-Y.: Dekker M., 1995. 474 p.

266. Ersser R.S., Davey J.F. Amino acid analysis of physiological fluids // J. Chromatogr. 1986. V. 528. № 1. P. 177-250.

267. Tyree R.W., Clausen E.S., Gaddy J.L. Production of propionic acid from sugars by fermentation through lactic acid as intermediate // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1991. V. 50. P. 155-166.

268. Goel A., Lee J., Atai M.M. Supresed acid formation by cofeeding of glucose and citrate in Bacillus cultures // Biotechnol. Progr. 1995. V. 11. № 2. P. 380-385.

269. Ahring B.K., Sandberg M, Angelidakii I. Volatile fatty acids as indicator of process imbalance in anaerobic digestors // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 43. № 4. P. 559-565.

270. Дегтерев E.B., Подгорнова Г.П. Количественное определение L-лейцина и L-изо-лейцина методом хроматографии в тонком слое сорбента // Хим. Фарм. Жур. 1978. Т. 12. № 8. С. 133-135.

271. Niederwieser A., Wadman S.K., Danks D.M. Profiling of amino acids in body fluids and tissues by means of thin-layer chromatgrahy // Clin. Chim. Acta. 1978. V. 90. P. 195-214.

272. Sannen J., Brandeis E., Cash T. The importance of residues 2-arginine in high-affinity angiotensin II // J. Med. Chem. 1986. V. 31. P. 737-741.

273. Lammek В., Melvin P. Synthesis of 8-D-Arg vasopressin analogues, modified in position I // J. of Pharm. 1988. V. 40. P. 423-428.

274. Lammek В., Melvin P. Synthesys and some pharmacological properties of three new analogues of Arg-vasopressin modified in positions 1, 2, 4, 9 // J. of Pharm. 1989. V.41.P. 97-102.

275. CamagBibligr. Service. 1993. V. 76. lip.

276. Nyiredy S.Z., Erdelmeier C.A., Meier B. TLC mobile phase optimization. Procedure using "PRIZMA" model // Planta. Med. 1985. P. 241-254.

277. Mikes O. Laboratory Handbook of Chromatograhic and applied methods. N.-Y.: Ellis Hopwood, 1979. 512p.

278. Шталь E. Хроматография в тонких слоях. М.: Мир, 1965. 580 с.

279. Jork Н., Funk W., Fisher W., Wimmer Н. Thin-Layer Chromatography. Reagents and Detection Methods. VCH, Verlag sgesellshafit, Weinheim, 1990. 453 P

280. Дегтерев E.B. Анализ лекарственных средств в исследованиях, производстве и контроле качества // Рос. хим. журнал. 2002. № 4. С. 43-51.

281. Seracu D. I. Spectra of ninhydrin complexes with 22 amino acids // Anal. Left. 1987. V. 20. P. 1417-1424.

282. Abasi A., Ali R.: Zaidi Z. Effective solvent systems for separation and an improved detection method for amino acid by paper and thin-layer chromatography // Biochem, et Biophys. Methods. 1980. V. 3. P. 311-320.

283. Оксолин. Проспект. M.: Внешторгиздат, 1971. 2 с.301. RTECS NK 542 5000. 1997.

284. А. С. № 957076 СССР // Б. И. № 33. 1983.

285. А. С. № 758694 СССР // Б. И. № 45. 1980.

286. ВФС 42-2446-94. таблетки "Тиофедрин Н".

287. ВФС 42-7947-97. сироп "Бронхолитин".

288. ВФС 42-1670-88. "Оксолин".

289. Зенкова Е.А., Дегтерев E.B. 1,2,3,4-тетрагидро-1,4-диоксо-2,2,3,3-тетрагидроксинафталин (оксолин), как реагент для обнаружения биогенныхаминов методом ТСХ и источник получения нингидринового реактива // Хим. Фарм. Журн. 2000. Т. 34. № 2. С. 40-48.

