автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.07, диссертация на тему:Фотолюминесцентное обнаружение микробиологического загрязнения пищевых продуктов

Министерство образования Российской Федерации

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, МЕХАНИКИ И ОПТИКИ

«ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ»

Специальность 05.11.07 Оптические и оптико-электронные приборы и комплексы

На правах рукописи

ДЁМИН

Роман Евгеньевич

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт-Петербург

2004

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете информационных технологий, механики и оптики

Научный руководитель: кандидат технических наук, доцент

Лукин Сергей Борисович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Мешковский Игорь Касьянович

кандидат технических наук, доцент Ефимов Виктор Викторович

Ведущая организация: ВНИИМ им. Менделеева, 198005, г. Санкт-Петербург, Московский, 19.

Зашита диссертации состоится 2004 г. в ■^•^часов

на заседании диссертационного совета Д 212.227.01 «Оптические и оптико-электронные приборы и комплексы» при Санкт-Петербургском Государственном университете информационных технологий, механики и оптики, по адресу: 197101, г. Санкт-Петербург, ул. Саблинская, д.14.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

Ваши отзывы и замечания по автореферату (в 2-х экз.), заверенные печатью, просим направлять по указанному адресу Ученому секретарю диссертационного совета.

Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.227.01 кандидат технических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Патогенные микроорганизмы широко распространены повсюду в природе и окружающей среде. Некоторые потенциально опасные микроорганизмы могут быть причиной различных инфекционных заболеваний. Микробиологические заболевания, вызванные патогенными бактериями, составляют главную причину смерти во многих странах мира.

Мясо сельскохозяйственных и диких промысловых животных, птицы, и продукты их переработки составляют значительную долю в рационе питания человека. Они служат источником биологически полноценных белков, жиров, витаминов и минеральных веществ, необходимых для нормального протекания жизненных процессов в организме. Однако продовольственное сырье и пищевые продукты животного происхождения могут представлять собой опасность, если они были получены или изготовлены с нарушением санитарно гигиенических правил.

Мясо и мясо продукты представляют собой благоприятную среду не только для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, но и, в ряде случаев, для их размножения и накопления, что представляет собой опасность для жизни и здоровья человека. Мясные продукты могут играть значительную роль в распространении инфекционных заболеваний.

Важнейшим звеном в системе профилактических мероприятий по предупреждению заражения людей через потребляемое мясо и продукты их переработки, а также распространения инфекционных заболеваний среди животных является бактериологическое исследование, которое позволяет гарантировать санитарное благополучие продовольственного сырья и вырабатываемой из него продукции.

В мире и в нашей стране очень большое внимание, уделяется обнаружению микроорганизмов, вызывающих заболевания. Однако в продаже для бытового применения отсутствуют общедоступные средства диагностики бактериальных загрязнений пищевых продуктов, быстродействующие, достаточно надежные, простые в применении и доступные по цене. Известные методики оперативного обнаружения патогенных микроорганизмов базируются на различных физических принципах; большинство методов позволяет довольно точно обнаружать микроорганизмы при концентрации бактерий 104-106 клеток/мл, в некоторых случаях при концентрации 103 клеток/мл.

Недостатками существующих лабораторных методов бактериальной идентификации является то, что эти методы контактны, требуют сложного и дорогостоящего оборудования. Наиболее перспективными методами дистанционного обнаружения патогенных бактерий в быту являются прямые оптические методы, а именно, методы основанные на использовании эффекта люминесценции. Оптические методы являются основой для соз-

| национальная! 1 библиотека I

дания портативных приборов оперативного контроля уровня общей микробиологической загрязненности, несмотря на отдельные преимущества других методов, такие как чувствительность, возможность идентификации видов и родов бактерий и возможность количественного обнаружения бактерий.

Приведенные факты говорят об актуальности темы представляемой работы.

Цель и задачи диссертационной работы.

Целью работы является разработка структуры и алгоритмов функционирования фотолюминесцентной системы обнаружения общей микробиологической загрязненности пищевых продуктов, компактной, быстродействующей, надежной и эффективной.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- Провести обзор существующих методов бактериальной идентификации;

- Провести экспериментальное исследование на стационарной аппаратуре с целью определения возможности детектирования спектров люминесценции образцов и построения статистической модели спектров люминесценции;

- Разработать алгоритмы оценки информативных признаков в выбранном признаковом пространстве для бесконтактной методики обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов.

- Разработать схему переносного компактного прибора обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов;

- Дать оценку эффективности обнаружения микробиологического загрязнения на основе результатов компьютерного моделирования с использованием разработанной имитационной цифровой модели.

Основные результаты, выносимые на защиту

1. Статистическая модель спектров фотолюминесценции пищевых продуктов в отсутствии и при наличии микробиологического загрязнения;

2. Алгоритмы обработки спектров люминесценции образцов;

3. Результаты оценки эффективности работы компактного прибора на основе компьютерного моделирования;

4. Структурная схема оптико-электронной системы контроля общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов.

Научная новизна работы

1. Предложена статистическая модель спектров излучения люминесценции образцов сырого мяса, основанная на оценках параметров нестационарного случайного процесса;

2. Разработаны алгоритмы оценки информативных признаков для методики бесконтактного обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов, основанные на методе спектрального отношения, используемого для характеристики изменения формы спектров фотолюминесценции;

3. Проведена оценка эффективности методики дистанционного обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов;

4. Экспериментально обоснованы возможность и целесообразность обнаружения микробиологического загрязнения с помощью фотолюминесцентной методики.

Практическое значение результатов работы

Практическая ценность диссертационной работы определяется как результатами исследований на стационарном оборудовании, продемонстрировавших возможность определения наличия бактериального загрязнения пищевых продуктов, так и построением статистической цифровой модели прибора. Основные результаты работы, представляющие практическую ценность следующие:

1. Разработаны алгоритмы обработки спектров фотолюминесценции и сигналов, используемых для формирования информативных признаков;

2. Разработана схема портативного прибора бесконтактного обнаружения микробиологического загрязнения, определено необходимое число спектральных каналов;

3. Предложена статистическая цифровая модель прибора бесконтактного обнаружения загрязнения пищевых продуктов;

4. Дана оценка вероятностям ошибок обнаружения с помощью цифровой модели и их изменения в зависимости от параметров системы и приведена оценка параметров системы по заданным вероятностям обнаружения.

Апробация работы

Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:

- второй международной конференции молодых ученых и специалистов «Оптика 2002» (г. Санкт-Петербург, 2002 г.);

- третьей международной конференции молодых ученых и специалистов «Оптика 2003» (г. Санкт-Петербург, 2003 г.);

- 32 научной и учебно-методичской конференции СПбГИТМО (ТУ), посвященной 300 - летию Санкт-Петербурга (4-7 февраля 2003 г.);

- 1-ой Научно-технической конференция молодых специалистов 2004 (38 февраля 2004 г.);

- 33 научной и учебно-методической конференции СПбГУИТМО: «Достижения ученых, аспирантов и студентов СПбГУИТМО в науке и образовании» (2-6 февраля 2004 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы и приложения.. Материал изложен на стр., содержит

v рис., список литературы состоит из наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность проводимых исследований, сформулированы цель и основные направления работы.

