автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Новые варианты электроосмотической тонкослойной хроматографии

На правах рукописи

БАЛУШКИН Алексей Олегович

НОВЫЕ ВАРИАНТЫ ЭЛЕТРООСМОТИЧЕСКОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

05.11.11 - Хроматография и хроматографические приборы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Березкин Виктор Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Беленький Борис Григорьевич

кандидат химических наук, доцент Гурковская Елена Александровна

Ведущая организация:

Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук

Защита состоится «28» июня 2005 г. в 15 час. 00 мин на заседании диссертационного совета Д 002.246.03 в Институте физической химии Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинский проспект, 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии Российской академии наук

Автореферат разослан «_27» мая 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Коломиец Л.Н.

Общая характеристика работы

Актуальность

В настоящее время хроматографические методы активно используются в промышленности, контроле состояния окружающей среды, медицине, научных исследованиях и т.д. Тонкослойная хроматография (ТСХ), открытая в 1938 г. Н.А. Измайловым и Н.С. Шрайбер, является одним из наиболее простых и экономичных методов современной хроматографии. Стоимость количественного анализа в ТСХ составляет всего 35% от затрат, необходимых для проведения анализа тех же проб методом колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии [1]. Поэтому отечественные и зарубежные аналитики уделяют развитию этого метода большое внимание; так, например, на Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в органической химии», прошедшего в 2002 г. в г. Краснодаре, тонкослойная хроматография используется в 17% докладов, посвященных хроматографии.

Однако современному классическому варианту ТСХ присущи и определённые недостатки, основным среди которых является невысокая скорость движения подвижной фазы вдоль пластинки, которая постепенно уменьшается во времени.

Для преодоления этого недостатка в последние годы за рубежом стала развиваться электроосмотическая ТСХ, предложенная Мулдом и Синжем в 1949 г [2], в которой для повышения скорости подвижной фазы используется явление электроосмоса.

Однако в своих публикациях по электроосмотической ТСХ зарубежные исследователи [3,4] отмечают, во-первых: интенсивное неконтролируемое испарение летучей подвижной фазы, как основной недостаток этого варианта хроматографии. Это имеет своим последствием: во-первых, низкую воспроизводимость хроматографического процесса и, во-вторых, нередко полное прекращение хроматографического процесса из-за полного испарения подвижной фазы на отдельных участках ТСХ пластинки. Во-вторых, в ряде публикаций отмечается также движение подвижной фазы поверх поверхности слоя сорбента, что естественно приводит к резкому дополнительному размыванию хроматографических зон

Поэтому разработка новых решений в электроосмотической ТСХ, которые позволили бы преодолеть указанные выше недостатки, является несомненно актуальной.

Цели работы

Предварительный поиск и оценка новых принципиальных возможных решений в области электроосмотической ТСХ позволил отобрать для экспериментальной оценки, следующие перспективные по-нашему мнению, новые варианты ЭО-ТСХ:

1. электроосмотическая ТСХ с закрытым (например, полиэтиленовой пленкой) сорбционным слоем;

2. электроосмотическая ТСХ с использованием в качестве подвижной фазы малолетучих подвижных фаз.

Реализация вариантов 1 и 2 имела своей целью повышение стабильности, воспроизводимости и надежности наиболее распространенного линейного варианта электроосмотической ТСХ. Одновременно представлялось целесообразным реализовать круговую электроосмотическую ТСХ, которая теоретически должна характеризоваться повышенной эффективностью, а также «сжатием» начальных зон.

Научная новизна

Основная научная новизна работы заключается в разработке новых вариантов ЭО-ТСХ и их экспериментальной реализации и оценки практической пригодности.

Предложены, реализованы и изучены следующие варианты ЭО-ТСХ:

1. ЭО-ТСХ с закрытым сорбционным слоем;

2. ЭО-ТСХ с малолетучими подвижными фазами,

3. Круговая ЭО-ТСХ (как с закрытым слоем, так и с использованием малолетучих фаз в качестве подвижной фазы), которая характеризуется повышенной эффективностью.

В результате экспериментального исследования было показано, что в новых вариантах ЭО-ТСХ скорость движения хроматографических зон существенно возрастает по сравнению с ТСХ.

Практическая значимость

Новые варианты ЭО-ТСХ свободны от принципиальных недостатков, характерных для методов, описанных в литературе. Предложенные варианты позволяют расширить возможности ЭО-ТСХ, в частности предотвратить испарение ПФ, приводящее к прекращению процесса при повышении подаваемого напряжения, отсутствует явление накопления подвижной фазы и ее движения по поверхности слоя сорбента, приводящей к дополнительному размыванию хроматографических зон; предложенный вариант характеризуется повышенной воспроизводимостью разделения.

Для демонстрации практической ценности ЭО-ТСХ с закрытым сорбци-онным слоем и с малолетучими подвижными фазами разработаны методики, представляющие определенный практический интерес: 1)методика разделения и полуколичественного определения макролидных антибиотиков 2)методика разделения нуклеозидов. Практическое использование соответствующих методик подтверждено соответствующими документами.

На защиту выносятся следующие результаты и положения:

Новые варианты ЭО-ТСХ с улучшенными физико-химическими и аналитическими характеристиками и их экспериментальные исследования:

1) ЭО-ТСХ с закрытым полимерной пленкой адсорбционным слоем;

2) ЭО-ТСХ с применением малолетучих фаз в качестве подвижной фазы;

3) Круговая ЭО-ТСХ, характеризующаяся повышенной эффективностью;

4) Примеры практического применения новых вариантов электроосмотической тонкослойной хроматографии для разделения реальных смесей, подтверждающих практическую ценность новых методов ЭО-ТСХ.

Апробация результатов работы

Основные результаты работы были доложены на 41th International petroleum conference (Bratislava, Slovak Republic, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Клязьма, 2004); the 12th International Symposium "Advances and Applications of Chromatography in Industry" (Bratislava, Slovak Republic, 2004).

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 6 статьях и 5 тезисах сообщений.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания приборов и методики эксперимента, изложения полученных результатов и выводов. Материалы диссертации изложены на 139 страницах текста, включая 38 таблиц, 42 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 118 ссылок.

Структура диссертационной работы

Основное содержание работы

1. Обзор литературы

В литературном обзоре представлен аналитический обзор современных работ и рассмотрена история развития электроосмотической тонкослойной хроматографии. Отмечены трудности, возникающие при реализации нового метода.

2. Методика исследования

Для реализации ЭО-ТСХ использовали установку, состоящую из 2-х блоков - высоковольтного выпрямителя (0-30 кВ, максимальный ток 1000 мкА) и камеры для проведения ЭО-ТСХ. Электрическая часть установки была изготовлена в СКБ ИНХС РАН. Питание выпрямителя осуществлялось от сети переменного тока (220 В, 50 Гц). Камера для линейного варианта ЭО-ТСХ была изготовлена в Университете Марии Кюри-Склодовской (Люблин, Польша) (см. рис. 1.), для проведения круговой ЭО-ТСХ была использована разработанная ранее в ИНХС РАН установка (см. рис. 2.) Для проведения экспериментов в режиме традиционной ТСХ применяли камеру для восходящей хроматографии. В обеих камерах в качестве материала электродов использовалась проволока из нержавеющей стали диаметром 1 мм.