290. Зенкова Е.А., Дегтерев Е.В. Оптимизация получения нингидринового реактива и 1,2,3,4-тетрагидро-1,2-диоксо-2,2,3,3-тетрагидроксинафталина (оксолина) и возможности его применения // Хим. Фарм. Журн. 2000. Т. 34. № 3. С. 31-33.

291. Ахрем А.А., Кузнецова А.И. Тонкослойная хроматография. М.: Наука, 1964. 71 с.

292. Instrumental Thin-Layer Chromatography / Ed. by D. Janchen Camag. Muttenz. 1983. 54 p.

293. Quantitative TLC and its Industrial Application. N.-Y.: Dekker M, 1987.370 р.

294. КрешкоеА. П. Основы аналитической химии. М.: Химия, 1965. 414с.

295. Kubelka P., MunkM., Techn Z. // Phys. 1931. V. 12. 539р.

296. Kortum G. Reflectionsspectroschie, Spinger. Verlag. Berlin, 1969. 414s.

297. Camag. Camag TLC-Scanner III. Muttenz. 2000. 12 p.

298. The United States Pharmacopeia // The Natural Formular. 2000.

299. European Pharmacopoeia. Supplement. 2000.

300. British Pharmacopoeia. 2001. V. 2. Appendix 3.

301. Validation of Analytical Procedures: Methodology Recommended for Adoption Step 4, of the ICN Process on 6 November 1996 by the ICN Steering Committee.

302. Dammertz W., Renger B. Validation and quality assurance in planar chromatography // Planar Chromatography 2002: Proceedings of the International Symposium on Planar Chromatography Separation. / Heviz, 2002. P. 11-16.

303. Ferencz-Fodor K., Vegh Z., Renger В., Zeller M. Validation and quality assurance of planar chromatographic procedures in pharmaceutical analysis // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 2001. V. 84. P. 1265-1276.

304. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир, 1994.267 с.

305. ДанцерК., Тан Э., МолькД. Аналитика. М.: Химия, 1981. 278 с.

306. Unger К. К. Porous Silica, its properties and use as Support in Column Liquid Chromatography. N.-Y.: Elsevier, 1979. P. 147-167.

307. Dewhins J. V. Polymer-gel interactions in CPC with Organic eluents // J. Liquid Chrom. 1978. V. 1. № 3. P. 279-289.

308. Жданов СЛ. Сравнительное исследование структуры пористых стекол адсорбционными методами и под электронным микроскопом // Докл. АН СССР. 1952. Т. 82. № 2. С. 281-284.

309. Majors R.E. MacDonald F.R. Practical implication of modern liquid chromatography. Column performance // J. Chromatogr. 1973. V. 83. P. 169-179.

310. Нестеров B.B., Чубарова E.B., Красиков В Д., Вензель Б.И., Лупал СД, Беленький Б.Г. Влияние объема пор и методики дробления нахроматографический свойства макропористых стекол // Ж. аналит. Химии. 1982. Т. 37. №9. С. 1665-1669.

311. Вензель Б.И., Жданов С.П. Физика и химия стекла. 1975. Т. 1. № 2. С. 122-128.

312. Нестеров В.В., Мальцев ВТ., Красиков В.Д., Беленький Б.Г. Новые хроматографические колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии синтетических полимеров и биополимеров // Журнал физ. химия. 1991. Т. 65. № 10. С. 2717-2723.

313. Жданов С.П. Пористые стёкла кремнезёмные сорбенты с тонкорегулируемыми параметрами их структуры // Ж. всесоюзного хим. общества. 1989. Т. 24. № 3. С. 298-307.

314. Leitch R.E., Stefanc J. De. Column Packing for Modern Liquid Chromatography // J. Chromatogr. Sci. 1973. V. 11. № 3. H. 105-113.

315. А. С. ПЮткинЛ.А., ГольцоваЛ.И.ПЪЖ. №1. 1950. 1957 с.

316. Peaker F.W., Tweedale C.R. Gel Permiation Chromatography: Gel Preparation and Packing Technique // Nature. 1967. V. 216. № 7. P.75-77.

