автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.06, диссертация на тему:Управление процессом биосинтеза лизина с использованием контроля состава методом тонкослойной хроматографии

На правах рукописи

ПАРАМОНОВ Егор Анатольевич

Управление процессом биосинтеза лизина

с использованием контроля состава методом тонкослойной хроматографии

05.13.06- Автоматизация и управление технологическими

процессами и производствами (промышленность) 05.11.13 - Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2010

004606900

Работа выполнена на кафедре «Техническая кибернетика и автоматика» Московского государственного университета инженерной экологии

Научный руководитель:

кандидат технических наук Зубов Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор технических наук Рылов Владимир Аркадьевич кандидат технических наук, доцент Татяринов Александр Владимирович

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, г. Москва

Защита диссертации состоится «24» июня 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.145.02 при Московском государственном университете инженерной экологии, 105066, г. Москва, ул. Старая Басманная, д. 21/4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУИЭ.

Автореферат разослан «20» мая 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.145.02 к.т.н., доцент

Мокрова Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Среди комплекса основных задач, решаемых на технологических производствах для обеспечения их эффективной и бесперебойной работы, особое место занимают задачи автоматизации как производства в целом, так и отдельных его участков. Анализ работ по автоматизации и оптимальному проведению процессов биосинтеза показывает, что можно снизить непроизводительные затраты энергии путём использования в системе управления технологическим процессом более точных адаптивных математических моделей. При биотехнологическом производстве основным прямым параметром, объективно характеризующим ход процесса, является концентрация целевого вещества в культуральной жидкости. Изучение современных достижений в области датчиков показывает, что не существует стабильных и доступных in-line анализаторов как многих продуктов (аминокислоты, антибиотики и т.д.), так и редуцирующих веществ, поэтому используют различные методы химического анализа, в частности тонкослойную хроматографию (ТСХ). Преимущества данного метода, такие как простота использования, дешевизна оборудования и материалов, сочетаются с его недостатками: большое время получения результата анализа (в течение 4-8 часов) и низкая точность, на которую оказывает значительное влияние человеческий фактор. Следовательно, повышение точности и стабильности получаемых результатов лабораторных анализов даст возможность производить своевременную выработку управляющих воздействий на процесс, что позволит достичь заданного качества готовой продукции и решить актуальную задачу экономии энергоресурсов.

Объект и предмет исследования. В диссертационной работе рассмотрена автоматизация процесса биосинтеза лизина с использованием метода тонкослойной хроматографии для анализа культуральной жидкости.

Цель диссертационной работы. Целью работы является создание АСУТП биотехнологическим производством, обеспечивающей снижение энергозатрат за счёт модификации традиционных алгоритмов обработки информационных сигналов.

Задачи диссертационного исследования. В соответствии с данной целью были поставлены следующие теоретические и практические задачи исследования:

1. Разработка и апробация модели окрашенности зон диффузии в методе ТСХ-анализа.

2. Усовершенствование методики ТСХ-анализа с применением полученной модели, снижающей погрешность химического анализа.

3. Разработка автоматизированной системы управления биотехнологическим производством лизина, обеспечивающей снижение энергозатрат.

Методы исследований. Для решения поставленных задач использовались методы теории моделирования и идентификации технологических процессов, статистического оценивания и экспериментальные исследования.

Достоверность результатов подтверждена экспериментальными исследованиями в лаборатории, использующей разработанную методику и основанный на ней аппаратно-программный комплекс. На защиту выносится:

1. Методика автоматизированного анализа тонкослойных хроматограмм.

2. Функциональная организация програмного обеспечения автоматизированного определения концентраций продуктов биосинтеза и редуцирующих веществ при помощи ТСХ-анализа.

3. Алгоритм адаптивного управления процессом биосинтеза на примере биотехнологического производства лизина.

Научная новизна заключается в следующем:

1. Разработана экспериментально-аналитическая модель окрашенности зоны диффузии.

2. Методика детектирования определяемых веществ в пробах культуральной жидкости, основанный на разработанной модели, и реализующее её программное обеспечение.

3. Разработана и предложена инженерная методика применения полученных решений при создании автоматизированной системы управления биотехнологическим производством.

Практическая ценность и реализация результатов работы.

Созданная методика успешно внедрена для анализа культуральной жидкости на содержание L-лизина, углеводов и эритромицинов в научно-исследовательской лаборатории кафедры ЭиПБ МГУИЭ, включена в разработанный промышленный регламент получения L-лизина.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на XXI Межд. н. конф. «Математические методы в технике и технологиях» (Тамбов 2008 г.), V Межд. н.-практ. конф.-выставке «Экологические проблемы индустриальных мегаполисов» (Донецк, 21-23 мая 2008 г.), Н. конф. студентов и молодых учёных МГУИЭ (Москва, 2009 г.), демонстрировались на биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2007», «РосБиоТех-2008», VIII Всероссийская выставка н.-т. творчества молодежи НТТМ-2008 (ВВЦ, 25-28 июня 2008 года), VII Межд. специализированной выставке «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2009».

Публикация результатов исследования. Основные результаты научных исследований по теме диссертации содержатся в 10 печатных работах, в том числе одна статья в журнале, рекомендованном ВАК.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографического списка. Основной текст изложен на 132 страницах и содержит 19 таблиц, 50 рисунков, 2 приложения. Библиографический список содержит 154 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении рассмотрены вопросы оптимального управления процессом биосинтеза и обоснована необходимость автоматизированного анализа культуральной жидкости на содержание продуктов и редуцирующих веществ методом тонкослойной хроматографии, обоснована актуальность темы диссертационной работы, дано краткое изложение содержания работы по её разделам, раскрыта научная новизна и практическая ценность работы.

В первой главе рассматриваются работы по оптимальному управлению процессами биосинтеза (Бирюков В.В., Кантере В.М., Музыченко Л.А., Казаков A.B., Станишкис Ю. К-Ю., Лубенцов В.Ф., Амелькин A.A., Шнайдер Л.Е. и д.р.), отмечается важность методов оперативного анализа культуральной жидкости, приведена их общая характеристика. Показана возможность улучшения технико-экономических показателей процесса при снижении погрешности определения концентраций продуктов биосинтеза и редуцирующих веществ. Поставлена задача оперативного определения состава культуральной жидкости и сформулированы требования к селективности и точности. Проанализированы современные тенденции в создании датчиков (Дженнер), показана необходимость использовать отбор проб с дальнейшим анализом. Приведён обзор работ по методикам анализа (Золотов Ю.А.), обоснована целесообразность использования для разделения компонентов пробы метода ТСХ - разновидности планарной жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза перемещается в пористой среде слоя адсорбента. ТСХ обеспечивает разделение анализируемого вещества на компоненты для дальнейшего проявления (путём химической реакции с получением окрашенных продуктов) и анализа. Указана область применимости данной методики. Приведён литературный обзор публикаций по методам хроматографии (Гейсс Ф.), отмечено, что при общем количественном росте публикаций по методам хроматографического анализа, количество работ по ТСХ невелико. Рассмотрены разные способы детектирования (денситометрия, методы элюирования). Указаны способы повышения эффективности химического анализа и в частности ТСХ-анализа за счёт применения в качестве детекторной базы компьютерной техники.

