автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Оптимизация метода ВЭЖХ для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов, метотрексата и циклоспорина А

На правах рукописи

ФЕДОРОВА ГАЛИНА АФАНАСЬЕВНА

Оптимизация метода ВЭЖХ для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов, метотрексата и циклоспорина А

Специальность 05.И.II. - хроматография и хроматографические приборы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Иркутск 2003

\

Рабата выполнена в Лимнологическом институте Сибирского отделения РАН

Научный руководитель: доктор химических наук

Г.И.Барам

Научный консультант кандидат медицинских наук

А.В.Стародубцев

Официальные оппоненты: доктор химических наук

А.В.Ларин

доктор химических наук Л.А.Баратова

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

РАН

Защита диссертации состоится 27 января 2004 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.246.03 в Институте физической химии РАН по адресу: 119991, Москва, Ленинский пр., д.31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии РАН.

Автореферат разослан 25 декабря 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Л.Н.Коломиец

Щ)0.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Здравоохранение - одна из главных областей человеческой деятельности, успехи которой прямо и косвенно зависят как от уровня развития аналитической химии в общем, так и от степени внедрения наиболее передовых методов химического анализа в практику. К таким методам относится и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая за последние 30 лет во многом определила заметный прогресс в практической медицине. Важнейшим приложением ВЭЖХ стал терапевтический лекарственный мониторинг, позволяющий оптимизировать индивидуальную дозировку лекарств, которая необходима для предотвращения побочных эффектов и повышения эффективности лечения.

ВЭЖХ как высокочувствительный и универсальный метод анализа, которому во многих случаях нет альтернативы, позволяет одновременно следить за изменением концентрации несколько лекарственных веществ (ЛВ), отличается достаточной точностью и воспроизводимостью. Однако, активное использование ВЭЖХ в повседневной (рутинной) клинической практике ограничено из-за отсутствия унифицированных методик анализа. В настоящее время для определения какого-либо ЛВ применяются своя "уникальная" процедура подготовки пробы и своя методика ВЭЖХ-анализа, которые в каждом конкретном случае предписывают использование разных колонок, разных элюентов и разных детекторов. Очевидно, что эти обстоятельства приводят к необходимости каждый раз изменять хроматографическую систему и калибровать хроматограф, что, в конечном итоге, значительно увеличивает продолжительность всего анализа, требует высокой квалификации персонала и, наконец, существенно повышает стоимость анализа.

Один из возможных путей решения этой проблемы - разработка максимально унифицированных, экономичных и экспрессных методик подготовки пробы и хроматографических процедур. Реализация такого подхода, очевидно, позволит снизить расходы на проведение анализа и широко внедрить ВЭЖХ в практику лекарственного мониторинга

Это направление развития ВЭЖХ, безусловно, представляется нам важным и актуальным.

Р0( '• •

• * А

( , . . ,«г

Цель и задачи исследований.

1. Оптимизировать метод ВЭЖХ для задач терапевтического лекарственного мониторинга препаратов в сыворотке крови с целью широкого его внедрения в клиническую практику.

2 Унифицировать и оптимизировать метод ВЭЖХ для определения ряда лекарственных веществ (метотрексат, циклоспорин А, этосуксимид, гексамидин, фенобарбитал, ламиктап, дифенин, карбамазепин, бензонал, клоназепам, депакин), которые являются важнейшими объектами терапевтического лекарственного мониторинга.

3. Унифицировать и оптимизировать процедуру подготовки образцов крови для определения в них методом ВЭЖХ вышеперечисленных препаратов.

4. Определить метрологические характеристики разработанных методик для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для биоаналитических методов.

5. Апробировать разработанные методики в клинической практике и подтвердить их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

Научная новизна работы работы заключается в следующем:

1. Предложена унифицированная, оптимизированная и экономичная ВЭЖХ-методика для определения этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама и депакина (все -противосудорожные препараты), метотрексата и циклоспорина А, позволяющая хроматографировать все соединения на колонке с обращенно-фазовым сорбентом типа "С 18" при использовании одной и той же двухкомпонентной подвижной фазы.

2. Предложена унифицированная и экономичная методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови методом ВЭЖХ. Ее отличительная особенность - возможность работы с малыми объемами образцов крови. Методика подготовки образца обеспечивает достаточную степень его очистки от балластных веществ крови и позволяет проводить более 400 анализов противосудорожных препаратов в сыворотке на одной колонке, что существенно повышает экономичность всего метода.

3. Показана пригодность разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХ-анализа для терапевтического лекарственного мониторинга противо-судорожных препаратов (ПСП), метотрексата и циклоспорина А путем апробации в рутинной клинической практике. На примере свыше 700 определений подтверждено соответствие метрологических характеристик разработанных методик требованиям, принятым для биоаналитических методов.

Практическая значимость работы.

Предложенные методики были использованы для терапевтического лекарственного мониторинга ПСП, метотрексата и циклоспорина А в крови пациентов, проходившим лечение в Иркутской Государственной областной детской клинической больнице и в Иркутском Государственном институте усовершенствования врачей в период 1997-2003 гт. Данные мониторинга в сочетании с клиническими показателями были использованы врачами для коррекции доз лекарственных препаратов.

Внедрение разработанных методик для терапевтического лекарственного мониторинга в клиническую практику позволит более обоснованно определять тактику и стратегию лечения, сделав лечение эффективнее и безопаснее.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Оптимизированная ВЭЖХ-методика для определения ПСП, метотрексата и циклоспорина А, которая является экспрессной и экономичной вследствие унификации как условий ВЭЖХ-анализа, так и применения микроколоночного варианта ВЭЖХ. Время анализа составляет 10-15 мин.

2. Методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови, являющаяся простой, экспрессной и экономичной. Объем сыворотки крови для одного определения не превышает 50 мкл. На одной колонке выполняется более 400 анализов ПСП.

3. Результаты апробации разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХ-анализа в рутинной клинической практике, подтверждающие их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

4. Результаты исследования метрологических характеристик разработанных методик анализа, полученные путем обработки экспериментального

материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для биоаналитических методов анализов.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы изложены в 11 публикациях и доложены на: Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998); Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999), V Национальном Съезде фармацевтов Украины "Достижения современной фармацевтики и перспективы его развития в новом тысячелетии" (Харьков, 1999); VI Конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2000" (Новосибирск, 2000), VIII Всероссийском съезде неврологов (Казань, 2001); II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск; 2002); X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", (Москва, 2003); 3-ем Международном симпозиуме по методам разделения в биологических науках (Москва, 2003).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 137 страницах текста, содержит 23 рисунка, 12 таблиц и 4 приложения. В списке цитируемой литературы 127 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Терапевтический лекарственный мониторинг (TJIM) как самостоятельное направление в фармакокинетическом анализе сформировался около 20 лет назад. Он представляет собой контроль концентрации лекарственного вещества (ЛВ) и/или его активных метаболитов в организме пациента в течение всего периода лечения. ТЛМ особенно важен, когда соединение имеет узкий терапевтический интервал действия, когда необходима длительная терапия, когда наблюдается нелинейная фармакокинетика и значительная вариабельность фармако-кинетических параметров у разных пациентов.

В РФ список ЛВ, подлежащих мониторингу, регламентируется Приказом №64 Минздрава РФ от 21 февраля 2000 г. Он содержит около 50 лекарств, характерная особенность которых - близость их терапевтической концентрации

к токсической. Именно это обстоятельство и яляется причиной, требующей мониторинга таких ЛВ при проведении терапии. Особенно важно осуществлять ТЛМ при лечении детей, так как дозировка сильнодействующих лекарств, выбираемая, исходя из веса больного, в большинстве случаев не может обеспечить "правильную" концентрацию ЛВ в крови.

10 лекарственных веществ, часто применяемых для лечения детей, йриве-дены в следующей таблице 1.

