автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.06, диссертация на тему:Получение и свойства ферментсодержащих материалов медицинского назначения на основе композиций поливинилового спирта и амфифильных полимеров

0046

6509

^ Ермакова Анна Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КОМПОЗИЦИЙ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА И АМФИФИЛЬНЫХ

ПОЛИМЕРОВ

Специальность 05.17.06 «Технология и переработка полимеров и композитов»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 9 ЛЕК 2010

Москва-2010 год

004616509

с^у^/ Ермакова Анна Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КОМПОЗИЦИЙ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА И АМФИФИЛЬНЫХ

ПОЛИМЕРОВ

Специальность 05.17.06 «Технология и переработка полимеров и композитов»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2010 год

Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон и наноматериалов Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина»

Научный руководитель: доктор химических наук

Юданова Татьяна Николаевна

Официальные оппонента: доктор химических наук, профессор

Зеленецкий Александр Николаевич

кандидат технических наук Матвеев Дмитрий Владимирович

Ведущая организация: Государственное образовательное учре-

ждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Защита диссертации состоится ъ/е^а^иг года в -М^сс часов на заседании диссертационного совета Д 212.139.01 при Московском государственном текстильном университете имени А.Н. Косыгина по адресу: 119071, Москва, Малая Калужская, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина».

Автореферат разослан « » С- года

Ученый секретарь диссертационного совета: д.х.н., профессор Кильдеева Н.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В настоящее время кардинально изменился и расширился арсенал перевязочных средств, однако большинство из них не обладают биологической активностью или являются антимикробными. Несмотря на значительное число работ, посвященных получению полимерных материалов с протеолитической активностью, практически реализованы единицы, что может быть обусловлено объективными причинами, в частности неудовлетворительной стабильностью. Поэтому исследование новых полимерных систем, содержащих ферменты, разработка принципов регулирования их активности с целью создания перевязочных материалов для энзимотерапии гнойных ран является актуальным. Использование таких материалов необходимо для повышения эффективности лечения (снижения аллергенного действия, стоимости лечения за счет уменьшения расхода фермента, повышения его стабильности и т.д.).

Одним из путей регулирования свойств иммобилизованных ферментов является включение их в структуру комплексов, образованных с участием неионогенных полимеров, например амфифильных полимеров. При этом не происходит химическое модифицирование белковых глобул, а стабилизация протеаз достигается за счет гидрофобных взаимодействий и водородных связей. Использование в составе матрицы дешевых и доступных синтетических биодеградируемых полимеров медико-биологического назначения является предпосылкой для разработки технологичных способов переработки полимерных композиций в пленочные покрытия и композиционные материалы на волокнистой основе. К числу таких полимеров относятся поливиниловый спирт, полиэтиленоксид и триблок-сополимер полиэтиленоксида и поли-пропиленоксида. Симметричный триблок-сополимер интересен тем, что способен к самоорганизации с образованием структур различного типа. Системы, содержащие белок и полиэтиленоксид с молекулярной массой от нескольких сотен до тысяч, в настоящее время активно исследуются. В литературе в основном представлены работы, посвященные определению характера продуктов интерполимерного взаимодействия полиэтиленоксида и белков; данные по влиянию на активность ферментов практически отсутствуют. Можно ожидать, что варьирование состава компонентов системы может привести к формированию различных структур, а, следовательно, и свойств иммобилизованного фермента.

Целью работы являлась разработка методов получения раневых покрытий пленочного и волокнистого типа с использованием композиций протеолитических ферментов - трипсина и террилитина и синтетических биосовместимых биодеградируемых полимеров - полиэтиленоксида и/или симметричного триблок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

- установить закономерности иммобилизации трипсина и террилитина в структуре поливинилспиртовых пленок, а также целлюлозных или полиэтилентерефталатных волокнистых материалов с использованием полиэтиленоксида и/или симметричного триблок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида;

- установить влияние структуры полимерных систем на свойства иммобилизованных ферментов;

- установить влияние состава полимерных систем на физико-химические свойства иммобилизованных ферментов и физико-механические свойства биоактивных материалов;

- определить состав многокомпонентной полимерной системы, обеспечивающей высокую активность и стабильность протеаз.

Методы исследования: химические, физико-химические, реологические, УФ- и видимая спектроскопия, нефелометрия, электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). Расчет термодинамических характеристик полимеров выполнен с использованием программного обеспечения дифференциально-сканирующего калориметра DSC Q10 "ТА Instruments" (ГОУ ВПО "МГТУ им. А.Н.Косыгина").

Научная новизна работы.

Установлены особенности структурообразования в полимерных системах, содержащих поливиниловый спирт, трипсин или террилитин и полиэтиленоксид и/или симметричный триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида, которое заключается в пластификации полимерной матрицы или фазовом разделении системы, а его направление определяется содержанием и типом амфифильного полимера и фермента, а также температурой системы.

Показано, что способность фермента к ассоциации имеет решающее значение, определяющее тип локализации фермента при его иммобилизации в струюуре целлюлозной или полиэтилентерефталатной волокнистой матрицы в составе композиции с полиэтиленоксидом.

Установлена взаимосвязь между активностью и стабильностью иммобилизованного трипсина и террилитина и характером распределения фермента в структуре полимерной матрицы пленочного или волокнистого типа, содержащей полиэтиленоксид и/или симметричный триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида.

Установлено повышение активности трипсина, иммобилизованного в структуре поливинилспиртовых пленок, содержащих полиэтиленоксид или симметричный триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида, при длительном хранении, что свидетельствует о протекании в полимерных системах релаксационных процессов.

Практическая значимость. Предложены новые пути регулирования свойств раневых покрытий на основе композиций полимеров медико-биологического назначения для эгоимотерапии ран.

Разработано асимметричное раневое покрытие на основе поливинилового спирта, содержащее полиэтиленоксид, симметричный триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида и трипсина, обладающее высокой активностью, стабильность и удовлетворительной паропроницаемостью.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке полимерных материалов с ферментативной активностью.

Апробация результатов работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007; IX Все-рос. выставке и I Межд. научно-пракг. конф. «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях», Москва, 2009; IV Всерос. научной конф. (с межд. участием) «Физикохимия процессов переработки полимеров», Иваново, 2009; Пятой межд. Каргинской конф. «Полимеры -2010», Москва, 2010.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи, в том числе 3 в журналах, включенных в перечень ВАК, 1 - в журнале "Fiber Chemistry", и 6 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, методической части, главы, посвященной изложению основных результатов и их обсуждению, выводов, списка использованной литературы.

Диссертация содержит 160 страниц машинописного текста, 69 рисунков, 34 таблицы и библиографию из 114 наименований.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Исследование влияния полиэтиленоксида на активность и стабильность трипсина и террилнтина в растворе

Объектами исследований в работе являлись: протеолитические ферменты -трипсин (ТР) и терршштин (ТЕР), поливиниловый спирт (ЛВС), амфифильные полимеры: полиэтиленоксид (ПЭО) с молекулярной массой (ММ) 1,5 , 4 или 6 кДа, симметричный триблок-сополимер полиэтиленкосида и полипропиленоксида (ПЭО-ППО-ПЭО)

-[ СН2 - СН2 - О- ]х [-СН2(СН3Ь СН - О -]у [ -СН2 - СН2 - О- ]х где х = 101, у = 56, ПЭО составляет 73,2 ±1,7% масс., ММ 12,7 кДа.

Для анализа активности иммобилизованных ферментов использовали казеин по Гаммерстену. Изменение активности фермента после иммобилизации характеризовали относительной активностью (ОА) - отношение активности иммобилизованного и нативного фермента, выраженное в процентах. О стабильности фермента судили по остаточной активности после инкубации в течение различного времени в модельных условиях: 0,9% раствор ЫаС1, модуль 10, температура 37 °С.

Композиции ферментов с полиалкиленоксидами получали путем смешения водных растворов компонентов. В результате исследования активности и стабильности трипсина в растворах разного состава, содержащих ПЭО, установлено, что уровень проявляемой активности повышается с увеличением содержания в растворе трипсина или ПЭО при прочих равных условиях. Наибольшую активность в заданных условиях инактивации демонстрировал трипсин в композиции с 2,5% ПЭО ММ 4 кДа (рис. 1). По стабилизирующему эффекту полимеры располагаются в ряд ПЭО 4кДа > ПЭО 6 кДа > ПЭО 1,5 кДа.