Во второй главе представлено описание проведения анализа методом тонкослойной хроматографии и даётся обзор качественных и количественных методов детектирования. Сравнение метрологических характеристик методик определения различных веществ указывает на то, что с помощью планшетного сканера и компьютерных программ цифровой обработки изображения можно определять указанные компоненты с такой же чувствительностью, как и с помощью денситометрии.

Рассматриваются методики количественного анализа ТСХ пластин с пробами антибиотиков (на примере эритромицинов), которые основаны на том, что по величинам интегральной интенсивности окрашенности S (также используются и

другие характеристики, например диаметр пятна) пятен стандартных образцов (с известными концентрациями С/= 0,25 г/л, С2 = 0,5 г/л, С3= 1 г/л) строится калибровочная кривая 5 =/(С), которую аппроксимируют какой-либо гладкой функцией. Основными недостатками рассмотренных методик являются узкий рабочий диапазон измерений, резкое снижение точности из-за дефектов пластины и разной степени растекания проб при хроматографическом разделении.

Приведённые результаты экспериментальных исследований показывают, что при определении интегральных характеристик происходит потеря части имеющейся на пластинке полезной графической информации. При помощи планшетного сканера можно, не меняя материальную базу и ход анализа, повысить точность анализа за счёт изменения математической обработки отсканированного изображения проявленной хроматографической пластинки. Для преодоления вышеуказанных недостатков предложено строить калибровочную кривую не для пятна в целом, а для квадратного сегмента пластинки, соответствующего одной ячейке растра изображения, и в качестве её аргумента использовать не концентрацию пробы (г/л), как ранее, а количество вещества (в моль или г) в сегменте пластинки, соответствующего данной ячейке растра.

Рис. 1. Проявленная хроматографическая пластинка с набором известных концентраций эритромицина А, г/л. СТ1 и СТ2 - используемые пятна при расчете

параметров модели

Используя изображения хроматографических пластин с известным набором концентраций (рис. 1), была выбрана функция для эритромицина А:

где / -интенсивность окрашивания ячейки растра (в диапазоне от 0 (белый) до 255 (чёрный)); а, Ъ - калибровочные коэффициенты; N - количество анализируемого вещества, содержащегося в сегменте, моль.

Характер зависимости интенсивности окрашенности растровой ячейки от количества содержащегося в нём анализируемого вещества приведён на рис. 2.

0,4 1 2 3

щ

4 5 6 7

аз А г о н с ё &г у I

8 9 10 Ь \г 13 14 15

1п(/) = а + Ь-1п(Я),

(1)

Рис. 2. Зависимость интенсивности окрашенности растровой ячейки от количества содержащегося в нём анализируемого вещества: I- интенсивность окрашивания растровой ячейки; Ы- количество вещества, моль

Для нахождения параметра Ь используется следующее соотношение:

¿иу *

ЛИП"*1'

(2)

где И1, ТУ2 — количество вещества для стандартного пятна СТ1 и СТ2 соответственно, моль; /'/, интенсивность окрашивания г-ой растровой ячейки для стандартного пятна СТ1 и СТ2.

Зная величину параметра Ь, можно легко получить из выражения (1) величину параметра а:

Г 'р.

а = Ь

1п

2 (',<

¡=1 у

Л

-1пи,

(3)

Зная параметры анЬ, найдём количество вещества в анализируемом пятне Сх:

I \ 7L / И/.

(4)

1=1.у '

л

В третьей главе рассмотрено применение предложенной методики для создания программно-технического комплекса детектирования определяемых веществ.

Программная реализация состоит из основных блоков, решающих следующие подзадачи:

- выбор способа перевода цвета растровой ячейки из 24 битного формата в 8 битный;

- поиск параметров модели, соответствующих данному веществу, режиму проявки и типу пластинки;

- расчёт и вывод рассчитанных значений составов проб.

Вспомогательные функции (получение изображения, организация диалога с пользователем, вывод данных и т.д.) осуществляются общепринятыми способами.

Необходимость выбора способа перевода цвета растровой ячейки из 24 битного формата в 8 битный связана с тем, что после проявления пластинки каждое из веществ окрашивается в свой собственный оттенок. Например, пятна эритромицинов А и С окрашиваются в фиолетово-синий цвет, а эритромицинов В и D - в серо-зеленый, аминокислота L-лизин в сиреневый, а такие углеводы, как глюкоза и мальтоза, приобретают красный. Во избежание потери информации при использовании 8-битного изображения в оттенках (градациях) серого, целесообразно применять монохроматическое, по одному их цветовых каналов R, G или В (красный R, зеленый G и синий В). Использование данной схемы позволит снизить влияние паразитной окрашенности фона. Были получены гистограммы распределения по каждому каналу для следующего ряда веществ: антибиотики (эритромицины), сахара (мальтоза, глюкоза) и аминокислоты (лизин, серин, валин, изолейцин). Соответственно, там где площадь под кривой цветовой составляющей больше (т.е. этот канал превалирует в окраске определяемого вещества), тот канал и необходимо использовать при расчёте параметров модели. Как известно, в цветовом режиме RGB любой цветовой оттенок является результатом аддитивного вычитания из белого цвета. Таким образом, базовым цветовым каналам RGB-модели в реальности соответствуют циановый С (Cyan), малиновый М (Magenta) и желтый Y (Yellow) цвета (режим CMY).

На рис. 3. показаны используемые цветовые каналы для эритромицина и лизина:

Color Model RGB

Red

ШШ' Green

aá Min f d Max ^50™

М Min fj Ö Max í 50

й Min fÖ~ Max Ig 5Ö~

Color Model I RGB Preview Color

Red

Mln 3 II Max M56

Min fo-Мзх Jfsif

- красный для эритромицинов;

Min go Max ¥ 50

- зеленый для аминокислот.