Таблица 1. Терапевтические и токсические концентрации 10 ЛВ в крови

Лекарственное вещество Структурная формула Концентрация, мкг/мл

терапевтич. токсическая

Гексамидин Н ,0 И-С и'^оО 5-12 15

Вальпроевая кислота сн3сн!-сн^сн с<о СНзСН2-СНа/ "ОН 40-100 120-150

Дифенин о}>° ° н 5-20 20

Карбамазепин осро о=с-ын2 2-12 10

Клоназепам Н ,о ХУГУ* & 0,01-0,08 0,1

Ламиктал 'ОН}- С1 С1 ИНг 0,5 (1)-3 (12) 2-20

Фенобарбитал Н 0 н о 10-40 (50) 30

Этосуксимид 30-100 100

Мето грексат Г^М СНз/=\ о м пГ Т"СНг /-С-МН-СН-СООН N " " сн-соон 0,23 0,45

Циклоспорин А СН, СН=СН-СНз Н-4--СНЗ н--)-он МеСеи МеУзК АЬи-Эаг 1.еиМе 1 еиМе С1-А1а-А1а-Меиви-Уа! 0,1-0,4 0,4

Концентрацию всех этих веществ определяют в крови, как правило, методом обращенно-фазной ВЭЖХ. В литературе для каждого из ЛВ описано много вариантов методик анализа, но реальное внедрение их в практический ТЛМ требует весьма значительных затрат, связанных с необходимостью приобретения большого количества разных колонок и реактивов. Вынужденная перестройка хроматографической системы и ее калибровка при переходе с определения одного вещества к определению другого, увеличивает продолжительность всего анализа и требует высокой квалификации персонала, что, в конечном итоге, повышает стоимость каждого анализа еще больше.

Очевидно, что при системном подходе к организации ТЛМ все разнообразие аналитических процедур необходимо свести к минимуму и оптимизировать их с экономической точки зрения.

1. Выбор масштаба ВЭЖХ.

От масштаба хроматографии, определяемого размерами колонки, зависит такой "потребительский" параметр, как количество расходуемой на один анализ подвижной фазы (ПФ).

Длина хроматографических колонок, используемых в терапевтическом лекарственном мониторинге (ТЛМ), составляет обычно 100-250 мм, а их внутренний диаметр - 4-4,6 мм. Применение коротких колонок - один из важных путей снижения стоимости анализа за счет сокращения его длительности и уменьшения расхода ПФ. Уменьшение диаметра колонки при сохранении на1рузки приводит к повышению чувствительности анализа и, тем самым, снижает требования к чистоте растворителей. Очевидно, что одновременное уменьшение длины и диаметра колонки по сравнению со "стандартной" позволяет получить существенные выгоды. Применение колонки размером 02x75 мм взамен традиционной (04,6x250 мм) в 10-20 раз снижает расход растворителей и во столько же раз повышает чувствительность определения.

ВЭЖХ на колонках 02x75 мм мы считаем оптимальным масштабом для целей ТЛМ. Дальнейшее уменьшение колонки до размеров капиллярной представляется нецелесообразным, так как оборудование для капиллярной

ВЭЖХ пока слишком дорого. Отметим также, что выигрыш в чувствительности определения и экономия растворителей при переходе от колонок диаметром 2 мм к колонкам диаметром 1 мм и менее, становятся уже не такими заметными.

Все хроматографические определения мы выполняли на жидкостном хроматографе "Милихром А-02" (ЗАО "ЭкоНова, г.Новосибирск).

2. Выбор неподвижной фазы.

В TJIM используются, главным образом, обращенные фазы (ОФ) типа "С8" и "С 18", синтезированные на основе силикагеля Известно, что практически все ОФ, даже при условии "одинаковости" их нормируемых характеристик, могут существенно различаться по селективности. Для оценки пригодности конкретных ОФ нами совместно с М.О.Родинко и И.Н.Азаровой было исследовано 7 сорбентов (частицы сферической формы с диаметром 5 мкм), упакованных в колонки 02x75 мм.

Так как большинство JIB, подлежащих TJ1M относятся к весьма гидрофильным соединениям, было изучено поведение ОФ в бинарном элюенте с высоким содержанием воды. Для этого в режиме градиентного элюирования записывали хроматограммы экстракта черного чая, содержащего большое количество гидрофильных веществ. Показано, что градиентное элюирование с начальной концентрацией ацетонитрила 2% возможно лишь для двух фаз -Nucleosil 100-5-С18 (рис. 1 В) и Nucleosil 300-5-С8 (рис 1 Г). Остальные ОФ при таком высоком содержании воды в ПФ "коллапсировали". Это явление характерно для фаз с высоким содержанием углерода (полимерные фазы) или с предельно высокой плотностью прививки алкильных радикалов. В данном случае такими ОФ оказались Nucleosil 100-5-С18 АВ и РАН, Kromasil 100-5-С4, С8 и С18 Снижение содержания воды в ПФ с 98 до 90% в начале градиента лишь частично "снимает" коллапс сорбента Kromasil С18 (рис. 13).

Комплексную проверку пригодности ОФ Nucleosil 100-5-С18 для определения веществ различной химической природы мы проводили с помощью тестовой смеси, которую хроматографировали в градиентном режиме (рис. 2). Два ее компонента - прозерин и трифтазин - содержащие основной атом азота, весьма чувствительны к наличию неэкранированных силанольных групп сорбента Оба вещества на выбранном сорбенте хроматографируются в виде

симметричных пиков с коэффициентами асимметрии А ,0%= 1,15-1,19, что говорит об отсутствии значимых ионообменных взаимодействий с силанолами.

^с1е<к11100-5 С18 РАН А !Чис1е(кП 100-5 С18 АВ Б I ГЧиЫеовН 100-5 С18 В Nucle ззЛ 300-5 С8 Г

Кготаз||-100-5-С4 д Кгота8Н-100-5-С8 Е к КготазП 100-5-С18 Ж К Кгот Т а8||-100-5-С18 3

О 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 мин

Рис. 1. Определение гидрофильных соединений на различных ОФ. Колонки: 02x75 мм. Элюенты: "А"- 0,2 М ПСЮ4 - Н3Р04 (рН 3); "Б"- МеСЫ. Градиенты: А-Ж - 3000 мкл от 2 до 50% "Б"; 3 - 3000 мкл от 10 до 50% "Б". Скорость потока: 100 мкл/мин. Температура: 45°С. УФ-детектор: Х=280 нм. Проба: 2 мкл экстракта черного чая; экстрагент - этанол:вода (1:1)

Рис. 2. Хроматограмма тестовой смеси.

Колонка: 2x75 мм; Мис1еозН 100-5 С18. Элюенты: А- 0.2 М 1лСЮ4-Н3Р04, рН 3; Б - АСЫ. Градиент: 4000 мкл от 5 до 100% Б; 300 мкл 100% Б. Р: 100 мкл/мин. 40°С. 0 500 1000 1500 2000 2500 мкл Х=210 нм. Проба. 5 мкл.

3. Выбор подвижной фазы.

Хорошая симметрия пиков на рис. 2 обусловлена также кислым значением рН элюента и присутствием в нем LiC104. ВЭЖХ-анализ JIB на ОФ часто выполняется при рН~3, однако, при длительной эксплуатации колонки при таком значении рН существует опасность отщепления от снликагеля радикалов С18 с образованием свободных силанольных групп. Для того, чтобы заранее подавить эффект "силанолов", мы увеличили ионную силу ПФ, введя в ее состав LiC104. Выбор оптимальной концентрации L1CIO4 в ПФ выполнен нами совместно с М.О.Родинко экспериментально путем изучения поведения 6 веществ при градиентном элюировании. Концентрацию LiCl04 в элюенте А изменяли от 0 до 0,5 М. Зависимости объемов удерживания и ширины пиков на половине их высот от концентрации L1CIO4 приведены на рис. 3-1 и II.

V„, w«-

Концентрация LiCIO< в элюенте А, М

Рис. 3. Зависимость объемов удерживания и ширины пиков на уровне Ь/2 компонентов тестовой смеси от концентрации перхлората лития в ПФ. Условия хроматографии в подписи к рис. 2.

Из кривых на рис. 3-1 и II видно, что изменение концентрации LiC104 заметно влияет на подвижность только прозерина и трифтазииа, являющихся основаниями с рКд>8. Увеличение их удерживания можно связать с образованием слабогидрофобных ионных пар с С104 Изменение концентрации L1CIO4 лития от 0 до 0,2 М вызывает уменьшение ширины пиков уридина, прозерина и трифтазина. Концентрация LiC104 в элюенте А, равная 0,2 М выбрана нами как оптимальная.