Первая глава посвящена обзору и анализу различных методов и устройств контроля бактериальной загрязненности. Дана общая характеристика известных методов. Существующие методы разделены на группы: прямые и непрямые, контактные и бесконтактные. Даны оценки предельно определяемых концентраций. Для рассмотренных методов приведены их характеристики: точность, предельно определяемые концентрации и время необходимое для проведения измерений. Показано, что наиболее перспективными методами, на основе которых возможно создать систему дистанционного обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов являются оптические бесконтактные методы. В главе рассматриваются источники и приемники оптического излучения, применяемые для фотолюминесцентных измерений. Рассматриваются некоторые схемы флуоресцентного анализа.

Во второй главе проводится описание методики проводимых экспериментов. Предлагается метод замены искусственно зараженного мяса состаренным при комнатной температуре 20 С' в естественных условиях, так как транспортировка бактерий связана с определенным риском. Риск заключается в возможности их потери или завладения ими лицами, которые могут применить их в террористических целях. Эксперименты с использованием патогенных бактерий представляют опасность оператору, необходимо иметь соответствующее образование и допуск к работе с патогенной микрофлорой.

Обосновывается состав аппаратуры, необходимый для проведения экспериментальных измерений трансформации спектров фотолюминесценции тестируемых образцов, включающий: высокоинтенсивный источник излучения - аргоновый лазер; спектральный селектор с возможностью сканирования; высокочувствительный приемник излучения — ФЭУ, работающий в режиме счета фотонов; регистрирующее устройство, рис.1. Рассматриваются требования, предъявляемые к перечисленной аппаратуре. Описывается методика и программа измерений. Приведенная оценка метрологических свойств установки позволяет считать, что погрешность измерений не превышает 0.03.

спектрофотометр

Рис.1. Структурная схема экспериментальной установки 1- аргоновый лазер (ЛГ- 106-М), 2 - дифракционная решетка, 3 — интерференционный фильтр 488 нм, 4 - образец, 5 - приемный объектив, 6 - дифракционные решетки спектрофотометра 1200 шт/мм, 7 - ФЭУ, 8 - схема счета фотонов, 9 - частотомер, 10 - компьютер, 11 - развертывающая система, 12 — индикатор и пульт управления.

Далее приводятся результаты экспериментов - графики спектрального распределения интенсивности фотолюминесценции образцов, мяса говядины, содержавшегося 0 часов при комнатной температуре, 12, 24 и 48 часов. В качестве примера на рис.2, рис.3 приведены семейства спектров интенсивности люминесценции чистого мяса (0 часов при комнатной температуре) и мяса, которое содержалось 12 часов при комнатной температуре.

-О200 Л

X О150 А •

о •&100

о о О 50

«

0

491 494 497 500 515 530 545 560 - 575 590 605 620

Длина волны, нм

Рис.2. Семейство спектров интенсивности люминесценции сырого мяса 0 часов содержания при комнатной температуре, полученные от различных образцов (10 шт).

491 495 499 515 535 555 575 595 615

Длина волны,нм

Рис.3. Семейство спектров интенсивности люминесценции сырого мяса, содержавшегося 12 часов при комнатной температуре, полученные от тех же образцов (10 шт).

Анализируя ход кривых на рис.2, можно отметить присутствие четырех максимумов. Максимум в области длина волны 496 нм является паразитным. Максимумы, локализованные вблизи длин волн 515, 560 и 600 нм характерны для типичного спектра фотолюминесценции мяса говядины. Каждый следующий максимум по интенсивности меньше предыдущего. Первый расположен на отметке 515 нм, второй - на 560 нм и третий на отметке 600 нм. При многократном повторении экспериментов с различными образцами происходит постоянное повторение хода спектра люминесценции с теми или иными отклонениями, вызванными структурой поверхности образца.

Размножение на поверхности мяса микроорганизмов, сопровождающееся процессом гниения приводит к трансформации вида спектральных зависимостей, иллюстрированный на рис.3. Указанные выше локальные

максимумы становятся мене выражены, а весь спектр сдвигается в сторону более длинных волн примерно на 25-35 нм.

Отмеченные трансформации спектров могут служить необходимым материалом для формирования оптико-электронной системы обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов.

Проведенная далее в главе оценка идентичности полученных экспериментальных данных со спектрами мяса, которое подвергалось заражению патогенными бактериями, подтверждает возможность использования экспериментальных данных для построения фотолюминесцентной системы обнаружения общего микробиологического загрязнения продуктов. На рис.4 показаны спектры интенсивности люминесценции сырого мяса говядины образцов, на которые была нанесены патогенные бактерии рода ЕэскепсЫа-еоН при концентрациях ,106(1/см2), 107 (1/см2) и спектры люминесценции образца сырого мяса, содержащегося при комнатной температуре 12 и 24 часа. Спектры мяса, подвергавшегося заражению, взяты из литературных источников. Сравнение может быть проведено методом критерия согласия Пирсона, так как и те и другие данные получены экспериментально и имеют характер оценок случайной величины.

0 4—1—I I I I—Г-1—Г—1—I I I—Г I I I—I I I I—Г—I

480 520 560 600 640 680

Длина волны, нм

Рис. 4. Усредненные спектры интенсивности люминесценции иск) сственно зараженного мяса бактериями и мяса состаренного при комнатной температуре в течение 12 и 24 часов.

Мерой отличия кривых друг от друга может служить выборочная дисперсия. Приведенные в работе расчеты показали, что отличия находятся в пределах погрешности измерений. Таким образом, сделан вывод о возможности замены графиков спектров мяса зараженного патогенными микроорганизмами с определенной концентрацией, спектрами фотолюминесценции мяса состаренного в естественных условиях при комнатной температуре для построения статистической модели.

Разброс полученных кривых при одних и тех же условиях для различных образцов, рис.3, дает возможность применить для их описания методы теории случайных процессов. В работе предложена статистическая модель нестационарного случайного процесса, в которой интенсивность

люминесценции в выбранных диапазонах длин волн может считаться случайной величиной, распределенной по нормальному закону, с параметрами М(Х) - математическое ожидание интенсивности на ¡-ой длине волны (X), и о (X.) - среднеквадратическое значение интенсивности на i — ой X. Нормальный закон распределения вероятности выбран исходя из центральной предельной теоремы теории вероятностей.

Дадим оценку значениям моделируемых функций математического ожидания и среднеквадратического отклонения по результатам эксперимента. Графические изображения математических ожиданий, аппроксимирующих функций и среднеквадратических отклонений приведены на рис. 5 - 6. Значения величин для образцов, содержавшихся 0 часов при комнатной температуре, 12,24 и 48 часов приведены в табл.1.

