автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Хроматографические методы идентификации и анализа аминированных метаболитов в микробиологических процессах

□03167 1ЬЬ>

На правах рукописи

НОВИКОВА АННА ЕВГЕНЬЕВНА

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И АНАЛИЗА АМИНИРОВАННЫХ МЕТАБОЛИТОВ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОЦЕССАХ

Специальность 05 11 11 - хроматография и хроматографические приборы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2008

003167166

Работа выполнена в Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук и в лаборатории № 5 Закрытого акционерного общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель: доктор химических наук

Буряк Алексей Константинович

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Ларин Александр Васильевич

ИФХЭ РАН

кандидат химических наук Назимов Игорь Владимирович ИБХРАН

Ведущая организация:

Химический факультет МГУ им. М.Й. Ломоносова

Защита состоится « 19 » февраля 2008 года в 14 час 00 мин

на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002 259 04 при Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук по адресу. 119991, г Москва, Ленинский пр-т, д. 3корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук.

Автореферат размещен на сайте Института' http:7phyche.ac ги

Отзывы на автореферат (заверенные печатью) просим выслать по адресу 119991, г. Москва, Ленинский пр-т, д 31, корп. 4, ИФХЭ РАН ученому секретарю Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д002.2'59-.04

Автореферат разослан « // » января 2008 года.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

кандидат химических наук

Л.Н. Коломиец

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Биотехнологический процесс является основным способом получения многих биологически активных веществ, химический синтез которых сложен или экономически невыгоден В частности, микробиологический способ получения аминокислот, которые играют большую роль в здравоохранении, животноводстве и пищевой промышленности, отличается существенными преимуществами, так как позволяет синтезировать аминокислоты Ь-формы из относительно дешевых источников углерода Аминокислоты секретируются в среду штаммами-продуцентами, способными к эффективному биосинтезу основного продукта в результате генетического конструирования В процессе микробиологического синтеза целевой аминокислоты могут накапливаться сопутствующие аминированные метаболиты, образующиеся как в процессе биосинтеза, так и при деградации основного продукта. Поэтому, на всех этапах биотехнологического процесса необходим аналитический контроль этих соединений

В процессе разработки и оптимизации биотехнологического процесса необходимо контролировать не только количество целевого компонента и его известных метаболитов, но и отслеживать появление новых, не всегда предсказуемых примесей Кроме того, аналитический контроль необходим и в процессе генетического конструирования штаммов-продуцентов для получения информации об изменении активностей ферментов, участвующих в биосинтезе целевого продукта

Биотехнологические образцы, в частности культуральные жидкости (КЖ) штаммов-продуцентов, являются сложными смесями, содержащими компоненты исходной питательной среды, клетки микроорганизмов, продукты биосинтеза Поэтому, при работе с реальными биологическими образцами целесообразно использовать комплексный подход, сочетающий высокоэффективные методы разделения, идентификации и количественного анализа соединений

Используя метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), можно провести идентификацию соединений только по времени удерживания, что может быть недостаточным в случае неразделенных хроматографических

пиков Дополнительную информацию могут дать спектры поглощения и флуоресценции, и, безусловно, надежность идентификации повышается при использовании масс-спектрометра (МС) Однако, для анализа с использованием масс-спектрометрического детектора существует ряд ограничений по составу подвижной фазы Традиционно используемые в ВЭЖХ подвижные фазы, содержащие фосфатные буферы, растворы солей высокой концентрации (50 -100 мМ) не рекомендуется использовать при работе с МС, так как это может быть причиной подавления ионизации аналитов При этом условия хроматографирования должны обеспечивать полное разделение соединений, имеющих одинаковую молекулярную массу, и, вместе с тем, быть совместимыми с МС

Таким образом, актуальной является разработка комплекса высокоэффективных аналитических методов, необходимых на этапе генетического конструирования штаммов-продуцентов, а также при оптимизации условий биосинтеза целевого продукта

Цель и задачи исследований: Целью диссертационной работы являлась разработка комплекса инструментальных методов идентификации аминосоединений с использованием ВЭЖХ, ВЭЖХ/МС и высокоэффективного капиллярного электрофореза (КЭ) для исследований биотехнологических образцов, таких как КЖ бактериальных штаммов и реакционные смеси изучаемых ферментных препаратов

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- изучить влияние состава подвижной фазы на разделение N-[(6-хинолиниламино)карбонил]-производных (ХАК) аминокислот и полиаминов в условиях обращенно-фазового режима ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ),

- исследовать влияние параметров источника ионизации на интенсивность и соотношение сигналов ионов в масс-спектре ХАК-производных аминокислот и полиаминов,

- на основе проведенных исследований выбрать оптимальные условия хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования ХАК-производных биогенных полиаминов и аминокислот, в том числе структурных изомеров,

- с помощью метода КЭ исследовать влияние состава компонентов буфера на разделение анионов дикарбоновых и М-замещенных аминокислот и выбрать условия для определения этих соединений Научная новизна:

1 Исследовано влияние рН и концентрации буферного раствора на удерживание ХАК-производных аминокислот и полиаминов в зависимости от структуры соединений при разделении их в режиме ОФ-ВЭЖХ

2 Показано влияние параметров источника ионизации напряжения на капилляре, напряжения на конусе, напряжения на экстракторе - на интенсивность и соотношение сигналов наблюдаемых ионов в масс-спектрах ХАК-производных аминокислот и полиаминов

3 В КЖ исследуемых штаммов, продуцирующих аминокислоты, впервые идентифицированы примеси гомоизолейцина и димера валина в виде ХАК-производных с помощью ВЭЖХ/МС

4 Предложены условия анализа для определения с помощью метода КЭ продуктов ферментативных реакций, катализируемых путресцинтранс-аминазой, М-ацетилглутаматсинтазой, глутамат-]Ч-ацетилтрансферазой, аргининосукцинатсинтетазой, карбамоилфосфатсинтетазой, гомосеринкиназой Практическая значимость работы: Разработанные ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС методы были использованы для идентификации и анализа аминосоединений, в том числе непротеиногенных аминокислот, и полиаминов в КЖ различных штаммов-продуцентов Полученные сведения о накоплении сопутствующих аминированных метаболитов способствуют пониманию путей биосинтеза этих соединений в генетически модифицированных микроорганизмах и позволяют снизить уровень накопления этих примесей На основе полученных данных о накоплении полиаминов могут быть сделаны выводы об активации путей деградации соответствующих аминокислот, в том числе основного продукта, что позволяет оптимизировать процесс ферментации или селекции соответствующих штаммов-продуцентов

Особое значение методы разделения имеют при подтверждении новых способов получения биологически активных соединений Так, при использовании предложенных методов ВЭЖХ/МС и ВЭЖХ была подтверждена возможность получения 4-гидроксиизолейцина с помощью ферментативного

синтеза, а также у-аминомасляной кислоты (ГАМК), норвалина и/или норлейцина с помощью бактериальных штаммов, способных к сверхсинтезу этих соединений Способы получения данных аминокислот защищены патентами РФ (патент № 2241036 и патентные заявки № 2004127011, № 2005127811) и могут стать основой их микробиологического производства

Метод КЭ был использован для экспресс-анализа продуктов ферментативных реакций в реакционных смесях, что позволило получить информацию об изменении активностей ферментов в процессе селекции штаммов-продуцентов Результаты вошли в патент РФ № 2264459 На защиту выносятся следующие положения: í

1 Качественные закономерности влияния рН, концентраций ацетонитрила и буферного раствора на удерживание ХАК-производных аминокислот и полиаминов при разделении их в режиме ОФ-ВЭЖХ

2 Результаты исследования закономерностей удерживания ХАК-производных аминокислот и полиаминов при разделении их на сорбентах разного типа с привитыми алкильными группами

3 Результаты исследования влияния параметров источника ионизации МС на фрагментацию ХАК-производных аминокислот и полиаминов

4 Результаты исследования влияния состава, концентрации и рН буферного электролита на время миграции анионов дикарбоновых и N-замещенных аминокислот при разделении с помощью метода КЭ

5 Результаты идентификации и количественного определения примесей аминокислот и полиаминов в КЖ штаммов-продуцентов Результаты анализа продуктов семи ферментативных реакций при исследовании активностей ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва, 2006), III международной конференции-школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, 2007), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (Москва - Клязьма, 2007), научно-прикладном семинаре «Аналитические методы и приборы для

химического анализа» (Санкт-Петербург, 2007), II Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007)

Публикации. По результатам исследования опубликовано 7 статей, 7 тезисов, 2 патента, поданы 2 заявки на патент (имеются положительные решения) Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы и приложений Материал изложен на 210 страницах машинописного текста, включает 95 рисунков и 28 таблиц Библиография состоит из 198 источников

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дано обоснование темы, отражены актуальность исследований и практическая значимость

1 глава. Обзор литературы

Проведен анализ работ, посвященных исследованиям аминокислот и биогенных аминов методами ВЭЖХ, ВЭЖХ/МС, КЭ Рассмотрены методы получения производных разного типа Проведен сравнительный анализ различных хроматографических методов разделения аминокислот Анализ литературы позволил обосновать целесообразность использования комплекса высокоэффективных методов разделения для идентификации и анализа аминосоединений в биологических образцах На основе анализа литературных данных выбрано основное направление исследований использование ХАК-производных для идентификации и анализа аминосоединений в биотехнологических образцах методом ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС, использование КЭ для анализа продуктов ферментативных реакций в реакционных смесях

2 глава. Экспериментальная часть

В работе были использованы жидкостные хроматографы Agilent 1100 Senes (Agilent Technologies, США) с градиентным насосом Quaternary Pump 1100, автоматическим инжектором Autosampier 1100, воздушным термостатом Column compartment 1100, флуориметрическим детектором Spectrofluorimeter 1100 с программным обеспечением для обработки хроматографических данных

ChemStation A 08 04 (Agilent Technologies, США); Alliance 2695 (Waters, США), оснащенный масс-спектрометрическим детектором Quattro-Micro (Waters-Micromass, США) с ионизацией при атмосферном давлении в режиме электроспрея (API-ES) и программным обеспечением для обработки хроматографических данных Masslynx 4 0 (Waters-Micromass, США)

Хроматографическое разделение проводили на стальных колонках Nova-Pak С]8 150 х 3 9 мм, 4 мкм (Waters, США), Synergi Hydro-RP 250 х 4 6 мм, 4 мкм (Phenomenex, США), Synergi MAX-RP 250 х 4 6 мм, 150 х 4 6 мм и 150 х 2 мм, 4 мкм (Phenomenex, США), LUNA С 18(2) 150 х 46 мм и 150 х 2 мм, 3 мкм (Phenomenex, США), AQUA Cl8 150 х 4 6 мм, 3 мкм (Phenomenex, США), Zorbax Eclipse XDB-C18 50 х 2 1 мм, 5 мкм (Agilent Technology, США) Условия хроматографирования приведены в таблице 1

Таблица 1. Условия хроматографического разделения.