Рис. 3. Выбор цветовых каналов

На рис. 1. представлена проявленная хроматографическая пластина с набором чистых (почти без примесей) проб. В реальных пробах наличие примесей вносит погрешность в анализ и использование только одной из цветовых составляющих позволяет уменьшить влияние второстепенных веществ.

Параметр Ь модели (1) находят методом золотого сечения на интервале [0; 1] с погрешностью 0,001, параметр а рассчитывают по формуле (3). В частности, для эритромицина значения коэффициентов составили 6 = 0,466 и а = 4,517. Расчёт концентраций в анализируемых пробах осуществляется при помощи выражения (4).

Для автоматизированного определения концентраций веществ на ТСХ-пластинах в среде Delphi 6.0 было создано программное обеспечение. При загрузке программы появляется пять основных окон (см. рис. 4):

1. Основное окно;

2. Окно с цифровым изображение отсканированной пластинки;

3. Окно задания геометрических размеров площади выбора;

4. Таблица рассчитанных значений;

5. Динамическое окно, появляющееся после выбора необходимой области.

Рис. 4. Скриншот программы для расчета концентраций на ТСХ-пластинах

Пользователь выбирает ранее отсканированное изображение ТСХ-пластины с пробами (или сканирует новое), указывает на ней два стандарта и далее выбирает области с неизвестными значениями проб для автоматического расчёта концентраций. Полученные данные могут быть сохранены в формате Excel таблицы и распечатаны на принтере.

Весь процесс сканирования и обработки пластины с пробами занимает около 10 минут, что значительно меньше, чем при применении систем с денситометрией или спектрометрией, и при этом требует меньше места в лаборатории.

В четвёртой главе изложено описание экспериментов, подтверждающих адекватность получаемых по предложенной методике результатов, и приводятся направления развития работы и областей её применения.

Для подтверждения предлагаемой методики был произведён ряд экспериментов. На ТСХ-пластину были нанесены образцы с известными концентрациями мальтозы и глюкозы (аналогичные опыты были проведены для эритромицинов и аминокислот). Ряд концентраций для мальтозы в г/л: 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8; для глюкозы в г/л: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5 в двух повторениях на пластинке для каждого из веществ. Далее не хроматографируя (не проводя диффузии), её проявили (см. рис. 5) и отсканировали на планшетном сканере с разрешением в 600 dpi.

э?1- OJ o's oif о'я з'г Уг 9'i <t't о? л''/ як afg ji о:. J2

И,£~ <о 2,0 ДО 0S {0 г,!> s.s Л\о ,t.£~ 4>,е е'в fft£- ip

Z^ffO К -л, ■ 'Ул

Рис. 5. Проявленная хроматографическая пластинка, не подвергнутая диффузии

На рис. 6 приведены увеличенные изображения пятен, соответствующих пробе, подвергнутой диффузии (а), и пробе, не подвергнутой диффузии (б). Видно, что пятно, соответствующее подвергнутой диффузии пробе состоит из пикселов с разными интенсивностями окрашенности, а пятно, соответствующее не подвергнутой диффузии пробе состоит из пикселов с близкими значениями интенсивностей окрашенности.

Рис. 6. Проба, подвергнутая диффузии (а), проба, не подвергнутая диффузии (б), одной и той же концентрации мальтозы 3 г/л

Для каждого из отсканированных изображений пятен (рис. 5) были построены гистограммы частот повторения интенсивностей окрашенности по синему каналу (рис. 7).

Гистограмма пятна без диффузии

Гистограмма пятна с диффузией

2000 т

1800 -

1600 -

1400 -

1200 -

Л £

? о 1000 -

то

у

800 -

600 -

400 --

200 -

т-т-т-т-т-т-ГЧГ^СЧО!

Интенсивности окрашенности пикселей

а

к<5> # # .«Р „<$ & п9

ку гу <у ЛУ Я- тг 'V

Интенсивности окрашенности пикселей

Рис. 7. Гистограммы интенсивностей окрашенность растровых ячеек пятен проб одинакового объёма и состава, не подвергнутого (а) и подвергнутого диффузии (б)

Поскольку пятна, не подвергнутые диффузии, состоят из растровых ячеек практически одной и той же окрашенности 1Г, то, зная площадь пятна, можно получить зависимость интенсивности окрашенности растровой ячейки от количества содержащегося в нём вещества: \п(1г)=а+Ь-\п(С)) (рис. 7). Полученное значение достоверности корреляции интенсивности окрашенности растровой ячейки от количества содержащегося в ней вещества =0.99 свидетельствует о состоятельности предлагаемой методики. Аналогичные результаты были получены и для других рассмотренных веществ, представляющих интерес для биотехнологического производства - глюкозы, эритромицинов, аминокислот и других веществ.

Также было проанализировано более 50 имеющихся в наличии изображений отсканированных хроматограмм с известными концентрациями проб, и было получено, что погрешность методики не превышает 5 %.

4,5 4 - ln(l)= 1,30*|п(С) + 1,63 R2 = 0,9882 А

3,5

"с* 3 */

2,5 - ♦

0,5 1 1,5 2 !п(С) 2,5

Рис. 8. Калибровочная кривая для мальтозы

Таким образом, программная обработка оцифрованных изображений j хроматограмм представляет собой новый объективный метод количественной планарной хроматографии. По сравнению с современной денситометрией в данном случае не требуется сложное и дорогостоящее аналитическое оборудование. По затратам времени на анализ одного образца программная обработка сопоставима с оптической видеоденситометрией (в среднем этот показатель составляет 5-10 I минут). Снижение затрат времени связано, в первую очередь, с разработкой i специализированного программного обеспечения (программа "М9"). Так, при обработке изображений хроматограмм в графическом редакторе (таком, как PhotoShop) и ПО ImageQuant для расчёта интенсивности окрашенности, продолжительность анализа одного образца возрастает до 30 - 45 минут.

Применение цветовой обработки хроматограмм в модели RGB позволяет в некоторых случаях существенно повысить чувствительность метода.

Помимо планшетных сканеров в качестве детектирующих устройств могут быть использованы и цифровые фото- или видеокамеры, что позволит расширить число используемых для проявления хроматограмм реагентов (за счёт отсутствия контакта стекла сканера с агрессивными реагентами типа серной кислоты). Кроме того, применение в качестве детекторов цифровых камер позволит проводить анализ не только в диапазоне видимого света, но и в ультрафиолете.

В пятой главе рассмотрена возможность применения разработанной автоматизированной методики анализа культуральной жидкости при управлении процессом биосинтеза.

