автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.15, диссертация на тему:Научные основы получения волокнистых и пленочных биокатализаторов из белкосодержащих формовочных дисперсий

ОЛ

На правах рукописи

? С г"

"" 0 УДК 677.021.125:577.151.042

с' КИЛЬДЕЕВА Наталия Рустемовна

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВОЛОКНИСТЫХ И ПЛЕНОЧНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ ИЗ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ ФОРМОВОЧНЫХ ДИСПЕРСИЙ

(05.17.15 - Технология химических волокон)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена в Московской государственной текстильной академии имени А.Н.Косыгина.

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки и техники РФ доктор химических наук профессор Л.С.Гальбрайх

заслуженный деятель науки и техники РФ доктор технических наук профессор Э.М.Айзенштейн

доктор химических наук профессор А.Е.Васильев

доктор химических наук профессор И.А.Ямсков

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет технологии и дизайна

Защита состоится 21 октября 1998 года в Ю00 на заседании диссертационноп совета Д 138.08.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте поли мерных волокон по адресу: 114009 г.Мытшци Московской обл., ул.Колонцова, 5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИПВ.

Автореферат разослан 1998:

Ученый секретарь диссертационного совета доктор технических наук,

профессор '^¡^-^-р Перепечкин Л.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие прогрессивных методов лечения и потребности новых технологий ставит проблему получения материалов с различной направленностью биологического действия и, в первую очередь, ферментсодер-жащих материалов, в число наиболее актуальных задач современной науки.

Многообразие ферментов в природе, их исключительно высокая каталитическая активность, а также совершенствование методов выделения этих уникальных белков открывают перспективы их использования для создания новых эиотехнологических процессов и лечения целого ряда заболеваний. В то же зремя для нативных ферментов характерен ряд недостатков (низкая стабильность, приводящая к быстрой потере активности, сложность отделения от реакционной среды), снижающих технико-экономическую эффективность каталитических процессов с их участием и ограничивающих их применение в биотехно-тогии и медицинской практике. Иммобилизация ферментов в структуре поли-черов-носителей позволяет осуществить переход к нерастворимым формам иммобилизованных ферментов, сохраняющих свойства нативного предшественни-<а, но выгодно отличающимся от него стабильностью и меньшей подверженностью биологическому воздействию. Нерастворимые производные ферментов зегко отделять от продуктов реакции, что обеспечивает возможность многократного применения в биокаталитических процессах превращения специфических субстратов.

В решении этих задач важное место занимает разработка методов получения волокон и пленок, содержащих иммобилизованные ферменты. Целесооб-эазность использования волокон и пленок в качестве носителей для иммобили-¡ации ферментов обусловлена рядом причин. Высокая удельная поверхность золокна способствует интенсивному массообмену в гетерогенном катализе, а хорошие физико-механические свойства наряду с удобной физической формой эбеспечивают широкие возможности аппаратурно-технологического оформления биотехнологических процессов. Биокатализаторы в виде волокон и пленок, содержащих протеолитические ферменты, могут быть использованы для создания полимерных покрытий на рану, шовных нитей и иных хирургических средств, оказывающих лечебно-профилактическое действие.

Наиболее простым методом придания химическим волокнам специальных свойств, в том числе биологической активности, является формование химических волокон из композиций, включающих в качестве наполнителей соответствующие соединения. Метод получения волокнистых материалов, содержащих «мобилизованные ферменты, включенные в структуру волокна в процессе

формования, может рассматриваться как один из вариантов получения напох ненных волокон. Однако специфические свойства ферментов, такие как химичс екая природа белка, бифильность его макромолекулы, лабильность ферменто при экстремальных значениях температуры и рН и действии органических ра< творителей, растворимость ферментов в реакционной среде (водные растворь и высокие скорости превращения специфических субстратов требуют специал! ных подходов при разработке технологии получения волокон, содержащих ш мобилизованные ферменты. Эти обстоятельства, а также острая потребност отечественной медицины в эффективных хирургических средствах и ряда от раслей промышленности в продуктах, которые можно получить только путе: биокатализа, обусловливают необходимость разработки научных основ проце< сов иммобилизации в структуре волокон и пленок ферментов с разными физ* ко-химическими свойствами, различной специфичностью и эффективностью кг тализа.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось комплексное репи ние научных и технологических проблем создания высокоэффективных волоз нистых и пленочных биокатализаторов для биотехнологии и медицины с т пользованием белоксодержащих формовочных дисперсий и композиций. В св: зи с этим были поставлены следующие задачи:

- на основе анализа факторов, определяющих стабильность иммобилиз< ванного фермента и кинетику его десорбции из волокнистого биокатализатор осуществить обоснованный выбор метода модифицирования фермента;

- изучить структурно-механические свойства белоксодержащих дисперск на основе растворов триацетата целлюлозы в метиленхлориде;

- исследовать структуру волокнистых биокатализаторов и возможное] направленного регулирования ее параметров;

- изучить влияние диффузионных факторов на кинетику превращения сп цифических субстратов в гетерогенно-каталитических процессах с использов нием волокнистых биокатализаторов;

- изучить кинетику выделения нативных ферментов и их полиэлектроли ных комплексов из волокон и пленок в модельные среды;

- на основе проведенных исследований разработать волокнистые и пл ночные биокатализаторы и изучить возможность их использования в биотехн логических процессах и в медицине при создании новых хирургических средсп

Научная новизна работы заключается в реализации нового подхода к п лучению ферментсодержащих наполненных волокон и пленок, включающе модифицирование фермента непосредственно в формовочной дисперсии, об< печивающего получение материалов с заданными свойствами.

На основе комплексного изучения кинетики процессов, протекающих в оксодержащих дисперсных системах, и взаимосвязи физико-химических ха-теристик этих систем сформулированы научно обоснованные принципы точения ферментов в структуру химических волокон, что позволило полу-ъ высокоактивные и стабильные волокнистые и пленочные биокатализато-

В результате изучения особенностей макромолекулярных реакций в мно-омпонентных ферментсодержащих полимерных системах показана возмож-ггь необратимой фиксации ферментов в структуре волокон и пленок и увели-ия стабильности волокнистых биокатализаторов в условиях биотехнологи-ких процессов. Рассчитаны кинетические и термодинамические характери-ки реакции взаимодействия глутарового альдегида с р-галактозидазой и ановлена корреляция между степенью превращения аминогрупп и степенью 1ктивации фермента, что обеспечило возможность выбора основных пара-ров процесса модифицирования белка.

Выявлены особенности реологического поведения дисперсных систем на юве растворов триацетата целлюлозы в метиленхлориде, содержащих водные творы белка. Сформулированы представления об изменении прочности и тава межфазного адсорбционного слоя как основных факторах, наряду с 5емным содержанием дисперсной фазы, влияющих на реологические свойства :персных систем. Получено уравнение, отражающее взаимосвязь основных »актеристик дисперсий, используемых для получения волокнистых биоката-¡аторов.

Установлены закономерности формирования пористой структуры волок-в присутствии дисперсной фазы. Показана роль агрегации макромолекул тцетата целлюлозы на границе раздела фаз в образовании дополнительных пров структурообразования и ускорении распада системы на фазы. Опреде-[ы пути направленного регулирования структуры волокнистых биокатализа-)ов за счет изменения объемной доли дисперсной фазы, состава межфазного :орбционного слоя, скорости фазового распада и введения полимера-эообразователя.

На основании анализа кинетики ферментативных реакций с участием во-сон и пленок, содержащих иммобилизованные ферменты, полученных с ис-тьзованием разработанных методов, установлена количественная взаимо-:зь каталитических и диффузионных характеристик волокнистых биокатали-оров, позволяющая прогнозировать эффективность иммобилизации в струк->е волокна ферментов с различными каталитическими свойствами.

С учетом результатов изучения кинетики выделения нативных белков и и полиэлектролитных комплексов из волокон и пленок выявлены пути регулирс вания фармакодинамических и медико-биологических свойств ряда материало медицинского назначения.

Новизна предложенных решений подтверждена 15 авторскими свид< тельствами и патентами РФ.

Практическая значимость работы. Разработаны способы и научные оснс вы технологических процессов получения высокоактивных и стабильных в< локнистых биокатализаторов для биотехнологических процессов и волокни! тых и пленочных материалов для медицинского применения. Полученные р< зультаты были использованы при разработке технического задания и проект установки для выпуска волокнистых биокатализаторов различных типов. В сс ответствии с разработанным технологическим регламентом был осуществле выпуск укрупненных опытных партий биокатализаторов, содержащих модиф! цированные (3-галактозидазу и пенициллинамидазу, показатели которых соо' ветствовали требованиям технических условий.

Использование волокнистого биокатализатора, содержащего иммобил] зованную р-галактозидазу, в биотехнологическом процессе гидролиза лактоз в молочной сыворотке обеспечивает получение сахаристых веществ из нетрад] ционных источников сырья, утилизацию сыворотки, решение экологичесю проблем производства молочной продукции. Волокнистый биокатализатор, о держащий иммобилизованную пенициллинамидазу, может найти применен! при модернизации существующей технологии получения 6-амин пенициллановой кислоты за счет организации процесса гидролиза бензилпен циллина в аппаратах колонного типа.

Проведенные исследования позволили разработать ассортимент фермен содержащих хирургических средств, обладающих выраженным лечебн профилактическим действием: покрытия на рану, дренажи, шовные нити, и пользование которых в экспериментальной и клинической хирургии позволя сократить сроки лечения ран и ожогов и уменьшить расход дорогостоящ! ферментных препаратов.

Полимерное покрытие на рану "Терриплен", содержащее террилитин, д которого были проведены все необходимые предклинические исследования клинические испытания, был рекомендован Комитетом по новой медицине«1 технике МЗ РФ к производству и применению в качестве средства для лечен гнойных ран и ожогов.

Основные результаты работы внедрены на опытном заводе НПО Символокно", Охтинском НПО "Пластполимер", в учебном процессе (курсы )сновы биотехнологии", "Полимерные материалы в медицине и биотехноло-и") на кафедре технологии химических волокон МГТА.