В работе использованы пластинки на основе силикагеля фирмы «Сорбпо-лимер» (Краснодар, Россия): ПТСХ П-В-УФ, ПТСХ-П-В, ПТСХ-П-А, а также поликолоночные пластинки ПТСХ-П-В-УФ (2x3x20); пластинки фирмы «Merck» (Дармштадт, Германия): «Kieselgel 40F254» , «Kieselgel 6OF254», пластинки фирмы «ЛайнеКалур» (ЭССР). Пластинки разрезались на полоски (2,5x10 см) или на квадраты (10x10 см, для круговой хроматографии). Были использованы как пластинки с открытым слоем, так и с закрытым слоем.

Приготовление пластин с закрытым слоем адсорбента включает нанесение полимерной пленки на сорбционный слой пластинки. Были испытаны: а) пленки из полиэтилена низкой плотности толщиной 40 мкм, б) «пищевой» полиэтилен (ПП) фирмы «Paclan» (Польша, Варшава) толщиной пленки 10 мкм и в) полиэфирная пленка для ламинирования (ПЛ) «perfex gloss» фирмы «GMP» (Германия) толщиной 80 мкм (толщина пленки 38 мкм, толщина слоя клея 42 мкм).

(б)

Рис 1. Схема горизонтальной камеры для ЭО-ТСХ: (а) в сечении и (б) вид сверху. 1- съемная крышка камеры; 2- кожух; 3- ванночка с растворителем (подвижная фаза); 4- электроды; 5- бумажный питатель; 6- ТСХ пластинка (расположена адсорбционным слоем вниз).

б

Рис 2. Схема камеры для проведения электроосмотической круговой хроматографии: а (вид сбоку) 1 - кожух, 2 - анод, 3 - стеклянная трубка для подачи подвижной фазы, заполненная измельченной фильтровальной бумагой; 4 - БП (фильтровальная бумага в виде круга в центре и квадрат с вырезом (окружность), используемый для отвода избытка растворителя с пластины; 5-ТСХ пластинка (адсорбционным слоем вверх), 6 - катод; б (вид сверху)

С помощью разработанных способов были приготовлены закрытые пластины как для линейного (рис. 3), так и для кругового варианта хроматографии.

Рис. 3. Тонкослойная хроматографическая пластина с закрытым сорбцион-ным слоем в исполнении для линейной хроматографии. 1. полимерное покрытие; 2. сорбционный слой ТСХ пластины; 3. подложка; 4. свободная от покрытия поверхность сорбционного слоя

В качестве подвижных фаз использовали этанол, ацетонитрил, диметил-сульфоксид (ДМСО), Р,р-оксидипроопионтирил, ЭДК-диметилформамид, ^^ диметилацетамид, а также их смеси.

Нанесение проводили либо с помощью микрошприца, либо автоматическим аппликатором. Обработку хроматограмм проводили как вручную (используя измерительную лупу), так и с использованием высокоскоростного видеоденситометра «Сорбфил» фирмы «Сорбполимер» и программы статистической обработки ТСХ хроматограмм «Сорбфил Видеоденситометр 1.7.».

3. Новые варианты электроосмотической ТСХ

3.1.Новый вариантЭО-ТСХсиспользованиемпластин с закрытым сорбционнымслоем

Реализация электроосмотической ТСХ (ЭО-ТСХ) с закрытым адсорбционным слоем позволила устранить один из основных недостатков этого варианта, который отмечали многие работающие в этой области исследователи [3,4], а именно: интенсивное улетучивание используемых подвижных фаз (аце-тонитрила, этанола). Решение этой проблемы позволило существенно повысить воспроизводимость метода и исключить самопроизвольное (неконтролируемое) прекращение процесса разделения в результате образования высохших областей на используемой пластинке ТСХ, а также «выплескивание» потока ПФ (на первых минутах эксперимента) на поверхность слоя силикагеля и как следствие

1

4

перемещение ПФ не только внутри слоя, но по его поверхности. Поверхностный поток ПФ, достигая зон сорбатов, вызывает их дополнительное размытие. При использовании пластинок с закрытым слоем таких негативных явлений не наблюдалось.

Таблица 1. Линейная скорость (и) и размывание (ВЭТТ) зон красителей в электроосмотической планарной хроматографии (подвижная фаза -этанол, время эксперимента- 14 мин; ТСХ пластинки "Kieselgel-40")._

Сорбат ЭО-ТСХ на пластивк крытым сорбционны» (напряжение 3 к ахсза-1 слоем В) ЭО-ТСХ на пластинках с открытым сорбционным слоем

Миграция пятна, мм Скорость и, мм/мин ВЭТТ, мкм Хроматоцюфический процесс в условиях ЭО-ТСХ с открытым адсорбционным слоем при напряжении 3-4 кВ через 3-4 минуты самопроизвольно прекращается в результате образования на пластинке сухих областей

Родамин С 34.7 3.4 30

Бриллиантовый зеленый 51.0 4.8 15

Родамин Ж 60.0 5.7 10

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что реализовать ЭО-ТСХ на пластинках с открытым сорбционным слоем невозможно, если используемое напряжение составляет 3-4 кВ или превышает этот предел. Воспроизводимые результаты были получены только на пластинках, адсорбционный слой которых был закрыт полиэтиленовой пленкой.

Полученные данные по размыванию (ВЭТТ) в режиме ЭО-ТСХ с закрытым слоем на пластинках «Сорбфил» находятся в интервале значений 15-60 мкм, на пластинках «Merck» 10-30 мкм. Следовательно, закрытие пластинок термопластичным полимером не приводит к снижению эффективности и позволяет получать сопоставимые данные по сравнению с литературными по размыванию в условиях ЭО-ТСХ.

Согласно литературным данным, одним из направлений исследований, обеспечивающих разделение смесей веществ без накопления жидкости на поверхности и пересыхания слоя в процессе эксперимента, является введение добавки электролита (солей) в состав подвижной фазы, позволяющие повысить значение величины электрокинетического потенциала и ионной силы растворителя, приводящее к уменьшению толщины ДЭС. Исходя из вышесказанного, интересно было детально исследовать влияние введения в подвижную фазу ионной добавки при использовании пластинок с закрытым слоем, что позволило бы без опасения высыхания реализовать ЭО-ТСХ в новых условиях, т.е. при повышенном значении напряжения (и силы тока). В табл.2 приведены данные

по увеличению скорости движения зон красителей в электроосмотической хроматографии (по сравнению с традиционным вариантом ТСХ).

Таблица 2. Относительное увеличение скорости движения зон красителей (р = и^о/Игр) при переходе от традиционного варианта ТСХ к ЭО-ТСХ при использовании пластинок с закрытым полиэтиленовой пленкой адсорбционным слоем.