Одним из распространённых полупериодических процессов биосинтеза является производство незаменимой аминокислоты лизина, применяемой в сельском хозяйстве и медицине. В предварительно вымытый и простерилизованный ферментёр Ф загружают стерильную питательную среду (в основном состоящую из продуктов переработки зерна и ряда добавок, стимулирующих рост биомассы) и ферментационную среду из посевного ферментёра ПФ, содержащую культуру-продуцент L-лизина (например, рода Brevibacterium sp. или Micrococcus glutam), вырабатывающую лизин в процессе своей жизнедеятельности. В ферментёре регулируются температура (подачей охлаждающей воды), давление (открытием клапана на линии отходящих газов), непрерывно подаётся стерильный воздух и по некоторому закону подаются подпитки, поддерживающие на заданном уровне показатель рН среды и восполняющие недостаток углеводов (Сахаров) в ферментационной среде, см. рис. 9.

Рис. 9. Схема автоматизации процесса промышленной ферментации: 1,2 -подача и отвод охлаждающей воды; 3 - линия отходящих газов; 4 - линия подачи подпиток; ПФ1 - посевной ферментер; Ф1-4 - батарея ферментеров

Необходимость в подпитке сахарами обусловлена тем, что существует их оптимальная концентрация, обеспечивающая максимальную скорость биосинтеза лизина, и большую часть времени её стараются поддерживать при помощи подпитки. В конце процесса, когда исчерпаны запасы основной питательной среды и наработано достаточное количество лизина, ферментационную среду передают на стадию выделения, за несколько часов перед этим прекращая подачу подпиток, чтобы культура-продуцент Ь-лизина потребила остатки Сахаров — их присутствие резко затрудняет процесс выделения лизина, увеличивает расходы на промывку и I регенерацию используемых на стадии выделения мембранных систем, см. рис. 10.

ПФ1 Слив Подготов. § Рост операции я биомассы Слив ¡П°ДГ0Т0В- § Рост ™ [операции $ биомассы Слив Подготов.! § Рост операции $ биомассы Подготов. 1 операции £

01 ФЗ Слив Подготовительные операции - л : Засев 1 ^ост 1 Наработка лизина | биомассы |

Засев _ Рост Наработка лизина биомассы

Наработка лизина Слив Подготовительные операции Засев Рост биомассы Наработка лизина

| Ф4 .................... Наработка лизина Слив Подготовительные операции Рост биомассы

Рис. 10. Циклограмма стадий процесса биотехнологического производства

лизина для посевного аппарата ПФ1 и ферментеров Ф1-4

Таким образом, в стадии биосинтеза можно выделить три этапа:

- рост биомассы (его ускоряют при помощи подпитки так называемого "ростового фактора");

- биосинтез лизина (для его ускорения поддерживают постоянную концентрацию Сахаров);

- окончание процесса - снижение концентрации Сахаров до допустимых значений.

Оптимальные профили концентраций ростового фактора (Р), лизина (Л), биомассы (Б) и Сахаров (С) по времени изображены на рис. 11.

биомассы (Б) и Сахаров (С) по времени

Очевидно, что третий этап желательно сделать как можно короче, что позволит снизить затраты на поддержание температуры, подачу стерильного воздуха и перемешивание - только энергозатраты на производство сжатого стерильного воздуха составляют порядка 7-12% от всех энергозатрат производства, уменьшение этапа окончания процесса позволит уменьшить затраты и даст больше гибкости в составлении расписания обслуживания ферментёров. Для выбора оптимального времени начала и продолжительности этапа окончания биосинтеза необходимо знать текущие концентрации лизина (продукта биосинтеза) и Сахаров (редуцирующих веществ) в ферментационной среде, для чего приходится отбирать пробы культуральной жидкости и подвергать их длительному химическому анализу. Решение задачи выбора оптимального момента прекращения процесса сводится к определению времени снижения концентрации углеводов до пороговой величины. В соответствии с регламентными требованиями содержание остаточных Сахаров в среде не должно превышать 8 кг/м3. Эта величина принята в качестве пороговой. На практике, при использовании традиционных методик анализа, средняя погрешность определения времени окончания ферментации составляет б ч.

Анализ данных ряда биохимических заводов позволил установить зависимость изменения концентрации Сахаров во времени в конце процесса:

где 5 - концентрация Сахаров (г/л) в среде; I - время отбора очередной пробы; ; -номер пробы.

Это позволяет рассчитать прогнозируемый момент окончания ферментации:

'*=/гМЛ). С6)

где & - требуемая концентрация Сахаров (г/л) в среде на момент окончания ферментации; 4 - время окончания ферментации.

Алгоритм адаптивного прогноза момента окончания периодического процесса ферментации состоит, таким образом, в выполнении следующих процедур:

1. Определение величины параметров уравнения (5) по данным двух или большего числа анализов концентрации Сахаров во время этапа биосинтеза.

2. По достижении требуемой концентрации лизина в ферментационной среде прекращается подача подпитки.

3. Определение момента окончания ферментации по выражению (6), исходя из результатов анализа концентрации 5/ Сахаров.

Существенную роль в прогнозировании времени достижения пороговой величины концентрации Сахаров играет точность и скорость проведения анализа отобранной пробы культуральной жидкости.

На рис. 12 представлен наихудший для прогноза вариант, когда при всех анализах содержание Сахаров завышается. Момент времени Ц соответствует прекращению подачи подпитки, кривая А соответствует погрешности анализа 5 %

(использование предложенной методики анализа), кривая В - 20 % (традиционные химические методы анализа), и (¡- время отбора 1 и 2 пробы для ТСХ анализа; Б0Л и ¿>/ — концентрация сахара в момент времени /о и о соответственно при погрешности анализа 5%; 51/ и 5/ - концентрация сахара в момент времени /о и // соответственно при погрешности анализа 20%; истинное время окончания процесса ферментации; - прогнозируемое время окончания процесса ферментации при погрешности анализа 5 %; ¡„з - прогнозируемое время окончания процесса ферментации при погрешности анализа 20 %.

Б, г/л

8»

А в

<

«А

8, 35

30 25 20 15 10

Эк

N ч в истинная / концентрация /

- \

- . , 1 1 г i r 1 1 ' 1

О»»3 10 15 2° t„. t 25 30 t____t 4 «

Рис. 12. Прогнозирование времени окончания процесса

В случае, представленном на рис. 12, использование предложенной методики анализа культуральной жидкости даёт удовлетворительную погрешность в 2,5 часа против 12 часов с использованием традиционных химических методов анализа.

