автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.15, диссертация на тему:Разработка биологически активных многокомпонентных пленочных материалов для медицинских целей

На правах рукописи УДК 677.021.125:577.151.042

РГБ ОД

ЛАРИОНОВА АННА СЕРГЕЕВНА^ 1 Ф£3 20Г

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ ПЛЁНОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ

Специальность 05.17.15 -технология химических волокон и плёнок

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

л

МОСКВА-2000г.

Работа выполнена в Московской Государственной текстильной академии им. А.Н.Косыгина

Научный руководитель:

доктор химических наук

профессор Гальбрайх Л.С.

Официальны? оппоненты:

доктор химических наук Штильман М.И. профессор

канди хат технических наук Би5ср Б.Л.

Ведущая организация: ГП Всероссийский научно-исследовательский институт полимерных волокон

Защита состоится « Л- » ^М^Ьтъи.2- 2000 г. в часов на заседании диссертационного совета К 053.25.05 в Московской Государственной текстильной академии им. А.Н.Косыгина по адресу: 117918, г.Москва, Ма^ая Калужская ул., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан «

2000г.

Учёный секретарь диссертационного совета: доктор технических наук профессор

¿у

Сафонов В.В.

»

киа с\с\ « Р г»

Актуальность темы диссертации

Одним из современных типов перевязочных материалов являются полимерные пленочные покрытия на рану, структура и свойства которых должны обеспечивать выполнение ряда требований: защитное действие от микроорганизмов, воздухопроницаемость, атравматичность и др. Повышение эффективности лечебного действия таких материалов может быть обеспечено введением в их состав различных типов биологически активных соединений.

В случае использования пленочных покрытий при лечении глубоких гнойных ран , ожогов в состав полимерной композиции должны быть введены протеазы, а полимерный материал должен обладать высокой сорбционной способностью. Имеющийся в настоящее время ассортимент материалов не позволяет в полной мере решать эти задачи. Поэтому задача разработки биологически активных многокомпонентных пленочных материалов, содержащих в качестве биологически активного компонента ферменты различного происхождения и обладающих, благодаря особенностям структуры, необходимым комплексом сорбционных и диффузионных характеристик, является весьма актуальной. Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является разработка способов получения биологически активных мембран на основе хитозана и синтетических биодеградируемых полимеров с регулируемыми физико-химическими и фармакодинамическими свойствами.

В связи с поставленной целью в задачи работы входило:

- изучение влияния состава и условий приготовления на свойства ферментсодержащих формовочных композиций и сформованных из них пленок из хитозана (ХТЗ) и полилактидов;

- изучение влияния структуры пленок на кинетику выделения протеолитических ферментов-трипсина (ТР) и протеазы С (ПР) и их полиэлектролитных комплексов в модельные среды;.

- изучение влияния диффузионных факторов на кинетику превращения специфических субстратов в присутствии пленок, содержащих иммобилизованные ферменты.

Методика исследований

При выполнении экспериментальной части работы 4 были использованы химические методы анализа, потенциометрия, фотоколориметрия, электронная микроскопия, элементный анализ. Для количественной характеристики процессов диффузии проведен расчет коэффициентов диффузии с использованием вычислительной техники. Научная нодична

Выявлены закономерности формирования и установлен состав нерастворимого в воде слоя, образующегося при поверхностном модифицировании додецилсульфат9м натрия ферментсодержащей хитозановой пленки. Установлено, что скорость выделения фермента из

хитозановой пленки , модифицированной додецилсульфатом натрия, определяется кинетикой ее набухания в воде.

Показано, что образование полиэлектролитного комплекса между макромолекулами фермента и высокомолекулярными компонентами формовочных композиций является условием замедления скорости выделения белка, необходимым как при создании высоконабухающих, так и биодеградируемых полимерных пленок медицинского назначения.

На основании изучения кинетики потери массы белоксодержащих биодеградируемых пленок на основе полимеров и сополимеров лактонов показана возможность регулирования скорости деградации путем изменения состава пленкообразующих полимеров и структуры сформованных пленок.

Практическая значимость работы и проверка результатов

Разработан способ получения поверхностно модифицированных высоконабухающих ферментсодержащих хитозановых пленок, состав и структура которых обеспечивают пролонгированное .выделение протеолитического фермента.

Определены составы ферментсодержащих формовочных композиций на основе сополимеров лактонов и условия формования и структура пленок из них, обеспечивающие возможность регулирования скорости биодеградации - пленкообразующего полимера и диффузии иммобилизованных ферментов в модельных средах, что позволяет рассматривать разработанные материалы как перспективные для использования в качестве эффективных перевязочных средств.

Результаты диссертационной работы являются основой для дальнейшей целенаправленной разработки процессов получения новых типов пленок, содержащих ферменты других классов.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов (МГТАД998 г.), Международном симпозиуме « Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов» ( Минск, 1998 г.), 3-ей Международной конференции "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов» ( Москва, 1998 г.), пятой конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Москва-Щелково, 1999 г.), 2-ой Международной научно-методической конференции «Наука-сервису» (Москва,1999 г.).

Объем работы

Диссертация состоит из введения , литературного обзора, двух глав, в которых приведены основные экспериментальные результаты и их обсуждение, методической части , выводов и списка литературы.

Введение содержит общую характеристику работы, обоснование актуальности решения поставленной в диссертации научной задачи,

принципов ее решения, характеристику основных научных и практических результатов.

В литературном обзоре диссертации рассмотрены методы получения полимерных материалов, содержащих иммобилизованные ферменты, их свойства, некоторые аспекты применения волокнистых и пленочных материалов в медицине, а также получение и некоторые свойства полиэлектролитных комплексов и материалов на их основе.

Изложению основных экспериментальных результатов и их обсуждению посвящена гл. 2, в которой рассмотрены реологические свойства ферментсодержащих растворов хитозана, данные, являющиеся основой разработки способа получения поверхностномодифицированных хитозановых пленок, кинетика выделения фермента из хитозановых пленок композиционной структуры, принципы получения, структура и некоторые фармакодинамические свойства ферментсодержащих полилактидных пленок.

В гл.З приведены характеристики методов и методик, использованных при выполнении экспериментальной части работы.

Диссертация содержит также выводы и список литературы, насчитывающий 145 ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка высоконабухающих покрытий на рану, обладающих протеолитической активностью

Поскольку введение белка (фермента), содержащего ионогенные группы кислотного и основного характера, в формовочную композицию на основе хитозана может оказать влияние как на ее структуру , так и на структуру и свойства сформованных пленок, с целью характеристики протекающих в системе процессов были исследованы реологические свойства формовочных композиций различного состава и свойства полученных из них пленок.

Таблица 1

Реологические характеристики формовочных растворов на основе ХТЗ и ТР

и свойства пленок, полученных на их основе

№ Конц—ия Кол-во ТР в Ло, Еа, Время

п.п р-ра форм. р-ре,% от Па-с кДж/моль разру-

уксусной массы ХТЗ шения

к-ты, % пленок в

воде,мин.

1 2 • 0 2,1 18,4 10

2 2 3 1.4 1

3 1 0 2,7 20,4 26

4 1 3 1,9 19,8 17

Согласно полученным данным (табл. 1), введение ТР в формовочный раствор приводит к уменьшению его вязкости, что может быть связано с нарушением системы межмолекулярных взаимодействий. Макромолекулы белка, в отличие от макромолекул ХТЗ, имеют глобулярную форму, поэтому в ферментсодержащем формовочном растворе реализуется структура, характеризующаяся большими расстояниями между макромолекулами полисахарида и меньшим числом межмолекулярных контактов. Следствием этих структурных изменений является изменение свойств пленок, полученных из ТР-содержащих растворов ХТЗ , скорость растворения которых значительно превышает скорость растворения пленок, не содержащих ТР.