В условиях инактивации фермента в некоторых случаях наблюдается повышение его активности свыше 100% от начальной (рис. 1), что связано с разрушением ас-социатов трипсина, для которого характерен гетерологический тип ассоциации. Методом ДСК установлено существование зависимости стабильности ТР от степени его ассоциации: величина эндоэффекга, характеризующая процесс денатурации, изменяется симбатно степени ассоциации. Полученные результаты объясняют стабилизацию фермента в композициях при повышении его содержания.

Содержание в растворе композиции: ПЭО 1, 3 -0,5%, 2 - 2,5%; ТР 1 -0,72%, 2,3 -0,4%. ММ ПЭО: 4 кДа.

Рисунок 1 - Кинетика инактивации ТР в растворах полимерных композиций разного состава, содержащих ПЭО.

12 3 4

Продолжительность инкубации, ч

В зависимости от состава композиций глубина разрушения ассоциатов и структура комплексов с ПЭО, образуемых за счет взаимодействия гидрофобных групп, может быть различна. Об интерполимерных взаимодействиях между белками и ПЭО судили по изменению мутности и реологических свойств растворов. Уменьшение ин-

тенсивности рассеянного светового потока, а также изменение вязкости композиций свидетельствуют о структурных превращениях в полимерной системе.

Сравнительные исследования активности и стабильности двух протеаз в полимерных композициях, содержащих ПЭО, показали стабилизирующее действие в отношении трипсина и дестабилизирующее - террилитина. При этом термостабильность ТЕР в растворе композиции увеличивается с повышением концентрации и ММ ПЭО и максимальна в композиции с ПЭО ММ бкДа, а ОА тем выше, чем выше содержание ПЭО, и минимальна в композиции с ПЭО ММ 4 кДа. А трипсин, напротив, наиболее стабилен в композициях с ПЭО ММ 4 кДа. Стабилизации ТР способствует увеличение концентрации ПЭО в растворе.

Полученные результаты, по-видимому, обусловлены различной конформацией белковых глобул и структурой образуемых интерполимерных комплексов, для оптимальной стабилизации которых должны быть использованы полимерные цепи ПЭО разной длины.

2 Исследование влияния условий формования на свойства иммобилизованных в структуре пленок ферментов

Формование ПВС пленок осуществляли с помощью щелевой фильеры по сухому способу методом полива на подложку формовочных растворов, содержащих 9% ПВС, 0,05-0,5% ПЭО и 0,04-0,072% фермента. Толщина пленок составляла 45±5 мкм.

В результате комплексной оценки активности и стабильности иммобилизованного ТР, реологических свойств формовочных растворов, анализа полимерных пленок разного состава методом ДСК, установлено, что свойства фермента зависят от способа получения формовочного раствора, а именно - от последовательности введения компонентов, что объясняется невысокой скоростью релаксационных процессов в исследуемых системах. Высокую относительную активность трипсина обеспечивает способ, при котором в раствор ПВС вводят сначала фермент, а затем ПЭО, а стабильность - обратная последовательность. В дальнейшей работе для получения пленок использовали последовательность, при которой достигается высокая термостабильность.

Для исследования влияния состава полимерных систем на свойства иммобилизованных ферментов получали пленки из формовочных растворов, состав которых приведен в табл. 1. Как видно, варьирование в формовочном растворе содержания ТР, ПЭО и его ММ приводит к разнонаправленному изменению ОА и стабильности фермента, иммобилизованного в структуре пленки. Снижение ОА иммобилизованного фермента, по-видимому, обусловлено диффузионными ограничениями из-за включения фермента в полимерную матрицу, не растворимую при температуре 37 °С.

С увеличением содержания ПЭО, как правило:

- при содержании 0,04% трипсина ОА и стабильность повышаются, что свидетельствует о большей доступности фермента и конформационной устойчивости белковой глобулы;

- при содержании 0,072% трипсина ОА уменьшается, а стабильность практически не изменяется или снижается в системе с ПЭО ММ 4 кДа.

Изучение кинетики инактивации биоактивных пленок разного состава показало, что зависимость активности иммобилизованного ТР от продолжительности инактивации имеет моно- или полимодальный характер (рис. 2). Это можно объяснить наличием напряжений в пленках и низкой скоростью релаксационных процессов, протекающих в условиях испытаний (модуль 10). Наиболее высокий уровень активности по отношению к начальному демонстрирует трипсин, иммобилизованный в структуре

пленок, содержащих ПЭО ММ 4 кДа (рис. 2), причем увеличение модуля обработки этих пленок с 10 до 20 приводит к повышению активности иммобилизованного фермента примерно в 1,5 раза (рис. 2в). Таблица 1 - Влияние состава формовочных растворов для получения пленок на активность иммобилизованного ТР

Содержание в формовочного раствора ОА, % от нативной Остаточная активность (5 ч, 37°С)

ПЭО ТР,%

% от нативной % от начальной

ММ, кДа %

- - 0,040 61,14 50,30 82,27

- - 0,072 12,64 4,12 32,59

1,5 0,05 0,040 51,78 31,56 60,95

0,25 69,03 40,93 59,29

0,05 0,072 68,68 14,01 20,40

0,25 57,69 14,56 25,24

4 0,05 0,040 4,19 4,68 111,69

0,25 42,41 36,00 84,88

6 0,05 103,55 36,00 34,95

0,25 49,31 29,59 60,00

4 0,05 0,072 24,7 17,86 72,30

0,25 18,96 8,24 43,46

6 0,05 95,88 31,04 32,37

0,25 88,19 31,32 35,51

1 2 3 4 5

Продолжительность инкубаии, ч

12 3 4 Продолжительность инкубации, ч

0,5 1 2 3 5

Продолжительность инкубации, ч

Содержание в формовочных растворах для изготовления пленок: ТР а - 0,04 %, б, в - 0,072 %; ПЭО 1 - 0,05 %, 2 -0,2 5 %, 3-0 %; ПВС 9%. Модуль: а, б-10, в - 20.

Рисунок 2 - Кинетика инактивации ТР, иммобилизованного в пленках, содержащих ПЭО ММ 4 кДа.

Следует отметить, что практически во всех случаях установлено проявление более высокой (до 4 раз) активности иммобилизованного фермента по сравнению с начальной. Поскольку основное количество фермента десорбируется из пленки в начальный период, можно предположить, что в модельной среде происходят процессы,

приводящие к активации ТР. Таким процессом, очевидно, является разрушение ассо-циатов фермента.

Закономерности иммобилизации, установленные для ТЕР, отличались от таковых для ТР. Как видно из табл. 2, относительная и остаточная активность ТЕР в меньшей степени зависят от содержания ПЭО и его молекулярной массы, хотя при содержании в формовочном растворе 0,25% ПЭО эти значения, как правило, более высокие.

Таблица 2 - Влияние состава формовочного раствора для получения пленок* на ак-

тивность и стабильность иммобилизованного террилитина

№ п.п. Содержание в формовочном растворе ПЭО ОА, % от нативной Остаточная активность (5 ч, 37 °С)

ММ,кДа % % от нативной % от начальной

1 1,5 0,25 86,72 61,66 71,10

2 4,0 87,80 69,11 78,81

3 6,0 58,42 48,81 83,55

5 1,5 0,05 75,00 57,98 77,31

6 4,0 66,09 51,47 77,88

7 6,0 79,83 61,34 76,84

Содержание ПВС 9%, ТЕР 0,04%.

Таким образом, сравнительный анализ активности и стабильности иммобилизованных ТР и ТЕР в структуре ПВС пленок разного состава, показал различное влияние на ОА и стабильность ферментов молекулярной массы ПЭО и содержания компонентов и позволил определить оптимальный состав формовочных растворов для получения пленок:

- содержащих ТР - 0,25% ПЭО ММ 4 кДа и 0,4% ТР;

- содержащих ТЕР - 0,2% ПЭО ММ 6 кДа и 0,32% ТЕР.

3 Исследование структуры полимерных систем, содержащих протеолитический фермент и ПЭО

Для получения информации о структурных особенностях полимерных систем разного состава проводили реологические исследования формовочных растворов. Кривые вязкости формовочных растворов характеризуют их как неньютоновские псевдопластичные, что объясняется высокой концентрацией ПВС (9%), склонного к гелеобразованию, присутствием олигомерного ПЭО, глобулярного белка и интерполимерными взаимодействиями в системе. О структурных особенностях судили по эффективной вязкости (т^ф), константе структурирования и кажущейся энергии активации вязкого течения (АЕр).

Введение в раствор ПВС добавок ПЭО и/или фермента сопровождалось снижением эффективной вязкости, т.е. оказывало пластифицирующее действие. Корреляция между константой структурирования и эффективной вязкостью отсутствует, что свидетельствует об образовании в полимерной системе значительно отличающихся структур.