Условия Подвижная фаза

экспери- Ацетонит- Ацетонитрил Этанол Этанол +

мента Сорбат рил- -(7,5%) во- (0,01%)LiCl

(7,5%)вода да+(0,01%)

LiCl

р = иэо/ип, p = u90/un> P = uM/uro P = lfeo/Un,

Пластин- Родамин Ж 5,9 6,4 2,7 5,1

ки «Сорб-

фнл» Бриллиант. 7,6 3,9 1,9 4,4

зеленый

Пластин- РодаминЖ 1,9 3,5 2,0 2,6

ки Kiesel- Бриллиант. 5,4 5,8 3,0 3,6

gel-60 зеленый

Скорость миграции зон красителей увеличивается в 2-6 раз по сравнению с традиционной ТСХ, причем введение добавки в большинстве случаев способствует увеличению скорости перемещения зон. Можно предположить, что скорость движения зон сорбатов включает электроосмотическую и электро-форетическую составляющие, поскольку исследуемые красители родамин Ж и бриллиантовый зеленый являются заряженными частицами (катионы). При введении в состав подвижной фазы хлорида лития, меняется ее ионная сила, что приводит к другому соотношению составляющих скорости (электрофоре-тической и электроосмотической).

Описанный вариант электроосмотической хроматографии с закрытым слоем был успешно применен для анализа отечественного лекарственного ветеринарного препарата талан, в состав которого входят макролиды: тилозин, ре-ломицин и дезмикозин. В качестве подвижной фазы использовалась смесь зтанол-ацетонитрил-диэтиламин (100:100:1, v/v). Продолжительность анализа этого антибиотика была уменьшена с 40 мин при использовании традиционной ТСХ (подвижная фаза: этилацетат-дизтиламин 95+5, v/v) до 5 мин.

3.2. Использования малолетучих соединений в качестве подвижной фазы в электроосмотической тонкослойной хроматографии

До настоящего времени в электроосмотической тонкослойной хроматографии (ЭО-ТСХ), в качестве подвижной фазы использовались только два органических растворителя - этанол и ацетонитрил или их смеси с водой. Поэтому расширение круга подвижных фаз в ЭО-ТСХ весьма актуальна. Существенным недостатком изученных подвижных фаз является их летучесть. Неизбежное нагревание сорбционного слоя в результате прохождения электрического тока через слой жидкой подвижной фазы, и, как следствие, интенсификацию процесса испарения традиционно используемых летучих жидких фаз вплоть до образования сухих областей на пластинке и прерыванию потока, в результате чего прекращается процесс электроосмотической хроматографии.

Основные критерии пригодности растворителей при их применении в ЭО-ТСХ вытекают из уравнения Смолуховского И = {^Е / 4я77)£, где е - диэлектрическая проницаемость, т|-вязкость жидкости, Е - напряженность внешнего поля, £-электрокинетический потенциал. Из уравнения следует, что при переходе от одного растворителя к другому скорость потока изменяется пропорционально диэлектрической постоянной и обратно пропорционально вязкости. Дзета-потенциал зависит сложным образом как от состава подвижной фазы, так и от природы поверхности сорбента.

Для индивидуальных растворителей (без электролитов) определяющими являются значения диэлектрической проницаемости и вязкости. Для изученных подвижных фаз - этанола и ацетонитрила значения диэлектрической проницаемости 8 (25°С) равны 24,3 и 36,2, а вязкости ц (25°С) - 1,08 мПа.с и 0,345 мПа*с соответственно.

В приведенной таблице дан перечень растворителей, которые были испытаны в качестве подвижных фаз. Первые члены этого ряда - пропионитрил и р,Р-оксидгатропионитрил (ОДПН) являются аналогами ацетонитрила. Показана возможность применения для ЭО-ТСХ К,М-диалкиламидов: NN диметилформамида (ДМФА), ^-диметилацетамида (ДМАА), циклического амида Н-метил-2-пирролидона, а также диметилсульфоксида (ДМСО). Температуры кипения этих растворителей на 70 и более градусов выше температуры кипения известных подвижных фаз, использованных ранее в ЭО-ТСХ.

Таблица 3. Свойства растворителей, испытанных в качестве подвижных фаз для

ЭО-ТСХ

Растворитель Т кип. °С Вязкость П(25°С) мПа*с е (25°С) е(25°Су Т1 (25° С)

новые малолетучие подвижные фазы

пропионитрил 97 0,45 (15"С) 27 59,5

оксидипропионитрил 270 0,93 66,6 71,3

Ы^-диметилформамад 152 0,79 36,7 46

КД^-диметилацетамид 165 0,92 37,8 41,1

М-метил-2-пирролидон 202 1,65 32,2 19,5

Диметилсульфоксид 189 1,98 49 24,7

известные легколетучие подвижные фазы

Этанол 78,3 1,08 24,3 22,5

Ацетонитрил 81,6 0,345 36,2 104

Наиболее целесообразно использовать в качестве подвижных фаз соединения с наибольшими величинами отношения е/т). Если расположить исследованные подвижные фазы в порядке повышения их величин г/ц, то в результате образуется следующий ряд: №метил-2-пирролвдон<этанол<ДМСО <ДМАА<ДМФА<1ф01шонитрил<ОД1Ш<ацетоншрил. В этом ряду малолетучие подвижные фазы чередуются с летучими.

Были проведены исследования 4-х малолетучих подвижных фаз, имеющих различные физические свойства. Для сравнения нами были изучены характеристики разделения красителей при использовании малолетучих фаз в условиях традиционной ТСХ. В ходе эксперимента не наблюдалось изменения проводимости для ОДПН и ДМСО, однако при использовании ДМАА и ДМФА происходило некоторое уменьшение силы тока в течение опыта, что, по-видимому, связано с большим нагреванием подвижной фазы в ходе эксперимента, а также с вымыванием примесных солей из пластинки. Полученные экспериментальные результаты (средние из 3-6 независимых экспериментов) приведены в таблице 4.1 и 4.2.

Таблица 4.1. Характеристики удерживания зон красителей для традиционной ТСХ и ЭО-ТСХ при использовании в качестве подвижных фаз ДМСО, ОДПН.

Условия э кепепимента: ТСХ пластинки "M eick 40", время эксперимента 10 мин

Подвижная фаза напряжение Сорбат Скорость миграции, мм/мин соотношение скорости движения красителей p = u3c/uip

ток иэо-тсх Чтсх

ДМСО 1кВ, 240 мкА Судан П 2,2 1,6 1,4

Крист.фиол. 1,0 0,2 4,5

Родамин Ж 1,5 0,5 3,1

ОДПН 5 кВ, 100 мкА Судан П 6,2 6,1

Крист.фиол. 0,9 0,1 12,9

РодаминЖ 0,7 0,1 10,4

Таблица 4.2. Характеристики удерживания зон красителей для традиционной ТСХ и ЭО-ТСХ при использовании в качестве подвижных фаз ДМФА, ДМАА. Условия эксперимента: ТСХ пластинки "Merck 40", время эксперимента 5 мин_

Подвижная фаза напряжение Сорбат Скорость миграции, мм/мин соотношение скорости движения красителей р = Ibo/Ujp

ток иэо-тсх Чтсх

ДМФА 2кВ, 630 мкА Судан II 9,0 4,7 1,9

Метил кр. 5,2 3,7 1,4

Крист.фиол 8,5 0,6 14,2

ДМАА 2 кВ, 500 мкА Судан П 8,0 5,2 1,5

Метил кр. 3,5 4,3 0,8

Крист.фиол 7,1 0,6 11,8

Как следует из таблицы 4.1. и 4.2., скорость движения сорбатов в режиме ЭО-ТСХ как правило выше, чем в традиционной ТСХ. Поэтому для реализации преимуществ малолетучих ПФ представляется особенно целесообразным использование ЭО-ТСХ. Следует отметить, что увеличение скорости движения зон красителей различно. Это можно объяснить тем, что перемещение красителей кристаллического фиолетового и родамина Ж, являющихся катионами, по пластинке ТСХ зависит от двух процессов: как от скорости электроосмотического движения подвижной фазы, так и от электрофоретического эффекта. В соответствии с этим наибольшее ускорение (увеличение р) наблюдается для катионных красителей - кристаллического фиолетового и родамина Ж, наименьшее для анионного красителя - метилового красного. Для неионно-

го вещества, такого как Судан П также наблюдалось ускорение в 1,4-6,1 раз при использовании всех изученных подвижных фаз.