Далее нами показано, что все 10 веществ из Табл. 1, выбранные в качестве аналитов для TJIM, хорошо хроматографируются на колонке 02x75 мм с ОФ Nucleosil 100-5 С18 в подвижной фазе 0.2 М LiC104-H3P04 (рН 3) - ацетонитрил в изократическом или градиентном режимах.

4. Изократическое и градиентное элюирование.

Изократическое элюирование по сравнению с градиентным по многим причинам всегда предпочтительнее. В тех случаях, когда это допускалось, мы этому следовали. В Табл. 2 для приведены оптимальные составы ПФ для изократического ВЭЖХ противосудорожных препаратов (ПСП). ПФ готовили путем смешивания элюентов А (0.2 М LiC104-H3P04 (рН 3) и Б (ацетонитрил).

Таблица 2. Состав ПФ для определения ПСП и значения к'и /4)0%.

Лекарственное Определяемое Элюент А к' Коэффициент

вещество соединение Элюент Б асимметрии, А |0%

Фенобарбитал Фенобарбитал 80:20 5,21 1,12

Бензонал Фенобарбитал 80:20 5,21 1,12

Карбамазепин Карбамазепин 70:30 4,49 1,12

Гексамидин Гексамидин 85:15 3,94 1,12

Фенобарбитал 85:15 10,61 1,12

Ламиктал Ламиктал 80:20 5,66 1,02

Дифенин Дифенин 70:30 4,61 1,12

Клоназепам Клоназепам 65:35 4,06 1,15

Этосуксимид Этосуксимид 90:10 4,14 1,15

Вальпроевая кислота (ВК) ладра-бромфена-цилбромид ВК 35:65 6,16 1,08

Градиентное элюирование применяли для одновременного определения в крови нескольких JIB при комплексной терапии. Иллюстрация разделяющей способности градиентной ВЭЖХ по отношению к ПСП приведена на рис. 4.

Рис. 4. Хроматограмма смеси ПСП.

Колонка: 2x75 мм; Nucleosil 100-5 С18. Элюент А: 0.2 М LiC104-H3P04, рН 3. Элюент Б: ACN. Градиент: 2000 мкл от 10 до 30% Б. Р=150 мкл/мин. i=55°C Х.=2Ю, 220,230, 240 нм. Проба: 2 мкл стандартного раствора-1- гексамидин; 2- фенобарбитал; 3 - ламиктал; 4- дифенин; 5- карбамазепин; 6- клоназепам.

При мониторинге метотрексата и циклоспорина А градиентный режим применяли для повышения чувствительности их определения. Она повышалась примерно в 3 раза для метотрексата (рис. 5) и в 2 раза для циклоспорина А.

1~ д" Рис. 5. Хроматограммы мето-

3 " трексата при изократическом (I)

и градиентном (II) элюировании.

Колонка: 2x75 мм;

2- Nucleosil 100-5 С18.

д Я Элюенты: А- 0.2М LiC104 - Н3Р04,

' в20 ■ 1 ___рНЗ; Б- MeCN.

д310 it Подвижные фазы:

---Я--,-_--1-10% Б;

• _A__„_ »И- градиент: 2200 мкл от 5% до

А Л 20% Б; 500 мкл 20% Б

0 ——-1\- г^Г" . ... --F=150 мкл/мин. /=40°С.

1 I 1 Г'" I 1 I 1 I 1 I • I 1 I 1 I 1 I Проба: 2 мкл водного раствора

0 6 12 0 6 12 мин метотрексата (0,5 мг/мл).

5. Выбор длин волн при фотометрическом детектировании JIB.

Длину волны детектирования определяли, исходя из УФ-спектра JIB. Чаще всего такой длиной волны являлась длина волны, соответствующая Х.макс раствора вещества или близкая к ней. Вальпроевая кислота не поглощает в УФ-области спектра. Ее анализировали в виде УФ-поглощающего производного -иора-бромфенацилбромида.

Для повышения надежности идентификации веществ применяли многоволновое детектирование. Идентификацию проводили по спектральным отношениям (отношения площадей пиков при разных длинах волн), вычисляемые с помощью программы "МультиХром" (ЗАО "Амперсенд", г.Москва).

I Аз20 I II

А3,о ■

Азоо Д -

Агво А

' I ' Г ' I ' I ' I И ■ I ' I ' I ■ I ' I

о 6 12 о 6 12 мин

В тех случаях, когда определяли ЛВ, поглощающие в длинноволновой области УФ-спектра, то элюат детектировали при "длинных" X, так как это позволяло минимизировать мешающее влияние эндогенных соединений крови. Детектирование клоназепама при Х=310нм позволяет уменьшить мешающее влияние карбамазепина в случае комплексной терапии.

Таблица 3. Длины волн максимального поглощения и детектирования ЛВ.

Растворитель - элюент (МеСЫ-0,2 М1ЛС104- Н3Р04, рН 3).

ЛВ ^•мах. ИМ ^лет» НМ

Фенобарбитал 194 210, 220, 230, 240

Карбамазепин 214, 284 210, 220, 230, 240

Гексамидин 194 210, 220, 230, 240

Ламиктал 212, 266 210, 220, 230,240

Дифенин 198 210,220, 230,240

Клоназепам 196,310 310, 320,330, 340

Этосуксимид 196 196,200,210, 220

Вальпроевая кислота 200, 256 250,260,270, 280

Циклоспорин А 200 200,204,210,214

Метотрексат 202,304 280,300,310, 320

Целесообразность привлечения спектральных отношений для идентификации вещества видно на примере циклоспорина А, пик которого плохо отделяется от веществ крови (рис. 6).

Рис. 6. Хроматограмма экстракта сыворотки крови пациента, принимающего циклоспорин А (200 мг/сутки).

Колонка: 2x75 мм; Nucleosil 100-5 С18. Элюентьг А- 0.2 М LiC104 - Н3РО4, рН 3; Б- MeCN. Градиент. 2500 мкл от 50% Б до 80% Б, 1000 мкл 80% Б. F= 150 мкл/мин. /=70°с.0бъем пробы- 100 мкл. Концентрация циклоспорина А в сыворотке составила 98±10 мкг/мл.

Сравнение спектральных отношений 52о4^2оо и -^>210^200, вычисленных для пиков циклоспорина А в стандарте и в пробе приведены ниже:

Спектральные отношения. ^204^200 Згю^гоо

Циклоспорин А (проба) 0,918 0,626

Циклоспорин А (стандарт) 0,938 0,658

6. Температура колонки.

В практике ТЛМ ВЭЖХ-анализ проводят, как правило, при комнатной температуре, видимо, "экономя" на термостате колонки. Однако, термостатиро-вание колонки необходимо не только для лучшей воспроизводимости времен удерживания пиков, но и для решения проблем, связанных с разделением пиков ЛВ, применяемых при комплексной терапии. Так, на рис. 7 показано изменение селективности хроматографической системы при нагревании колонки от 35 до 55°С для пар ПСП "ламиктал-фенобарбитал" "дифенин-карбамазепин".

1.3-

§ о

X X

л I 1 2 -

I 8 '

I

' 5 о

130 40 50 60 Температура, °С

Рис. 8. Влияние температуры колонки на селективность разделения.

1- "ламиктал-фенобарбитал"; 2- "дифенин-карбамазепин".

Нагрев колонки до 70°С имеет решающее значение для определения циклоспорина А. При более низких температурах он элюируется несимметричным пиком (рис. 9).

е=40°С

11 ■ ) ■ т

И

1=50°С

» Г • I ■ I

III

«=60°С

1л-

т-г

IV

1=70°С

I 1 I ■ 8 12 мин

Рис. 9. Хроматограммы циклоспорина А (Меога1) при разных температурах. Условия разделения в подписи к рис. 6.

7. Подготовка образца сыворотки крови.

Подготовка образца крови для TJIM методом ВЭЖХ является важнейшей процедурой, с одной стороны, во многом определяющей правильность получаемых результатов, а с другой - время "жизни" колонки. Последнее связано с проблемой удаления из сыворотки крови липидов и белков.