Отрицательные значения кажущейся энергии активации вязкого течения (АЕр), установленные для ПВС формовочных растворов, содержащих: 0,25% ПЭО ММ 1,5 кДа или 6 кДа; 0,05% ПЭО ММ 4 кДа и 0,04% трипсина; 0,25% ПЭО ММ 1,5 кДа или 6 кДа и 0,04% террилитина, говорят о снижении доли свободного объема при повышении температуры с 20 до 40 °С. Очевидно, это обусловлено усилением гидрофоб-

ных взаимодействий между молекулами ПЭО вследствие разрушения водородных связей, что может привести к фазовому разделению.

Для формовочных растворов, содержащих террилитин, установлена однозначная зависимость: эффективная вязкость многокомпонентных растворов при комнатной температуре изменяется симбатно с изменением ММ ПЭО. К тому же, для них характерны более низкие значения константы структурирования, за исключением растворов с ПЭО ММ 6 кДа, по сравнению с формовочными растворами, содержащими трипсин.

При формовании пленок отсутствовало напряжение сдвига и не проводилось ориентационное вытягивание, поэтому следовало ожидать, что структура пленки в значительной степени будет определяться структурой раствора. Действительно, результаты исследования пленок методом ДСК, приведенные в табл. 3, хорошо коррелировали с результатами реологических исследований, свидетельствующих о пластифицирующем действии добавок.

Увеличение в формовочных растворах, содержащих ПЭО, количества трипсина с 0,04 до 0,072%, в большинстве случаев при прочих равных условиях приводит к повышению Т„, Т^ и ДНШ полимерного материала, что говорит об упорядочении структуры полимерной системы. Изображения поверхности этих пленок, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), однозначно свидетельствуют о фазовом разделении в этом случае. Таким образом, упорядочение структуры полимерной матрицы - ПВС достигается за счет фазового разделения. Эти процессы объясняют высокие значения ОА трипсина в пленке, содержащей ПЭО ММ 6 кДа и максимальное количество фермента.

ММ ПЭО не оказывает заметного влияния на температуры фазовых переходов.

Можно отметить, что уровень активности и стабильности ТР повышается, когда наполненный ПВС имеет более высокие Тст и ТГ1Л, а также низкую Т^ но высокую ДНпл, Причиной первого может быть фазовое разделение, повышающее доступность фермента, а второго - локализация фермента в аморфной области, приводящая к ее структурированию таким образом, что обеспечивается как доступность, так и прочность фиксации, а значит, и стабильность иммобилизованного фермента.

Данные АСМ хорошо коррелировали с результатами реологических исследований и подтверждали, что отрицательные значения кажущейся энергии активации вязкого течения формовочных растворов, содержащих ТЕР и ПЭО ММ 1,5 или ПЭО ММ 4,0 кДа, обусловлены процессами структурообразования, приводящими к фазовому разделению, которое в растворах ПЭО происходит при повышении как температуры раствора, так и концентрации полимера.

4 Исследование закономерностей иммобилизации ТР и ТЕР в полимерных системах, содержащих симметричный триблок-сополимер ПЭО и ППО

Предварительные исследования свойств трипсина в водных растворах с симметричным триблок-сополимером показали, что ОА трипсина снижается незначительно (максимум на 6%), однако остаточная активность в условиях инактивации была невысока (6-15% от нативной).

Поскольку температурные условия существенно влияют на струкгурообразова-ние в системе, содержащей триблок-сополимер, формование пленок осуществляли при комнатной температуре, а сушили - при 23 и 46±3 °С. Как следует из данных, представленных в табл. 3, как правило, относительная активность трипсина, иммобилизованного в структуре ПВС пленок, содержащих триблок-сополимер, при повышении температуры сушки с 22 до 46 °С снижается, а стабильность - повышается.

Таблица 3 - Влияние состава ПВС пленок и условий сушки на относительную актив_ность и стабильность иммобилизованного трипсина_

Содержание в формовочном растворе для получения пленок, % ОАтрр (% от на' иммобили при темпе] шсина гивной), зованного эатуре, °С Остаточная активность пленок (% от начальной), иммобилизованного при температуре, °С

TP ПЭО-ППО-ПЭО 22±1 46±3 22±1 46±3

0,04 0,05 34 5 15 150

0,25 37 54 26 85

0,50 373 57 84 96

0 61 10 50 10

0,072 0,05 69 43 17 86

0,25 59 62 17 69

0,50 312 298 68 38

0 12 9 4 5

С целью установления структуры полученных пленок исследовали реологические свойства формовочных растворов разного состава. Полученные результаты свидетельствуют о пластифицирующем действии триблок-сополимера, которое усилива- j ется при увеличении его содержания в формовочном растворе, а также при введении фермента. Для всех формовочных растворов, содержащих триблок-сополимер, характерны отрицательные значения кажущейся энергии активации вязкого течения, что является следствием усиления гидрофобных взаимодействий между макромолекулами ПЭО-ППО-ПЭО.

Для объяснения наблюдаемых различий биокаталитических свойств пленок разного состава методом АСМ установлена различная поверхностная морфология пленок и фазовое разделение (рис. 3). Так, в пленках, высушенных при комнатной I температуре, образуются сферические мицеллы ПЭО-ППО-ПЭО с ярко выраженным гидрофобным ядром и гидрофильной короной. Центрами мицеллообразования являются частицы фермента. При повышенной температуре триблок-сополимер образует на поверхности пленки протяженную фазу, в структуре которой находятся частицы трипсина.

Температура сушки, °С: а - 23, б, в - 46.

Рисунок 3 - АСМ-изображение поверхности ПВС пленок, полученных из формовочного раствора с содержанием 0,04% трипсина и 0,25% ПЭО-ППО-ПЭО.

Локализация частиц фермента на поверхности в ядрах мицелл, образующих открытые поры, повышает доступность фермента для субстрата, способствует разрушению ассоциатов трипсина и объясняет более высокую относительную активность иммобилизованного фермента.

Об усилении фазового разделения при повышении содержания триблок-сополимера даже при комнатной температуре позволяют судить АСМ-изображения поперечного среза пленки. Как видно из рис. 4, поперечный срез пленки представляет собой неоднородную структуру, фермент в основном расположен в верхней части пленки.

Повышение температуры сушки способствует фазовому разделению полимерной системы, в результате которого ПЭО-ППО-ПЭО на поверхности пленки образует различные структуры в зависимости от его содержания в формовочном растворе: при содержании 0,05% - дендритоподобные, 0,25% - сферические мицеллы, 0,50% -сплошную фазу, при этом гидрофобные частицы трипсина включены в структуру триблок-сополимера.

О структурных изменениях, происходящих в полимерных пленках, судили по температурам стеклования и плавления (Тсг, Тщ,) и энтальпии плавления. С повышением температуры сушки ПВС пленок с 22 до 46 °С, а также содержания в них ПЭО-ППО-ПЭО и трипсина наблюдается симбатное изменение температуры стеклования и приближение ее значения к температуре стеклования чистого ПВС. Это хорошо коррелирует с данными АСМ и, таким образом, подтверждает протекание процесса фазового разделения. При этом температура плавления изменяется разнонаправленно, а энтальпия плавления, как правило, при содержании белка в формовочном растворе 0,04% повышается, а 0,072% - снижается.

Следует отметить, что увеличение в пленке содержания трипсина в формовочном растворе до 0,072% приводит к повышению температуры стеклования полимера даже в результате сушки при комнатной температуре. По-видимому, увеличение в составе пленки трипсина также способствует фазовому разделению. Таким образом, результаты ДСК удовлетворительно коррелируют с данными атомно-силовой микроскопии, что позволило сделать вывод об усилении фазового разделения с увеличением содержания в формовочном растворе триблок-сополимера, трипсина, а также с повышением температуры.

Представляло интерес оценить влияние блок-сополимера на иммобилизованный ТЕР. Как и в случае с ПЭО, активность и стабильность ТЕР были менее чувствительны к присутствию в пленке ПЭО-ППО-ПЭО: OA составляла 78-104%, а остаточ-

низ пленки

верх пленки

Рисунок 4 - АСМ-изображение поперечного среза ПВС пленки, полученной из формовочного раствора с содержанием 0,04% трипсина и 0,5% ПЭО-ППО-ПЭО.

ная активность - 66-83% от нативной. Отличие от пленок, содержащих ТР, состоит в том, что на АСМ-изображениях отсутствуют мицеллы или иные структуры, свидетельствующие о наличии в составе триблок-сополимера. Причиной этого является присутствие низкомолекулярных солей в составе ферментного препарата, которые 1 могут влиять на критическую концентрацию мицеллообразования ПЭО-ППО-ПЭО, а также гидрофильный характер макромолекулы террилитина.