При оценке возможностей ЭО-ТСХ с использованием в качестве подвижной фазы малолетучих соединений важно оценить отношение скорости движения красителей в условиях ЭО-ТСХ (малолетучие ПФ) по отношению к скорости при традиционной ТСХ (летучие ПФ). Для родамина Ж ^эо-тсх/тсх)= и{дмсо/и(1щегош111>нл)=3,6 и ^эогсхлсхг «(ОДпщ/^ацсгошприл^З^., Таким образом, даже по сравнению с летучими ПФ применение ЭО-ТСХ для малолетучих ПФ позволяет существенно уменьшить продолжительность хроматографического процесса.

Была опробована возможность использования электроосмотической ТСХ с малолетучей подвижной фазой для разделения некоторых нуклеозидов, используемых в фармацевтической промышленности. Проведено отделение нуклеозидов (инозина, аденозина, уридина или тимидина), полученных путём гидролиза РНК и ДНК от соответствующих нуклеотидов и азотистых оснований, присутствующих в гидролизате, с помощью электроосмотической ТСХ. Показано что, время, необходимое для отделения данных веществ можно существенно снизить: 45-50 мин в классической ТСХ и 10 мин в условиях электроосмотической ТСХ. В качестве подвижной фазы был использовано малолетучее соединение - диметилсульфоксид, что повысило стабильность хромато-графического процесса.

З.З.Электроосмотическаякруговая тонкослойнаяхроматогра-фия

Круговая тонкослойная хроматография, как известно, имеет следующие преимущества по сравнению с традиционной линейной: 1) значительное улучшение разрешающей способности, 2) повышение чувствительности (за счет концентрирования сорбатов). Одновременно были отмечены и следующий недостаток этого варианта ТСХ: относительно низкая скорость потока подвижной фазы.

Для подтверждения повышенной эффективности метода ЭО-ТСХ и возможности его использования для автоматического сужения начальной очень широкой зоны был использован вариант круговой ЭО-ТСХ. В наших экспериментах продольная ширина начальной зоны пробы (наносимой в виде полосы) составляла 1 см. В таблице 5 приведены экспериментальные данные, характеризующие сужение начальной зоны в ходе хроматографического процесса.

Таблица 5. Сужение начальных зон хроматографируемого соединения в условиях круговой ТСХ: традиционной (ТР) и электроосмотической (ЭО).

Условия эксперимента: подвижная фаза - ДМСО, пластинка ТСХ — «Сорбфил» (ПТСХ-П-В), напряжение 1,0 кВ, хроматографируемое соединение - кристаллический фиолетовый_

Вид ТСХ Характеристики элюирования зоны Ширина зоны, мм Изменение ширины зоны

перемещение, мм время, мин начальная конечная

ТР 1 4 10 20 10,0 10,0 10,2 10,8 +0,2 +0,8

ЭО 10 10 10,0 8,5 -15%

15 20 10,0 7,0 -30%

Как видно из таблицы, заметное сужение начальной зоны (15-30%) наблюдается для круговой ЭО-ТСХ. Поэтому метод может оказаться пригодным для повышения чувствительности анализа.

Для оценки метода было проведено сравнение основных хроматографических характеристик традиционной круговой ТСХ (ТК-ТСХ) и ЭО-круговой ТСХ (ЭО-К-ТСХ) для красителей при использовании в качестве подвижной фазы этанола. Для изученных красителей (родамин С и бриллиантовый зеленый) скорость их перемещения по слою увеличивается в 3,5 -5,4 раз, причем наблюдалось также и увеличение эффективности. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о целесообразности применения электроосмотического потока в круговой хроматографии.

Поскольку одним из недостатков электроосмотической ТСХ является интенсивное испарение подвижной фазы, то нами был реализованы также новый вариант круговой ЭО-ТСХ в котором в качестве подвижной фазы используется малолетучий диметилсульфоксид (ДМСО). Полученные результаты приведены в таблице 6.

Таблица б. Сравнение характеристик круговой и электроосмотической

ТСХ при использовании малолетучей подвижной с |>азы (ДМСО).

Вариант хроматографии Хроматографи-руемые красители Величина перемещения зоны на пластинке, мм Средняя скорость перемещения зоны, мм/мин Относительная средняя скорость перемещения зон

ТСХ Судан II 13 1,3 1,0

Кристалл, фиолетовый 2 0,2 1,0

Родамин Ж 7 0,7 1,0

ЭО-ТСХ, напряжение на1,5 кВ Судан II 19 1,9 1,5

Кристалл, фиолетовый 12 и 6,7

Родамин Ж 15 1,5 2,1

Как следует из приведенных данных, скорость перемещения зон хромато-графируемых соединений увеличивается при ЭО-ТСХ в 1,8-3,4 раз. То есть, для рассматриваемого варианта электроосмотической круговой хроматографии с малолетучей подвижной фазой хроматографические характеристики также улучшаются по сравнению с традиционным вариантом круговой ТСХ.

Полученные положительные эффекты для круговой ЭО-ТСХ представлялось желательным реализовать также и в квазилинейном варианте, используя стандартное оборудование для линейной хроматографии. Проведенные нами эксперименты качественно подтвердили полученные ранее результаты в круговой ЭО-ТСХ и для ЭО-ТСХ в линейном варианте для пластинок трапецеидальной (треугольной) формы, представляющей сектор круга.

Выводы

1. Проведен критический литературный анализ нового метода - электроосмотической тонкослойной хроматографии. Отмечены основные преимущества и недостатки нового метода.

2. Исследованы особенности процесса хроматографического разделения при движении подвижной фазы под действием электроосмоса в условиях закрытого слоя сорбента. Показано, что проведение хроматографического разделения на пластинках с закрытым слоем сорбента обеспечивает высокую воспроизводимость результатов разделения и возможность использования высоких напряжений (2 кВ и выше), что актуально для увеличения экспрессности.

3. Исследованы особенности процесса хроматографического разделения при движении подвижной фазы под действием электроосмоса с использованием малолетучих подвижных фаз. Показано, что испарение подвижной фазы, при-

водящее к образованию сухих зон, и прекращению процесса в ЭО-ТСХ с легколетучими фазами при применении малолетучих фаз отсутствует. Проведено систематическое исследование ряда ранее не использовавшихся в ЭО-ТСХ малолетучих подвижных фаз. Показано, что в среднем скорость движения изученных красителей увеличивается в несколько раз (в 3-10 раз) и превышает скорость движения легколетучих подвижных фаз в ТСХ.