Градиент № Условия

1 100 % буферный раствор - 0 % ацетонитрил, через 0 5 мин 95 % буферный раствор - 5 % ацетонитрил, затем линейное уветичение ацетонитрила до 30 % за 59 мин, затем промывка колонки раствором 60 % ацетонитрил -40 % вода и уравновешивание на начальных условиях Скорость подвижной фазы 0 4 мл/мин

2 100 % буферный раствор - 0 % ацетонитрил, через 0 2 мин 95 % буферный раствор - 5 % ацетонитрил, затем линейное увеличение ацетонитрила до 30 % за 29 мин, затем промывка колонки раствором 60 % ацетонитрил -40 % вода и уравновешивание на начальных условиях Скорость подвижной фазы 0 8 мл/мин

3 82 % буферный раствор - 18 % ацетонитрил в течение 30 мин, затем промывка колонки раствором 60 % ацетонитрил - 40 % вода и уравновешивание на начальных условиях Скорость подвижной фазы 0 2 мл/мин

4 92 % буферный раствор - 8 % ацетонитрил, линейное увеличение ацетонитрила до 23 % за 35 мин, затем промывка колонки раствором 60 % ацетонитрил - 40 % вода и уравновешивание на начальных условиях Скорость подвижной фазы 0 3 мл/мин

5 77 % буферный раствор - 23 % ацетонитрил, затем линейное увеличение ацетонитрила до 40 % за 30 мин, затем промывка колонки раствором 40 % ацетонитрил - 10 % вода - 50 % буферный раствор Скорость подвижной фазы 0 4 мл/мин

В работе использована установка капиллярного электрофореза Quanta 4000 (Waters, США) снабженная ультрафиолетовым детектором с фиксированной длинной волны 254 нм и программным обеспечением для обработки хроматографических данных Мультихром 2 0 для Windows (Амперсенд,

Россия) Разделение проводили в кварцевом капилляре с внутренним диаметром 75 мкм (Waters, США) Общая длина капилляра - 60 см, эффективная длина (до детектора) - 53 см Использовали воздушное термостатирование капилляра и гидростатический ввод образцов

Кислотность водных растворов контролировали с помощью рН-метра MP 225 (Mettler Toledo, Швейцария) В работе использовали центрифугу 5415D (Eppendorf, Германия) и ультразвуковую баню 2510E-DTH (Bransonic, США)

Для получения производных аминокислот и полиаминов реагент 1-[[(6-хинолиниламино)карбонил]окси]-2,5-пирролидиндион готовили по стандартной методике растворением точной навески в ацетонитириле (3 мг/мл) ХАК-производные (рис 1) готовили непосредственно перед проведением эксперимента по следующей методике аликвоту модельной смеси или образца смешивали с раствором боратного буфера с pH 8 0 и добавляли раствор реагента (1 5 4). Реакцию проводили при температуре 55°С в течение 10 мин

В качестве стандартных соединений были взяты аминокислоты (Sigma, США), биогенные полиамины (Aldnch, США) Растворы аминокислот и полиаминов готовили растворением соответствующего реактива в деионизованной воде и хранили при температуре -20°С Растворы элюентов готовили непосредственно перед экспериментом

Рис. 1. Реакции, сопровождающие получение флуоресцирующих производных аминокислот по методу Accq-Tag а) реакция образования производных первичных и вторичных аминов и аминокислот, б) реакция гидролиза избытка 1-[[(6-хинолиниламино)карбонил]окси]-2,5-пирролидиндаона

3 глава. Результаты и обсуждение.

Исследование влияния условий хроматографического разделения на удерживание ХАК-производных.

Известно, что разделение аминокислот и биогенных аминов, как правило, осуществляют с использованием процедуры получения производных,

9

характеризующихся большим удерживанием на обращенной фазе и содержащих группы, флуоресцирующие или поглощающие в ультрафиолетовой области спектра Поэтому для работы нами был выбран метод, основанный на получении устойчивых ХАК-производных аминов и аминокислот с последующим разделением в режиме ОФ-ВЭЖХ Для работы в качестве сорбентов были выбраны Synergi Hydro-RP, MAX-RP, LUNA С 18(2), AQUA C18, Zorbax Eclipse XDB-C18 В качестве подвижной фазы использовали элюенты, содержащие совместимые с MC компоненты ацетонитрил и ацетат аммония

В результате исследования влияния органического модификатора на удерживание аналитов с использованием уравнения Скотта - Кучеры показано, что для ХАК-производных аминокислот характерно образование ассоциатов с ацетонитрилом Из рассчитанных значений logP с помощью некоммерческой версии программы ACD/labs получено, что ХАК-производные аминокислот -вещества с резко различающейся полярностью Поэтому, для работы с этими соединениями целесообразно использовать градиентное элюирование

В результате сравнения колонок Synergi Hydro-RP, MAX-RP, LUNA CI 8(2) и AQUA С18 получено, что в условиях нейтрального pH усиление удерживания ХАК-производных основных соединений наблюдается на сорбентах AQUA С18 и MAX-RP При сопоставлении в изократических условиях разрешающей способности исследуемых колонок согласно полученным расчетным данным основных хроматографических параметров (фактор удерживания, число теоретических тарелок, разрешение пиков) показано, что наибольшей эффективностью обладает колонка LUNA С 18(2), которая была в дальнейшем использована для разделения ХАК-производных диастереомеров

При исследовании зависимости удерживания ХАК-производных аминокислот и полиаминов от pH применяли градиентное элюирование В результате проведенных исследований отмечены следующие закономерности - с увеличением pH с 3 5 до 7, увеличивалось время удерживания ХАК-производных аминокислот, содержащих основные функциональные группы, что, предположительно, связано с переходом производных этих соединений из катионной в цвиттер-ионную форму, а для лизина и орнитина - из катионной в анионную форму через цвиттер-ион,

- аналогичная зависимость наблюдалась для 6-аминохинолина, N-(6-хинолинил)-мочевины, а также для производных спермидина и путресцина, что, в свою очередь, связано с переходом этих соединений из катионной формы в нейтральную,

- для ХАК-производных дикарбоновых аминокислот и большей части аминокислот с неполярными заместителями наблюдалась обратная зависимость в том же диапазоне рН, что, вероятно, связано с переходом производных этих соединений из цвиттер-ионной формы в анионную,

- зависимость удерживания производного ГАМК от рН раствора имеет резко выраженный максимум Предположительно, это связано с узкой зоной рН, при которой ГАМК существует в виде цвиттер-иона, что отличает эту аминокислоту от других исследованных соединений

Для разделения ХАК-производных аминокислот и полиаминов предложено использовать буферный раствор с рН 6 8

При исследовании влияния концентрации ацетата аммония в диапазоне 1 -10 мМ (рН 6 8) показано, что для тех ХАК-производных аминокислот, которые находятся в виде ионов, удерживание увеличивается с увеличением концентрации соли, что объясняется эффектом «высаливания» В тоже время изменение концентрации буферного раствора не влияет на соединения в нейтральной форме, такие как 6-аминохинолин, М-(6-хинолинил)-мочевина, производные спермидина и путресцина Иным образом ведет себя агматан Для производного этого соединения наблюдается эффект «всаливания», что проявляется в уменьшении удерживания

В результате проведенных исследований было также установлено, что ХАК-производные аминокислот подчиняются общим закономерностям удерживания в условиях ОФ-ВЭЖХ

- время удерживания возрастает внутри гомологических рядов ХАК-производных с ростом числа атомов углерода в молекуле Для высших членов гомологического ряда значения относительного изменения свободной энергии аддитивны по группам -СН2-, при этом вклад одной метальной группы составляет 2 3 кДж/моль,

- для структурных изомеров при переходе от разветвленной к линейной конфигурации углеродной цепи удерживание увеличивается,

- при введении в молекулу полярных функциональных групп (-ОН, -ЫН2), которые сильнее взаимодействуют с полярным элюентом, удерживание уменьшается,

- полученные в изократических условиях (18 % ацетонитрил - водный раствор ацетата аммония 10 мМ рН 6 8) на колонке 8упег§1 НуЛго-КР корреляции фактора удерживания ХАК-производных аминокиспот с числом атомов углерода в молекуле и 1о£Р могут быть использованы для прогнозирования удерживания ХАК-производных других соединений со структурой, близкой к исследованному ряду веществ

Исследование влияния параметров источника масс-спектрометра на ионизацию ХАК-производных.

