автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Количественная высокоэффективная тонкослойная хроматография аминокислот

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Выбор хроматографического метода для количественного определения аминокислот.

2.2. Выбор условий для разделения АК в тонких слоях силикагеля.

2.3. Окрашивание хроматограмм.

2.4. Количественная обработка результатов методом денситометрии.

2.4.1. Инструментальные способы измерения.

2.4.2. Количественная оценка результатов измерений.

2.4.3. Анализ ошибок в тонкослойной хроматографии.

2.5. Валидация хроматографических методов анализа.

2.5.1 Предвалидационные тесты в планарной хроматографии.

2.5.2. Валидация различных типов аналитических (включая фармакопейные) методов.

2.5.3. вЬР в тонкослойной хроматографии.

3. Техника и методика проведения эксперимента.

3.1. Приборы и материалы.

3.2. Реактивы.

3.3. Приготовление растворов стандартных образцов аминокислот, проб плазмы крови и проб КЖ.

3.5. Подготовка хроматографических пластинок.

3.5. Хроматографические системы, используемые в работе и их приготовление.

3.6. Подготовка хроматографической камеры.

3.7. Приготовление раствора нингидринового реактива.

3.8. Нанесение стандартных образцов (Бг Б^), проб нативной сыворотки крови О^гИм) и проб КЖ (ИгИм) на хроматографическую пластинку.

3.9. Проявление хроматограмм.

3.10. Обработка хроматограммы нингидриновым реактивом.

3.11. Количественная обработка хроматограмм.

3.12. Определение аминокислот методом ВЭЖХ.

3.13. Выделение неизвестного вещества, имеющего хроматографическую подвижность и УФ-спектр, аналогичные фенилаланину из лейцин-содержащей КЖ с помощью колоночной хроматографии.

3.14. Регистрация ЯМР-'Н спектров.

4. Обсуждение результатов.

4.1. Хроматографический комплекс для количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

4.1.1. Разработка состава слоя для пластин тонкослойной хроматографии.

4.1.2. Оборудование для высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

4.1.3. Компьютерный видеоденситометр «ДенСкан» для количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии: состав прибора, программное обеспечение.

5. Количественная высокоэффективная тонкослойная хроматография аминокислот.

5.1. Выбор метода нанесения обнаруживающего реагента на хроматограмму для визуализации пятен аминокислот.

5.2. Выбор оптимальных условий проведения цветной реакции для визуализации пятен аминокислот на хроматограммах.

5.3. Прямое разделение многокомпонентных смесей аминокислот сочетанием методов двухмерной и одномерной тонкослойной хроматографии.

5.4. Анализ аминокислот в биологических жидкостях.

5.5. Анализ аминокислот в культурачьных жидкостях.

5.5.1. Анализ оксиаминокислот серина, гомосерина и треонина, а также сопутствующих им в КЖ аминокислот.

5.5.2. Анализ гомосерина и сопутствующих аминокислот в КЖ штамма-продуцента гомосерина.

5.5.3. Количественное определение треонина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот.

5.6. Количественное определение ароматических аминокислот - триптофана и фенилаланина в образцах КЖ.

5.6.1. Разработка методов количественного определения триптофана.

5.6.2. Анализ фенилаланина в культуральных жидкостях.

5.7. Анализ основных аминокислот - лизина, аргинина и орнитина в промышленных образцах КЖ.

5.7.1. Применение методов хроматоденситометрии и ВЭЖХ для определения содержания лизина в КЖ.;.

6. Выводы.

7. Литература

Целыо настоящей работы была разработка методов определения широкого спектра аминокислот (АК) методом количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

Аминокислоты1 являются основным строительным материалом для синтеза специфических тканевых белков, ферментов, пептидных гормонов и других физиологически активных соединений. Часть аминокислот (аланин, аспа-рагин, аспарагиновая кислота, глицин, глутамин, глутаминовая кислота, про-лин, серии, тирозин и цистеин) синтезируются в организме человека. Это, так называемые, заменимые аминокислоты. Другие, относящиеся к незаменимым аминокислотам (аргинин, валин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фени-лаланин, лейцин, изолейцин и гистидин), организмом не синтезируются и поступают внутрь организма с пищей.

Аминокислотам принадлежит большая роль в современной фармакологии. Они имеют большое функциональное значение не только как структурные элементы белков и других эндогенных соединений. Некоторые из ни^ выступают в качестве нейромедиаторных веществ (глутаминовая и аспарагиновая кислоты, глицин, таурин, у-аминомасляная кислота и др.). Фенилаланин и тирозин являются предшественниками в биосинтезе дофамина, норадреналина и адреналина; триптофан - предшественником серотонина, а гистидин - предшественником гистамина. Производными аминокислот являются энкифалины, эндорфины, динорфины и другие нейропептиды.

Некоторые аминокислоты (глутаминовая, у-аминомасляная, глицин, метионин, гистидин, цистеин и таурин) нашли самостоятельное применение в качестве лекарственных средств, синтезируемых с помощью аминокислот. Например, даралгин (тирозил-2-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин) применяется в качестве лечебного средства при обострениях язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки; каптоприл - 1-[(28)-3мсркапто-2-метилпропионил]-Ь-пролин используется для лечения гипертонической болезни и застойной сердечной недостаточности; тимоген (глутамил-триптофан)-иммуностимулятор [1].