2. Разработка способа получения ферментсодержащего композиционного материала на основе хитозана

Уменьшение скорости растворения пленкообразующего полимера -ХТЗ согласно литературным данным может быть осуществлено в результате присоединения небольших количеств дифильных ПАВ, например, додецилсульфата натрия (ДС). Исследования проводились в области концентраций и соотношений компонентов, при которых система кинетически устойчива, увеличение содержания ДС свыше 2,5% сопровождается появлением оптической неоднородности в результате мицеллобразования или образования нерастворимых комплексов ДС-ХТЗ.

Введение в раствор ХТЗ ДС приводит к повышению вязкости эквиконцентрированного раствора, которая увеличивается при увеличении содержания ПАВ (табл.2). Увеличение вязкости и энергии активации вязкого течения связано с протеканием в системе реакции между протонированными аминогруппами ХТЗ и сульфатными группами ДС и реализацией гидрофобных взаимодействий между алкильными радикалами ДС. При этом на изменение интенсивности межм'олекулярного взаимодействия в исследованных растворах более заметное влияние оказывает взаимодействие ДС с ХТЗ, чем с аминогруппами белка.

Введение ДС в состав пленки из ХТЗ, содержащей ТР, не привело к пролонгированию выделения фермента из полимерного материала из-за высокой скорости растворения самой пленки в водной среде. Следует, кроме того, подчеркнуть, что сильные ионные взаимодействия , изменяя конформацию макромолекулы белка, приводят к инактивации значительной части фермента в формовочной композиции.

?

Таблица 2

Реологические характеристики 2%-ных формовочных растворов ХТЗ в 2% уксусной кислоте, содержащих ДС, ТР и свойства пленок, полученных на

их основе

Кол-во Кол-во •По, Па*с Еа,кДж/ Время Кол-во Активность ТР,

ТР в ДС в моль разру- белка, выделившегося

форм, р- форм р- шения выделив- из пленки в

ре, % от ре, % от пленок в шегося из течение 30 мин,

массы массы воде, пленки в % от включ. в

ХТЗ ХТЗ мин. течение 30 мин,% от включ. в пленку ' пленку

0 0 2,1 18,4 10,0 - -

0 0,4 2,8 21,1 30,0 - -

0 0,7 4,0 25,5 40,0 - -

0 2,5 6,31 28,0 60,0 - -

3 0 1,4 18,5 1,0 100 98,5

з • 0,4 1,6 19,0 1,0 100 29,2

3 0,7 2,8 21,1 0,5 - -

3 2.5 4,7 22,3 0,4 100 19,5

С целью получения на основе ХТЗ высоконабухающих пленочных покрытий на рану с гидрофобной поверхностью и некролитическим действием был предложен метод модифицирования белоксодержащих хитозановых пленок ДС. Модифицирование поверхностного слоя пленки, полученной по сухому способу, проводили погружением пленки в водные растворы ДС различной концентрации в течение 15-90 минут с последующей сушкой при комнатной температуре.

Для выбора условий обра&отки пленок раствором ДС было изучено влияние концентрации раствора ПАВ и времени обработки на максимальную степень набухания в воде пленок, полученных из растворов ХТЗ, содержащих ТР и не содержащих фермента.

Согласно полученным данным, концентрация ДС не оказывает определяющего влияния на степень набухания пленки, в то время как увеличение времени обработки раствором ПАВ приводит к снижению максимальной степени набухания, по-видимому, вследствие взаимодействия ХТЗ с ДС не только в поверхностных, но и во внутренних слоях пленки. Наблюдаемая зависимость в наибольшей мере проявляется в отсутствие фермента в составе полимерного материала.

При исследовании морфологии ХТЗ пленок разной толщины было показано, что набухшая модифицированная пленка представляет собой неоднородный материал, состоящей из нерастворимого слоя ( мембраны) толщиной около 10 мкм и раствора ХТЗ,.концентрация которого изменяется в зависимости от степени набухания пленки. Толщина поверхностной мембраны в выбранных условиях модифицирования ( 0,7 %-ный раствор ДС,

30 мин.) пленки практически не зависит ни от толщины пленки, ни от наличия в ее составе фермента. Установленное по данным элементного анализа в поверхностном слое значительное содержание серы при одновременном снижении содержания азота может свидетельствовать о том, что эта мембрана представляет собой комплекс ХТЗ-ДС.

Введение небольшого количества ( от общей массы пленки) фермента не должно было бы сказаться на аналитически определяемых характеристиках элементного состава. Однако поверхностный слой трипсинсодержащей пленки характеризуется пониженным содержанием серы и повышенным-азота. Это позволяет сделать вывод о наличии в поверхностном слое пленки , содержащей трипсин, заметного количества фермента. Этот вывод подтверждается способностью поверхностной мембраны к гидролизу специфического субстрата ТР-этилового эфира И- бензоил-Ь-аргинина. На основании полученных результатов сформулированы предположения о механизме поверхностного модифицирования хитозановой пленки ПАВ, в соответствии с которыми на начальной стадии процесса происходит адсорбция молекул ДС на поверхности пленки. В результате образования ионных связей при взаимодействии ионизованных сульфатных групп ДС с аминогруппами хитозана резко уменьшается количество гидрофильных групп. Вследствие этого поверхностный слой пленки превращается в нерастворимую в воде мембрану, в то время как не участвующий в реакции ХТЗ во внутренних областях сохраняет растворимость в воде. В ферментсодержащей пленке аминогруппы белка, расположенного на ее поверхности, также принимают участие в образовании ионных связей с ДС, что приводит к возникновению более рыхлой структуры по сравнению со структурой поверхностного слоя хитозановой пленки, полученной в аналогичных условиях.

3. Изучение взаимосвязи набухания в воде ферментсодержащего композиционного материала на основе хитозана и кинетики выделения

белка

Для определения степени набухания пленок в воде их выдерживали при 200; С с периодическим взвешиванием до достиже чя набухшей пленкой постоянной массы. В ряде опытов набухание изучали об чмным методом, измеряя геометрические размеры образца пленочного материала ( площадь, толщина). Как , следует из полученных экспериментальных данных, графическая зависимость кинетики набухания Н = Г ( т ) имеет вид кривой с насыщением , характерный для ограниченного набухания полимера, что свидетельствует о принципиальном отличии процесса набухания модифицированной пленки от поведения ХТЗ, который в форме уксуснокислой соли набухает в воде неограниченно.

Изучение кинетики набухания полученных пленок показало, что наибольшее значение Нтах наблюдается у пленок с большей поверхностью контакта с адсорбатом. Толщина пленки влияет как на, значение Н.щах , так и на время , за которое достигается максимальное набухание. Для пленок большой

толщины (150 мкм) увеличение давления набухания приводит к разрыву пленки раньше, чем достигается соответствующее значение Нтах.

Значительное набухание пленок оказывает влияние на кинетику диффузии трипсина из пленки во внешнюю среду. Изучаемая ферментсодержащая поверхностномодифицированная пленка, погруженная в воду, является диффузионной системой, в которой массоперенос осуществляется через полупроницаемую мембрану модифицированного ХТЗ. В процессе набухания пленки ее объем меняется более, чем на порядок, соответственно меняется концентрация трипсина внутри пленки. Кроме того, в процессе набухания поверхностная мембрана испытывает деформации, приводящие к уменьшению ее толщины и изменению пористости, в результате чего может увеличиваться эффективный коэффициент диффузии.

Многокомпонентность изучаемой системы, изменение ее структуры и диффузионной проницаемости в процессе набухания делает достаточно сложной задачу количественного описания протекающих в сгтеме П" щессов. С учетом этих обстоятельств в работе дано феноменологии шсание как процесса набухания XI3 пленки, поверхность кото, юдифицирована ДС, так и процессов выделения из нее иммобилизован!; в ее структуре трипсина. s

Согласно полученным данным (рис.1) , образование поверхностного эдонераствор'имого слоя приводит к существенному замедлению диффузии фермента из пленки, завершающейся в течение длительного времени ( суток и б' ее).

Рис.1. Кинетика выделения белка из хитозановых пленок, товерхностномодифицированныхДС. Толщина пленки, мкм: 1-50,2,3,4- 100.