317. Kato Y. Kido S., Hashimoto T. High resolution Gel-Permiation Chromatography // J. Polym. Sci., Polym. Phys. Ed. 1973. V. 11. № 12. P. 23292337.

318. Hashimoto Т., Sasaki H., Aiura M., Kato Y. High-Speed Aqueous Gel-Permiation Chromatography // J. Polym. Sci., Polym. Phys. Ed. 1978. V. 16. № 10. P.1788-1803.

319. Vivileschia R, Zoghotobody В., Thimot N., Quinn H. Exclusion chromatography of polymers and related materials // N.-Y., Academic Press. 1978. P. 11-27.

320. Yau W.W., Grinnard C.R., KirklandJ.J. Broad-rouge linear:calibration in high-performance size-exclusion chromatography using column packing with bimodal pores // J. Chromatogr. Polym. Simposia. 1978. V. 149. P. 465-487.

321. Виленчик Л.З., Куренбин О.И., Жмакина Т.П., Беленький Б.ГВыбор сорбента для получения линейной калибровочной зависимости в гель-проникающей хроматографии полимеров // Высокомол. соед. 1980. Т. А22. № 12. С. 2801-2804.

322. Красиков В.Д., Жмакина Т.П. Поиск сорбента, обеспечивающего линейную калибровочную зависимость в гель-проникающей хроматографии полимеров // VI Научная конференция молодых ученых: Сб. науч. докл. / ИВС АН СССР. Ленинград, 1980. С. 7.

323. Билетик Л.З., Куренбин О.И., Жмакина Т.П., Беленький Б.Г. Хроматографическая порометрия // Докл. АН СССР. 1980. Т. 250. №. С. 381383.

324. А. С. № 1037938 // Виленчик Л.З., Куренбин О.И., Жмакина Т.П., Нестеров В.В., Красиков В.Д., Беленький Б.Г., Жданов С.П., Вензель Б.И.// Б.И.

325. Красиков В.Д. Высокоэффективная эксклюзионная жидкостная хроматография блок-сополимеров: Автореф. дис. .канд. хим. наук. Л., 1985. 24 с.

326. Замойская Л.В., Миловская Е.Б. Синтез блок-сополимеров под влиянием систем алюминийорганическое соединение-перекись в процессе низкотемпературной радикальной полимеризации // Высокомол. соед. 1979. Т. А21. № 9. С. 1974-1980.

327. Нестеров В.В., Замойская Л.В., Красиков В Д., Мартьянова Т.П. Исследование блок-сополимеров полистирол-полиметилметакрилата с помощью высокоэффективной гель-проникающей хроматографии // Высокомол. соед. 1983. Т. А25. № 12. С. 2561-2567.

328. Wagner H.L. The Polymer Standard References Materials Program at the National Bureau of Standards. Washington. 1973. P. 17-25.

329. Патент США (Du Pont) № 3591518 // Mc Millan D. //1971.

330. Айлер З.Л. Химия кремнезема. M.: Мир, 1982. Т. 1. 416 с.

331. Патент США. № 3489516 //Айлер Р. // 1975.

332. Unger К., Schick-Kabb J., Krebs K.F. Spheric Silikagel for Chromatography //J. Chrom. 1973. № 83. P. 5-23.

333. A.C. (ЧССР). № 232120 // Способ приготовления дисперсного гидроксида кремния // БерекД., Новак И. // Б.И. № 23, 1987.

334. А.С. (ЧССР) № 217020 // Лахема. Сферический силикагель // Б.И. № 11, 1985.

335. Majors R.E. Recent Advances in HPLC Packing and Columns // J. Chrom. Sci. 1980. V. 18. P. 488-511.

336. Novak I., Buszewski В., Garaj J., Berek D. Influence of pore structure of silica packing on HPLC column Characteristics // Chem. Papers. 1990. V. 44. № 1. P. 31-43.