4. Показана целесообразность практического использования новых методов -ЭО-ТСХ с закрытым сорбционным слоем и с малолетучими подвижными фазами для решения аналитических задач по разделению смесей, представляющих определенный практический интерес, вследствие чего были разработаны методика разделения и количественного определения антибиотиков и нуклео-зидов

5. Предложен новый вариант электроосмотической ТСХ - круговая электроосмотическая ТСХ и изучены его основные хроматографические характеристики в условиях закрытого сорбционного слоя и при использовании малолетучей подвижной фазы. Показано, что круговая электроомотическая ТСХ (как с закрытым сорбционным слоем, так и с малолетучими подвижными фазами) по сравнению с круговой ТСХ характеризуется следующими преимуществами: 1) большей экспрессностью, 2) более высокой эффективностью, 3) сужением первоначально широких зон.

Список литературы

1. В.Д. Красиков, ЖАХ, 2003, т.58, №8, с.792

2. R.L.M Synge. Disc Faraday Soc. (1949), №7, p. 164

3. A.G. Howard, T. Shafik, F. Moffat, I.D. Wilson, J. Cromatography A, 1999, v.844,p.333

4. D.Nurok. J. Chromatography A, 2004, v.1044, p.83

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в следующих работах:

I. Статьи

1. Березкин В.Г., Балушкин А.О., Тяглов Б.В., Литвин Е.Ф. Электроосмотическая тонкослойная хроматография с малолетучими подвижными фазами // ДАН. - 2004. - Т. 398. - №3. - С. 353-355.

2. Березкин В.Г., Балушкин А.О., Тяглов Б.В., Рожило Я., Малиновская И. Электроосмотическая тонкослойная хроматография с закрытым сорбци-онным слоем // ДАН. - 2004. - Т. 399. - № 3. - С. 362-365.

3. В. Г. Березкин, Е. Ф. Литвин, А. О. Балушкин, Я.К. Рожило, И. Малинов-ска. Электроосмотическая тонкослойная хроматография (обзор) // Заводская лаборатория. - 2004. - Т. 70. - № 12. - С. 3-14.

4. V.G.Berezkin, A.O.Balushkin. Circular Electro osmotic Chromatography // J. Planar Chromatography. - 2004. - V. 17. - P.476-479.

5. Б.В.Тяглов, А. О. Балушкин, В. Г. Березкин, Я.К. Рожило, И. Малиновска Разделение некоторых нуклеозидов методом электроосмотической ТСХ // Заводская лаборатория. - 2005. Т. 71. - № 5. - С. 3-6.

6. V.G. Berezkin, E.F. Litwin, A.O. Balushkin, J.K.Rozylo, I. Malinowska. Elec-troosmotic thin-layer chromatography // Chem. Anal.(Warsaw). - 2005. - V. 50.-P. 349-364.

П. Рефераты сообщений на отечественных и международных симпозиумах

7. Berezkin V.G., Litwin E.F., Balushkin A.O. The Perspectives of development the electroosmotic chromatography // 41th International petroleum conference. -Bratislava, Slovak Republic. - 2003. - P.54.

8. Балушкин А.О., Березкин В.Г., Тяглов Б.В., Непоклонов Э.Б. Применение электроосмотической ТСХ с малолетучей подвижной фазой для разделения некоторых нуклеозидов // Сб. тезисов Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». - М, 2004. - С. 238.

9. Berezkin V.G., Balushkin A.O., Tyaglov B.V., Litwin E.F. Application of nonvolatile mobile phases in electroosmotic TLC // The 12th International Symposium "Advances and Applications of Chromatography in Industry". - Bratislava, Slovak Republic. - 2004. - P. 109.

10. Berezkin V.G., Balushkin A.O. Circular electroosmotic chromatography // The 12th International Symposium "Advances and Applications of Chromatography in Industry". - Bratislava, Slovak Republic. - 2004. - P. 108.

11. Berezkin V.G., BalushkinA.O., Tyaglov B.V., Rozylo J.K., Malinowska I. Electroosmotic TLC with closed by a polyethylene film sorbent layer // The 12th International Symposium "Advances and Applications of Chromatography in Industry". - Bratislava, Slovak Republic. - 2004. - P. 110.

Пописано в печать 27 05 2005

Бумага офсетная Тираж ЮОэкз

Печать офсетная Заказ 222/8 5/ОБ Отпечатано в типографии издательства «БЕИЯШИ»

*ч

1663

Введение.

Глава 1. Электроосмотическая ТСХ (обзор литературы).

1.1. ТСХ с управляемым потоком подвижной фазы.

1.2. Открытие электроосмотической планарной хроматографии.

1.3. Теоретические основы электроосмоса.

1.4. Развитие электроосмотической ТСХ.

1.4.1. ЭО-ТСХ на вертикальных пластинках.

1.4.2. ЭО-ТСХ на горизонтальных пластинках.

1.4.2.1. ЭО-ТСХ при повышенном давлении подвижной фазы.

1.4.3. Хроматография на сухих адсорбционных слоях в ТСХ в электрическом поле.

1.4.4. Общая оценка современного состояния ЭО-ТСХ.

1.4.5. Перспективы развития ЭО-ТСХ.

Глава 2. Методика исследования.

Глава 3 Новый вариант ЭО-ТСХ с использованием пластин с закрытым сорбционным слоем.

3.1. Обоснование целесообразности реализации нового варианта ЭО-ТСХ.

3.2. Исследование нового варианта ЭО-ТСХ на пластинах с закрытым сорбционным слоем.

3.3. Влияние солей электролитов на характеристики удерживания и размывания в ЭО-ТСХ с закрытым слоем.

3.4. Изучение влияния среднего размера зерен сорбента в адсорбционном слое используемых пластинок на характеристики размывания в ЭО-ТСХ.96 3.5. Применение ЭО-ТСХ для разделения ветеринарных антибиотиков тилозина, реломицина, дезмикозина, продуцируемых культурой Str. fradiae

Глава 4. Новый вариант ЭО-ТСХ, основанный на использовании малолетучих растворителей в качестве подвижной фазы.

4.1. Обоснование возможности применения нового варианта ЭО-ТСХ.

4.2. Критерии выбора малолетучих подвижных фаз.

4.3. Изучение особенностей ЭО-ТСХ при применении малолетучих подвижных фаз.

4.4 Влияние добавок к подвижной фазе на характеристики разделения в ЭО

4.5. Применение ЭО-ТСХ с использованием малолетучих подвижных фаз для разделения нуклеозидов.

Глава 5. Электроосмотическая тонкослойная круговая хроматография.

Актуальность работы

В настоящее время хроматографические методы активно используются в науке и промышленности, для контроля состояния окружающей среды, медицине, научных исследованиях и т.д. Тонкослойная хроматография (ТСХ), открытая в середине прошлого века Н. А. Измайловым и Н.С. Шрайбер, является одним из наиболее простых и экономичных методов современной хроматографии. Стоимость количественного анализа в ТСХ составляет всего 35% от затрат, необходимых для проведения анализа тех же проб методом колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии [1]. Поэтому отечественные и зарубежные аналитики уделяют развитию этого метода большое внимание, например, на Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в органической химии» [2], прошедшем в 2002 г. в г. Краснодаре, тонкослойная хроматография используется в 17% докладов, посвященных хроматографии.