Столь существенное замедление процесса диффузии белка через тонкую (~ 10 мкм ) полимерную мембрану позволило предположить , что молекула фермента внутри набухшей пленки находится в виде полиэлектролитного комплекса, размеры которого превышают размеры молекулы белка. Подтверждением предположения об образовании полиэлектролитного комплекса ТР с ХТЗ являются данные гель-

SQ 1Q0 150 ¿00 250

хроматографии на биогеле Р-60, согласно которым при эяюировании раствора смеси трипсина и ХТЗ белок на выходе щз колонки определяется достоверно позже, чем при элюировании раствора фермента. Кинетические , кривые, описывающие процесс массопереноса, могут быть разделены на 2 участка, различия в рассчитанных эффективных коэффициентах диффузии для которых

(01=2*10"7 см2*мин"' и 02=Ю'8 см 2 *мин"' соответственно),подтверждают предположение о существенном изменении структуры поверхностного слоя в процессе набухания пленки.

Анализ активности трипсина, выделившегося из пленки в модельную среду, показал, что фермент сохраняет 70% первоначальной активности. Из этого следует, что поверхностная модификация пленки ДС, а также образование комплекса трипсина и ХТЗ не приводит к инактивации фермента.

4. Иммобилизация протеолитических ферментов в структуре пленок из

полилактидов

Способность полилактидов растворяться в метиленхлориде является предпосылкой для получения волокон и пленок с неполитической активностью путем формования из эмульсий, содержащих в качестве дисперсной фазы водные растворы протеолитических ферментов. В диссертации рассмотрены возможности метода включения ферментов в структуру полимерных материалов путем формования из эмульсий при получении из синтетических биодеградируемых полимеров материалов медицинского назначения. Для получения пленок, содержащих иммобилизованные ферменты, были использованы полилактид и сополимеры лактида с гликолидом или этиленоксалатом.

В качестве протеолитических ферментов использованы как кристаллический препарат трипсина , так и комплекс протеаз, обладающий дополнительно коллагенолитической активностью- протеазу С (ПР). Белоксодержащие композиции получали^ путем диспергирования водного раствора фермента в растворах полилактидов. Концентрация формовочных растворов пленкообразующих полимеров была либо одинаковой, либо обеспечивающей их одинаковую вязкость. Следует отметить, что при приготовлении формовочных дисперсий на основе 12%-ного раствора полилактида в метиленхлориде из-за высокой вязкости дисперсионной среды удается ввести только 1 мл раствора белка на 1 г триацетата целлюлозы. Дальнейшее увеличение доли дисперсной фазы

приводит к реверсии фаз эмульсии. Пленки формовали при температуре 20° С путем испарения растворителя или осаждением различными осадителями. Толщина полученных пленок варьировалась от 20 до 70 мкм, масса 1 см2 пленки от 0,9 до 3,5 мг. Ферментативную активность нативных иммобилизованных трипсина'и протеазы определяли по скорости гидролиза метилового эфира КГ- бензоил- Ь- аргинина.

а

Сравнительный анализ активности пленок, полученных из формовочных композиций на основе эквиконцентрированных растворов (табл.3), показывает, что относительная активность ПР, включенной в структуру пленок из полилактидов при одинаковом содержании ее в материале выше, чем активность ПР, иммобилизованной в триацетатной пленке. При этом протеолитическая активность пленок на основе сополимеров лактида снижается при увеличении концентрации пленкообразующего полимера в формовочной дисперсии.

Таблица 3

Влияние химического строения и состава пленкообразующего полимера на

активность ПР , включенной в структуру пленок

№ Пленко- Содер- Конц. Коли- Активность

п.п образую- жание пленко- чество иммобилизован-

щий лактида образую- раство- ной ПР,

полимер в сополи- щего поли- ра ПР, мл/ г

мере, % мера в , % поли-

мера Е/г пленки % от введенной в пленку

1 ТАЦ 7 2 11.5 16

2 Полилак-тид 100 7 2 14,2 20

3 Полил ак-тид 100 2 1 4,3 14

4 слэ 85 7 2 15,1 19

5 слг 83 10 2 14,2 6

6 слг 83 12 2 9,9 20

7 слг 68 12 2 13,5 16

8 слг 68 14 2 11,4 21

9 слэ 72 14 2 10,1 14

Заметное влияние на протеолитическую активность фермента оказывают как химическое строение, так и - в случае сополимеров- их композиционный состав. Уменьшение содержания лактидных звеньев в сополимере приводит к увеличению относительной активности ПР. Наибольшую активность имеют пленки, полученные на основе 7%-ного раствора в метиленхлориде сополимера лактида с этиленоксалатом, содержащие 85% лактида.

Для того, чтобы определить степень влияния диффузионных факторов на скорость ферментативного процесса при иммобилизации протеазы в структуре пленок из полилактида и сополимеров на основе лактида , нами была изучена зависимость относительной активности фермента от параметров, определяющих как скорость диффузии субстрата внутрь пленки ( концентрация пленкообразующего полимера) и размеры диффузионного пространства ( толщина пленки), так и скорость ферментативной реакции

внутри волокна (количество введенного в пленку фермента, степень очистки ферментного препарата).

Было показано, что изменение параметров, определяющих соотношение скоростей диффузии субстрата внутрь полимерного материала и ферментативного гидролиза субстрата , предсказуемо влияет на относительную активность протеолитического фермента, включенного в структуру пленок из полилактида и сополимеров на основе лактида. Этот факт свидетельствует о том, что диффузионные факторы играют существенную роль в кинетике ферментативного гидролиза под действием иммобилизованных в полилактидах протеаз, что особенно заметно для пленок большой толщины,, полученных на основе растворов полилактидов в метиленхлориде высокой концентрации , содержащих высокоактивный белок. Установлены различия в кинетике выделения фермента из полилактидных пленок, полученных из растворов разной концентрации, в частности, в пленках, полученных из формовочной композиции на основе 9%-ного раствора полилактида в метиленхлориде, после контакта с физиологическим раствором сохраняется до 20 % первоначальной активности. При формовании пленки из низкоконцентрированных композиций и при уменьшении толщины сформованной пленки активность пленок за время эксперимента уменьшается в значительно большей степени.

5. Разработка методов регулирования скорости выделения ферментов из

полилактидных пленок Выявленная для пленок на основе полилактидов значительная скорость десорбции фермента не обеспечивает длительного неполитического воздействия при использовании этих пленок для лечения ран. С целью устранения этого недостатка была изучена возможность изменения кинетики выделения белка из биодеградируемых пленок за счет изменения их структуры и композиционного состава.

Для изучения влияния условий формования пленок из полилактида, содержащих иммобилизованный трипсин, была использована формовочная композиция на основе 7 %-ного раствора полилактида в метиленхлориде , в котором диспергирован водный раствор трипсина с концентрацией 12,5 мг/мл ( 2 мл на 1 г полимера). Процесс формования осуществляли по сухому способу и мокрым способом формованием в

осадители с разной осаждающей способностью . В качестве осадителей применяли изопропиловый спирт и гексан.

Как показывает анализ полученных кинетических данных (рис.2 ) выделение белка из пленки, полученной сухим методом формования прекращается уже в первые 30 минут.

~То То 60 80 100 120

Время ,/чин

2

-{

Рис. 2. Кинетика выделения ТР в физ раствор из полилактидных пленок , сформованных по сухому (1) и по мокрому (2,3) способу осаждением в

гексан (2) и изопропанол (3) Структура пленок, полученных формованием в изопропанол из 12 % -ного раствора полилактида в метиленхлориде и эмульсий водного раствора ТР в 12% - и 7%- ных растворах полилактида в метиленхлориде, была изучена методом электронной сканирующей микроскопии. Было показано, что пленки обладают высокопористой структурой с макропорами размером 5-10 мкм, образованными дисперсной фазой. Размер этих пор изменяется при изменении вязкости дисперсионной среды, объемной доли дисперсной фазы и скорости перемешивания. В результате фазового разделения образуются поры меньшего диаметра (0,1 мкм), в основном, выполняющие роль транспортных каналов в процессе выделения макромолекул белка. .