Липиды, сорбируясь на фазе С ¡8, уменьшают емкость колонки. Полное удаление их из колонки возможно лишь только при промывке ее такими растворителями, как ацетон, гексан, хлороформ, что, как правило, неудобно Предварительная обработка пробы гексаном позволяет удалить часть таких соединений Нами показано, что гексан извлекает из 1 мл сыворотки крови в нейтральной среде (сыворотка:гексан=1:5; рНсь„ = 7) от 0,8 до 1,2 мг липидов. Это составляет 10-20 % от их общего количества.

Более полное извлечение липидов возможно при экстракции гексаном из кислой среды (рН2) после осаждения белков ацетонитрилом. Такой прием используется, например, при определении циклоспорина А в сыворотке крови.

На рис. 10 приведены хроматограммы сыворотки крови после осаждения белков ацетонитрилом без обработки гексаном (I) и после экстракции гексаном из нейтральной (II) и кислой среды (III).

08

0.6

04-

02-

0-

I

W

Агоо

II

Wl

п

III

I ■ I ■ I ■ I' ■ I ■ I ■ I' I ■ ■ I' I' I ■ I >

8 16 0 8 16 0 8 16 Время, мин

Рис. 10. Хроматограммы сыворотки после разных способах обработки пробы. I- без обработки;

П- после экстракции гексаном, рН 7; III- после экстракции гексаном, рН 2.

Колонка: 2x75 MM;Nucleosil 100-5 С18 Элюент А: 0.2 М LiC104-H3P04, рН 3. Элюент Б: ACN. Градиент: 2500 мкл от 50 до 80% Б; 1000 мкл 100% Б. F=150 мкл/мин. г=70°С. ¿.=200 нм. Проба: 100 мкл сыворотки.

Более высокое оптическое поглощение элюата на рис 10(1) и (II) в области 6-18 мин свидетельствует о большей концентрации УФ-поглощающих гидрофобных соединений в хроматографируемом образце.

Белки, прису1ствующие в большом количестве в сыворотке крови, чаще всего в ТЛМ осаждаю!, используя, например, ацетонитрил при различных

соотношениях "ацетонитрил-сыворотка". В нашей работе мы выбрали соотношение "ацетонитрил-сыворотка"=1:1, так как при увеличении соотношения до 2:1 степень осаждения белка возрастает незначительно, а меньшее соотношение "ацетонитрил-сыворотка" ведет к меньшему разбавлению пробы и позволяет вводить пробу из растворителя с более высокой полярностью, что обеспечивает лучшую эффективность разделения.

При осаждении белков важным параметром является консистенция образующегося осадка, который требуется отделить от раствора. Для получения после центрифугирования достаточно уплотненного осадка мы использовали раствор перхлората лития в ацетонитриле, содержащий 1% уксусной кислоты. При выборе концентрации перхлората лития критерием уплотненности осадка была прозрачность надосадочной жидкости при слабом встряхивании центрифужной пробирки. Экспериментальные данные приведены в таблице 9.

Таблица 4. Зависимость консистенции осадка от концентрации 1ЛС1С>4.

Концентрация 1лСЮ4 в пробе, М Консистенция осадка

0.5 Плотный

0.4 Плотный

0.3 Плотный

0.2 Рыхлый

0.1 Рыхлый

При мониторинге кпоназепама, концентрация которого в сыворотке крови мала и составляет 40-70 нг/мл, требуется стадия предварительного концентрирования, например, экстракция хлористым метиленом. Ее проводили после удаления из сыворотки липидов. Степень извлечения клоназепама (50 нг/мл) из сыворотки при двукратной экстракции и соотношении сыворотка:экстрагенг=1:1 составила в среднем 99%. Подобным же образом экстрагировали из сыворотки циклоспорин А, но после осаждения белков.

Разработанные нами процедуры подготовки сыворотки для определения ЛВ методом ОФ ВЭЖХ, несмотря на свою простоту, обеспечивают проведение на одной колонке более 400 анализов без существенного уменьшения ее эффективности и заметного увеличения ее гидродинамического сопротивления.

Примеры определения лекарственных веществ в сыворотке крови пациентов приведены на рис. 11-17.

^ЛД Д220 1

—¿S------JU^.

I- Л___ А2<0 .

1 I ' I 1—I—1—г

" ll^^A-JuJL--Ä-

m

ФБ

—р-.11111— О 4 в 12 16 МИН

II

"Г—1—| I | г |

Г

ФБ IV

1—I—I—I—I—I—г

4 8 12 16 мин

Рис. 11. Определение фенобарбитала (ФБ) в сыворотке крови. I- холостая проба; И- Сфб=5,8 мкг/мл;

III- Сфб=22 мкг/мл;

IV-C®b=33 мкг/мл.

Колонка: 2x75 мм; Nucleosil 100-5 С18. Элюенты: А- 0.2М LiC104-H3P04, рНЗ; Б: ACN. Градиент: 2000 мкл от 10% Б до 30% Б, 1000 мкл 30% Б. F=150 мкл/мин. /=40°С. Х=210, 220, 230, 240 им. Проба: 2 мкл обработанной сыворотки крови.

Время, мин

Рис. 12. Определение этосуксимида в сыворотке.

Концентрация этосуксимида в исходной сыворотке 28 мкг/мл.

Колонка: 2x75 мм; Ыис1еоз11 100-5 С18. Элюент А: 0.2 М 1лСЮ4-Н3Р04, рН 3. Элюент Б: АСЫ. Подвижная фаза- 10% Б. /М50 мкл/мин /=40°С. Проба: 2 мкл

Часть из этих хроматограмм являются примером использования ВЭЖХ при комплексной терапии. На рис. 13 приведена хроматограмма обработанной сыворотки пациента, проходящего лечение гексамидином. В организме гексамидин медленно превращается в фенобарбитал. На практике мониторинг гексамидина часто ведут только по концентрации фенобарбитала, так как фенобарбитал обладает большей противосудорожной активностью по сравнению с гексамидином. Мониторинг фенобарбитала основан, как правило, на иммунологических методах. ВЭЖХ позволяет одновременно определять как исходный гексамидин, так и его активный метаболит - фенобарбитал.

Рис. 13. Хроматограмма обработанной сыворотки крови пациента, принимающего лечение гексамидином.

1 - гексамидин (2,9±0,2 мкг/мл);

2 - фенобарбитал (36±2 мкг/мл).

Условия разделения как на рис. 11 Проба: 5 мкл обработанной сыворотки крови.

Рис. 14. Хроматограмма сыворотки пациента при комплексной терапии. Суточная доза: гексамидин - 400 мг, ламиктал - 50 мг, карбамазепин — 600 мг.

Условия разделения как на рис. 11. /=55°С. Проба: 5 мкл обработанной сыворотки крови.

1- гексамидин (14,7±0,7 мкг/мл);

2- фенобарбитал (21±1 мкг/мл);

3- ламиктал (1,8±0,2 мкг/мл);

4- карбамазепин (8,0±0,4 мкг/мл).

Рис. 15. Хроматограмма сыворотки пациента при комплексной терапии. Суточная доза: фенобарбитал - 100 мг, дифенин - 100 мг, карбамазепин - 1 г.

Условия разделения как на рис. 11. <=55°С. Проба: 5 мкл обработанной сыворотки крови.

1- фенобарбитал (19±1 мкг/мл);

2- дифенин (1,9±0,2 мкг/мл);

3- карбамазепин (7,4±0,4 мкг/мл).

Рис. 16. Определение клоназепама в сыворотке.

I- экстракт стандартного раствора

II- и III- экстракты сывороток пациентов, принимающего и не принимающего карбамазепин и клоназепам.

Условия разделения как на рис. 11. А.=310, 320,330, 340 нм. Проба: 20 мкл.

1- карбамазепин (6,4±0,4 мкг/мл)

2- клоназепам (25±5 нг/мл).

Рис. 17. Определение вальпроевой кислоты (ВК) в экстракте сыворотки в виде пара-

бромфенацилового эфира (1). Концентрация ВК в сыворотке 67±8 мкг/мл.