Табл. 1

Ряд значений функций математического ожидания - М(Х,) и среднеквадратнческого отклонения- <о()ц) по результатам эксперимента

X, нм 500 520 540 560 580 600 620

М(Х), Фотон/с 0 часов 67 86 58 66 45 53 37

12 часов 185 370 405 365 275 245 170

24 часа 275 460 467 423 315 290 210

48 часов 255 445 475 440 310 250 160

а(Х) Фотон/с 0 часов 7.5 7.2 6.5 5.8 5.2 4.8 4

12 часов 18 23 22.5 21 20 19 18

24 часа 19 24 25 22 21 20 19

48 часов 18 22 23 21 20 19 18

Предложены аппроксимации экспериментальных кривых степенными полиномами. Уравнения аппроксимирующих кривых математического ожидания У и среднеквадратического отклонения Ъ имеют вид:

У0 = - 1006 + 2406Х- 1969.5Х2 + 782.98Х3- 162.78Х4+ 16.988Х5- 0.701Х6 (2.1) 2о= 6.6286 + 1.7501*. - 1.0583Х2 + 0.1874Х3-0.0114Х4 (мясо 0 часов содержания при 20 °С, рис.2.5);

У12 = -37.143+ 161.76Х + 122.08Х2- 72.888Х3 + 12.348Х4-0.6875Х5 (2.2)

2 = 3.2143 + 21.922Х- 82708Х2 + 1.2412Х3-0.0663Х4 (мясо 12 часов содержания при 20 °С, рис.2.6);

У24 = - 16.429 + 294.54Х + 41.708Х2- 53.69 IX3 + 10.284Х4 - 0.6042Х5 (2.3) г24 = 3.1429 + 22.986Х - 8.333Х2 + 1.1919Х3 - 0.0606Х4 (мясо 24 часа содержания при 20 °С);

У48 = 33.571 + 164.07Х + 115.2 IX2-67.348Х3 + 10.928Х4- 0.5833Х3 (2.4)

= 6.4286+16.451X - 5.6667Х2 + 0.7727Х3 - 0.0379Х4 (мясо 48 часа содержания ппи 20 °С1:

Уравнения кривых получены с помощью средств программы Шогё_97. Аппроксимация проведена полиномиальной линией тренда, рис.5 и рис.6. Полученные уравнения справедливы в диапазоне длин волн от 500 нм до 620 нм.

Таким образом, по результатам эксперимента получена модель для образцов различного типа, записанная в виде полиномов четвертой, пятой и шестой степени. Конкретные значения интенсивности фотолюминесценции могут быть получены с помощью генератора квазислучайных чисел, имеющего нормальное распределение.

В Третьей главе в качестве математической модели, описывающей совокупность спектров предложена нестационарная случайная функция, характеризующаяся математическим ожиданием - М(А,) и среднеквадрати-ческим отклонением - о(Х,). Отмечено, что для образцов пораженных микробиологическими объектами и чистых характер этих зависимостей отличается.

Введем обозначения: Мо(Х) и Оо(Х.) — вид функций для чистого продукта, М|(Х) И Oi(X) - вид функций для загрязненного мяса. Графические изображения указанных функций даны на рис. 2.5 и рис.2.6.

Вычислим меру отличия в виде модуля разности - функций математического ожидания:

E(X).»jM0(X)-M,(X)| (3.1)

Графическое изображение функции Е(Х) приведено на рис.7. После нахождения функции показывающей расхождение двух процессов,

становится видно, на каких длинах волн оно максимально. Наиболее заметны два максимума функции Е(Х) на длинах волн 505 нм и 545 нм. Полуширина обоих максимумов составляет 20 нм.

Рис.7. Модуль разности Е().) функций математических ожиданий двух процессов Мо(Х) и М,(Х)

Анализируя ход кривой функции Е(Х), можно сделать вывод о том, что частным решением глобальной задачи фильтрации может стать метод спектрального отношения двух диапазонов длин волн с центрами на 505

нм и 545 нм, так как расхождение математических ожиданий процессов в этих диапазонах наибольшее. При смещении в длинноволновую область, расхождение двух процессов уменьшается. Можно наблюдать еще два характерных максимума с центрами на длинах волн 570 нм и 585 нм. Однако, они расположены близко друг к другу и к тому же близко к максимуму на длине волны 545 нм. Интенсивность их на порядок меньше, соответственно сигнал, полученный, используя эти два максимума, будет меньше.

Оценим ширину вырезаемых диапазонов длин волн. Ширина вырезаемых диапазонов длин волн выбирается исходя из ширины спектральных линий фотолюминесценции образцов. Вырезаемый диапазон не может быть бесконечно мал, из-за низкой интенсивности люминесценции - теряется уровень сигнала. Диапазон не должен быть слишком широким, потому что он перестает нести необходимую информацию об отношении ин-тенсивностей - все показания усредняются. Для выбора ширины выделяемой спектральной линии используем вид кривой и вид кривой представляющей собой производную от спектральной кривой плотности люминесценции.

На рис.8 изображен спектр фотолюминесценции мяса говядины и его производная. На рис.9 приведена зависимость потока падающего на приемную площадку фотоприемника от ширины вырезаемого диапазона длин волн. Из рис 9. видно, что ширину диапазона нельзя выбрать меньше 10 нм, так как падающий на фотоприемник поток будет равен его пороговому потоку. Также, оценивая кривую производной, можно сделать вывод, что нецелесообразно принимать выделяемый диапазон более чем 20 нм.

Рис.8 Спектр фотолюминесценции мяса говядины - 1, его производная - 2

1 2 3 10 15 20 Д?.,|М Рис.9 Зависимость падающего потока люминесценции •• на фотоприемник от ширины вырезаемого диапазона длин волн. 1 - канал 1,2- канал 2,3 - канал 3

Исходя их экспериментальных данных, рассчитываются выходы люминесценции образцов чистого мяса, табл.2, чтобы на их основе произвести расчет характеристик компактного прибора.

Табл.2.

Рассчитанные на основе экспериментальных данных выходы люминесценции образцов

Длина волны, нм 500 520 540 560 580 600 620

Выход Люминесценции 1.4-10"7 1.9-10"7 1.3-10"7 1.5-10"7 1.1-10'7 1.2-10"7 8.2-10"8

Проводится отбор информативных признаков. За информационные признаки примем отношения интенсивностей фотолюминесценции Ijj, 1ц, Ijj на определенных диапазонах длин волн. Диапазоны выбираются в зависимости от вида мяса. Отношение интенсивности фотолюминесценции R, получается в результате действий с интенсивностями фотолюминесценции I/.1.1ц4лз: R = f(I).i, Ьъ Ьз). Для пищевых продуктов на основе мяса говядины центрыдиапазонов:: XI = 505 нм, ?J2 = 545 нм и ХЗ = 585 нм. Указанные диапазоны вырезаются при помощи спектрального селектора или фильтра.

Проводится обоснование выбора метода спектрального отношения. При использовании в оптико-электронной системе контроля бактериальной загрязненности в качестве информационного параметра спектрального распределения потока излучения измеряется отношение потоков излучения в двух ограниченных различными фильтрами участках спектра:

Y-F^/F« (3.2)

Далее в главе делается заключение о том, что использование дополнительного диапазона является полезным, но не является необходимым по следующим причинам:

- возникающие в результате порчи мяса бактериями различия между выделяемыми в спектре интенсивностями первого и второго каналов больше, чем различия между выделяемыми в спектре интенсивностями первого и третьего каналов;

- заключение о присутствии или отсутствии патогенных бактерий можно сделать, используя только одно соотношение, то есть при классификации чистого мяса от зараженного третий канал не требуется;

- введение дополнительного канала ведет к существенному удорожанию прибора, так как необходим дополнительный спектральный селектор и приемник излучения;

- третий приемник необходим только в.том случае, если необходимо установить степень загрязненности образца.

Таким образом, для обнаружения общего микробиологического загрязнения мяса используется двухканальная схема, формирующая сигнал для алгоритма принятия решения в виде отношения двух интенсивностей первого и второго канала.

Оценки значений М(Х,) и о(Х,) для диапазонов локализации максимумов спектров люминесценции приведены в табл. 3.

В дальнейшем при исследовании характеристик и свойств аппаратуры в качестве сигнала люминесценции на будет приписываться значение квазислучайной величины, выработанной датчиком случайных чисел по программе со значениями

Табл.3.