Специальное значение имеют смеси аминокислот, используемые в качестве средств для парентерального питания. При ряде патологических состояний, таких как непроходимость пищевода, нарушение всасывания из кишечника, острые интоксикации и др., а также операциях на желудке и кишечнике возникает необходимость в парентеральном введении продуктов, обеспечивающих белковое питание организма [1]. Парентеральное введение белков, как правило, приводит к аналфилаксии. Аминокислоты в отличии от белков не обладают ни видовой, ни тканевой специфичностью, и поэтому их растворы в чистом виде вполне обеспечивают потребность организма в белках. Для полноценного белкового питания необходимо, чтобы применяемые препараты содержали набор аминокислот, в том числе незаменимые.

Существующие в настоящее время препараты для парентерального питания содержат необходимые организму аминокислоты. В качестве примера можно привести: полиамин (содержит аланин, аргинин, валин, гистидин, глицин, изолейцин, лейцин, лизин и триптофан), вамин (раствор препарата содержит аланин, аргинин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, цистин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин, таурин и валин), ваминолак - раствор для парентерального питания новорожденных (содержит 18 аминокислот, подобранных в соотношениях, соответствующих аминокислотному составу грудного молока) [1]. Необходимо отметить, что именно эти препараты в настоящее время заменили смеси аминокислот, полученные с помощью глубокого гидролиза белка.

К другим областям применения аминокислот можно отнести использо

1 Здесь и далее имеются ппиду природные аминокислоты, имеющие Ь-конфигурацию ванне их в качестве пищевых [2] и кормовых добавок [3]. В настоящее время, как и ранее, чистые аминокислоты получают и получали с помощью микробиологического синтеза [4, 5].

Актуальной задачей для современого здравоохранения является диагностика аминоацидурий, наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена аминокислот. Анализ АК, их количества и качества, ответственных за возникновение различных отклонений в организме, является одним из наиболее информативных подходов в клинической и лабораторной диагностике [197].

При производстве чистых АК разработка процесса микробиологического синтеза включает в себя ряд ступеней, которые можно разделить на четыре группы:

1. Создание штаммов-продуцентов аминокислот с использованием методов классической генетики и селекции, а также генной инженерии.

2. Выбор условий их культивирования с учетом физиологических особенностей микроорганизмов, доступности сырья, уменьшения времени процесса ферментации, повышения накопления целевого продукта при одновременном снижении накопления побочных веществ.

3. Выбор методов выделения и очистки основного продукта, а в некоторых случаях и побочных продуктов, представляющих интерес.

4. Исследование стоков и выбросов, образующихся в результате не только процесса культивирования, но и очистки.

На всех этих этапах методы аналитического контроля играют первостепенную роль.

Так, на первом этапе, когда селекция направлена на повышение уровня целевого продукта, необходимо контролировать его содержание. Наряду с этим необходимы методы оценки ферментов, обеспечивающих биосинтез аминокислот и их предшественников.

На втором этапе оптимизация условий культивирования предусматривает оценку влияния изменения параметров процесса ферментации величина рН, уровень аэрации, тип и концентрации субстратов) на накопление основной и побочных аминокислот.

На третьем этапе необходим контроль за степенью извлечения основной аминокислоты из культуральной жидкости (КЖ) и содержанием в ней примесей. А

Наконец, на четвертом этапе важной задачей является определение компонентов жидких стоков, пригодных для утилизации.

КЖ штаммов-продуцентов аминокислот представляют собой сложные смеси, содержащие компоненты исходной питательной среды; продукты их модификации, образующиеся в процессе стерилизации; клетки микроорганизмов, их фрагменты; высокомолекулярные соединения (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т. д.); низкомолекулярные соединения (аминокислоты, олигонуклеотиды, углеводы, окси- и кетокислоты и т. д.); продукты неэнзима-тических процессов, протекающих при ферментации (пигменты, основания Шиффа и т. д.); а также неорганические соединения, главным образом различные соли, входящие в состав питательных сред. Анализ КЖ дополнительно усложняется тем. что на фоне водной матрицы общее содержание органических веществ может достигать 30%.

Вследствие того, что объекты для определения состава АК ( биологические и культуральные жидкости, фармацевтические препараты и т.п.) очень сложны, анализировать их с помощью таких физико-химических методов, как спектрофотометрия,спектрофлуореметрия, ЯМР и др. является практически невозможным. Ферметативные методы анализа также не всегда обеспечивают получение достоверных результатов. Частичное разделение на группы их компонентов с помощью отгонки, экстракции и высаливания приводит к увеличению времени, стоимости анализа и зачастую к малодостоверным результатам. Вследствие этого при анализе аминокислот большое значение приобретают хроматографические методы, которые обеспечивают частичное фракционирование исследуемой пробы непосредственно в процессе анализа. Кроме того, при использовании хроматографических методов, как правило, удается добиться не только отделения аминокислот от сопутствую-щихкомпонентов, обладающих близкими свойствами и характеристиками, но и их количественного определения.

Основными требованиями, предъявляемыми к хроматографическим методам для анализа АК, на наш взгляд, являются следующие: »

- простота

-экспрессность

- надежность

- достоверность

- дешивизна.

Простота и быстрота метода обеспечивают его массовое использование, особенно при клинических и лабораторных исследованиях, а также в условиях производства; неточность и ненадежность метода, вообще не должны подлежать рассмотрению, а дороговизна метода сильно ограничивает возможности. Возвращаясь к вопросу о достоверности и надежности метода, следует отметить, что требования, предъявляемые к аналитической хроматографии, например, в биохимии и биотехнологии существенно различаются. Так, в биохимии подходящим считается метод, обеспечивающий ошибку не более 15% и воспроизводимость 90% [6]. Аналогичные требования предъявляются к хроматографическим методам на стадии создания штаммов-продуцентов амнокислот. Однако, на этапе оптимизации процесса ферментации необходима более высокая точность анализа - ошибка не должна превышать 3%. То же самое требование предъявляется к аналитической хроматографии при разработке стадии выделения и очистки основной аминокислоты, поскольку 10-15 процентная ошибка может привести к выпуску препарата недостаточной чистоты или чрезмерно высоким потерям на этой стадии, что неприемлемо в условиях крупнотоннажного производства. Так, например, на Бердском биохимическом заводе (г. Бердск, Новосибирская область) для производства лизина используются ферментеры емкостью 100 м3.