337. Iler R.K. Solubility of silicagel // J. Colloid. Interface Sci. 1973. V. 43. P. 399-411.

338. Iler R.K. The Chemistry of Silica. Solubility, Polymerization, Colloid and Burface Properties. N.-Y.:John Willey & Sons Inc. 1979. 866 p.

339. Weil W.A., Marboe Е.С. The Constitution of Glasses. N.-Y.: Willey, 1967. V.2.P. 1119-1120.

340. Нестеров В.В., Красиков В.Д., Згоник В.Н., Меленевская Е.Ю., Кошелева И.В., Беленький Б.Г. Исследование блок-сополимеров полистирола и полибутадиена методом гель-проникающей хроматографии и озонолиза / Высокомол. соед. 1983. T. А2. № 12. С. 2568-2574.

341. Згоник В.Н., Красиков В.Д., Меленевская Е.Ю., Нестеров В.В. О роли ассоциированных форм полибутадиениллитиевых цепей в процессах гомо- сополимеризации // IV Международный симпозиум по гомогенному катализу: Сб. науч. докл. / JL, 1984. Т. 3. С. 61-62.

342. Березкин В.Г., Алиноев В.Р., Немировская И.Б. Газовая хроматография в химии полимеров. М.: Наука, 1972. 79 с.

343. Березкин В.Г. Хроматографические методы в газовой хроматографии. М.: Химия, 1980. 23 с.

344. Туркова Л. Д., Беленький Б.Г. Пиролитическая газовая хроматография сополимеров стирола и метилметакрилата // Высокомол. соед. 1970. T. А12. № 2. С. 457-471.

345. Разумовский С Д., Заиков Г.Е. Озон и его реакции с органическими соединениями. М.: Наука, 1974. 48 с.

346. Позняк Т.Н. Разработка и применение экспериментальных методов исследования продуктов полимеризации на основе озонолитических реакций: Дис. .канд. хим. наук. М., 1980. 12 с.

347. Cadle R.D., Schadt С. Kinetice of Reaction of Olefins with Ozone // J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. № 12. P. 6002-6004.

348. Williamson D.E., Cvetanivic R.J. Rates of Ozone-Paraffin Reactions in Carbons Tetrachloride Solution // J. Am. Chem. Soc. 1970. V. 92. № 10. P. 29492952.

349. Lucki J., Ronby В., Rabec J.F. Comparative Studies of Reactione of Commercial Polymers with Molecular Oxygen, Singlet Oxygen, Atomic Oxigen and Ozon. II. Reactions with 1,2-Polybutadiene. // Europ. Polym. J. 1979. V. 15. № ll. p. 1Ю1-1108.

350. Красиков В.Д. Исследование блок-сополимеров методами двухдетекторной гель-проникающей хроматографии и озонолиза // VI Научная конференция молодых ученых: Сб. науч. докл. / Л., 1980, с. 6.

351. Нестеров В.В., Красиков В.Д., Чубарова Е.В. Исследование блок-сополимеров методами двухдетекторной ГПХ и озонолиза // П Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии: Сб. науч. докл. / Звенигород, 1982. С. 47-48.

352. Hackathorn M.J., Brock M.I. Alternating Structures in copolymers as Elucidated by Microozonolysis // J. Polym. Sci. 1975. V. 13. № 4. P. 945-954.

353. Tanaka J., Sato M., Nakifutani J. Determination of Sequence Length Distribution in SBR by Ozonolysis. GPC Method // Polymer 1981 V. 22. P. 17231726.

354. Balke S.T., Patel R. D. Orthogonal Chromatography. Polymer Croes-Fractionation by Coupled Gel Permiation Chromatography. In: Polymer Characterization / Ed. by Craver C.D. Washington: Am.Chem Soc. 1983. P. 281310.

355. Малахова И. И., Красиков В Д. Отечественный оптический денситометр «ДенСкан-2», его новые возможности и применение в количественной ТСХ // Хроматогр. Методы в химии, биологии, медицине: Сб. науч. докл. / Минск, 1995. С. 117-127.

