автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании физико-химических свойств кумаринов, фурокумаринов и их комплексов с переходными металлами

СЕМЕНИСТАЯ ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КУМАРИНОВ, ФУРОКУМАРИНОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ПЕРЕХОДНЫМИ МЕТАЛЛАМИ

Специальность 05.11.11 - Хроматография и хроматографические приборы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

003 17БВ13

МОСКВА 2007

003176819

Работа выполнена в Институте физической химии и электрохимии имени А.Н.Фрумкина Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ларионов Олег Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук Сердан Анхель Анхелевич, МГУ им. М.В.Ломоносова доктор химических наук, профессор Ящин Яков Иванович, НПО «Химавтоматика»

Ведущая организация: Институт нефтехимического синтеза имени A.B. Топчиева Российской академии наук

Защита состоится 18 декабря 2007 г. в 15 час. 00 мин. на заседании Совета по защите докторских диссертаций Д 002.259.04 при ИФХЭ РАН по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 31, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина Российской академии наук

Автореферат размещен на сайте Института: http://phyche.ac.ru

Отзывы на автореферат (заверенные печатью) просим высылать по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 31, корп. 4, ИФХЭ РАН ученому секретарю Совета по защите докторских диссертаций Д 002.259.04

Автореферат разослан « » ноября 2007 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских диссертаций Д 002.259.04 кандидат химических наук

Коломиец Л.Н,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В последние годы широкое применение в различных областях биотехнологии, медицины, пищевой и косметической промышленности находят биологически активные соединения Среди них - природные кумарины, обладающие широким спектром лекарственной активности антиоксидантной, противовирусной, антиканцерогенной, антикоагулянтной Перспективность медицинского применения кумаринов стимулирует синтез их разнообразных производных Особый интерес представляют комплексные соединения природных кумаринов с биометаллами Включение природных кумаринов в состав комплексных соединений изменяет их редокс-потенциал и влияет на направление окислительно-восстановительных реакций, которые ответственны за протекторные свойства кумаринов в живых организмах Интенсивно изучаются фотоактивные комплексы кумаринов, способные доставлять активное вещество (лиганд) к биологической цели и высвобождать его при облучении

Для изучения антиоксидантной активности кумаринов и их комплексов моделируют окислительно-восстановительные реакции с их участием методами фотолиза и радиолиза Классические методы анализа, применяющиеся для изучения процессов в модельных системах (вольтамперометрия, адсорбционная спектроскопия спектрофотомерия в видимой и УФ-области), не дают полной информации о свойствах образовавшихся продуктов, природе метаболитов Количественно и качественно характеризовать процессы в растворах комплексных соединений позволяют методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектроскопии Актуальность темы диссертации связана с необходимостью разработки методов ВЭЖХ для изучения физико-химических свойств природных и синтетических кумаринов и их комплексов с биометаллами, анализа продуктов их фото- и радиационно-химических превращений и идентификации в сложных смесях Ранее метод ВЭЖХ не применялся для изучения радиационно-химических превращений комплексных соединений кумаринов

Цель работы: разработка метода ВЭЖХ анализа кумаринов в сложных природных объектах, а также исследование физико-химических свойств кумаринов и их комплексных соединений с ионами переходных биометаллов

В соответствии с поставленной целью определены задачи диссертации

1 Изучить влияние температуры, состава неподвижной фазы и природы элю-ента на удерживание кумаринов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ,

2 Выбрать оптимальные с точки зрения поставленных целей условия разделения и детектирования кумаринов в сложных смесях, получить хроматогра-фические и спектральные характеристики кумаринов,

3 Использовать разработанный ВЭЖХ метод для определения продуктов фото- и радиационно-химических превращений кумаринов и фурокумаринов,

4 Методом ВЭЖХ изучить поведение комплексов кумаринов с переходными металлами при различных рН и режимах элюирования,

5 Используя ОФ ВЭЖХ, изучить реакции металлокомплексов кумаринов в водных и спиртовых растворах при воздействии УФ- и у-облучения,

6 Используя метод ОФ ВЭЖХ с диодно-матричным и электрохимическим детектированием и хроматографическую базу данных фенольных соединений, сравнить состав антиоксидантов экстрактов лекарственных растений Научная новизна определяется совокупностью полученных в работе новых

результатов

1 Выбраны оптимальные для решения поставленных задач условия хромато-графического разделения и детектирования природных и синтетических кумаринов в сложных смесях Определены индексы удерживания (ИУ) и характеристики оптического поглощения 25 природных и синтетических кумаринов

2 С использованием хроматографической базы данных проведена групповая идентификация продуктов фото- и радиационно-химических превращений кумарина, 4-гидрокси-З-нитрозокумарина, 4-гидроксикумарина, 4-метил-5,7-дигидроксикумарина, 4-метилэскулетина, 8-нитрозоэскулетина, эскулетина, псоралена, 8-метоксипсоралена

3 Исследовано влияние условий ВЭЖХ анализа (рН среды, присутствия воды в элюенте, природы кислоты, использующейся для регулирования рН) на стабильность и состав металлокомплексов кумаринов

4 Методом ОФ ВЭЖХ впервые изучены фото- и радиационно-химические превращения комплексов кумаринов с ванадием (IV) и хромом (III) Установлено, что УФ-облучение вызывает образование метастабильных продуктов деградации комплексов, у-излучение инициирует превращения во внешней сфере комплекса (сольватация, образование комплексов с молекулярным кислородом) Исследовано влияние условий хранения облученных растворов и природы иона металла на скорость деградации металлокомплексов в пострадиационный период

5 Проведена групповая идентификация природных фенольных соединений в водно-спиртовых экстрактах ромашки, шалфея, мяты, душицы, клевера, тархуна, подорожника, сельдерея, цикория, базилика, алоэ и пропиленгликоле-вых экстрактах ромашки, шалфея, мяты, душицы

Практическая значимость:

• Полученные хроматографические и спектральные характеристики природных и синтетических кумаринов дополнили существующую базу данных фенольных соединений, которая может быть использована при разработке методов разделения и идентификации фенольных соединений в сложных смесях

• Разработан метод исследования фото- и рационно-химической стабильности металлокомплексов кумаринов с использованием ОФ ВЭЖХ Метод может использоваться для прогнозирования поведения кумаринов и их металлокомплексов (как и других фенольных соединении и их комплексов) в биологических средах, а также при выборе оптимальных фенольных антиоксидантов в медицине, биотехнологии и промышленности

• С использованием диодно-матричного и амперометрического детектора проведен качественный и количественный анализ состава фенольных фракций экстрактов лекарственных растений Показано, что антиоксидантная активность экстрактов сложным образом зависит от природы, количества и механизма действия природных биологически активных соединений

На защиту выносятся следующие положения:

• выбор условий хроматографического разделения и детектирования 25 синтетических и природных кумаринов и фурокумаринов,

• изучение методом ОФ ВЭЖХ влияния структуры молекул на фото- и ра-диационно-химическую стабильность кумаринов, фурокумаринов и их комплексов с переходными металлами,

• изучение методом ОФ ВЭЖХ физико-химические свойств металлоком-плексов кумаринов (устойчивость, комплексообразование, поведение в различных условиях элюирования),

• сравнение качественного и количественного состава антиоксидантов в растительных экстрактах методом ОФ - ВЭЖХ с диодно-матричным и электрохимическим детектированием

Публикации: По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи и 9 тезисов докладов

Результаты диссертации доложены на II Всероссийской конференции по аналитической химии (Краснодар, 7-12 октября, 2007), 31th International symposium "HPLC 2007" (Ghent, June 17-22, 2007), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (Москва- Клязьма, 23-27 апреля 2007), International Congress on analytical Sciences «ICAS-2006» (Moscow, Russia, June 25-30, 2006), X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва - Клязьма, 24-28 апреля, 2006), International Conférence "Physical-chemical foundations of new technologies of XXI century" (Moscow, Russia, May 30-June 4, 2005), Первом международном конгрессе молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-2005" (Москва, 26-28 октября, 2005), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии Применение в нефтехимии» (Самара, 3-8 июля, 2005), IV Баховской конференции по радиационной химии (Москва, 1-3 июня, 2005)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы (163 наименований) и 3-х приложений Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 7 таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цели и задачи, отражены научная новизна и практическая значимость работы

Обзор литературы обобщает информацию по классификации, применению кумаринов, определения их в различных объектах хроматографическими методами, анализируются данные по применению ВЭЖХ в исследованиях продуктов фотолиза и радиолиза органических и металлоорганических соединений

Экспериментальная часть

Кумарины (табл 1), комплексы хрома (III) с эскулетином и ванадия (IV) с эскулетином и 6-гидрокси-7-нитрозо-4-метилкумарином синтезированы и охарактеризованы д х н Э А Парфеновым (НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им НН Блохина РАМН). Индивидуальность соединений подтверждена данными ТСХ, ИК-спектроскопии и результатами измерения Тпл Фурокумарины были предоставлены к м н Э С Мамедовым (кафедра клинической лабораторной диагностики при РГМУ)

Таблица 1

_Общая формула исследованных производных кумарина_

Кумарины:

Ri = -Н, -ОН, -NH2, -NO, -NO2, -S-C6H5, ноос

w

/У

R2 = -H, -СНз, -ОН, -NH2, -NHC1sH37, -N(C3H8)2j N(iBu)2, -0~N+(Bu)4, -0~Na+, -SN(Bu)4, -S-C6H5,

HO ,0 ,0 H,N о

R3 = -H-OH, R4 = -Н,-OH, Rs = -H,-СНз,-он, NO, R¿ = -H, -NO

Фурокумарины:

R7 = Rs = -H (псорален)

R7 = -OCH3, R« = —H (8-метоксипсорален)

R7= Rg = -OCH3 (5,7-диметоксипсорален)

Вещества вводили в хроматограф в виде растворов в этаноле или ацето-нитриле, объем пробы 5 мкл

Методы исследования. Оборудование ВЭЖХ включало жидкостный хроматограф Agilent 1100 Senes с градиентным насосом и диодно-матричным детектором, амперометрический детектор со стеклоуглеродным электродом (НПО «Химавтоматика», постояннотоковый режим, рабочее напряжение 1200 мВ) Скорость потока элюента 0,3 мл/мин Условия проведения эксперимента представлены в табл 2

Таблица 2

Экспериментальные условия

Цель этапа исследования Колонка Режим элюирования *) Гемпера- гура, Тс,°С

1) Изучение хроматографи-ческого поведения кумари-нов при оптимальных условиях разделения Нурегс!! ОБ Б С18 (100x2 мм, 13 мкм) [ 0-1,25 мин - 10% В, 6,25-6,75 мин -100% В, 8,00-10,00 мин - 10% В 10, 20, 35, 45, 60

7огЬах 8В-РЬепу1 (150x2,15 мкм)

2) Дополнение базы данных, изучение фото- и радиаци-онно-химических превращений кумаринов, анализ экстрактов растений Нуреш1 СЮ 8 С18 (100x2 мм,13 мкм) II 0-3 мин 5% В, 18,00-23,00 мин 100% В, 25 мин 5% В 20

3) Изучение фото- и ра-циационно-химических превращений метал-покомплексов кумаринов гогЬах БВ-СЫ (150x2 мм,15 мкм) градиент I, изократика 15% В 20

** В - ацетонитрил

Удерживание соединений характеризовали индексами удерживания (ИУ), рассчитанными относительно реперных н-алкиларилкетонов, СбН5СОС„Н2„+/ (« = 1-3,5,6)4 Ошибка измерения в трех последовательных опытах 0,12% Кван-товомеханические расчеты проводили в программах НурегСкещ 8 0 и СЬешО^ йсе