На защиту выносятся:

а) научно-обоснованные принципы получения волокнистых и пленочных юкатализаторов из ферментсодержащих дисперсий, являющиеся основой соз-ния нового поколения высокоэффективных полимерных материалов для био-хнологии и медицины;

б) совокупность установленных закономерностей и обобщений, позво-ющая осуществить направленное регулирование свойств химических волокон пленок, полученных из формовочных композиций, содержащих биологически тивные белки;

в) разработанные методы модифицирования ферментов в процессе приго-1вления формовочных дисперсий.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докла-твались и обсуждались на Международных симпозиумах по химическим во-жнам (Калинин, 1981 и 1990 гг.), Международных симпозиумах по контроли-'емому выделению биологически активных веществ (Бостон, 1995 г. и Сток-льм, 1997 г.), Международных конференциях "Современные подходы к разра-)тке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных шлантантов" (Москва, 1992, 1995 и 1998 гг.), Международном хирургическом >ырессе (Тель-Авив, 1994 г.), Международной научно-технической конферен-ш "Актуальные проблемы химии и химической технологии" (Иваново, 1997 I, Корейско-Российском семинаре по химической технологии (Москва, 1997 г.), ;есоюзных симпозиумах по получению и применению иммобилизованных грментов (Ленинград, 1980 г., Киев, 1983 г., Кобулетти, 1985 г., Москва, 1991 , Суздаль, 1995 г.), Менделеевском съезде по общей и прикладной химии 'ашкент, 1989 г.), Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры меди-шского назначения" (Алма-Ата, 1983 г.), Всесоюзном симпозиуме по меди-шской энзимологии (Астрахань, 1979 г.), Всесоюзном симпозиуме "Методы шучения высокоочищенных ферментов" (Вильнюс, 1978 г.), Всесоюзных сове-аниях "Химия и технология производных целлюлозы" (Владимир, 1980 г., уздаль, 1990 г.). Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества [дробионтов - новые лекарственные препараты" (Владивосток, 1991 г.), Все-1Юзной конференции "Проблемы модификации природных и синтетических шокнообразующих полимеров" (Москва, 1991 г.), Межреспубликанской науч-)-технической конференции "Интенсификация процессов химической и пище-

вой технологии" (Ташкент, 1993 г.), Всероссийской конференции "Современнь достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1996 г.), Конгрессе химико текстильщиков и колористов (Иваново, 1996 г.), Симпозиуме по химии проте литических ферментов (Москва, 1997 г.), Всероссийской научно-техническс конференции "Современные технологии текстильной промышленносп (Москва, 1997 г.), Международной конференции "Биокатализ-98" (Пущин 1998 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 77 научных р бот, получено 15 авторских свидетельств СССР и патентов РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, восьь глав, выводов, списка литературы (286 наименований) и приложений, вюп чающих акты об испытаниях и другую научно-техническую документацию.

Во введении дана общая характеристика работы, обоснована актуал ность научного направления, поставлена цель исследования. Первая глава п священа рассмотрению состояния проблемы разработки волокон и пленок, с держащих иммобилизованные ферменты. Анализ перспектив использован] различных методов получения волокнистых и пленочных биокатализаторов п зволил сформулировать основные задачи исследования.

Во второй главе на основании изучения иммобилизации в структуре вол кон и пленок нативных и модифицированных ферментов показана возможное модифицирования фермента в формовочной дисперсии и обоснована целесоо разность выбора в качестве модифицирующего реагента глутарового альдегид В третьей главе представлены результаты исследования кинетики реакции вэ имодействия аминогрупп белка с глутаровым альдегидом и сопровождающих процессов структурирования и инактивации фермента. Данные, полученш при изучении реологических свойств белоксодержащих дисперсий на осно растворов триацетата целлюлозы в метиленхлориде на разных стадиях их пол чения, приведены в четвертой главе. Пятая глава посвящена обсуждению ро. белоксодержащей дисперсной фазы при формировании структуры волокнист го биокатализатора и возможностей направленного изменения ее параметров, шестой главе рассмотрены особенности кинетики реакций гидролиза специф ческих субстратов с использованием ферментов, включенных в структуру тр* цетатного волокна. Седьмая и восьмая главы посвящены разработке волокш тых биокатализаторов для биотехнологических процессов и волокнистых пленочных материалов с протеолитической активностью для хирургии.

Основной текст диссертации изложен на 276 страницах, включая 64 £ сунка и 58 таблиц.

Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон Москов-ой государственной текстильной академии в рамках совместных исследований кафедрой химической этимологии МГУ, Всероссийским научно-следовательским институтом полимерных волокон, Научно-следовательским институтом антибиотиков, Охтинским НПО 1ластполимер", Институтом элементоорганических соединений РАН, Мо-овской медицинской академией имени И.М.Сеченова, Научно-следовательским физико-химическим институтом имени А.Я.Карпова, Науч-»-исследовательским молочным институтом в соответствии с Координацион-ши планами АН СССР, Комплексной целевой программой ОЦ 015, Государ-венной научно-технической программой "Новейшие методы биоинженерии" i направлению "Инженерная энзимология", Межвузовской научной програм-т "Университеты России".

Автор выражает признательность научному консультанту профессору С.Гальбрайху и профессору А.Д.Вирнику за большую помощь и внимание, ;азанные при выполнении и оформлении диссертационной работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммобилизация нативных и модифицированных ферментов в структуре

волокон и пленок

Одним из важнейших вопросов в проблеме создания волокнистых биока-дизаторов (ВБК) формованием из эмульсий водного раствора фермента в не-1ешивающемся с водой органическом растворителе является вопрос о принци-1х управления процессом фиксации иммобилизуемого фермента в структуре >локна, от которой зависит возможность десорбции фермента из волокнистого зсителя. При этом в случае применения ВБК в биотехнологических процессах >лжна быть обеспечена возможность предотвращения десорбции - задача, для ;шения которой могут быть использованы методы химического модифициро-шия. В то же время в материалах медицинского назначения, напротив, де->рбция лекарственного вещества часто определяет эффективность лечебного :йствия. Поэтому с целью разработки волокнистых и пленочных биокатализа-)ров, предназначенных для использования как в биотехнологических процес-1х, так и в медицине, была изучена иммобилизация в структуре волокон и пле-эк нативных и модифицированных ферментов.

При изучении каталитических свойств волокон и пленок, содержащих ротеолитические ферменты трипсин и а-химотрипсин, полученных путем ормования из суспензии фермента или эмульсии его водного раствора в рас-

творе триацетата целлюлозы (ТАЦ) в метиленхлориде, а также из суспенз* фермента в растворе вторичного ацетата целлюлозы (ВАЦ) и фторопласта « (ФП) в ацетоне, обнаружено существенное (более 70%) снижение в результа-иммобилизации активности ферментов, определяемой по скорости гидроли: специфических субстратов, причиной которого может быть как инактиващ фермента под действием органического растворителя, так и влияние диффуз] онных факторов.

Полученные данные о зависимости активности трипсина и < химотрипсина, включенных в структуру пленок из ТАЦ, полученных из эмул сий на основе растворов ТАЦ в метиленхлориде разной концентрации, от вел; чины межфазной поверхности (рис.1), а также о количестве активных центров полученных препаратах (показывающие, что включенный в полимерные мат риалы а-химотрипсин сохраняет активность) свидетельствуют об определя! щем влиянии структуры полимерного материала, а следовательно и диффуз] онных факторов на каталитические свойства ферментов, включенных в стру туру полимерных волокон и пленок.

0 -1------

0 0,5 1 1,5 2

Б, м2/см3 раствора фермента

Установлено отсутствие необратимой фиксации в структуре волокон пленок из ТАЦ, ВАЦ и ФП нативных гидролаз, молекулярная масса которых превышает 100000: протеолитических ферментов, пенициллинамидазы, галактозидазы, протосубтилина, террилитина. В зависимости от структу! формовочной дисперсии и морфологии полимерного материала десорбция эт] ферментов может составлять от 13 до 60% активного белка.

50

Рис.1. Зависимость активности < химотрипсина (1 и 1') и трипсина и 2'), включенных в структуру пле; ки из ТАЦ, от поверхности конта та (Б) органической и водной фаз формовочной эмульсии. 1 и 2 - ] прядильного раствора отгоня1 часть метиленхлорида до концен рации ТАЦ в растворе 9%; Г и 2 прядильный раствор не упаривали

40

Анализ закономерностей изменения свойств нативных ферментов в ре-1ьтате включения в структуру волокон и пленок позволил определить в рам-к рассматриваемого метода иммобилизации возможности воздействия на ка-титическую активность и продолжительность эксплуатации иммобилизован-[х ферментов с учетом области их использования.

Невозможность применения ферментов, включенных в структуру волокна, сачестве гетерогенных биокатализаторов без дополнительной модификации свойств, создает необходимость при разработке методов модифицирования гивных ферментов одновременного решения двух задач: предотвращения де-эбции белка из волокна при его использовании в качестве гетерогенного био-гализатора и стабилизация фермента по отношению к инактивирующим воз-Гкггвиям. Показано, что модификация фермента ковалентным присоединени-к водорастворимым производным декстрана с дополнительной фиксацией иными связями путем синтеза продуктов взаимодействия производного кар-ксиметилдекстрана различной молекулярной массы и а-химотрипсина, и их точение в структуру пленок из ТАЦ путем формования из эмульсий позволя-повысить на два порядка термостабильность нативного а-химотрипсина. то установлено, что молекулярная масса модифицированного фермента, еспечивающая его необратимую фиксацию в структуре триацетатной пленки, лжна превышать 400000.

Предложен также метод повышения стабильности ферментов, основанный получении нерастворимых в воде стабильных производных протеолитиче-эго фермента, присоединенного к носителю координационными связями. Так, пример, иммобилизация протосубтилина, модифицированного присоедине-ем к сополимеру стирола и малеиновой кислоты в присутствии ионов Сг3+, в руктуре пленок из ТАЦ, ВАЦ и ФП формованием из суспензий нерастворимо в воде производного фермента в растворе пленкообразующего полимера ивела к десятикратному повышению устойчивости ферментсодержащего мплекса к действию аминокислот.

Предварительное модифицирование фермента обеспечивает получение окатализаторов с улучшенным комплексом свойств, однако создает необхо-мость введения дополнительных стадий технологического процесса. Прове-нный в ходе разработки методов, совмещающих приготовление формовочной мпозиции и химическое модифицирование фермента, анализ показал, что при шобилизации ферментов могут быть использованы химическая сшивка би-'нкциональными сшивающими реагентами, приводящая к образованию как дорастворимых, так и нерастворимых в воде продуктов в виде осадка или ге-

ля, включение в структуру геля, а также сочетание этих методов. Показана воз можность при использовании эмульсии водного раствора фермента в раствор ТАЦ в метиленхлориде модифицирования фермента непосредственно в формо вочной дисперсии путем введения в эмульсию водного раствора модифици рующего реагента (бифункционального соединения, мономера, компоненте инициирующей системы и др.).

Необходимыми условиями межмолекулярной сшивки как фактора, опре деляющего эффективность иммобилизации, при использовании для модифици рования фермента бифункционального сшивающего реагента являются высоки концентрации белка и низкая степень протонирования аминогрупп. В то ж время в этих условиях происходит быстрое снижение активности протеолитиче ских ферментов в результате автолиза, что не позволяет использовать этот под ход для иммобилизации протеолитических ферментов. Для модифицировани протеаз в процессе иммобилизации значительно более рациональным оказалос включение в структуру геля (полиакриламидного или кальций-альгинатнопУ Для других типов ферментов высокий эффект стабилизации за счет образовани внутри- и межмолекулярных ковалентных связей при использовании концет рированных (свыше 100 мг/см3) растворов белка и потеря ферментом раствори мости в воде в результате образования гелеподобной сшитой структуры обус ловили целесообразность модифицирования ферментов в формовочной диспер сии путем сшивки бифункциональным сшивающим реагентом - глутаровьи альдегидом (ГА).

Таким образом, проведенные исследования показали, что при выборе ме тода модификации, осуществляемого в процессе получения формовочной кол-позиции, следует учитывать специфичность фермента, используемого для полз чения гетерогенного биокатализатора.