В 0,2 М фосфатном буфере рН = 7,0 при 37 ± 1 0 С была изучена кинетика потери массы пленок из полилактида, а также сополимеров лактида с этиленоксалатом различного состава , полученных по сухому способу, в условиях, моделирующих условия рассасывания перевязочного пленочного материала. Согласно полученным данным, за счет измененния состава сополимера можно существенно изменять скорость разрушения пленки : одинаковый уровень потери массы может быть достигнут за несколько недель и даже месяцев. Было также показано, что на скорость деградации пленок из полилактида оказывает влияние характер пористой структуры пленки, изменяющейся при варьировании способа получения полимерного материала.

Для изменения транспортных характеристик диффундирующего вещества ( фермента) в работе предложен метод модифицирования , основанный на образовании в водной фазе эмульсии полиэлектролитного комплекса белок- полисахарид. С этой целью в водный раствор фермента вводили водорастворимые полисахариды, содержащие ионогеНные группы

к

кислотного или основного характера: карбоксиметилцеллюлозу или хитозан Однако использование формовочных композиций , содержащих в качеств( дисперсной фазы растворы белка и полисахарида, привело лишь I незначительному снижению количества десорбированного белка (ТР) . Дги дальнейшего снижения скорости десорбционного процесса в формовочнук эмульсию были введены растворы альгината натрия и глюконата кальция Образование в результате коалесценции капель этих растворов гел? альгината кальция привело к уменьшению скорости десорбции фермента * количества белка, десорбирующегося из пленок, сформованных из таки> композиций. За счет этого эффект, пролонгирования действия фермента I материале достигает суток.

Для регулирования скорости выделения трипсина из полилактидны? пленок был использован также метод, использованный дл* модифицирования ферментсодержащих хитозановых пленок,-взаимодействие ХТЗ с ДС. При добавлении раствора ДС в формовочнук эмульсию на основе полилактида, содержащую раствор ХТЗ и трипсинг заданной степени дисперсности, на поверхности частиц дисперсной фазь происходит образование комплекса ХТЗ-ПАВ. В этом случае диффузш макромолекул белка по транспортным каналам пленки должнг предшествовать диффузия через тонкую межфазную пленку ПАВ-полиэлектролитного комплекса. Эта стадия является, очевидно лимитирующей, что приводит к замедлению выделения белка и: композиционной полилактидной пленки при увеличении соотношенш ДС:ХТЗ. Следует отметить, что скорость десорбции белка из этих пленок I физиологический раствор мало отличается в течение всего исследованногс периода (24 часа). Этот факт, а также биосовместимость и ранозаживляющие свойства ХТЗ позволяют рекомендовать этот метод для полученш биодеградируемых пленок с пролонгированным некролитическим действием Введение в состав ферментсодержащих биодеградируемых пленок и; полилактида хитозана увеличивает гидрофильность материала и приводит ъ значительному увеличению максимальной степени набухания в воде.

Таким образом, в настоящей работе на примере создана* высоконабухаюищх композиционных пленочных материалов у биодеградируемых пленок с комплексным биологическим действием бьи экспериментально обоснован принцип многокомпонентности при созданш изделий медицинского назначения.

ВЫВОДЫ

1. Изучены пути регулирования физико-химических и фармакодинамическю свойств полимерных пленок для медицинских целей на основе хитозана I биодеградируемых синтетических'полимеров.

2. Исследованы реологические свойства формовочных композиции различного состава на основе уксуснокислых растворов хитозана. Показано что введение в формовочный раствор фермента, а также взаимодействие

i5

хитозана с додецилсульфатом натрия приводит к изменениям вязкости, обусловленным изменением интенсивности и характера межмолекулярных взаимодействий в системе.

Путем поверхностного модифицирования ферментсодержащих хитозановых пленок додецилсульфатом натрия получены высоконабухающие мембраны композиционной структуры, характеризующиеся наличием водорастворимого внутреннего и нерастворимого в воде поверхностного слоев.

Изучена кинетика выделения фермента из

поверхностномодифицированных хитозановых пленок в процессе их набухания в воде и рассчитаны значения коэффициентов диффузии на начальном и заключительном участках кинетической кривой. Показано, что белок находится во внутреннем слое пленки в виде полиэлектролитного комплекса с хитозаном, что, наряду с диффузионным сопротивлением поверхностной мембраны , обеспечивает пролонгирование выделения фермента.

Установлена возможность получения биодеградируемых полилактидных пленок из ферментсодержащих формовочных дисперсий и регулирования скорости десорбции из них ферментов за счет изменения строения пленкообразующего полимера , состава и структуры формовочной композиции и условий формования.

Показано, что в процессе приготовления формовочной дисперсии и формования полилактидных пленок не происходит существенной инактивации фермента , а низкие значения активности фермента , определяемые по скорости гидролиза специфического субстрата, обусловлены влиянием внутридиффузионных затруднений.

На основании кинетики деградации полилактидных пленок в опытах in vitro показана возможность изменения скорости этого процесса при изменении структуры полимерного материала.

Основные материалы диссертации изложены в следующих публикациях:

Ларионова A.C., Гальбрайх Л. С. Разработка композиций для создания полимерных систем с регулируемым выходом лекарственного вещества // Сборник научных трудов аспирантов.-М.:МГТА, 1998.-№2. -С. 75-79.

Кильдеева Н.Р., Гальбрайх Л.С., Ларионова A.C. Современные тенденции создания биологически активных материалов для хирургии // Тезисы докладов научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов.-М.:МГТА, 1998.-С.45.

Кильдеева Н.Р., Вихорева Г.А., Ларионова A.C., Гальбрайх Л.С. Перспективы использования хитозана для создания терапевтических систем // Тезисы докл. Международного симпозиума « Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов».-Минск, 1998.-С. 14-15.

i6

4. Кильдеева H.P., Вихорева Г.А., Ларионова A.C., Гальбрайх J Биологически активные сорбирующие пленки на основе хитозана // Тез] докл. 3-тьей Международной конференции «Современные подходь разработке эффективных перевязочных средств, шовных материало! полимерных имплантатов».-М., 1998.-С.130-131.

5. Ларионова A.C., Журавлева Е.М., Кильдеева Н.Р., Вихорева Г Гальбрайх Л.С., Мороз H.A., Ларионова Н.И. Ферментсодержа! высоконабухающие хитозановые пленки // Тезисы докл. Пятой конфереш « Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».-Москва-Щелко 1999.-С.273-275.

6. Ларионова A.C., Кильдеева Н.Р., Овчинникова Т.Н., Гальбрайх Л Шалашева В.В., Вершинина Л,И. Разработка ферментсодержа! биодеградируемых пленок для лечения ран // Тезисы докл. 2 Международной научно-методической конференции « Наука-сервису».-1999.-С.70.

7. Dimitrov D.V., Kildeyeva N.R., Larionova A.S., Vikhoreva G.A., Galbraikh ] Surface-modified chitosan films for local enzyme delivery // Proceed . 26 Int Symp. On Controlled Release of Bioaktive Materials.- Boston, USA, 1999. 451-452. /

ЛР N 020753 от 23.04.98

Подписано в печать И ,01.2000 Сдано в производство И .р1.2000 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл. печ. л. 1,0 Уч.-изд. л. 0,75 Заказ 5 Тираж 80

Электронный набор, МГГУ, 117918, Москва, Малая Калужская, 1

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. {О

Получение и свойства полимерных материалов, содержащих иммобилизованные ферменты.

1.1. Методы получения полимерных материалов, содержащих иммобилизованные ферменты. .Н

1.2.Получение и некоторые свойства полиэлектролитных комплексов и материалов на их основе.

1.3. Некоторые вопросы медицинского применения биологически активных волокнистых и пленочных материалов.