Хроматографические методы, которые применяются, а также которые мы собираемся использовать для разделения и количественного определения аминокислот, будут рассмотрены в литературном обзоре. и

2. Литературный обзор.

6. Выводы

1) Разработано и налажено производство хроматографического комплекта для высокоэффективной тонкослойной хроматографии, включая первый отечественный видеоденситометр серии "ДенСкан".

2) Для проведения количественного анализа АК найдены оптимальные условия проведения цветной реакции на хроматограммах: обработка хроматограммы проводится нингидриновым раствором методом погружения с экспозицией хроматограммы в кювете с раствором НГ реактива - 17-20 сек.; время проведения цветной реакции - 30-40 мин.; температура проведения цветной реакции - 45-50°С. Установлено, что окраска продуктов реакции нингидрина с аминокислотами различных классов на хроматограммах устойчива при температуре 21°С в интервале от 0,5 до 7,0 часов.

3) Разработаны условия разделения смеси 23 свободных аминокислот с использованием методов двухмерной и одномерной тонкослойной хроматографии.

4) Разработан способ разделения и количественного определения аминокислот в биожидкостях для диагностики наследственных заболеваний - аминоцидурий.

5) Разработаны методы количественного анализа ароматических, основных, неполярных и оксиаминокислот аминокислот в КЖ штаммов-продуцентов: серина, треонина, гомосерина, триптофана, фени-лаланина, лизина, орнитина, аргинина, валина. Показана возможность определения гомолейцина и фенилаланина при содержании последних в КЖ штаммов-продуцентов валина и лейцина 0,1% и ниже по отношению к целевым продуктам, а также количественное определение ряда АК в производственных жидких отходах и сточных водах.

6) Показана возможность образования продуктов конденсации аминокислот с углеводами с образованием оснований Шиффа.

Установлено, что содержание основания Шиффа в КЖ может достигать 6 % по отношению к целевому продукту. На основании полученных результатов даны рекомендации о необходимости включения в технологический регламент производства стадии подкисления сливных КЖ штаммов-продуцентов АК перед проведением выделения, что позволит увеличить выход целевого продукта на 3-6%.

1. М. Д. Машковский, Лекарственные средства, "Новая волна", Москва, т. 1 и 2, 2000.

2. В. Г. Дебабов, Биотехнология, Наука, Москва, 1994, с. 425.

3. В. JI. Марков, А. Е. Варшавский, Наука и высокие технологии в России на рубеже третьего тысячелетия, "Наука", Москва, 2001, с. 635.

4. Т. Давени, Я. Грей, Аминокислоты и белки, Мир, Москва, 1976, с.340.

5. И. Ф. Кленова, Н. А. Яременко, Ветеринарные препараты в России, Сельхозиздат, Москва, 2000, с. 544.

6. С. Hartmann, D. L. Massart, В. D. McDowall, Validation of bioanalytical techniques, J. Pharm. Biomed. Analysis, v. 12, 1994, p. 1337-1345.

7. G. Sarwar, H. G. Botting, Analysis of nutritionally important amino acids in food and physiological fluids, J. Chromatogr., v. 615, 1993, p. 1-22.

8. K. Watanebe, H. Dansako, N. Asada, M. Sekai, Effects of chemical modification of arginine residnes outside the active site cleft of ricin, Biosci. Biotechnol. Biochem., 58(4), 1994, p. 716-721.

9. Ж. Гитон, К. Гийемен, Количественная газовая хроматография, "Мир", Москва, 1991, с. 520.

10. P. Husek, Н. М. Liebich, Organic and amino acids profiling by direct treatment of deprotenized plasma with ethyl chlorformiate, J. Chromatogr., v. 656, 1994, p. 37-43.

11. P. Husek, Amino and long-chain fatty acids esterified by action of alkyl chloroformiates and analyzed by capillary gas chromatography, J. Chromatogr., v. 615, 1993, p. 334-338.

12. P. Husek, Capillary GC analysis of biogenic amines, their precursors and cataboltes after fast derivatization with ethyl chlorformiate, J. Microcol. Sep., v. 5, 1993, p. 101-103.

13. P. Husek, Simultananeus profile analysis of plasma amino and organicacids by capillary gas chromatography, J. Chromatogr., v.669, 1995, p. 352-357.

14. E. В. Дегтерев, А. И. Резник, Состояние аналитического контроля биосинтеза L-лизина, Микробиологическая промышленность, вып. 3, 1979, с. 41-42.

15. Е. В. Дегтерев, Аналитический контроль в исследованиях биосинтеза аминокислот и их производных, Тезисы докладов конференции "Микробиологический и энзиматический синтез аминокислот", Пущино, 1980, с. 15-16.

16. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии, Под ред. А. Хеншен, "Мир", Москва, 1988, с. 643.

17. R. Bhushan, Amino Acids, Hand Book of Thin Layer Chromatography ed. by J. Sherma, v. 60, Chromatographic Sci. Series, 1996, p. 990.

18. E. Tyihak, E. Minksovics, Trend in overpressured Thin layer chromatography, J. Planar. Chromatogr., v. 4, 1991, p. 288-294.