4 Получение и исследование биокаталитических свойств и структуры пленочных материалов, полученных из композиций ПВС, ТР, ПЭО и триблок-сополимера ПЭО-ППО-ПЭО

Представляло интерес использовать смесь амфифильных полимеров при получении ферментео держащей пленки. На основании результатов проведенных исследований выбран состав формовочного раствора, в котором содержание компонентов составляет: 9% ПВС, 0,25% ПЭО, 0,5% ПЭО-ППО-ПЭО, 0,04% ТР. Сушку пленок про- -водили при комнатной температуре и 45 °С. Относительная активность иммобилизованного ТР составила 142,1 и 93,2% соответственно. Данные по кинетике инактивации показали более высокую стабильность фермента, включенного в структуру пленки, высушенной при комнатной температуре. Причиной этого являются структурные отличия, установленные с помощью АСМ. На поверхности полимерных пленок, высушенных при комнатной температуре можно выделить два основных типа структурных элементов: мицеллы (рис. 5а) с характерными ядром и короной и дендритопо-добные структуры без ядра (рис. 56). Центрами структурообразования в обоих случаях являются частицы ТР. Более крупные и доступные в ядрах мицелл, они обеспечивают высокую относительную активность фермента, а мелкие в дендритных образованиях - стабильность.

Повышение температуры сушки способствует формированию совершенно иной I поверхностной структуры. В результате фазового разделения на поверхности пленки образуется протяженная фаза с характерной регулярной структурой (рис. 5в), при этом частицы фермента на поверхности отсутствуют. Вероятно, из-за быстрого испарения растворителя фазовое разделение оказывается незавершенным, и фермент оста- I ется включенным в глубокие слои пленки и малодоступным для высокомолекулярного субстрата.

а б в

Температура сушки, °С: а - 23, в - 46.

Рисунок 5 - АСМ-изображение поверхности пленок, полученных из формовочного раствора, содержащего 9% ПВС, 0,25% ПЭО, 0,5% ПЭО-ППО-ПЭО, 0,04% ТР.

5 Исследование физико-химических свойств и стабильности иммобилизованных ферментов

В результате исследования зависимости ферментативной активности от рН и температуры установлено, что сохраняется характерный для ферментов экстремальный вид, что свидетельствует о сохранении третичной структуры ферментов. рН-Профиль иммобилизованного террилитина расширяется в щелочную область со сдвигом с 7,5 до 8,0-8,5. Температурный оптимум иммобилизованных ферментов сдвигается с 50 °С до 40-45 °С и по сравнению с профилем активности нативного фермента расширяется, что косвенно говорит о стабилизации фермента.

Важной эксплуатационной характеристикой материалов, содержащих иммобилизованный фермент, является стабильность при хранении. Испытания, проведенные через 1 год после изготовления пленок разного состава, показали, что активность и стабильность иммобилизованного трипсина значительно повышаются, а террилитина

- снижается в 2 и более раз, что может быть результатом структурных превращений полимерной матрицы.

6 Физико-механические свойства поливинилспиртовых плевок, содержащих иммобилизованный фермент

Дана оценка паропроницаемости пленок разного состава, их разрывной нагрузки и удлинения. Установлено, что наибольшую паропроницаемость имеют пленки, содержащие террилитин (4,3-16,8 г воды/г пленки).

Состав пленок незначительно влияет на их прочностные характеристики в воздушно-сухом состоянии: прочность составляет 112-141 Н/см2, относительное удлинение 2,0-2,96 мм.

7 Исследование закономерностей иммобилизации трипсина и террилитина в композициях с амфифильпымн полимерами на волокнистых материалах

В ряде случаев полимерные композиции используют для придания специальных свойств волокнистым материалам. К числу наиболее широко применяемых относятся волокна с высокой биосовместимостью - целлюлозные (ЦМ) и полиэтиленте-рефталатные (ПЭМ). При нанесении полимерных композиций на волокнистую матрицу, как правило, наблюдаются иные закономерности в отношении свойств иммобилизованных ферментов. Действительно, достигнуты более высокие показатели активности иммобилизованного ТР. При этом для обоих ферментов независимо от типа матрицы с увеличением содержания ПЭО относительная активность уменьшается. При одинаковом содержании ПЭО с увеличением молекулярной массы ПЭО относительная активность ТЕР в результате иммобилизации на ЦМ уменьшается, а на ПЭМ

- увеличивается.

Увеличение молекулярной массы ПЭО приводит к снижению ОА трипсина при содержании 0,5% ПЭО в целлюлозной матрице и 2,5% - в полиэфирной, и к повышению ОА - при содержании 2,5% и 0,5% соответственно. Отсутствие однозначности в закономерностях свидетельствует о сложных процессах межмолекулярного взаимодействия в этих системах, приводящих к образованию комплексов разной структуры, что связано с образованием и разрушением ассоциатов трипсина.

Существенное влияние на реализацию биологической активности ферментов оказывает тип волокнистой матрицы. Иммобилизация ТЕР на ПЭМ обеспечивает в 24 раза более высокую активность, чем на ЦМ, а для ТР в некоторых случаях наиболее подходящей матрицей является ЦМ. Это объясняется разной структурой формируе-

мых на матрице композиционных слоев, которая зависит от типа фермента и матрицы, о также от содержания и молекулярной массы ПЭО.

Как показали результаты электронной микроскопии, при одинаковом количестве ПЭО и ТЕР амфифильный полимер образует на поверхности ПЭМ протяженную фазу, чего не наблюдается на целлюлозной матрице, и тем самым обеспечивает большую доступность ТЕР для субстрата, а, значит, и активность.

Если в композициях с ТЕР частицы фермента на поверхности не визуализируются, то в случае ТР, напротив, обнаруживаются на поверхности как целлюлозного, так и полиэтилентерефталатного материала. Именно такая локализация объясняет более высокую активность иммобилизованного ТР по сравнению с ТЕР.

Важное требование к полимерным материалам медицинского назначения - устойчивость к радиационной стерилизации. Для исследования радиорезистентности волокнистые материалы, содержащие иммобилизованный ТЕР, стерилизовали у-лучами (доза 25 кГр) и анализировали активность сразу после облучения (0 лет) и через 2 года после хранения при комнатной температуре. Полученные данные свидетельствуют о повышении активности фермента в 2-4 раза по сравнению с начальной в зависимости от состава. Это связано с отсутствием влияния радиационно-химического воздействия на активный центр фермента и повышением его доступности в результате медленно протекающих релаксационных процессов, приводящих к изменению конформации макромолекул в многокомпонентных полимерных системах.

ВЫВОДЫ

1. С целью получения ферменгсодержащих материалов медицинского назначения на основе композиций с полиэтиленоксидом и/или симметричным триблок-сополимером полиэтиленоксида и полипропиленоксида исследованы закономерности иммобилизации протеолитических ферментов трипсина и террилитина в структуре поливинилспиртовой пленки и волокнистых материалов - целлюлозного и полиэтилентерефталатного.

2. На основании реологических и нефелометрических исследований растворов ферментов с полиалкиленоксидами установлено протекание интерполимерных реакций, приводящих к разрушению ассоциатов трипсина и повышению стабильности.

3. Установлено влияние способа получения формовочного раствора на относительную активность и стабильность иммобилизованного трипсина и определена оптимальная последовательность введения компонентов в раствор поливинилового спирта, при которой фермент вводится в полимерную композицию последним.

4. В результате реологических, калориметрических и микроскопических исследований полимерных систем разного состава установлено, что добавки полиэтиленоксида или триблок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида в раствор поливинилового спирта оказывают на полимерную матрицу пластифицирующее действие. Для систем с террилитином выявлена симбатная зависимость между эффективной вязкостью и молекулярной массой полиэтиленоксида.

5. Установлено, что в полимерных системах, содержащих фермент и триблок-сополимер, а также в некоторых системах, содержащих полиэтиленоксид, увеличение содержания трипсина, полиалкиленоксида и температуры способствует фазовому разделению в результате усиления гидрофобных взаимодействий. Показано, что центрами структурообразования при фазовом разделении являются гидрофобные частицы трипсина.

6. С использованием принципов пластификации и фазового разделения получена ассиметричная поливинилспиртовая пленка, содержащая трипсин, полиэтиленоксид и триблок-сополимер, с высокой активностью, стабильностью и паропроницаемостью.

7. Установлено влияние состава пленок на уровень их паропроницаемости, которая имеет колебательный характер.