Условия у-облучения установка РХМ-у-20 (РХТУ им Д И Менделеева), источник у-излучения Со60, поглощенная доза 0,5 кГр (мощность дозы 0,26±0,01 Гр/с по ферросульфатному дозиметру), стеклянные бюксы (1 мл) Спектры поглощения исходных и облученных растворов записывали на спектрофотометре СФ-2000 в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см2' Условия УФ-облучения лампа ДКШФ-500, световой фильтром ЖС-11 (X (пропускания) = 300-400 нм), мощность лампы 380 Вт, освещенность кюветы 575 клк (люксометр «ТКА-ПК»), кварцевая кювета3) Дозы облучения 2,85, 5,70, 45,6, 114,0, 228,0, 342,0 кДж/м2 Облучение фурокумаринов УФ-светом области 320-400 нм проводилось в ЦНИЛ РГМУ, в кварцевой кювете (1 мл) при непрерывном перемешивании лампой мощностью 17 Вт Дозы облучения 1,0, 2,0 кДж/м2 Все эксперименты по облучению проводились в присутствие кислорода воздуха и при комнатной температуре

'' Зенкевич И Г , Кочетова М В , Ларионов О Г , Ревина А А Индексы удерживания как наиболее воспроизводимые хроматографические параметры для характеристики фенольных соединений в обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии // Журнал аналитической химии 2005 Т 60 С 734-746

2) у-облучение и спектрофотометрические измерения выполнены аспиранткой РХТУ Антроповой И Г

3) Фотолиз проводили в секторе методов исследования наноразмерных систем ИФХЭ РАН

ИЗУЧЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ПОВЕДЕНИЯ КУМАРИ-НОВ. СОЗДАНИЕ БАЗЫ ДАННЫХ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ КУМАРИНОВ И ФУРОКУМАРИНОВ

Исследованные кумарины принадлежат к различным классам и имеют различную полярность, поэтому для разделения их смеси был выбран градиентный режим ВЭЖХ (Рис.1)

Рис. 1. Хроматограмма смеси кумаринов, колонка Hypersil ODS (3 мкм, 100x2,1 мм), X = 308 нм. ГрадиентИ. Номера пиков соответствуют веществам в табл. 5.

В каждом из классов соединений было достигнуто полное разделение производных. Критические пары были дополнительно исследованы на колонке Zorbax SB - Phenyl. Сравнение факторов удерживания (к), эффективности (Nef) и разрешения проводили на примере разделения модельной смеси кумаринов (табл. 3).

Таблица 3.

Сравнение эффективности колонок Hypersil ODS и Zorbax SB-Phenyl.

№ Название веществ (в порядке элюирова-ния) Hypersil ODS С18 Zorbax SB-Phenyl

k R k R

1 4-гидрокси-З-нитрокумарин 4,69 2,77

2 З-нитро-4-аминоку марин 6,47 4,15

3 7-гидрокси-4-метил кумарин 7,03 0,41 4,40 0,50

4 6-гидрокси-7-нитрозо-4-метилкумарин 7,41 4,49

5 5,7-дигидрокси-4-метилкумарин 7,80 4,66

6 4-метил кумарин 9,37 5,58

7 1,3-бис(3-гндрокси-4-кумаринилтио)пропан 10,77 0,79 6,18 1,17

8 Неизвестная примесь (спектр соединения №7) 11,07 6,41

9 З-бензилтио-4-гидроксику марин 12,94 0,35 7,50 0,77

10 4,7-диметил кумарин 13,14 7,66

11 1,2-бис(4-кумаринилтио)этан 14,68 8,70

12 4-бензилтиокумарин 16,85 9,45

13 4-дипропиламино-З-аминокумарин 18,75 9,78

14 4-диизобутиламино-З-аминокумарин 21,55 10,39

15 3,4-дибензилтиокумарин 22,95 12,44

Примечание табл. 2

к- фактор удерживания, k = (tR - to)/tR,

где ír - время удерживания исследуемого вещества, мин, to - время удерживания несор-бирующегося вещества (KN03) мин, to (Hypersil ODS С18) = 0,90 мин, to (SB-Phenyl) = 1,58 мин,

R - разрешение пиков, R = 1/4 [(fe - t'Ri)/ t'R2] ~^Ncf2 , где t' - исправленное время удерживания, t'R = tR - to

Nef - число эффективных теоретических тарелок (Nef = [k/(l+k)]2N, где N - число теоретических тарелок, N = 5,54(tR/ jx 0 î)2 ^о 5, мин - ширина пика на полувысоте,

Разрешение пиков в интервале 6-14 минут у колонки Zorbax SB-Phenyl выше, вероятно, вследствие неспецифического взаимодействия фенильных групп неподвижной фазы с л-системой кумаринов Это позволило разделить 4-бензилтиокумарин и 4-бензилтио-З-нитрокумарин (R=0,95), 4-бензилтио-З-гидроксикумарин и 4-октадециламино-З-аминокумарин (R=0,89) Не удалось полностью разделить 4,7-диметилкумарин и З-нитро-4-кумаринилтиолят тетра-бутиламмония (R=0,50) Соли 4-гидрокси-З-нитрокумарина в условиях эксперимента гидролизуются и элюируются размытым пиком

Взаимосвязь между структурой и временами удерживания кумаринов отвечает общепринятым положениям о взаимодействии элюатов с неподвижной и подвижной фазами Первыми элюируются более полярные соединения, содержащие гидроксо- и нитрогруппы С введением метальных заместителей растет вклад дисперсионных взаимодействий с неподвижной фазой, времена удерживания увеличиваются Протонирование аминогрупп (при рН=3) дополнительно уменьшает удерживание аминокумаринов Большие времена удерживания тио-кумаринов обусловлены большей молекулярной массой и высокой поляризуемостью молекул (вследствие подвижности электронной пары атома серы)

Соединения с тиофенильной- и гидроксогруппами при двойной связи в положении 3,4 элюировались в виде двойных несимметричных пиков с идентичными спектрами Предполагая существование 3- и 4-гидроксизамещенных кумаринов в виде кето-енольных изомеров, мы смоделировали условия сольватации данных форм (рис 2) (HyperChem 8 0, поле сил ММ+, алгоритм оптимизации геометрии Polak-Ribiere, метод Molecular Dynamic, периодическая ячейка с молекулами воды, 25°С, диполь-дипольные электростатические взаимодействия, радиус взаимодействия > 4 Â) (табл 4)

Рис 2 Схема кето-енольной изомерии 4-бен-зилтио-3-шдроксикумарина (А, В) и 3-бен-зилтио-4-гидроксикумарина (С, D)

Ph-S об уОН PIK Cà с°

sr~ О

А он Ph À В О Cá Ph с

-Г О

Таблица 4

Сравнение энергетических характеристик и ИУ кетонных и енольных _форм тио- и нитро- и нитрозокумаринов___

Соединение Общая энергия, Е, ккал/моль ДЕ, ккал/ моль Диполь-ный момент, ¡я, Б Дц, В ДИУ

4-бензилтио-З-гидроксикумарин енольная форма (А) -1688,60 437,24 97,19 41,53 37

кето-форма (В) -1251,36 55,66

3-бе нзилтио-4-гидроксикумарин енольная форма (С) -1594,76 617,36 103,60 52,66 8

кето-форма (Б) -977,43 50,94

4-гидроксикума-рин енольная форма -1319,79 41,06 94,71 29,71 -

кето-форма -1360,85 65,00

4-гидрокси-З-нитрокумарин енольная форма -1173,84 173,27 41,81 5,75 -

кето-форма -1000,57 47,56

4-гидрокси-З-нитрозокумарин енольная форма -1108,04 39,50 75,80 55,17 -

кето-форма -1068,54 130,97

Данные квантово-мехнических расчетов не противоречат нашей гипотезе если время взаимопревращения изомеров меньше времени удерживания, есть вероятность, что вещество будет элюироваться двойным пиком, причем еноль-ный изомер будет преобладать как энергетически более выгодный Малое различие в энергиях изомеров нитро- и нитрозокумаринов может быть следствием дестабилизирующего действия электроноакцепторных нитрозо- и нитрозамес-тителей Электронодонорный тиофенил, напротив, стабилизирует изомеры

В ходе работы база фенольных соединений была дополнена новыми данными по кумаринам (табл 5) Значения ИУ и спектральные характеристики были получены в условиях градиента, использовавшегося ранее при создании базы (Градиент II) Разрешение пиков при этом несколько ухудшилось, однако сохранилось разделение между кумаринами, принадлежащими к одним классам

Таблица 5

Хроматографические и спектральные характеристики кумаринов

Название Время удерживания, мин ^макс, НМ ИУ, мин

Метил- и гидроксипроизводные

6,7-дигидроксикумарин (эскулетин) 8,50 ± 0,03 226,298,345 662,1±4,5

4-метилэскулетин 9,63 ± 0,02 226,292,343 706,7±3,3

6-гидрокси-4-метилкумарин (6) 10,28 ± 0,02 224,276,339 743,3±3,0

5,7-дигидрокси-4-метилкумарин (9) 10,51 ±0,02 212,256,321 756,5±2,9

7-гидрокси-4-метилкумарин (5) 10,82 ± 0,02 217,294,320 774,0±3,0

4-гидроксикумарин 11,00 ±0,01 217,280,303 782,5±2,3

кумарин 11,13 ±0,01 210,276,310 791,4±2,4

4-метилкумарин (11) 12,01 ±0,06 212,273,310 837,2±3,2

4,7-диметилкумарин (16) 12,50 ±0,01 214,282,314 8б7,0±2,0

Аминопроизводные

N,N' -бис(3 -амино-4-кумаринид)-1,3-диаминопропан(10) 10,97 ± 0,02 222,279,303 782,3±2,9

4-октадециламино-З -аминокумарин (12) 13,00 ±0,02 210,282,317 896,5±2,2

4-дипропиламино-З-аминокумарин (24) 16,71 ±0,03 204,268,326 1221,2±5,2

4-диизобутиламино-З-аминокумарин (25) 18,03 ±0,04 204,270,336 1362,7±8,1

Нитрозо- и нитропроизводные

4-гидрокси-З-нитрокумарин (1) 8,61 ± 0,02 216,242,330 650,8±4,0

З-нитро-4-кумаринолят тетрабути-ламмония (2) 8,61 ±0,01 214,240,330 649,8±2,1

З-нитро-4-кумаринолят натрия (3) 8,63 ± 0,03 212,240,330 652,3±4,0

З-нитро-4-аминокумарин (4) 8,67 ± 0,02 212, 240,330 656,9±2,6

6-гидрокси-7-нитрозо-4-метилкума-рин (7) 10,35 ± 0,02 206,224,276, 346 746,9±2,5

8-нитрозоэскулетин 10,50 ±0,02 214,320,346 755,5±3,0

5,7-дигидрокси-8-нитрозо-4-метилку-марин (8) 10,57 ± 0,04 210,256,322 759,6±2,5

4-гидрокси-З-нитрозокумарин 12,50 ±0,01 215,262,355 866,5±1,7

S-содержащие кумарины

4-бензилтио-З-гидроксикумарин (14) 11,75 ±0,04 12,40 ± 0,03 209,245,326 210,245,326 823,2±3,1 861,1±3,9

1,3-бис(3-гидрокси-4-кумаринил-тио)пропан (15) 13,04 ±0,02 14,31 ±0,05 206,222,310 207,240,313 901,6±2,7 999,5±5,5

З-нитро-4-кумаринилтиолят тетрабу-тиламмония (17) 14,17 ±0,04 14,39 ±0,06 212,290,330 212,290,330 987,2±3,9 1004,6±5,3

3-(2-карбоксифенилтио)-4-гидрокси-кумарин (18) 14,06 ± 0,02 216,290,330 978,3±3,1

З-бензилтио-4-гидроксикумарин ( 19) 14,30 ± 0,02 14,41 ±0,04 208,272,317 997,5±2,4 1005,1 ±3,5