356. Кулев Д.Х., Пацовский А.П., Красиков В.Д., Малахова ИИ. Идентификация и определение содержания красителей в алкогольных напитках // Партнёры и конкуренты. 200. № 4. С. 26-30.

357. Герасимов А.В., Красиков В Д., Малахова ИИ. Компьютерная хроматоденситометрия и её применение при анализе синтетических пищевых красителей // Всероссийский конф. Химический анализ веществ и материалов: Сб. науч. докл. / Москва, 2000. С. 392-393.

358. Красиков В.Д., Малахова И.И., Герасимов А.В. Денситометры на основе сканирующих устройств для ТСХ и электрофореза // Всероссийский конф. Химический анализ веществ и материалов: Сб. науч. докл. / Москва, С. 3.

359. Grosz J., Jonas О. Rapid and quantitative determinational of aspartame and alitame by thin-layer chromatography // J. Planar Chromatogr. 1990. V. 3. P. 261-263.

360. Postaire E., Sarbach C., Deivarde P., Regnault C. A new method of derivatization in planar chromatography: Overpressure derivatization // J. Planar Chromatogr. 1990. V. 3.P. 247-250.

361. Planar Chromatography 2002. Modern Thin-Layer Chromatography. Camag. Muttenz. 2002. 40 p.

362. MerckE. Merck. Catalog 2001-2002. Darmstadt, 2001.

363. Touchstone J.C., Mansfield C.T. Quantitative Thin-Layer Chromatography. N.-Y.: John Willey, 1973. 372 p.

364. KreuzigF. Chromatographic. 1980. V. 13. P. 238-240.391 .KreuzigF. Chromatographic. 1977. V. 142. P. 441-447.

365. Pachaly P. Dunnshicht-Chromatographie der Apotheka, Wissenschafilich Veriagages. Stutdgart, 1996. 45 s.

366. Degterev E.V., Degtiar W.G., Tyaglov B.V., Tarasov A.P., Kryeor V.M., Malakhova I.I., Krasikov V.D. Quantitative analysis of L-tryptophan in fermentation broth//J. Planar Chromatogr. 2002. V. 13. P. 191-194.

367. Sizova I.A., Tyaglov B.V., Zvenigorodskii V.I. Quantitative determination moenomycin antibiotics by thin layer chromatography // J. Planar Chromatogr. 1997. V. 10. P. 200-205.

368. Rolka K, Xie J. Separation of a-amino acids by thin-layer Chromatogr. //J. Med. Chem. 1989. V. 32. P. 1497-1503.

369. Хохлов А.С., Щукина JI.A., Шемякин M.M. II Журн. Общей химии. 1951. Т. 21. С. 1016-1033.

370. Kaiser R.E. Simple and Instrumentalized High Perfomance Planar Chromatography. HFC-Hyper Card Course-Paper Version. I.F.E.A.R. Bad Duerkheim, 1996. 157 p.

371. Kaiser R.E. Instrumental HPTLC. Huthing: Heidelberg, 1980. 179 p.

372. Руководство по современной тонкослойной хроматографии / Под ред. Ларионова ОТ. Москва. 1994. 180 с.

373. Тяглое Б.В., Тарасов А.П., Дегтерев Е.В, Крылов В.М., Новицкий А.П., Полубенцева М.И., Малахова И.И., Красиков В.Д. Видеоденситометр "Денсискан-1" для количественной тонкослойной хроматографии. // Биотехнология. 1992. № 5. С. 44-47.

374. Полубенцева М.И., Иванов КВ., Новицкий А.П. Особенности алгоритмов обмера, используемых в компьютерном видеоденситометре "ДенСкан-04" .// Количественная ВЭТСХ. Проблемы и их решения: Материалы 2ой школы-семинара / Санкт-Петербург, 2002. С. 9-17.

375. Красиков В.Д. Высокоэффективная количественная ТСХ // Всероссийский симпозиум "Современные проблемы хроматографии". Сб. научн. докл. / М. 2002. С. 11.