В процессе работы с ХАК-производными аминокислот исследовано влияние параметров источника ионизации на масс-спектры анализируемых соединений Для большинства ХАК-производных аминокислот основным сигналом в масс-спектре является молекулярный протонированный ион Также наблюдается небольшой сигнал фрагментного иона с т/г = 171 Показано, что при уменьшении напряжения на конусе источника с 40 до 20 В и при уменьшении напряжения на экстракторе с 4 до 2 В увеличивается соотношение МН/171 (рис 2) Изменение напряжения на капилляре в диапазоне 2 - 3 кВ и температуры 300 - 450°С несущественно влияло на соотношение МН/171 В связи с этим, для дальнейшей работы были выбраны следующие параметры источника напряжение на конусе 20 В, напряжение на экстракторе 2 В, напряжение на капилляре 2 кВ, температура распыления 450°С

Показано, что при ионизации в условиях положительного электроспрея и 20 В на конусе источника ионизации ХАК-производных основных аминокислот и полиаминов, кроме протонированного молекулярного иона образуются также двузарядные ионы Как показано на рисунке 3, агматин дает двузарядный ион (т/г = 151), что может происходить вследствие протонирования гуанидиновой группы

Рис. 2. Зависимость соотношения интенсивностей [МН]+/171 ХАК-производных аминокислот от параметров источника ионизации а) напряжение на конусе, б) напряжение на экстракторе 3 - серин, 4 - глицин, 5 - треонин, 7 - аланин, 9 - аргинин, 13 - метионин, 15 - лейцин

Аналогичный эффект наблюдается и в спектре аргинина (m/z = 173), при этом двузарядный ион не возникает в спектрах N-ацетил-замещенных производных орнитина Двузарядные ионы образуются, вероятно, вследствие присутствия нескольких ХАК-заместителей в молекуле и регистрируются в спектрах ХАК-производных лизина (m/z = 244), спермидина (m/z = 329), путресцина (m/z = 215), орнитина (m/z = 237) Двузарядный ион зарегистрирован и в спектре гистидина (m/z = 163) Кроме того, в масс-спектрах производных основных аминокислот и полиаминов образуются следующие фрагменты [МН - 170]+ для лизина (m/z = 317), аргинина (m/z = 175), гистидина (m/z = 156), орнитина (m/z = 303) и агматина (m/z = 131), [МН - 186 - 170]v для спермидина (m/z = 301) В случае лизина и орнитина - ионы m/z = 317 и m/z = 303, вероятно, соответствуют ХАК-производным по одной из аминогрупп, образованным в источнике ионизации при отщеплении фрагмента 170 Ионы с m/z = 175, m/z = 156, m/z = 116, m/z = 147, m/z = 131 соответствуют протонированным молекулярным ионам исходных аминосоединений аргинина, гистидина, пролина, лизина и агматина соответственно Ионы протонированных молекул исходных соединений, образующихся в источнике ионизации, также регистрируются в спектрах ХАК-производных орнитина (m/z = 133) и путресцина (m/z = 89) При увеличении напряжения от 20 до 30 В наблюдается подавление сигнала двузарядных ионов при несущественном изменении интенсивности протонированных молекулярных ионов исследуемых соединений

I, 100%

[ornHf

[Мт2Н] 237

[MH-302]4"

-133

[МН-170]+ 303

200

300

400

[МтН]+ 473

орнитин

[M+Na]+ ,-495

500

600

700

| m/z

I, 100% isi[M+2H]:

1Л

[М+Н]+ 301

[agmHf

171

[МН-130]+

[M+Na]+

323

у

200

300

400

500

600

700

! m/z

I, 100%

[М+2Н]

[МН-174]

+ 173

17<i[argH]+

118

¡75

/

[м+нр

345

аргинин

150

200

250

300

350

400

450

■ m/z

Рис. 3. Масс-спектры, полученные в максимуме хроматографического пика ХАК-производных полиаминов и аминокислот Протонированные молекулярные ионы [огпН]+, [азтН]+, [а^Н]+ - орнитина, агматина и аргинина соответственно

При значении 40 В отмечено 10-кратное падение интенсивности двузарядных и протонированных молекулярых ионов, а также существенное увеличение интенсивности дочернего иона m/z =171 Поскольку этот фрагмент не является селективным и характерен для всех ХАК-производных аминосоединений, сделан вывод, что дальнейшее увеличение напряжения на конусе источника нецелесообразно Полученные данные показывают, что для

анализа ХАК-производных полиаминов напряжение на конусе должно быть не более 30 В

Исследование влияния состава буферного электролита на скорость миграции дикарбоновых и ^замещенных аминокислот.

Известно, что анализ соединений, ье поглощающих в области УФ, можно осуществлять с помощью метода КЭ в режиме непрямого детектирования При разработке методики анализа смесей дикарбоновых и М-замещенных аминокислот выбран состав разделяющего буфера Для этого проведено исследование влияния состава буферного электролита на скорость миграции и разделение аналитов (рис 4)

г

т

б -| 55 -5 -454 -35 -3 -25 -2 -

-и

1 ' 2 -3 '4

(а)

. _ — . — • Д

—1-1-1-г-

г

т б

5,5 5

4,5 4 3.5 3 2,5 2

-Д-

(В)

А

-----д

»,« рн

111 7

4 6 В 10 12 14 16 18 20 22 24 26

бензойная кислота, мМ

1,6 2,1 2,6 3,1

ТТАБ, мМ

105

205

305

Рис.4. Влияние бензойной кислоты, ТТАБ и ТРИС (рН) на время миграция анализируемых соединений в режиме обращенного элеетроосмотического потока Напряжение -20 кВ, термостатирование +20 °С, ввод образца 5 сек Состав разделяющего буфера бензойнаякислота, ТРИС, ТТАБ 1 -глутамат, 2 -Ы-ацетилглутамат, 3 - аспартат, А - аргининосукцинат

ТРИС, ыМ

Показано, что увеличение модификатора электроосмотического потока -тетрадецилтриметиламмоний бромида (ТТАБ) уменьшает время миграции анализируемых соединений в диапазоне 0 1-06 мМ, а при более высоких концентрациях - не влияет, что может быть связано с установлением устойчивого двойного слоя ТТАБ на стенках капилляра Увеличение концентрации бензойной кислоты приводит к увеличению времени миграции аналитов, что связано с уменьшением электроосмотического потока Время миграции анионов возрастает с увеличением концентрации трис(гидроксиметил)метиламина (ТРИС) в диапазоне 25 - 50 мМ, сопровождающимся повышением рН 5 7 - 8 1, что также можно объяснить уменьшением электроосмотического потока

В результате проведенных исследований для анализа дикарбоновых и М-замещенных аминокислот выбран разделительный буфер, содержащий 25 мМ бензойной кислоты, 0 25 мМ ТТАБ, 50 мМ ТРИС (рН 8 1)

4 глава. Применение разработанных методов. Идентификация аминокислот и полиаминов в биотехнологических образцах.

Идентификация ГАМК При работе с продуцентом пролина на одном из этапов селекции было обнаружено, что при изменении состава ростовой среды продукция пролина резко падала, при этом происходило накопление другого аминосоединения. На первом этапе исследования это соединение было выделено из КЖ с помощью препаративной бумажной хроматографии и идентифицировано как ГАМК с помощью методов масс-спектрометрии и ЯМР На рисунке 5 представлена полученная методом ВЭЖХ/МС хроматограмма КЖ одного из исследуемых штаммов, подтверждающая его способность накапливать ГАМК, которая является нейромедиатором и применяется как лекарственное средство при сосудистых заболеваниях головного мозга Следовательно, подтверждение способности исследованного штамма к сверхсинтезу этого соединения может иметь потенциальный интерес для микробиологического и фармацевтического производств Полученные результаты вошли в патент РФ № 2241036

1,100%

1,100%

2-4

ГАМК

59

. | ni'z

10D 200 300 4D0 JO 0 60 D (50 1DQ 14Q IgO 220 2Й0 300 340 3g0

Рис. 5 Хроматограмма КЖ штамма Е coli (с добавлением 200 мг/л изолейцина в ростовую среду), зарегистрированная по полному ионному току и масс-спектр, полученный в максимуме хроматографического пика № 20 Для разделения была использована колонка Hydro-RP 250 х 4 б, 4 мкм, t 25°С, градиент № 1 11 - NH4+ (М-(б-хинолинил)-чочевина), 17 - 6-аминохинотин, 20 - ГАМК

Идентификация норвалина и норлещина Непротеиногенные аминокислоты, такие как как норвалин и норлейцин, которые используются для производства пищевых добавок, гомеопатических препаратов и других фармацевтических средств, можно получать с использованием бактериальных штаммов

Рис. 6. Хроматограмма КЖ штамма Е coli В-7 AilvBNÄilvGMAilvIH при разделении на колонках (250 х 4 6, 4 мкм) a) MAX-RP (pH 6 4) и б) Hydro-RP (pH 5 8) Условия разделения 123°С, градиент Ks 2 7 - NH4+ (Ы-(б-хинолинил)-мочевина), 20 - норвалин, 21 - норлейцин, 31 - неизвестный компонент

Согласно результатам, полученным в главе 3, для определения норвалина и норлейцина можно было использовать колонку MAX-RP и буферный раствор ацетата аммония с pH 6 4 или колонку Hydro-RP и буферный раствор pH с 5 8, применяя флуоресцентное детектирование Однако, исследования показали, что в процессе анализа реальных образцов на колонке MAX-RP неизвестный компонент № 31 (рис 6а) не разделяется с норвалином, что подтверждают спектры флуоресценции Поэтому целесообразно применение колонки Hydro-RP для анализа данных образцов (рис 66)

Масс-спектры, полученные в максимумах хроматографических пиков ХАК-производных, подтвердили накопление аминокислот норвалина и норлейцина в КЖ исследуемого штамма Е coli Полученные результаты вошли в патентную заявку РФ № 2004127011

Идентификация примеси гомоизолейцина Известно, что бактериальные штаммы Е coli, продуцирующие лейцин, способны накапливать примеси гомолейцина При исследовании КЖ этих штаммов показано, что наряду с гомолейцином может также образовываться и другая непротеиногенная аминокислота - гомоизолейцин Для анализа накопления изомеров гомоизолейцина и гомолейцина, наряду с колонкой Hydro-RP, была использована колонка LUNA С18(2) 150 х 2 мм (рис 7)

Рис. 7. Масс-хроматограммы КЖ бактериальных штаммов, зарегистрированные по соответствующим протонированным молекулярным ионам ХАК-производных с m/z = 316 а) модельная смесь, 6) КЖ после инкубации с покоящимися клетками Е coli с добавлением рацемата 2-оксо-З-метилвалериавовой кислоты в ростовую среду, в) КЖ после инкубации с покоящимися клетками Е coli (отрицательный контроль) Условия разделения t 25°С, градиент № 3 29 и 30 - диастереомеры гомоизолейцина, 31 —гомоизолейцин

Идентификация 4-гидроксиюолейцина 4-гидроксиизолейцин -непротеиногенная аминокислота, обладающая инсулинотропным и противодиабетическим действием Получение 4-гидроксиизолейцина in vitro

18

31

jl_)).......Ад,

IqlOOfo

k

a 29 30

J от 'о

б

.f _______

1,100%

в

litt-

29 30 ■лЛА»

ft * ^ 29 31 мя

2 5 5 0 ÍI 17 5 20 0 22 5 25 0

возможно посредством сопряжения ферментативных активностей альдолазы и аминотрансферазы из ацетальдегида, а-кетобутирата и глутамата На рисунке 8 приведены хроматограммы ХАК-производных изомеров 4-гидроксиизолейцина, образовавшихся в результате сопряженных ферментативных реакций Для разделения использована колонка LUNA С 18(2) 150 х 2 мм Полученные результаты вошли в патентную заявку РФ №2005127811