1.4. Особенности строения и некоторые свойства хитина и хитозана.

1.5. Биодеградируемые полимеры медицинского назначения.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Использование многокомпонентных ферментсодержащих композиций для создания различных типов полимерных раневых покрытии. ~и

2.1. Разработка высоконабухающих покрытий на рану, обладающих протеолитической активностью.

2.1.1. Изучение возможности использования хитозана в качестве носителя лекарственных средств.

2.1.2. Разработка способа получения ферментсодержащего композиционного материала на основе хитозана.

2.1.3. Изучение взаимосвязи набухания в воде ферментсодержащего композиционного материала на основе хитозана и кинетики выделения белка.

2.2. Ферментсодержащие полимерные композиции на основе биодеградируемых синтетических полимеров.

2.2.1. Иммобилизация протеолитических ферментов в структуре пленок из полилактидов. 8{

2.2.2. Разработка методов регулирования скорости выделения ферментов из полилактидных пленок.%

3. МЕТОДИЧЕСКИЙ РАЗ ДЕЛ. УУ

4. выводы.

Актуальность проблемы.

Историю человечества на всем ее протяжении сопровождали многочисленные природные , а в последнее время — и антропогенные катастрофы , последствиями которых были разрушения и человеческие жертвы. Не стал исключением , а только привел к увеличению их количества и масштабов последствий и завершающийся XX век . При решении медициной задач , возникающих в каждодневной медицинской практике, традиционно использовались перевязочные средства ( бинты, марля, вата), основные функциональные свойства которых сводились к удалению некротических масс и защите пораженных областей организма от внешних воздействий.

В то же время, углубление и развитие знаний в области биохимии, микробиологии и смежных областей науки, выявление механизмов взаимодействия патогенной микрофлоры с системами организма, механизмов регенерации поврежденных тканей создали предпосылки для разработки нового поколения перевязочных материалов, роль которых заключается в активном воздействии на протекающие в ране процессы. В основе принципа получения таких материалов лежит введение в их структуру различных по своей природе и механизму биологического действия веществ ( соединений, обладающих антимикробными свойствами, ферментов, веществ, ускоряющих репарационные процессы и др.). Исследования, посвященные разработке методов получения биологически активных волокнистых и пленочных материалов, изучению их свойств и наиболее эффективных областей применения в настоящее время приобретают все возрастающее значение.

В ряду этих материалов значительный интерес представляют волокна и пленки , содержащие иммобилизованные протеолитические ферменты , которые могут быть использованы в медицинской практике при лечении гнойных ран и ожогов.

Одним из перспективных методов получения содержащих ферменты волокон и пленок является введение фермента в структуру указанных полимерных материалов в процессе формования. Однако специфические свойства ферментов, такие как химическая природа белка, бифильность его макромолекулы, лабильность ферментов при экстремальных значениях температуры и рН и действии органических растворителей, растворимость ферментов в реакционной среде ( водные растворы) и высокие скорости превращения специфических субстратов создают необходимость в специальных подходах при решении проблемы получения волокон и пленок, содержащих иммобилизованные ферменты, в основе которых - управление составом и структурой полимерной составляющей и диффузионными характеристиками иммобилизованных ферментов.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы является разработка способов получения биологически активных мембран на основе хитозана и синтетических биодеградируемых полимеров с регулируемыми физико-химическими и фармакодинамическими свойствами.

В связи с поставленной целью в задачи работы входило:

- изучение влияния состава и условий приготовления на свойства ферментсодержащих формовочных композиций и сформованных из них пленок из ХТЗ и полилактидов;

- изучение влияния структуры пленок на кинетику выделения протеолитических ферментов и их полиэлектролитных комплексов в модельные среды;

- изучение влияния диффузионных факторов на кинетику превращения специфических субстратов в присутствии пленок, содержащих иммобилизованные ферменты.

Научная новизна.

В диссертационной работе впервые :

- выявлены закономерности формирования и установлен состав нерастворимого в воде слоя, образующегося при поверхностном модифицировании додецилсульфатом натрия ферментсодержащей хитозановой пленки;

- установлено, что скорость выделения фермента из хитозановой пленки, модифицированной додецилсульфатом натрия , определяется кинетикой ее набухания в воде;

- показано, что образование полиэлектролитного комплекса между макромолекулами фермента и высокомолекулярными компонентами формовочных композиций является условием замедления скорости выделения белка, необходимой как для создания высоконабухающих , так и биодеградируемых полимерных пленок медицинского назначения;

- на основании изучения кинетики потери массы .белоксодержащих биодеградируемых пленок на основе полимеров и сополимеров лактонов показана возможность регулирования скорости деградации путем изменения состава пленкообразующих полимеров и структуры сформованных пленок.

Практическая значимость работы. Разработан способ получения поверхностномодифицированных высоконабухающих ферментсодержащих хитозановых пленок, состав и структура которых обеспечивает пролонгированное выделение протеолитического фермента.

Определены составы ферментсодержащих формовочных композиций на основе сополимеров лактонов^ условия формования и структура пленок из них , обеспечивающие возможность регулирования скорости биодеградации пленкообразующего полимера и диффузии иммобилизованных ферментов в модельных средах, что позволяет рассматривать разработанные материалы как перспективные для использования в качестве эффективных перевязочных средств.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения , литературного обзора, двух глав, в которых приведены основные экспериментальные результаты и их обсуждение, методической части, выводов и списка литературы.

4.ВЫВОДЫ

1. Изучены пути регулирования физико-химических и фармакодинамических свойств полимерных пленок для медицинских целей на основе хитозана и биодеградируемых синтетических полимеров.

2. Исследованы реологические свойства формовочных композиций различного состава на основе уксуснокислых растворов хитозана. Показано, что введение в формовочный раствор фермента, а также взаимодействие хитозана с додецилсульфатом натрия приводит к изменениям вязкости, обусловленным изменением интенсивности и характера межмолекулярных взаимодействий в системе.

3. Путем поверхностного модифицирования ферментсодержащих хитозановых пленок додецилсульфатом натрия получены высоконабухающие мембраны композиционной структуры, характеризующиеся наличием водорастворимого внутреннего и нерастворимого в воде поверхностного слоев.

4. Изучена кинетика выделения фермента из поверхностномодифицированных хитозановых пленок в процессе их набухания в воде и рассчитаны значения коэффициентов диффузии на начальном и заключительном участках кинетической кривой. Показано, что белок находится во внутреннем слое пленки в виде полиэлектролитного комплекса с хитозаном, что, наряду с диффузионным сопротивлением поверхностной мембраны , обеспечивает пролонгирование выделения фермента.

5. Установлена возможность получения биодеградируемых полилактидных пленок из ферментсодержащих формовочных дисперсий и регулирования скорости десорбции из них ферментов за счет изменения строения

126 пленкообразующего полимера , состава и структуры формовочной композиции и условий формования.

6. Показано, что в процессе приготовления формовочной дисперсии и формования полилактидных пленок не происходит существенной инактивации фермента , а низкие значения активности фермента , определяемые по скорости гидролиза специфического субстрата, обусловлены влиянием внутридиффузионных затруднений.

7. На основании кинетики деградации полилактидных пленок в опытах in vitro показана возможность изменения скорости этого процесса при изменении структуры полимерного материала.

1Zt

1. Калинина Т.Н., Хохлова В.А., Чуфаровская Т.И., Илларионова Е.А. Перевязочные средства на основе хитина . Там же.- С. 123-124.

2. Shtilman M.I. Immobilization on Polymers. Utrecht, Tokyo. LSP. 1993.-P. 121.

3. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. -М.: Наука, 1984.-281с.

4. Торчилин В.П. Иммобилизованные ферменты в медицине.- М.: ВНТИЦ.- 198 с.

5. Платэ H.A., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры.- М.: Химия , 1986,-296 с.

