автореферат диссертации по технологии, машинам и оборудованию лесозаготовок, лесного хозяйства, деревопереработки и химической переработки биомассы дерева, 05.21.03, диссертация на тему:Окисление лигнинных веществ в присутствии катализатора - пероксидазы из корней хрена

На правах рукописи

004600790

АЙЗЕНШТАДТ Мария Аркадьевна

ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИННЫХ ВЕЩЕСТВ В ПРИСУТСТВИИ КАТАЛИЗАТОРА - ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА

05.21.03 - технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 5 АПР 2910

Архангельск 2010

004600790

Работа выполнена на кафедре теоретической и прикладной химии Архангельского государственного технического университета

Научный руководитель - заслуженный деятель науки РФ,

доктор химических наук, профессор Боголицын К.Г.

Консультант - доктор химических наук,

профессор Шеховцова Т.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Хабаров Ю.Г.;

кандидат химических наук Синицына O.A.

Ведущая организация ОАО « Всероссийский научно - исследовательский институт целлюлозно - бумажной промышленности (ВНИИБ)»

Защита диссертации состоится «20» апреля 2010 г., в 10 - часов на заседании диссертационного совета Д.212.008.02 в Архангельском государственном техническом университете (163002, г. Архангельск, набережная Северной Двины, 17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Архангельского государственного технического университета.

Автореферат разослан « // » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, кандидат химических наук, доцент ¿¿t/urf*^ Т.Э. Скребец

Общая характеристика работы Актуальность темы

Одними из основных компонентов технологических сред целлюлозно-бумажных предприятий (ЦБП) являются лигнинные вещества, представляющие собой группу родственных высокомолекулярных соединений ароматической природы. Они не относятся к опасным токсичным соединениям, однако, при попадании в природный водоем группа конденсированных и малотрансформируемых лигнинных веществ склонна к накоплению и образованию опасных для здоровья и жизни компонентов. Таким образом, актуальными задачами химической технологии древесины являются поиск и создание новых экологически чистых способов химической переработки лигносодержащих материалов и совершенствование системы производственного экологического контроля путем разработки и внедрения новых высокочувствительных, информативных и экспрессных методов анализа.

В соответствии с «Перечнем приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в РФ» и «Перечнем критических технологий РФ» по направлению «Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии», перспективным для решения указанных задач является использование ферментативных систем; создание новых высокоэффективных, стабильных и специфичных биокатализаторов и разработка на их основе ферментативных методов делигнификации и анализа технологических растворов.

Большой интерес в связи с этим вызывают ферменты класса оксидо-редуктаз, а именно пероксидазы. Этот класс широко применяется для контроля примесей в объектах пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности, в мониторинге окружающей среды, для решения некоторых медицинских и биохимических задач. Кроме того, в литературе представлены сведения о возможности применения пероксидаз в ЦБП, а именно в процессе делигнификации древесины, так как одной из основных биологических функций этих ферментов является окисление фенольных соединений и участие в процессе биосинтеза веществ лигнинной природы.

Цель диссертационной работы - установление основных закономерностей окисления лигнинных веществ в водной среде в присутствии катализатора - пероксидазы из корней хрена.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

1) исследовать основные закономерности протекания процесса пероксидаз-ного окисления модельных соединений структурного звена лигнина в водной среде;

2) определить оптимальные условия проведения процесса пероксидазного окисления модельных соединений лигнина гваяцильного ряда в водной среде;

3) изучить влияние природы, функционального состава и полимолекулярных свойств препаратов лигнина на эффективность их пероксидазного окисления;

4) разработать схему механизма и кинетическую модель процесса ферментативного окисления лигнинных веществ.

Работа выполнена в рамках гранта Министерства науки и образования Российской Федерации, Федерального агентства по науке и инновациям (Государственный контракт № 02.444.11.7036) и гранта Администрации Архангельской области по поддержке научно-исследовательской работы молодых ученых (Проект № 04-04).

Научная новизна

Установлены основные закономерности пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда в водной среде (влияние рН раствора, концентрации катализатора, концентрации субстрата-окислителя, концентрации субстрата-восстановителя); показано, что основным реакционным центром, участвующим в редокс - превращениях структурных единиц лигнина, является фенольный гидроксил.