Колонка: 2 х 75 мм; Nucleosil 100-5 С18. Элюенты: А- 0.2 М L1CIO4 - Н3Р04, pH 3; Б-MeCN. Подвижная фаза: 65% Б. F=150 мкл/мин. f=40°C. Х=250,260, 270 и 280 нм. Объем пробы. 5 мкл

На рис. 18 приведена зависимость концентрации метотрексата от времени в образцах крови пациента, проходящего лечение по стандартной схеме. Максимальная концентрация метотрексата в процессе инфузии достигает 13 мкМ, а через 6 часов после окончания инфузии составляет 0,1 мкМ (точка "42 час"). Быстрое снижение концентрации MTX в образцах крови после окончания инфузии свидетельствует о нормальной скорости его выведения из организма. Тем, не менее, концентрация 0,1 мкМ высока и пациенту был введен лейковорин (антидот MTX) При следующей инфузии доза MTX была снижена на 10%, т.к. ранее было отмечено, что при снижении дозы на 10 % концентрация MTX в крови в процессе инфузии снижается в 3-5 раз. Концентрация MTX в образцах крови данного пациента в процессе инфузии не превышала 4 мкМ, а через 6 часов после окончания инфузии составила 0,02 мкМ.

Рис 18. Изменение концентрации MTX в сыворотке крови пациента в процессе лечения высокими дозами MTX.

По разработанной методике был проведен мониторинг 30 пациентов онко-

гематологического отделения Областной Государственной детской клинической

больницы г Иркутска, проходящих лечение высокими дозами MTX (рис 19) Отмечено, что около 75% пациентов нуждаются в изменении "стандартной" схемы лечения.

Рис. 19. Максимальная найденная концентрация метотрексата в крови пациентов в процессе инфузии при дозе MTX 1000 мг/м2.

Разработанные методики для мониторинга противосудорожных препаратов были использованы для определения их в сыворотке крови более 700 пациентов, проходящих лечение в Иркутской Государственной Областной детской клинической больнице. Результаты исследований использованы для выбора и коррекции доз лекарственных препаратов в процессе курсового лечения, выбора временных интервалов приема препарата. По данным мониторинга за 1997-2003 гг. около 25% пациентов, проходящих лечение в Областной Государственной детской клинической больнице г. Иркутска с диагнозом "эпилепсия" требуют изменения "стандартных" доз лекарственных препаратов.

ВЫВОДЫ.

1 Разработана и оптимизирована унифицированная ВЭЖХ-методика для определения концентрации этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама, депакина, метотрексата и циклоспорина А в сыворотке крови Ее основными особенностями являются:

- колонка: 0 2x75 мм с сорбентом Nucleosil 100-5 С18;

- элюенты: 0,2 М перхлорат лития (рН 3, Н3РО4) и ацетонитрил;

- многоволновое фотометрирование в УФ области спектра;

- продолжительность анализа: 10-15 мин.

Методика позволяет осуществлять лекарственный терапевтический мониторинг противосудорожных препаратов при проведении как moho-, так и комплексной терапии.

2. Разработана методика подготовки проб сыворотки крови для лекарственного терапевтического мониторинга этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата путем их прямого определения с помощью ВЭЖХ Методика включает в себя 2 стадии: удаление свободных липидов экстракцией гексаном и осаждение белков добавлением 0,6 М раствора перхлората лития в ацетонитриле (рН 2). Методика подготовки пробы требует не более 50 мкл сыворотки, и позволяет выполнить на одной колонке не менее 400 анализов.

3. Практическая применимость разработанных методик ВЭЖХ-анализа и подготовки проб сыворотки крови для лекарственного терапевтического мониторинга показана на примере мониторинга концентрации противосудорожных препаратов более чем у 700 больных и на примере мониторинга концентрации метотрексата при химиотерапевтическом лечении 30 пациентов

4 Метрологические характеристики разработанных методик анализа удовлетворяют требованиям, принятым для биоаналитических методов Относительное стандартное отклонение не превышает 15% в интервале терапевтических концентраций для всех соединений

Список публикаций.

1. Федорова Г.А., Барам Г.И., Грачев MA , Толмачева О.П., Александров И.А., Стародубцев A.B. Определение лекарственных препаратов в крови методом ВЭЖХ с многоволновым детектированием. // Тезисы Всеросийского симпозиума по теории и практике хроматографии и электрофореза. Москва. 1998.13-17 апреля. С.93.

2. Барам Г И., Федорова Г.А., Грачев М.А., Толмачева О.П., Александров И.А., Стародубцев А.В Определение лекарственных препаратов в крови методом ВЭЖХ. // Материалы V Национального съезда фармацевтов Украины "Достижения современной фармацевтики и перспективы его развития в новом тысячелетии". Харьков. 1999. САН.

3. Кожанова Л А., Барам ГИ, Федорова ГА. Определение во до- и жирорастворимых витаминов в премиксах методом ВЭЖХ. // Тезисы Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов". Москва. 16-21 апреля 2000 г. С.70.

4. Федорова Г.А., Грачев М.А., Барам Г.И., Толмачева О.П., Урсуленко Е.В., Горбачева C.B., Кузьмина Л.А.Применение метода микроколоночной ВЭЖХ для исследования фармакокинетики метотрексата в режиме мониторинга индивидуальных пациентов. // Тезисы VI Конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока". Новосибирск. 21-24 ноября 2000. С.390.

5. Fedorova G.А, Baram G.I., Grachev M.A., Aleksandrov Yu.A., Tyuleneva G.N., Starodubtsev A.V. Application of Micro-Column HPLC to the Determination of Phénobarbital and Carbamazepine in Human Blood Serum. // Chromatographie. 2001. V.53. No.9-10. P.495-497.

6. Стародубцев A.B., Федорова Г.А., Лаврик С.Ю., Рубцова Е.А. Применение методов микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и компьютерной электроэнцефалографии для контроля эффективности лечения больных эпилепсией. // Тезизы VIII Всеросийского съезда неврологов.Казань. 23-24 мая 2001 г. С.408.

7. Кожанова Л.А., Федорова Г.А., Барам Г.И. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Ж. аналит. химии. 2002. Т.57. № 1 С. 49-54.

8. Стародубцев A.B., Федорова Г.А. Применение методов микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии, компьютерной электроэнцефалографии и психофизиологического исследования для контроля эффективности лечения больных эпилепсией. // Тезисы II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН. Новосибирск. 18-19 июня 2002 г. С. 112.

9. Федорова Г.А., Барам Г.И., Стародубцев A.B., Александров Ю.А., ТюленеваГ.И. Определение противосудорожных препаратов в сыворотке крови методом ВЭЖХ. // Тезисы II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН. Новосибирск. 18-19 июня 2002 г. С.85.

Ю.Стародубцев A.B. Федорова Г.А., Рубцова Е.А. Мониторинг функций мозга в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией при лечении

карбамазепинов и вальпроатами больных эпилепсией. // Тезисы X Российского национального конгресса "Человек и лекарство". Москва. 7-11 апреля 2003, г. С.361.

П.Федорова Г.А., Барам Г.И. Применение микроколоночной ВЭЖХ в терапевтическом лекарственном мониторинге. // Тезисы 3 Международного симпозиума "Применение хроматографии в бионауках". Москва. 13-18 мая

2003 г. С. 143.

Подписано к печати 17.12.2003 г. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 259. Издательство Института географии СО РАН | 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

1. ВВЕДЕНИЕ.,.:.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Введение.

2.2. Неподвижные фазы.

2.3. Хроматографические колонки.

2.4. Подвижные фазы.

2.5. Детектирование лекарственных веществ в ОФ ВЭЖХ.!.

2.6. Подготовка пробы.

2.7. Валидация биоаналитических методов.

Актуальность темы. Здравоохранение - одна из главных областей человеческой деятельности, успехи которой прямо и косвенно зависят как от уровня развития аналитической химии в общем, так и от степени внедрения наиболее передовых методов химического анализа в практику. К таким методам относится и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая за последние 30 лет во многом определила заметный прогресс в практической медицине. Важнейшим приложением ВЭЖХ стал терапевтический лекарственный мониторинг, позволяющий оптимизировать индивидуальную дозировку лекарств, которая необходима для предотвращения побочных эффектов и повышения эффективности лечения.