6. Melson J.M., Griffin E.G.J. Absorbtion of invertase // J.Am.Chem. Soc. -1916,- V. 38. -P. 1109-1 111.

7. Kobamoto N., Lobroth G., Camp P., Van Amburg G., Augenstein L. Specificity of trypsin absorption onto cellulose, glass and guart // Biochem. Biophys. Res Commun.-1976.-V.24.-P.622-627.

8. Севастьянова E.B., Давиденко Г.И. Иммобилизация протеолитических ферментов на угольных материалах //Биотехнология. 1991. -№1 .-С. 12-17.

9. Мишулин И.Д., Бородинская И.Н. Влияние физико-химических свойств аминокислот и белков на процесс их иммобилизации на АЦВМ // Методы получения, анализа и применения ферментов: Тез.докл. Всесоюзн. Конф. Юрмала, 1990.-С.42.

10. Применение иммобилизованных ферментов в медицине В кн.: Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы - т.2. Под ред. И.В.Березина, В.К.Антонова и К.Мартинека. - М. :Изд-во МГУ, 432 с.

11. Раппопорт С.М. Медицинская биотехнология. М.:Медицина, 1976. - 212 с.

12. Лобич Л.С. Иммобилизация трипсина и папаина на волокнах различной природы и исследование свойств модифицированных ферментов: // Автореф.дисс. . канд.хим.наук. Л., 1982. - 22с.

13. Иванова М.В., Костанова Е.А., Высоцкая Е.П. Исследование иммобилизации трипсина и лизоцима на привитом сополимере целлюлозы и полиакриловой кислоты // Прикл. биохим. и микробиол. 1992.- Т. 28.- № 5.- С. 703-710.

14. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Вирник А.Д. Исследование иммобилизации про-теолитических ферментов на привитых сополимерах целлюлозы различного строения // Прикл. биохим. и микробиол. 1997.- Т. 33. - С. 38- 42.

15. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Вирник А.Д. Получение ферментсодержащих целлюлозных волокнистых материалов на основе привитых сополимеров, содержащих сульфогруппы // Хим. волокна.- 1997,- № 1. С. 10-13.

16. Химическая энзимология / Под ред.Березина И.В., Мартинека К. М.:МГУ,1983.-278с.12У

17. Тривен М.Д. Иммобилизованные ферменты: Пер. с англ. М.:Мир, 1983.-213с.

18. Попов Е.М. Проблемы белка.-М.:Наука, 1997. Т.З. - 395с.

19. Хорунтина С.И., Шамолина И.И., Хохлова В.А., Вольф JI.A. Иммобилизация папаина на волокнистом полимере из поливинилового спирта // Прикл.биохим. и микробиол. 1978.- Т.12. - №1. - С.11-14.

20. Вольф J1.A, Шамолина И.И., Хохлова В.А. Получение, свойства и применение волокон с ферментативной активностью // Хим.волокна.- 1979. №4. - С.З-8.

21. Гаврилова В.П., Федорова Л.Н., Степанова Л.С. и др. Изучение стабильности ферментов, иммобилизованных в альгинатном волокне // Там же. С. 232.

22. Вольф Л.А., Хохлова В.Н. Ферментактивные волокна для пищевой промышленности и медицины // В сб.: Получение и применение волокон со специфическими свойствами. Мытищи: ВНИИВ Проект, 1980. - С 98-101.

23. Любич Л.С., Власов Г.П., Вольф Л.А.Изучение стабильности и кинетических параметров трипсина и папаина, иммобилизованных на волокнах различной природы // Инженерная энзимология: Тезисы докл IV Всесоюзн. Симп. -Киев, 1983,-4.2.-С. 98.

24. Любич Л.С., Власов П.И. Полимерные материалы, содержащие ферменты протеолитического действия// Синтетические полимеры медицинского назначения: Тезисы докл. IV Всесоюзн. симп. Алма-Ата, 1983. - С. 172-173.

25. Вольф Jl.A., Гончарова H.A., Лобова А.Б., Шамолина И.И. и др. Иммобилизация ферментов на волокнистых носителях // Прикл. биохим. и микробиол.-1986. Т.22. - №5. - С.664-668.

26. Варфоломеев С.Д., Судьина Г.Ф. Кинетика реакций с иммобилизованными ферментами // Итоги науки и техники. Сер.Биотехнология. М.: ВИНИТИ АН СССР, 1986. - Т.5. - С.87-133.

27. Кабанов В.Я. Получение полимерных биоматериалов с использованием ра-диоционно- химических методов // Успехи химии .-1998.-№ 9.- С. 861-893.

28. Dobo J. //Acta Chim. Acad. Sei. -1970.- V. 63.- P. 453. Приведено в 31.

29. Garnett J. L., Long V. A., Sangster D.F. //Radiat. Phys. Chem.- 1986.-P. 301. Там же.

30. Garnett J. L., Levot R., Sangster D. F. // Radiat. Phys. Chem. 1985,- V. 25,- P. 509. Там же.

31. Liddy J., Garnett J. L., Kenyon S. // J. Polym. Sei. -V. 49.- P. 109. Там же.

32. Alves M. da Silva, Gil M., Lapa E., Kotov S. // Radiat. Phys. Chem.- 1990,- V. 36,- P. 589. Там же.

33. Beddows С. G., Gil M., Guthrie J. // Biotech. Bioeng. 1982,- V. 24,- P. 1371. Там же.

34. Plate N.A., Valiev L. I. // J. Am. Chem. Soc. Polym. Prepr.- 1992,- V. 33,- P. 939. Там же.

35. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Дронова М. В., Гальбрайх Л.С. Текстильные материалы медицинского назначения с комбинированным биологическим действием : получение и свойства // Текстильная химия.- 1998.-№ 1. С. 96-102.

36. Dinelli D., Morisi F. Fibre entrapped enzymes // Enzyme Eng.- 1974.- N.- Y.London, Plenum Press.- V. 2. P. 293-301.

37. Маркони В. Промышленное применение свободных и иммобилизованных ферментов// Успехи химии .- 1976.- Т. 4.- №11.- С. 2077-2092.

38. Рат. 4004980 ( USA). Enzyme entrappment with cellulose acetate formulation./ A. Emery, H. Lim, M. Kolari.- 1977.

39. Pat. 3947325 (USA). Preparation of high permeability cellulose fibres containing enzymes./ D. Dinelli, F. Bartoly, S. Gullinelli. 1976.

40. Pat. 176580 (Hungria). / Nagy M., Horkay F.- 1978.

41. Antomo A., Vitolo M., Oliveira de R. C., Higa O. Z. // Radiat. Phys. Chem. -1997.-V. 47.-P. 873. Приведено в 31 .

42. Maeda H., Suzuki H. // Proc. Biochem. 1977.- V. 12,- P. 9. Там же.

43. Kaetsu I., Kumakura M. //Radiat. Phys. Chem. -1987.- Y. 30.- P. 263. Там же.

44. Yoshida ML, Kaetsu I. // J. Appl. Polym. Sci. 1981,- V. 26,- P. 687. Там же.

45. Maeda H., Suzuki H., Yamauchi A. // Biotech. Bioend. -1973.- V. 15,- P. 607. Там же.

46. Айдарова С. Б. Свойства синтетических полиэлектролитов в водных растворах на границе вода / воздух и влияние на них поверхностно-активных веществ : Дис. . к. х. н. -М., 1982.

47. Касаикин В.А. Полимер коллоидные комплексы. Получение, строение , свойства: Дис. . д. х. н. -М.: МГУ, 1988.

48. Goddard Е. D. Polymer / Surfactant Interaction Its Relevance to Detergent System // J. Amer. Oil Chem. Soc. -1994.- V. 71.- № 1.- P. 1 -16.

49. Стародубцев С. Г. Влияние топологического строения полиэлектролитных сеток на их взаимодействие с противоположно заряженными мицеллообра-зующими поверхностно-активными веществами // Высокомолек. соед. -1990,- Т. 32 Б . № 12.- С. 925-930.