Средние значения и среднеквадратические отклонения интенсивностей фотолюминесценции на X! = 515 им, Х2 = 545 нм

Характеристика образца Мм [фотон/с] Он [фотон/с] Ми [фотон/с] ou [фотон/с]

0 часов 288 9 283.8 <а <293.7 22.3 19 3 <о< 26.2 174.3 169.2 <а< 179.1 21.1 19.1 <о<25.98

12 часов • 160.7 156.1 <а< 165.3 20.9 183 <а< 24.7 235.7 1 24.59 230.1<а<241.2 i 21.39<ст< 2901

24 часа 154.4 151.4 <а< 157.2 12.7 11.1 <а< 14.7 271.8 265.8 <а<277.5 25.9 22.5 < а <303

48 часов 139.5 137.4 <а< 141 6 10 5 9 03< а < 12.2 193 8 190.2 <а< 197.4 163 14.19<а< 19.23

Предлагается структура оптико-электронной аппаратуры для оценки информативных признаков, рис.10. Оценивается мощность источника излучения, который можно применить совместно с лавинными фотодиодами. Вычисляются потоки излучения фотолюминесценции, падающие на чувствительную площадку приемника излучения; Пороговые потоки вычисляются на основе рассчитанных выходов люминесценции и мощности возбуждающего источника излучения. Потоки, падающие на фотоприемник, составляют: для диапазона 500 - 520 нм: (Вт), для диапазона 540-

560 нм 2.2-10"9 (Вт) и для диапазона 570-590 нм: 1.3-10'" (Вт).

Выходы люминесценции рассчитаны на основе данных полученных от свежего мяса, содержащегося 0 часов при 20 "С. После содержании образцов некоторое время при их выходы люминесценции увеличиваются в два и более раз. Таким образом, можно сделать вывод, что потоки,

рассчитанные для свежего мяса, являются минимальными потоками фотолюминесценции, возникающими при работе прибора.

Показана возможность и целесообразность использования метода спектрального отношения в системе обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов. Рассмотрены возможные информативные признаки. Определена структурная схема оптико-электронного-прибора обнаружения микробиологического загрязнения пищевых продуктов отвечающая алгоритму обработки и уровням сигналов имеющих место на практике.

яои Гоиф, •• 1 !

Рис. 10 Структурная схема ОЭП обнаружения микробиологического загрязнения. З.Г. - Задающий генератор импульсов; И.И. - источник излучения; Ф1, Ф2 — светофильтры; 01, 02 - микрообъективы, П0И1, П0И2 - приемники излучения; ИУ1, ИУ2 - избирательные усилители; СД1, СД2 - синхронные детекторы; АДН - аналоговый делитель напряжений; К - компаратор, АИ - аналоговый индикатор.

В четвертой главе проведено математическое моделирование работы портативного прибора контроля общего уровня бактериальной загрязненности. Разработана имитационная модель прибора обнаружения общей микробиологической загрязненности, обладающая высокой универсальностью и экономичностью, позволила оценить с помощью машинного эксперимента средние уровни ошибок распознавания, характерные для различных сочетаний параметров элементов структурной схемы. Определены параметры системы, такие как полоса частот избирательного усилителя, мощность излучения лазера, радиус входного зрачка приемного объектива.

Рассматриваются результаты функционирования программы. Приводятся гистограммы отношения первого и второго канала прибора на

рис.11. и признаковое пространство на основе трех спектральных каналов на рис.12. Определяется пороговое значение признаков. Оценивается эффективность принятия решения о наличии или отсутствии загрязненности образца при использовании двух и трех диапазонов длин волн. В качестве оценки эффективности обнаружения используем вероятности правильных или ошибочных решений.

0 5 06< 08 09< II 1 25 14 155 17 1Х2,1 ,

Рис 11. Гистограммы распредепения точек двухканальной системы обнаружения. 1-область точек, соответствующая чистому мясу, 2 - область точек, соответствующая мясу, содержащемуся 12 часов при 20 "С, 3 - область точек, соответствующая мясу, содержащемуся 24 часа при 20 *С, 4 - область точек, соответствующая мясу, содержащемуся 48 часов при 20 *С.

Рис.12 Признаковое пространство, построенное с использованием трех спектральных каналов 1»ь 1ц и 1«. 1 - область точек, соответствующая чистому мясу, 2 - область точек, соответствующая мясу, содержащемуся 12 часов при 20 "С, 3 - об пасть точек, соответствующая мясу, содержащемуся 24 часа при 20 'С, 4 - область точек, соответствующая мясу, содержащем) ся 48 часов при 20 "С.

Вероятность оощеи ошибки системы с двумя диапазонами составляет Рощ = 0.04. Вероятность общей ошибки системы использующей три диапазона составляет Р0щ = 0.035.

В заключении подведен итог полученных в диссертационной работе

результатов. Основные результаты и выводы работы могут быть сформулированы следующим образом:

1. Проведен обзор различных методов и систем контроля бактериальной загрязненности. Показано, что среди исследованных методов определения наличия бактерий оптические методы, а именно - методы спектрально-флуоресцентного анализа, позволяют проводить бесконтактный контроль;

2. Проведено экспериментальное исследование динамики спектров фотолюминесценции мяса в зависимости от временного фактора; Вычислены выходы люминесценции образцов;

3. Проведен анализ полученных спектров люминесценции образцов, найдены области отличий, определена ширина вырезаемых диапазонов из всего спектра люминесценции, определено количество диапазонов. Предложены аппроксимации кривых функций математического ожидания и среднеквадратического отклонения;

4. Произведен отбор информативных признаков и на их основе составлено признаковое пространство. Предложена структура аппаратуры для измерения этих признаков;

5. Произведена оценка эффективности обнаружения флуоресцентного метода дистанционного обнаружения патогенных бактерий на поверхности пищевых продуктов;

6. Получены численные оценки ошибок первого и второго рода флуоресцентного метода определения наличия патогенных бактерий на поверхности мясных продуктов;

7. Построена статистическая цифровая модель оптико-электронной системы обнаружения микробиологического загрязнения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Демин Р.Е., Лукин СБ. Обнаружение и контроль пищевых патогенных бактерий с помощью дистанционного флуоресцентного метода. — Труды второй международной конференции молодых ученых и специалистов «Оптика 2002». Тезисы докладов. Санкт-Петербург, 2002, с.35.

2. Демин Р.Е., Лукин СБ. Экспресс метод бесконтактного обнаружения патогенных бактерий на поверхности мясных продуктов.- Научно-технический вестник СПбГИТМО(ТУ). Выпуск 9.2003, 80-83 с.

3. Демин Р.Е., Лукин СБ. Флуоресцентный метод бесконтактного обнаружения и контроля патогенных организмов на поверхности пищевых продуктов.- Труды третьей международной конференции молодых ученых и специалистов «Оптика 2003». Санкт-Петербург, 2003,282 с.

Тиражирование и брошюровка выполнены в Центре "Университетские Телекоммуникации". Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14 Тел. (812) 233-46-69. Лицензия ЦДЛ № 69-182 от 26.11.96 Тираж 100 экз.