8. Установлено, что иммобилизация не оказывает существенного влияния на зависимость активности ферментов от температуры и pH. рН-Профиль иммобилизованного террилитина расширяется в щелочную область со сдвигом с 7,5 до 8,0-8,5. Температурный оптимум иммобилизованных ферментов сдвигается с 50 °С до 40-45 °С.

9. На основании анализа активности полимерных материалов при хранении в течение 1 года при комнатной температуре установлено повышение активности иммобилизованного трипсина и снижение активности террилитина.

10. Показана возможность использования полимерных композиций на основе поли-этиленоксида или триблок-сополимера, содержащих трипсин и террилитин, для иммобилизации на целлюлозной и полиэфирной волокнистых матрицах. Методом атом-но-силовой микроскопии установлено, что высокая активность иммобилизованного трипсина обусловлена локализацией частиц фермента на поверхности волокон.

Основное содержание диссертационной работы

1 Антипова A.A., Юданова Т.Н., Малинкина Т.Б., Карелина И.М. Влияние способа получения биологически активных поливинилспиртовых пленок на свойства иммобилизованного трипсина / Хим. технология.- 2009.- № 12-С.725-729.

2 Антипова A.A., Юданова Т.Н., Питомцева М.А., Серцова A.A. Влияние температуры сушки и состава поливинилспиртовых пленок, содержащих трипсин и триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида, на их структуру и свойства / Хим. технология,- 2010.- № 10.- С.615-621.

3 Антипова A.A., Юданова Т.Н., Папков М.А., Милюкина E.H., Гальбрайх JI.C. Иммобилизация композиций протеаз с полиэтиленоксидом на волокнистых носителях / Хим. волокна.- 2010.- №2.- С.21-24.

4 Antipova A.A., Yudanova T.N., Papkov М.А., Milyukina E.N., Gal'braikh L.S. Immobilizationa of protease composites with polyethylene oxide on fibre substrates/Fibre Chemistry.-2010.-V.42.- №2.- P.99-102.

5 Антипова A.A., Папков MA., Юданова Т.Н. Исследование стабильности трипсина и террилитина в композициях с полиалкиленоксидами / Тез. докл. и стенд, сообщений VI симп. «Химия протеолитических ферментов», РАН, 2007,- С. 105.

6 Антипова A.A., Юданова Т.Н. Активация трипсина путем иммобилизации в поливинилспиртовые пленки. - Химическая технология / Тез. док. межд. конф. по хим. технологии XT'07 / Под ред. А.А.Берлина, Н.А.Халтуринского, А.А.Вошкина. - М.: ЛЕНАНД, 2007.- Т.З.- С. 79.

7 Юданова Т.Н., Антипова A.A., Огальцова Ю.П. Полимерные пленочные материалы для энзимотерапии ран. - Высокие технологии - стратегия XXI века" / Мат. конф. десятого юбилейного межд. форума, 21-24 апреля 2009 г. -М.: ЗАО НПКФ "МаВР", 2009,- С.297-299.

8 Антипова A.A., Юданова Т.Н. Паропроницаемое пленочное покрытие для энзимотерапии некротизированных ран / I Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи -путь к обществу, основанному на знаниях»: Сб. научных докл. / Мое. гос.

строит. ун-т-М.: МГСУ, 24-27 июня 2009 г. -С.270-271.

9 Антипова A.A., Юданова Т.Н. Процессы структурообразования в полимерных системах, содержащих трипсин и полиэтиленгликоль / Тез. докл. IV Всерос. научн. конф. (с международным участием) «Физикохимия процессов переработки полимеров». - Иваново, 2009. - С. 102 - 103.

10 Антипова A.A., Серцова A.A., Юданова Т.Н. Структура и свойства поливи-нилспиртовых пленок, содержащих триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида и трипсин // Тез. докл. пятой международной Каргин-ской конференции «Полимеры -2010».- Москва, 2010.- С.37.

Подписано в печать 25.11.10 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл.печ.л. 1,0 Заказ 392 Тираж 80 ГОУВПО «МГТУ им. А.Н. Косыгина», 119071, Москва, ул. Малая Калужская, 1

Введение.

1 Литературный обзор.

1.1 Иммобилизация ферментов в полимерных системах.

1.1.1 Комплексообразование как способ иммобилизации ферментов при получении раневых покрытий.

1.2 Свойства полиэтиленоксида и его использование при создании лекарственных средств.

1.3 Свойства блок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленок-сида.

1.4 Влияние полиэтиленоксида и блок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида на свойства белков.

1.5 Ассоциация белков и ее влияние на активность ферментов.

1.5.1 Влияние способности ферментов к ассоциации на протекание интерполимерных реакций и свойства иммобилизованных ферментов

2 Методический раздел.

3 Основные результаты и их обсуждения.

3.1 Исследование влияния полиэтиленоксида на активность и стабильность трипсина и террилитина в растворе.

3.2 Исследование влияния условий формования на свойства иммобилизованных в структуре пленок ферментов.

3.3 Исследование структуры полимерных систем, содержащих проте-олитический фермент и полиэтиленоксид.

3.4 Исследование закономерностей иммобилизации трипсина и террилитина в полимерных композициях, содержащих симметричный три-блок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида.

3.5 Исследование биокаталитических свойств и структуры пленочных материалов, полученных из композиций поливинилового спирта, трипсина и амфифильных полимеров.

3.6 Физико-химические свойства иммобилизованных ферментов.

3.7 Исследование стабильности иммобилизованных ферментов при хранении.

3.8 Физико-механические свойства пленок, содержащих протеазу и амфифильный полимер.

3.9 Исследование закономерностей иммобилизации трипсина и терри-литина в композициях с амфифильными полимерами на волокнистых матрицах.

Выводы.

В настоящее время кардинально изменился и расширился арсенал перевязочных средств, однако большинство из них не обладают биологической активностью или являются антимикробными. Несмотря на значительное число работ, посвященных получению полимерных материалов с протеолитиче-ской активностью, практически реализованы единицы. Вероятно, это обусловлено тем, что недостаточно только осуществить иммобилизацию, иммобилизованный в структуре полимерного носителя фермент должен быть устойчивым к стерилизации и длительному хранению (в течение 3-5 лет), что достигается не всегда. Поэтому исследование новых полимерных систем для включения в них ферментов с целью разработки новых перевязочных материалов для энзимотерапии гнойных ран является актуальным. Использование таких материалов необходимо для повышения эффективности лечения (снижения аллергенного действия, стоимости лечения за счет уменьшения расхода фермента и повышения его стабильности, качества медицинского обслуживания благодаря удобству использования).

Одним из путей регулирования свойств иммобилизованных ферментов является включение их в структуру комплексов, образованных с участием неионогенных полимеров, например амфифильных полимеров. При этом не происходит химическое модифицирование белковых глобул, а стабилизация протеаз достигается за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Использование в составе матрицы дешевых и доступных синтетических биодеградируемых полимеров медико-биологического назначения является предпосылкой для разработки технологичных способов переработки полимерных композиций в пленочные покрытия и композиционные материалы на волокнистой основе. К числу таких полимеров относятся поливиниловый спирт, полиэтиленоксид и триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипро-пиленоксида. Симметричный триблок-сополимер интересен тем, что способен к самоорганизации с образованием структур различного типа. Системы, содержащие белки и полиэтиленоксид с молекулярной массой от нескольких сотен до тысяч, активно исследуются. Однако необходимо учитывать некоторые ограничения, которые связаны с осаждением белков при высоких концентрациях растворов полиэтиленоксида (более 5%). В литературе в основном представлены работы, посвященные исследованию характера продуктов интерполимерного взаимодействия полиэтиленоксида и белков. Следует ожидать, что варьирование состава компонентов системы может привести к формированию различных структур, а, следовательно, и свойств иммобилизованного фермента.

Целью работы является разработка методов получения раневых покрытий пленочного и волокнистого типа с использованием композиций протео-литических ферментов — трипсина и террилитина и синтетических биосовместимых биодеградируемых полимеров - полиэтиленоксида и/или симметричного триблок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

- установить закономерности иммобилизации трипсина и террилитина в структуре поливинилспиртовых пленок, а также целлюлозных или полиэти-лентерефталатных волокнистых материалов с использованием полиэтиленоксида и/или симметричного триблок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида;

- установить влияние структуры полимерных систем на свойства иммобилизованных ферментов;

- установить влияние состава полимерных систем на физико-химические свойства иммобилизованных ферментов и физико-механические свойства биоактивных материалов;

- определить состав многокомпонентной полимерной системы, обеспечивающей высокую активность и стабильность протеаз.