Однако современному классическому варианту ТСХ присущи и определённые недостатки, основным среди которых является невысокая скорость движения подвижной фазы вдоль пластинки, которая постепенно уменьшается в ходе анализа.

Для преодоления этого недостатка в последние годы были предложены новые решения, позволяющие ускорить движение подвижной фазы и сделать его более равномерным во времени. Одним из наиболее перспективных направлений, развиваемых в последние годы в ТСХ, является электроосмотическая ТСХ, в которой ускорение движения подвижной фазы основано на использовании явления электроосмоса. Электроосмотическая хроматография была предложена Мулдом и Синжем в статье, опубликованной в 1949 г [3].

Однако в публикациях по электроосмотической ТСХ исследователи отмечают как результат выделения джоулевого тепла в адсорбционном слое интенсивное неконтролируемое испарение летучей подвижной фазы, что имеет своим последствием : во-первых, низкую воспроизводимость хроматографиче-ского процесса и, во-вторых, нередко полное прекращение хроматографического процесса из-за полного испарения подвижной фазы на отдельных участках ТСХ пластинки. В ряде публикаций отмечается также движение подвижной фазы на поверхности слоя сорбента, что естественно приводит к резкому дополнительному размыванию хроматографических зон.

Поэтому можно было надеяться, что разработка новых решений в электроосмотической ТСХ, которые позволили бы преодолеть известные недостатки, является несомненно актуальной. Цели работы

Разработка и исследование следующих новых вариантов электроосмотической ТСХ (ЭО-ТСХ), свободных от известных недостатков разработанных вариантов ЭО-ТСХ:

1. электроосмотическая ТСХ на пластинках с закрытым (например, полиэтиленовой пленкой) сорбционным слоем.

2. электроосмотическая ТСХ с использованием малолетучих подвижных фаз;

3. круговая электроосмотическая ТСХ, характеризующаяся повышенной эффективностью разделения, а также «сжатием» начальных зон;

Научная новизна

Основная научная новизна работы заключается в том, что разработаны принципиально новые методы ЭО-ТСХ, свободные от недостатков известного линейного варианта в ЭО-ТСХ, а также новый вариант круговой электроосмотической ТСХ и изучены основные характеристики предложенных вариантов.

Показано, что применение новых вариантов позволяет повысить скорость движения хроматографических зон (в 2 и более раз по сравнение с традиционной ТСХ), причем одновременно увеличивается и эффективность разделения. Практическая значимость

Практическая значимость работы заключается в том, что предложены и экспериментально продемонстрированы преимущества следующих новых вариантов ЭО-ТСХ, основанных на использовании пластинок с закрытым сорб-ционным слоем и применения малолетучих подвижных фаз.

Новые варианты ЭО-ТСХ свободны от следующих принципиальных недостатков известного метода ЭО-ТСХ, затрудняющих его эффективное использование: 1) самопроизвольное прекращение хроматографического процесса в результате улетучивания подвижной фазы и, как следствие, высыхания адсорбционного слоя; 2) накопления подвижной фазы на поверхности слоя сорбента, приводящей к дополнительному размыванию хроматограифческих зон.

Практическая пригодность новых методов показана на примере анализа ряда соединений, представляющих определенный практический интерес: 1) разделения макролидных антибиотиков, 2)нуклеозидов

На защиту выносятся следующие результаты и положения: Новые варианты ЭО-ТСХ с улучшенными физико-химическими и аналитическими характеристиками:

1) ЭО-ТСХ с закрытым полиэтиленовой пленкой адсорбционным слоем;

2) ЭО-ТСХ с применением малолетучих фаз в качестве подвижной фазы;

3) новый вариант электроосмотической тонкослойной хроматографии - электроосмотическая круговая хроматография, который характеризуется повышенной эффективностью;

4) методики применения новых вариантов электроосмотической тонкослойной хроматографии для разделения сложных органических веществ.

Апробация результатов работы

Основные результаты работы были представлены на 41th International petroleum conference (Bratislava, Slovak Republic,2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Клязьма, 2004); the 12th International Symposium "Advances and Applications of Chromatography in Industry" (Bratislava, Slovak Republic,2004).

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 6 статьях и 5 тезисах докладов конференциях и симпозиумах.

Общие выводы

1. Проведен критический литературный анализ нового метода - электроосмотической тонкослойной хроматографии. Отмечены основные преимущества и недостатки нового метода.

2. Исследованы особенности процесса хроматографического разделения при движении подвижной фазы под действием электроосмоса в условиях закрытого слоя сорбента. Показано, что проведение хроматографического разделения на пластинках с закрытым слоем сорбента обеспечивает высокую воспроизводимость результатов разделения и возможность использования высоких напряжений (2 кВ и выше), что актуально для увеличения экспрессности.

3. Исследованы особенности процесса хроматографического разделения при движении подвижной фазы под действием электроосмоса с использованием малолетучих подвижных фаз. Показано, что испарение подвижной фазы, приводящее к образованию сухих зон, и прекращению процесса в ЭО-ТСХ с легколетучими фазами при применении малолетучих фаз отсутствует. Проведено систематическое исследование ряда ранее не использовавшихся в ЭО-ТСХ малолетучих подвижных фаз. Показано, что в среднем скорость движения изученных красителей увеличивается в несколько раз (в 3-10 раз) и превышает скорость движения легколетучих подвижных фаз в ТСХ.

4. Показана целесообразность практического использования новых методов -ЭО-ТСХ с закрытым сорбционным слоем и с малолетучими подвижными фазами для решения аналитических задач по разделению смесей, представляющих определенный практический интерес, вследствие чего были разработаны методика разделения и количественного определения антибиотиков и нуклео-зидов

5. Предложен новый вариант электроосмотической ТСХ - круговая электроосмотическая ТСХ и изучены его основные хроматографические характеристики в условиях закрытого сорбционного слоя и при использовании малолетучей подвижной фазы. Показано, что круговая электроомотическая ТСХ (как с закрытым сорбционным слоем, так и с малолетучими подвижными фазами) по сравнению с круговой ТСХ характеризуется следующими преимуществами: 1) большей экспрессностью, 2) более высокой эффективностью, 3) сужением первоначальных широких зон.

В заключение отметим, что данная диссертация является первой работой, выполненной в России в области электроосмотической ТСХ.

1. В.Д. Красиков, ЖАХ, 2003, т.58, №8, с.792

2. Тезисы докладов международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии». ЖАХ,2003, т.58,№7, с.686

3. R.L.M Synge. Disc Faraday Soc. (1949), №7, p. 164

4. H.A. Измайлов, M.C. Шрайбер. Фармация. 1938, №3,1

5. M.C. Шрайбер. Успехи хроматографии. 1972 г., М., изд-во «Наука», с.31

6. V.G. Berezkin. The Discovery of Thin Layer Chromatography. J. Planar. Chrom. 1995, v.8 , p.401.

7. E. Stahl. J. Chromatogr., 1979, v. 165, p. 59

8. V.G. Berezkin. J. Planar. Chrom. 1999, v.12, p. 51

9. В. Г. Березкин, А. С. Бочков, Количественная тонкослойная хроматография, М.: Наука, 1980, 183 с.