С помощью предложенного метода ВЭЖХ/МС в КЖ различных штаммов также были идентифицированы о-, м-, п-изомеры гидроксифенилаланина и димер валина

LU 30 20 10 о

20

to is

я'

а

......Í Ш

LU зо 20 10

20

at

15 20

Рис. 8. Хроматограммы реакционных смесей сопряженных ферментативных реакций а-б) Хроматограммы, полученные с помощью флуоримстра а'-б') Масс-хроматограммы продуктов по соответствующим протонированным молекулярным ионам ХАК-производных m/z = 318 а-а') модельная смесь, б-б') образец реакционной смеси сопряженных реакций Условия разделения t 25°С, градиент № 4 1 - глутамат, 2 - М-(6-хинолинил)-мочевина, 3 - б-аминохинолин, 4 - 2-аминомасляная кислота, 5 - 7 - изомеры 4-гидроксиизолейцина

Идентификация примеси путресцина Известно, что в клетках микроорганизмов биогенные полиамины (агматин, путресцин, спермидин) образуются в результате декарбоксилирования основных аминокислот Присутствие этих соединений в КЖ свидетельствует об активации путей деградации соответствующих аминосоединений При исследовании КЖ штаммов Е coli, продуцирующих аргинин, показано, что наряду с его предшественником - орнитином, происходит накопление путресцина (рис 9)

19

Для разделения использована колонка Бупегд! Нуёго-КР 250 х 46 мм (обоснование выбора условий дано в главе 3)

Рис. 9. Масс-хроматограммы, зарегистрированные по соответствующим протонировавным молекулярным ионам ХАК-производных в образце ЮК штамма, продуцирующего аргинин а) m/z = 429, б) m/z = 473 и модельной смеси: а') путресцин m/z = 429, 6') орнитин m/z = 473 Условия разделения t 25°С, градиент № 5

Применение КЭ для анализа дикарбоновых и N-замещенных аминокислот, как продуктов ферментативных реакций в реакционных смесях.

Анализ глутаминовой кислоты В процессе изучения путресцинтрансаминазы, участвующей в процессе деградации путресцина и биосинтеза ГАМК в клетках Ecoli, необходима оценка активности этого фермента в разных штаммах Как следует из схемы реакции (путресцин + 2-оксоглутарат = 4-аминобутаналь + глутамат) измерение ферментативной активности можно проводить по накоплению глутаминовой кислоты

нгн"

"2 + НО.

но

Hjtl'

путресцин 20мВ

2-оксоглутарат 4-аминобутаналь

20мВ

О^/ОН

н2

глутамат

i мин

Рис. 10. Электрофореграммы реакционных смесей после инкубирования ферментного препарата для измерения активности путресцинтрансаминазы а) 0 мин, б) 3 ч Напряжение -20 кВ, термостатирование +20°С, ввод образца 5 сек 1 - аспартат (добавлен в качестве внутреннего стандарта), 2 - глутамат

Как видно из электрофореграмм, представленных на рисунке 10, в реакционной смеси в процессе инкубирования фермента наблюдается накопление глутамата

Анализ аргининоянтарной кислоты При работе со штаммом Е coli, продуцирующим аргинин, одним из этапов оптимизации направления работы являлась оценка активности аргининосукцинат-синтетазы Активность этого фермента (цитруллин + аспартат + АТФ = АМФ + ФФН + аргининосукцинат) оценивали по количеству образовавшейся аргининоянтарной кислоты Как показано на рисунке 11 (а, б), накопление аргининосукцината происходит в результате инкубирования ферментного препарата штамма Е coli B-2525/pUC-argG, содержащего плазмиду с клонированным геном argG

о

дифосфат+ АМФ но

0 .-г* У о I! АТ\/*

0^\он аргининосукцинат

3 мм

3 мин

Рис. 11. Электрофореграммы реакционных смесей после инкубирования бесклеточных экстрактов штамма Е coli B-2525/pUC-argG для измерения активности аргининосукцинат-синтетазы а) 0 мин, б) 15 мин Напряжение -25 кВ, термостатирование +20°С, ввод образца 20 сек 1 - АТФ, 2 - АМФ, 3 - аспаратат, 4 - аргининосукцинат

Также, с помощью разработанного метода КЭ в реакционных смесях различных ферментативных реакций провели определение Ы-ацетилглутамата и фосфорилированных продуктов карбамоилфосфата и О-фосфогомосерина

Выводы.

1 Показано, что ХАК-производные аминокислот подчиняются общим закономерностям удерживания соединений на обращенной фазе, что подтверждается изменением удерживания внутри гомологических рядов, структурных изомеров, а также при введении в молекулу полярных функциональных групп

2 Исследовано влияние рН и концентрации буферного раствора на удерживание ХАК-производных аминокислот и полиаминов при разделении в условиях ОФ-ВЭЖХ Показано, что в диапазоне рН 3 5 - 7 характер полученных зависимостей связан с образованием цвиттер-ионной или нейтральной формы разделяемых ХАК-производных в исследованной области рН, что определяется природой заместителя изучаемых аминокислот.

3 Установлено, что для масс-спектров ХАК-производных основных аминокислот и полиаминов характерно образование двузарядных ионов наряду с протонированным молекулярным ионом Показано, что варьируя параметры источника ионизации (напряжение на конусе и экстракторе) можно изменять относительные интенсивности и соотношения сигналов протонированных молекулярных, двузарядных и фрагментных ионов, наблюдаемых в масс-спектрах ХАК-производных аминокислот и полиаминов.

4 С помощью метода КЭ получены зависимости времени миграции анионов дикарбоновых и М-замещенных аминокислот от концентрации компонентов разделяющего буфера На основании полученных закономерностей предложены условия анализа продуктов реакционных смесей при исследовании активностей ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот Результаты включены в патент РФ № 2264459

5 С помощью метода ВЭЖХ/МС идентифицированы аминокислоты, в том числе и непротеиногенные (ГАМК, п-, м-, о- изомеры гидроксифенил-

аланина, гомоизолейцин, норвалин, норлейцин, орнитин), димер валина и биогенный амин путресцин, накапливаемые в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов Подтверждена возможность получения 4-гидроксиизолейцина с помощью ферментативного синтеза Полученные результаты вошли в патент РФ № 2241036 и патентные заявки РФ № 2004127011, № 2005127811

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях

1 Новикова А Е, Ямпольская Т А, Гусятинер М М Использование капиллярного электрофореза для определения N-ацетилглутамата, аргининсукцината и карбамилфосфата при измерении активности ферментов пути биосинтеза аргинина И Биотехнология 2004 № 3 С 78-86

2 Новикова А Е , Анисимова О С , Турчин К Ф , Фомина С А, Лунц М Г, Дегтерев Е В Идентификация и анализ у-аминомасляной кислоты в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов // Химико-фармацевтический журнал 2005 Т 39 № 4 С 47-52

3 Samsonova N N, Smirnov S V, Novikova A E, Ptitsyn L R Identification of Escherichia coli K12 YdcW protein as a y-aminobutyraldehyde dehydrogenase // FEBS Letters 2005 V 579. P 4107-4112

4 Новикова A E, Стоинова H В, Сычева E В, Колоколова А В Идентификация и анализ непротеиногенных аминокислот норвалина и норлейцина в культуральных жидкостях штаммов Escherichia coli // Сорбционные и хроматографические процессы 2006 Т 6 № 5 С 796-806

5 Новикова А Е , Колоколова А В , Буряк А К. Идентификация полиаминов методом ВЭЖХ/МС в культуральных жидкостях штаммов Escherichia coli // Сорбционные и хроматографические процессы 2007 Т 7. № 1 С 66-77

6 Новикова А Е , Стоинова Н В , Ямпольская Т А, Буряк А К Идентификация аминокислот, в том числе их структурных изомеров, в виде N-[(6-хинолиниламино)карбонил]-производных методом ВЭЖХ-МС // Сорбционные и хроматографические процессы 2007 Т 7 № 3. С 430-443

7 Smirnov S V, Samsonova N N, Novikova А Е, Matrosov N G, Rushkevich N Y, Kodera T , Ogawa J , Yamanaka H, Shimizu S A novel strategy for enzymatic synthesis of 4-hydroxyisoleucine identification of an enzyme possessing HMKP (4-hydroxy-3-methyl-2-keto-pentanoate) aldolase activity // FEMS Microbiology Letters 2007 V 273 P 70-77

8 Фомина С A, Новикова A E, Лунц M Г, Гусятинер M M Способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) // Патент РФ № 2241036 Опубликован 27 11 2004 Бюл №33

9. Птицын Л Р, Смирнов С В , Альтман И Б , Новикова А.Е, Котлярова В А, Гусятинер М М, Ростова Ю.Г, Ямпольская Т А Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата // Патент РФ № 2264459 Опубликован 20 11 2005 Бюл №32

10 Стоинова НВ, Сычева ЕВ, Преображенская ЕС, Новикова АЕ, Матросов Н Г Способ получения непротеиногенных аминокислот с использованием бактерии семейства Enterobactenaceae, в которой все синтазы ацетогидроксикислот инактивированы // Патентная заявка РФ № 2004127011 Опубликована 20 02 2006 Бюл № 5

11 Смирнов С В, Самсонова Н Н, Новикова А Е, Матросов Н Г, Рушкевич Н Ю , Птицын J1Р , Мацуи К , Кодера Т Способ ферментативного получения 4-гидроксиизолейцина И Патентная заявка РФ № 2005127811 Опубликована

20 03 2007 Бюл № 8

12 Новикова А Е , Фомина С А, Анисимова О С, Турчин К Ф, Лунц М Г, Дегтерев Е В Идентификация и анализ у-аминомасляной кислоты в культуральных жидкостях пггаммов-продуцентов // Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» Москва 18 — 22 апреля, 2005 С 778

13 Новикова АЕ, Ямпольская Т. А, Стоинова НВ., Серебряный В А, Матросов НГ, Сычева ЕВ Идентификация и анализ непротеиногенных аминокислот с помощью метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Тезисы докладов X международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва - Клязьма 24 - 28 апреля, 2006 С 305

14 Новикова АЕ, Буряк А К Идентификация и анализ полиаминов методом ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС в культуральных жидкостях штаммов Escherichia coh // Тезисы докладов III международной конференции-школы «Масс-слектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» Звенигород 16 -

21 апреля, 2007 С 145

15 Новикова А Е, Буряк А К Жидкостная хроматография с флуоресцентным и масс-спектрометрическим детектированием при анализе биогенных аминов и изомерных аминокислот // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» Москва - Клязьма 23 - 27 апреля, 2007 С 45

16 Новикова А Е, Киверо А Д, Буряк А К. Использование метода капиллярного электрофореза в режиме непрямого детектирования для измерения активностей ферментативных реакций // Тезисы докладов научно-прикладного семинара «Аналитические методы и приборы для химического анализа» Санкт-Петербург 29-31 августа, 2007 С 24

17 Новикова АЕ, Смирнов СВ, Буряк А К Сравнение методов ВЭЖХ с флуориметрическим и масс-спектрометрическим детектированием при идентификации и анализе аминированных метаболитов в виде N-[(6-хинолиниламино)карбонил]-производных // Тезисы докладов II Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» Москва 3-7 сентября, 2007 С АС-8

18 Колоколова АВ, Стоинова НВ, Новикова АЕ Определение дивалина, секретируемого валинустойчивыми клетками Е coli, с применением ВЭЖХ // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии Москва 23 - 28 сентября, 2007 В пяти томах Т4 С 163

Подписано в печать 16 01 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 7 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat ru

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ.