Изучение процесса модифицирования фермента глутаровым альдегидом

Очевидно, что эксплуатационные свойства ВБК, его активность и прс должительность использования зависят от эффективности модифицировани фермента, происходящего в каплях дисперсной фазы при добавлении раствор ГА к эмульсии раствора фермента в растворе ТАЦ в метиленхлориде. С целы оценки влияния на инактивацию фермента и структурирование в системе бело — сшивающий реагент в процессе модифицирования фермента была изучен кинетика реакции взаимодействия (З-галактозидазы с ГА. В табл.1 суммирован: данные, иллюстрирующие влияние условий модифицирования р-галактозидаз ГА на константу скорости реакции и взаимосвязь параметров процесса мод! фицирования и инактивации фермента.

Таблица 1

Зависимость параметров реакции модифицирования р-галактозидазы ГА и инактивации фермента от условий проведения процесса*

№ пы- та Темпе рату-ра °С рН Константа скорости модифицирования фермента ГА, л-моль"1 хмин"1 Остаточное количество свободных аминогрупп, % от исходНОГО Остаточная активность, % от исходной Значение коэффици ента К в уравнении (1)

1 20 5.25 1.19 46 85 0.26

2 20 5.85 1.68 40 78 0.39

3 20 6.30 2.52 33 74 0.39

4 30 5.25 2.49 47 84 0.30

5 30 5.85 2.56 40 78 0.23

6 30 6.30 5.84 32 74 0.31

7 40 5.25 2.73 48 86 0.32

8 40 5.85 3.69 40 78 0.30

'Соотношение ГА:белок 1 ммоль/г белка.

Согласно полученным данным, на константу скорости реакции модифи-1рования р-галактозидазы и остаточное количество свободных аминогрупп грмента существенное влияние, обусловленное изменением доли аминогрупп ермента, находящихся в непротонированном состоянии, оказывает изменение Я среды. Закономерное увеличение константы скорости процесса наблюдалось 1кже при увеличении температуры реакции и соотношения ГА:белок.

Процесс модифицирования р-галактозидазы сопровождается снижением ерментативной активности из-за взаимодействия с ГА аминогрупп вблизи ак-1вного центра, и изменения нативной конформации макромолекул фермента, ыло показано, что при взаимодействии с ГА степень инактивации р-шактозидазы меньше степени превращения аминогрупп белка. Количественно ¡аимосвязь активности модифицированного фермента и степени превращения чиногрупп можно представить уравнением:

А, = А0 - АоКБ, = А0(1-К Бх) (1)

;е Ах - активность фермента в момент времени т, Е/мл; А0 - активность фермен-1 в начальный момент времени т=0, равная активности исходного немодифи-

цированного фермента, Е/мл; Бт - степень модифицирования аминогрупп фе^ мента в момент времени т, определяемая по уравнению: [-ИНг]0 - р^н2г 8т= - (2)

где [-К;1Ь]° , [ЫН:]1 - концентрация аминогрупп белка в начальный момент вр< мени и в момент времени т, моль/л.

Рассчитано значение эмпирического коэффициента (Кср « 0.3), характер! зующего относительную активность модифицированного фермента (табл.1).

Потеря ферментом растворимости в воде в результате реакции с ГА, нео£ ходимая для предотвращения его десорбции из ВБК, является следствием обрг зования межмолекулярных связей, которое сопровождается структурирование системы, приобретающей вязкоупругие свойства.

Установлено, что концентрация аминогрупп в системе, зависящая от ко! центрации белка в растворе, существенно влияет как на скорость структурирс вания раствора, так и на преимущественное протекание процессов внутри- ил межмолекулярной "сшивки". При низком содержании белка в растворе (<1С мг/см3) протекает преимущественно процесс образования внутримолекулярнь: связей, вязкость системы во времени возрастает незначительно, предельное н; пряжение сдвига равно нулю. Избыток сшивающего реагента приводит к во растанию скорости реакции модифицирования и, следовательно, к быстрое уменьшению концентрации аминогрупп, необходимых для последующей сши] ки, в результате чего снижается число межмолекулярных связей в системе и ре кое падение величины предельного напряжения сдвига. Уменьшение степеи протонирования аминогрупп белка с ростом рН реакционной среды спосо! ствует закономерному увеличению как скорости структурирования в систем так и прочности образующегося геля. Однако буферные свойства белков, я ляющихся полиамфолитами, не позволяют в области используемых высок! концентраций получать растворы р-галактозидазы с рН>6 без потери акта ности фермента.

Реализация количественного подхода к процессу модифицирования бел] ГА и установленные закономерности структурообразования в системе ГА-бел< позволили обоснованно подойти к выбору основных параметров процесса м дифицирования р-галактозидазы с помощью ГА при оптимизации технология ского процесса получения ВБК.

Реологические свойства формовочных дисперсий для получения волокнистых и пленочных биокатализаторов

Основной предпосылкой протекания реакции между аминогруппами бел-i и глутаровым альдегидом является коалесценция капель ГА и фермента, воз-эжность которой определяется составом композиции и реологическими юйствами дисперсии.

Формовочные композиции для получения ВБК представляют собой смеси ;рмодинамически несовместимых несмешивающихся жидкостей, которые обдуют многокомпонентные дисперсные системы. Изменение реологических ¡ойств системы при переходе от раствора ТАЦ в метиленхлориде к дисперсиям i его основе свидетельствует о заметных структурных изменениях, обуслов-:нных введением частиц водной фазы. Значения начальной вязкости водных ютерсий более, чем в 2 раза превышают значение этого параметра для 7%-зго раствора ТАЦ, а область наибольшей ньютоновской вязкости смещается в орону меньших значений скорости сдвига. Увеличение значений начальной [зкости при введении водной фазы обусловлено образованием в системе коа-шяционных контактов взаимодействующих частиц и проявляется более от-ггливо для дисперсий, содержащих белок в водной фазе, что свидетельствует 5 образовании на границе раздела фаз адсорбционного слоя, в состав которого ;одят макромолекулы белка.

Изучение кинетики формирования межфазного адсорбционного слоя _) на границе раздела фаз модельной системы водный раствор альбумина/1 яый раствор ТАЦ в метиленхлориде показало, что увеличение концентрат белка в водной фазе приводит к снижению прочности MAC. Отмеченная 1висш' >сть связана с тем, что в более концентрированных растворах альбуми-1 на межфазной поверхности адсорбируются ассоциаты макромолекул белка, Зразующие менее совершенную структуру MAC. Предложен механизм, пред-;матривающий включение молекул метиленхлорида в более "дефектный" [АС и повышение локальной концентрации ТАЦ в метиленхлориде вблизи ежфазной поверхности частиц водной фазы формовочной композиции. Эти зления мог ут быть одной из причин увеличения вязкости формовочных дис-:рсий при повышении концентрации белка в дисперсной фазе. Увеличение элщины MAC приводит к увеличению эффективного размера частиц дисперс-эй фазы и вследствие этого ее объемной доли и вязкости системы.

Объемная доля дисперсной фазы является одним из основных факторов, пределяющих реологическое поведение дисперсий. Поскольку ферментные репараты обладают разной удельной активностью, объем дисперсной фазы в

растворе ТАЦ в метиленхлориде не является постоянным и может изменяться в зависимости от типа и партии фермента.

Было установлено изменение структуры белоксодержащей дисперсии при увеличении количества вводимого раствора белка свыше 2 см3/г ТАЦ (рис.2). Перегиб на кривой изменения вязкости и максимум на кривой изменения теплоты активации вязкого течения соответствуют области перехода от дисперсии, характеризующийся наличием единичных контактов между частицами, к системе агрегатов частиц.

При диспергировании ГА в эмульсии с высоким объемным содержанием раствора фермента и соответственно с высокой вязкостью более вероятным является образование отдельных капель модификатора, чем коалесценции его с каплями раствора фермента. В результате не достигается степень модифицирования белка, обеспечивающая комплекс заданных свойств.

На основании изучения зависимости относительной вязкости формовочных дисперсий, полученных диспергированием раствора ß-галактозидазы i растворах ТАЦ в метиленхлориде различной концентрации и аппроксимации экспериментальных зависимостей пс уравнению Муни (3): кв <рг

1п(л/Пш) =--(3)

1 - cpr Vfr

Содержание водной фазы, см3/г ТАЦ

Рис.2. Зависимость теплоты активации вязкого течения (1) и вязкости (2) дисперсных систем на основе 7%-ного раствора ТАЦ в метиленхлориде от содержания в них водной фазы (раствора пе-нициллинамидазы 100

мг/см3)

где г) и г)т - вязкости дисперсии и дисперсионной среды; срг - объемная доля дис персной фазы; Уц- - коэффициент, характеризующий фракционный объем непре рывной фазы, связанный с каплями, - было получено уравнение, отражающе« взаимосвязь основных характеристик дисперсий, используемых для полученю высокоэффективного волокна-биокатализатора, содержащего иммобилизован ный фермент - объемной доли дисперсной фазы (раствора фермента), вязкосп дисперсионной среды (раствора ТАЦ в метиленхлориде) и вязкости дисперсии 1 целом:

(2.5 пт + 0.81)срг

П = г)га • ехр --(4)

1-(0.75лт + 1.42) фг С помощью уравнения (4), а также математической обработки способом гелинейной множественной регрессии экспериментальных данных, полученных фи исследовании зависимости константы инактивации фермента от вязкости щсперсии и соотношения ГА:белок, определены параметры технологического фоцесса приготовления формовочной дисперсии, обеспечивающие возмож-юсть коалесценции капель фермента и глутарового альдегида, необходимую ггепень модифицирования фермента и вследствие этого высокие эксплуатаци->нные характеристики ВБК.

Установлено, что химическое модифицирование фермента в водной фазе формовочной композиции приводит к дополнительному увеличению вязкости и вменению характера кривых течения по сравнению с системами, содержащими ^модифицированный белок.

Основной причиной обнаруженного увеличения вязкости при переходе от шульсий к дисперсиям модифицированного фермента является снижение деформируемости капель. В эмульсиях, содержащих поверхностно-активные ве-цества, подавляющие внутреннюю циркуляцию жидкости, капли при течении тодвергаются деформированию и ориентируются в направлении течения. Уве-шчение упругости капли снижает ее деформацию и увеличивает сопротивление зозникающим напряжениям. Кроме того , вязкоупругие свойства капли, содержащей модифицированный фермент, препятствуют коалесценции частиц дис-7ерсной фазы, что приводит к дополнительной стабилизации дисперсии.

Закономерности формирования структуры волокнистых биокатализаторов Решение задачи стабилизации фермента и предотвращения его десорбции ¡13 ВБК создало предпосылки для решения задачи увеличения проницаемости волокна для молекул субстрата.

Были изучены закономерности структурообразования в дисперсных системах на основе растворов ТАЦ в метиленхлориде, содержащих водные растворы белка, способного к упорядоченной ориентации на границе раздела фаз. При этом для обеспечения фазовой проницаемости был выбран не традиционный для получения триацетатного волокна — сухой, а мокрый метод формования в осадительные ванны, содержащие органический растворитель.