50. Хандурина Ю. В., Рогачева В. Б., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Взаимодействие сетчатых полиэлектролитов с противоположно заряженными поверхностно- активными веществами // Высокомолек. соед. 1994,- Т. 36 А .- № 2 . - С. 229-234.

51. Magdassi S., Vinetsky Y. Microencapsulation of o/w emulsions by formation of protein- surfactant insoluble complex // J. Microencapsulation . 1995,- V. 12 .-№ 5,-P. 537-545.

52. Дубинская A. M., Добротворская A. E. // Хим.- фарм. журнал,- 1989.- № 5,-C. 623.

53. Скорикова E. E., Вихорева Г. А., Гальбрайх Jl. С., Котова С. Л. и др. Свойства интерполиэлектролитных комплексов хитозана и полиакриловой кислоты // Высокомолек. соед. 1996.- Т. 38.- № 1.-С. 61-65.

54. Wenjun Li, Yuhda Lu, Wang Zhiliang. Studies on chitosan and poly ( arrylic acid) interpolymer complex // J. Appl. Polym. Sci. 1997.- V. 65.-№ 3 .-P. 1445-1450.

55. Kosmella S., Kotz J., Liu J. Cooperative nature of complex formation in mixed polyelectrolyte-surfactant systems // J. Phys. Chem. B. 1998.- P. 102.

56. Мусабеков К.Б., Айдарова С. Б., Абдиев К. Ж. Адсорбция полиэлектролитных ассоциатов на подвижных границах раздела фаз // В кн.: Успехи коллоидной химии .- Ленинград : Химия , 1991.- С. 209-223.

57. Holmberg Ch., Nilsson S., Singh S. K., Sundelof L.O. Hydrodynamic and thermodynamic aspects of the polysacharides- water system // J. Phys. Chem. -1992.-V. 96,-P. 871-876.

58. Guerrini M., Negulescu I. I., Paly W. H. Interaction of aminoalkylcarbamoyl cellulose and sodium dodecyl sulfate // J. Appl. Polym. Sci. 1998.- V. 68.- № 7,-P. 1091-1097.

59. Yoshioka H., Nonaka K., Fukuda K., Karama S. Chitosan- derived polymer- surfactants and their micellar properties // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry .- 1995.- V. 59.- № 10,- P. 1901- 1904.

60. Гостищев B.K., Толстых П.И., Василькова З.Ф. //Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов М., 1989. -С.29-35.

61. Вельш А.А.//Актуальные вопросы гнойной челюстно-лицевой хирургии. -Красноярск, 1988.-С. 18-20.

62. Геращенко И.И. Изучение модели взаимодействия ферментсодержащей лечебной композиции на основе полисорба с экссудатом раны // Хим.-фарм. журнал. 1997,- №3,- С.72-74.

63. Усманов Т.И., Закинова H.A., Карамова У.Г. и др. // Синтетические полимеры медицинского назначения. Киев, 1989. - С.80-81.

64. Кассин В.Ю., Николаев A.B., Мамедов JI.H. // Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов. М., 1998. - С. 93-94.

65. Мышкина JI.A., Петухова Т.В., Левина О.И. и др. // Человек и лекарство: I Рос. нац.конгресс: Тез. докл.- М., 1992.- С.229.

66. Пат.82 19496 Яп.// Рж.Хим. -1995.- №24. - 02116П.

67. Пат.4952618 США//Рж.Хим. 1995. - №13. - 0297П.

68. Fukuda Н., Kikuchi R.// Macromol. Chem.- 1987. V. 178,- N 10. -Р.2895.

69. Плиско Е.А. Нудьга Л.А., Данилов С.Н. Хитин и его химические превращения//Усп. химии, 1988,-Т.46, вып.7. - С. 1470-1487.

70. Muzzarelli R.A. Chitin. Pergamon Press. - Oxford. - 1977.

71. Suryanarayana R., Yashodho S.V., Mahendral^ar N.S., Auttaraiappa P. Deacetylation of chitin at low temperature by a novel alkali impregnation technique // Indian Y. Technol.- 1987,- V.25.-№ 4.- P.194-196.

72. Пат. 2087483 ( Россия). Способ получения хитозана./ Сова В. В., Фрайман Д. Б., Банников В.В., Львович Ф.И. 1997.id:

73. Рогожин C.B., Лозинский В.И., Вайнерман Е.С., Кулакова В.К и др. Способ получения хитозана. А.С. 1363831 СССР.

74. Немцев С.В. Способы получения хитина и хитозана // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования: Тез. докл. 3-ей Всес.Конф.- Москва, 1992.- Р.715.

75. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Иванова Н.И., Гелин Я.В. Физико-химические свойства хитина крабов и некоторых микроскопических грибов // Прикладная биохимия и микробиология.- 1980.- Т.16.- № 3.- С.377-382.

76. Oweltz N.E. Structure of chitin // Biochem. Biophys. Acta.- I960.- V.44.-P.416-435.

77. Blackwell Y. Structure of (3-chitin or parallel chain systems of poly-(3-(l-4)-N-acetyl-D-glycosamine // Biopolymers.- 1969.- V.7.-№ 3.- P.281-289.

78. Генин Я.В., Скляр A.M., Цванкин Д.Я., Гамзазаде А.И. и др. Рентгенографическое изучение пленок хитозана // Высокомол. соед. -1984. -Т. 26Ф.-№11.-С.2411-2416.

79. Горбачева И.Н., Овчинников Ю.К., Гальбрайх Л.С., Трофимов Н.А. Рентгенографическое изучение структуры хитозана // Высокомолек. соед. Т. 30А .-№ 12.-С. 2512-2515.

80. Salmon S., Hudson S.M. Crystal morphology, biosynthesis, and physical assembly of cellulose/ chitin, and chitosan // J. Macromol. Sci. Reviews in Macromol. Chem.and Phys.- 1997,- V. 37.-№ 2,- P. 199-276.

81. Rudall К. M. The distribution of collagen and chitin // Symp. Soc. Exp. Biol. -Fibrous Proteins and their Biological Significans.- 1955.- P. 49-71.

82. Rudall К. M., Kenchington W. The chitin system // Biol. Rew. 1978,- V.18.- P. 597-636.

83. Mima S., Miya M., Iwamoto R., Yoshikawa S. Highly deacetylated chitosan and its properties // J. Appl. Polym. Sci. 1983,- V. 28,- P. 1909-1917.

84. Нудьга JI.A., Баклагина Ю. Г., Петропавловский Г. А., Михайлов Г. М. и др. Надмолекулярная организация и физико-механические свойства волокна из хитина с низкой степенью дезацетилирования // Высокомолек. соед. 1991.- Т. ЗЗБ.-№ 11.-С. 864-868.

85. Piron Е., Accominatti М., Domard A. Interaction between chitosan and uranyl ions, role of physical and physicochemical parameters on the kinetics of sorbtion // Langmuir .- 1997.- V. 13,- № 6,- P. 1653-1658.

86. Samuels R. J. Solid state characterization of the structure of chitosan films // J. Polym. Sci. Polym. Physics Ed. 1981.- V. 19.- № 7.- P. 1081-1105.

87. Tomihata K., Ikada Y. In- vitro and In-vivo degradation of films of chitin and its deacetylated derivatives // Biomaterials .- 1997.- V. 18.- № 7.- P. 567-575.

88. Struszczyk H. Microcrystalline Chitosan. Preparation and properties of micro-crystalline chitosan//J. Appl. Polym. Sci. 1987.-V. 33.-P. 177-189.

89. Васнев В. А. Биоразлагаемые полимеры // Высокомолек. соед. 1997.- Т. 39Б.- № 12,- С. 2073-2086.

90. Роговин З.А., Гальбрайх Л.С. Химические превращения и модификация целлюлозы.- М.: Химия, 1979, 224с.

91. Липатова Т.Э. , Пхакадзе Г.А. Применение полимеров в хирургии .- Киев: Наук, думка, 1977.- 132 с.