376. Красиков В.Д. Современная планарная хроматография // Ж. Аналитической химии. 2003. Т. 58. №. 8. С. 792-807.

377. Беленький Б.Г., Гурковская Е.А., Коган Ю.Д., Красиков В.Д. Тонкослойная хроматография в России // 100 лет хроматографии. Москва. 2003.С. 61-99.

378. Малахова И.И., Красиков В.Д. Современная высокоэффективная тонкослойная хроматография // Лабораторный журнал. 2002. № 1. С. 30-31.

379. Красиков В.Д. Современная тонкослойная хроматография // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: Сб. науч. докл. / Казань. 2003. С. 521.

380. Allwonh J., Ebel S. Testing and validation of TLC scanners // J. Planar Chromatography. 1989. V. 2. P. 71-75.

381. Densitometry in Thin-Layer Chromatography / Ed. by Touchstone J.C. andSherma J. N.Y.: Wiley-Interscience. 1989. 489 p.

382. Petrovic M., Lazaric K., Babic S. Validation of TLC determination with CCD-camera and slit-scanning densitometers // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1999. V. 82. P. 25-30.

383. Ebel S., Glaser E. II J. High Resolut. Chromatogr. Commun. 1979. V. 2. P. 36-49.

384. Kasiser R.E. Instrumental HPTLC // Proceedings of 1st International. Symposium on Instrumental HPTLC. Bad Dürkheim. Huthig. Heidelberg, 1980. P. 165-184.

385. Betke H., Santi W., Frei К. Data pair technique application in TLC // J. Chrom. Sei. 1974. V. 12. P. 392-398.

386. Ford T.S., Radin N.S. Quantitation of thin-layer chromatograms with an Apple II computer based video-densitometer // Anal. Biochem. 1985. V. 150. P. 359-363.

387. Pongor S. High-speed video-densitometry principles and applications // J. Liquid Chromatogr. 1982. V. 5. P. 1583-1595.

388. Lenkeyi В., Csanyi J., Nanasi P. Rapid determination of sucrose and fructose in biological samples by video densitometry // J. Liquid. Chromatogr. 1986. V. 9. P. 1869-1875.

389. Papp S., Toth E., Polak В. Polyamine analysis in series of samples by OPLC // Proceedings of International Symposium on TLC with special Emphasis on OPLC: / Szeged, 1984. P. 67.

390. Ebel S. The chromatographic uncertainly principles // Chromatographic 1987. V. 20. P. 123-134.

391. Новицкий П.В., Зограф И.А. Оценка погрешностей результатов измеренийю 2-е изд. Л.: Энергоатомиздат, 1991. 121 с.

392. Нестеров В.В., Красиков В.Д., Чубарова Е.В., Беленький Б.Г. Исследование блок-сополимеров методом гель-проникающей хроматографии //Высокомол. соед. 1982. Т. А24. № 6. С. 1330-1335.

393. Ерусалимский Б.Л., Любецкий С.Г. Процессы ионной полимеризации. Л.: Химия, 1974. 45 с.

394. Brown T.L. The Structures of Organolithium Compounds // Adv. Organomet.Chem. 1965. V. 3. P. 365-395.

395. Johnson A.F., Worsfold D.J. Anionic Copolymerization of Styrene and Butadiene//Makromol. Chem. 1965. B. 85. S. 273-279.

396. Ohlinger R., Bandermann F. Kinetik der Wachstumereaktionen der Copolymerisation von Butadien und Styrol mit Lithiumorganylen // Makromol. Chem. 1982. B. 181. S. 1935-1939.

397. Nesterov V.V., КигепЫп O.I., Krasikov V.D. Belenkii B.G. Determination of Molecular-Weight Distribution and Average MolecularWeights of Block Copolymers by Gel-Permiation Chromatography // Talanta, 1987. V 34. P. 161-165

398. Баранцева A.P., Красиков В.Д., Степанов В.В. Исследование стабильности активного центра в катионной полимеризации цис-1,2-диметоксиэтилена. В кн.: Химия и физика высокомолекулярных соединений / Л, 1983. С. 23-24.