Было показано, что независимо от осаждающей способности осадитедя введение ферментсодержащей дисперсной фазы приводит к снижению количества осадителя, вызывающего застудневание системы. Сравнение зависимо-

стей вязкости дисперсий от концентрации раствора ТАЦ в метиленхлориде по казывает, что в присутствии наполнителя процессы структурообразования на чинаются при меньшей концентрации раствора (рис.2). Эти факты, а также ана лиз кинетики образования межфазных слоев на границе раздела метиленхлори, — раствор белка, который обнаружил существенные отличия в процессе обра зования MAC по сравнению с системой, содержащей ТАЦ (рис.3), свидетель ствуют, что в результате ассоциации макромолекул ТАЦ вблизи межфазно: границы частицы дисперсной фазы могут служить при формовании волокн дополнительными центрами структурообразования.

6 8 10 [ТАЦ], %

Рис.3. Зависимость вязкости раствора Рис.4. ТАЦ в метиленхлориде (1) и дисперсии на его основе (2), содержащей раствор пеницилли-намидазы (100 мг/см3, ср=0,3) от концентрации раствора ТАЦ в метиленхлориде

о 1

о 2

Зависимость предельного н; пряжения сдвига от времен контактирования фаз для а стем: раствор альбумина (1С мг/см3) - 7% раствор ТАЦ в м( тиленхлориде (1); раствор аш бумина - метиленхлорид (2)

Установленные закономерности структурообразования в белоксодерж; щей дисперсии существенным образом влияют на структуру ВБК. Исследован! пористой структуры ВБК методами ртутной порометрии, низкотемпературно сорбции криптона, тепловой десорбции азота, а также растровой электронно микроскопии и ядерного магнитного резонанса с импульсным градиентом ма нитного поля показали, что в результате формования по мокрому способ триацетатных волокон, содержащих иммобилизованные белки, образует* структура, характеризующаяся переходными и макропорами. При введен* дисперсной фазы увеличиваются как \У0, так и Буд, определенные различные методами, а также средние значения коэффициента самодиффузии молекул в<

[ы (КСД) (табл.2); при этом, как свидетельствуют данные распределения пор по >адиусам, увеличение пористости ВБК происходит за счет пор г<1 мкм. Пока-ано, таким образом, что изменение параметров пористой структуры ВБК шределяется адсорбционными взаимодействиями на границе раздела фаз фор-яовочной дисперсии и скоростью распада системы на фазы, а не является след-ггвием наличия в волокне крупных замкнутых пор (свыше 5 мкм), образованных раствором фермента.

Таблица 2

Характеристики пористой структуры триацетатного волокна и ВБК, содержащего иммобилизованную р-галактозидазу, сформованных в перхлор-

этилен

Тип волокна (pf Суммарный объем пор Wo, мм3/г Удельная поверхность Sv.-I, м2/г КСД-109 м2-с-«

по методу ртутной поро-метрии по сорбции криптона поде-сорбции азота по сорбции криптона

Триацетатное волокно 0.3 83 0.2 0.3 0.3 1.74

ВБК 0.3 138 0.6 0.8 0.6 2.24

Формование волокна из дисперсий создает возможности регулирования структуры полимерного материала за счет введения дополнительных компонентов формовочных композиций, влияющих на процесс фазового распада, или юрообразователей. Для повышения проницаемости ферментсодержащих воло-сон и пленок были разработаны методы, основанные на использовании смененных растворителей, а также введении в дисперсию полиэтиленгликоля ПЭГ), удаление которого из ВБК в процессе промывки водой приводит к обра-юванию в структуре волокна дополнительных пор. В результате наряду с ожигаемым увеличением выявляемой активности фермента за счет повышения гранспортных характеристик волокна обеспечено увеличение удельной актив-юсти ВБК.

Изучение реологических свойств дисперсных систем на основе растворов ГАЦ в метиленхлориде, содержащих ПЭГ, позволило выявить роль MAC как карьера, препятствующего перераспределению ПЭГ между фазами эмульсии. 1оказано резкое (в 20 раз) увеличение прочности MAC при введении ПЭГ в состав ферментсодержащей дисперсной фазы. Выдвинуто предположение о ми-

целлообразовании на межфазной границе как причине возрастания прочност связей между элементами структуры слоя.

Результаты исследований, изложенные в настоящей главе, показываю: что варьирование состава формовочных дисперсий даже при неизменном состг ве осадительной ванны позволяет за счет изменения прочности МАС, скорост фазового распада или удаления из готового волокна полимерс порообразователя улучшить показатели пористой структуры волокна, отве! ственные за скорость массопереноса субстрата к активным центрам фермента.

Особенности кинетики гетерогенного биокатализа с использованием ферментов, включенных в структуру волокна

Общая скорость процесса в гетерогенном катализе, осуществляемом ил мобилизованным ферментом, определяется соотношением скоростей двух прс цессов, протекающих внутри полимерного материала: скорости ферменте тивной реакции (5) и скорости диффузии субстрата к месту локализации фе{ мента (6):

Ушах ' [Зо] ккат ' [Ео] •Ро]

уф= - =--(5)

Км + [Бо] Км + [Бо]

где Ушах - максимальная скорость ферментативной реакции; ккат - каталитич< екая константа; Км - константа Михаэлиса; [Е0] и [Бо] - концентрация фермент и субстрата соответственно.

Уд„ф = кдиф ([Бо] - [Бв]) (6)

где кдиф - константа скорости диффузии субстрата в структуре волокна; [Б0] и [Б - концентрация субстрата во внешнем растворе и внутри волокна.

Если скорость диффузии не обеспечивает внутри волокна концентрацш субстрата [5в]»Км, то скорость ферментативной реакции Уф < Умах - макс? мальной скорости реакции. Фермент, расположенный в области волокна, обе; ненной субстратом, будет проявлять низкую активность.

С целью определения путей и способов снижения лимитирующего влияш массопереноса на кинетику гетерогенного биокатализа с участием ВБК был изучено влияние факторов, определяющих соотношение скоростей фермент; тивной реакции и диффузии субстрата внутрь полимерного материала, на кат; литические свойства различных ферментов, иммобилизованных в структур триацетатных волокон и пленок.

Показано, что при включении в структуру волокна ферментов с высоким удельной активностью и значениями к.кат диффузионные затруднения оказывак существенное влияние на скорость ферментативного процесса, о чем свидетел

вуют низкие значения относительной активности препаратов нативных про-аз трипсина (ккаг = 36 с-1) и ос-химотрипсина (ккат=175 с-1), при иммобилизации структуре ТАЦ волокна. Замена субстратов на медленно реагирующие <ат=3.0) в несколько раз увеличивает эффективность использования фермента. ;лючение в структуру полимерного материала препаратов с низкой концент-цией активного фермента снижает влияние диффузионных факторов за счет [еньшения Уф. ВБК, содержащий 200-350 мг технического препарата Р-лактозидазы на 1 г волокна проявляет свыше 60% активности. Хотя наиболее |Остым путем уменьшения роли массопереноса в гетерогенном биокатализе ляется снижение содержания активного фермента в полимерном материале, неприемлем для практического использования, так как для обеспечения вы-кой эффективности биокаталитического процесса необходимы биокатализа-ры, обладающие значительной удельной активностью. При включении фер-^тов в состав волокон и пленок в процессе их формования эта задача может 1ть решена путем направленного изменения структуры полимерного материа-

Скорость диффузии вещества через волокно или пленку зависит от соот->шения размеров пор и молекул диффундирующего вещества, объема соб-венно полимера и объема, занимаемого порами, и их формы. Определение ко-|фициентов диффузии субстрата в структуре полимерных материалов позво-:ло установить неожиданный факт: наибольшее значение Е)эф соответствует руктуре волокна с наибольшей долей пор максимального радиуса, а не с наи-дьшими значениями Буд и \VcyM, как это можно было ожидать. По-видимому, в нном случае крупные поры играют роль не только транспортных каналов, но средства, утончающего волокно, и тем самым способствующего увеличению орости массопереноса. Установлено, что для снижения влияния диффузион-тх факторов на скорость ферментативной реакции необходимо получать во-|Кно в условиях, обеспечивающих формирование, главным образом, крупных >р при сохранении суммарного объема пор на уровне 200 мм3/г волокна. Это-г требованию отвечает процесс формования в перхлорэтилен из дисперсий, держащих ПЭГ в дисперсионной среде. Полученные в таких условиях ВБК 1еют не только максимальный Ээф по субстрату и наибольшее значение КСД, > и наименьшее значение модуля Тиле А, (7), характеризующего степень влия-[я диффузионных факторов на кинетику ферментативной реакции в гетеро-нном катализе:

где Я - радиус частицы иммобилизованного фермента; Б - коэффициент диффузии субстрата.

Метод включения ферментов в структуру волокон или пленок в процессе их формования является универсальным, пригодным для иммобилизации различных ферментов, которые обладают каталитическими характеристиками, отличающимися на 1-2 порядка, и разной удельной активностью. В каждом конкретном случае должны быть подобраны максимально возможные концентрации фермента в волокне, при которых влияние диффузионных факторов не приводит к существенному снижению эффективности процесса.

Выявленные зависимости расчетных значений модуля Тиле от структуры ВБК и каталитических свойств ферментов, включенных в волокна и пленки, позволили установить количественную взаимосвязь каталитических характеристик фермента, диффузионных показателей волокна и эффективности иммобилизации.

Учитывая, что л,<1 является условием отсутствия влияния диффузионных факторов на кинетику ферментативной реакции, выражение для определения максимальной объемной концентрации фермента в ВБК диаметром 2К имеет вид (В):

ВБК, содержащие рассчитанные по этому уравнению количества иммобилизованного фермента (табл.3), обладают высокой относительной активностью Показано, что абсолютные значения активности полученных ВБК, содержащие иммобилизованные ферменты пенициллинамидазу и р-галактозидазу, обеспе чивают высокую эффективность биокаталитических процессов гидролиза бен зилпенициллина и лактозы.

Км • 0>ф [Ео]в= _

(8)

ккат • Я2

Таблица 3

несчитанные значения максимальной концентрации ферментов в волокне, при которой диффузионные затруднения не влияют на кинетику ферментативной

реакции

Фермент Удельная активность фермента, мкмоль субстра-та/минхмг фермента ккаг, с*! Км-10J М Расчетные значения при условии А.<1 Относительная активность (экспе-римен-таль-ное значение), %

концентрация фермента в волокне, активность, мкмоль мин X хг ТАЦ

[Е]в, М мг г ТАЦ

-химо-эипсин 378 175 0.49 4.9-10« 0.24 91 82

эипсин 69 36 0.70 3.410- 1.66 114 78

пени-цил-лин-1мида-за 8 7.7 4.5 8.7-10-- 428 856 71

Р-га- такто- ¡идаза 2 * 9.0 1.0-10-3 50 384 70

* Для определения максимальной концентрации Р-галактозидазы в ВБК

СПОЛЬЗОВаНЫ Значения Умах.

* * *

Установленные закономерности процесса модифицирования ферментов в астворе и в формовочной дисперсии, оптимизация условий формирования груктуры ВБК и анализ особенностей гетерогенного катализа ферментативных еакций с использованием ВБК позволили автору, а впоследствии и другим ис-тедователям, используя общие подходы к иммобилизации ферментов в струк-уре волокон из ТАЦ, разработать ВБК, содержащие различные типы гидроли-ических ферментов: пенициллинамидазу, р-галактозидазу, уреазу, аминоаци-азу, трипсин, а-химотрипсин, протосубтилин и др.