»11977

Введение

1. Методы и схемы бактериальной идентификации

1.1 Методы обнаружения патогенных микроорганизмов и возможность их использования в микробиологических датчиках безопасности

1.2 Флуоресцентный метод дистанционного контроля качества пищевых продуктов

1.3 Источники и приемники излучения для фото люминесцентных измерений

1.4 Выводы по главе

2 Экспериментальное определение возможности детектирования трансформации спектров фотолюминесценции тестируемых образцов

2.1 Описание методики проводимых экспериментов

2.2 Схема установки экспериментального определения возможности детектирования трансформации спектров фотолюминесценции образцов

2.3 Результаты эксперимента

2.4 Оценка идентичности полученных экспериментальных данных со спектрами зараженного мяса

2.5 Математическая статистическая модель спектров люминесценции

2.6 Выводы по главе

3 Анализ спектров и алгоритмы обработки сигналов

3.1 Отбор информативных признаков системы обнаружения микробиологического обнаружения пищевых продуктов

3.2.Структура оптико-электронной аппаратуры для оценки выбранных информативных признаков

3.3 Выводы по главе

4 Математическое моделирование работы аппаратуры

4.1 Описание метода моделирования

4.2 Описание модели

4.3 Описание результатов имитационного моделирования и эффективности принятия решения

4.4 Выводы по главе

Вирусы бактерий и другие микроорганизмы широко распространены повсюду в природе и окружающей среде. Некоторые потенциально опасные микроорганизмы могут быть причиной различных инфекционных заболеваний. Микробиологические заболевания, вызванные патогенными бактериями, составляют главную причину смерти во многих странах мира.

Мясо сельскохозяйственных и диких промысловых животных, птицы и продукты их переработки составляют значительную долю в рационе питания человека. Они служат источником биологически полноценных белков, жиров, витаминов и минеральных веществ, необходимых для нормального протекания жизненных процессов в организме. Однако продовольственное сырье и пищевые продукты животного происхождения могут представлять собой опасность, если они были получены или изготовлены с нарушением санитарно гигиенических правил. В результате чего при заготовке и на этапах обращения производственной пищевой продукции (хранение, транспортирование, реализация) она была инфицирована патогенной, токсигенной и сапрофитной микрофлорой. Пути обсеменения мяса микрофлорой чрезвычайно разнообразны. Мясопродукты могут заражаться возбудителями, обладающими высокой выживаемостью, от объектов внешней среды. Источником заражения также могут быть инвентарь, оборудование, руки работников мясоперерабатывающих предприятий и насекомые. Большую опасность для здоровья людей представляет мясо животных с инфекционными заболеваниями. У таких животных микроорганизмы проникают во внутренние органы и ткани еще до убоя (прижизненное обсеменение). Бактерии вида Escherichia-coli, вызывающие эшерихозы могут легко заражать туши говядины, сырое молоко и мясо курицы, поэтому тщательный контроль этого патогена очень важен особенно в пищевом производстве. Род бактерий Salmonella - опасный пищевой патоген, содержит более 2000 видов, большая часть которых может стать причиной сальмонеллезов. Основной путь передачи инфекции - пищевой. [1,2,3]

Мясо и мясо продукты представляют собой благоприятную среду не только для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, но и, в ряде случаев, для их размножения и накопления, что представляет собой опасность для жизни и здоровья человека. Мясные продукты могут играть значительную роль в распространении инфекционных заболеваний.

Приведем в табл. 1 некоторые примеры заболевания бактериальной этиологии, передающиеся через мясо животных, птицы и продукты их переработки.

Табл 1.

Заболевания бактериальной этиологии, предающиеся через мясо животных, птицы и продукты их переработки [6]

Заболевание Источник инфекции

Животные Птица Человек

Сибирская язва +

Лептоспироз +

Листериоз + +

Сальмонеллез + + +

Колибактериоз + + +

Брюшной тиф +

Ботулизм +

Туберкулез + + +

Важнейшим звеном в системе профилактических мероприятий по предупреждению заражения людей через потребляемое мясо и продукты их переработки, а также распространения инфекционных заболеваний среди животных является бактериологическое исследование, которое позволяет гарантировать санитарное благополучие продовольственного сырья и вырабатываемой из него продукции [4,5,6].

В мире и в нашей стране очень большое внимание, уделяется обнаружению микроорганизмов, вызывающих серьезные заболевания. Однако на рынке для бытового применения отсутствуют общедоступные средства диагностики бактериальных загрязнений пищевых продуктов, быстродействующие, достаточно надежные, простые в применении и доступные по цене. Эффективное обнаружение и идентификация бактерий требует методов анализа, которые должны отвечать ряду важных критериев обнаружения патогенных микроорганизмов. Самые важные критерии - это время, чувствительность и стоимость анализов.

Известные методики оперативного обнаружения патогенных микроорганизмов базируются на различных физических принципах; большинство методов позволяет довольно точно обнаружать микроорганизмы при концентрации бактерий 104-10б клеток/мл, в некоторых случаях при концентрации 103 клеток/мл. Надо сказать, что эти данные о минимальных концентрациях относятся к определенному ранее типу бактерий, находящихся в чистом физиологическом растворе. Для использования этих методов необходимо производить отбор и очистку проб, что затрудняет их применение на практике. Недостатком существующих лабораторных методов бактериальной идентификации является то, что эти методы контактны, требуют сложного, дорогостоящего оборудования, и имеют время интерпретации результатов, не позволяющее определять зараженность образцов в режиме реального времени [5]. Под реальным временем понимается определение наличия бактериальной зараженности образцов без дополнительного приготовления образца для измерений.

Другим фактором, препятствующим использованию большинства методик в быту, является контактность измерений, что может привести к бактериальному заражению при их проведении неподготовленным человеком.

Из изложенного можно сделать следующий вывод, что наиболее перспективными методами дистанционного обнаружения патогенных бактерий являются прямые оптические методы, а именно, методы основанные на использовании эффекта люминесценции. Оптические методы, а именно - методы спектрально-флуоресцентного анализа, позволяют проводить бесконтактный контроль. Таким образом, несмотря на отдельные преимущества других методов, такие как чувствительность, возможность идентификации видов и родов бактерий, возможность количественного обнаружения бактерий, настоящее время лишь оптические методы являются возможной основой для создания портативных приборов оперативного контроля уровня общей микробиологической загрязненности.

Попытки использовать спектральные характеристики люминесценции микроорганизмов в качестве одного из классифицирующих признаков предпринимались достаточно давно. Исследование первичной флуоресценции микроорганизмов различных групп показало, что бактерии, относящиеся к разным родам и видам, флуоресцируют, как правило, весьма сходно. Это и понятно, так как ответственными за такую флуоресценцию служат клеточные белки, точнее аминокислота триптофан. Лишь у некоторых видов была обнаружена специфическая флуоресценция, связанная с накоплением в клетках флуоресцирующих веществ. [7]

Таким образом, используя указанную методику невозможно определять роды и виды бактерий, так как спектры флуоресценции у различного вида бактерий схожи, из-за того, что вещества, ответственные за спектры флуоресценции присутствуют во многих микроорганизмах.

Существующие методы могут определять концентрацию патогенов в воде, еде, мясе в частности и клинических образцах. Они базируются на различных принципах определения. Например, хемилюминесценция, инфракрасная или флуоресцентная спектроскопия, биолюминесценция и другие. На протяжении последних 15 лет наметился значительный рост в использовании явления флуоресценции в биологии. Флуоресценция сейчас используется в мониторинге окружающей среды, клинической химии и генетических анализах и потоковой цитометрии [8,10,15,18,25,29,32,49,54].

Приведенные факты говорят об актуальности темы представляемой работы. Целью работы является создание системы обнаружения микробиологического загрязнения пищевых продуктов, в частности сырого мяса крупного рогатого скота.