1.2. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ И БИОГЕННЫХ

АМИНОВ.

1.3. ВЭЖХ/МС АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ И БИОГЕННЫХ АМИНОВ.

1.4. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ КЭ.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. РЕАКТИВЫ.

2.2. ОБОРУДОВАНИЕ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ НА УДЕРЖИВАНИЕ ХАК-ПРОИЗВОДНЫХ.

3.1.1. Влияние концентрации органического модификатора на удерживание ХАК-производных.

3.1.2. Влияние неподвижной фазы используемых сорбентов на удерживание ХАК-производн ых.

3.1.3. Влияние рН и концентрации буферного раствора на удерживание ХАК-производных.

3.1.4. Связь строения ХАК-производных аминокислот с их удерживанием на обращенной фазе. Описание удерживания ХАК-производных на обращенной фазе с использованием моделей «удерживание — свойство» и «удерживание — строение».

3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ИСТОЧНИКА МАСС-СПЕКТРОМЕТРА НА ИОНИЗАЦИЮ ХАК-ПРОИЗВОДНЫХ.

3.2.1. Влияние параметров источника ионизации на масс-спектры ХАК-производных аминокислот.

3.2.2. Влияние напряжения на конусе источника ионизации на масс-спектры ХАК-производных полиаминов и орнитина.

3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЭЛЕКТРОФОРЕТИ-ЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ НА СКОРОСТЬ МИГРАЦИИ ДИКАРБОНОВЫХ И ^ЗАМЕЩЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ.

3.3.1. Влияние концентрации компонентов разделяющего буфера.

3.3.2. Влияние приложенного напряжения на разделение исследуемых компонентов. Влияние времени инжекции на площадь пиков аналитов.

ГЛАВА 4. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДОВ.

4.1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ И ПОЛИАМИНОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ.

4.1.1. Идентификация и анализ ГАМК.

4.1.2. Идентификация неканонических аминокислот.

4.1.2.1. Идентификация и анализ норвалина и норлейцина.

4.1.2.2. Идентификация примесей о-, м-, п- изомеров гидроксифенил-аланина.

4.1.2.3. Идентификация примеси гомоизолейцина.

4.1.2.4. Идентификация 4-гидроксиизолейцина и 4-гидроксинор-валина.

4.1.3. Идентификация дипептида валилвалин.

4.1.4. Идентификация и анализ примеси путресцина.

4.2. ПРИМЕНЕНИЕ КЭ ДЛЯ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ В РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЯХ.

4.2.1. Анализ глутаминовой кислоты.

4.2.2. Определение И-ацетилглутаминовой и аргининоянтарной кислот.

4.2.3. Анализ фосфорилированных продуктов ферментативных реакций.

ВЫВОДЫ.

Биотехнологический процесс является одним из основных способов получения биологически активных веществ, таких как аминокислоты, нуклеозиды, витамины и т.д [1 - 5]. В частности, микробиологический способ получения аминокислот отличается существенными преимуществами, так как позволяет синтезировать аминокислоты Ь-формы из относительно дешевых источников углерода. Аминокислоты секретируются в среду штаммами-продуцентами, способными к эффективному биосинтезу основного продукта в результате генетического конструирования. В процессе микробиологического синтеза целевой аминокислоты могут накапливаться сопутствующие аминированные метаболиты, образующиеся как в процессе биосинтеза, так и при деградации основного продукта. При разработке и оптимизации биотехнологического процесса необходимо контролировать не только количество целевого компонента и его известных метаболитов, но и отслеживать появление новых, не всегда предсказуемых примесей. Кроме того, аналитический контроль необходим и в процессе генетического конструирования штаммов-продуцентов для получения информации об изменении активностей ферментов, участвующих в биосинтезе целевого продукта.

Биотехнологические образцы, в частности культуральные жидкости штаммов-продуцентов, представляют собой сложные смеси, в составе которых содержатся компоненты исходной питательной среды, клетки микроорганизмов, продукты биосинтеза. Поэтому, при работе с реальными биологическими образцами целесообразно использовать комплексный подход, сочетающий высокоэффективные методы разделения, идентификации и количественного анализа соединений. Такими методами являются, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез (КЭ).

Следует отметить, что, используя метод ВЭЖХ, можно провести идентификацию соединений, используя только такую хроматографическую характеристику, как время удерживания, однако этого может быть недостаточно в случае неразделенных веществ. Дополнительную информацию могут дать спектры поглощения и флуоресценции, и, безусловно, надежность идентификации повышается при использовании масс-спектрометра (МС). Однако, для анализа с использованием МС существует ряд ограничений по составу подвижной фазы [6]. Так, наиболее часто применяемые в ВЭЖХ подвижные фазы, содержащие фосфатные буферы, растворы солей высокой концентрации (50 - 100 мМ), не рекомендуется использовать при работе с МС, в связи с возможным подавлением ионизации аналитов и отложением нелетучих солей на линзах источника [7]. При этом условия хроматографирования должны обеспечивать полное разделение соединений, имеющих одинаковую молекулярную массу, и, вместе с тем, быть совместимыми с МС.

Таким образом, актуальной является разработка комплекса высокоэффективных аналитических методов, необходимых на этапе генетического конструирования штаммов-продуцентов, а также при оптимизации условий биосинтеза целевого продукта.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ХАК-производные аминокислот подчиняются общим закономерностям удерживания соединений на обращенной фазе, что подтверждается изменением удерживания внутри гомологических рядов, структурных изомеров, а также при введении в молекулу полярных функциональных групп.

2. Исследовано влияние рН и концентрации буферного раствора на удерживание ХАК-производных аминокислот и полиаминов при разделении в условиях ОФ-ВЭЖХ. Показано, что в диапазоне рН 3,5 -7,0 характер полученных зависимостей связан с образованием цвиттер-ионной или нейтральной формы разделяемых ХАК-производных в исследованной области рН, что определяется природой заместителя изучаемых аминокислот.

3. Установлено, что для масс-спектров ХАК-производных основных аминокислот и полиаминов характерно образование двузарядных ионов наряду с протонировапным молекулярным ионом. Показано, что варьируя параметры источника ионизации (напряжение на конусе и экстракторе) можно изменять относительные интенсивности и соотношения сигналов протонированных молекулярных, двузарядных и фрагментных ионов, наблюдаемых в масс-спектрах ХАК-производных аминокислот и полиаминов.

4. С помощью метода КЭ получены зависимости времени миграции анионов дикарбоновых и И-замещенных аминокислот от концентрации компонентов разделяющего буфера. На основании полученных закономерностей предложены условия анализа продуктов реакционных смесей при исследовании активностей ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот. Результаты включены в патент РФ № 2264459.

5. С помощью метода ВЭЖХ/МС идентифицированы аминокислоты, в том числе и непротеиногенпые (ГАМК, п-, м-, о- изомеры гидроксифенилаланина, гомоизолейцин, норвалин, норлейцин, орнитин), димер валина и биогенный амин путресцин, накапливаемые в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов. Подтверждена возможность получения 4-гидроксиизолейцина с помощью ферментативного синтеза. Полученные результаты вошли в патент РФ № 2241036 и патентные заявки РФ № 2004127011, № 2005127811.

1. М.Е. Бекер. Введение в биотехнологию. Рига: Звайгэне, 1974. 231с.

2. А.Г. Гриневич, A.M. Босенко. Техническая микробиология. Минск: Высшая школа, 1986. 168 с.

3. В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. М.: Высшая школа, 1988. 208 с.

4. Н.П. Блинов. Основы биотехнологии. СПб.: Наука, 1995. 600 с.

5. Б. Глик, Дж. Пастернак. Молекулярная биотехнология. М,: Мир, 2002. 589 с.

6. R. Willoughby, Е. Sheehan, S. Mitrovich. A global view of LC/MS. Pittsburgh: Chem-Space Associates Inc., 1998. 554 P.

7. N.B. Cech, C.G. Enke. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals // Mass. Spectrom. Rev. 2001. 20. P. 362-387.

8. K. Kiritani, R.P. Wagner, alpha, beta-Dihydroxy acid dehydratase // Methods Enzymol. 1970. 17A. P. 755-764.

9. G.L. Ellman. Tissue sulphydril groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. 82. P. 70-77.

10. P.P. Trotta, M.E. Burt, R.H. Haschemeyer, A. Meister. Reversible dissociation of carbamoyl Phosphate synthetase into a regulated synthesis subunit required for glutamine utilization // Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1971. 68. P. 2599—2603.

11. Э.А. Буриков, M.M. Гусятинер, С.В. Иванов и др. Сравнение методов хроматографического определения L-серина в ферментационных растворах//Биотехнология. 1996. 9. С.51 -56.

12. Х.Д. Якубке. X. Ешкайт. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. 456 с.

13. В.Д. Красиков, И.И. Малахова, Е.В. Дегтерев, Б.В. Тяглов. Планерная хроматография свободных аминокислот. Практическое применение метода в промышленной биотехнологи //

14. Хроматография на благо России. Ред. А.А. Курганов. М.: Граница, 2007. С. 518-537.

15. И.И. Малахова, В.Д. Красиков, Е.В. Дегтерев, Э.В. Кузнецов, Б.В. Тяглов. Тонкослойная хроматография свободных аминокислот. Подбор условий для разделения L-лизина, L-гомосерина и L-треонина//Биотехнология. 1996. 11. С.27-32.