Свойства ВБК, содержащих модифицированные ферменты, полученные е оптимальных условиях, приведены в табл.4.

Таблица 4

Характеристика ВБК, содержащих различные ферменты

Иммобилизованный фермент Биокаталитический процесс Активность, мкмоль/г-мин Эффективность имобилиза-ции, % Увеличение стабильности по отношению к нативно му ферменту

Пенициллин-амидаза получение 6-аминопени-циллановой кислоты 550 (бензилпени-циллин, рН 7.5, 40°С) 60 в 8-10 раз

Р-галакто-зидаза получение глюкозо-галактозных сиропов 400 (лактоза, рН 4.0, 30°С) 70 в 2-3 раза

трипсин гидролиз казеина 350 (N-бензо-ил-Ь-арги-нин-метило-вый эфир, рН=7.5, 20°С) 25 в 10 раз

протосубти-лин гидролиз пептидов 90 (N-ацетил-L-тирозин-этиловый эфир, рН=7.0, 20°С) 25 в 15 раз

аминоацила-за получение оптически активных а-аминокислот 500 (N-аце-тил-Ь-фенил- глицин, рН=7.0, 43°С) 90 в 6 раз

уреаза гидролиз мочевины в биологических жидкостях 450 (мочевина, рН=7.0, 20°С) 65 в 2-3 раза

Полученные нами результаты, а также совместные исследования с НП< "Химволокно" (ныне ВНИИПВ) по разработке технологии получения ВБ легли в основу проектирования пилотной установки, предназначенной для вь пуска ВБК различных типов. На установке производительностью 250 кг ВБК

гонтированной в цехе № 5 Экспериментального завода НПО "Химволокно", >иш проверены основные технологические параметры процесса получения БК, содержащих иммобилизованные ферменты Р-галактозидазу и пеницилли-шидазу.

Сравнение показателей опытных партий ВБК, содержащих иммобилизо-шные пенициллинамидазу и р-галактозидазу, с результатами экспериментов, ^служивших основой для выбора параметров технологического процесса, попало хорошую воспроизводимость процесса в опытно-промышленных усло-1ях.

Изучение эффективности использования волокнистых биокатализаторов в биотехнологических процессах

С целью определения условий эксплуатации ВБК, а также изучения влия-■1я иммобилизации на физико-химические свойства ферментов были изучены [висимости активности ВБК, содержащих пенициллинамидазу и р-тактозидазу, от температуры и рН реакционной среды. Рассчитанные значе-ия констант ионизации комплекса Михаэлиса к1 и кг -к, кг

[ЕН28]+ +[ЕШ]- + [ЕБ]- + 2Н+ ,

ЕН25]+ и [Е8]- - "ионные" формы комплекса Михаэлиса; +[ЕШ]- - электроней-эальная форма комплекса Михаэлиса - различаются для иммобилизованной енишшлинамидазы на пять порядков, что свидетельствует о более широкой элпсти максимальной стабильности комплекса и соответствует расширению Н-области максимальной активности по сравнению с нативным ферментом, к1 кз которого различаются всего на 3 порядка. Было показано, что различия в изико-химических свойствах являются следствием влияния внутридиффузисн-ых факторов, препятствующих массопереносу субстрата и продуктов реакции.

Установленная зависимость, аппроксимирующая совместное влияние тем-ературы и рН на активность р-галактозидазы, включенной в структуру волока из ТАЦ, позволила определить оптимальные условия процесса гидролиза актозы. Показано соответствие расчетных значений активности биокатализа-эра с экспериментальными данными, полученными как в непроточной ячейке, ак и в кинетических экспериментах в насадочном реакторе.

Изучено влияние способов организации биотехнологического процесса с спользованием ВБК на эффективность и длительность его использования. По-азано, что фильтрация раствора субстрата через неподвижный слой волокна вляется наиболее эффективным способом взаимодействия субстрата с биоката-изатором.

При сравнительном изучении гидролиза лактозы в модельных растворах и молочной сыворотке в различных реакторах по непрерывной и периодической схемам показано, что при непрерывном процессе гидролиза высокая конверсия субстрата (в отсутствие рециркуляции) может быть достигнута лишь при низкор скорости потока и вследствие внешнедиффузионных ограничений это приводит к низкой удельной производительности (рис.5). Сравнение периодического у. непрерывного процессов в реакторе с интенсивной рециркуляцией субстрата показало, что удельная производительность при непрерывном процессе суще> ственно ниже, чем при периодическом (рис.5), что объясняется особенностями кинетики процесса, движущая сила которого определяется равновесной кон центрацией комплекса Михаэлиса, возрастающей с увеличением концентрации лактозы и уменьшающейся с ростом концентрации продуктов реакции. Прг конверсии 75-80% удельная производительность при периодическом процессе i два и более раза выше, чем при непрерывном, что позволило рекомендовать егс для практической реализации.

0,4 0,8 1,2 1,6

Скорость раствора субстрата, см/с

Рис.5. Удельная производительносп различных процессов гидролиз; лактозы в ультрафильтрате сы воротки; 1 - периодический про цесс в реакторном узле с интен сивной рециркуляцией субстрата 2 - непрерывный процесс в реак торном узле с интенсивной ре циркуляцией субстрата; 3 - не прерывный процесс гидролиз; лактозы за один проход субстра та; <2ша> - уровень производи тельности для реактора с пере мешиванием.

Полученные данные были использованы при разработке математически моделей процессов гидролиза лактозы и бензилпенициллина с помощью ВБК содержащих р-галактозидазу и пенициллинамидазу, и оптимизации услови получения глюкозо-галактозных сиропов и 6-аминопенициллановой кислоты.

Эффективность применения ВБК, содержащих иммобилизованные фер менты, была показана в биотехнологических процессах получения аминокисло для парентерального питания, глюкозо-галактозных сиропов, ( аминопенициллановой кислоты в лабораторных и опьгтно-промышленны

гловиях в ИНЭОС АН СССР, ВНИИА, на Саранском заводе медпрепаратов, кспериментальном заводе ВНИМИ и Московском молочном комбинате.

Разработка волокнистых и пленочных биокатализаторов медицинского

назначения

Использование белоксодержащих формовочных композиций для получе-ия волокнистых и пленочных материалов медицинского назначения имеет наяду с общими закономерностями получения ВБК свои особенности, связанные необходимостью регулирования скорости выделения лекарственного вещест-а. В настоящей главе рассмотрены возможности метода включения ферментов структуру волокон и пленок для создания хирургических средств с некролити-еским или иным биологическим действием.

При разработке материалов, предназначенных для пролонгированной эн-шотерапии, решалась проблема поиска путей регулирования скорости диффу-яи лекарственного вещества, определяющей фармакодинамические свойства 1ерментсодержащего хирургического средства.

Было показано, что независимо от метода введения фермента в структуру олимерного материала наибольший эффект пролонгирования достигается при юрмовании волокна или пленки в условиях, обеспечивающих формирование аиболее плотной структуры. Так, пластификационное вытягивание волокна 1Торлон, содержащего трипсин, приводит к замедлению скорости диффузии юрмента в водные среды, пропорциональному степени вытягивания. Анало-ичный эффект был достигнут при увеличении концентрации пленкообразую-iei о полимера или повышении температуры формования пленок из поливини-ового спирта, приводящих к уменьшению степени набухания ферментсодер-сащих материалов.

Еще более эффективное замедление диффузионных процессов было до-гигнуто в результате связывания основного панкреатического ингибитора ротеаз в поликомплексы с водорастворимыми полиэлектролитами (рис.6, 7). ¡ведение в состав полимерных композиций водорастворимых полимеров, не пособных образовывать полиэлектролитные комплексы с макромолекулами елка, напротив, способствовало увеличению in vitro скорости выделения инги-итора (рис.6, 7).

Включение в структуру полимерных пленок и волокон, как правило, при-одило к стабилизации фермента к у-облучению, что позволило использовать тот метод для стерилизации разработанных материалов.

На основании проведенных исследований разработаны способы получе-:ия волокон и пленок с протеолитической активностью формованием из суспен-ий протеаз или эмульсий их водных растворов в растворах волокно- и пленко-

образующих полимеров (ТАЦ, ВАЦ, ФГТ, полилактонов), а также совместного раствора фермента и водорастворимого полимера (поливинилового спирта, хи тозана, карбоксиметилцеллюлозы).

Волокнистые и пленочные биокатализаторы, содержащие иммобилизо ванные протеазы, оптимизированные по фармакодинамическим свойствам, бы ли проверены в условиях эксперимента на животных и гистологических иссле дованиях: ферментсодержащие водорастворимые пленки из поливинилового спирта и карбоксиметилцеллюлозы - в качестве полимерных покрытий на рану пленки из фторопласта и ацетатов целлюлозы, содержащие протеазы - в ка честве дренажей, волокно фторлон с протеолитической активностью - в ка честве хирургического шовного материала. Испытания, проведенные в 1-ол Московском медицинском институте имени И.М.Сеченова (ныне Московска: медицинская академия), показали, что вследствие пролонгированного некроли тического действия, высокой дренирующей способности разработанные дрена жи и покрытия на рану сокращают

ь

я ю га и, зз

200 150 100 50

10 30 50 70 90 110 Объем, см

Рис.6. Гель-хроматография на Сефа-дексе в-бС^ (V КОЛ — 1.5x29 см3) 1 - основного панкреатического ингибитора протеаз, и формовочных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих: 2 - 0.5% ингибитора, 3 - 0.5% ингибитора и 1% поли-винилпирролидона, 4 - 0.5% ингибитора и 1% альгината натрия

10 20 30 40 50

ча

Рис.7. Кинетика выделения основног панкреатического ингибитора протеа из пленок, полученных из формово1 ных композиций на основе поливиш лового спирта. (Номера кривых соот ветствуют номерам формовочных кол позиций на рис.6)

эоки очищения ран от гнойно-некротических масс в 2-5 раз и в 6 раз умень-гают расход фермента по сравнению с лечением препаратами нативных протез. При применении для ушивания экспериментальных ран у животных хирур-яческих нитей из фторлона, содержащего трипсин, вместо традиционных шов-ых материалов улучшается течение раневого процесса, снижается количество агноившихся ран, сокращаются сроки лечения.

Материал Терриплен (пленка из поливинилового спирта, содержащая гррилитин) успешно прошел весь комплекс доклинических и клинических ис-ытаний и был рекомендован Комитетом по новой медицинской технике Мин-драва РФ к постановке на промышленное производство и применению в меди-инской практике.

Развитие методов выделения и синтеза перспективных полимеров позво-ит использовать выявленные возможности метода включения ферментов в груктуру волокон и пленок для создания медицинских средств, таких как био-еградируемые in vivo материалы широкого медицинского назначения на основе актонов или материалы с комплексным биологическим действием и высокой эрбционной способностью на основе хитозана.