Методы исследования: химические, физико-химические, реологические, УФ- и видимая спектроскопия, нефелометрия, электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, дифференциальная сканирующая калориметрия. Расчет термодинамических характеристик полимеров выполнен с б использованием программного обеспечения дифференциально-сканирующего калориметра DSC Q10 "ТА Instruments" (ГОУ ВПО "МГТУ им. А.Н.Косыгина").

Научная новизна полученных результатов:

- Установлены особенности структурообразования в полимерных системах, содержащих поливиниловый спирт, трипсин или террилитин и полиэтил еноксид и/или симметричный триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида, которое заключается в пластификации полимерной матрицы или фазовом разделении системы, а его направление определяется содержанием и типом амфифильного полимера и фермента, а также температурой системы.

- Показано, что способность фермента к ассоциации имеет решающее значение, определяющее тип локализации фермента при его иммобилизации в структуре целлюлозной или полиэтилентерефталатной волокнистой матрицы в составе композиции с полиэтиленоксидом.

- Установлена взаимосвязь между активностью и стабильностью иммобилизованного трипсина и террилитина и характером распределения фермента в структуре полимерной матрицы пленочного или волокнистого типа, содержащей полиэтиленоксид и/или симметричный триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида.

- Установлено повышение активности трипсина, иммобилизованного в структуре поливинилспиртовых пленок, содержащих полиэтиленоксид или симметричный триблок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида, при длительном хранении, что свидетельствует о протекании в полимерных системах релаксационных процессов.

Практическая значимость. Предложены новые пути регулирования свойств раневых покрытий на основе композиции полимеров медико-биологического назначения для энзимотерапии ран.

Разработано асимметричное раневое покрытие на основе поливинилового спирта, содержащее полиэтиленоксид, симметричный триблоксополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида и трипсин, обладающее высокой активностью, стабильностью и удовлетворительной паропроницае-мостью.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке полимерных материалов с ферментативной активностью.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, в том числе 3 - в журналах, включенных в перечень ВАК, 1 — в зарубежном журнале и 6 тезисов докладов на научных конференциях.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, методической части, главы, посвященной изложению основных результатов и их обсуждению, выводов, списка использованной литературы.

Выводы

1. С целью получения ферментсодержащих материалов медицинского назначения на основе композиций с полиэтиленоксидом и/или симметричным триблок-сополимером полиэтиленоксида и полипропиленоксида исследованы закономерности иммобилизации протеолитических ферментов трипсина и террилитина в структуре поливинилспиртовой пленки и волокнистых материалов - целлюлозного и полиэтилентерефталатного.

2. На основании реологических и нефелометрических исследований растворов ферментов с полиалкиленоксидами установлено протекание интерполимерных реакций, приводящих к разрушению ассоциатов трипсина и повышению стабильности.

3. Установлено влияние способа получения формовочного раствора на относительную активность и стабильность иммобилизованного трипсина и определена оптимальная последовательность введения компонентов в раствор поливинилового спирта, при которой фермент вводится в полимерную композицию последним.

4. В результате реологических, калориметрических и микроскопических исследований полимерных систем разного состава установлено, что добавки полиэтиленоксида или триблок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида в раствор поливинилового спирта оказывают на полимерную матрицу пластифицирующее действие. Для систем с террилитином выявлена симбатная зависимость между эффективной вязкостью и молекулярной массой полиэтиленоксида.

5. Установлено, что в полимерных системах, содержащих фермент и триб-лок-сополимер, а также в некоторых системах, содержащих полиэтиленок-сид, увеличение содержания трипсина, полиалкиленоксида и температуры способствует фазовому разделению в результате усиления гидрофобных взаимодействий. Показано, что центрами структурообразования при фазовом разделении являются гидрофобные частицы трипсина.

6. С использованием принципов пластификации и фазового разделения получена ассиметричная поливинилспиртовая пленка, содержащая трипсин, полиэтиленоксид и триблок-сополимер, с высокой активностью, стабильностью и паропроницаемостью.

7. Установлено влияние состава пленок на уровень их паропроницаемости, которая имеет колебательный характер.

8. Установлено, что иммобилизация не оказывает существенного влияния на зависимость активности ферментов от температуры и рН. рН-Профиль иммобилизованного террилитина расширяется в щелочную область со сдвигом с 7,5 до 8,0-8,5. Температурный оптимум иммобилизованных ферментов сдвигается с 50 °С до 40-45 °С.

9. На основании анализа активности полимерных материалов при хранении в течение 1 года при комнатной температуре установлено повышение активности иммобилизованного трипсина и снижение активности террилитина.

10. Показана возможность использования полимерных композиций на основе полиэтиленоксида или триблок-сополимера, содержащих трипсин и тер-рилитин, для иммобилизации на целлюлозной и полиэфирной волокнистых матрицах. Методом атомно-силовой микроскопии установлено, что высокая активность иммобилизованного трипсина обусловлена локализацией частиц фермента на поверхности волокон.

1.Ф., Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Ферменты и белковые препараты в медицине // Биотехнология. М.: Наука, 1984. С. 113-125.

2. Толстых П.И., Гостищев В.К., Арутюнян Б.Н. и др. Протеолитические ферменты, иммобилизованные на волокнистых материалах, в хирургии. Ереван: Айстан, 1990. 136 с.

3. Назаренко Г.И., Сугурова И.Ю., Глянцев С.П. Рана. Повязка. Больной.-М.: Медицина.- 2002.- 472 с.

4. Юданова Т.Н. Полимерные раневые покрытия с ферментативным и антимикробным действием: Дисс. . .докт. хим. наук.- М., 2004.- 328 с.

5. Филатов В.Н., Рыльцев В.В. Биологически активные текстильные материалы. Т.1. Терапевтические системы «Дальцекс — трипсин».- М.: Инфор-мэлектро, 2002.- 248 с.

6. Юданова Т.Н., Решетов И.В. Современные раневые покрытия: получение и свойства (Обзор). 2. Раневые покрытия с иммобилизованными протео-литическими ферментами / Химико-фарм. журнал.- 2006.- Т.40.- №8.-С.24-48.

7. Николаев А.Ф., Мосягина Л.П. Поливиниловый спирт и сополимеры винилового спирта в медицине // Пластические массы. 2000. - №3. — С.34-42.

8. Полищук А .Я., Заиков Г.Е., Мадюскин Н.Н. Биоразлагаемые полимеры и их применение в современной медицине // Пластические массы. — 2000. -№2. С.28-33.

9. Ruizcardona L., Sanzgiri Y.D., Benedetti L.M., et al. Application of benzyl hyaluronate membranes as potential wound dressing evalution of water-vapor and gas permeabilities // J. Biomaterials. - 1996.- V. 17 (16).- P. 1639-1643.

10. Choi Y.S., Hong S.R., Lee Y.M., et al. Studies on gelatin-containing artificial skin. II. Preparation and characterization of cross-linked gelatin-hyaluronate sponge // J. Biomed. Mater. Res.- 1999.- V. 48 (5).- P. 631-639.

11. Tomihata К., Burczak К., Shiraki К., Irada Y. Cross-linking and biodégradation of native and denatured collagen // ACS Symposium Series.- 1994.-V.540.- P. 275-286.

12. Hong S.R., Lee S.J., Shim J.W., et al. . Study on gelatin-containing artificial skin. IV. A comparative study on the effect of antibiotic and EGF on cell proliferation during epidermal healing // J. Biomaterials.- 2001.- V. 22 (20).- P. 2777-2783.

13. Ulubayram K., Cakar A.N., Korkusuz P., et al. EGF containing gelatin based wound dressings // J. Biomaterials.- 2001.- V. 22 (11).- P. 1345-1356.

14. Tucci M.G., Ricotti G., Mattiolibelmonte M. et al. Chitosan and gelatin as engineered dressing for wound repair // J. of Bioactive and Compatible Polymers." 2001.- V. 16.- № 2.- P. 145-157.

15. Кулиш Е.И., Кузина Л.Г., Чудин А.Г., Мударисова Р.Х., Колесов C.B., Свойства пленок на основе хитозана // Энцикл. инж.-химика.- 2007.- №9.-С.9-11.

16. Choi Y.S., Hong S.R., Lee Y.M. et al. Study on gelatin-containing artificial skin. I. Preparation and characteristics of novel gelatin-alginate sponge // Biomaterials.- 1999.- V.20.- № 5.- P. 409-417.

17. Draye J.P., Delaey В., Vandevoorde A. et al. In vitro and in vivo biocompati-bility of dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films // Biomaterials.- 1998.-V. 19.-№18.-P. 1677-1687.

18. Платэ H.А., Васильев A.E. Физиологически активные полимеры.- M.: Химия, 1986.-296 с.

19. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. — М.: Наука, 1984.- 261 с.