10. Nely Grinberg (Ed.) Modern Thin-Layer Chromatography. M. Dekker. New York. 1990

11. Ф. Гейсс, Основы тонкослойной хроматографии. Москва, Т. I и II, 1999, 405 и 348 с.

12. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (под. ред. А. Златкиса и Р. Кайзера), М.: Мир, 1979, 265 с.

13. Н. Kalasz. Chromatographia. 1984, v. 18, p. 628.

14. E. Tyihak, E.Mincsovics, J. Planar Chromotography, 1988 ,v.l, p. 6

15. E. Tyihak, H. Kalasz, E. Mincsovics, J. Nagy. Proc. XVII Hung. Annu. Meet. Biochem. 1977, v. 17, p. 183

16. E. Tyihak, E. Mincsovics, H. Kalasz. J. Chromatography. 1979. v.174, p.75

17. E. Tyihak, E. Mincsovics, H. Kalasz. J. Chromatography. 1980. v. 191, p. 293

18. H. Kalasz, J. Nagy, E. Mincsovics, E. Tyihak. J. Liq. Chromatogr. 1980, v.3, p. 845

19. E. Tyihak, E. Mincsovics, H. Kalasz, J. Nagy. J. Chromatography. 1981. v.211, p.45

20. E. Tyihak, Е. Mincsovics, in Sz. Nyiredy (Ed.), Planar Chromatography: A retrospective View for the Third Millennium, Springer, Budapest., 2001, p. 177

21. В.Г. Березкин, B.B. Бузаев. Успехи химии. 1987, т.56, №4, с.656

22. Sz. Nyiredy, in Sz. Nyiredy (Ed.), Planar Chromatography: A retrospective View for the Third Millennium, Springer, Budapest., 2001

23. Z.Witkiewicz,J. Bladek. J. Chromatography, 1986 v.373, p.lll

24. L. Botz, E. Wehrli, O. Sticher J. Planar Chromotography, 1993 ,v.6, p. 13

25. L. Botz, K.Dallenbach-Toelke, S. Nyiredy, O. Sticher, J. Planar Chromotography, 1992 ,v.5, p. 80

26. V. G. Berezkin. V.V. Buzaev. J. Chromatography A. 1997, v. 758, p. 125

27. В.И. Ролдугии. В книге: Химическая энциклопедия, т.5. Научное издательство Большая Российская энциклопедия.М.: 1998. Гл. редактор Н.С. Зефиров, с.847.

28. D. Nurok, М.С. Frost, D.M. Chenoweth, J. Chromatography A, 2000, v.903, p. 211

29. J.H. Knox, J.H. Grant, Chromatographia, 1987, v.24, p.135

30. D. Nurok, M.C. Frost, C.L. Pritchard, D.M. Chenoweth, J. Planar Chromatography, 1998, v.ll, p.244

31. D. Nurok, J. M. Koers, D.A. Nyman, Welmin Liao. J. Planar Chromatography,2001, v.14, p. 409

32. D. Nurok, J. M. Koers, M.A. Carmichael, Т.Н. Dzido, J. Planar Chromatography, 2002, v.15, p.320

33. D. Nurok, J. M. Koers, M.A. Carmichael, W. Liao, Т.Н. Dzido, Proceedings of the International Symposium on Planar Separations, Planar Chromatography2002, p.3

34. D. Nurok, J.M. Koers, M.A. Carmichael. J. Chromatography A, 2003, v.983, p. 247

35. T. Shafik, A.G. Howard, F. Moffat, I.D. Wilson, J. Cromatography A, 1999, v.841, p.127

36. A.G. Howard, Т. Shafik, F. Moffat, I.D. Wilson, J. Cromatography A, 1999, v.844, p.333

37. A.G. Howard, T. Shafik. LC-GC Europe, February 2000, p. 104

38. Т.Н. Dzido, R. Majewski, B. Polak, W. Golkiewicz, E. Soczewinski. J. Planar Chromatography, 2003, v. 16, p. 176

39. Т.Н. Dzido, R. Majewski. Proceedings of the International Symposium on Planar Separations, Budapest, 2003, p. 129

40. D. Nurok, J.M. Koers, A.L. Novotny, M.A. Carmichael, J J. Kosiba, R.E. San-tini, G.L. Hawkins, R.W. Replogle. Analitical Chemistry, 2004, v.76, p. 1690

41. V.Pretorius, B.J. Hopkins, J.D. Schiecke. J. Chromatography, 1974 v.99, p.23

42. D.L. Mould, R.L. Synge. Analyst. (London), 1952, v. 77, p.954

43. D.L. Mould, R.L. Synge, Biochemistry J., 1954 v.58, p.571

44. Рейсс Ф.Ф. Зап. Моск. общества натур., 1809, т.2, с. 327

45. J.E. Melanson,N.E. Baryla, С.A. Lucy. Trends in analytical chemistry. 2001, v.20, p.365

46. C.C. Духнн. Электропроводность и электрокинетические свойства дисперсных систем. 1975.

47. J.K. Rozylo, I.Malinowska. in Sz. Nyiredy (Ed.), Planar Chromatography: A retrospective View for the Third Millennium, Springer, Budapest. 2001, p.200

48. Б. Дамаскин, О. Петрий. Введение в электрохимическую кинетику. М.: «Высшая школа 1983 г.

49. R. Stol, Н. Рорре, W.T. Kok, Analytical Chemistry, 2003, v.75,p.5246

50. D.Nurok. J. Chromatography A, 2004, v. 1044, p.83

51. Malinowska, K.Rozylo.Proc. 10th Symp.Instrumental Planar Chromatography,1999, p.187-196

52. Malinowska, K.Rozylo.Proc. 9th Symp.Instrumental Planar Chromatography, 1998, p.l 79-186

53. M. Pukl, M. Prosek, R.E. Kaiser, Chromatographia, 1994, v. 38, p. 83

54. Malinowska. J. of Planar Chromatography, 1999, v. 12, p.408

55. Malinowska. J. of Planar Chromatography, 2000, v. 13, p.4

56. Malinowska. Chem. Environ. Res. 9 (3,4), 2000, p. 263

57. Malinowska. J. of Planar Chromatography, 2000, v. 13, p.307

58. Malinowska. Acta Chromatography, 2001, v.l 1, p.204

59. Malinowska, J.K. Rozylo, A. Krason. J. Planar Chromatography, 2002, v.15, p.418

60. M.M. Ditmann, G.P.Rozing. J. Cromatography A, 1996, vol. 744, p. 63

61. Т.Н. Dzido, in Sz. Nyiredy (Ed.), Planar Chromatography: A retrospective View for the Third Millennium, Springer, Budapest., 2001, p.68-86

62. Б.В. Столяров, И.М. Савинов, А.Г. Витенберг, Л.А. Карцова, И.Г. Зенкевич, В.И. Колмановский, М.А. Каламбет. Практическая газовая и жидкостная хроматография. С. Петербург. Издательство С-Петербургского университета, 1998 г ,612 с.