ВЫВОДЫ

На основании результатов комплексного исследования процесса модифи-ирования ферментов в водном растворе и в формовочной дисперсии, данных зучения реологических свойств белоксодержащих дисперсий на основе раство-ое ТАЦ в метиленхлориде, установленных закономерностей формирования груктуры триацетатного волокна в присутствии белоксодержащей дисперсной 1азы и выявленных особенностей кинетики гетерогенного биокатализа с чс-ользованием ВБК разработаны научные основы технологии получения волок-истых и пленочных биокатализаторов из белоксодержащих дисперсий.

1. Предложен и реализован принципиально новый подход к решению за-,ачи получения волокнистых и пленочных биокатализаторов, основанный на юдифицировании ферментов в процессе включения в структуру полимерного штериала, обеспечивающий придание им комплекса свойств для эффективного спользования в качестве гетерогенных биокатализаторов или изделий меди-;инского назначения.

2. Установлена взаимосвязь основных параметров процессов, проте-ающих при модифицировании фермента глутаровым альдегидом взаимодействия белка с глутаровым альдегидом, инактивации фермента в ре-ультате реакции и структурирования в системе белок — глутаровый альдегид).

Предложено уравнение, описывающее инактивацию фермента в процессе вза имодействия с глутаровым альдегидом.

3. С учетом выявленных особенностей реологического поведения белоксо держащих дисперсных систем с высокой степенью наполнения и кинетики фор мирования межфазных адсорбционных слоев на границе водный раствор белк — раствор триацетата целлюлозы в метиленхлориде сформулированы предз ставления о механизме структурообразования на границе раздела фаз форме вочной дисперсии.

4. Установлена количественная взаимосвязь основных характеристик дис персий, используемых для получения ВБК - вязкости дисперсионной сред! (раствора ТАЦ в метиленхлориде), объемной доли дисперсной фазы (раствор фермента) и вязкости дисперсии перед модифицированием, позволяющая р« шить технологическую задачу определения условий приготовления формовое ной дисперсии, обеспечивающих коалесценцию диспергированных растворо модификатора и фермента и достижение степени превращения аминогрупп бех ка, необходимой для стабилизации фермента и исключения его десорбции и волокна.

5. Выявлена роль частиц ферментсодержащей дисперсной фазы в процесс формирования пористой структуры ВБК как дополнительных центров структз рообразования, ускоряющих распад системы на фазы. Показано, что в резуш тате формования по мокрому способу триацетатных волокон, содержащих и\ мобилизованные белки, образуется структура, характеризующаяся наличие переходных и макропор, параметры которой определяются адсорбционным взаимодействиями на границе раздела фаз формовочной дисперсии и скоросты распада системы на фазы. Разработаны способы направленного регулирован« пористой структуры ВБК путем изменения объемной доли дисперсной фазь состава межфазного адсорбционного слоя, скорости фазового распада и введ| ния полимера-порообразователя.

6. Определены пути снижения влияния диффузионных затруднений на ю нетику гетерогенного биокатализа с использованием ферментов, включенных структуру волокна. Реализован подход, позволяющий с использованием дифф; зионных моделей прогнозировать эффективность иммобилизации в структур волокна, полученного в заданных условиях, ферментов с известными каталит! ческими свойствами.

7. Показана возможность направленного воздействия на структуру воло нистых и пленочных биокатализаторов и диффузионные характеристики би логически активных белков при включении ферментов в структуру волокон пленок в процессе их формования, позволяющие в широких пределах регулир

.ть фармакодинамические свойства ферментсодержащих материалов медициною назначения. Показана эффективность использования разработанных ма-риалов при лечении экспериментальных ран у животных и в клинике. Мате-тл Терриплен рекомендован Комитетом по новой медицинской технике Мин-рава РФ к постановке на промышленное производство и применение в меди-1Нской практике.

8. Разработана технология процесса получения ВБК на основе триацетата ¡ллюлозы, в структуру которых включены модифицированные ферменты. Ре-имы получения ВБК проверены при выпуске в условиях Экспериментального вода НПО "Химволокно" опытных партий ВБК, содержащих иммобилизо-1нные ферменты пенициллинамидазу и ß-галактозидазу. Показана возмож-)сть применения разработанных ВБК для гидролиза бензилпенициллина и 1ктозы в молочной сыворотке.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Кильдеева Н.Р., Казанская Н.Ф., Вирник А.Д. Иммобилизация в струк-фе волокон и пленок протеолитических ферментов.// Изв.ВУЗов. Химия и ш.технол. 1979. №2. С.225-229.

2. Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д., Толстых П.И., Василькова З.Ф., Гости-ев В.К., Канорский И.Д. Дренирующий материал.// АС № 700138 (не публ.).

3. Гостищев В.К., Толстых П.И., Василькова З.Ф., Роговин З.А., Вирник .Д., Кильдеева Н.Р., Хомяков К.П., Меня Н.Б., Розенберг М.Э., Войтко Н.П., огомольный Б.Я., Берченко Г.Н. Полимерная композиция.// АС 835140 (не убл.).

4. Кильдеева Н.Р., Шаркова Е.Ф., Вирник А.Д. Получение волокон и пле-эк из фторопласта 42 с протеолитическим ферментом.// Хим.волокна. 1980. зб. С.24, 25.

5. Кильдеева Н.Р., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф., Вирник А.Д. Иммо-илизация модифицированного а-химотрипсина в структуре пленок из триаце-гта целлюлозы.// Биохимия. 1980. Т.45. №3. С.569-574.

6. Толстых П.И., Арутюнян Б.Н., Стручков Ю.Б., Беляева O.A., Кильдеева :.Р„ Красовская С.Б. Биологически активный шовный материал как средство рофилактики нарушений заживления ран (обзор).// Хирургия. 1980. №5. С.103-38.

7. Толстых П.И., Василькова З.Ф., Арутюнян Б.Н., Кильдеева Н.Р. Кра-эвская С.Б. Сравнительная оценка влияния биологически активного и обычно-э хирургического шовного материала на течение раневого процесса.// Хирур-4Я. 1980. №11. С.66-73.

8. Вирник А.Д., Седов A.A., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Ныс П.С. Булычева М.С., Журавлев А.К. Способ получения гетерогенных биокатализаторов. // АС 845474 (не публ.).

9. Вирник А.Д., Красовская С.Б., Седов A.A., Кильдеева Н.Р., Булычеве Н.С., Ныс П.С., Савицкая Е.М. Получение и применение химических волокон содержащих иммобилизованные ферменты.// В кн.: Препринты III Между нар.симп. по хим.волокнам. Калинин. 1981. Т.5. С.200-208.

10. Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д., Слободянникова J1.C., Латов В.К., Бе ликов В.М. Способ получения гетерогенных катализаторов.// АС № 906602. BV №7. 1982.

11. Кильдеева Н.Р., Роговин З.А., Толстых П.И., Вирник А.Д., Васильковг З.Ф. Композиция для очищения ран от гноя.// АС 933797 (не публ.).

12. Толстых П.И., Гостищев В.К., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И., Ва силькова З.Ф., Кильдеева Н.Р., Сахаров И.Ю., Журавлев А.Г., Владимиро! В.Г., Берченко Ю.А., Стручков Ю.В. Применение иммобилизованных фермен тов и их природных ингибиторов в хирургии.// Хирургия. 1983. №6. С.94-96.

13. Роговин З.А., Толстых П.И., Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д., Васильков; З.Ф., Гостищев В.К., Шаркова Е.Ф., Луневский В.А. Дренирующая компози ция.// АС № 978863 (не публ.).

14. Ларионова Н.И., Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Хомяков К.П., Гости щев В.К., Василькова З.Ф., Харитонов Ю.К., Вавилова Г.С., Затолокин В.Д. Николаев A.B., Берченко Г.Н. Полимерная композиция для лечения ран.// АС № Ю47177 (не публ.).

15. Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д., Слободянникова Л.С., Латов В.К., Бе ликов В.М. Включение в полимерные пленки протосубтилина Г-ЗХ, иммобили зованного на сополимере стирола и малеиновой кислоты координационным] связями в присутствии ионов Сг3+.// Прикл.биохим. и микробиол. 1985. Т.21 №4. С.501-535.

16. Вирник А.Д., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Водолазская Л.В., Би бер Б.Л., Соломон З.Г., Нечаева Л.Н., Мевх А.Г. Получение волокнистых мате риалов, содержащих иммобилизованные ферменты. // Промышленность хими ческих волокон. Обзорная информация. М.: НИИТЭХим, 1985.- 58 с.

17. Хомяков К.П., Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д., Прокофьева М.Ф., Не чаева Л.Н., Тавобилов И.М. Прядильный раствор для формования волокна, i АС № 1342076 (не публ.).

18. Вирник А.Д., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Бибер Б.Л., Соломо: З.Г. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пленок.// Антибиотики : мед.биотехнол. 1986. №2. С.117-122.

19. Галкин С.А., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Вирник А.Д., Галь->айх JT.C., Матвеев Д.В., Соломон З.Г., Бибер Б.Л. Способ приготовления шпозиции для получения волокон-биокатализаторов.// АС № 1467990 (не гбл.).

20. Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Водолазская JI.B., Со->мон З.Г., Бибер Б.Л. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пле-ж в процессе их формования. I. Иммобилизация немодифицированных ферритов (обзор). // Биотехнология. 1987. Т.4. №6. С.602-611.

21. Вирник А.Д., Гостищев В.К., Кильдеева Н.Р., Хомяков К.П., Толстых .И., Василькова З.Ф. Получение пленок и волокон, содержащих протеолити-:ские ферменты, и применение их в хирургической практике. // Прикл.биохим. микробиол. 1987. Т.23. №1. С.78-83.

22. Галкин С.А., Кильдеева Н.Р., Гальбрайх Л.С., Вирник А.Д. Реологиче-ие свойства прядильных композиций, предназначенных для формования во-жна-биокатализатора.//Хим.волокна. 1987. №1. С.9-10.

23. Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Водолазская Л.В., Со->мон З.Г., Бибер В.Л. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пле-ж в процессе их формования. II. Иммобилизация модифицированных фермен->в (обзор).// Биотехнология. 1988. Т.5. №1. С.91-96.

24. Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Царевская И.Ю., Вирник А.Д., Фи-тпова О.И. Влияние структуры полимерных материалов на свойства иммо-шизованных в них ферментов.// Прикл.биохим. и микробиол. 1988. Т.24. №3. .375-379.

25. Матвеев Д.В., Кильдеева Н.Р., Самошина Н.М., Лотменцева Е.Ю., ирник А.Д., Нахапетян Л.А., Соломон З.Г., Бибер Б.Л. Способ получения гид-шазы, иммобилизованной в волокне из триацетата целлюлозы.// АС № Г78383 (не публ.).

26. Галкин С.А., Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д., Гальбрайх Л.С. О влиянии >става прядильных композиций, используемых для формования волокна-юкатализатора, на их реологические свойства. // Журн.прикл.хим. 1988. №7. .1671-1672.

27. Вавилова Т.П., Ларионова Н.И., Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д., Петро-14 Ю.А., Барер Г.Н. Способ получения иммобилизованного поливалентного (гибитора протеаз для лечения гингивита и пародонтита.// АС № 1614496 (не

)гбл.).