ВЭЖХ как высокочувствительный и универсальный метод анализа, которому во многих случаях нет альтернативы, позволяет одновременно следить за изменением концентрации несколько лекарственных веществ (ЛВ), отличается достаточной точностью и воспроизводимостью. Однако, активное использование ВЭЖХ в повседневной (рутинной) клинической практике ограничено из-за отсутствия унифицированных методик анализа. В настоящее время для определения какого-либо ЛВ применяются своя "уникальная" процедура подготовки пробы и своя методика ВЭЖХ-анализа, которые в каждом конкретном случае предписывают использование разных колонок, разных элюентов и разных детекторов. Очевидно, что эти обстоятельства приводят к необходимости каждый раз изменять хроматографическую систему и калибровать хроматограф, что, в конечном итоге, значительно увеличивает продолжительность всего анализа, требуют высокой квалификации персонала и, наконец, существенно повышают стоимость анализа.

Один из возможных путей решения этой проблемы - разработка максимально унифицированных, экономичных и экспрессных методик подготовки пробы и хроматографических процедур. Реализация такого подхода, очевидно, позволит снизить расходы на проведение анализа и широко внедрить ВЭЖХ в практику лекарственного мониторинга.

Это направление развития ВЭЖХ, безусловно, представляется нам важным и актуальным.

Цель и задачи исследований.

1. Оптимизировать метод ВЭЖХ для задач терапевтического лекарственного мониторинга препаратов в сыворотке крови с целью широкого его внедрения в клиническую практику.

2. Унифицировать и оптимизировать метод ВЭЖХ для определения ряда лекарственных веществ (метотрексат, циклоспоринА, этосуксимид, гексамидин, фенобарбитал, ламиктал, дифенин, карбамазепин, бензонал, клоназепам, депакин), которые являются важнейшими объектами терапевтического лекарственного мониторинга.

3. Унифицировать и оптимизировать процедуру подготовки образцов крови для определения в них методом ВЭЖХ вышеперечисленных препаратов. Определить метрологические характеристики разработанных методик для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для биоаналитических методов.

4 .Апробировать разработанные методики в клинической практике и подтвердить их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

Научная новизна работы представленной работы заключается в следующем:

1. Предложена унифицированная, оптимизированная и экономичная ВЭЖХ-методика для определения этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама и депакина (все -противосудорожные препараты), метотрексата и циклоспорина А, позволяющая хроматографировать все соединения на колонке с обращенно-фазовым сорбентом типа "С 18" при использовании одной и той же двухкомпонентной подвижной фазы.

2. Предложена унифицированная и экономичная методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови методом

ВЭЖХ. Ее отличительная особенность - возможность работы с малыми объемами образцов крови. Методика подготовки образца обеспечивает достаточную степень его очистки от балластных веществ крови и позволяет проводить более 400 анализов противосудорожных препаратов в сыворотке на одной колонке, что существенно повышает экономичность всего метода.

3. Показана пригодность разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХ-анализа для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов (ПСП), метотрексата и циклоспорина А путем апробации в рутинной клинической практике. На примере свыше 700 определений подтверждено соответствие метрологических характеристик разработанных методик требованиям, принятым для биоаналитических методов.

Практическая значимость работы.

Предложенные методики были использованы для терапевтического лекарственного мониторинга ПСП, метотрексата и циклоспорина А в крови пациентов, проходившим лечение в Иркутской Государственной областной детской клинической больнице и в Иркутском Государственном институте усовершенствования врачей в период 1997-2003 гг. Данные мониторинга в сочетании с клиническими показателями были использованы врачами для коррекции доз лекарственных препаратов.

Внедрение разработанных методик для терапевтического лекарственного мониторинга в клиническую практику позволит более обоснованно определять тактику и стратегию лечения, сделав лечение эффективнее и безопаснее.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Оптимизированная ВЭЖХ-методика для определения ПСП, метотрексата и циклоспорина А, которая является экспрессной и экономичной вследствие унификации как условий ВЭЖХ-анализа, так и применения микроколоночного варианта ВЭЖХ. Время анализа составляет 10-15 мин.

2. Методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови, являющаяся простой, экспрессной и экономичной. Объем сыворотки крови для одного определения не превышает 50 мкл. На одной колонке выполняется более 400 анализов ПСП.

3. Результаты апробации разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХ-анализа в рутинной клинической практике, подтверждающие их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

4. Результаты исследования метрологических характеристик разработанных методик анализа, полученные путем обработки экспериментального материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для биоаналитических методов анализов.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на: Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998); Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999); V Национальном Съезде фармацевтов Украины "Достижения современной фармацевтики и перспективы его развития в новом тысячелетии" (Киев, 1999); VI Конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2000" (Новосибирск, 2000); VIII Всеросийском съезде неврологов (Казань, 2001); II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск; 2002); X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", (Москва, 2003); 3-ем Международном симпозиуме по методам разделения в биологических науках (Москва, 2003).

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 137 страницах текста, содержит 23 рисунок, 12 таблиц и 4 приложения. В списке цитируемой литературы 127 наименований.

5. ВЫВОДЫ.

1. Разработана и оптимизирована унифицированная ВЭЖХ-методика для определения концентрации этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама, депакина, метотрексата и циклоспорина А в сыворотке крови. Ее основными особенностями являются: колонка: 0 2x75 мм с сорбентом Nucleosil 100-5 С18; элюенты: 0,2 М перхлорат лития (рН 3, Н3РО4) и ацетонитрил; многоволновое фотометрирование в УФ области спектра; продолжительность анализа: 10-15 мин.

Методика позволяет осуществлять лекарственный терапевтический мониторинг противосудорожных препаратов при проведении как moho-, так и комплексной терапии.

2. Разработана методика подготовки проб сыворотки крови для лекарственного терапевтического мониторинга этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата путем их прямого определения с помощью ВЭЖХ. Методика включает в себя 2 стадии: удаление свободных липидов экстракцией гексаном и осаждение белков добавлением 0,6 М раствора перхлората лития в ацетонитриле (рН 2). Методика подготовки пробы требует не более 50 мкл сыворотки, и позволяет выполнить на одной колонке не менее 400 анализов.

3. Практическая применимость разработанных методик ВЭЖХ-анализа и подготовки проб сыворотки крови для лекарственного терапевтического мониторинга показана на примере мониторинга концентрации противосудорожных препаратов у более, чем 700 больных и на примере мониторинга концентрации метотрексата при химиотерапевтическом лечении 30 пациентов.

4. Метрологические характеристики разработанных методик анализа удовлетворяют требованиям, принятым для биоаналитических методов. Относительное стандартное отклонение не превышает 15% в ^"тервале терапевтических концентраций для всех соединений.

2.8. Заключение.

Обзор литературных данных по ВЭЖХ-анализу лекарственных соединений, рекомендованных для ТЛМ, показывает, что существуют общие подходы к определению JIB в биологических жидкостях.

Подавляющее число определений выполняется на обращенных фазах С18 различных торговых марок, обладающих некоторыми сходными характеристиками (форма и диаметр зерна, размер пор, плотность прививки, эндкеппинг), но существенно различающиеся селективностью.

Различия в селективности используемых сорбентов зачастую обуславливают разнообразие используемых ПФ, хотя достаточно часто применяется бинарная ПФ ацетонитрил-водный буфер (рН 3). Концентрация ацетонитрила в ПФ варьируется в широких пределах, в зависимости от определяемого соединения, так как в TJIM используется обычно изократический режим элюирования.

Детекторы, чаще всего используемые в ТЛМ - УФ-спектрофотометры с перестраиваемой длиной волны. Применение детекторов с многоканальной регистрацией повышает достоверность идентификации пиков, позволяет оценивать их гомогенность, но высокая стоимость таких детекторов ограничивает их применение в рутинном анализе.

Подготовка пробы в ТЛМ зависит от концентрации определяемого ЛВ, его физико-химических свойств. Традиционные методы подготовки пробы включают в себя осаждение белка, ТФЭ или, реже, жидко-жидкостную экстракцию. К современным методам можно отнести применение предколонок, заполненными сорбентами с "ограниченным доступом".