1,2-бис(4-кумаринилтио)этан (20) 15,07 ±0,01 210,284,324 1060,7±3,5

4-бензилтио-З-аминокумарин (21) 15,78 ±0,09 209, 295, 330 1096,1±2,9

4-бензилтиокумарин (22) 15,89 ±0,05 209,240, 327 1138,7±4,3

4-бензилтио-З-нитрокумарин (23) 16,00 ±0,08 209,239,295, 337 1146,8±8,3

3,4-дибензилтиокумарин (26) 18,49 ±0,02 206,251,340 1412,1±15,7

Фурокумарины (псоралены)

Псорален 12,83 ± 0,08 204,245,293, 330 871,5±3,4

8-метоксипсорален (13) 13,04 ±0,12 218,248,301 883,2±3,9

5,8-диметоксипсорален

13,34 ±0,10 [223,269,313 901,0±6,4

Значения ИУ большинства кумаринов в зависимости от структуры и гид-рофильности лежат в диапазоне от 650 до 900 единиц ИУ Вклад функциональных групп в значения ИУ зависит от положения группы в бензольном или пи-роновом кольце Замещение атома водорода —на ОН-группу в 4-м и 5-м положении понижает ИУ на 9—18 ед, -на ОН-группу в 6-м и 7-м положении понижает ИУ на 60-130 ед , -на СНз-группу в 4-е положение повышает ИУ на 48-53 ед , -на СНз-группу в 7-е положение повышает ИУ на 80 ед , -на N0- или ТЧОг-группу в пироновом кольце понижает ИУ на 85-132 ед , -на N0- группу в бензольном кольце понижает ИУ на 3-100 ед

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ФОТОЛИЗА КУМАРИНОВ МЕТОДОМ ОФ ВЭЖХ Для УФ-облучения были выбраны кумарины, проявившие терапевтическую и антиоксидантную активность в предварительных биологических экспериментах Фотолиз проводили под действием света в области 300-400 нм, известной в медицине как "УФ-А" (в комбинации с приемом фурокумаринов используется при лечении кожных заболеваний) Чтобы исключить влияние рН на продукты облучения использовали нейтральные элюенты Об образовании новых продуктов судили по появлению пиков веществ с неизвестными спектрами и новыми временами удерживания по сравнению с хроматограммами необлу-ченных растворов

Облучение кумаринов и фурокумаринов дозами 2,85 и 5.70 кДж/м' На первых стадиях облучения при малых дозах было зафиксировано образование новых продуктов (табл 6)

Таблица 6

Соединение (ИУ; 1тах, нм) Фотопродукты (мощность облучения 380 Вт/м2)

Доза 2,85 кДж/м2 Доза 5,70 кДж/м2

ИУ | Хтах, нм ИУ | А.тах, нм

са и и Кумарин (799,2; 210, 276,310) Фотостабилен

ОН сс£с 4-гидрокси-З -нитрозо-кумарин (873,4; 215, 261,335) 887,6 198,219, 246, 301 892,3 218,247,300

752,7 207,270, 345

он 650,5 206,284 667,5 206, 286

Odo

4-гидроксикумарин (781,3; 217, 270,303)

ОН СН3 674,3 190, 276

АА. 790,2 190, 269

ill L 805,7 204, 249,319 880,1 204,249,319

но^^о^о 4 метил 5,7 - дигид-роксикумарин (762,5; 212,256,321) 864,4 190, 267

884,2 208,256,319 885,4 208, 256,319

907,3 205, 247, 324 908,6 205, 247, 324

1006,1 190, 266

_** 208, 260, 327 - 208, 260, 327

iX 1 654,9 204, 262, 345 657,2 204,262, 345

эскулетин (674,8; 212, 226,255,298,345)

СН, 675,3 190, 276 Новые пики не образу-

773,9 190, 278 ются, пик 4-метилэскуле-

TT i 815,3 190, 267 тин размывается (появля-

но-^АА 835,3 190, 268 ется "горб")

4-метинэскулетин (701,1; 226, 292, 343)

н°хп

нс^^^о^о

8-нитрозоэскулетин (760,5; 214,321, 346) Фотостабилен

ГГГ\ 862,1 218, 248, 301 (пик 8-МОП раздваивается) 859,5 218, 248, 301 (пик 8-МОП раздваивается)

о^-^о 0 993,5 195, 242

ОМе 1150,8 238 1154, 195

8-метоксипсорален 2

(892,5; 218, 248, 301) 1192,8 195,239 1196, 3 195, 238

АГАА Фотопродукты (мощность облучения 17 Вт/м2)

Доза 1 кДж/м2 Доза 2 кДж/м2

901,5 200, 242 849,0 203, 246, 298, 336

псорален (872,6; 204, 857,2 208, 246, 252, 294

245, 299,334) 904,2 212, 246,294

917,1 204, 246, 300, 334

937,6 204; 246; 335

961,9 211; 253; 295

**Расчет ИУ невозможен, так как время удерживания фотопродукта меньше допустимых в алгоритме пределов (800 ед).

При фотолизе могут протекать несколько реакций, продукты которых мы наблюдали в эксперименте: 1) образование димеров по двойной связи гетеро-цикла; 2) присоединение молекул растворителя с раскрытием пиронового цикла; 3) фотодеструкция гетероцикла с участием активных промежуточных частиц, образующихся при облучении; 4) фотоокисление функциональных (в основном метальных) групп; 5) образование цис- и транс-изомерных димеров фу-рокумаринов.

Кумарин и 8-нитрозоэскулетин устойчивы к малым дозам облучения. 4-гидрокси-З-нитрозокумарин деградировал с образованием нового продукта (рис.3). Нитрозокумарины существуют в растворе в виде азодиоксидимеров. При облучении димеры разрушаются с образованием нитроксильных радикалов (N0*) (1), инициирующих дальнейшие реакции превращения по радикальному механизму.

О

+ I Ьу Ь7 И-—К.-ЕЖ) --К.2ЫО + ЫО (1)

I

О

По-видимому, данная реакция имела место в случае 4-гидрокси-З-нитро-зокумарина. Нитроксильный радикал 4-гидрокси-З-нитрозокумарина стабилизируется за счет образования резонансных структур с участием нитрозогруппы, Нитрозогруппа 8-нитрозоэскулетина не вступает в сопряжение с пироновым кольцом, нитроксильный радикал 8-нитрозоэскулетина нестабилен.

Рис. 3. Хроматограммы 4-гидрокси-3-нитрозокума-рина, Х=280 нм: 1 — необ-лученный, 2 - доза 5,70 кДж/м2, 3 - через 40 минут после облучения. На вставке: спектры пиков 4-гидрокси-3-нитрозокума-рина (а) и фотопродукта с 1К=7,78 мин. (б)

200 300 403 (ЯП

/

Рис 4 Хроматограммы 4-гидро-ксикумарина, 1=280 нм 1 - необ-лученный, 2, 3 - облученный дозами 2,85 и 5,70 кДж/м2 На вставке спектры необлученного 4-гидроксикумарина (1) и продукта облучения дозами 2,85 (2) и 5,70

(3) кДж/м2

Фотопродукт 4-гидроксикумарин имеет меньшее время удерживания (рис 4) и Лтах=206, 284 нм, характерные для карбонильной группы Его ИУ близок ИУ гидрокси- и метокси- производных фенольных кислот (кофейная кислота -655,7, сиреневая кислота - 658,0, фенол - 659,3) Это позволяет считать продуктом фотолиза ароматическую структуру, содержащую фенольную и карбонильную группы

Число фотопродуктов (табл 5) кумаринов увеличивается при наличии заместителей в положении 7 Спектры продуктов облучения имеют полосы при Атах в области 250-300 нм и 267-278 нм, что позволяет отнести их к фенольным спиртам, альдегидам или кислотам Наибольшее количество фотопродуктов имеет 5,7-дигидрокси-4-метилэскулетин Образование аналогичных продуктов фотолиза у 4-метилэскулетина и 5,7-дигидрокси-4-метилэскулетина (ИУ 675,3 и 674,3, Хтах= 190 и 267 нм) свидетельствует о сходных механизмах их фотохимических реакций Продукты фотолиза 8-метоксипсоралена с Лшах = 195 и 238 нм (1154,2 и 1150,8 ед ИУ) можно отнести к неароматическим либо циклическим непредельным углеводородам с алкильными заместителями Наибольшее число фотопродуктов имеют метилкумарины Максимальную устойчивость проявляют нитрозопроизводные

При облучении псоралена светом мощностью 380 Вт новые соединения не были обнаружены Уменьшив мощность лампы и дозы (17 Вт, дозы 1,0 кДж/м2 и 2,0 кДж/м2), получили фотопродукты различной полярности Отсутствие данных по спектрам и ИУ возможных фотопродуктов затрудняет идентификацию

Облучение кумаринов и фурокумаринов дозами 46,5 - 342,0 кДж/м' При облучении большими дозами (45,6-342 кДж/м2) новые продукты не обнаружены С ростом дозы облучения площадь и форма соответствующих пиков нелинейно изменялись, времена удерживания уменьшались, однако форма спектра оставалась постоянной (рис 5)

Рис. 5. Хроматограммы 8-метоксипсоралена, А. = 280 нм: необлученный (1), облученный различными дозами УФ-света, кДж/м2: 45,6 (2); 114 (3); 228 (4); 342 (5). На вставке: спектр псо-ралена

о -

12

12.5

13

ггнп

Совпадение спектров оптического поглощения продуктов с исходными кумаринами указывает на минимальные структурные отличия в их молекулах. Рост хроматографиических пиков с увеличением дозы облучения свидетельствует о больших коэффициентах молярной экстинкции фотопродуктов. Вероятно, при больших дозах облучения в структуре фотопродуктов происходят изменения, приводящие к росту оптического поглощения и не затрагивающие основную хромофорную группу: образование двойной связи, сопряженных связей, фодимеризация.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ КУМАРИНОВ С ПЕРЕХОДНЫМИ МЕТАЛЛАМИ И ПРОДУКТОВ ИХ РАДИОЛИЗА И ФОТОЛИЗА

Для изучения физико-химических свойств комплексов кумаринов с металлами, определения продуктов их УФ- и у-облучения были выбраны комплексы кумаринов с Сг (III) и V (IV). В связи со сложностью процессов в растворах комплексов, задача изучения количественных закономерностей не ставилась.

Чтобы уменьшить удерживание и избежать уширения хроматографиических пиков комплексов использовалась колонка с более полярной цианофазой. Химическая стабильность комплексов при контакте с сорбентом подтверждена элюированием на разных скоростях потока элюента (50, 100, 200, 300 мкл/мин). Соотношение площадей пиков комплекса и лигандов оставалось постоянным.

В изократическом режиме элюирования нейтральными элюентами при 5%-м содержании воды в ацетонитриле начинается диссоциация комплексов (при рН элюента = 3 порог повышался до 15%): увеличивались ассиметрия и расщеплении пиков комплексов, площади пиков лигандов. Время удерживания комплексов с ростом содержания воды в элюенте от 0 до 60% увеличивалось

незначительно на 1 минуту) В градиентном режиме анализа при рН=3 большое значение имела природа кислоты При использовании Н3Р04 пик комплекса У(Г/) элюировался с мертвым объемом колонки (рис 6) При замене Н3РО4 на ТФУ комплекса У(1У) увеличивается в 5 раз На хроматограмме видны пики двух различных форм комплекса и обоих лигандов Очевидно,

mAU 4

1600- f

1200- i! I -л б-гидрокси-7 нитрозо-4 метилкумарин

1000800- ¡ITT'7 ,!;i II

600400- ii;> 11 Г;,! эскулетин 1 , »g Я ' v V -

2000- 0 521 >1 168 S1 310 )

0 2 4 6 8 10 mir

mAU

1600-

1400-

1200-

1000800600- 6 гидрокси 7 HVfrp030-4 метилкумарин

400200 ?