28. Матвеев Д.В., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Кукушкина С.А., Ко-эвалова Л.Я., Негодяева Г.С., Вирник А.Д. Исследование структуры волокна-

биокатализатора, содержащего модифицированную ß-галактозидазу.// Хим.волокна. 1989. №1. С.21-23.

29. Матвеев Д.В., Шульчишин В.А., Вирник А.Д., Красовская С.Б., Киль-деева Н.Р. Исследование зависимости активности ß-галактозидазы, иммобилизованной в структуре волокна из триацетата целлюлозы, от pH и температуры.// Прикл.биохим. и микробиол. 1989. Т.25. №5. С.614-617.

30. Вирник А .Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Гальбрайх JT.C., Галкин С.А., Матвеев Д.В. Научные основы создания волокнистых биокатализаторов.// В кн.: XIV Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Рефераты докладов и сообщений.- Ташкент. 1989. Т.2. С.358.

31. Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Матвеев Д.В., Вирник А.Д., Германский Г.М. Многокомпонентные формовочные композиции на основе триацетата целлюлозы для получения волокон, содержащих иммобилизованные ферменты.// В кн.: Препринты У Междунар.симпоз. по хим.волокнам. Калинин. 1990. Т.5. С.136-140.

32. Вирник А.Д., Седов A.A., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Ныс П.С., Булычева М.С. Способ получения гетерогенных биокатализаторов. // Патент РФ № 845475. 1993 г.

33. Роговин З.А., Вирник А.Д., Седов A.A., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Скокова И.Ф., Савицкая Е.М., Ныс П.С., Булычева М.С., Милешин Ю.Н. // Патент РФ № 845476. 1993 г.

34. Хомяков К.П., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Нечаева Л.Н., Соломон З.Г., Бибер Б.Л., Тавобилов И.М. Композиция для получения биокатализаторов. // Патент РФ № 1198955. 1993.

35. Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Матвеев Д.В., Анохина O.A., Вирник А.Д., Гальбрайх Л.С., Шульчишин В.А., Соломон З.Г., Германский Г.И., Фа-дюшина Т.В., Полищук H.A., Бибер Б.Л. Способ получения иммобилизованной гидролазы. // Патент РФ № 1800842. 1993 г.

36. Шульчишин В.А., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Хомяков К.П., Вирник А.Д. Математическая модель периодического процесса гидролиза бен-зилпенициллина с использованием волокна-биокатализатора, содержащего модифицированную пенициллинамидазу. // Хим.фарм. журнал. 1993. №4. С.52-54.

37. Kildeyeva N.R., Galkin S.A., Anokhina O.A., Virnik A.D., Galbraich L.S. Rheological properties of spinning compositions based on triacetate cellulose solutions for the obtainment of enzyme-contained fibers.// Cell.Chem.Technol/ 1993. V.27. №6. Р.655-669/

38. Balabushevitch N.G., Kildeyeva N.R., Larionova N.I. New polyfunctional ilymer sistems of acceleration of regenerative process.// In: Proc.3-rd Intern.Surgery ingress. Wounds, burns, dressings. Telaviv. 1994. P.50-51.

39. Кильдеева H.P., Трусова С.П., Пилевская Н.И., Вирник А.Д. Свойства >рмовочных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих биотически активные вещества, и полученных на их основе пленок. // ш.волокна. 1994. №2. С.23-24.

40. Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б. Научные и технологи-ские основы создания и применения волокон-биокатализаторов (обзор).// им.волокна. 1994. №5. С.28-36.

41. Шульчишин В.А., Матвеев Д.В., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., фник А.Д. Рациональная организация технологического процесса гидролиза ктозы молочной сыворотки в присутствии гетерогенного волокнистого био-тализатора.// Прикл.биохим. и микробиол, 1994. Т.30. №1. С.143-149.

42. Кильдеева Н.Р., Вирник А.Д. Особенности реологических свойств вы-конаполненных белоксодержащих формовочных композиций. II им.волокна. 1995. №5. С.21-27.

43. Ларионова Н.И., Кильдеева Н.Р., Мороз Н.А. Инженерно-[зимологические подходы к дизайну полимерных форм апроктинина.// Вест-IK МГУ. Химия. 1995. Т.36. №2. С.139-143.

44. Kildeyeva N.R., Ovchinnikova T.N., Virnik A.D. Biodegradable film essing containing immobilized protease with controlled pharmacodynamic operties.// In: Proc.22nd Intern.Symp. on Controlled Release of Bioactive iaterials. Seattle. 1995. P.486-487.

45. Larionova N.I., Kildeyeva N.R., Balabushevitch N.G., Moroz N.A., rusova S.P., Khromov G.I., Virnik A.D. Insoluble and bioadhesive soluble polymer ms for delayed release of protein protease inhibitor.// In: Proc.22nd Intern.Symp. on ontrolled Release of Bioactive Materials. Seattle. 1995. P.488-489.

46. Kildeyeva N.R., Krasovskaya S.B., Virnik A.D., Galbraich L.S. Fibrous id film biocatalists for biotechnology and medicine.// In: Proc. Korea-Russian joint minar on chemical technologies "Chemistry: Today and Tomorrow". Moscow. )96. P.l-d.

47. Balabushevitch N.G., Kildeyeva N.R., Moroz N.A., Trusova S.P., Virnik .D., Khromov G.I., Larionova N.I. Regulating aspects of biosoluble and insoluble Im release systems containing protein protease inhybitor.// ppl.Biochem.Biotechnol. 1996. V.61. P.129-138.

48. Кильдеева Н.Р., Галкин С.А., Гальбрайх Л.С., Вирник А.Д. Влияние полиэтиленгликоля на реологические свойства формовочных композиций для получения волокон-биокатализаторов.// Хим.волокна. 1997. №3. С.9-12.

49. Kildeyeva N.R., Gostishev V.K., Tolstikh P.I., Galbraich L.S. Development of the fibre with protease controlled release for obtained surgical suture materials.// In: Proc. 24th Intern. Symp. on Controlled Release of Bioactive Materials. Stochholm. 1997. P.603-604.

50. Кильдеева H.P., Гальбрайх Л.С. Использование водно-органических дисперсий для получения ферментсодержащих волокон.// В кн.: "Тезисы докл. I Междунар.научно-технич. конф. "Актуальные проблемы химии и химической технологии". Иваново. 1997. С.9.

51. Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Шульчишина Е.В., Матвеев Д.В., Вирник А.Д. Кинетические исследования взаимодействия р-галактозидазы с глутаровым альдегидом.// Прикл.биохим. и микробиол. 1997. Т.ЗЗ. №2. С.166-171.

52. Кильдеева Н.Р. Особенности получения наполненных волокон из композиций, содержащих биологически активные белки.// Вестник МГТА. 1997. С.87-89.

53. Кильдеева Н.Р., Трусова С.П., Горчакова В.А., Хомяков К.П., Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Мороз Н.А., Вирник А.Д. Многокомпонентные полимерные системы, содержащие биологически активные белки и антимикробные вещества. // Прикл.биохим. и микробиол. 1997. Т.ЗЗ. №5. С.488-491.

54. Димитров Д.В., Кильдеева Н.Р., Гальбрайх Л.С., Шульчишин В.А. Моделирование свойств ферментсодержащих дисперсий.// Хим.волокна. 1998.

№3. С.16-18.

55. Kildeyeva N.R., Ovchinnikova T.N. Protease entrapment and release characteristics from biodegradable biocompatible films.// In: Proc.Intern. Confer. "Biocatalysis-98". Puschino. 1998. P.40.

JIP N 020753 от 23.04.98

Подписано в печать 08.07.98 Сдано в производство 25.08.98 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл. печ. л. 2,25 Уч.-изд. л. 2,0 Заказ 224 Тираж 100

Электронный набор, МГТА, 117918, Малая Калужская, 1.

' -

Московская государственная текстильная академия им.А.Н.Косыгина

На правах рукописи УДК 677.021.125: 577.151.042

КИЛЬДЕЕВА Наталия Рустемовна

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВОЛОКНИСТЫХ И ПЛЕНОЧНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ ИЗ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ ФОРМОВОЧНЫХ ДИСПЕРСИЙ

Специальность 05.17.15 Технология химических волокон ц плВИОК

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой ст^пенр доктора химичес|

М

юи степени с^^^ук/

Научный консультант: профессор, доктор химических наук Гальбрайх Леонид Семенович

Москва, 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ.............................................. 5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................ 13

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВОЛОКОН И ПЛЕНОК, СОДЕРЖАЩИХ ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ..... 14

1.1. Химическое присоединение ферментов к волокнистым материалам........................................... 16

1.2. Включение ферментов в химические волокна и пленки....... 38

1.3. Перспективы использования волокнистых и пленочных биокатализаторов ..................................... 55

ГЛАВА 2. ИММОБИЛИЗАЦИЯ НАТИВНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ В СТРУКТУРЕ ВОЛОКОН И ПЛЕНОК.............................................. 67

2.1. Иммобилизация в структуре волокон и пленок немодифи-цированных ферментов ................................ 68

2.2. Иммобилизация в структуре волокон и пленок модифицированных ферментов .................................. 77

2.3. Изучение возможности модифицирования ферментов в процессе получения ферментсодержащей формовочной дисперсии............................................ 86

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА МОДИФИЦИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТА ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ .............. 95

3.1. Кинетика взаимодействия фермента с глутаровым альдегидом ................................................ 96

3.2. Кинетика инактивации р-галактозидазы в процессе взаимодействия с глутаровым альдегидом .......................103

3.3. Структурирование в системе р-галактозидаза - глутаровый альдегид..............................................108

ГЛАВА 4. РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФОРМОВОЧНЫХ ДИСПЕРСИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВОЛОКНИСТЫХ И ПЛЕНОЧНЫХ БЙОКАТАЛИЗАТОРОВ ....................116

4.1. Свойства дисперсий на основе растворов триацетата целлюлозы в метиленхлориде, содержащих ^модифицированный белок..........................................117

4.2. Реологические свойства адсорбционных слоев на границе раздела фаз раствор триацетата целлюлозы в метиленхлориде-раствор белка..........................................121

4.3. Влияние объемной доля дисперсной фазы на реологические свойства формовочной дисперсии ........................127

4.4. Математическое моделирование процесса приготовления формовочных дисперсий для получения волокнистых биокатализаторов .....................................132

4.5. Реологические свойства формовочных дисперсий, содержащих модифицированные ферменты ....................... 141

4.6. Изменение реологических свойств формовочных дисперсий

во времени............................................ 146

ГЛАВА 5. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ВОЛОКНИСТЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ ............ 151

5.1. Влияние белоксодержащей дисперсной фазы на структуру триацетатных волокон, полученных по мокрому способу .... 153

5.2. Изучение возможности регулирования структуры фермент-

содержащих триацетатных волокон.......................165

ГЛАВА 6. ОСОБЕННОСТИ КИНЕТИКИ ГЕТЕРОГЕННОГО БИОКАТАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В СТРУКТУРУ ВОЛОКНА.................183

6.1. Влияние внутридиффузионных факторов на свойства ферментов, иммобилизованных в структуре волокон и

пленок............................................... 183

6.2. Определение путей снижения влияния диффузионных затруднений на кинетику гетерогенно-каталитического процесса............................................. 193

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВОЛОКНИСТЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ............................. 203

7.1. Физико-химические параметры процессов гидролиза специфических субстратов под действием ферментов, включенных в структуру триацетатного волокна............ 203

7.2. Изучение способов организации биотехнологического процесса с использованием волокнистого биокатализатора .... 208

ГЛАВА 8. РАЗРАБОТКА ВОЛОКНИСТЫХ И ПЛЕНОЧНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ .. 219 8.1. Изучение возможностей направленного изменения

фармакодинамических свойств ферментсодержащих волокон

и пленок.............................................. 220

8.2. Исследование эффективности применения волокон и пленок, содержащих протеолитические ферменты, в

гнойной хирургии..................................... 238

ВЫВОДЫ................................................248

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................251

ПРИЛОЖЕНИЯ..........................................277

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Развитие прогрессивных методов лечения и потребности новых технологий ставят проблему получения материалов с различной направленностью биологического действия и, в первую очередь, ферментсодержащих материалов, в число наиболее актуальных задач современной науки.