Обращает на себя внимание тот факт, что в ТЛМ практически для каждого ЛВ существует своя методика определения, предполагающая определенный сорбент, определенные элюенты, детектор, методику подготовки пробы. Работ, где в одних условиях определяется несколько различных ЛВ, очень мало, хотя очевидно, что необходимость анализа различных ЛВ в рамках одной лаборатории при большом разнообразии методик ведет к увеличению продолжительности анализа, требует высокой квалификации персонала и, в конечном итоге, существенно повышает стоимость анализа. Эту стоимость можно заметно снизить путем унификации условий подготовки пробы и условий хроматографического разделения, и такой подход для анализа JIB в биологических объектах используется в токсикологическом скрининге, где он обусловлен самой аналитической задачей [91, 92]. Аналогичный подход к определению терапевтических JIB позволил бы широко внедрить этот метод в рутинную практику. Решение этой проблемы представляется нам актуальной задачей.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Оборудование.

В работе использовали микроколоночный жидкостный хроматограф "Милихром А-02" (ЗАО "ЭкоНова", Новосибирск) с колонками 02x75 мм, заполненными сорбентами Nucleosil 100-5 С18, Nucleosil 100-5 С18 РАН, Nucleosil 100-5 С18 АВ и Nucleosil 300-5 С8 (Macherey-Nagel, Германия); Kromasil-100-5-С18 , Kromasil-100-5-С8 и Kromasil-100-5-C4 ("ЕКА Chemicals" (Швеция).

Центрифуга ОС-6МУХЛ (6000 об./мин), рН метр-иономер И-120.2.

3.2. Материалы.

В качестве стандартных (контрольных) веществ были использованы фармацевтические субстанции JIB, содержание основного вещества в которых не ниже 98%.

В качестве реагента для модификации вальпроевой кислоты использован п-бромфенацил бромистый ("Sigma", США).

Для приготовления элюентов и обработки проб использованы: ацетонитрил (сорт 1) и гексан фирмы "Криохром" (Санкт-Петербург); трифторуксусная кислота ("Sigma", США), уксусная кислота, фосфорная кислота, перхлорат лития квалификации не ниже "х.ч". Хлористый метилен, метанол и триэтиламин были перегнаны перед использованием. Дистиллированная вода была дополнительно очищена с помощью системы "Norganic, Millipore Corporation" (США).

3.3. Методы

3.3.1. Условия хроматографического определения JIB.

Элюенты и режимы элюирования. В качестве элюента А использовали 0,2 М LiC104 - Н3РО4 (рН 3); элюент Б - MeCN. При определении индивидуальных противосудорожных препаратов (ПСП) использовали изократическое элюирование. Содержание ацетонитрила в ПФ для каждого из определяемых соединений приведено в Главе 4 (п. 4.3). При определении двух и более ПСП применяли градиентное элюирование: 2000 мкл от 10 до 30% Б; 1000 мкл 30% Б.

При определении метотрексата применяли следующий режим градиентного элюирования: 2200 мкл от 5 до 20% Б; 1000 мкл 20% Б.

Циклоспорин А определяли при градиентном элюировании: 2500 мкл от 50 до 80% Б; 1000 мкл 80% Б.

Скорость потока элюента при всех режимах была 150 мкл/мин.

Длины волн детектирования для каждого из определяемых соединений приведены в Главе 4 (п. 4.4.1)

Температура колонки. При определении циклоспорина А температура колонки в процессе разделения была 70°С; при совместном присутствии в пробе дифенина и карбамазепина - 55°С; во всех остальных случаях - 40°С.

Запись УФ-спектров. Для записи УФ-спектров готовили стандартные растворы определяемых соединений с концентрацией 0,2 мг/мл. В качестве растворителей для приготовления стандартных растворов использовали: метанол (гексамидин, фенобарбитал, ламиктал, дифенин, карбамазепин); воду (этосуксимид, метотрексат); смесь ацетонитрил - вода (циклоспорин А); нейтрализованный реакционный раствор (яара-бромфенациловый эфир вальпроевой кислоты). Спектры записывали во время хроматографического анализа после остановки потока вблизи максимума пика (интервал длин волн 190 - 360 нм, шаг 2 нм).

3.3.2. Отбор и хранение проб крови.

Для определения максимального содержания ПСП кровь из локтевой вены отбирали через 1,5-2 часа после утреннего приема препарата или в течение суток в заданное время. Для определения минимальной концентрации циклоспорина А кровь из локтевой вены отбирали за 1-2 часа до утреннего приема препарата. Для определения содержания метотрексата пробы крови отбирали через подключичный катетер через установленные интервалы времени после начала инфузии метотрексата (9 проб в процессе инфузии и 9-11 проб после ее окончания).

После добавления к цельной крови 1 капли раствора гепарина, плазму отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоту плазмы анализировали или хранили при - 20°С до анализа.

3.3.3. Удаление липидов из сыворотки крови.

Отделение наиболее гидрофобных соединений сыворотки крови (липидов) от целевых компонентов проводили экстракцией гексаном, для чего к сыворотке крови добавляли гексан в соотношении 1:5 по объему, встряхивали в течение 5 мин, центрифугировали для разделения слоев, гексановый слой отбрасывали, а сыворотку использовали для дальнейшей работы.

3.3.4. Удаление белков из сыворотки крови.

После отделения удаления липидов к сыворотке крови добавляли 0,6 М раствор перхлората лития в ацетонитриле, содержащем 1% уксусной кислоты, в соотношении 1:1 по объему, центрифугировали и верхний слой (супернатант) использовали для работы.

3.3.5. Подготовка пробы сыворотки крови для определения гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата.

В пробирку вносили 120 мкл сыворотки крови и проводили обработку в соответствии с п. 3.3.3. В две пробирки помещали по 50 мкл обработанной сыворотки и осаждали белки в соответствии с п. 3.3.4. Аликвоту супернатанта (520 мкл) инжектировали в колонку. 3.3.6. Подготовка пробы для определения этосуксимида.

В пробирку вносили 200 мкл сыворотки крови, содержащей этосуксимид и обрабатывали в соответствии с п. 3.3.3. В две пробирки помещали по 80 мкл обработанной сыворотки и осаждали белки в соответствии с п. 3.3.4. Аликвоту супернатанта (2 мкл) инжектировали в колонку. Если концентрация этосуксимида в исходной сыворотке была ниже 3,3 мкг/мл, то в каждую пробирку, содержащую супернатант, добавляли по 200 мкл хлористого метилена для экстракции российская государственная библиотека ацетонитрила, встряхивали и после разделения слоев 2-10 мкл верхнего раствора инжектировали в колонку.

3.3.7. Подготовка пробы для определения вальпроевой кислоты.

Вальпроевую кислоту в сыворотке крови определяли в виде пара-бромфенацилового эфира, методика получения которого была любезно предоставлена Г.Г.Шамовским (ЗАО "ЭкоНова", Новосибирск). Подготовка пробы проводилась следующим образом: для удаления липидов к 200 мкл сыворотки крови добавляли 1 мл гексана, встряхивали 5 мин и гексановый слой отбрасывали. Для экстракции вальпроевой кислоты к оставшемуся водному слою добавляли 200 мкл 2 М водного раствора Н3РО4, 1 мл гексана, встряхивали 5 мин и разделяли слои центрифугированием. 500 мкл верхнего гексанового слоя переносили в другую пробирку и упаривали досуха в токе аргона. Для получения пара-бромфенацилового эфира к остатку приливали 400 мкл раствора пара-бромфенацила бромистого в ацетонитриле (5 мг/мл), 20 мкл раствора триэтиламина в ацетонитриле (28 мг/мл) и выдерживали при комнатной температуре 1 час. К пробе добавляли 10 мкл 2 М водного раствора Н3РО4 и хроматографировали. Производное стабильно не менее суток.

3.3.8. Подготовка пробы для определения клоназепама.