63. Б.П. Никольский. Справочник химика. т.З. Госхимииздат, 1952 г., Ленинград 1190 с.

64. А.А.Лурье. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1971 г, 169 с.

65. Ю. Кирхнер. Тонкослойная хроматография, т.1. М.: «Мир», 1981, 523 с.бб.Э.Шталь. Хроматография в тонких слоях. М.: «Мир», 1965, 508 с

66. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Тюрина Н.В. Тонкослойная хроматография. Теоретические основы и практическое применение. Саратов: Изд-во Саратовского университета, 2002. 106 с.

67. Березкин В.Г., Бочков А.С. Количественная тонкослойная хроматография. М.: Наука, 1980. 184 с.

68. Представление результатов химического анализа (рекомендации IUPAC 1994 г) ЖАХ, т. 53, №9, с.999

69. Mandel. J. The statistical analysis of experimental data. New York. Wiley-Interscience, 1964 , 307 p.

70. М.С. Черновьянц, И.Н. Щербаков, Е.М. Цыганков, О.И. Аскалепова, И.В. Евлашенкова. Систематические и случайные погрешности химического анализа. М.:ИКЦ «Академкнига», 2004, 157 с.

71. Кибардин С.А., Макаров К.А. Тонкослойная хроматография в органической химии.М.: Химия, 1978. 126 с.

72. Волынец М.П. Тонкослойная хроматография в неорганическом анализе. М.: Наука, 1974, 152 с.

73. А.П. Бабичев, Н.А. Бабушкина, A.M. Братковский. Физические величины: справочник. -М.: Энергоатомиздат, 1991, 1232 с

74. Williams T.I. An introduction to chromatography. Glasgow: Blackie, 1947, p.36

75. В.Г. Березкин. B.B. Бузаев. Доклады АН. 1996,т.347, №4, с.481

76. E.V. Degterev, В. V. Tyaglov, 1.1. Malakhova, V. D. Krasikov. J. Planar Chromatogr., v. 13,2000, p. 194

77. E.V. Degterev, В. V. Tyaglov, 1.1. Malakhova, V. D. Krasikov. J. Planar. Chromatogr., v. 13, 2000, p. 217

78. B. V. Tyaglov, I. A. Sizova, V. I. Zvenigorodskii. J. Planar Chromatogr., v. 8, 1995, p. 374

79. C.C. Духин, B.B. Дерягин. Электрофорез. M.: Наука, 1976, 257 с.

80. А.В. Сеупанов, Е.К. Корчемная. Электромиграционный метод в неорганическом анализе. М.: Химия, 1979, 305 с.

81. I.S. Krull, R.L. Stevenson, К. Mistry, М.Е. Swartz. Capillary electrochroma-togrphy and pressurized flow capillary electrochromatography. New York, HNB Publishing, 2000,240 p.

82. C. F. Pool, in Sz. Nyiredy (Ed.), Planar Chromatography: A retrospective View for the Third Millennium, Springer, Budapest., 2001.

83. Куренбин О.И., Беленький Б.Г., Литвинова JI.C., Ганкина Э.С. ЖАХ.1989.Т.44. №.3.c.493-502.

84. Brinkman U.A. Th. De Vries G. J.Planar. Chrom, .1988, v.l, p.336

85. Н.С. Егоров. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986, 435 с.

86. Ю.О. Сазыкин. Антибиотики как ингибиторы биохимических процессов. М.: Наука, 1976, 447 с.

87. Зуев Н.П., Положенко Э.Г., Болгова В.И., Першина С.И. Актуальные проблемы ветеринарии в борьбе с незаразными болезнями животных. Сб. н. тр. ВНИИНБЖ. Воронеж. 1990. с. 34

88. Kirst НА. Antibiotics ( macrolides ). In: Howe- Grant M (Ed), Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th edition, Wiley, New York 1992, v.3., p. 169

89. Hamill R.L. Antibiot. Chemoterapy. 1961, v.ll, №5, p.328

90. D.A. Amorese, V.R. Bamberg. J. Cromatography Science, 2002, v.40, p. 190194

91. M. Vega, E. Geske, G. Garcia, R. Saelzer. J. Planar. Chromatography.2002, v.15, p.437-439

92. Gray P.P., Bhuwapathanapun S. Biotechnol. Bioeng. 1980, v.22, №9, p.1785

93. Б.В. Тяглов, В.Г. Жданов, В.И. Пермогоров, А.Ф. Шолин, Б.В. Щербачев, JI.C. Юстратова, Н.Г. Ярославцева. Биотехнология. 1988, т.4, №4, с. 548

94. Niederwieser A., Honegger С.С. Gradient techniques in thin-layer chromatography. In: Advances in Chromatography. New York, Marcel Dekker, 1966, p.123

95. V.G. Berezkin, S.L. Bolotov. J. HRC.1983, v.6, p.203

96. V.G. Berezkin, S.L. Bolotov. Talanta. 1987, v.34, p. 183

97. J. Kowalczyk, J. Chromatography. 1964, v. 14, p.411

98. J. Kowalczyk, A. Czapinski, Anal. Chem. 1964, v.9, p. 1021

99. K.O. Alt, G. Szekely. J. Chromatography. 1980, v.202, p. 151

100. Gordon A.J., Ford R.A. The chemist's companion. A Handbook of Practical Data, Techniques, and References. New York, Wiley, 1972

101. Bollinger J., Yvernault G., Yvernault T, R.Houriet. Can. J. Chem. 1984 v.62, p. 361

102. А.Н. Король. Неподвижные фазы в газожидкостной хроматографии: Справочник. -М.: Химия, 1985.- 240 с.

103. Jork Н, Funk W., Fischerand W., Wimmer H. Thin-Layer Chromatography. Reagents and Detection Methods. VCH Verlag, Wenham. Germany. 1990.

104. E. Postaire,C.Sarbach, P. Deivordre, C.Regnauit. J. Planar Chromatography, 1990, v.3, p.247

105. V.G. Gimpelson, V.G. Berezkin. J. Liq. Chromatography. 1988, v.ll, p.2199

106. Кочетков H.K., Будовский Э.Н., Свердлов Е.Д. . Органическая химия нуклеиновых кислот. М.: Химия, 1970, 717 с

107. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, т.1 , 2000, 539 с.

108. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, т.2 , 2000, 608 с.

109. Шаршунова М., Шварц В., Михалец И. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. М.: Мир, т.2, 1980, 621 с.

110. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981, т.2, -494 с.

111. Остреман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, -536 с.

112. Sibirklang М.М., Gilum A. Meth. Enzymol. 1979, v.59,p.58.

113. Haber M.J., Maddocks J.L. .Chromatography. 1976, v. 125, p.530

114. Schwartz P.M.,.Drach J.C. J.Chromatography. 1975, v.106, p.406.

115. Э. В. Кузнецов, H. В. Королькова, А. С. Миронов, Б. В. Тяглов, А. И. Заика и др. Биотехнология, 1995, N9-10, с.60

116. Kaiser R.E. Einfuhruns in die HPPLS (Hochdruck-Planar-Flussigkeitschromatographie). Heidelberg: Htithig Verlag, 1987,215 s.

117. Березкин В.Г., Горшунов О.Л. Ж.физ.химии. 1968. Т.42. №10. С.2587