16. R.W. Zumwalt, К. Kuo, C.W. Gehrke. A nanogram and picogram method for amino acid analysis by gas-liquid chromatography // J. Chromatogr. A.1971. 57. P. 193-208.

17. S. Casal, M. B. Oliveira, M.A. Ferreira. Gas chromatographic quantification of amino acid enantiomers in food matrices by their N(0,S)-ethoxycarbonyl heptafluorobutyl ester derivatives // J. Chromatogr.A. 2000. 866. P.221-230.

18. Е.В. Сунозова, В.И. Трубников, К.И. Сакодынский. Газовая хроматография аминокислот. М.: Наука, 1976. 83 с.

19. P. Dallakian, Н. Budzikiewicz. Gas chromatography-chemical ionization mass spectrometry in amino acid analysis of pyoverdins // J. Chromatogr. A. 1997. 787. P. 195-203.

20. G.J. Hughes, K.H. Winterhalter, E. Boiler, K.J. Wilson. Amino acid analysis using standard high-performance liquid chromatography equipment// J. Chromatogr. A. 1982. 235. P. 417-426.

21. R.B.H. Wills, J. Silalahi, M. Wootton. Simultaneous determination of food-related amines by high-performance liquid chromatography // J. Liquid Chromatogr. 1987. 10. P. 3183-3191.

22. J.-Z. Sun, H. Kaur, B. Halliwell, X.-Y. Li, R. Bolli. Use of aromatic hydroxylation of phenylalanine to measure production of hydroxyl radicals after myocardial ischemia in vivo // Circ. Res. 1993. 73. P. 534-549.

23. R. Biondi, Y. Xia, R. Rossi, N. Paolocci, G. Ambrosio, J.L. Zweier. Detection of Hydroxyl Radicals by Phenylalanine Hydroxylation: A Specific Assay for Hydroxyl Radical Generation in Biological Systems. // Anal. Biochem. 2001. 290. P. 138-145.

24. H.A. Кравченко, Г.В. Клеопина. Руководство по хроматографическому анализу аминокислот на колонках. М.: Наука, 1964. 73 с.

25. А. Хеншен, К.П. Хупе, Ф. Лотшпайх, В. Велтер. ВЭЖХ в биохимии. М.: Мир, 1988. 688 с.

26. Hitachi L-8800 Instruction manual.

27. J.C. Anders. Advances in amino acids analysis. // BioPharm. 2002. P. 32-29.

28. N.Seiler. Polyamines // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1986. 379 P. 157-176.

29. A. Fiorino, G. Frigo, E. Cucchetti. Liquid chromatographic analysis of amino and imino acids in protein hydrolysates by post-column derivatization with o-phthalaldehyde and 3-mercaptopropionic acid // J. Chromatog. A. 1989. 476. P.83-92.

30. S.-Y. Chung, E. T. Champagne. Peanut polyamines may be non-allergenic // J. Sci. Food Agric. 2005. 85. P. 990 994.

31. T. Hayashi, II. Tsuchiya, H. Naruse.Reversed-phase ion-pair chromatography of amino acids : Application to the determination of amino acids in plasma samples and dried blood on filter papers // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1983. 274. P.318-324.

32. J. Haginaka, J. Wakai. Liquid chromatographic determination of amino acids using a hollow-fiber membrane reactor // Anal. Biochem. 171. 1988. P. 398-403.

33. W.S. Hancock. Handbook of HPLC for the separation of amino acids, peptides and proteins. Florida: CRC Press, 1986. 481 P.

34. A. Fallon, R.F.G. Booth, L.D. Bell. Application of HPLC in biochemistry. Amsterdam: Elsevier Publishers, 1987. 338 P.

35. П. Садек. Растворители для ВЭЖХ. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2006. 704 с.

36. S. M. Kim. Isocratic separation of phenylthiohydantoin-amino acids by reversed-phase high-performance liquid chromatography // J. Chromatog. A. 1982. 247. P. 103-110.

37. H. Schrenker. Effect of mobile phase pre-heating on high-performance liquid chromatographic column performance: A new type of column thermostat // J. Chromatog. 1981. 213. P. 243-252.

38. K. Hayakawa, M. Hirano, K. Yoshikawa, N. Katsumata, T. Tanaka. Separation of phenylthiohydantoin-amino acids by temperature-controlled reversed-phase high-performance liquid chromatography // J Chromatogr. A. 1999. 846. P. 73-82.

39. S.A. Cohen, D.J. Strydom. Amino acid analysis utilizing phenylisothiocyanate derivatives // Anal. Biochem. 1988. 174. P. 1-16.

40. J.Y. Chang, R. Knecht, D.G. Braun. Amino acid analysis at the picomole level. Application to the C-terminal sequence analysis of polypeptides // Biochem. J. 1981. 199. P. 547-555.

41. O. Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira, E. Mendes, B.M. Oliveira, M. Ferreira. Effect of temperature on evolution of free amino acid and biogenic amine contents during storage of Azeitao cheese // Food Chemistry. 2001. 75. P.287-291.

42. J.Y. Chang. Isolation and characterization of polypeptide at the picomole level. Pre-column formation of peptide derivatives with dimethylaminoazobenzene isothiocyanate // Biochem. J. 1981. 199. P. 537-545.

43. J.Y. Chang. N-terminal sequence analysis of polypeptide at the picomole level //Biochem. J. 1981. 199. P. 557-564.

44. N.P.J. Price, J.L. Firmin, D.O. Gray. Screening for amines by dansylation and automated high-performance liqid chromatography // J Chromatogr. A. 1992. 598. P. 51-57.

45. A.M. Swensen, J. Golowasch, A.E. Christie, M.J. Coleman, M.P. Nusbaum, E. Marder. GABA and responses to GABA in the stomatogastric ganglion of the crab Cancer borealis // J. Exp. Biol. 2000. 203. P. 2075-2092.

46. L. Miranda-Contreras, P. Benitez-Diaz, Z. Pena-Contreras, R.V. Mendoza-Briceno, E. Palacios-Pru. Levels of amino acid neurotransmitters during neurogenesis and in histotypic cultures of mouse spinal cord // Dev. Neurosci. 2002. 24. P. 59-70.

47. T.-Y. Kim, H.-J. Kim. Chiral separation of 9-fluorenylmethyl chloroformate- and dansyl chloride-derivatized D,L-serine by y-cyclodextrin-bonded high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2001. 933. P. 99-106.

48. B. N. Jones and J. P. Gilligan. O-phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids // J. Chromatog. A. 1983. 266. P. 471-482.

49. R. Hanczko, D. Kutlan, F. Toth, I. Molnar-Perl. Behavior and characteristics of the o-phthaldialdehyde derivatives of n-C6-C8 amines and phenylethylamines with four additive SH-containing reagents // J. Chromatogr. 2004. 1031. P. 51-66.

50. B.R. Loper, W.T. Cobb, K.A. Anderson. Chemical marker for ALS-Inhibitor herbicides: 2-aminobutyric acid proportional in sub-lethal application // J. Agric. Food Chem. 2002. 50. P. 2601-2606.

51. A.A. Lavdas, M.E. Blue, J. Lincoln, J.G. Parnavelas. Serotonin promotes the differentiation of glutamate neurons in organotypic slice cultures of the developing cerebral cortex // J. Neurosci. 1997. 17. P. 7872-7880.

52. J. Kehr. Determination of y-aminobutyric acid in microdialysis samples by microbore column liquid chromatography and fluorescence detection // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1998. 708. P. 49-54.

53. J. Garduno, S. Elenes, J. Cebada, E. Becerra, U. Garcia. Expression and Functional Characterization of GABA Transporters in Crayfish Neurosecretory Cells // J. Neurosci. 2002. 22. P. 9176-9184.

54. T. Kodama, Y.-Y. Lai, J.M. Siegel. Change in inhibitory aminoa cid release linked to pontine-induced atonia: an in vivo microdialysis study // J. Neurosci. 2003. 23. P. 1548-1554.

55. J. Kirschbaum, B. Luckas, W.-D. Beinert. Pre-column derivatization of biogenic amines and amino acids with 9-fluorenylmethyl chloroformate and heptylamine // J. Chromatogr. A. 1994. 661. P. 193-199.

56. R. Schuster. Determination of amino acids in biological, pharmaceutical, plant and food samples by automated precolumn derivatization and high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1988. 431. P. 271-284.

57. P. Furst, L. Pollack, T.A. Graser, H. Godel, P. Stehle. HPLC analysis of free amino acids in biological material an appraisal of four precolumn derivatization methods // J. Liquid Chromatogr. 1989. 12. P. 2733-2760.

58. I. Molnar-Perl. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, eithersimultaneously or separately // J. Chromatogr. A. 2003. 987. P. 291309.

59. T.-Y. Kim, H.-J. Kim. Chiral separation of 9-fluorenylmethyl chloroformate- and dansyl chloride-derivatized D,L-serine by y-cyclodextrin-bonded high-performance liquid chromatography //J. Chromatogr. A. 2001. 933. P. 99-106.

60. M. Pawlowska, S. Chen, D.W. Armstrong. Enantiomeric separation of fluorescent, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyI carbamate, tagged amino acids // J. Chromatogr. A. 1993. 641. P. 257-265.

61. D.J. Strydom, S.A. Cohen. Comparison of Amino Acid Analyses by Phenylisothiocyanate and 6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl Carbamate Precolumn Derivatization // Anal. Biochem. 1994. 222. P. 19-28.

62. S.A. Cohen, K.M. De Antonis. Applications of amino acid derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate: Analysis of feed grains, intravenous solutions and glycoproteins // J. Chromatogr. A. 1994. 661. P.25-34.

63. D.L. Crimmins, R. Cherian. Increasing the Sensitivity of 6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl Carbamate Amino Acid Analysis: A Simple Solution // Anal. Biochem. 1997. 244. P. 407-410.

64. N. Ahmed, P.J. Thornalley. Chromatographic assay of glycation adducts in human serum albumin glycated in vitro by derivatization with 6-aminoquinoJyl-N-hydroxysuccinimidyI-carbamate and intrinsic fluorescence // Biochem. J. 2002. 364. P. 15-24.

65. G.P. Palace, C.H. Phoebe. Quantitative Determination of Amino Acid Levels in Neutral and Glucosamine-Containing Carbohydrate Polymers //Anal. Biochem. 1997. 244. P. 393-403.