0 J ______ --" W.

0 ■} 4 6 8 10 mu

Рис. 6 Хроматограммы водного раствора На[У(езс)2б-гидрокси-7-нитрозо-4-метилкумарин] 2Н20, 1=230 нм градиентное элюирование при подкислении ТФУ (вверху) и нейтральных элюентах (внизу)

Изменение режима элюирования не влияло на поведение комплекса Сг(Ш) При рН 3 он элюировался симметричным пиком с мертвым объемом колонки В нейтральных растворителях, вследствие диссоциации, появлялся дополнительный размытый пик со спектром, отвечающим комплексу (1я=1,22±0,35 мин ) В обоих случаях наблюдался пик лиганда (эскулетина)

Комплексы кумаринов с металлами чувствительны к воздействию света и температуры Диссоциация наблюдалась в водных растворах даже при 5°С, в отсутствие света На хроматограммах водных растворов, хранившихся 2 недели при комнатной температуре, были обнаружены пики новых соединений (рис 7) Новые пики в области элюирования комплекса могут принадлежать дис-социированым и сольватированным формам, а также лабильным комплексам с молекулярным кислородом пЬ гаМеп+ Ю2 (Ь -лиганд, Ме"+ - ион металла) Спиртовые растворы устойчивы при хранении в темноте при 5°С

Высокое содержание ацетонитрила затрудняет разделение возможных фотопродуктов фотолиза и радиолиза комплексов Поэтому в качестве элюента для дальнейших экспериментов был выбран 85% водный ацетонитрил

mAU_ сч ТГ

2000- !i а

1750- |У !

1500- 1 1 |

1250- 1 | ;

1000- ,0 846 1 043 / 1 485 т}- § б

750- о -е ' h ;/ / Ю (О , см » Г эскулетин

500- И, ■N , 1

250- ,i ' / \ t-3v S s ■sr /X

/

о i 4 S

Рис 7 Хроматограммы водного раствора Na[Cr(esc)2] 2Н20, к=210 нм до (а) и после 2-х недель хранения (б) при комнатной температуре Изократическое элюирование, 15% ацетонитрил в воде

В условиях эксперимента возможны дополнительные приемы, улучшающие разделение и форму пиков ионных комплексов применение модификаторов (алифатических аминов) и концентрированных солевых буферов Влияние данных факторов является предметом специального исследования При изучении фото- и радиационно-химических реакций комплексов рН элюента не изменяли с целью исключить дополнительные превращения продуктов облучения

Радиолиз комплексов кумаринов с У(1У) и Cr(IIl) Спиртовые растворы комплексов согласно результатам спектрофотомет-рического анализа были более устойчивы, чем водные их спектры были неизменны Объяснить это можно акцептированием активных радикалов ОН и H молекулами спирта с образованием менее реакционноспособных радикалов СгНдОН , С2Н50 , С2Н5

Изменения в спектрах при радиолизе водных растворов комплексов (доза 0,5 кГр) свидетельствовали о большей устойчивости комплекса Cr (III) в его растворе наблюдается небольшой рост коэффициентов экстинкции, тогда как в спектре комплекса V(IV) полоса поглощения на 400 нм смещается в УФ-область (до 350 нм)

Результаты ВЭЖХ анализа облученных водных растворов коррелировали с данными спектрофотометрии Разрушение пика комплекса V (IV) сопровождалось увеличением площади пиков лигандов и образованием новых соединений (рис 8) О стабильности комплекса Cr (III) свидетельствовала неизменность площадей пиков комплекса и лиганда (эскулетина), время удерживания комплекса изменялось в пределах 1,30±0,37 мин

до облучения

через 3 ч после облучения

через 48 ч после облучения

Рис 8 Хроматограммы водного раствора На[Сг(езс)2] 2Н20, полученные через 48 ч после у-облучения (0,5 кГр) Детектирование при >.=230 нм Изократиче-ское элюирование, 15% ацетонитрила в воде

ВЭЖХ анализ спиртовых растворов металлокомплексов кумаринов в течение 48 часов после облучения подтвердил стабильность раствора комплекса Сг (III) Комплекс У(1У) деградировал с образованием пика эскулетина и одновременным ростом площади пика второго лиганда (рис 9)_

Т до облучения «

Т 6-гвдрокси-7-нитрозо-4-метилкумарин «

II со Агеа=2499

\ со

М___________________>

\ \

I \ — СО

.' V -

через 3 ч после облучения

эскулетан Агеа=3821

через 48 ч после облучения

эскулетин Агеа=4461

К

Й «О О см

уд-

Рис 9 Хроматограммы спиртового раствора Ка[У(е8с)26-гидрокси-7-нит-розо-4-метилкумарин] 2Н20, полученные через 48 ч после у-облучения (0,5 кГр) Детектирование при Х=230 нм Изократическое элюирование, 15% ацето-нитрил в воде На хроматограммах приведена площадь пика 6-гидрокси-7-нит-розо-4-метилкумарина

Фотолиз комплексов кумаринов с У(1У) и Сг(Ш) В предыдущих главах было показано, что только дозы облучения <10 кДж/м2 инициируют фотохимическое образование новых продуктов. УФ-облу-чение комплексов проводили в диапазоне длин волн 300-400 нм (область поглощения комплексов кумаринов) в водных растворах при дозе 2,85 кДж/м2.

Условия хранения облученных растворов имели решающе влияние на протекание фотохимических реакций в облученных растворах. В условиях изоляции от света отмечались небольшие изменения формы и площади пиков комплексов. При хранении облученных растворов на свету эскулетин, входящий в состав обоих комплексов, обратимо трансформировался в метастабильные продукты с большими временами удерживания (время жизни продуктов 24 - 48 ч). Площадь пика 6-гидрокси-7-нитрозо-4-метилкумарина изменялась незначительно. Его стабильность подтвердили данные о фотостабильности нитро-зопроизводных (глава 4.1.1).

Спектры оптического поглощения и времена удерживания продуктов фотолиза комплекса Cr (III) совпали с эскулетином. Спектры фотопродуктов комплекса V(1V) идентифицировать не удалось (Рис. 10). Большие значения времен удерживания позволяют предположить малую полярность соединений и/или высокую молекулярную массу. Возможно, имеет место образование димеров эскулетина.

, до облучения

/

со через 24 ч после облучения

6-гидрокси-7-нитрозо-4 метилкумарин

эскулетин

через 2 ч после облучения

, к М

Рис.10. Хроматограммы водного раствора Ма[У(езс)26-гидрокси-7-нитрозо-4-метилкумарина]-2Н20, полученные через 24 ч после УФ-облучения дозой, равной 2,85 кДж/м2. Детектирование при ^=230 нм. Изократическое элюирование, 15% ацетонитрил в воде.

Полная фотодеградация и образование метастабильных продуктов свидетельствует о большей чувствительности комплексов к УФ-облучению, чем к у-излучению. В обоих случаях водные растворы были менее стабильны, чем спиртовые. По результатам только стационарных методов облучения и определения конечных продуктов нельзя сделать вывод о механизме первичных актов

взаимодействия излучения (УФ- или ионизирующей радиации) с кумаринами и их комплексов с металлами, поскольку в пострадиационный период могут протекать процессы регенерации продуктов превращений, дополнительной деградации не только продуктов, но и исходных молекул. Однако полученные результаты позволяют прогнозировать условия изменения защитных свойств комплексных соединений ванадия (IV) и хрома (III) в биологических средах по отношению к ионизирующему облучению, что ранее уже было доказано для соединений меди, железа, марганца и цинка.

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ (АОА) РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ С ДИОДНО-МАТРИЧНЫМ И АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ Для сравнения состава и АОА экстрактов, полученных при экстракции различными растворителями, были отобраны растения, используемые в медицине, пищевой промышленности и косметологии. Идентификацию проводили по хроматографической базе данных 74 фенольных соединений (ароматические спирты, альдегиды, кислоты, метокси- и ацилированные производные, флава-ноиды и их гликозиды, кумарины, фурокумарины). Полностью установить состав экстрактов не удалось из-за отсутствия всех необходимых стандартов. На основании ИУ и спектральных данных был проведен анализ методом fingerprint («метод отпечатков пальцев») и установлен групповой состав фенольных фракций (рис. 11).

Рис.] 1. Спектры оптического поглощения фенольных соединений, наиболее часто встречавшихся на хроматограммах экстрактов (Хтах, нм): 1 - изофла-воны (196, 260, 300); 2 - гликозиды флавонов и флавонолов (204, 250 (266), 352370); 3 - гликозиды флаванонолов (200, 266, 330-338); 4, 5 - ароматические гид-рокси- и метоксилированные спирты и кислоты (218,236 - 240, 297,320 (327)); 6 - антоцианидины базилика (200, 222, 280-290, 528).

Некоторые фенольные соединения в исследованных экстрактах были обнаружены впервые. Так, в литературе не встречается сообщений о наличии фу-

рокумаринов в крапиве и алоэ. В базилике по наличию максимумов поглощения на 320-350 и 528 нм (ИУ = 719-780) впервые обнаружены антоцианидины.

Состав пропиленгликолевых (ПГ) и водно-спиртовых экстрактов сравнивали на качественном уровне. Максимальное извлечение фенольной фракции достигается при использовании ПГ. Однако ПГ извлекает большее количество органических веществ матрицы, что создает сильный фон. 50%-ые спиртовые экстракты содержат больше разнообразных фенольных соединений, чем ПГ экстракты

Большинство фенольных соединений в составе фракций детектируется на амперометрическом детекторе (АД). Мы попытались установить корреляцию между величиной сигнала АД и УФ-детектора (на 280, 308 и 346 нм - длины волн, наиболее часто используемые для определения природных фенольных соединений). Провести линейную зависимость между откликом АД и УФ, обобщив данные всех исследованных экстрактов, не удалось. Максимальное значение коэффициентов корреляции линейной зависимости наблюдалось для экстрактов свежих растений - 0,92 для Х=346 нм (рис. 12).

Суммарная площадь пиков

140000

# # ^ ¿г» л?

.г^4 .с^4 .г^4

Рис.12. Сумма площадей пиков фенольных фракций экстрактов: базилик - клевер - свежие растения, «этанол 50%» - экстракты сухих лекарственных сборов. АД - Амперометрический детектор, нА/мин; УФ-детектор, мАЕ/мин.