92. Барская И. Г., Людвиг Е. Б., Тарасов С. Г., Тодовский Ю. К. Катионная со-полимеризация гликолида с D , L лактидом // Высокомолек. соед. - 1983.- Т. 25А .-№6,- С. 1289-1293.

93. Барская И. Г., Людвиг Е. Б., Шифрина Р. Р., Изюмников А. Л. Катионная полимеризация D, L лактида // Высокомолек. соед. - 1983.- Т. 25А.- № 6.- С. 1283-1288.

94. Беленькая Б. Г., Сахарова В.И., Белоусов С. И., Синевич Е. А., Чвалун С. Н. Исследование биодеструкции монофиламентных нитей на основе полигли-колида// Росс. хим. журнал.- 1998.- № 4.- С. 70-74.

95. Пхакадзе Г. А., Алексеева Т.Т. Пути биодеструкции полиуретанов. Биоде-структируемые полимерные материалы // Сб. научн. трудов.- Киев : Наук, думка,- 1982,-С. 12-19.

96. Липатова Т. Э., Бакало Л.А., Алексеева Т.Т. Сравнительная оценка деструкции линейных полиуретанов в физиологическом растворе и организме животных // Высокомолек. соед. 1979.- Т. 21.- № 10 .- С. 2305-2310.

97. Липатова Т. Э., Пхакадзе Г. А. Полимеры в эндопротезировании. Киев : Наук, думка, 1983,- 160 с.

98. Lipatova Т.Е. Some chemical aspects of the behavior of synthetic polimers in living organism // J. Polym. Sci. 1979.- V. 66. - P. 239-257.

99. Reich G., Bernickel E., Alvarez P.E. In vitro degradation kinetics of PLA/ PLGA devices in the presence of enzymes : a mechanistic study //

100. Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 1999,- V. 26.- P. 343.

101. Hanes J., Hildgen P. и др. Porous poly( D, L lactic-co- glycolic acid) microsphere dergadation and release of macromolecules copolymers // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. - 1997.-V. 24.- P. 1027-1028.

102. Biodegradable polymers as drag delivery systems. Ed. by Chasin M., Langer R. -1990,- Marcel Dekker, Inc.: N. Y. 385p.

103. Беленькая Б. Г., Гаспарян С.С., Сахарова В. И., Полевов В.Н. Предварительные результаты использования биодеструктируемых полимеров в нейрохирургии // Современные подходы к разработке эффективных перевязочныхт

104. Whang К., Healy К. Е., Thomas С. Н., Nuber G. A novel method to fabricate bio-absorbable scaffolds // Polymer.- V.36.- № 4,- P. 837- 842.

105. Kildeeva N. R., Ovchinnikova T. N., Virnik A. D. Biodegradable film dressing containing immobilized protease with controlled pharmacodynamic properties // In : Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.-1995.- V. 22. P. 486-487.

106. Овчинникова Т. H., Веретенникова А.Н. Перспективы использования сополимеров на основе этиленоксалата с гликолидом для создания пролонгированных лекарственных препаратов// Инженерная энзимология: Тез. докл. Всесоюз. симп. -1991.-С. 75.

107. Aisina R. В., Diomina N. В., Ovchinnicova Т. N., Varfolomeyev S. D. Microencapsulation of somatropic grought hormone // S.T.P. Pharma Sci. 1994,- V. 4.- № 6,-P. 437-441.

108. Zhu K. J., Caj J. Bioactivity of (3- galaktosidase released from degradable copolymers // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. -1997,- V. 24.- P. 469-470.

109. Cleland J. F., Jones A.J.S. Development of stable protein formulations for microencapsulation in biodegradable polymers // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 1995.- V. 22,- P. 514-515.

110. Calvo P., Vila- Jato J. L., Alouso M. J. Cationic polymer- coated nanocapsules as ocular drug carriers // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 1997.- V. 24,- P. 97-98.

111. Системы с регулируемым высвобождением из биодеградируемых полимеров // Pharm. Ind. 1996.- V. 58.- № 12.- P. 1147-1151. Приведено в : Биотехнологическое производство за рубежом . Экспресс- информация. 1997. Вып. 2.

112. Кильдеева Н.Р., Трусова С.П., Горчакова В.А. и др. Многокомпонентные полимерные системы , содержащие биологически активные белки и антимикробные вещества // Прикл. биохим. и микробиол. 1997.- Т. 33.- № 5.- С. 488-491.

113. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Принципы иммобилизации и научные подходы к использованию ферментов и других физиологически активных соединений в медицине. // В кн.: Химическая энзимология. М.:МГУ, 1983.-С. 115-153.

114. Кивман Г.Я., Лященко Ю.В., Рабинович Э.З., Флейдерман Л.И. Гидроколлоидные покрытия новое поколение средств для лечения ран и ожогов // Хим. фарм. журнал.- 1994,- № 9.- Т. 28,- С. 21-27.

115. Клесов A.A. Инженерная энзимология на промышленном уровне // Биотехнология. Итоги науки и техники,- М.: ВИНИТИ АН СССР.- 1989.- Т. 18.- С. 184.

116. Вихорева Г.А., Енгибарян Л.Г., Голуб М.А. и др. Модифицирование хитоза-новых пленок поверхностно-активными веществами с целью регулирования их растворимости и набухания // Хим. волокна.- 1994.- № 5,- С. 14-19.

117. Вихорева Г.А., Бабак В.Г., Галич Е.Ф., Гальбрайх Л.С. Комплексообразова-ние в системе додецилсульфат натрия хитозан // Высокомолек. соед. - 1997.-№ 6.- С. 947-952.

118. Малкин А. Я., Чалых А.Е. Диффузия и вязкость полимеров. Методы измерения.- М.: Химия. 1979,- 304 с.

119. Левашов А.Л., Клячко Н.Л., Хмельницкий Ю.А. Моделирование природной иммобилизации ферментов в системах обращенных мицелл // Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР . 1986,-Т. 5,- С. 134- 171.

120. Кильдеева Н.Р. Научные основы получения волокнистых и пленочных биокатализаторов из белоксодержащих формовочных дисперсий : Дис. . д.х.н. М., 1998.-277С.

121. Березин И.В., Клесов A.A. Практический курс химической и ферментативной кинетики .- М.: МГУ, 1976.- 321 с.

122. Папков С.П. Физико-химические основы переработки растворов полимеров. -М.: Химия, 1971.-363 с.

123. КестингР.Е. Синтетические полимерные мембраны.-М.: Химия, 1991.- 336с.

124. Папков С.П. Студнеобразное состояние полимеров.- М.: Химия, 1978.-255 с.

125. Папков С.П. Физико- химические основы процессов формования химических волокон.- М.: Химия, 1978.- 320 с.

126. Липатов Ю.С., Сергеева Л.М., Тодосийчук Т.Т., Хромова Т.С. Об особенностях адсорбции макромолекул из концентрированных растворов // РАН СССР. -1974,-Т. 218.-№ 5,-С. 1144-1146.

127. Kildeeva N.R., Galkin S.A., Anokhina O.A., Virnik A.D. Rheological properties of spinning composition based on triacetate cellulose solutions for the obtained of enzyme- contained fibres // Cell. Chem.Technol.- 1993.- V. 27,- № 6 .- P. 655-669.ш

128. Whang К., Thomas С.Н., Healy K.E., Nuber G. A novel method to fabricate bioabsorbable scaffords // Polymer.- 1995,- V. 36.- № 4. P. 837-842.

129. Кильдеева H.P., Красовская С.Б., Шульчишина E.B., Матвеев Д.В. и др. Кинетические исследования взаимодействия Р- галактозидазы с глутаровым альдегидом // Прикл. биохим. и микробиол. 1997.- Т. 33.- № 2.- С. 166-171.

130. Афиногенов Т.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры .- Спб.: Гиппократ, 1993,- 125с.

131. Lowry О.Н., Rosebrogh N.J., Randal R.J. Protein measurement with the folin phenol regent//J. Biol. Chem. 1951.-V. 193,-P. 265-275.