66. G.P. Palace, R. Fitzpatrick, K.V. Tran, C.H. Phoebe, K. Norton. Determination of amino acids in diverse polymeric matrices using HPLC, with emphasis on agars and agaroses // Biochim. Biophys. Acta (BBA) General Subjects. 1999. 1472. P. 509-518.

67. C. Velazquez, M. Llovera, J. Plana, R. Canela. Effect of solvents on the fumonisins analysis by high-performance liquid chromatography with AccQ.Fluor as the derivatizing reagent // J. Chromatogr. A. 2000. 870. P. 469-472.

68. S. Merali, A.B. Clarkson. Polyamine analysis using N-hydroxysuccinimidyl-6-aminoquinoyl carbamate for pre-column derivatization // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1996. 675. P. 321-326.

69. S. Merali, A.B.Jr. Clarkson. Polyamine content of Pneumocystis carinii and response to the ornithine decarboxylase inhibitor DL-alpha-difluoromethylornithine // Antimicrob. Agents Chemother. 1996. 40. P. 973-978.

70. D.J. Strydom, S.A. Cohen. Comparison of Amino Acid Analyses by Phenylisothiocyanate and 6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl Carbamate Precolumn Derivatization // Anal. Biochem. 1994. 222. P. 19-28.

71. P. Jandik, A.P. Clarke, N. Avdalovic, D.C. Andersen, J. Cacia. Analyzing mixtures of amino acids and carbohydrates using bi-modal integrated amperometric detection // J. Chromatog. B: Biomed. Sci. Appl. 1999. 732. P. 193-201.

72. A.P. Clarke, P. Jandik, R.D. Rocklin, Y. Liu, N. Avdalovic. An integrated amperometry waveform for the direct, sensitive detection of amino acids and amino sugars following anion-exchange chromatography//Anal. Chem. 1999. 71. P. 2774-2781.

73. Ю.С. Другов, A.A. Родин. Анализ загрязненных биосред и пищевых продуктов. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2007. 294 с.

74. Z. Deyl, J. Hyanek, М. Horakova. Profiling of amino acids in body fluids and tissues by means of liquid chromatography // J. Chromatogr. 1986.379. P. 177-250.

75. J. Abian. The coupling of gas and liquid chromatography with mass spectrometry// J. Mass Spectrom. 1999. 34. P. 157-168.

76. J. Abian. A.J. Oosterkamp, E. Gelpi. Comparison of conventional, Narrow-bore and capillary liquid chromatography/mass spectrometry for electrospray ionization mass spectrometry: practical considerations // J. Mass Spectrom. 1999. 34. P. 244-254.

77. R.B. Cole. Some tenets pertaining to electrospray ionization mass spectrometiy // J. Mass Spectrom. 2000. 35. P. 763-772.

78. N.B. Cech, C.G. Enke. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals // Mass. Spectrom. Rev. 2001. 20. P. 362-387.

79. A.T. Лебедев. Масс-спектрометрия в органической химии. М.: Бином, 2003. 493 с.

80. М. Tuchman, М.Т. McCann. Phenylalanine and tyrosine quantification by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry from filter paper blood spots // Clin. Chem. 1999. 45. P.571 573.

81. K. Petritis, P. Chaimbault, C. Elfakir, M. Dreux. Parameter optimization for the analysis of underivatized protein amino acids by liquid chromatography and ionspray tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 896. 2000. P. 253-263.

82. J.J. Dalluge, S. Smith, F. Sanchez-Riera, C. McGuire, R. Hobson. Potential of fermentation profiling via rapid measurement of amino acid metabolism by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2004. 1043. P. 3-7.

83. B. Field, G. Cardon, M. Traka, J. Botterman, G. Vancanneyt, R. Mithen. Glucosinolate and amino acid biosynthesis in Arabidopsis // Plant Physiol. 2004. 135. P. 828 839.

84. Y. Nozawa, N. Sakai, K. Arai, Y. Kawasaki, K. Harada. Reliable and sensitive analysis of amino acids in the peptidoglycan of actinomycetes using the advanced Marfey's method // J. Microbiol. Methods. 2007. 70. P. 306-311.

85. Y. Kawasaki, Y. Nozawa, K. Harada. Elution behavior of diaminopimelic acid and related diamino acids using the advanced Marfey's method // J. Chromatog. A. 2007. 1160. P. 246-253.

86. C.J. Feistner. Profiling of basic amino acids and polyamines in microbial culture supernatants by electrospray mass spectrometry // Biol. Mass. Spectrom. 1994. 23. P. 784-792.

87. J.M.C. Geuns, M.L. Orriach, R. Swennen, G. Zhu, B. Panis, F. Compernolle, M. Van der Auweraer. Simultaneous liquid chromatography determination of polyamines and arylalkyl monoamines //Anal. Biochem. 2006. 354. P. 127-131.

88. H. Nohta, H. Satozono, K. Koiso, H. Yoshida, J. Ishida, M. Yamaguchi. Highly Selective Fluorometric Determination of Polyamines Based on Intramolecular Excimer-Forming Derivatization with a Pyrene-Labeling Reagent // Anal. Chem. 2000. 72. P. 41994204.

89. R. Hanczko, A. Koros, F. Toth, I. Molnar-Perl. Behavior and characteristics of biogenic amines, ornithine and lysine derivatized with the o-phthalaldehyde-ethanethiol-fluorenylmethyl chloroformate reagent // J. Chromatogr. A. 2005. 1087. P. 210-222.

90. K.D. Altria, D. Elder. Overview of the status and applications of capillary electrophoresis to the analysis of small molecules // J. Chromatogr. A. 2004. 1023. P. 1-14.

91. X. Энгельгардт. Руководство по капиллярному электрофорезу. Ред. A.M. Волощук. М.: ЦНИИТЭИ Тракторсельхозмаш, 1996. 111с.

92. C.W. Klampfl, W. Buchberger, М. Turner, J.S. Fritz. Determination of underivatized amino acids in beverage samples by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1998. 804. P. 349-355.

93. K. Otsuka, S. Terabe, T. Ando. Electrokinetic chromatography with micellar solutions : Separation of phenylthiohydantoin-amino acids // J. Chromatog. A. 1985. 332. P. 219-226.

94. M. Castagnola, D.V. Rossetti, L. Cassiano, R. Rabino, G. Nocca, B. Giardina. Optimization of phenylthiohydantoinamino acid separation by micellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatog. A. 1993. 638. P. 327-334.

95. P.G. Righetti. Capillary Electrophoresis in Analytical Biotechnology. Florida: CRC Press Inc., 1996. 551 P.

96. I.E. Valko, H. Siren, M.-L. Riekkola. Chiral separation of dansyl-amino acids in a nonaqueous medium by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1996. 737. P. 263-272.

97. L. Cavani, C. Ciavatta, C. Gessa. Determination of free l- and d-alanine in hydrolysed protein fertilisers by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 2003. 985. P. 463-469.

98. Z.-X. Zheng, J.-M. Lin, F. Qu. Chiral separation of underivatized and dansyl amino acids by ligand-exchange micellar electrokinetic capillary chromatography using a copper(II)-L-valine complex as selector // J. Chromatogr. A. 2003. 1007. P. 189-196.

99. J. Liu, K. A. Cobb, M. Novotny. Separation of precolumn ortho-phthalaldehyde-derivatized amino acids by capillary zone electrophoresis with normal and micellar solutions in the presence of organic modifiers // J. Chromatog. A. 1989. 468. P. 55-65.

100. K.C. Chan, G.M. Janini, G.M. Muschik, H.J. Issaq. Laser-induced fluorescence detection of 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatized amino acids in capillary electrophoresis // J. Chromatog. A. 1993. 653. P. 93-97.

101. M.R. Stuart, L.S. Chou, B.C. Weimer. Influence of carbohydrate starvation and arginine on culturability and amino acid utilization of lactococcus lactis subsp. Lactis //Appl. Environ. Microbiol. 1999. 65. P. 665-673.

102. M. Strickland, B.C. Weimer, J.R. Broadbent. Capillary electrophoresis of Cheddar cheese // J. Chromatogr. A. 1996. 731. P. 305-313.

103. A.R. Ivanov, I.V. Nazimov, A.P. Lobazov, G.B. Popkovich. Direct determination of amino acids and carbohydrates by high-performance capillary electrophoresis with refractometric detection // J. Chromatogr. A. 2000. 894. P. 253-257.

104. R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn. Capillary Electrophoresis : principles and Practice. Berlin: Springer, 1993. 378 P.

105. J. Romano, P. Jandik, W.R. Jones, P.E. Jackson. Optimization of inorganic capillary electrophoresis for the analysis of anionic solutes in real samples // J. Chromatogr. 1991. 546. P. 411-421.

106. A.G. Diress, C.A. Lucy. Study of the selectivity of inorganic anions in hydro-organic solvents using indirect capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 2005. 1085. P. 155-163.

107. B.F. Kenney. Determination of organic acids in food samples by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. 1991. 546. P. 423-430.

108. W.R. Jones, P. Jandik.Various approaches to analysis of difficult sample matrices of anions using capillary ion electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1992. 608. P. 385-393.

109. M.C. Breadmore, P.R. Haddad, J.S. Fritz. Optimisation of the separation of anions by ion chromatography-capillary electrophoresis using indirect UV detection // J. Chromatogr. A. 2001. 920. P. 31-40.

110. G.J.M. Bruin, A.C. Asten, X. Xu, FI. Poppe. Theoretical and experimental aspects of indirect detection in capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1992. 608. P. 97-107.

111. Y.-H. Lee, T.-I. Lin. Capillary electrophoretic determination of amino acids with indirect absorbance detection // J. Chromatogr. A. 1994. 680. P. 287-297.

112. T. Soga, G.A. Ross. Simultaneous determination of inorganic anions, organic acids, amino acids and carbohydrates by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1999. 837. P. 231-239.

113. Waters Accq-Tag Chemistry Package Instruction Manual.

114. M. Крейчи, Я. Паюрек, P. Комерс. Вычисления и величины в сорбционной колоночной хроматографии. М.: Мир, 1993. 208 с.

115. А.В. Киселев, Д.П. Пошкус, Я.И. Яшин. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия, 1986. 272 с.

116. R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn. Capillary electrophoresis: principles and practice. Berlin: Springer-Ver lag, 1993. 375 P.