В более вероятном случае (когда погрешности двух анализов имеют разные знаки) погрешность прогноза составляет менее 0,5 часа при погрешности анализа 5 % и примерно 2 часа при погрешности анализа в 20 %.

Таким образом, уменьшение погрешности прогноза позволит закладывать меньший запас времени для гарантированного снижения концентрации Сахаров до требуемого уровня.

На рис. 13 представлена структурная схема верхнего уровня системы управления процессом биосинтеза, реализующая предлагаемый алгоритм.

Загрузка аппаратов исходным материалом Процесс роста биомассы Процесс биосинтеза Окончание процесса биосинтеза Информационно-измерительная система химического анализа Подсистема отбора пробы

6.1. Дозированный отбор пробы

6.2. Подготовка пробы Подсистема преобразования пробы

7.1. Разбавление пробы

7.2. Нанесение пробы на хроматографическую пластинку

7.3. Хроматографирование

7.4. Проявка Подсистема измерения

8.1. Сканирование пробы

8.2. Распознавание пятен соответствующих стандартов

8.3. Распознавание пятен, соответствующих конкретной пробе и конкретному веществу

8.4. Расчёт по пятнам стандартов коэффициентов модели

8.5. Определение концентраций в пробе Пересчёт параметров математической модели процесса по полученным данным Расчёт новых настроек регулятора для адаптивной модели процесса управления

11. Выгрузка биомассы

12. Мойка аппарата

Г. Новая загрузка аппарата исходным материалом для начала процесса биосинтеза Рис. 13. Структурная схема верхнего уровня управления процессом биосинтеза

В приложениях приведены листинги ключевых фрагментов разработанного ПО и инструкция по эксплуатации программного комплекса «М9».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Разработана экспериментально-аналитическая модель окрашенности зоны диффузии от количества, содержащегося в ней, вещества.

2. Создана методика определения концентрации продуктов биосинтеза и редуцирующих веществ в культуральной жидкости и реализующий её программно -технический комплекс.

3. Разработана автоматизированная система определения оптимального момента завершения процесса биосинтеза лизина на базе созданной методики, которая обеспечивает снижение энергозатрат.

6.

1. 2.

3.

4.

5.

9.

10.

4. Созданная методика внедрена в работу научно-исследовательской лаборатории Института промышленной биотехнологии МГУИЭ и в учебный процесс, включена в производственный регламент завода по производству L-лизина в республике Чувашии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Парамонов Е.А., Зубов Д.В. Применение компьютерной обработки изображения для повышения точности анализа методом тонкослойной хроматографии // Инженерная физика. - 2008 №4 - с.53-58.

2. Парамонов Е.А. Автоматизированное определение концентрации эритромицина // Студ. н. конф. факультета Автоматизации и информационных технологий. Тезисы докладов аспирантов, магистрантов и студентов. -М.: МГУИЭ,

- 2005 - с. 4.

3. Парамонов Е.А. Автоматизированное определение концентрации аминокислот // Студ. н. конф. факультета Автоматизации и информационных технологий. Тезисы докладов аспирантов, магистрантов и студентов. - М.-. МГУИЭ, -2006-с. 4.

4. Парамонов Е.А. Автоматизированное определение содержания Сахаров в культуральной жидкости методом ТСХ // Студ. н. конф. факультета Автоматизации и информационных технологий. Тезисы докладов аспирантов, магистрантов и студентов. - М.: МГУИЭ, 2007 - с. 4-5.

5. Зубов Д.В., Парамонов Е.А. Автоматизированное определение состава методом тонкослойной хроматографии // Математические методы в технике и технологиях, №8, Воронеж 2006. - с. 20-22.

6. Парамонов Е.А. Автоматизированный анализ культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии// Сб. трудов XX Международной н. конф. Математические методы в технике и технологиях - ММТТ-20, Т10, Ростов-на-Дону, Издательский центр ДГТУ - 2007 - с. 71-73.

7. Парамонов Е.А., Толченов A.A. Автоматизированный анализ культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии // Сборник трудов XXI Международной научной конференции Математические методы в технике и технологиях - ММТТ-21, Тамбов - 2008 - с. 125-127.

8. Парамонов Е.А., Толчёнов A.A., Студеникин Г.И. Компьютерная система анализа культуральной жидкости на содержание продуктов биосинтеза и редуцирующих веществ // VIII Всероссийская выставка научно-технического творчества молодёжи. Официальный каталог. Москва, ВВЦ, 2008 - с. 127.

9. Парамонов Е.А., Толчёнов A.A., Зубов Д.В. Усовершенствование метода тонкослойной хроматографии // Актуальные проблемы естественных наук: материалы всероссийской заочной н.-практической конференции

- Тамбов: Издательский дом ТГУ им. Г.Р. Державина, 2009 - с. 59-64.

10. Парамонов Е.А., Шотин А.Б. Адаптивное управление процессом биосинтеза лизина. Научная конференция студентов и молодых учёных МГУИЭ: Тезисы докладов. - М.: МГУИЭ, 2009 - с. 120-124.

Подписано в печать 20.05.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

ООО «КопиМастерЦентр» 109147, Москва, ул. Воронцовская, д. 35А Тел.: 956-62-63 www.copycenter.ru

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Особенности биотехнологического процесса как объекта оптимизации.

1.2 Математическое моделирование микробиологических процессов.

1.3 Оптимизация продолжительности цикла периодического процесса биосинтеза.

1.4 Оптимальное управление процессами биосинтеза на основе математических моделей.

1.5 Химический анализ как информационный процесс.

1.6 Использование тонкослойной хроматографии.

1.7 Постановка задач диссертационной работы.

ГЛАВА 2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ. ПРИМЕРЫ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО МЕТОДОВ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ.

2.1 Использование метода ТСХ для анализа.

2.2 Применяемое оборудование и материалы в исследовании.

2.3 Проведение анализа методом тонкослойной хроматографии.

2.3.1 Нанесение пробы и получение хроматограмм.

2.3.2. Обзор методов детектирования в тонкослойной хроматографии.

2.3.2.1 Электрохимические методы.

2.3.2.2 Ядерно-физические методы.

2.3.2.3. Оптические методы.

2.4 Количественный анализ антибиотиков (эритромицинов) методом ТСХ.

2.5 Количественный анализ пищевых красителей методом ТСХ.

2.6 Выводы.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТАННАЯ МЕТОДИКА ДЕТЕКТИРОВАНИЯ.

3.1 Получение модели.

3.2 Программно-технический комплекс, реализующий разработанную методику.

3.2.1 Выбор цветовой составляющей.