Данные амперометрического детектирования подтверждают высокий ан-тиоксидантный потенциал природных фенольных антиоксидантов и свидетельствуют о сложном характере зависимости антиоксидантной активности от состава экстрактов растений. Нахождение корреляций между содержанием и раз-

I "1

нообразием фенольных фракций, многообразием механизмов антиоксидантной защиты индивидуальных соединений и их комплексов с микроэлементами требует дополнительных параллельных медицинских исследований для рекомендаций растительных экстрактов в виде пищевых добавок и медицинских препаратов

ВЫВОДЫ

1 Впервые проведено хроматографическое разделение и идентификация природных и синтетических кумаринов различных классов (метил-, гидрокси, амино-, тио-, нитро- и нитрозопроизводные)

2 Спектры поглощения и ИУ исследованных кумаринов включены в созданную ранее базу соединений фенольной природы

3 Хроматографически исследованы реакции фотолиза растворов кумаринов и фурокумаринов С использованием хроматографической базы данных проведена групповая идентификация фотопродуктов

4 Изучено влияние pH и режимов элюирования на хроматографическое поведение металлокомплексов кумаринов

5 Методом ОФ ВЭЖХ изучены фото- и радиационно-химические реакции в растворах металлокомплексов кумаринов Показано, что гамма-излучение инициирует процессы диссоциации, сольватации и образование новых комплексов УФ-облучение вызывает разрушение комплексов, трансформации лигандов и образование метастабильных продуктов Стабильность комплексов зависит от природы растворителя и фотостабильности лиганда

6 С использованием разработанной хроматографической базы данных установлен групповой состав фенольных фракций экстрактов лекарственных и пищевых растений (пропиленгликолевых, водно-спиртовых, спиртовых) Антиок-сидантная активность экстрактов в наибольшей степени определяется веществами с максимумом поглощения в области 340-350 нм (флавоноиды и их гли-козиды)

Основные результаты диссертаиии изложены в следующих публикаииях

1 Семенистая Е Н, Ларионов О Г , Антропова И Г, Ревина А А Изучение стабильности и фото- и радиационно-химических реакций комплексов кумаринов с переходными металлами методом ВЭЖХ // Сорбционные и хроматогра-фические процессы 2007 Т 7 С 733-740

2 Кочетова М В , Семенистая Е Н , Ларионов О Г , Ревина А А Определение биологически активных соединений фенольной и полифенольной природы в различных объектах методами хроматографии // Успехи химии 2007 Т 76 №1 С 88-100

3 Ларионов О Г, Ревина А А , Парфенов Э А , Толкачев О Н , Семенистая ЕН Исследование хроматографического поведения кумаринов методом ОФ ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы 2006 Т 6 С 250-258

4 Ларионов О Г , Ревина А А , Семенистая Е Н , Парфенов Э А Хроматография синтетических кумаринов // Сорбционные и хроматографические процессы 2006 Т 6 С 44-54

5 Семенистая Е Н, Ларионов О Г , Антропова И Г , Ревина А А Изучение фото- и радиационно-химических превращений кумаринов и их комплексов с

переходными металлами методом ВЭЖХ // II Всероссийская конференция по аналитической химии, Краснодар, 7-12 октября, 2007 г

6 Semenistaya Е N , Larionov О G, Kolomiets L N, Antropova I G , Revma A A. Coumarms and coumarm-metall complexes HPLC investigation of photo- and radio-chemical reactions // Proceedings of the 31th International symposium "HPLC 2007", Ghent, June 17-22, 2007 P 612

7 Семенистая E H, Ларионов О Г, Антропова И Г ,Ревина А А Изучение фото- и радиационно-химических комплексов кумаринов с переходными металлами методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сборник тезисов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях», Москва- Клязьма, 23 - 27 апреля 2007 г №49

8 Семенистая Е Н, Абламонова Е В , Ларионов О Г , Мамедов И С , Ревина А А Исследование фотолитических реакций кумаринов и фурокумаринов методом ОФ ВЭЖХ // International Congress on analytical Sciences, ICAS-2006 Moscow, Russia, June 25 - 30,2006 V I P 203-204

9 Semenistaya E N , Larionov О G , Parfenov E A Synthetic coumarms retention parameters in reversed-phase high-performance liquid chromatography // Сборник тезисов X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва - Клязьма, 24-28 апреля, 2006 С 340

10 Semenistaya Е N , Antropova I G , Parfenov Е А , Larionov О G , Revma А А High-pressure liquid chromatography method for investigation of chemical-radiation stability of coumarms // Abstr "Physical-chemical foundations of new technologies of XXI century" International Conference Moscow, Russia, May 30 - June 4, 2005 VHP 174

11 Антропова И Г , Семенистая Е Н , Фенин А А, Ревина А А Влияние структуры на радиационно-химические превращения молекул кумаринов Спектральные и хроматографические исследования // Первый международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-2005", Москва, 26-28 октября 2005

12 Семенистая Е Н, Ларионов О Г , Ревина А А, Парфенов Э А , Толкачев О Н Исследование хроматографического поведения кумаринов методом ОФ ВЭЖХ // Сборник тезисов Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии Применение в нефтехимии» Самара 3 - 8 июля 2005 С 180

13 Антропова И Г , Семенистая Е Н , Ревина А А Спектральное и хромато-графическое исследование продуктов радиолиза кумаринов // IV Баховская конференция по радиационной химии, Москва, 1-3 июня 2005 г

Заказ № 92/11/07 Подписано в печать 13.10.2007 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Общая характеристика соединений класса кумаринов.

1.1.1. Природные кумарины. Структура, классификация

1.1.2. Использование в медицине

1.1.3. Хроматографическое определение кумаринов в различных объектах.

1.1.3.1. Определение кумаринов в растительном материале.

1.1.3.2. Определение кумаринов в биологических образцах методом ВЭЖХ

1.2. Возможности метода ВЭЖХ для изучения фото- и радиационно-химических реакций фенольных соединений.

1.2.1. Использование ВЭЖХ для изучения фото- и радиационно-химических реакций

1.2.2. Использование ВЭЖХ для изучения фото- и радиационно-химических реакций кумаринов

1.2.3. Возможности метода ВЭЖХ для изучения фото- и радиационнохимических реакций металлокомплексов.

Выводы главы 1.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Растворы, реагенты, объекты исследования.

2.2. Характеристика хроматографического оборудования и условий эксперимента.

2.3. Методики экспериментов.

2.3.1. Радиационное облучение

2.3.2. Облучение ультрафиолетовым светом

2.3.3. Экстракция фенольной фракции растений

ГЛАВА 3. СОЗДАНИЕ БАЗЫ ДАННЫХ ПРИРОДНЫХ И

СИНТЕТИЧЕСКИХ КУМАРИНОВ И ФУРОКУМАРИНОВ.

3.1. Анализ смеси синтетических кумаринов в условиях ОФ ВЭЖХ.

3.1.1. Выбор оптимальных условий разделения и идентификации смеси синтетических кумаринов

3.1.2. Влияние температуры и природы элюента на устойчивость кумаринов

3.1.3. Зависимость хроматографического поведения кумаринов от структуры веществ.

3.1.3. 1. Компьютерное моделирование кето-енольной изомерии 3(4)-гидроксикумаринов.

3.2. Создание базы данных синтетических и природных кумаринов.

3.3. Выводы главы 3.

ГЛАВА 4. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ФОТОЛИЗА И РАДИОЛИЗА КУМАРИНОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С

ПЕРЕХОДНЫМИ МЕТАЛЛАМИ МЕТОДОМ ОФ ВЭЖХ.

4.1. Хроматографическое исследование продуктов фотохимических реакций кумаринов и фурокумаринов.

4.1.1. Облучение кумаринов и фурокумаринов дозами 2,85 и 5,70 кДж/м2.

4.1.2. Облучение кумаринов и фурокумаринов дозами 45,6 - 342 кДж/м .69 4.2. Спектрофотометрическое и хроматографическое исследование продуктов радиолиза и фотолиза комплексов кумаринов с переходными металлами.

4.2.1. Влияние условий хранения и рН элюента и режима элюирования на комплексы кумаринов с У(1У) и Сг(Ш)

4.2.2. Спектрофотометрическое и хроматографическое исследование устойчивости комплексов кумаринов с У(1У) и Сг(Ш) при у-облучении.

4.2.3. Хроматографическое исследование поведения комплексов кумаринов при УФ-облучении

4.3. Выводы главы 4.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

С УФ- И АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ.

ВЫВОДЫ.

В последние годы широкое применение в различных областях биотехнологии, медицины, пищевой и косметической промышленности находят биологически активные соединения (БАС). Они являются основой для многих лекарственных препаратов и биологически активных добавок, привлекают внимание разработчиков антиоксидантов. Для рационального использования биологически активных соединений необходимы эффективные методы изучения их метаболитов и продуктов воздействия рН (УФ-, радиационного излучение и т.д.), процессов взаимодействия с биологическими средами и взаимовлияния на клеточном уровне. Это особенно актуально для фенольных соединений и их комплексов с переходными металлами, способных проявлять свойства прооксидантов и антиоксидантов в зависимости от условий среды и внешних стрессовых факторов. Одним из методов исследования сложных смесей органических и неорганических соединений является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Целью данной работы была разработка методов ВЭЖХ анализа кума-ринов в сложных природных объектах и исследования физико-химических свойств кумаринов и их комплексных соединений с ионами переходных биометаллов. Метод ВЭЖХ не применялся ранее для изучения радиационно-химических превращений комплексных соединений кумаринов. Потенциал и возможности хроматографического анализа, по нашему мнению, в подобных исследованиях раскрыт не полностью.

Актуальность темы.

Природные кумарины, как многие фенольные соединения, обладают широким спектром лекарственной активности: антиоксидантной, противовирусной, антибактерицидной, антиканцерогенной, антикоагулянтной. Они занимают важное место при разработке физиологически совместимых антиоксидантов (ФСАО). ФСАО представляют собой минорные метаболиты природных антиоксидантов, образующихся в экстремальных и патологических ситуациях, и играют важную роль сопрягающих факторов при мобилизации защитных систем организма на всех уровнях его биологической организации.

Перспективность медицинского применения кумаринов стимулирует синтез их разнообразных производных. Актуальность темы диссертации связана с необходимостью в связи с этим изучения их физико-химических свойств, поведения в биологических средах, устойчивости и разработки методов анализа и идентификации в сложных смесях.

Особый интерес представляют комплексные соединения природных кумаринов с переходными металлами. Включение природных антиоксидан-тов в состав комплексных соединений является эффективным инструментом воздействия на их редокс-потенциал и, следовательно, на редокс-потенциал живой клетки, с которой эти агенты взаимодействуют. Методы фотолиза и радиолиза позволяют моделировать окислительно-восстановительные реакции комплексов металлов с органическими лигандами и прогнозировать таким образом их антиоксидантные свойства. Однако классические методы анализа, применяющиеся затем к модельным системам (спектрофотомерия, вольтамперометрия, абсорбционная спектроскопия в видимой и УФ-области) не дают полной информации о свойствах образовавшихся продуктов, метаболитов, различных форм комплексов при совместном присутствии. Количественно и качественно характеризовать разнообразные процессы в растворах комплексных соединений позволяют ВЭЖХ и масс-спектроскопии. Информация о фото- и радиационно-химических реакциям кумаринов и их комплексов с металлами крайне ограничена. Метод ВЭЖХ для их исследования ранее не применялся Это делает актуальным разработку метода ВЭЖХ -анализа фото- и радиационно-химических реакций природных и синтетических кумаринов, их метаболитов и комплексов с металлами.

Цель работы; разработка метода ВЭЖХ анализа кумаринов в сложных природных объектах, а также исследование физико-химических свойств кумаринов и их комплексных соединений с ионами переходных металлов. В соответствии с поставленной целью определены задачи диссертации:

1. Изучить влияние температуры, состава неподвижной фазы и природы элюента на удерживание кумаринов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ;

2. Выбрать оптимальные с точки зрения поставленных целей условия разделения и детектирования кумаринов в сложных смесях, получить хроматогра-фические и спектральные характеристики кумаринов;

3. Использовать разработанный ВЭЖХ метод для определения продуктов фото- и радиационно-химических превращений кумаринов и фурокумаринов;

4. Методом ВЭЖХ изучить поведение комплексов кумаринов с переходными металлами при различных рН и режимах элюирования;

5. Используя ОФ ВЭЖХ, изучить реакции металлокомплексов кумаринов в водных и спиртовых растворах при воздействии УФ- и у-облучения;

6. Используя метод ОФ ВЭЖХ с диодно-матричным и электрохимическим детектированием и хроматографическую базу данных фенольных соединений, сравнить состав антиоксидантов экстрактов лекарственных растений.

Научная новизна определяется совокупностью полученных в работе новых результатов:

• Выбраны оптимальные для решения поставленных задач условия хромато-графического разделения и детектирования природных и синтетических кумаринов в сложных смесях. Определены индексы удерживания (РТУ) и характеристики оптического поглощения 25 природных и синтетических кумаринов.