В работе оценивается возможность обнаружения патогенных бактерий на поверхности пищевых продуктов. Проводятся эксперименты на стационарной аппаратуре. На основе экспериментальных данных производится построение статистической модели трансформации спектров фотолюминесценции исследуемого пищевого продукта. Выбирается признаковое пространство. Разрабатываются алгоритмы оценки информативных признаков. Предлагается теоретическая реализация схемного решения оптико-электронного прибора контроля общего уровня микробиологической загрязненности пищевых продуктов. Выполняется математическое моделирование работы прибора. Оценивается эффективность принятия решения на основе статистических расчетов и компьютерного моделирования.

Для решения поставленных задач в первой главе проводится анализ различных методов и устройств контроля бактериальной загрязненности. Дана общая характеристика известных методов. Существующие методы разделены на группы: прямые и непрямые, контактные и бесконтактные. Даны оценки предельно определяемых концентраций. Для рассмотренных методов приведены их характеристики: время анализа и предельно измеряемые концентрации. Показано, что наиболее перспективными методами с точки зрения быстроты, простоты реализации и безопасности для человека являются оптические методы. Приводятся некоторые схемы флуоресцентного анализа. Рассматриваются возможные источники и приемники оптического излучения для флуоресцентного метода анализа бактериальной загрязненности.

Во второй главе представляется экспериментальная стационарная установка и результаты экспериментов. Источником излучения для флуоресцентного метода исследования был выбран аргоновый лазер. Для регистрации сигнала флуоресценции используется спектрофотометр и фотоумножитель, работающий в режимы счета фотонов.

Сущность метода состоит в том, что спектры чистого мяса и искусственно зараженного, по прошествии нескольких часов отличаются качественно и количественно. Указанный эффект используется для решения вопроса о присутствии или отсутствии патогенных бактерий на тестируемой поверхности. Вероятной причиной изменения спектров флуоресценции являются продукты метаболизма бактерий. В работе проводятся эксперименты по изучению динамики спектров мяса, содержащегося при комнатной температуре (20 °С) без нанесения на него патогенных бактерий.

В третьей главе рассматриваются алгоритмы обработки спектров и сигналов. Анализируются спектры и находятся области отличий. Выбираются рабочие диапазоны длин волн и необходимая ширина вырезаемых из всего спектра люминесценции диапазонов. Показывается возможность и целесообразность использования метода спектрального отношения в системе обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов. Выбирается количество вырезаемых из всего спектра диапазонов. Производится отбор информативных признаков. Разрабатываются алгоритмы обработки информативных признаков, строится признаковое пространство. Показано, что нет необходимости в использование третьего канала. Определена структурная схема оптико-электронного прибора обнаружения общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов отвечающая алгоритму обработки и уровням сигналов имеющих место на практике.

В четвертой главе проводится математическое моделирование работы аппаратуры. Дается описание метода моделирования, показывается адекватность такого моделирования, представляются результаты имитационного моделирования работы устройств на ЭВМ и оцениваются общие уровни ошибок характерные для различных сочетаний параметров элементов структурной схемы, такие как полоса частот избирательного усилителя, мощность излучения лазера, радиус входного зрачка приемного объектива. Оценивается эффективность принятия решения, используя предложенное признаковое пространство. Показано, что предложенные признаки позволяют с высокой степенью эффективности производить классификацию пищевых продуктов на наличие патогенных микроорганизмов.

В качестве объектов исследования выбрано мясо, так самые опасные пищевые отравления происходят при использовании в пищу некачественных, зараженных мясных продуктов. Мясо и мясопродукты представляют собой благоприятную среду не только для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, но и для их размножения и накопления.

Автор выражает благодарность кафедре Оптико-электронных приборов и систем за сотрудничество и к.т. н., доценту Лукину С.Б. за руководство.

4.4 Выводы по главе

Разработанная имитационная модель прибора для обнаружения общей микробиологической загрязненности, обладающая высокой универсальностью и экономичностью, позволила оценить с помощью машинного эксперимента средние уровни ошибок распознавания, характерные для различных сочетаний параметров элементов структурной схемы. Определены возможные параметры системы, такие как полоса частот избирательного усилителя, мощность излучения лазера, радиус входного зрачка приемного объектива. Предложенная модель позволила определить границы и оценить вероятности ошибок в процессе обнаружения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературы позволил сделать следующий вывод, о том, что имеются некоторые сложности в разработке биодатчиков для достоверного, быстрого и эффективного применения в промышленности и быту. Система биодатчика должна различать самые разные бактерии, должна иметь: высокую адаптивность, чтобы определять различные образцы, высокую чувствительность, чтобы определять бактерии прямо, без обогащения и быстроту. В то же самое время, биодатчик должен быть простым в эксплуатации и быть доступным по цене.

Проведенные в работе результаты обзора литературы и экспериментальных исследований показали, что возможна физическая реализация прибора контроля общей микробиологической загрязненности. Эта реализация обеспечивает эффективное принятие решения с вероятностью ошибки < 0.05, в случае концентрации бактерий не менее 106 см"2.

Современный уровень развития элементной базы лазерной техники ограничил круг эффективных признаков, используемых для обнаружения. Эффективное обнаружение загрязнения (с вероятностью ошибки обнаружения < 0.05) достигается с использование блока лазерного полупроводникового источника с длинной волны излучения 405нм, двух спектральных селекторов и двух фотоприемников - пары лавинных фотодиодов, согласованных по температурному уходу напряжения лавинного пробоя.

Экспериментальное исследование образцов на стационарной аппаратуре позволило сделать вывод о возможности обнаружения на поверхности образцов микробиологического загрязнения. Дана оценка выходам фотолюминесценции образцов, выбраны диапазоны длин волн, отношение которых дает необходимую информацию о качестве исследуемого продукта. На основе выходов фотолюминесценции образцов, оценивались характеристики модели оптико-электронного прибора контроля уровня общего микробиологического загрязнения пищевых продуктов.

Произведено сравнение спектров и их изменений искусственно зараженного мяса патогенными бактериями, со спектрами образцов без искусственного заражения с использованием только старения в естественных условиях при комнатной температуре. После проведенного сравнения спектров ясно, что для дальнейшей обработки, создания методик и алгоритмов классификации продуктов, для построения адекватной статистической модели излучения люминесценции имеет смысл использование информации, полученной от спектров состаренного мяса, без использования патогенных бактерий. Также был произведен анализ результатов экспериментов: построена статистическая модель спектров с вычислением математических ожиданий, дисперсий и доверительных интервалов, проведены аппроксимации экспериментальных кривых.

Результаты экспериментов позволили разработать статистическую модель фотолюминесценции на XI и Х2, на которых наблюдается наибольшая деформация спектральных кривых при поражении пищевых продуктов (мяса) микробиологическими объектами.

В третьей главе рассмотрены возможные информативные признаки. Оценено их необходимое количество. Выбраны рабочие диапазоны длин волн и их необходимая ширина. Определены алгоритмы обработки принимаемых сигналов фотолюминесценции и смоделированы структурные схемы устройств последетекторной обработки смеси сигнала с шумом, обеспечивающие измерение значений признаков. Построено признаковое пространство. Предложена структурная схема оптико-электронного прибора контроля микробиологического загрязнения пищевых продуктов.

Для исследования эффективности работы смоделированной . системы распознавания разработана имитационная модель оптико-электронного прибора, определены реальные уровни входных параметров модели (ширина полосы частот избирательного усилителя, мощность лазерного источника, расстояние от источника до образца, расстояние от объекта фотолюминесценции до входного зрачка приемного объектива). Имитационная модель прибора для обнаружения общей микробиологической загрязненности, обладающая высокой универсальностью и экономичностью, позволила оценить с помощью машинного эксперимента средние уровни ошибок обнаружения, характерные для различных сочетаний параметров элементов структурной схемы.