399. Степанов В.В., Баранцева А.Р., Нестеров В.В., Красиков В.Д., Скороходов С. С. Попытка синтеза блок-сополимеров последовательной сополимеризацией цис-1,2-диметоксиэтилена с бензиловым эфиром. В кн.: Успехи ионной полимеризации / Прага, 1983. С. 47-48.

400. Степанов В.В., Кланин С.И., Троицкая A.B., Скороходов С. С. Исследование катионной полимеризации 1,2-диалкоксиэтиленов // Высокомол. соед. 1976. Т. А18. С. 821-824.

401. Higashimura Т., Sawamoto М. Living Polymerization and Selective Dimerization: Two Extremes of the Polymer Synthesis by Cationic Polymerization // Adv. Polym. Sei. 1984. V. 62. P. 78-94.

402. Dobbin C.J., Rudin A., Tchir M.F. Evaluation of GPC Methods for Estimation of Mark-Houwink-Sakurada Constants // J. Appl. Polym. Sei. 1980. V. 25. № 12. P. 2985-2992.

403. Stepanov V.V., Barantseva A.R., Krasikov V.D., Nesterov V.V., Skorohodov S.S. Untersuchung des Verhaltens von Poly (dimethoxyethylen) bei der Copolymerisation mit Vinylether (E) // Acta Polymerica. 1985. B. 36. 11. S. 605-609.

404. Stepanov V.V., Barantseva A.R., Krasikov V.D., Nesterov V.V. Die Reaction von Polysteren-Makroanionen mit Poly (dimethoxy-ethylen)-Makrokationen (E) // Acta Polymerica. 1985. B. 36. № 11. S. 609-612.

405. Skorokhodov S.S., Stepanov V.V., Nesterov V.V., Krasikov V.D. Synthesis of Poly (cis-1, 2-dimethoxyethylene of very high molecylar weight // Acta Polymerica. 1986. B. 37. № 9. P. 583-587.

406. Erussalimsky В., Belenkii В., Davidjan A., Nesterov V, Nikolaev N. Krasikov V., Sgonnik V, Sergutin V. Subcatalytic effects in the anionic polymerization processes. In: 27 Intern. Symp. on Macromolecules / Strasbourg, 1981. V. l.P. A182-A185.

407. Davidjan A., Nikolaev N., Sgonnik V, Belenkii В., Nesterov V., Erussalimsky B. Zur Natur der durch Katalytische Mengen von N,N,N',N'

408. Tetramethylathylendiamin in Organolithium / Isopren Systemen bedingten Effekte //Makromol. Chem. 1978, B. 177. S. 2469-2479.

409. Davidjan A., Nikolaev N., Sgonnik V., Belenkii В., Nesterov V., Krasikov V., Erussalimsky B. Subkatalytische Effect im System Isoprene / Oligoisoprenillithium / N,N,N',N'-Tetramethylendiamin // Makromol. Chem. 1978. B. 179. S. 2155-2160.

410. Davidjan A., Nikolaev N., Sgonnik V., Krasikov F., Belenkii В., Erussalimsky B. Subkatalytische Effect im Systemen Isoprene / Organolithium / Elektronendonator, 1,2-Dimethoxyethan II Makromol. Chem. 1981. B. 182. S. 917-920.

411. Hendrickson J.G. Molecular Size Analysis Using Gel Permiation Chromatography // Anal. Chem. 1968. V. 40. № 1. P. 49-53.

412. Беленький Б.Г., Давтян M.JI., Добычин Д.П., Красовский А.Н., Нефедов П.П. Влияние модификации поверхности пористых кремнеземов на элюционное поведение полистриролов в различных растворителях // Высокомол. соед. 1975. Т. А17. № 12. С. 2811-2812.

413. Nesterov V.V., КигепЫп 0.1., Krasikov F.D., Belenkii B.G. Determination of Molecular-Weght Distribution and Averege Molecular Weghts of Blok Copolumers by Gel-Permiation Chromatography // Talanta. 1987. V. 34. № 1. P. 161-165.