3.2.2 Созданное программное обеспечение «Chromatography».

3.3 Выводы.

ГЛАВА 4. ОБОСНОВАНИЕ ПРЕДЛОЖЕННОЙ МЕТОДИКИ. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ.

4.1 Обоснование предлагаемой методики.

4.2 Результат применения методики М9 для антибиотиков.

4.3 Результат применения методики М9 для аминокислот.

4.4 Результат применения методики М9 для Сахаров.

4.4.1 Глюкоза.

4.4.3 Мальтоза.

4.5 Выводы.

ГЛАВА 5. АДАПТИВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ПРОЦЕССОМ БИОСИНТЕЗА ЛИЗИНА.

5.1 Стадии процесса биосинтеза лизина.

5.2 Автоматизация процесса биосинтеза.

5.3 Технические решения, принятые при построении АСУТП биотехнологическим производством лизина.

5.4 Оптимизация стадии окончания процесса биосинтеза.

5.5 Выводы.

Получение таких продуктов, как антибиотики, ферменты, аминокислоты, кормовые белки, с использованием микробиологического синтеза широко применяется в современном производстве. Интеграция естественных и инженерных наук позволяет наиболее полно реализовать возможности живых организмов. Технология производства этих веществ хорошо отработана, получение их микробиологическим путём не только экономически выгодно, но и более безопасно, нежели с использованием химического синтеза.

Биотехнологические производства бурно развивались в СССР до середины 80-х годов, микробиологический синтез имел широкое распространение. После распада Советского Союза данная отрасль промышленности пришла в полный упадок. Только в конце 90-х годов начало возобновляться данное производство, ввиду возросшего интереса к различного вида белкам, аминокислотам и ферментам.

Среди комплекса основных задач, решаемых на биотехнологических производствах для обеспечения их эффективной и бесперебойной работы, особое место занимают задачи автоматизации как производства в целом, так и отдельных его участков. Основным образующим и энергоемким является отдел ферментации, состоящий из батареи аппаратов называемых биореакторами.

Назначением всякого биореактора (рис. 1.1) является создание оптимальных условий для жизнедеятельности культивируемых в нём клеток и микроорганизмов, а именно обеспечение аэрации, подвод питания и отвод метаболитов путём равномерного перемешивания газовой и жидкой-составляющих содержимого аппарата. Такие показатели как, рН, давление, концентрация растворенного кислорода рОг, температура являются косвенными показателями процесса биологического синтеза. Основным прямым параметром, объективно характеризующим ход процесса биосинтеза, является концентрация целевого вещества в культуральной жидкости. Своевременная корректировка процесса с учётом оперативно получаемой информации об основных показателях состояния процесса позволит достичь оптимального соотношения между себестоимостью и качеством готовой продукции, решить чрезвычайно важную задачу экономии энергоресурсов за счет оптимизации всех стадий процесса. Обеспечить высокую скорость анализа продуктов биологического синтеза с необходимой точностью позволяет метод тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Рис. 1.1. Схема биореакгора 1. Емкость; 2. Контур нагрева; 3. Механическая мешалка; 4. Подача воздуха; 5. Аэрация; 6. Порты; 7. Смотровые окна; 8. Выход воздуха; 9. Засев; 10. Отбор образцов; 11. Слив;

12. Залив среды

Метод ТСХ позволяет разделять до нескольких десятков компонентов и поэтому находит широкое применение для анализа состава продуктов микробиологического синтеза, которые представляют собой сложную смесь близко родственных по своей структуре веществ.

Важным достоинством ТСХ по сравнению со значительно более дорогостоящей колоночной хроматографией является возможность анализа загрязненных проб и, таким образом, резкое упрощение пробоподготовки при анализе реальных, в первую очередь природных, объектов [1].

Одним из основных способов детектирования в ТСХ, наряду с традиционными фотометрическим (в отраженном или проходящем свете) и флуориметрическим методами, возрастающую роль начинают играть масс-спектрометрические методы детектирования — главным образом с лазерной десорбцией-ионизацией. Для фотометрического детектирования все больше используется сканирующая лазерная денситометрия, в том числе с применением оптоволоконной техники.

Не менее важной задачей является подбор среды и сравнение эффективности различных штаммов на них. Для анализа полученных культуральных жидкостей также используется метод тонкослойной хроматографии.

Таким образом, для оптимального управления процессом биосинтеза в промышленных ферментёрах и проведения экспериментов на исследовательских установках необходимо иметь метод анализа культуральной жидкости на такие антибиотики, как эритромицины, низин; аминокислоты - лизин, лейцин, триптофан, серин; сахара - глюкоза, мальтоза, лактоза, обладающий следующими характеристиками: время анализа не должно превышать 1 час; одновременный анализ нескольких проб; не должно сказываться влияние примесей; способность определять наличие вещества в малых количествах, порядка 100 нг; погрешность анализа не должна превышать 5 %; низкая стоимость проведения анализа; простота проведения анализа.

Метод ТСХ вполне удовлетворяет всем заявленным требованиям, кроме точности анализа - в настоящее время методы детектирования обладают существенной погрешностью, что приводит к использованию ТСХ для полуколичественного или качественного анализа.

В соответствии с вышеизложенным и учитывая, что концентрация целевого вещества в культуральной жидкости является основным прямым параметром, одной из основных задач работы является усовершенствование методики экспресс-анализа в процессах биосинтеза методом тонкослойной хроматографии и её внедрение в структуру АСУТП сложным биотехнологическим производством на базе современной вычислительной техники.

В данной работе будет рассмотренно применение усовершествованного метода детектирования анализа при помощи тонкослойной хроматографии для управления процессом биосинтеза аминокислот на примере L-лизина. Аминокислоты — это любые органические кислоты, в состав молекулы которых входит аминогруппа, хотя чаще всего под этим названием подразумевают а-аминокислоты вследствие их исключительного значения как составляющей части биополимеров — белков. Незаменимыми называются а-аминокислоты, которые не могут быть синтезированы организмом из веществ, поступающих с пищей в количествах, необходимых для поддержания жизнедеятельности. К незаменимым для человека аминокислотам относятся лейцин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин.

По химическим свойствам лизин - а-аминокислота с сильными основными свойствами, обусловленными е-аминогруппой. С кислотами дает два ряда солей, например с соляной кислотой — гидрохлорид и дигидрохлорид. Образует нерастворимые соли с пикриновой и фосфорномолибденовой кислотами. н н 0 L-лизин {рас. 1.2) - необходимый компонент пищи для

S I l/N~~<f—человека и животных (незаменимая аминокислота), н сн он

Г 2 сн 2

Встречается во всех организмах в составе молекул белков и сн2 пептидов, входит в состав активных центров ферментов,

С* н

I 2 например аминотрансфераз в больших количествах nh2 содержится в гистонах и протаминах. Его содержание в

Рис. 1,2.