Многообразие ферментов в природе, их исключительно высокая каталитическая активность, а также совершенствование методов выделения этих уникальных белков открывают перспективы их использования для создания новых биотехнологических процессов и лечения целого ряда заболеваний. В то же время для нативных ферментов характерен ряд недостатков (низкая стабильность, приводящая к быстрой потере активности, сложность отделения от реакционной среды), снижающих технико-экономическую эффективность каталитических процессов с их участием и ограничивающих их применение в биотехнологии и медицинской практике. Иммобилизация ферментов в структуре полимеров-носителей позволяет осуществить переход к нерастворимым формам иммобилизованных ферментов, сохраняющим свойства нативного предшественника, но выгодно отличающимся от него стабильностью и меньшей подверженностью биологическому воздействию. Нерастворимые производные ферментов легко отделять от продуктов реакции, что обеспечивает возможность многократного применения в биокаталитических процессах превращения специфических субстратов.

В решении этих задач важное место занимает разработка методов получения волокон и пленок, содержащих иммобилизованные ферменты. Целесообразность использования волокон и пленок в качестве носителей для иммобилизации ферментов обусловлена рядом причин. Высокая удельная поверхность волокна способствует интенсивному массообмену в гетерогенном катализе, а хорошие физико-механические свойства наряду с удобной физической формой обеспечивают широкие возможности аппаратурно-технологического оформления биотехнологических процессов. Биокатализаторы в виде волокон и пленок, содержащих протеоли-

тические ферменты, могут быть использованы для создания полимерных покрытий на рану, шовных нитей и иных хирургических средств, оказывающих лечебно-профилактическое действие.

Наиболее простым методом придания химическим волокнам специальных свойств, в том числе биологической активности, является формование химических волокон из композиций, включающих в качестве наполнителей соответствующие соединения. Метод получения волокнистых материалов, содержащих иммобилизованные ферменты, включенные в структуру волокна в процессе формования, может рассматриваться как один из вариантов получения наполненных волокон. Однако специфические свойства ферментов, такие как химическая природа белка, бифиль-ность его макромолекулы, лабильность ферментов при экстремальных значениях температуры и рН и действии органических растворителей, растворимость ферментов в реакционной среде (водные растворы) и высокие скорости превращения специфических субстратов требуют специальных подходов при разработке технологии получения волокон, содержащих иммобилизованные ферменты. Эти обстоятельства, а также острая потребность отечественной медицины в эффективных хирургических средствах и ряда отраслей промышленности в продуктах, которые можно получить только путем биокатализа, обусловливают необходимость разработки научных основ процессов иммобилизации в структуре волокон и пленок ферментов с разными физико-химическими свойствами, различной специфичностью и эффективностью катализа.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось комплексное решение научных и технологических проблем создания высокоэффективных волокнистых и пленочных биокатализаторов для биотехнологии и медицины с использованием белоксодержащих формовочных дисперсий и композиций. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- на основе анализа факторов, определяющих стабильность иммобилизованного фермента и кинетику его десорбции из волокнистого биокатализатора, осуществить обоснованный выбор метода модифицирования фермента;

- изучить структурно-механические свойства белоксодержащих дисперсий на основе растворов триацетата целлюлозы в метиленхлориде;

- исследовать структуру волокнистых биокатализаторов и возможности направленного регулирования ее параметров;

- изучить влияние диффузионных факторов на кинетику превращения специфических субстратов в гетерогенно-каталитических процессах с использованием волокнистых биокатализаторов;

- изучить кинетику выделения нативных ферментов и их полиэлектролитных комплексов из волокон и пленок в модельные среды;

- на основе проведенных исследований разработать волокнистые и пленочные биокатализаторы и изучить возможность их использования в биотехнологических процессах и в медицине при создании новых хирургических средств.

Научная новизна работы заключается в реализации нового подхода к получению ферментсодержащих наполненных волокон и пленок, включающего модифицирование фермента непосредственно в формовочной дисперсии, обеспечивающего получение материалов с заданными свойствами.

На основе комплексного изучения кинетики процессов, протекающих в белоксодержащих дисперсных системах, и взаимосвязи физико-химических характеристик этих систем сформулированы научно обоснованные принципы включения ферментов в структуру химических волокон, что позволило получить высокоактивные и стабильные волокнистые и пленочные биокатализаторы.

В результате изучения особенностей макромолекулярных реакций в многокомпонентных ферментсодержащих полимерных системах показана возможность необратимой фиксации ферментов в структуре волокон и пленок и увеличения стабильности волокнистых биокатализаторов в условиях биотехнологических процессов. Рассчитаны кинетические и термодинамические характеристики реакции взаимодействия глутарово-го альдегида с (3-галактозидазой и установлена корреляция между степенью превращения аминогрупп и степенью инактивации фермента, что

обеспечило возможность выбора основных параметров процесса модифицирования белка.

Выявлены особенности реологического поведения дисперсных систем на основе растворов триацетата целлюлозы в метиленхлориде, содержащих водные растворы белка. Сформулированы представления об изменении прочности и состава межфазного адсорбционного слоя как основных факторах, наряду с объемным содержанием дисперсной фазы, влияющих на реологические свойства дисперсных систем. Получено уравнение, отражающее взаимосвязь основных характеристик дисперсий, используемых для получения волокнистых биокатализаторов.

Установлены закономерности формирования пористой структуры волокна в присутствии дисперсной фазы. Показана роль агрегации макромолекул триацетата целлюлозы на границе раздела фаз в образовании дополнительных центров структурообразования и ускорении распада системы на фазы. Определены пути направленного регулирования структуры волокнистых биокатализаторов за счет изменения объемной доли дисперсной фазы, состава межфазного адсорбционного слоя, скорости фазового распада и введения полимера-порообразователя.

На основании анализа кинетики ферментативных реакций с участием волокон и пленок, содержащих иммобилизованные ферменты, полученных с использованием разработанных методов, установлена количественная взаимосвязь каталитических и диффузионных характеристик волокнистых биокатализаторов, позволяющая прогнозировать эффективность иммобилизации в структуре волокна ферментов с различными каталитическими свойствами.

С учетом результатов изучения кинетики выделения нативных белков и их полиэлектролитных комплексов из волокон и пленок выявлены пути регулирования фармакодинамических и медико-биологических свойств ряда материалов медицинского назначения.

Новизна предложенных решений подтверждена 15 авторскими свидетельствами и патентами РФ.

Практическая значимость работы. Разработаны способы и научные основы технологических процессов получения высокоактивных и ста-

бильных волокнистых биокатализаторов для биотехнологических процессов и волокнистых и пленочных материалов для медицинского применения. Полученные результаты были использованы при разработке технического задания и проекта установки для выпуска волокнистых биокатализаторов различных типов. В соответствии с разработанным технологическим регламентом был осуществлен выпуск укрупненных опытных партий биокатализаторов, содержащих модифицированные (3-галактозидазу и пенициллинамидазу, показатели которых соответствовали требованиям технических условий.

Использование волокнистого биокатализатора, содержащего иммобилизованную Р-галактозидазу, в биотехнологическом процессе гидролиза лактозы в молочной сыворотке обеспечивает получение сахаристых веществ из нетрадиционных источников сырья, утилизацию сыворотки, решение экологических проблем производства молочной продукции. Волокнистый биокатализатор, содержащий иммобилизованную пенициллинамидазу, может найти применение при модернизации существующей технологии получения 6-аминопенициллановой кислоты за счет организации процесса гидролиза бензилпенициллина в аппаратах колонного типа.

Проведенные исследования позволили разработать ассортимент ферментсодержащих хирургических средств, обладающих выраженным лечебно-профилактическим действием: покрытия на рану, дренажи, шовные нити, использование которых в экспериментальной и клинической хирургии позволяет сократить сроки лечения ран и ожогов и уменьшить расход дорогостоящих ферментных препаратов.

Полимерное покрытие на рану "Терриплен", содержащее терри-литин, для которого были проведены все необходимые предклинические исследования и клинические испытания, был рекомендован Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ к производству и применению в качестве средства для лечения гнойных ран и ожогов.

Основные результаты работы внедрены на опытном заводе НПО "Химволокно", Охтинском НПО "Пластполимер", в учебном процессе

(курсы "Основы биотехнологии", "Полимерные материалы в медицине и биотехнологии") на кафедре технологии химических волокон МГТА.

На защиту выносятся:

а) научно-обоснованные принципы получения волокнистых и пленочных биокатализаторов из ферментсодержащих дисперсий, являющиеся основой создания нового поколения высокоэффективных полимерных материалов для биотехнологии и медицины;

б) совокупность установленных закономерностей и обобщений, позволяющая осуществить направленное регулирование свойств химических волокон и пленок, полученных из формовочных композиций, содержащих биологически активные белки;

в) разработанные методы модифицирования ферментов в процессе приготовления формовочных дисперсий.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международных симпозиумах по химическим волокнам (Калинин, 1981 и 1990 гг.), Международных симпозиумах по контролируемому выделению биологически активных веществ (Бостон, 1995 г. и Стокгольм, 1997 г.), Международных конференциях "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантантов" (Москва, 1992, 1995 и 1998 гг.), Международном хирургическом конгрессе (Тель-Авив, 1994 г.), Международной научно-технической конференции "Актуальные проблемы химии и химической технологии" (Иваново, 1997 г.), Корейско-Российском семинаре по химической технологии (Москва, 1997 г.), Всесоюзных симпозиумах по получению и применению иммобилизованных ферментов (Ленинград, 1980 г., Киев, 1983 г., Кобулетти, 1985 г., Москва, 1991 г., Суздаль, 1995 г.), Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989 г.), Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Алма-Ата, 1983 г.), Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Астрахань, 1979 г.), Всесоюзном симпозиуме "Методы получения высокоочищенных ферментов" (Вильнюс, 1978 г.), Всесоюзных совещаниях "Химия и технология производных целлюлозы" (Владимир, 1980 г., Суздаль, 1990 г.),

Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные препараты" (Владивосток, 1991 г.), Всесоюзной конференции "Проблемы модификации природных и синтетических