• С использованием хроматографической базы данных проведена групповая идентификация продуктов фото- и радиационно-химических превращений кумарина, 4-гидрокси-З-нитрозокумарина, 4-гидроксикумарина, 4-метил-5,7-дигидроксикумарина, 4-метилэскулетина, 8-нитрозоэскулетина, эскулетина, псоралена, 8- метоксипсоралена.

• Исследовано влияние условий ВЭЖХ анализа (рН среды, присутствия воды в элюенте, природы кислоты, использующейся для регулирования рН) на стабильность и состав металлокомплексов кумаринов.

• Методом ОФ ВЭЖХ впервые были изучены фото- и радиационно-химиче-ские превращения комплексов кумаринов с ванадием (V) и хромом (III). Установлено, что УФ-облучение вызывает образование метастабильных продуктов деградации комплексов; у-излучение инициирует превращения во внешней сфере комплекса (сольватация, образование комплексов с молекулярным кислородом). Исследовано влияние условий хранения облученных растворов и природы иона металла на скорость деградации металлокомплек-сов в пострадиационный период.

• Проведена групповая идентификация природных фенольных соединений в водно-спиртовых экстрактах ромашки, шалфея, мяты, душицы, клевера, тархуна, подорожника, сельдерея, цикория, базилика, алоэ и пропиленгликоле-вых экстрактах ромашки, шалфея, мяты, душицы.

Практическая значимость:

• Полученные хроматографические и спектральные характеристики природных и синтетических кумаринов дополнили существующую базу данных фенольных соединений, которая может быть использована при разработке методов разделения, и идентификации фенольных соединений в сложных смесях.

• Разработан метод исследования фото- и рационно-химической стабильности металлокомплексов кумаринов с использованием ОФ ВЭЖХ. Метод может использоваться для прогнозирования поведения кумаринов и их металлокомплексов (как и других фенольных соединении и их комплексов) в биологических средах, а также при выборе оптимальных фенольных антиок-сидантов в медицине, биотехнологии и промышленности.

• С использованием диодно-матричного и амперометрического детектора проведен качественный и количественный анализ состава фенольных фракций экстрактов лекарственных растений. Показано, что антиоксидантная активность экстрактов сложным образом зависит от природы, количества и механизма действия природных биологически активных соединений.

На защиту выносятся следующие положения:

- выбор условий разделения и детектирования 25 синтетических и природных кумаринов и фурокумаринов, позволяющих включить их в существующую хроматографическую базу данных фенольных соединений;

- изучение методом ОФ ВЭЖХ фото- и радиационно-химической стабильности кумаринов, фурокумаринов и их комплексов с переходными металлами;

- изучение методом ОФ ВЭЖХ физико-химических свойств металло-комплексов кумаринов (устойчивость, комплексообразование, поведение в различных условиях.элюирования);

- сравнение качественного и количественного состава антиоксидантов в растительных экстрактах методом ОФ - ВЭЖХ с диодно-матричным и электрохимическим детектированием.

Апробация работы и публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи и 9 тезисов докладов. Результаты диссертации доложены на II Всероссийской конференции по аналитической химии (Краснодар, 7-12 октября, 2007), 31th International symposium "HPLC 2007" (Ghent, June 17-22, 2007), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (Москва- Клязьма, 23-27 апреля 2007), International Congress on analytical Sciences «ICAS-2006» (Moscow, Russia, June 25-30, 2006), X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва - Клязьма, 24-28 апреля, 2006), International Conference "Physical-chemical foundations of new technologies of XXI century" (Moscow, Russia, May 30-June 4, 2005), Первом международном конгрессе молодых учёных по химии и химической технологии "МКХТ-2005" (Москва, 26-28 октября, 2005), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» (Самара, 3-8 июля, 2005), IV Баховской конференции по радиационной химии (Москва, 1-3 июня, 2005).

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Семенистая E.H., Ларионов О.Г., Антропова И.Г., Ревина A.A. Изучение стабильности и фото- и радиационно-химических реакций комплексов кумаринов с переходными металлами методом ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. С. 733-740.

2. Кочетова М.В., Семенистая E.H., Ларионов О.Г., Ревина A.A. Определение биологически активных соединений фенольной и полифенольной природы в различных объектах методами хроматографии // Успехи химии. 2007. Т.76. №1. С. 88-100.

3. Ларионов О.Г., Ревина A.A., Парфенов Э.А., Толкачев О.Н., Семенистая E.H. Исследование хроматографического поведения кумаринов методом ОФ ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6. С. 250-258.

4. Ларионов О.Г., Ревина A.A., Семенистая E.H., Парфенов Э.А. Хроматография синтетических кумаринов // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6. С. 44-54.

5. Семенистая E.H., Ларионов О.Г., Антропова И.Г., Ревина A.A. Изучение фото- и радиационно-химических превращений кумаринов и их комплексов с переходными металлами методом ВЭЖХ // II Всероссийская конференция по аналитической химии, Краснодар, 7-12 октября, 2007 г.

6. Semenistaya E.N., Larionov O.G., Kolomiets L.N., Antropova I.G., Revina A.A. Coumarins and coumarin-metall complexes: HPLC investigation of photo-and radio-chemical reactions // Proceedings of the 31th International symposium "HPLC 2007", Ghent, June 17-22, 2007. P. 612.

7. Семенистая E.H., Ларионов О.Г., Антропова И.Г.,Ревина A.A. Изучение фото- и радиационно-химических комплексов кумаринов с переходными металлами методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сборник тезисов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях», Москва- Клязьма, 23 - 27 апреля 2007 г. № 49

8. Семенистая Е.Н., Абламонова Е.В., Ларионов О.Г., Мамедов И.С., Ре-вина А.А. Исследование фотолитических реакций кумаринов и фурокума-ринов методом ОФ ВЭЖХ // International Congress on analytical Sciences, ICAS-2006. Moscow, Russia, June 25 - 30, 2006. V.I. P.203-204.

9. Semenistaya E.N., Larionov O.G., Parfenov E.A. Synthetic coiimarins retention parameters in reversed-phase high-performance liquid chromatography // Сборник тезисов. X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии». Москва - Клязьма, 24-28 апреля, 2006. С. 340.

10.Semenistaya E.N., Antropova I.G., Parfenov Е.А., Larionov O.G., Revina А.А. High-pressure liquid chromatography method for investigation of chemical-radiation stability of coumarins // Abstr. "Physical-chemical foundations of new technologies of XXI century" International Conference. Moscow, Russia, May 30 - June 4,2005. V. II. P. 174.

11 .Антропова И.Г., Семенистая E.H., Фенин А.А., Ревина А.А. Влияние структуры на радиационно-химические превращения молекул кумаринов. Спектральные и хроматографические исследования // Первый международный конгресс молодых учёных по химии и химической технологии "МКХТ-2005", Москва, 26-28 октября 2005.

12.Семенистая Е.Н., Ларионов О.Г., Ревина А.А., Парфенов Э.А., Толкачев О.Н. Исследование хроматографического поведения кумаринов методом ОФ ВЭЖХ // Сборник тезисов. Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии». Самара. 3-8 июля. 2005. С.180.

13. Антропова И.Г., Семенистая Е.Н., Ревина А.А. Спектральное и хрома-тографическое исследование продуктов радиолиза кумаринов // IV Баховская конференция по радиационной химии, Москва, 1-3 июня 2005 г.

выводы

1. Впервые проведено хроматографическое разделение и идентификация природных и синтетических кумаринов различных классов (метил-, гидро-кси, амино-, тио-, нитро- и нитрозопроизводные).

2. Спектры поглощения и ИУ исследованных кумаринов включены в созданную ранее базу соединений фенольной природы.

3. Хроматографически исследованы реакции фотолиза растворов кумаринов и фурокумаринов. С использованием хроматографической базы данных проведена групповая идентификация фотопродуктов.

4. Изучено влияние рН и режимов элюирования на хроматографическое поведение металлокомплексов кумаринов.

5. Методом ОФ ВЭЖХ изучены фото- и радиационно-химические реакции в растворах металлокомплексов кумаринов. Показано, что гамма-излучение инициирует процессы диссоциации, сольватации и образование новых комплексов. УФ-облучение вызывает разрушение комплексов, трансформации лигандов и образование метастабильных продуктов. Стабильность комплексов зависит от природы растворителя и фотостабильности лиганда.

6. С использованием разработанной хроматографической базы данных установлен групповой состав фенольных фракций экстрактов лекарственных и пищевых растений (пропиленгликолевых, водно-спиртовых, спиртовых). Антиоксидантная активность экстрактов в наибольшей степени определяется веществами с максимумом поглощения в области 340-350 нм (флавонои-ды и их гликозиды).

1. Murrey R.D.H., Mendez J., Brown S.A. The Natural Coumarins. Wiley: Chichester etc., 1982

2. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринке-вич. М.: «Высшая школа». 1983. С.95.

3. Egan D., O'Kennedy R., Moran E., Cox D., Prosser E., Thores R.D. The pharmacology, metabolism, analysis and applications of coumarin and cou-marin-related compounds // Drug Metab. Rev. V.20. 1990. P.503

4. Hoult J.R., Paya M. Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins: natural products with therapeutic potential // Gen. Pharmacol. 1996. V.27. P.713-722

5. Fylaktakidou K.C., Hadjipavlou-Litina D.J., Litinas K.E., Nicolaides D.N. Natural and synthetic coumarin derivatives with anti-inflammatory/ antioxidant activities // Curr. Pharm. Des. 2004. V.10. P.3813-3833.

6. Curini M., Cravotto G., Epifano F., Giannone G. Chemistry and biological activity of natural and synthetic prenyloxycoumarins // Curr. Med. Chem. 2006. V.13. P. 199-222

7. Потапенко А.Я., Бутов Ю.С., Левинзон Е.С., Андина Е.С., Юрикова Н.А., Неклюкова М.Б., Мамедов И.С., Лысенко Е.П., Бездетная Л.Н., Кягова А.А. Фотоокислительные реакции псораленов и их роль в терапии дерматозов // Вестник РАМН. 1999. №2. С.32-38

8. Waksmundzka-Hajnos М., Petruczynik A., Hajnos M.L., Tuzimski Т., Hawryl A., Bogucka-Kocka A. Two-dimensional thin-layer chromatography of selected coumarins // J Chromatogr. Sci. 2006. V.44. P.510-517

9. Hawryl M.A., Soczewinski E., Dzido T. H. Separation of coumarins from Archangelica officinalis in high-performance liquid chromatography and thin-layer chromatography systems // J.Chromatogr. A. 2000. V.886. P. 7581

10. Vogel H., González M., Faini F., Razmilic I., Rodríguez J., San Martín J., Urbina F. .Antioxidant properties and TLC characterization of four Chilean Haplopappus-species known as bailahuén // J. Ethnopharmacology. 2005. V.97. P. 97-100

11. Vuorela H., Dallenbach K., Sticher O., Hiltunen R. Separation of the main coumarines of Peucedanum palustre with various planar chromatographic methods // J.Planar.Chromatogr. 1988. V.l. P. 123-127

12. Glowniak K., Bieganowska M.L. Effects of modifier and molecular structure of some coumarines on retention in reversed-phase high performance thin-layer and column chromatography // J.Chromatogr. 1986. V.370. P.281-292

13. Liu R., Sun Q., Sun A., Cui J. Isolation and purification of coumarin compounds from Cortex fraxinus by high-speed counter-current chromatography //J. Chromatogr. A. 2005. V.1072. P.195-199

14. Liu R., Sun Q., Shi Y., Kong L. Isolation and purification of coumarin compounds from the root of Peucedanum decursivum (Miq.) Maxim by high-speed counter-current chromatography // J.Chromatogr. A. 2005. V.l076. P.127-132