20. Введение в прикладную энзимологию. / Под ред. Березина И.В., Марти-нека К.М. -М.: Изд-во МГУ, 1982.- 384 с.

21. Кабанов В.А., Зезин А.Б., Изумрудов В.А. Синтетические полиэлектролиты как регуляторы ферментативных реакций // Итоги науки и техники. Биотехнология / Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. М.: Высшая школа, 1987. - Т.4.- С.159-192.

22. Мартинек К., Березин И.В. Стабилизация ферментов — ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику // Успехи химии.- 1980.- №5.-С.737-770.

23. Изумрудов В.А. Зезин А.Б., Кабанов В.А. Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами // Докл. АН СССР.- 1986.- Т.291.- №5.- С. 1150-1154.

24. Изумрудов В.А., Лим С.Х. Контролируемые фазовые разделения в растворах комплексов полиметакрилатного аниона и глобулярных белков // Высокомол. соед.- 2002.- Т.44.- №5.- С.793-801.

25. Комисарова A.JL, Якубович B.C., Толстых П.И. и др. Получение пористого материала на основе альгиновой кислоты, содержащей иммобилизованный террилитин // Антибиотики и химиотерапия.- 1988.- №10.- С.735-739.

26. Вихорева Г.А., Хомяков К.П., Сахаров И.Ю., Гальбрайх JI.C. Иммобилизация протеолитических ферментов в пленках и губках карбоксиметилхи-тина// Химические волокна,- 1995.- №5.- С. 34-37.

27. Бабаев М.С., Кулиш Е.И., Мударисова Р.Х., Колесов C.B. Изучение взаимодействия хитозана с трипсином // Тезе. докл. Пятой Всероссийской Каргинской Конференции «Полимеры 2010» - МГУ.- 2010.- С.137.

28. Хомяков К.П., Кильдеева Н.Р., Богомольный В.Я. и др. Терриплен фер-ментсодержащая пленка из поливинилового спирта для лечения гнойныхран / Гидрофильные полимеры медицинского назначения: Сб. науч. тр. -JL: ОНПО «Пластполимер», 1989.- С.49-53.

29. Богомольный В.Я., Бодунова E.JL, Афиногенов Г.Е. и др. Антисептические поливинилспиртовые пленки для закрытия ран и ожогов / / Гидрофильные полимеры медицинского назначения: Сб. науч. тр. -JL: ОНПО «Пластполимер», 1989.- С.42-49.

30. Биологически активные перевязочные средства в комплексном лечении гнойно-некротических ран / Под. ред. В.Д.Федорова, И.М. Чижа.- М.: МЗ РФ, 2000.- 36 с.

31. Пат. RU 2174847, Чиссов В.И., Решетов И.В., Юданова Т.Н., Скокова И.Ф. Повязка для лечения ран, приор. 01.03.2000, опубл. 20.10.2001.

32. Решетов И.В., Юданова Т.Н., Маторин О.В., Морозов Д.С. Пленочное покрытие, содержащее хлоргексидин и лизоцим, для лечения ран // Химико-фармацевтический журнал.- 2004.- Т.38.- №7.- С.41-43.

33. Ухарцева И.Ю. Влияние температурных воздействий на структуру и физико-химические свойства наполненных гелей поливинилового спирта // Пластические массы.- 2002.- №8.- С. 15-17.

34. Химический энциклопедический словарь / Под ред. Кнунянц И.Л.- М.: Сов. энциклопедия, 1983.- 792 с.

35. Dhawan S., Dhawan К., Varma М. and Sinha V.R. Application of Polyethylene oxide) in drug delivery systems Part II // Pharmaceutical tech152nology.- 2005.- P.82-96.

36. Рабинович И.М. Применение полимеров. Д.: Медицина, 1972.- 197 с.

37. Гаврилин М.В., Компанцева Е.В., Ушакова JI.C. и др. Изучение возможности использования геля полиэтиленоксида в фармации // Фармация.-1998,-№2.- С.20-21.

38. Гаврилин М.В. Применение полимеров и сополимеров производных акриловой кислоты и этиленоксида в фармации // Химико-фарм. журнал.-2001.- Т.35.- №1.- С.33-36.

39. Jacob Israelachvili The different faces of poly(ethylene glycol) // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1997.- V. 94.- P. 8378-8379.

40. Boualem Hammouda, Derek L.Ho and Steve Kline Insight into clustering in poly (ethylene oxide) solutions // Macromolecules.- 2004.- №37.- P.6932-6937.

41. Boualem Hammouda, Derek L.Ho Insight into chain dimensions in PEO/water solutions // Journal of polymer Science.- 2007.- №45.- P. 2196-2200.

42. Масимов Э.А., Аббасов Х.Ф. О взаимодействии макромолекул с молекулами растворителя в системе полиэтиленгликоль вода // Журнал Университета Кавказа.- 2008.- №23.- С. 59-61.

43. Масимов Э.А., Пашаев Б.Г., Гасанов Г.Ш., Гусейнова С.В. Структурные особенности водных растворов полиэтиленгликолей // Вестн. Бакин. унта. Сер. физ-мат. н.- 2007.- №1.- С.101-108.

44. Макарова В.В., Герасимов В.К., Терешин А.К., Чалых А.Е., Куличихин В.Г. Диффузионное и фазовое поведение системы гидроксипропилцеллю-лозы полиэтиленгликоль // Высокомолекулярные соединения.- 2007.-Т.49.- №4.- С.663-673.

45. Сытник О.Ю., Ефимова Н.В., Красноперова А.П. Объемные свойства сис153темы поэтиленгликоль-400 — 1,2-пропандиол // Вестник Харьковского национального университета.- 2008.- №820.- С.299-302.

46. Gayet J.C., Fortier G. High Water-Content BSA-Peg Hydrogel for Controlled-Release Device Evaluation of the Drug-Release Properties // J. of Controlled Release.- 1996.- V. 38.- Iss 2-3.- P. 177-184.

47. Higa O.Z., Rogero S.O., Nachado L.D.B., Mathor M.B., Lugao A.B. Biocom-patibility Study for PVP Wound Dressing Obtained in Different Conditions // Radiation Physics and Chemistry.-1999.-V.55.- Iss 5-6.- P.705-707.

48. Yoshii F., Zhanshan Y., Isobe К et al. Electron-Beam Cross-Linked PEO and PEO PVA Hydrogels for Wound Dressing // Radiation Physics and Chemistry.- 1999.- V. 55.- Iss 2.- P. 133-138.

49. Hilmy N., Darwis D., Hardiningsih L. Poly(N-Vinylpyrrolidone) Hydrogels. 2. Hydrogel Composites as Wound Dressing for Tropical Environment // Radiation Physics and Chemistry.- 1993.- V. 42,- Iss 4-6.- P. 911-914.

50. Пат. RU 2170590, A 61 L 15/38. Способ получения альгинатного материала, обладающего ранозаживляющим действием / Бронштейн Б.Ю., Комиссарова А.Л., Якубович B.C.; Опубл. 20.07.2001.

51. Рамбиди Н.Г., Березкин А.В. Физические и химические основы нанотех-нологий.- М.: ФИЗМАТЛИТ, 2008.- 456 с.

52. Buchholz В.А., Shi W., Barron A.E. MicroChannel DNA sequencing matrices with switchable viscosities // Electrophoresis.- 2002.- № 23.- P. 1398-1409.154

53. Ruzette A.V., Leibler L. Block copolymers in tomorrow's plastics // Nature materials.- 2005.- №4.- P. 19-31.

54. Bohorquez, M., Koch, C., Trygstad, Т., and Pandi, N., A Study of the Temperature-dependent micellization of Pluronic F-127, J. Colloid Interface Sci.- 1999.-V.216.- P.34-40.

55. Escobar-Chavez J.J., Lopez-Cervantes, Naik A. et al. Applications of thermo-reversible Pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations // J.Pharm Pharmaceut Sci.- 2006.-V.9.- №3.- P.339-358.

56. Bromberg L.E., Ron E.S. Temperature-responsive gels and thermogelling polymer matrices for protein and peptide delivery // Advanced Drug Deliver Reviews. 1998.-№ 31.-P. 197-221.

57. Kyu Hyun, Jung Gun Nam, Manfred Wilhellm, Kyung Hyun Ahn and Seung Jong Lee Large amplitude oscillatory shear behavior of PEO-PPO-PEO triblock copolymer solutions // Rheol Acta.- 2006.- №45.- P.239-249.

58. Yun-Seok Rhee, Young-Hee Shin et al. Effect of flavors on the viscosity and gelling point of aqueous poloxamer solution // Arch Pharm Res.- 2006.- V.29.-№12.- P.l 171-1178.