Таким образом, в работе решены поставленные во введении задачи. Перспектива развития технологии биодатчиков прямого обнаружения бактерий для использования в промышленности и быту позволит контролировать качество пищевых продуктов, что в современной ситуации в мире очень важно.

1. Донченко Л.В., Надыкта В.Д.// Безопасность пищевого сырья и продуктов питания. М.: Пищевая промышленность, 1999. — 352 с.

2. Карцев В.В., Белова Л.В., Иванов В.П. //Санитарная микробиология пищевых продуктов. СПб: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2000. - 311 с.

3. Микробиология продуктов животного происхождения //Т.Д. Мюнх, X. Заупе, М. Шрайтер и др. М.: Агропромиздат, 1985. - 592 с.

4. Артемьева С.А. и др. // Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки: Справочник / С.А Артемьева, Т.Н. Артемьева, А.И. Дмитриев, В.В. Дорутина. М.: Колос, 2002. - 288с.

5. Артемьева С.А.// Руководство по бактериологическому исследованию мяса. М.: Агропромиздат, 1989. - 112 с.

6. Санитарная микробиология: Справочник //В.П. Иванов, А.Г. Бойцов, А.А. Порин и др. -СПб.: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 1998. 310 с.

7. В.Г. Петухов, И.С. Осин // Длительная люминесценция микроорганизмов при комнатной температуре: природа и применение. С.207-227.

8. Biosensors for detection of pathogenic bacteria: Review I D.Ivnitski, I. Abdel-Hamid, E. Wilkins // Biosensors & Bioelectronics. 1999. N14. P.599-624.

9. Swenson F.J. 1993. Development and evaluation of optical sensors for detection of bacteria. Sensors Actuators В 11. 315-321/

10. Cush R., Cronin, N.J., Stewae, W.J., Maule, C.H., The resonant mirror a novel optical biosensor for direct sensing of bimolecular interactions. Biosensors Bioelectronics. 8, 347-353.

11. Watts H.J., Lowe, C. R.,1994. Optical biosensor for monitoring microbial cells. Anal. Chem, 66,2465-2470.

12. Флюоресцентный метод дистанционного контроля качества пищевых продуктов/ В.И. Земский, О.В.Клим, Л.А. Кафтырева, И.К. Мешковский //Известия вузов. Приборостроение. 2002. T.45.N1.C.60-62.

13. Folley-Thomas Е.М., Whiplle, D.L, Bermudez, L.E., 1995. Phage infection, transfection and transformation of Mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter gene. Microbiology 141,1173-1181.

14. Sarkis G.K., Jacobs, W.R. 1995. Liciferase reporter of live mycobacterium. Mol. Microbiol. 15, 1055-1067.

15. Turphin P.E., Maycroft, К.A.,Bedford, J., Rowlands, C.L., 1993. A rapid luminescent phage-based MPN method for the enumeration of Salmonella typhimurium in environmental samples. Lett. Appl. Microbiol. 16, 24-27.

16. Loessner M.J., Rees, C.E.D., Stewart, G.S.A.B, Scherer, S., 1996. Construction of luciferase reporter bacteriophage A511: lux AB for rapid and sensitive detection of viable Listeria cells. Appl. Environ. Microbiol. 62,1133-1140.

17. Blasco R., Murphy, M. J., Sanders, M.F., Squirrell, D.J., 1998. Specific assays for bacteria using phage mediated release of adenylate kinase. J. Appl. Microbiol. 84, 661-666.

18. He, F.J., Geng Q., Zhu, W., Nie, L.H., Yao, S.Z., 1994. Rapid detection of E.coli using a separated electrode piezoelectric crystal sensor. Anal. Chim. Acta 289, 313-319.

19. Bao L., Deng, L., Nie, L., Yao, S., 1996. Determination of microorganisms with a quartz crystal microbalanse sensor. Anal. Chim. Acta 319,97-101.

20. Prusak-Sochacvzewski, E., Luong, J.H.T., Guilbault, G.G., 1990 Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of salmonella typhimurium. Enzyme Miocrobiol. Technol. 12, 173-177.

21. Koenig В., Gratzel, M., 1993b. Detection of viruses and bacteria with piezoelectric immunosensors. Anal. Lett. 26(8), 1567-1585.

22. Silley P, Forsythe S., 1996. Impedanse microbiology: a rapid change for microbiologist. J. Appl. Bacteriol. 80,233-243.

23. Harris C.M., Kell, D.B., 1985. The estimation of microbial biomass. Biosensors 1.17-24.

24. Dezenclos Т., Asconcabrera, M., Ascon, D., Lebeault, J.M., 1994. Optimization of the inderect impedancemetri technique a handy technique for microbial growth measurenment. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 232-238.

25. Deng, L., Bao, L.L, Yang, Z.Y, 1996. In-situ continues detection of bacteria on the surface of solid medium with a bulk acoustic wave-impedance sensor. J. Micribiol. Methods 26 (l-2, 197 -203.

26. Wijesuriya D.C., Anderson, G.P., 1994. A rapid and sensitive immunoassay for bacterial cells. Proceedings of the 1993 ERDEC Scientific Conference on Chemical Defense Research, 16-19 November. Report No. ERDEC-SP-024, pp. 671-677.

27. Yu, H., Stopa, P.J., 1995 Application of an immunomagnetic assay system for detection of virulent bacteria in biological samples. In: Van Emon, J.M., Gerlach, C.L., Jonson, J.C.,

28. Environmental Immunochemical Methods: Perspectives and Applications. ACS, Washington, DC, pp.397-306.

29. Yu, H., Bruno, J.G.,1996. Immunomagnetic-electrochemiluminescent detection of E.coli 0157 and Salmonella typhimurium in foods and environmental water supplies. Appl. Environ. Microbiol. 62 (2), 587-592.

30. Takayama, K., Kurosali, Т., Ikeda, Т.,1993. Mediated electrocatalysis at biocatalyst electrode bnased on a bacterium Gluconobacter industries. J Elecroanalyt. Chem. 356,295-301.

31. Wilkins, J.R., Young, R., Boukin, E., 1978. Multichannel electrochemiocal microbial detection unit. J. Appl. Environ. Microbiol. 35,214-215.

32. Matsunaga, Т., Karube, I., Suzuki, S., 1979. Electrode system for the determination of microbial populations. Appl. Env. Microbiol. 37,117-121.

33. Perez, F.G., Mascini, M., Tothill, I.E., Turner, A.P.F., 1998. Immunomagnetic separation with media flow-injection analysis amperometric detection of viable E.coli 0157. Anal. Chem. 70, 2380-2386.

34. Gegring. A.G., Craword, C.G., Mazenko, R.S., Van Houten, L.J., Brewster, J.D., 1996. Enzyme-linked immunomagnetic electrochemical detection of Salmonella typhimurium. J. Immunol. Methods 195, 15-25.

35. Holland, R.L., Cooper, B.H., Hegelson, N.G.P., Mc Craken, A.W.,1980. Automated detection of microbial growth in blood cultures by using stainless steel electrodes. J.Clin, microbiol. 12, 180-184.

36. Jenkins, S.H., Heineman, W.R., Halsall, H.B., 1988. Extending the detection limit og solid-phase electrochemical enzyme immunoassay to the attomolo level. Anal. Biochem. 168, 292299.

37. Gehring, A.G., Patterson, DI., Si, Т., 1998. Use of a light-addressable sensor for detewction of E. Coli 0157:H7. Anal. Biochem. 258, 293-298.