15. Chouchi D., Barth D. Rapid identification of some coumarin derivatives in deterpenated citrus peel oil by gas chromatography // J. Chromatogr. A. 1994. V.672. P. 177-183

16. Cappiello A., Famiglini G., Mangani F., Tirillini B. Analysis of coumarins by micro high-performance liquid chromatography-mass spectrometry with a particle beam interface // J. Amer. Soc. Mass Spectr. 1995. V. 6. P. 132139

17. Thompson H.J., Brown A.S. Separation of some coumarins of higher plants by liquid chromatography // J.Chromatogr. 1984. V.314. P .323-336

18. Arnoldi L., Ballero M., Fuzzati N., Maxia A., Mercalli E., Pagni L. HPLC-DAD-MS identification of bioactive secondary metabolites from Ferula communis roots// Fitoterapia. 2004. V.75. P.342-354

19. Ho P., Hogg T.A., Silva M.C.M. Application of a liquid chromatographic method for the determination of phenolic compounds and furans in fortified wines//Food Chem. 1999. V. 64. P. 115-122

20. Stanfill S.B., Calafat A.M., Brown C.R., Polzin G.M., Chiang J.M., Watson C.H., Ashley D.L. Concentrations of nine alkenylbenzenes, coumarin, piperonal and pulegone in Indian bidi cigarette tobacco // Food Chem. Toxicol. 2003. V.41. P.303-317

21. Wisneski H.H. Determination of coumarin in fragrance products by capillary gas chromatography with electron capture detection // J. AOAC Int.2001. V.84. P.689-692

22. Ochocka R.J., Rajzer D., Kowalski P., Lamparczyk H. Determination of coumarins from Chrysanthemum segetum L. by capillary electrophoresis // J.Chromatogr.A. 1995. V.709. P.197-202

23. Suntornsuk L. Capillary electrophoresis of phytochemical substances // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. V.27. P.679-698

24. Ganzera M., Sturm S., Stuppner H. HPLC-MS and MECC analysis of coumarins//Chromatographia 1997. V.46. P. 197-203

25. Chen C., Sheu S. Separation of coumarins by micellar electrokinetic capillary chromatography // J.Chromatogr. A. 1995. V.710. P. 323-329

26. Kamande M.W., Ross D., Locascio L.E., Lowry M., Warner I.M. Simultaneous concentration and separation of coumarins using a molecular micelle in micellar affinity gradient focusing // Anal. Chem. 2007. V.79. P. 1791-1796

27. Arnoldi L., Ballero M., Fuzzati N., Maxia A., Mercalli E., Pagni L. HPLC-DAD-MS identification of bioactive secondary metabolites from ferula comminis roots // Fitoterapia. 2004. V.75. P.342-354

28. Зенкевич И.Г. Формирование базы данных по индексам удерживания лекарственных веществ в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматогрфии // Журнал прикладной химии. 1994. Т.67. С. 1877-1882

29. Зенкевич И.Г., Косман В.М. О роли информационного обеспечения в обращенно-фазовой ВЭЖХ (на примере идентификации примесей в дигидроквертецине) // Журнал аналитической химии. 2005. Т.60. №8. С.837-841

30. Косман В.М., Зенкевич И.Г., Н.Ф. Комиссаренко. Информационное обеспечение для идентификации фенольных соединений растительного происхождения. Кумарины и фурокумарины. // Растительные ресурсы. 1997. Т.ЗЗ. №.3. С.32-37.

31. Сок I., Kocabas A. N., Cholerton S., Karakaya А.Е., Sardas S. Determination of coumarin metabolism in Turkish population // Hum. Exp. Toxicol. 2001. V.20. P. 179-184

32. Fang Y., Li Z., Watanabe Y. Pharmacokinetics of a novel anti-asthmatic, scoparone, in the rabbit serum assessed by a simple HPLC method // J. Eth-nopharcol. 2003. V.86. P.127-30

33. Kollroser M., Schober C. Determination of coumarin-type anticoagulants in human plasma by HPLC-electrospray ionization tandem mass spectrometry with an ion trap detector // Clin. Chem. 2002. V.48. P.84-91.

34. Wang L.H., Jiang S.Y. Simultaneous determination of urinary metabolites of methoxypsoralens in human and Umbelliferae medicines by highperformance liquid chromatography // J. Chromatogr. Sci. 2006. V.44. P.473-478

35. Soucek P. Novel sensitive high-performance liquid chromatographic method for assay of coumarin 7-hydroxylation // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1999. V.734. P.23-29

36. Suliman F.E.O., Al-Kindi S.S., Al-Kindy S.M.Z., Al-Lawati H.A.J. Analysis of phenols in water by high-performance liquid chromatography using coumarin-6-sulfonyl chloride as a fluorogenic precolumn label // J. Chroma-togr. A. 2006. V.1101. P. 179-184

37. Chen S., Chen K., Lien H. Determination of fatty acids in vegetable oil by reversed-phase liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. A. 1999. V.849. P. 357-369

38. Toyo'oka T. Fluorescent tagging of physiologically important carboxylic acids, including fatty acids, for their detection in liquid chromatography // Anal. Chim. Acta. 2002. V.465. P.l 11-130

39. Getoff N. Radiation chemistry and the environment // Rad. Phys. Chem. 1999. V.54. P.377-384

40. Legrini 0., Oliveros E., Braun A.M. Photochemical processes for water treatment // Chem. Rev. 1993. V.93. P.671-694

41. Buschann J., Canonica S., Lindauer U., Hug S.J., Sigg A. Photoirradiation of dissolved humic acid induces arsenic (III) oxidation // Environ. Sci. Technol. 2005. V.39. P.9541-9546

42. Chin Y., Miller P.L., Zeng L., Cawley K., Weavers L.K. Photosensitized degradation of bisphenol A by dissolved organic matter // Environ. Sci. Technol. 2004. V.38. P.5888 -5894

43. Frank M.P., Graebing P., Chib J.S. Effect of soil moisture and sample depth on pesticide photolysis // J. Agric. Food Chem. 2002. V.50. P.2607 -2614 ■

44. Balmer M.E., Sulzberger B. Atrazine degradation in irradiated iron/oxalate systems: effects of pH and oxalate // Environ. Sci. Technol. 1999. V.33. P.2418 -2424

45. Theurich J., Lindner M., Bahnemann D.W. Photocatalytic degradation of 4-chlorophenol in aerated aqueous titanium dioxide suspensions: a kinetic and mechanistic study // Langmuir. 1996. V.12. P.6368-6376

46. Chen O., Zhao W., Li J., Zhao J. Formation and identification of intermediates in the vsible-light-assisted photodegradation of sulforhodamine-B dye in aqueous Ti02 dispersion // Environ. Sci. Technol. 2002. V.36. P.3604 -3611

47. Goldston J. V., Pull in M.J., Bertilsson S., Voelker B.M. Reactions of hydroxy 1 radical with humic substances: bleaching, mineralization, and production of bioavailable carbon substrates // Environ. Sci. Tcchnol. 2002. V.36. P.364-372

48. Marugan J., Lopez-Munoz M., Gernjak W., Malato S. Fe/Ti02/pH interactions in solar degradation of imidacloprid with Ti02/Si02 photocatalysts at pilot-plant scale // Ind. Eng. Chem. Res. 2006. V.45. P.8900-8908

49. Fisher J.M., Reese J.G., Pellechia P.J., Moller P.L., Ferry J.L. Role of Fe(III), phosphate, dissolved organic matter, and nitrate during the photodegradation of domoic acid in the marine environment // Environ. Sci. Tech-nol. 2006. V.40. P.2200-2205

50. Dolinova J., Ruzhiska R., Kurkova R., Klanova J., Klan P. Oxidation of aromatic and aliphatic hydrocarbons by OH radicals photochemically generated from H202 in ice // Environ. Sci. Technol. 2006. V.40. P.7668-7674

51. Mahapatra S., Madras G., Row T.N.G. Structural and photocatalytic activity of lanthanide (Ce, Pr, and Nd) molybdovanadates // J. Phys. Chem. C. 2007. V. 11. P. 6505-6511

52. Sarakha M., Bolte M., Burrows H.D. The photo-oxidation of 2,6-dimethylphenol and monophenylphenols by uranyl ion in aqueous solution // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 1997. V.107. P.101-106

53. Gaplovsky A., Gaplovsky M., Toma S., Luche J.-L. Ultrasound effects on the photopinacolization of benzophenone // J. Org. Chem. 2000. V.65. P.8444-8447

54. Kitajima M., Hatanaka S., Hayashi S. Mechanism of 02-accelerated sonolysis of bisphenol A // Ultrasonics. 2006. V.44. P.371-373

55. Namjesnik-Dejanovic K., Cabaniss S.E. Reverse-phase HPLC method for measuring polarity distributions of natural organic matter // Environ. Sci. Technol. 2004. V.38. P. 1108-1114

56. Thompson D.H., Inerowicz H.D., Grove J., Sarna T. Structural characterization of plasmenylcholine photooxidation products // J. Photochem. Photobiol. 2003. V.78. P.323-330

57. Ceugniet C., Lepetit L., DeViguerie N.L., Jammes H., Peyrot N., Rivière M. Single-run analysis of retinal isomers, retinol and photooxidation products by high-performance liquid chromatography //J. Chromatogr. A. 1998. V.210. P.237-240

58. Andrisano V., Gotti R., Leoni A., Cavrini V. Photodegradation studies on atenolol by liquid chromatography // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. V.21. P.851-857

59. Andrisano V., Bertucci C., Battaglia A., Cavrini V. Photostability of drugs: photodegradation of melatonin and its determination in commercial formulations // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. V.23. PI5-23

60. Bordin F., DairAcqua F., Guiotto A. Angelicins, angular analogs of psoralens: chemistry, photochemical, photobiological and phototherapeutic properties //Pharmacol. Ther. 1991. V.52. P.331-363

61. Kitamura N., Kohtani S., Nakagaki R. Molecular aspects of furocoumarin: reactions: photophysics, photochemistry, photobiology, and structural analysis // J. Photochem. Photobiol. C: Photochem. Rev. 2005. V.6. P.168-185

62. McCarthy P.K., Blanchard G.J. AMI study of the electronic structure of coumarins //J. Phys. Chem. 1993. V.97. P.12205-12209

63. Llano J., Raber J., Eriksson L.A. Theoretical study of phototoxic reactions of psoralens // J. Photochem. Photobiol. A. 2003. V.154. P.235-243

64. Van Iperen H.P., Van Henegouwen G.M.J.B. Clinical and mechanistic aspects of photopheresis // J. Photochem Photobiol. B: Biol. 1997. V.39. P.99-109

65. Dyer J.M., Bringans S.D., Bryson W.G. Determination of photo-oxidation products within photoyellowed bleached wool proteins // J. Photochem. Photobiol. 2006. V.82. P.551-557

66. Caffieri S. Furocoumarin photolysis: chemical and biological aspects // Photochem. Photobiol. Sci. 2002. V.l P. 1499-1507

67. Potapenko A.Ya. Mechanisms of photodynamic effects of furocoumarins // J. Photochem Photobiol. B: Biol. 1991. V.9. P. 1-33

68. Waszkowska E., Zarobska Z., Poznanski J., Zhukov I. Spectroscopic detection of photoproducts in lecithin model system after 8-methoxypsoralen plus UV-A treatment // J. Photochem Photobiol. B: Biol. 2000. V.55. P. 145154

69. Gasparro F.P., Gattolin P., Olack G.A., Deckelbaum L.I., Sumpio B.E. The excitation of 8-methoxypsoralen with visible light: reversed phase HPLC quantitation of monoadducts and cross-links // Photochem. Photobiol. 1993. V.57. P.1007-1010

70. Кузнецова H.A., Калия O.JI. Фотохимия кумаринов // Успехи химии. 1992. Т.61. С.1243-1268

71. Mohanlall V., Odhav В. Biocontrol of aflatoxins Bl, B2, Gl, G2, and fu-monisin Bl with 6,7-dimethoxycoumarin, a phytoalexin from Citrus sinensis //J. Food Prot. 2006. V.69. P.2224-2229

72. Парфёнов Э.А., Смирнов Л.Д. Фармакологический потенциал антиок-сидантов на основе кумарина // Химико-фармацевтический журнал. 1988. Т.22. №12. С.1438-1448.