19. Planar Chromatography 2002, Modern Thin-Layer Chromatography, Camag, Muttenz, 2002, p. 40.

20. D. C. Fenimore, С. M. Davis, HPTLC, Anal. Chem., v. 53, 1998, p. 253

21. N. G. Grinberg, Modern Thin-Layer Chromatography, Marcel Dekker, London, New York, 1990, p. 490.22. FDA, Bull., 1994, p. 546.

22. Camag Bibliogr. Service, 1981, N2, p. 2-5.

23. Ф. Гейсс, Основы тонкослойной хроматографии, Москва, 1999, т. 1,с. 37.

24. Н. Kelker, Dunnschicht order Saulenflussigkeits Chromatographic Nachr. Chem. Tech. Lab., 1983, p. 786-794.26. ТУ 26-11-17-89.

25. I. A. Sizova, В. V. Tyaglov, W. G. Degtiar, Quantitative determination of herbicide-bialaphos in fermentation broth by application of video densitometry.

26. Proceedings of 8th International Symposium on Instrumental Planar

27. Cromatography, Interlaken, Switzerland, 5-7 April 1995, Q 10.

28. В. Д. Красиков, И. И. Малахова, А. П. Новицкий, М. И. Полубенце-ва, Видеоденситометр для тонкослойной хроматографии "ДенСкан-04", Материалы 2а школы-семинара "Количественная ВЭТСХ. Проблемы и их решения" 25-26 февраля 2002, Санкт-Петербург, с. 1-12.

29. Camag CD-ROM disk, version 104, Camag Bibliography Service, 2001.

30. Merck, Catalog 2000-2001, Merck, Darmstadt, 2000.31. "Ленхром", Оборудование для TCX, Каталог, НПЦ "Ленхром", Санкт-Петербург, 2001.

31. М. Warner, Analytical biotechnology, Anal. Chem., v. 60(14), 1988, p. 847-850.

32. S. A. Carr, M. E. Hemling, G. D. Roberts, Integration of mass spectrometry in analytical biotechnology, Anal. Chem., 63(24), 1991, p.2802-2824.

33. P. MacCarthy, R. W. Klusman, J. A. Rice, Water analysis, Anal. Chem., 72(12), 2000, R525-R 585.

34. D. J. Anderson, F. Vanlent, Clinical chemistry, Anal. Chem.*, 67(11), 1995, R 377-R 378.

35. R. K. Gilpin, L. A. Pachla, Pharmacutical and related drugs, Anal Chem., 69(12), 1997, R295-R 313.

36. T. A. Brettell, R. Saferstain, Forensic science, Anal. Chem., 67(12), 1995, R 273-R 294

37. R. E. Clement, G. A. Eiceman, C. J. Koester, Environmental analysis, Anal. Chem., 71(12), 1999, R 221-R 255.

38. D. L. Fox, Air pollution, Anal. Chem., 67( 12), 1995, R 183-R 198.

39. C. Shoneich, S. R. Rabell, T. D. Williams, Separation and analysis of peptides and proteins, Anal. Chem., 68(12), 1996, R 155-R 181.

40. S. K. S. Chang, E. Holm, Food, Anal. Chem., 68(12), R27-R 153.

41. J. Sherma, Pesticides, Anal. Chem., 72(12), 2000, R 1-R 20.

42. M. Kinter, Mass spectrometry, Anal. Chem., 68(12), 1996, R493-R 497.44. \V. W. Blaser, M. A. Lapack, Process analytical chemistry, Anal. Chem., 70(12), 1998, R 47- R74.

43. Y. Xu, Capillary electrophoresis, Anal. Chem., 70(12), 1998, R 467-R483.

44. D. J. Anderson, High performance liquid chromatography, 67(12), 1995, R 475-489.

45. Хроматография. Практическое приложение метода, под ред. Э. Хефтмана, "Миф", Москва, 1986, т. 1, с. 536.

46. Сверхкритическая флуидная хроматография, под ред. Р. Смита, "Мир", Москва, 1991.

47. Препаративная жидкостная хроматография, под ред. Б. Бидлингмей-ра, "Мир", Москва, 1990, с. 390.

48. JT. А. Остерман, Хроматография белков и нуклеиновых кислот, "Наука", Москва, 1985, с. 315.

49. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии, под ред. А. Хенмен, "Мир", Москва, 1988, с. 649.

50. В. Д. Шатц, О. В. Сахарова, Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории, методология, применение в лекарственной химии, "Зинатс", Рига, 1988.

51. К. И. Сакодынский, В. В. Бражников, С. А. Волков, Э. С. Ганкина, В. Д. Шатц, Аналитическая хроматография, "Химия", Москва, 1993, с. 463.

52. М. Шаршунова, В. Шварц, Г. Михалец, Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии, под ред. В. Г. Березкина, "Мир", Москва, 1980, т. 1, с. 295.

53. Количественный анализ хроматографическими методами, под ред. В. Г. Березкина, "Мир", Москва, 1990, с. 319.

54. High Perfomance Liquid Chromatography in Biotechnology, ed. By W.

55. S. Hancock, John Willey and Sons, Inc., New York, 1990, p. 564.

56. Analytical Capillary Electrophoresis and HPLC in Biotechnology, ed. by C. Horvat, M. Dekker, New York, 1995, p. 474.

57. R. S. Ersser, J. F. Davey, Amino acid analysis of physiological fluids, J. Chromatogr., v. 528(1), 1986, p. 177-250.

58. R. W. Tyree, E. S. Clausen, J. L. Gaddy, Production of propionic acid from sugars by fermentation through lactic acid as intermediate, J. Chem. Technol. Biotechnol., v. 50, 1991, p. 155-166

59. A. Goel, J. Lee, M. M. Atai, Supresed acid formation by cofeeding of glucose and citrate in Bacillus cultures, Biotechnol. Progr., v. 11(2), 1995, p. 380385.