Структурная продуктах (на сухую массу) составляет: в пшеничной муке формула 1,9%, говядине 10%, коровьем молоке 8,7%. Биосинтез лизина:

L-лизина из аспарагиновой и пировиноградной кислот через 2,6-диаминопимелиновую кислоту (декарбосилирование которой приводит к L-лизину) или из а-аминоадипиновой кислоты; последняя образуется также при распаде L-лизина в организме.

Получают L-лизин микробиологически или из гидролизатов белков путем осаждения в виде пикрата. Синтетически лизин получают аминированием а-галогенкапролактама. В спектре ПМР L-лизин в D20 химические сдвиги (в м.д.) 3,762 (а-Н), 1,91 (Р-Н), 1,393 (у-Н), 1,732 (8-Н), 2,649 (е-Н). Лизин применяют как кормовую добавку для восполнения дефицита этой аминокислоты в растительных белках; используют также в синтезе пептидов, в смеси с другими аминокислотами — для составления питательных сред.

Несмотря на большую историю промышленного биосинтеза лизина, предлагаются новые технологические способы улучшения технологии синтеза, выделения и очистки лизина. Например, в работе [21] разработан метод получения L-лизина гидрохлорида, пригодного для использования в качестве пищевой добавки, а также способ электродиализной конверсии гидрохлорида лизина в лизин основной. Приведены испытания, по добавлению лизина гидрохлорида в муку и хлеб при выпечке, которые показали повышение биологической ценности муки и хлеба. Для оптимизации разработанных мембранно-сорбционных технологий очистки и концентрирования аминокислот на основе теоретических и экспериментальных разработок получены сведения о механизмах процессов, происходящих в электромембранных системах, включающих в себя растворы аминокислот. Разработаны новые методики и построены адекватные математические модели.

Использование широко распространенной компьютерной техники позволяет существенно улучшить традиционные методы химического анализа, повысить его точность и оперативность. Используя более точные данные о ходе процесса возможно его моделировать и рассчитывать оптимальные расходы подпиток и время их внесения, время передачи ферментационной среды на стадию выделения, что позволит уменьшить расходы на исходные субстанции, снизить нагрузку на системы нано- и ультрафильтрации, уменьшить расход воды и реагентов на их чистку и регенерацию.

5.5 Выводы

Стадия ферментации, будучи самой энергозатратной, является определяющей для всего производства вцелом - от производительности каждого из аппаратов зависят экономические показатели производства вцелом, поэтому, оптимизируя процесс биосинтеза на каждой из стадий процесса, можно добиться существенных результатов. Обеспечить достижение требуемых показателей эффективности возможно лишь с применением адаптивных систем управления. Проведённые исследования показали, что последняя стадия - стадия окончания процесса - до настоящего времени не подвергалась оптимизации. Прогнозирование времени окончания сводится к определению времени снижения концентрации углеводов (сахаров) до пороговой величины. Таким образом, получение достоверной информации о составе культуральной жидкости позволяет спрогнозировать оптимальное время окончания процесса. Применение созданной методики экспресс-анализа состава и разработанный на её базе алгоритм работы адаптивной системы управления позволят вносить своевременные корректировки в процесс управления биосинтезом.

Заключение

1. Разработана экспериментально-аналитическая модель окрашенности зоны диффузии от количества, содержащегося в ней, вещества.

2. Создана методика определения концентрации продуктов биосинтеза и редуцирующих веществ в культуральной жидкости.

3. Разработанная методика апробирована и подтверждена экспериментально на ряде веществ - аминокислот, антибиотиков и Сахаров.

4. Создан программно-технический комплекс реализующий методику и необходимые для её работы алгоритмы.

5. Созданная методика внедрена в работу научно-исследовательской лаборатории Института промышленной биотехнологии МГУИЭ, включена в производственный регламент завода по производству L-лизина в республике Чувашии.

6. Разработана автоматизированная система определения оптимального момента завершения процесса биосинтеза лизина.

1. Автоматическое управление в химической промышленности: Учебник для вузов. Под редакцией Е.Г. Дудникова-М.: Химия, 1987.

2. Автоматизация биотехнологических процессов: Автоматический контроль, оптимизация и управление / Ю.-К. Ю. Станишкис, Д.Я. Левишаускас, Р.И. Симутис, У.Э. Виестур, М.Ж. Кристапсонс; под ред. У.Э. Виестура. Рига: Зинатне, 1992.

3. Агупова М.В., Бобрешова О.В., Бобринская Г.А., Якунина Т.В. Определение лизина после разделения смешанных растворов лизина и глицина с использованием катионита КУ-2-8 // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т.8. Вып. 6

4. Алесковский В.Б., Бардин В.В., Булатов М.И. Физико-химические методы анализа. Практическое руководство. Л.: Химия, 1988. -376с.

5. Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Многоканальный биосенсор для определения содержания глюкозы, метанола и этанола при их совместном присутствии // Биотехнология, 2008, N5, с. 84-91.

6. Амелькин А.А. Разработка систем автоматического управления процессами культивирования микроорганизмов // Дисс. на соиск. канд. техн. наук — М.: Московский технологический институт пищевой промышленности -1986.

7. Андреева Л.Н. Разработка, исследование и применение кинетических моделей для управления процессами биосинтеза по величине рН. // Дисс. на . канд. техн. наук, ЛХФИ, 1972.

8. Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. -М.: Пищевая промышленность, 1978, 232 с.

9. Ю.Беллман Р. Математические методы в медицине: пер. с англ. — М.: Мир, 1987. -200с.

10. Берёзкин В.Г. Что такое хроматография? -М.: Наука, 2003. —76 с.

11. Берёзкин В.Г., Бочкова А.С., Количественная тонкослойная хроматография, М: Наука, 1980, 183 с.

12. Березкин В.Г., Кормишкина Е.В. Вариант традиционной тонкослойной хроматографии контактно закрытым сорбционным слоем ("бескамерная" ТСХ) // Журнал аналитической химии Том 61, N10, 2006, с. 1074.

13. Биосенсоры: основы и приложения, Ред. Э. Тернер, И. Карубе, Дж. Уилсон. Ред. -М.: Мир, 1992.

14. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.-М.: Наука— 1985.

15. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. Учеб пособие для вузов. -М.: Колосс, 2004. 296 с.

16. Бирюков В.В., Шнайдер JI.E. Управляемые периодические процессы микробиологического синтеза. Обзорная информация. Серия XI. Процессы и аппараты микробиологических производств. -М.: ВНИИСЭНТИ, 1986, 52с.

17. Булдакова Т.И., Коблов А.В., Суятинов С.И. Информационно-измерительный комплекс совместной регистрации и обработки биосигналов // Приборы и системы. Управление, контроль, диагностика, 2008 N6.

18. Блохина И.Н., Угодчиков Г.А. Исследование динамики микробных популяций (системный подход). -Горький: Волго-Вятское книжное изд-во, 1980.

19. Блохина И.Н., Огарков В.И., Угодчиков Г.А. Управление процессами культивирования микроорганизмов. Горький, Волго - Вятское книжное изд., 1983. - 163 с.

20. Быков В.А., Манаков М.Н., Панфилов В.И., Свитцов А.А. Тарасова Н.В. Производство белковых веществ // Под ред. Н.С. Егорова. -М.: Высшая школа, 1987.

21. Васильев Н.Н., Амбросов В.А., Складнев А.А. Моделирование процессов микробиологического синтеза. —М.: Лесная промышленность, 1975.

22. Васильев В.П. Аналитическая химия. В 2 кн. Кн. 2: Физико-химические методы анализа. -6-е изд., стеретип. -М.: Дрофа, 2007. -383с.

23. Валуев В.И., Музыченко JI.A., Кантере В.М., Гуркин В.А., Математическое моделирование микробиологических процессов, 1973, 198 с.

24. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические модели микробиологических процессов. -М.: Высшая школа, 1990, 296 с.

25. Винаров А.Ю., Кухаренко А.А., Панфилов В.И. Лабораторные и промышленные ферментёры. -М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2004 -97 с.

26. Воейкова Т.А., Тяглов Б.В., Антонова С.В., Барсуков Е.Д., Сизова И.А., Малахова И.И., Красиков В.Д. Анализ макролидных, тетрациклиновых и пептидных антибиотиков методом тонкослойной хроматографии // Биотехнология, 2008 N2 с. 10.

27. Гармаш А.В., Сорокина Н.М. Метрологические основы аналитической химии. Издание 2-е, исправленное и дополненное. -М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, 2005. -42с.

28. Гаррисон Дж. Практическая спектроскопия -М.: 1950, 645 стр.

29. Гартман Т.Н., Клушин Д.В. Основы компьютерного моделирования химико-технологических процессов. М.: ИКЦ «Академкнига»,2006. — 416 с.

30. Герасимов А.В. Применение программной обработки сканированных изображений хроматограмм в количественной планарной хроматографии //Аналитическая химия, 2004г., том 59, № 4, с. 392-397.

31. Герасимов А.В. Применение цветной компьютерной обработки хроматограмм при ТСХ-анализе татразина // Журнал аналитической химии, 2003, том 58, №3, с. 241-243.

32. Герасимов А.В. Качественная и количественная интерпретация тонкослойных хроматограмм синтетических пищевых красителей в условиях неполного разделения // Журнал аналитической химии, 2000, том 55, Ш2, с. 1292.

33. Герасимов А.В. Применение программной обработки сканированных изображений хроматограмм в количественной планарной хроматографии //Аналитическая химия, 2004г., том 59, № 4, с. 392-397

34. Гейсс Ф., Основы тонкослойной хроматографии, —М.: 1999, т.1, 403 с, т.2, 348 с.

35. Голубков А.С. Разработка состава и исследование свойств эмульсий для извлечения лизина из водных растворов //Дисс. на соиск. канд. техн. наук М.: МХТИ им. Д.И. Менделеева - 1988.

36. Гордеева Ю.Л., Винаров А.Ю., Ивашкин Ю.А. Численное моделирование статики непрерывного ферментативного процесса в аппарате с перемешиванием. // ММТТ 21: сб. тр. -Саратов: СГТУ, 2008, т. 6, с.с. 109-110

37. Гордеева Ю.Л., Винаров А.Ю., Ивашкин Ю.А. Динамические характеристики непрерывного ферментативного процесса в аппарате с перемешиванием. // ММТТ 21: сб. тр. -Саратов: СГТУ, 2008, т. 6, с. 110-112

38. Гуревич М.М. Цвет и его измерение. -Д.: Изд-во Академии Наук СССР, 1950. -268 с.

39. Джексон Р.Г. Новейшие датчики -М.: Техносфера, 2007. -384 с.

40. Дудников Е.Г., Балакирев В.С, Кривсунов В.Н., Цирлин A.M., Построение математических моделей химико-технологических процессов, -М.: Химия, 1970.

41. Егорова Т.А. Основы биотехнологии. Учеб. пособие для вузов. М.: Академия, 2005. - 208 с.

42. Казаков А.В. Автоматизированное оптимальное управление периодическими процессами ферментации (на примере производства лизина) // Дисс. на соиск. д-ра техн. наук. -М.: Московский государственный технологический институт пищевой промышленности, 1992.

43. Казаков А.В., Тартаковский Б.А. Методика оптимизации процессов микробного синтеза // Биотехнология, N6, 1991, с. 86.

44. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. М.: Агропромиздат, 1990. - 272 с.

45. Кафаров В.В., Перов B.JL, Мешалкин В.П. Принципы математического моделирования химико-технологических систем. -М.: Химия, 1974. -344 с.

46. Клевлеев В.М. Статистические методы контроля и управления качеством. -М.: МГУИЭ, 2008. -538 с.

47. Клыков С.П., Дербышев В.В. Зависимость возрастной структуры популяции клеток, потребления субстрата и синтеза продуктов от энергетических затрат // Биотехнология, 2009, N5, с. 80-89.

48. Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов B.C. Физическая химия. -М.: Высш. шк., 1990. -416с.

49. Колпиков Ю.Г., Мунгиев А.А., Бабаянц А.В. и др. Математическое моделирование сложных химико-технологических систем, кн. 2. Тезисы докладов. Новомосковск, 1979, с.202-203.

50. Координационная химия природных аминокислот// С. Н. Болотин и др. Кубанский государственный университет. -М.: URSS, 2007. 238 с.

51. Кузнецов А.Е. Регулирующее воздействие экзогенных метаболитов и ритмов естественного происхождения на рост и продуктивность промышленных микроорганизмов // Дисс. на соиск. канд. техн. наук -М.: МХТИ им. Д.И. Менделеева 1988.