73. Kostova I., Manolov I., Nicolova I., Danchev N. New metal complexes of 4-methyl-7-hydroxycoumarin sodium salt and their pharmacological activity // И Farmaco. 2001. V.56. P.707-712

74. Pencheva I., Kostova I., Konstantinov S., Naidenova E., Karaivanova M., Manolov I. Cardioprotective efficacy of new esculin metal complexes // ActaPharm. 1998. V.48. P. 127-131

75. Kostova I., Momekov G. New zirconium (IV) complexes ofcoumarins with cytotoxic activity // Europ. J. Med. Chem. 2006. V.41. P.717-726

76. Rehman S.U, Chohan Z.H, Gulnaz F., Supuran C.T. In vitro antibacterial, antifungal and cytotoxic activities of some coumarins and their metal complexes //J. Enzyme. Inhib. Med. Chem. 2005. V.20. P. 333-340

77. Wang P., Lee H.K. Recent applications of high-performance liquid chromatography to the analysis of metal complexes // J. Chromatogr. A. 1997. V.789. P.437-451

78. Shepherd R.E. Chromatographic and related electrophoretic methods in the separation of transition metal complexes or their ligands // Coord. Chem. Rev. 2003. V.247. P.147-184

79. Sarzanini, M.C. Bruzzoniti. Metal species determination by ion chromatography // Trends in analytical chemistry. 2001. V.20. P.304-310

80. Ш.Иванов A.B., Нестеренко П.Н. Формирование и применение градиентов рН в жидкостной хроматографии. // Журнал аналитической химии. 1999. Т.54. № 6. С.566-584

81. Hughes H.P., Vos J.G. Control of photosubstitution in dinuclear Ruthenium polypyridyl complexes by hoice of bridging ligand // Inorg. Chem. 1995. V.34. P.4001-4003

82. Kirk A.D., Fernando S.R.L. Synthesis and photoproperties of a quencher, NaCr(l,3-diaminopropane)(CN)4., and reinvestigation of Cr(l,3•5 idiaminopropane) photoproduct quenching // Inorg. Chem. 1994. V.33. P.4435-4438

83. Hesek D., Hembury G.A., Drew M.G.B., Taniguchi S., Inoue Y. Ligand selective monosubstitution with complete enantiomeric retention in Ruthenium bis(bipyridine) complexes // Inorg. Chem. 2001. V.40. P.2478-2479

84. Kojima M., Yoshikawa Y. Chromatographic separation and characterization of the photoproduct of tris(L-cysteinesulfinato-N,S)cobaItate(III) // J. Chromatogr. A. 1997. V.789. P.273-277

85. Abrahamson H.B., Rezvani A.B., Brushmiller J.G. Photochemical and spectroscopic studies of complexes of iron(III) with citric acid and other carboxylic acids // Inorg. Chim. Acta. 1994. V.226. P. 117-127

86. Shiraishi Y., Hirai T., Komasawa I. A novel demetalation process for vanadyl- and nickelporphyrins from petroleum residue by photochemical reaction and liquid-liquid extraction // Ind. Eng. Chem. Res. 2000. V.39. P. 13451355

87. Tang A.N., Jiang D.Q., Jiang Y., Wang S.W., Yan X.P. Cloud point extraction for high-performance liquid chromatographic speciation of Cr(III) and Cr(VI) in aqueous solutions // J. Chromatogr. A. 2004. V.1036. P. 183188

88. Collins C.H., Pezzin S.H., Rivera J.F.L., Bonato P.S., Windmoller C.C., Archundia C., Collins K.E. Liquid chromatographic separation of aqueous species of Cr(VI) and Cr(III) // J. Chromatogr. A, 1997. V.789. P.469-478

89. Sommer S., Rimington C., Moan J. Formation of metal complexes of tumor-localizing porphyrins//FEBS. 1984. V.172. P.267-271

90. Voelker B.M., Sedlak D.L., Zafiriou O.C. Chemistry of superoxide radical in seawater: reactions with organic Cu complexes // Environ. Sci. Technol. 2000. V.34. P.1036 -1042

91. Carer M., Mangia A., Manini P., Predieri G., Licandro Е/, Papagni A. Characterization of chromium-carbene complexes by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry with particle beam interface // J. Chromatog. A. V.730. 1996. P.231-240

92. Akama Y., Iwadate Т., Tong A., Takahashi Y., Tanaka S. Chromatographic behaviour of the chromium(III) complex of l-phenyl-3-methyl-4-benzoyl-5-pyrazolone //J. Chromatogr A. 1997. V.789. P.479-483

93. Пикаев A.K. Современная радиационная химия. Экспериментальная техника и методы. М.: Наука, 1985 г.

94. Engelhardt Н. Practice of High Performance Liquid Chromatography. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-NewYork-Tokyo. 1986

95. Парфёнов Э.А., Смирнов Л.Д. // Химия гетероциклических соединений. 1993. №4. С. 459-462

96. Hammond G.S., Stout С.А., Lamola А.А. Mechanisms of photochemical reactions in ssolution. XXV. The photodimerization of coumarin // J. Am. Chem. Soc. 1964. V. 86. P. 3103-3106.

97. Химия нитро- и нитрозогрупп / Под ред. Г. Фойера. М.: «Мир», 1972. Т. 1.С. 150-152

98. Winters В.Н., Mandelberg H.I., Mohr W.B. Photochemical products in coumarin laser dyes // Appl. Phys. Lett. 1974. V. 25. P. 723-725

99. Казицына Л.А., Куплетская Н.Б. Применение УФ-, Ж- и ЯМР-спектроскопии в органической химии. М.: «Высшая школа». 1971.264 с.

100. Parfenov E.A., Zaikov G.E. Biotic Type Antioxidants: The Prospective Search Area of Novel Chemical Drugs // VSP.-Utrecht-Boston-Tokyo. 2000. P. 559.

101. Sakurai H., Kojima Y., Yoshikawa Y., Kawabe K., Yasui H. Antidiabetic vanadium(IV) and zinc(II) complexes // Coordination Chem. Rew. 2002. V.226. P. 187-198

102. K.H. Thompson, C. Orvig. Coordination chemistry of vanadium in metal-lopharmaceutical candidate compounds // Coord. Chem. Rev. 2001. V. 219221. P.1033—1053

103. A.D. Kirk. Photochemistry and Photophysics of Chromium(III) Complexes //Chem. Rev. 1999. V. 99. P. 1607-1640

104. M. Brindell, E. Kulis, S.K.C. Elmroth, K. Urban ska, G. Stochel. Light-induced anticancer activity of RuCb(DMSO)4. complexes // J. Med. Chem. 2005. V.48. P.7298-7304

105. Antropova I.G., Fenin A.A., Revina A.A. Radiation-chemical transformations of coumarins in organic solvents // High energy chemistry. 2007. V.41. P.61-65

106. Chen X., Guo Y., Liu В. Caution to HPLC analysis of tricarbonyl technetium radiopharmaceuticals: An example of changing constitution of complexes in column // J. Pharm. Biomed. Anal. 2007. V.43. P. 1576-1579

107. Kirk A.D., Fernando S.R.L. Synthesis and photoproperties of a quencher, NaCr(l,3-diaminopropane)(CN)4., and reinvestigation of Cr(l,3-diaminopropane)3"1" photoproduct quenching // Inorg. Chem. 1994. V. 33. P. 4435-4438

108. Bensasson R.V., Land E.J., Truscott T.G. Flash photolysis and pulse radio-lysis. Pergamon Press. Oxford. 1983

109. Tura D., Robards K. Sample handling strategies for the determination of biophenols in food and plants // J. Chromatogr. A. 2002. V. 975. P.71-93

110. Antolovich M., Prenzler P., Robards K., Ryan D. Sample preparation in the determination of phenolic compounds in fruits // Analyst. 2000. V.125. P.989-1009

111. Madhujith Т., Shahidi F. Optimization of the extraction of antioxidative constituents of six barley cultivars and their antioxidant properties // J. Ag-ric. Food Chem. 2006. V.54. P.8048-8057.

112. Liu F.F., Ang C.Y., Springer D. Optimization of extraction conditions for active components in Hypericum perforatum using response surface methodology // J. Agric. Food Chem. 2000. V.48. P.3364-3371

113. Кочетова M.B., Семенистая E.H., Ларионов О.Г., Ревина А.А. Определение биологически активных соединений фенольной и полифеноль-ной природы в различных объектах методами хроматографии // Успехи химии. Т.76. №1. 2007. С. 88-100

114. Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset С. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by coulometric detection // Talanta. 2000. V.51.P. 709-716.

115. Antolovich M., Prenzler P. D., Mc Donald E., McDonald S., Robards K. Methods for testing antioxidant activity //Analyst. 2002. V.127. P. 183-198

116. Яшин Я.И., Яшин А.Я., Пахомов В.П. Установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных соединений. Решение о выдаче патента на изобретение №2003123073/15 (024965). Дата подачи заявки 25.07.2003 г.

117. Яшин А.Я., Яшин Я.И. Аналитические возможности жидкостного хроматографа «ЦветЯуза» с электрохимическими детекторами // Российский химический журнал. 2002. Т.46. №4. С. 109-115

118. Косман В.М., Зенкевич И.Г. Информационное обеспечение для идентификации фенольных соединений растительного происхождения в об-ращено-фазовой ВЭЖХ//Растительные ресурсы. 1997. Т.ЗЗ. 1997.1. С. 14-26

119. Казаков А.Л., Хиля В.П., Межерицкий В.В., Литкен Ю. Природные и модифицированные изофлавоноиды. Издательство Ростовского университета. 1985

120. Минаева В. Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск: Наука. 1978. 255 с.

121. Горячева Н.Г., Кочетова М.В., Шаненко Е.Ф., Ревина А.А., Ларионов О.Г. Исследование фенольных соединений экстракта хмеля с помощью спектрофотометрического метода и ВЭЖХ. // Пиво и жизнь. 2003. Т.37. №.2. С.27-34.

122. Katalinic V. High-performance liquid chromatographic determination of flavan fingerprints in plant extracts // J. Chromatogr. A. 1997. V.775. P.359-367

123. Drasar P., Moravcova J. Recent advances in analysis of Chinese medical plants and traditional medicines // J. Chromatogr. B. 2004. V.812. P.3-21

124. Viera R.F., Grayer R.J., Paton A J. Chemical profiling of Ocimum ameri-canum using external flavonoids // Phytochemistry. 2003. V.63. P. 555-567

125. Zhang J.-lan, Cui M., He Y., Yu H.-lan, Guo D.-an. Chemical fingerprint and metabolic fingerprint analysis of Danshen injection by HPLC-UV and HPLC-MS methods // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V.36. P. 1029-1035

126. Wang B.-J., Liu C.-T., Tseng C.-Y., Yu Z.-R. Antioxidant activity of Bu-pleurum kaoi Liu (Chao et Chuang) fractions fractionated by supercritical C02 // LWT Food Sci. Tech. 2005. V.38. P.281-287

127. З-нитро-4-кумаринилтиолят тетрабу-тил аммония тА1) 1401201008060 4020 0 - к200 300 400 500 600 ^ 8.метоксипсорален mAU 350. I 300. f 250. 200. А 150. у \ 100. \ 50. \ 200 300 400 500 600 ни