60. B. K. Ahring, M. Sandberg, I. Angelidakii, Volatile fatty acids as indicator of process imbalance in anaerobic digestors, Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 43(4), 1995, p. 559-565.

61. A. Niederviesser, G. Pattaki, M. Brenner, Separation DNFB-derivatives of some amino acids on silica gel plates, Experientia, v. 17, 1961, p. 145-154.

62. N. Seilier, J. Weihmann, Prepatation separation and identification off amino acids, Experientia, v. 20, 1964, p.559-566.

63. W. R. Gray, B. S. Howtley, Derivatization of free amino group of 9 amino acids with 5 methyl amino naphthalene- 1-sulfonyl chloride and separation on silica gel, Biochem. J., V. 89, 1963, p. 59-64.

64. A. S. Inglis, P. W. Nicholls, Separation and identification some amino acids modifaied by phenyl isothiocyanate on silica gel plates, J. Chromatogr., v. 79, 1973, p. 344-350.

65. M. Brenner, A. Niedervieser, The simple tegunique for separation of amino acids, Experientia, v. 16, 1960, p. 378-386.

66. A. Niedervieser, M. Brenner, J. Pattaki, TLC of different amino acids on silica gel layers, Hebv. Chim. Acta, v. 44, 1961, p. 2022-2031.

67. A. Niedervieser, J. Pattaki, Separation amino acids and peptides on silicagel, J. Chim.Acta, v. 14, 1969, p. 378-390.

68. K. Chemel, Thin-layer chromatography on silica gel, Coll. Czech. Chem. Comm., v. 37, 1972, p. 3034-3040.

69. K. Chmel, Thin-layer chromatography 22 amino acids on silica gel and RP layers, Coll. Czech., Chem. Cmmun., v. 37, 1972, p. 3612-3621.

70. I. J. Shellard, G. H. Jolliffe, The separation of alanine, valine, phenylalanine and lysine on silica gel G, J. Chromatogr., v. 19, 1967, p. 32-39.

71. T. Rokkens, Determination 7 amino acids on silica gel. TLC-plates, J. Clin. Lab. Invest., v. 16, 1964, p. 149-161.

72. J. Pattaki, Thin-layer chromatography of 8 a-amino acids o silica gel G using mobile phases, J. Chromatogr., v. 16, 1964, p. 541-549.

73. E. Nurmberg, Investigation 20 amino acids on silica gel "G", Arch. Pharm., v. 292, 1959, p. 610-617.

74. E. Mutschiev, E. Rochenelmeyer, Inproved procedure for the separation threonine, serine and phenylalanine by thin-layer chromatography, Arch. Pharm., v. 292, 1959, p. 449-457.

75. T. Dianastein, H. Ehrahad, Z. Phys. Chim., v. 320, 1961, p. 131-140.

76. C. G. Hogger, Separation of the main protein amino acid by step gradient, Helv. Chim. Acta, v. 44, 1961, p. 173-181.

77. F. Geiss, A. Klose, Stepwise gradient separation of biogenic amines and amino acids using personal OPLC instrument, Z. Anal. Chim, v. 219, 1965, p. 321329.

78. W. Z. Rossetti, Separation amino acids and peptides from Hedyotic nudicanlis. Anal. Chim., v. 221, 1967, p. 397-404.80. 1. J. Shellard, G. H. Jolliffe, Thin-layer chromatography 9 amino acids on silica gel, J. Chromatogr., v. 38, 1968, p. 253-265.

79. E. H. Tyihak, Stepwise gradient determination of toxie ingredient nistidine and histamine in medical material, J. Chromatogr., v. 49, 1970, p. 349-356.

80. H. Sevdel, R. Voigh, Optimization of mobile phase composition in TLCfor rapid and economic determination of amino acids andshot peptides in medicine, Pharmazie, v. 24, 1969, p. 531-539.

81. E. Ploechl, Simultaneous determination of tryptophan, thyptamiul and some their derivatives by TLC and HPLC methods, Clin. Chim. Acta, v. 21, 1968, p. 271-281.

82. P. Wollenweber, Thin-layer chromatography separation of several amino acid on silica gel, J. Chromatogr., v. 9, 1962, p. 369-376.

83. R. L. Squibb, Nature, v. 199, 1963, p. 2116-2118.

84. R. L. Squibb, Nature, v. 198, 1963, p. 317-320.

85. R. Bhushan, Amino acids and their derivatives, Hand Book of Thin-Layer Chromatography (ed. by J. Sherma and B. Fried), v. 55, Chromatographic Sei. Series, New York, 1991, p. 353-387.

86. R. Bhushan, Peptides and proteins, Hand Book of Thin-Layer Chromatography (ed. by J. Sherma and B. Fried), v. 55, Chromatographic Sei. Series, New York, 1991, p. 388-389.

87. R. Bhushan, TLC of PTH-derivatives of amino acids, J. Liquid Chromatogr., v. 10, 1987, p. 3497-3528.

88. R. Bhushan, TLC of PTH-derivatives of amino acids on silica gel impregnated with metal ions, Anal. Letters, v. 21, 1988, p. 1075-1084.

89. R. Bhushan, V. K. Mahesh, P. V. Malli, Improved TLC-systems for rapid resolution ofPTH-amino acids, Biomed. Chromatogr., v. 3, 1989, p. 43-55.

90. R. Bhushan, G. P. Reddy, TLC resolution of 18 PTH-amino acids, using three solvent systems, J. Planar. Chromatogr., v. 2, 1989, p. 79-82.

91. R. Bhushan, G. P. Reddy, TLC of PTH and Dansyl derivatives of amino acids, Biomed Chromatogr., v. 3, 1989, p. 233-240.