38. Libby, J.M., wada, H.G., 1989. Detection of Nesseria meningitidis and Yersinia pestis with a novel silicon-based sensor. J Clin. Microbiol, 27,1456-1459.

39. Nakamura, N., Shigematsu, A., Matsunaga, Т., 1991. Electrochemical detection of viable bacteria in urine and antibiotic selection. Biosensors Bioelectron. 6(7), 575-580.

40. Brooks, J.L., Mirhabibollahi, В., Kroll, r.G., 1990. Sensitive enzyme-amplified elecrrical immunoassay for protein A-bearing Staphylococcus aureys in foods. Appl. Environ. Microbiol. 56, 3278-3284.

41. Kim, H.,J.,Bennetto, H.,P., Halablab, M.,A., 1995. A novel liposome-based electrochemical biosensor for the detection ofhaemolutic microorganisms. Biotechnol. Techn. 9(6), 389-394.

42. Brewster, J.D., Gehring, A.G., Mazenko, R.S., Vamhouten, L. J.,Crawford, С J.,1996. Immunoelectrochemical assays for bacteria: use of epifluorescence microscopy in development of an assay for Salmonella. Anal. Chem. 68 (23), 4153-4159.

43. Rispon, J., Ivnitski, D., 1997. An amperometric enzyme-channeling immunosensor. Biosensor Bioelectron. 12 (3), 195-204.

44. Rispon, J., Ivnitski, D., 1996. Amperometric enzyme-channeling immunosensor., Ann. NY Acad.Sci. 799, 508-513.

45. Abdel-Hamid, I., Ivnitski, D., atanasov, P., wilkins, E., 1998a. Fast amperometrci assay for E.coli 0157:H7 using partially immersed immunoelectrodes. Electroanalysis 10(11), 758-763.

46. Clark, C.r., Hines, k.K., Mallia, a.K., 1993. 96-Well apparatusand method for use in enzyme-linked immunofiltration assay. Biotechnol. Tech. 7,461-466.

47. Paffard, S.,M.,Miles, R.,J,,Clark, C.,R., Price,R.G., 1996. A rapid and sensitive enzyme-linked immunofilter assay for whole bacterial-cells. J. Immunol. Methods 192 (1-2), 133-136.

48. Bouvrette, P., Luong, J.H.T.,1995. Development of a flow-injection analysis immunosensor for the detection of E.coli. Intl. J. Food Microbiol. 27 (2-3), 129-137.

49. Brewster, J.D., Mazenko, R.S., 1998. Filtration capture and immunoelectrochemical detection for rapid assay of E.coli 0157:H7. J. Immunol. Methods 211 (1-2), 1-8.

50. Schmid, R.D. (ed), 1991/ Flow injection analysis based on enzymes or antibodies. GBF Monographs, vol. 14. Weinheim, Grmany.

51. Ding, Т., Bilitewski, U., Schmid, R.,D., Korz, D.,J., Sanders, E.,A.,1993. Control of microbial activity by flow injection analysis during high cell density cultivation of E. Coli. J Biotechnol. 27,143-157.

52. Abdel-Hamid, I., Ghindidlis, A.L., Atanasov, P., Wilkins,m E., 1998b. Development of a flow-through immunoassay system. Sensors Actuators b 49 (3), 202-210.

53. Abdel-Hamid, I., Ghindidlis, A.L., Atanasov, P., Wilkins,. E., 1999a. Flow-through immunofiltration assay system for rapid detection of E.coli 0157:H7. Biosensors Bioelectronics 14, 309-316.

54. Tenover,F.,C., 1988. Diagnostic Dexyribonikcleic acid probes for infections diseases. Clin. Microbiol. Rev. 1, 82.

55. Tretjen, M., Fung, D.Y.C., 1995. Salmonella and food safety. Crit. Rev. Microb. 21, 53-83.

56. Zhai, J.H., Cui, H., Yang, R.F., 1997. DNA-based biosensors. Biotechnol. Adv. 15(1), 43-58.

57. Feng, P., 1992. Commercial assay systems for detecting food borne Salmonella a review. J. Food Protect. 55, 927-934.

58. Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А., Кравченко А.В., Серебровская Л.В., Покровский В.В. //Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ инфицированных пациентов. Вопр. Вирусол. 1998; 2:91-5.

59. Jones, D.D., Law, R., Bej, A.K., 1993. Detection of Salmonella in oysters using polymerase chain reactions and gene probes. J. Food Sei. 58,1191-1193.

60. Mikkelsen., S.R., 1996. Electrohemical biosensors for DNA sequence detection. Electroanalysis 8(1), 15-19.

61. Бахшиев Н.Г. // Введение в молекулярную спектроскопию: Учеб. Пособие.- 2-е изд. Испр. И доп. JL: Изд-во Ленингр. Ун-та, 1987. 216 с.

62. Lakowicz, Joseph R, Principles of fluorescence spectroscopy/ Joseph R. Lakowicz. 2nd ed.

63. JI.B. Левшин, A.M. Салецкий. // Оптические методы исследования молекулярных систем 4.1. Молекулярная спектроскопия. М.: Изд-во МГУ, 1994 - 320 с.

64. Климков Ю.М. // Основы расчета оптико-электронных приборов с лазерами. М.: Сов. Радио, 1978.-264 с.

65. Лёвшин Л.В., Салецкий А.М. // Люминесценция и ёё измерения: Молекулярная люминесценция. М.: Изд-во МГУ, 1989. - 272 с.

66. Ишанин иГ.Г. Э.Д. Панков, В.П. Челибанов. // Приемники излучения. СПб.: Изд-во Папирус, 2003. - 527 с.

67. Аксиненко М.Д. // Приемники оптического излучения. Москва. 1987 г.

68. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П. , Рыбакова A.M.// Микробиология: Учебник. -2-е изд., перераб. И доп. М.: Медицина, 2003. - 336 с.

69. Королюк A.M. // Медицинская Микробиология, Санкт-Петербург, ЭЛБИ-СПб, 2002 г.-267 с.

70. Герасимович А.И. // Математическая статистика 2-е изд. М.: Высшая школа, 1983.- 279 с.

71. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика М.: Высшая школа, 2000. - 479 с.

72. Поскачей А.А., Чубаров Е.П. // Оптико-электронные системы измерения температуры. -2-е изд., перераб. И доп. М.: Энергоатомиздат, 1988. - 248 с.

73. Якушенков Ю.Г.// Теория и расчет оптико-электронных приборов. М. Машиностроение, 1989 г.-ЗбО стр.

74. Мосягин Г.М. и др. //Теория оптико-электронных систем: Учебник для студентов вузов по оптическим специальностям / Г.М. Мосягин, В.Б. Немтинов, Е.Н. Лебедев. М.: Машиностроение, 1990.-432 с.

75. Тихонов В.И., Харисов В.Н.,// Статистический анализ и синтез радиотехнических устройств и систем: Учеб пособие для вузов. М.: Радио и связь, 1991.- 68 с.

76. Горелик А.Л., Скрипкин В.А.// Методы распознавания: Учеб. Пособие для вузов. 3-е изд., перераб. И доп. - М.: Высш. Шк., 1989. - 232 с.

77. Порфирьев Л.Ф.// Основы теории преобразования сигналов в оптико-электронных системах. Учебник для студентов приборостроительных специальностей вузов. Л.: Машиностроение, Ленингр. Отд-ние, 1989. - 387 с.