К 1,1 мл сыворотки крови, содержащей клоназепам, добавляли 5 мл гексана для удаления липидов. 1 мл обработанной сыворотки переносили в другую пробирку. Клоназепам экстрагировали из обработанной сыворотки следующим образом: к 1 мл сыворотки добавляли 50 мкл 2 М водного раствора КОН и 1 мл хлористого метилена, встряхивали 5 мин и отделяли нижний слой раствора, содержащий клоназепам. К оставшемуся водному раствору добавляли еще 1 мл хлористого метилена, повторяли экстракцию, экстракты объединяли и упаривали досуха в токе аргона. Остаток растворяли в 50 мкл раствора ацетонтрил-вода (1:1) и 20 мкл этого раствора инжектировали в колонку.

3.3.9. Подготовка пробы для определения циклоспорина А.

Из 1,2 мл сыворотки крови удаляли белок в соответствии с п. 3.3.4. После этого 2,2 мл супернатанта помещали в пробирку, добавляли 2,2 мл хлористого метилена, энергично встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали для разделения слоев. Верхний (водный) слой удаляли, в другую пробирку переносили аликвоту нижнего слоя (хлористый метилен-ацетонитрил) объемом 3 мл и упаривали досуха в токе аргона при 40°С. Для экстракции липидов остаток растворяли в 140 мкл 50%-ного водного ацетонитрила, содержащем 1% трифторуксусной кислоты, добавляли 1 мл гексана и встряхивали 5 мин. После разделения слоев 100 мкл нижнего слоя (вода-ацетонитрил) инжектировали в колонку.

3.3.10. Оценка степени извлечения из сыворотки крови клоназепама и циклоспорина А.

Степень извлечения клоназепама и циклоспорина А из сыворотки оценивали путем добавки известных количеств этих соединений в образцы донорской сыворотки. Пробы с добавкой обрабатывали в соответствии с методиками. Степень извлечения рассчитывали как отношение площадей пиков веществ на хроматограммах экстракта сыворотки и стандартного раствора.

3.3.11. Определение градуировочных зависимостей для JIB.

Градуировочные растворы для всех определяемых JIB готовили путем добавления 10 мкл стандартных растворов этих JIB с подходящей концентрацией к 200-4000 мкл донорской сыворотки. Далее пробы обрабатывались в соответствии с методиками. Градуировочная зависимость для каждого определяемого JIB получена для пяти концентраций (п=10).

3.3.12. Оценка селективности и специфичности методик анализа.

Влияние эндогенных компонентов сыворотки крови для каждого определяемого ЛВ оценивали путем анализа 10 различных образцов сыворотки крови как доноров, так и пациентов, не принимающих этот препарат.

Оценку селективности разработанных ВЭЖХ-методик (включая подготовку пробы) выполняли для каждого определяемого противосудорожного препарата путем добавок других ПЭП, используемых при проведении комплексной терапии.

3.3.13. Оценка метрологических характеристик методик анализа.

Предел обнаружения (ПрО) для каждого определяемого вещества рассчитывали как минимальную концентрацию этого соединения в исходной сыворотке крови, для которой отношение "сигнал/шум" в инжектируемой пробе равно 3. Относительное стандартное отклонение и отклонение от номинального значения при этом были менее 20%.

Предел количественного определения рассчитывали как концентрацию определяемого соединения в исходной сыворотке, для которой отношение "сигнал/шум" в инжектируемой пробе равно 10. Относительное стандартное отклонение и отклонение от номинального значения при этом были менее 15%.

Оценку воспроизводимости во всем интервале определяемых концентраций для определяемых соединений выполняли, используя реальные или модельные образцы, приготовленные на основе донорской сыворотки (п=10).

Правильность метода оценивали методом добавок при количестве параллельных определений для каждой концентрации не менее 5.

Линейность метода для каждого ЛВ оценивали в интервале рабочих концентраций.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Выбор масштаба ВЭЖХ.

Как было нами отмечено в Главе 2, длина хроматографических колонок, используемых в ТЛМ, варьируется от 100 до 250 мм, а их внутренний диаметр составляет 4,0-4,6 мм. При этом в настоящее время около 50% разделений в TJIM выполняется на колонках длиной 100-150 мм. Применение коротких колонок -один из возможных путей снижения стоимости анализа за счет сокращения его длительности и уменьшения расхода ПФ [16-18]. Уменьшение диаметра колонки при сохранении нагрузки на сорбент приводит к повышению чувствительности анализа, что, в свою очередь, снижает требования к чистоте растворителей [18]. Очевидно, что одновременное уменьшение длины и диаметра колонки по сравнению со "стандартной" колонкой позволяет получить существенные выгоды [17]. Простой расчет показывает, что применение колонки размером 02x75 мм взамен традиционной (04,6x250 мм) в 10-20 раз снижает расход растворителей и во столько же раз повышает чувствительность определения.

ВЭЖХ на колонках 02x75 мм мы считаем оптимальным масштабом для целей TJIM. Дальнейшее уменьшение колонки до размеров капиллярной представляется нецелесообразным, так как ее нельзя использовать в сочетании со стандартным аналитическим хроматографическим оборудованием (инжекторы, насосы, ячейка детектора), оборудование, специально разработанное для капиллярной ВЭЖХ, пока слишком дорого и поэтому мало пригодно для рутинного анализа. Отметим также, что выигрыш в чувствительности определения и экономия растворителей при переходе от колонок диаметром 2 мм к колонкам диаметром 1 мм и менее, становятся уже не такими заметными.

4.2. Выбор неподвижной фазы.

Для определения лекарственных веществ в TJIM используются обращенные фазы С8 и С18 различных торговых марок, синтезированные на основе силикагеля. Известно, что практически все ОФ, даже при условии "одинаковости" их нормируемых характеристик, могут существенно различаться по селективности.

Для оценки пригодности конкретных ОФ нами совместно с М.О.Родинко и И.Н.Азаровой было исследовано 7 сорбентов (частицы сферической формы с диаметром 5 мкм), некоторые характеристики которых приведены в таблице 3.

1. Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований. Приказ МЗ РФ от 21 февр. 2000 г. № 64 // Рос. газ.-2000.

2. Regenthal R., Krueger М., Koeppel С., Preiss R. Drug levels: Therapeutic and toxic serum/plasma concentrations of common drugs. // J. Clin. Monit. 1999. V. 15. P. 529-544.

3. Przybyclel M., Majors R.E. Phase Collapse in Reversed-Phase LC. // LC GC Europe, 2002. № 10. P. 2-5.

4. Nagae N., Enami Т., Doshi S. The Retention Behavior of Reversed-Phase HPLC Columns with 100% Aqueous Mobile Phase. // LC GC North America, 2002.1. V. 20. № 10. P. 964-972.

5. Kobayashi S., Tanaka I., Shirota O., Kanda Т., Ohtsu Y. Synthesis and characterization of a polymer-coated С is stationary phase with high carbon content for liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 828. P. 75-81.

6. Fairbank R.W.P., Wirth M.J. Role of surface-adsorbed water in the horizontal polymerization of trichlorosilanes. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 830. P. 285-291.

7. Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Airoldi C. Development of new urea-functionalized silica stationary phases. Characterization and chromatographic performance. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 913. P. 65-73.

8. Layne J. Characterization and comparison of the chromatographic performance of conventional, polar-embedded, and polar-endcapped reversed-phase liquid chromatography stationary phases. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 957. P. 149-164.

9. Kirkland J.J., Van Straten M.A., Claessens H.A. Reversed-phase highperformance liquid chromatography of basic compounds at pH 11 with silica-based column packings. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 797. P. 111-120.

10. Wilson N.S., Nelson M.D., Dolan J.W., Snyder L.R., Wolcott R.G., P.W. Carr. Column selectivity in reversed-phase liquid chromatography. A general quantitative relationship. //J. Chromatogr. A. 2002. V. 961. P. 171-193.

11. Vervoort R.G.M., Debets A.J .J., Claessens H.A., Cramers C.A., De Jong G.J. Optimisation and characterisation of silica-based reversed-phase liquid chromatographic systems for the analysis of basic pharmaceuticals. //

12. J. Chromatogr. A. 2000. V. 897. P. 1-22.

13. Vervoort R.J.M., Derksen M.W.J., Maris F.A Selection of stationary phases for the liquid chromatographic analysis of basic compounds using chemometrical methods. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 678. P. 1-15.