92. R. Bhushan, Some effective solvent systems for rapid resolution of DPH-amino acids by TLC, Chromatographia, v. 25, 1998, p. 435-456.

93. R. Bhushan, 1. Ali, TLC resolution of enantiomeric mixtures of amino acids, Chromatographia, v. 23, 1987, p. 280-285.

94. R. Bhushan, J. Martens, Direct resolutions of enantiomers by impregnated TLC, Biomed. Chromatogr., 11, 1997, p. 141-152.

95. Е. В. Дегтерев, Г. П. Подгорнова, Количественное определение треонина в культуральной жидкости методом ТСХ, Микробиологическая промышленность, вып. 2 /133/, 1976, с. 28-30.

96. Е. В. Дегтерев, Пути совершенстования аналитического контроля производства аминокислот, Сборник научных трудов ВНИХФИ, Москва, 1985, с. 5-12.

97. Е. В. Дегтерев, Г. П. Подгорнова, Количественное определение L-лейцина и L-изо-лейцина методом хроматографии в тонком слое сорбента, Хим. Фарм. Жур., т. 12, N 8, 1978, с. 133-135.

98. A. Niederwieser, S. К. Wadman, D. М. Danks, Profiling of amino acids in body fluids and tissues by means of thin-layer chromatgrahy, Clin. Chim. Acta, v. 90, 1978, p. 195-214.

99. J. Sannen, E. Brandeis, T. Cash, The importance of residues 2-arginine in high-affinity angiotensin II, J. Med. Chem., v. 31, 1986, p. 737-741.

100. B. Lammek, P. Melvin, Synthesis of 8-D-Arg vasopressin analogues, modified in position I., Polish J. of Pharm., v. 40, 1988, p. 423-428.

101. B. Lammek, P. Melvin, Synthesys and some pharmacological properties of three new analogues of Arg-vasopressin modified in positions 1, 2, 4, 9, Polish J. of Pharm., v. 41, 1989, p. 97-102.

102. Camag Bibligr. Service, v. 76, 1993, p. 11.

103. S. Z. Nyiredy, C. A. Erdelmeier, B. Meier, TLC mobile phase optimization. Procedure using "PRIZMA" model, Planta. Med, 1985, p. 241-254.

104. О. Mikes, Laboratory Handbook of Chromatograhic and applied methods, "Ellis Hopwood", New York, 1979, p. 512.

105. E. Шталь, Хроматография в тонких слоях, "Мир", Москва, 1965, с.580.

106. Ю. Кирхнер, Тонкослойная хроматография, т. 1, "Москва", 1981, с.640.

107. Н. Jork, W. Funk, W. Fisher, H. Wimmer, Thin-Layer Chromatography.

108. Reagents and Detection Methods, VCH, Verlag sgesellshaft, Weinheim, 1990, p. 453.

109. E. В. Дегтерев, Хим. Фарм. Жур., 2002 (в печати).

110. D. I. Seracu. Spectra of ninhydrin complexes with 22 amino acids, Anal. Left., v. 20, 1987, p. 1417-1424.

111. А. С. 957076 СССР, Бюл. изобрет., N 33, 1983.

112. А. С. 758694 СССР, Бюл. изобрет., N 45, 1980.

113. ВФС 42-2446-94 таблетки "Тиофедрин Н".

114. ВФС 42-7947-97 сироп "Бронхолитин".120. ВФС 42-1670-88 "Оксолин".

115. Е. А. Зенкова, Е. В. Дегтерев, 1,2,3,4-тетрагидро 1,4-диоксо -2,2,3,3-тетрагидроксинафталин (оксолин), как реагент для обнаружения биогенных аминов методом ТСХ и источник получения нингидринового реактива, Хим. Фарм. Журн., т. 34(2), 2000, с. 40-48.

116. Е. А. Зенкова, Е. В. Дегтерев, Оптимизация получения нингидринового реактива и 1,2,3,4-тетрагидро 1,2-диоксо - 2,2,3,3-тетрагидроксинафталина (оксолина) и возможности его применения, Хим.

117. Фарм. Журн., т. 34(3), 2000, с. 31- 33.

118. А. А. Ахрем, А. И. Кузнецова, Тонкослойная хроматография, "Наука", Москва, 1964, с. 71.

119. Instrumental Thin-Layer Chromatography ed. By D. Janchen, Camag, Muttenz, 1983, p. 54.

120. H. Jork, Dtsch. Apoth. Ztg., v. 102, 1967, p. 1263.

121. H. Jork, J. Pharmac. Belg., 1963, p. 213-219.

122. Camag Bibliogr. Service, v. 81, 1998, p. 2-3.

123. M. Dekker, Quantitative TLC and its Industrial Application, New York, 1987, p. 370.

124. А. П. Крешков, Основы аналитической химии, "Химия", Москва, 1965, с. 414.

125. Р. Kubelka, М. Münk, Z. Techn. Phys., v. 12, 1931, p. 539.

126. G. Kortum, Reflectionsspectroschie, Spinger, Verlag, Berlin, 1969, p.414.

127. Camag, Camag TLC-Scanner III, Muttenz, 2000.

128. Б. В. Тяглов, А. П. Тарасов, E. В. Дегтерев, В. M. Крылов, А. П. Новицкий, М. И. Полубенцева, И. И. Малахова, В. Д. Красиков, Видеоденситометр "Денсискан-1" для количественной тонкослойной хроматографии, Биотехнология, N 5, 1992, с. 44-47.

129. Т. S. Ford, N. S. Radin, Quantitation of thin-layer chromatograms with an Apple II computer based video-densitometer, Anal. Biochem, v. 150, 1985, p. 359-363.