117. Д.А. Вяхирев, А.Ф. Шушунова. Руководство по газовой хроматографии. М.: Высшая школа, 1987. 335 с.

118. В.Д. Шатц, О.В. Сахарова. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатне, 1988. 390 с.

119. С. Horvath, W. Melander, I. Molnar. Solvophobic interactions in liquid chromatography with nonpolar stationary phases // J. Chromatogr. A. 1976. 125. P. 129-156.

120. R. Kaliszan. HPLC as a source of information about chemical structure of solutes // High performance liquid chromatography. Ed. By P.R. Brown, R.A. Hartwick. Wiley, 1989. 98. P. 563-599.

121. О.Б. Рудаков. Растворитель как средство управления процессом в жидкостной хроматографии. Воронеж, 2003. 300 с.

122. С.Н. Ланин. Адсорбционные модели удерживания в жидкостной хроматографии // 100 лет хроматографии. Ред. Б.А. Руденко. М.: Наука, 2003. С. 407-438.

123. С.Н. Ланин, Н.А. Ланина, Ю.С. Никитин. Влияние ассоциации молекул сорбата и модификатора в подвижной фазе на удерживание в высокоэффективной жидкостной хроматографии // ЖФХ. 1995. 69. С. 2045-2051.

124. А.Г. Харитонова, А.В. Буланова, В.А. Осянин, О.Г. Ларионов. Исследование удерживания азотсодержащих гетероциклических соединений в условиях ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2005. Т. 5. №3. С. 290-295.

125. О.Б. Григорьева, С.В. Курбатова, О.Г. Ларионов, М.Н. Земцова. Связь строения замещенных цинхониновых кислот с их удерживанием в условиях обращенно-фазового варианта ВЭЖХ // ЖФХ. 2002. Т. 76. №5. С. 927-931.

126. S.F. Donovan, М.С. Pescatore. Method for measuring the logarithm of the octanol-water partition coefficient by using short octadecyl-poly(vinyl alcohol) high-performance liquid chromatography columns // J. Chromatogr. A. 2002. 952. P.47 61.

127. T. Baczek, R. Kaliszan, K. Novotna, P. Jandera. Comparative characteristic of HPLC columns based on quantitative structure-retention relationships (QSRR) and hydrophobic-subtraction model // J. Chromatogr. A. 2005. 1075. P. 109 115.

128. N.E1. Tayar, R.S. Tsai, P.A. Carrupt, B.Testa. Octan-l-ol-water partition coefficients of zwitterionic a-amino acids. J.Chem. soc., Perkin Trans II, 1992. 1. P. 79-84.

129. V. Pliska, M. Schmidt, J.L. Fauchere. Partition coefficients of amino acids and hydrophobic parameters n of their side-chains as measured by thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1981. 216. P. 79-92.

130. M. Przybyciel, R. Majors. Phase collapse in reversed-phase liquid chromatography // LCGC. 2002. 20. P. 516 523.

131. R. Majors, M. Przybyciel. Columns for reversed-phase LC separations in highly aqueous mobile phases // LCGC. 2002. 20. P! 2 -7.

132. W. Melander, J. Stoveken, C. Horvath. Stationary phase effects in reversed-phase chromatography // J. Chromatogr. 1980. 199. P.35 56.

133. J.J. Gilroy, J.W. Dolan, L.R. Snyder. Column selectivity in reversed-phase liquid chromatography IV. Type-B alkyl-silica columns // J. Chromatogr. A. 2003. 1000. P.757 778.

134. N.S. Wilson, J. Gilroy, J.W. Dolan, L.R. Snyder. Column selectivity inreversed-phase liquid chromatography VI. Columns with embedded or end-capping polar groups // J. Chromatogr. A. 2004. 1026. P.91 -100.

135. M.R. Euerby, P. Petersson. Chromatographic classification and comparison of commercially available reversed-phase liquid chromatographic columns using principal component analysis // J. Chromatogr. A. 2003. 994. P.13-36.

136. J. Layne. Characterization and comparison of the chromatographic performance of conventional, polar-embedded, and polar-endcapped reversed-phase liquid chromatography stationary phases // J. Chromatogr. A. 2002. 957. P. 149-164.

137. П. Схунмакерс. Оптимизация селективности в хроматографии. М.: Мир, 1989. 399 с.

138. R. LoBrutto, A. Jones, Y.V. Kazakevich, Н.М. McNair. Effect of the eluent pH and acidic modifiers in high-performance liquid chromatography retention of basic analytes // J. Chromatogr. A. 913. 2001. P. 173-187.

139. И.М. Коренман. Экстракция в анализе органических веществ. М.: Химия, 1977. 200 с.

140. А. Альберт, Е. Сержент. Константы ионизации кислот и оснований. М.: Химия, 1964. 180 с.

141. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник Биохимика. М.: Мир, 1991. 544 с.

142. F. Gritti, G. Guiochon. Role of the buffer in retention and adsorption mechanism of ionic species in reversed-phase liquid chromatography I. Analytical and overloaded band profiles on Kromasil-C18 // J. Chromatogr. A. 2004. 1038. P. 53-66.

143. A.B. Киселев. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции и хроматографии. М.: Высшая школа, 1986. 360 с.

144. Т. Baczek, R. Kaliszan. Predictive approaches to gradient retention based on analyte structural descriptors from calculation chemistry // J. Chromatogr. A. 2003. 987. P.29 37.

145. M.T. Ackermans, F.M. Everaerts, J.L. Beckers. Quantitative analysis in capillary zone electrophoresis with conductivity and indirect UV detection // J. Chromatogr. 1991. 549. P. 345-355.

146. G.M. Janini, K.C. Chan, J.A. Barnes, G.M. Muschik, H.J. Issaq. Separation of pyridinecarboxylic acid isomers and related compounds by capillary zone electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1993. 653. P. 321-327.

147. D. Martinez, J. Farre, F. Borrull, M. Calull, J. Ruana, A. Colom. capillary zone electrophoresis with indirect UV detection of haloacetic acids in water// J. Chromatogr. A. 1998. 808. P. 229-236.

148. M. Willetts, P. Clarkson, M. Cooke. The use of capillary zone electrophoresis to determine lactate, pyruvate and other organic acids in neonatal urine// Chromatographia. 1996. 43. P.671-674.

149. J.Vindevogel and P. Sandra. Simultaneous pH and ionic strength effects and buffer selection in capillary electrophoretic techniques // J.Chromatogr. A. 541. 1991. P. 483-488.

150. P. G. Muijselaar, K. Otsuka and S. Terabe. Micelles as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. 780. P. 41-61.

151. C.-E. Lin, T.-Z. Wang, T.-C. Chiu, C.-C. Hsuch. Determination of critical micelle concentration of cationic surfactants by capillary electrophoresis // J. High Resol. Chromatogr. 1999. 22. P. 265 270.

152. M.A. Hayes, A.G. Ewing. Electroosmotic Flow Control and Monitoring with an Applied Radial Voltage for Capillary Zone Electrophoresis//Anal. Chem. 1992. 64. P. 512-516.

153. K.D. Altria. Capillary electrophoresis guidebook. Methods in molecular biology. 52. New Jersey: Humana Press Inc., 1996. 349 P.

154. A.E. Новикова, O.C. Анисимова, К.Ф. Турчин, C.A. Фомина, М.Г. Лунц, Е.В. Дегтерев. Идентификация и анализ у-аминомасляной кислоты в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов // Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т.39.№4. С.47-52.

155. С.А. Фомина, А.Е. Новикова, М.Г. Лунц, М.М. Гусятинер. Способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) // Патент РФ № 2241036. Опубликован 27.11.2004. Бюл. № 33.

156. Н. Jakubowski, Е. Goldman. Editing of Errors in Selection of Amino Acids for Protein Synthesis // Microbiol. Rev. 1992. 56. P.412-429.

157. M.M. Gusyatiner, E.B. Voroshilova, Y.G. Rostova, L.V. Ivanovskaya, M.G. Lunts, E.M. Khourges. Method for producing L-leucine. Патент US 20040091980. Опубликован 13.05.2004.

158. Y. Sauvaire, P. Petit, С. Broca, M. Manteghetti, Y. Baissac, J. Fernandez-Alvarez, R. Gross, M. Roye, A. Leconte, R. Gomis, G. Ribes. 4-Hydroxyisoleucine: a novel amino acid potentiator of insulin secretion // Diabetes. 1998. V.47. P.206-210.

159. L. Fowden, H.M. Pratt, A. Smith. 4-Hydroxyisoleucine from seed of Trigonella foenum greacum L. // Phytochemistry. 1973. V.12. P. 17071711.

160. C. Haefel, C. Bonfils, Y.Sauvaire. Characterization of a dioxygenase from Trigonella foenum-graecum involved in 4-hydroxyisoleucine biosynthesis // Phytochem. 1997. 44. P. 563-566.

161. C. Broca, M. Manteghetti, R. Gross, Y. Baissac, M. Jacob, P. Petit, Y. Sauvaire, G. Ribes. 4-Hydroxyisoleucine: effects of synthetic and natural analogues on insulin secretion // Eur. J. Pharmacol. 2000. 390. P. 339-345.

162. J.R. Pollard, D. Rialland, T.D.H. Bugg. Substrate selectivity and biochemical properties of HKP aldolase from E.coli // Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64. P. 4093-4094.

163. C.B. Смирнов, H.H. Самсонова, А.Е. Новикова, Н.Г. Матросов, Н.Ю. Рушкевич, JI.P. Птицын, К. Мацуи, Т. Кодера. Способ ферментативного получения 4-гидроксиизолейцина // Патентная заявка РФ № 2005127811. Опубликована 20.03.2007. Бюл. № 8.

164. D'Ari R., Casadesus J. Underground metabolism// BioEssays. 1998. 20. P.181-186.

165. C.W. Tabor, H. Tabor. Polyamines in microorganisms // Microbiol. Rev. 1985. 49. P.81-99.

166. A.E. Новикова, A.B. Колоколова, A.K. Буряк. Идентификация полиаминов методом ВЭЖХ/МС в культуральных жидкостях штаммов Escherichia coli // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7. №1. С.66-77.

167. N.N. Samsonova, S.V. Smirnov, A.E. Novikova, L.R. Ptitsyn. Identification of Escherichia coli K12 YdcW protein as a y-aminobutyraldehyde dehydrogenase // FEBS Letters. 2005. V. 579. P.4107-4112.