59. Indrajeet D. Gonjari, Amrit B. Karmarkar, Pramod V. Kasture In vitro evaluation of different transnasal formulations of sumatriptan succinate: A comparative analysis // Drug Discov Ther.- 2009.- V.3.- №6.- P. 266-271.

60. EP0481600 A2 (GB) A61 L 15/28. Materials useful in human and veterinary medicine / Payne Nicholas Ian, Gibson Mark, Taylor Peter Mark.; Опубл. 22.04.92.

61. Nagarajan R. Solubilization of Hydrocarbons and Resulting Aggregate Shape Transitions in Aqueous Solutions of Pluronic (PEO-PPO-PEO) Block Copoly155mers // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces.- 1999.- V.16.- P.55-72.

62. Liang Guo, Ralph H. Colby Micellar structure changes in aqueous mixtures of nonionic surfactants // J. Rheol.- 2001.- V.45.- №5.- P.1223-1243.

63. Daly S.M., Przybycien T.M., Tilton R.D. Adsorption of poly(ethylene glycol)-modified lysozyme to silica // Langmuir.- 2005.- №21.- P. 1328-1337.

64. Rawat S., Raman Suri C., Sahoo D.K. Molecular mechanism of polyethylene glycol mediated stabilization of protein // Biochem. biophys. res. commun.-2010.- №4.- P.561-566.

65. Kulkarni A.M., Chatterjee A.P., Schweizer K.S., and Zukoski C.F. Effects of polyethylene glycol on protein interactions // J. Chem. Phys.- 2000.- V.113.-№21.-P. 9863-9873.

66. Annunziata O., Asherie N., Lomakin A., Pande J., Ogun O., Benedek G.B. Effect of polyethylene glycol on the liquid-liquid phase transition in aqueous protein solutions //Proc. Nat. Acad. Sci. U S A.- 2002.- № 99,- P. 14165-14170.

67. Hermans J. Excluded-volume theory of polymer-protein interactions based on polymer chain statistics // J. Chem. Phys.- 1982.- № 77.- P. 2193-2204.

68. Чеботарева H.A., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б. Биохимические эффекты молекулярого краидинга // Биохимия.- 2004.- Т.69.- №11.- С. 1522-1536.

69. Schnell S., Turner Т.Е. Reaction kinetics in intracellular environments with macromolecular crowding: simulations and rate laws // Progress in Biophysics & Molecular Biology.- 2004.- № 85,- P. 235-260.

70. Топчиева И.Н. Водные растворы олигомеров на основе окиси этилена (обзор) // Химико-фарм. журн.- 1989.- т.23, №3.- С.261-267.

71. Топчиева И.Н., Ефремова Н.В., Курганов Б.И. Аддукты белков с водорастворимыми полиалкиленоксидами // Успехи химии.- 1995.- Т.64.- № 3.- С. 293-307.

72. Сорокина Е.М., Ефремова Н.В., Топчиева И.Н. Нековалентные комплексы а-химотрипсина с полиалкиленоксидами // IV симпоз. Химия протеоли-тических ферментов. Тез.докл. и стенд, сообщ.- М.: ИБХ РАН.- 1997.-С.120.

73. Сакодынская И.К., Сорокина E.M., Ефремова H.B., Топчиева И.Н. Ферментативная активность комплексов полимер-белок в смешивающихся с водой органических растворителях // Биоорганическая химия.- 1999.- Т. №25.-№6.- С. 439-443.

74. Yi X., Batrakova Е., Banks W., Vinogradov S., Kabanov A. Protein Conjugation with Amphiphilic Block Copolymers for Enhanced Cellular Delivery // Bioconjugate Chem.- 2008.- №19.- P.1071-1077.

75. Мосолов B.B. Протеолитические ферменты. M.: Наука, 1971.- 404 с.

76. Gottschalk Michael, Venu Kandadai, Halle Bertil Protein self-association in solution: the bovine pancreatic trypsin inhibitor decamer // Biophysical Journal.-2003.- №84.- P.3941-3958.

77. Ramakrisha Т., Pandit M.W. Self-association of a-chymotrypsin: effect of amino acids //Journal Biosciece.- 1988.- V.13.- №3,- P. 215-222.

78. Турманидзе Ц.С., Квеситадзе Г.И., Миканадзе Ю.С., Шанидзе М.Г., JIo-ладзе М.Ж., Биркадзе Т.В., Алибегашвили М.Г., Выделение и физико -химические свойства стафилококковой гиалуронидазы // Прикладная биохимия и микробиология. 1996.-№5 Т.32. - С.519-523.

79. Ruiz-Репа M.,Comas-Rojas Н., Rodnguez-Calvo S., Perez-Gramatges A. Self-association behaviour of protein : surfactant systems in alcohol/water mixtures //Nanobiotechnology.- 2005.- V.152.- №5.- P. 177-181.

80. John S. Philo, Tsutomu Arakawa. Mechanisms of protein aggregation // Current pharmaceutical biotechnology.- 2009.- № 10.- P.348-351.

81. Snoussi Karim, Halle Bertil Protein self-association induced by macromolecu-lar crowding: a quantitative analysis by magnetic relaxation dispertion // Biophysical journal.- 2005.- V.88.- №4.- P.2855-2866.

82. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов. -М.: Химия, 1992. — 54 с.

83. Lowry О.Н., Rosebrogh N.J., Randal R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.- 1951.- V.193.- P.265-275.

84. Васильева Р.П., Евтихов Н.П., Богород Г.В. Соотношение величин активности протеиназ, полученных двумя способами измерения // Микробиол. пром-сть.- 1976.- №4.- С.23-26.

85. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики.-М.: МГУ, 1976. 320 с.

86. Геллер Б.Э., Геллер А.А., Чиртулов В.Г. Практическое руководство по физикохимии волокнообразующих полимеров. М.: Химия, 1996. - 432 с.

87. Методические указания к лабораторным работам по курсу «Химия и фи-зико-химия полимеров» / Под ред. Л.С.Гальбрайха М.: МТИ, 1990.-С.31-35.

88. ГОСТ 14236-81. Пленки полимерные. Методы испытания на растяжение. Введен 01.07.1981. -М.: Госстандарт, 1981.

89. Гордон А., Форд Р. Спутник химика / Под ред. Беленькой И.С., Селище-вой И.В.-М.: Мир. 1976.- С. 512-524.

90. Практикум по высокомолекулярным соединениям / Под ред. Кабанова В.А.-М.: Химия.- 1985.- С.115-139.

91. Madaisy Cueto, М. Jesús Dorta, Obdulia Mungu'ia , Mat'ias Llabrés New approach to stability assessment of protein solution formulations by differential scanning calorimetry // International Journal of Pharmaceutics.- 2003.- № 252.-P.159-166.

92. Bruylants G., Wouters J., Michaux C. Differential Scanning Calorimetry in Life Science: Thermodynamics, Stability, Molecular Recognition and Application in Drug Design // Current Medicinal Chemistry.- 2005.- №12.- P.2011-2020.

93. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Талаленкова O.C., Гальбрайх JI.C. Получение и свойства полимерных композиций, содержащих лизоцим и протеазу С / Антибиотики и химиотерапия.- 2003.- т.48.- №4.- С. 7-10.

94. Перепелкин К.Е. Физико-химические основы процессов формования химических волокон. М.: Химия.- 1978. - 320 с.

95. Липатов Ю.С. Физико-химические основы наполнения полимеров.- М.: Химия.- 1991.- 262 с.

96. Малкин А .Я., Исаев А.И. Реология: концепции, методы, приложение. -СПб.: Профессия.- 2007.- 560 с.

97. Шрам Г. Основы практической реологии и реометрии / Пер. с англ. И.А.Лавыгина; Под ред. В.Г.Куличихина -М.: КолосС.- 2003. 312 с.

98. Кулезнев В.Н., Шершнев В.А. Химия и физика полимеров. М.: Высшая школа.- 1988.-312 с.

99. Агеев Е.П., Секачева Н.В. Автоколебательный режим проницаемости и селективности асимметричной мебраны из поливинилтриметилсилоксана //Высокомол. соед.- 1985,- Т. 27 Б.- №3.- С.163-164.

100. Пат. RU 2157243, А 61 L 15/22. Гидрогелевая композиция и перевязочные средства из нее для лечения ран различной этиологии / Валуев Л.И., Сытов Г.А., Адамян А.А.и др.; Опубл. 10.10.2000, Бюл. №28.

101. Капуцкий Ф.Н., Юркштович Т.Д. Лекарственные препараты на основе производных целлюлозы. — Минск: Университетское, 1989.- 111 с.