130. S. Pongor, High-speed video-densitometry principles and applications, J. Liquid Chromatogr., v. 5, 1982, p. 1583-1595.

131. B. Lenkeyi, J. Csanyi, P. Nanasi, Rapid determination of sucrose and fructose in biological samples by video densitometry, J. Liquid. Chromatogr., v. 9, 1986, p. 1869-1875.

132. S. Papp, E. Toth, B. Polak, Polyamine analysis in series of samples by

133. OPLC, Proceedings of International Symposium on TLC with special

134. Emphasis on OPLC, Szeged, Hungary, 1984, p. 67.

135. Proceedings of 8th International Symposium on Instrumental Planar Chromatography, 5-7 April, 1995, Interlaken, Swizerland, Exibition Section.

136. S. Ebel, The chromatographic uncertainly principles, Chromatographia, v. 20, 1987, p. 123-134.

137. Руководство по современной тонкослойной хроматографии, ред. О. Г. Ларионов, Москва, 1994, с. 180.

138. Planar Chromatography 2002, Modern Thin-Layer Chromatography, Camag, Muttenz, 2002, p. 40.

139. R. E. Kaiser, Simple and Instrumentalized High Perfomance Planar Chromatography, HFC-Hyper Card Course-Paper Version, I.F.E.A.R., Bad Duerkheim, 1996, p. 157.

140. S. Ebel, E. Glaser, J. High. Resolut. Chromatogr. Commun., v. 2, 1979, p. 36-48.

141. R. E. Kaiser, Instrumental HPTLC, Huthing, Heidelberg, 1980, p. 179.

142. The United States Pharmacopeia /The Natural Formular 2000/

143. European Pharmacopoeia, Supplement, 2000.

144. British Pharmacopoeia, 2001, Vol. II, Appendix III.

145. Validation of Analytical Procedures: Methodology Recommended for Adoption Step 4, of the ICN Process on 6 November 1996 by the 1CN Steering Committee.

146. W. Dammertz, B. Renger, Validation and quality assurance in planar chromatography. Proceedings of the International Symposium on Planar Chromatography Separation, "Planar Chromatography 2002", May 11-13, Heviz,1. Hungary, 2002, p. 11-16.

147. К. Ferencz-Fodor, Z. Vegh, B. Renger, M. Zeller, Validation and quality assurance of planar chromatographic procedures in pharmaceutical analysis, J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 84, 2001, p. 1265-1276.

148. К. Дерффель, Статистика в Аналитической химии, "Мир", Москва, 1994, с. 267.4

149. К. Данцер, Э. Тан, Д. Мольк, Аналитика, "Химия", Москва, 1981, с.278.

150. Н. Jork, Н. Winmer, Quantitative Auswertung von Dunnschicht-Chrommatogrammen, GIT Verlag, Darmstadt, 1989, p. 104.

151. B. Renger, Quantitative Planar Chromatography as tool in pharmaceutical analysis, J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 76, 1993, p. 7.

152. K. Zieloff, Dunnschicht- Chromatographie in der Autamatisiserung und GLP, Merck, GIT Verlag, Darmstadt, 1996, p. 96.

153. H. Jork, G. Pfaab, Validation of an Analytical Procedure in TLC, Dessaga, QffprintTLC, Heidlberg, 1994, p. 53.

154. Rapid and quantitative determinational of aspartame in beverages . Thin layer chromatography., v. 3, 1985, p. 131-135.

155. E. Postaire, С. Sarbach, P. Deivarde, С. Regnault, A new method of derivatization in planar chromatography: Overpressure derivatization J. Planar Chromatogr., v. 3, 1990, p. 247-250.

156. Merck, Catalog 2001 -2002, E. Merck, Darmstadt, 2001.

157. J. C. Touchstone, С. T. Mansfield, Quantitative Thin-Layer Chromatography, John Willey, New York, 1973, p. 372.

158. F. Kreuzig, Chromatographie, v. 13, 1980, p. 238-240.

159. F. Kreuzig, Chromatographie, v. 142, 1977, p. 441-447.

160. P. Pachaly, Dunnshicht-Chromatographie der Apotheka, Wissenschafilich Veriagages, Stutdgart, 1996, p. 45.

161. E. V. Degterev, W. G. Degtiar, В. V. Tyaglov, A. P. Tarasov, V. M.

162. Kryeor, I. I. Malakhova, V. D. Krasikov, Quantitative analysis of Ltryptophan in fermentation broth, J. Planar Chromatogr., v. 13, 2002, p. 191-194.

163. I. A. Sizova, В. V. Tyaglov, V. I. Zvenigorodskii, Quantitative determination moenomycin antibiotics by thin layer chromatography, J. Planar Chromatogr., v. 10, 1997, p. 200-205.

164. K. Rolka., J. Xie, Separation of a-amino acids by thin-layer

165. Chromatogr., J. Med. Chem., v. 32, 1989, p. 1497-1503. »

166. А. С. Хохлов, Л. А. Щукина, M. M. Шемякин, Журн. Общей химии, т. 21, 1951, 1016-1033.

167. Э. А. Буриков, Э. В. Кузнецов, А. П. Тарасов, Б. В. Тяглов, Е. В. Дегтерев, И. И. Малахова, В. Д. Красиков, Сравнение метедов хроматографи-ческого определения L-серина в ферментационных растворах, Биотехнология, 1996(9), с. 51-57.

168. В. А. Даванков, Дж. Наврашил, X. Уолтон, Лигандообменная хроматография, "Мир", Москва, 1989, с. 427.

169. Е. Gruska, S. Levin, С. Gilon, Separation of amino acids on reversed-phase columns as their cooper (II) complexes, J. Chromatogr., v. 235, 1982, p. 401413.