414. A.C. № 1453320 // Способ хроматографического анализа ароматических аминов. // Красиков В.Д., Нестеров В.В., Виленчик Л.З., Беленький Б.Г., Склизкова В.П., Кудрявцев В.В., Котон М.М. //Б.И. № 3, 1989.

415. Виленчик Л.З., Склизкова В.П., Тенникова Т.Б., Бельникевич Н.Г., Нестеров В.В., Кудрявцев В.В., Беленький Б.Г., Френкель С.Я., Котон М.М.

416. Хроматографическое исследование растворов поли-(4,4 -оксидифенилен) пиромеллитамидокислоты //Высокомолек. соед. 1985. Т. 27. № 5. С. 927-930.

417. Калистов О.В., Светлое Ю.Е., Силинская КГ. и др. Особенности гидродинамического поведения молекулярных клубков полиамидокислоты // ДАН СССР. 1979. Т.244. № 2. С. 396-399.

418. Нечаев П.П., Выгодский Я.С., Заиков Т.Е., Виноградова С.В. О механизме образования и распада полиимидов // Высокомолек. соед. 1976. Т. А18.С. 1667-1679.

419. Коршак В.В., Виноградова С.В. Равновесная поликонденсация. М.: Наука, 1968. С. 54-89.

420. Эмануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. М.: Наука, 1974. 370 с.

421. Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Згонник В.Н., Малахова И.И., Меленевская Е.Ю. Тонкослойная хроматография блок-сополимеров: механизм разделения, определение полидисперсности // Высокомолек. соед. 1991. Т. 33А, № 11. С. 2487-2493.

422. Патент РФ № 2078342 // Способ разделения аминокислот в биологических жидкостях. // Тяглое Б.В., Дегтерев Е.В., Малахова И.И., Красиков ВД Помазанов В.В. //Б.И. № 12, 1997.

423. Дегтерев Е.В., Тяглое Б.В., Красиков В.Д., Малахова И.И., Гаевский А.В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе биологически активных веществ. В кн.: 100 лет хроматографии / Под ред. Руденко Б.А. М.: Наука, 2003. С. 233-268.

424. Degterev E.V., Degtiar W.G., Polanuer В.М., Tyaglov B.V., Krylov V.M., Malakhova I.I., Krasikov V.D. Quantitative Analisis of L-Triptophan in Fermentation Broths //J. of Planar Chromatography. 1996. V. 9. P. 35-38.

425. Красиков В Д. Современная планарная хроматография // Журнал аналитической химии. 2003. Т. 58. № 8. С. 792-807.

426. Малахова И.И., Красиков ВД., Дегтерев Е.В., Кузнецов Э.В., Тяглое Б.В. Тонкослойная хроматография свободных аминокислот. Подбор условий для разделения L-лизина, L-гомосерина и L-треонина // Биотехнология. 1996. № 11. С. 27-32.

427. Krasikov V.D., Malakhova II, Degterev E.V., Tyaglov B.V. Planar Chromatography of Free Industrial Amino Acids // Jornal of Planar Chromatography. 2004. V. 17. P. 113-122.

428. Красиков В.Д., Малахова И.И. Метод планарной хроматографии в количественном определении свободных аминокислот в ферментационных растворах промышленных штамм-продуцентов // Журнал прикладной химии. 2004. Т. 77. Вып. 6. С. 919-928.

429. Malakhova I.I., Krasikov V.D., Degterev E.V., Tyaglov B.V. Quantitative defermination of industrial amino acids // J. Planar. Chromatogr. 1996. V. 9. P. 375-378.

430. Дегтерёв E.B., Дегтяръ В.Г., Красиков В.Д., Крылов В.М., Малахова И.И., Тарасов А.П., Тяглое Б.В. Количественное определение L-триптофана методом хроматоденситометрии // Хим.Фарм. Журнал. 1994. № 8-9.С. 52-55.