170. M. Cande, A. Foucault, Ligand exchange chromatography of amino acids on cooper (II) modified silica gel with ultraviolet spectrophotometric detection at 210 nm, Anal. Chem., 51, 1979, p. 459-467.

171. A. Foncault, R. Roset, Ligan exchange chromatography on cooper (II) modified silica gel- improvements and use for screening of protein hydrolyzates andquantitation of dipeptides and amino acids, J. Chromatogr., v. 317, 1984, p. 4149.

172. A. M. Федорова, JI. А. Музыченко, Селективное определение аминокислот методом обращено-фазовой ВЭЖХ, сб. Микробиологическая промышленность, Отечественный передовой опыт, вып. 10, 1988, с. 9-13.

173. Н. Г. Демина, Н. Ф. Румянцева, Б. М. Полануер, А. Ф. Шолин, Влияние температуры, рН и солевого состава на стабильность глутамина в модельных растворах, Биотехнология, 1992(1), с. 53-55.

174. Хроматография. Практическое приложение метода, ред. Э. Хефт-ман, "Мир", Москва, 1986, с. 350.

175. Е. В. Дегтерев, В. Н. Коробкин, А. И. Резник, Аналитический контроль биосинтеза гомосерина, тезисы докладов конференции "Микробиологический и энзиматический биосинтез аминокислот", Пущино, 1980, с. 43-48.

176. J. Sherma, Thin-layer chromatography, Anal. Chem., v. 60, 1988, p. 74R-98R.

177. C. F. Poole, Trends Anal. Chem, v. 4, 1985, p. 209-217.

178. J. P. Lautie, V. Stankovic, Automated multiple development TLC of phenylurea herbicides in plant, J. Planar Chromatogr., v. 9, 1996, p. 113-116.

179. G. Matysik, E. Wojtasik, Automated multiple development HPTLC analysis of Frantgula Authraguinones, J. Planar Chromatogr., v. 7, 1994, p. 34-38.

180. I. I. Malakhova, V. D. Krasikov, E. V. Degterev, В. V. Tyaglov, Quantitative determination of industrial amino acids, J. Planar. Chromatogr., v. 9, 1996, p. 375-378.

181. W. G. Degtiar, В. V. Tyaglov, E. V. Degterev, V. M. Krylov, I. I. Malakhova, V. D. Krasikov, Quantitative analysis of L-bysine, L-threonine, L-homoserine and coblamines in fermentation broth, J. Planar. Chromatogr., v. 13, 2002, p. 217-220.

182. N. Karpitschka, Microchim, Acta, 1963, p. 157-164.

183. E. В. Дегтерев, В. Г. Дегтярь, В. Д. Красиков, В. М. Крылов, И. И.

184. Малахова, А. П. Тарасов, Б. В. Тяглов, Количественное определение L-триптофана методом хроматоденситометрии, Хим. Фарм. Жур., 1994(8-9), с. 52-55.

185. Е. V. Degterev, V. G. Degtiar, В. V. Tyaglov, А. P. Tarasov, V. М. Krylov, I. I. Malakhova, V. D. Krasikov, Quantitative analysis of L-tryptophan in fermentation broth, J. Planar Chromatogr., v. 13, 2000, p. 191-194.

186. Sz. Myredy, Zs. Falter, Automatic mobil phase optimization, using the "PRIZMA" model for TLC separation of apolar compounds, J. Planar. Chromatogr., v. 8, 1995, p. 341-346.

187. Jl. А. Казицина, H. Б. Куплетская, Применение УФ, ИК и ЯМР спектроскопии в органической химии, МГУ, Москва, 1978, с. 291.

188. И. И. Малахова, В. Д. Красиков, Е. В. Дегтерев, Б. В. Тяглов, Способ разделениея и детектирования аминокислот, Патент РФ, RU, 2095808, С1, с приоритетом от 27.07.1994.

189. Т. Е. Попова, Развитие биотехнологии в СССР, "Наука", Москва, 1989, с. 219.

190. А. Ленинджер, Биохимия, "Мир", Москва, 1974, с. 941.

191. А. Ленинджер, Основы биохимии, "Мир", Москва, 1985, т. 2, с. 731.

192. Д. Роберте, М. Кассирю, Основы органической химии, "Мир", Москва, т. 1, 1978, с. 720.

193. Е. Д. Краснопольская, Г. Л. Цукерман, Методические рекомендации по выявлению наследственных дефектов обмена, "Медицина", Москва, 1990, с. 14-21.

194. Б. В. Тяглов, Е. В. Дегтерев, И. И. Малахова, В. Д. Красиков, В. В. Помозанов, Способ разделения аминокислот в биологических жидкостях, Патент РФ, w 2078342, с. 1, с приоритетом 10.08.1993.

195. Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Литвинова Л.С., Рубан В.Ф., Малахова И.И. и др. Состав для получениея хроматографического слоя пластин

196. ТСХ, , Патент РФ №1736541, 1993.

197. В.Х.Добрускин, Г.М.Белоцерковский, В.Ф.Карельская, Т.Г.Плаченов, Исследование пористой структуры силикагелей, полученных из концентрированных золей кремневой кислоты, Ж.прикл.химии, 1967, т.40, №11, с. 2443-2448.

198. Новицкий П.В., Зограф И.А., Оценка погрешностей результатов измерений. 2-е изд., - Л.: Энергоатомиздат, 1991, с.101-105, 121.

199. Б.Г.Беленький, В.В.Нестеров, Э.С.Ганкина, В кн. Физические и физико-химические методы анализа органических соединений, М., "Наука", 1970, с.80.