Экспериментально определены кинетические параметры (КШЭф, Ущэф, кЭфф, км,, кем/ Кшэф) позволяющие расположить модельные соединения лигнина по способности к пероксидазному окислению в следующий ряд: гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.

Показано, что полимолекулярные свойства и форма макромолекул лигнина являются важными факторами процесса биохимического окисления.

Теоретически обоснована и экспериментально доказана применимость модели неупорядоченного присоединения субстратов по типу Random Bi Uni для интерпретации процесса пероксидазного окисления лигнинных веществ в широком диапазоне концентраций.

Практическая ценность

Получены новые данные (кинетическое описание процесса, модель и схема механизма пероксидазного окисления соединений структурного звена лигнина), создающие необходимую теоретическую основу для разработки эффективных биокаталитических систем, применимых в сфере эко-лого-аналитического контроля.

Определены и обоснованы оптимальные условия пероксидазного окисления соединений фенольного ряда (гваякола, феруловой кислоты, ацетованилона, ванилинового спирта) в водной среде.

На защиту выносятся

• Основные закономерности пероксидазного окисления лигнинных веществ в водной среде на основе результатов исследования влияния рН

раствора, концентрации окисляемого вещества, окислителя и катализатора на кинетику процесса.

• Схема механизма и кинетическая модель процесса пероксидазного окисления соединений фенольного ряда пероксидом водорода в водной среде.

• Обоснование влияния электроноакцепторных свойств пара - заместителей на активность фенольного реакционного центра структурных единиц лигнина в процессах пероксидазного окисления.

• Обоснование влияния полимолекулярных свойств и формы макромолекул лигнина на процесс их биохимического окисления.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы докладывались и получили положительную оценку на международных конференциях «Аналитика России 2007» (Краснодар, 2007 г.); «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008 г.); «Северные территории России: проблемы и перспективы развития» (Архангельск, 2008 г.); «10th European Workshop on Lignocellulosics and Pulp «EWLP 2008» (Stockholm, Sweden, 2008); «Физикохимия лигнина» (Архангельск, 2009 г.); на международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008 г.); на всероссийской конференции «ЭКОАНАЛИТИКА-2009» (Йошкар-Ола, 2009 г.); а также на ежегодных научно-технических конференциях Архангельского государственного технического университета.

Публикации По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения; обзора литературы; методической части; экспериментальной части, включающей 4 раздела; выводов; списка литературы. Содержание работы изложено на 139 страницах, из них 122 страниц основного текста, включая 73 рисунка и 22 таблицы, библиография содержит 156 наименований.

Краткое содержание работы

В обзоре литературы рассмотрены основные пути образования, трансформации и способы определения лигнинных веществ в технологических средах ЦБП (на примере ОАО «Архангельский ЦБК»). Отмечено, что в настоящее время не существует универсального метода их определения, отличающегося высокой чувствительностью и экспрессностью.

Проанализированы результаты работ направленные на изучение катализируемого ферментами окисления лигнина и его модельных соединений.

Наиболее широко в процессе окисления лигнина применяются ферменты класса оксидоредуктаз, а именно пероксидазы: МпР (марганецпероксидаза), LiP (лигнинпероксидаза), лакказа. Использование пероксидазы хрена (HRP) ограничено недостатком сведений о механизме ее действия на компоненты древесины, в особенности на лигнин. Вместе с тем, рассмотренные в обзоре особенности строения этого фермента позволяют предположить перспективность его использования для создания эффективного, информативного и высокочувствительного метода определения лигнинных веществ в различных жидких средах.

На основе анализа литературных данных сформулированы цели и задачи исследования.

В методической части диссертационной работы приведена характеристика используемых модельных соединений структурного звена лигнина, а также функциональный состав и значения молекулярных масс препаратов диоксанлигнина ели, сульфатного хвойного лигнина исходного и восстановленного NaBHt (Табл. 1, 2); приведены характеристики, используемые для спектрофотометрического исследования кинетики пероксидаз-ного окисления лигнина и его модельных соединений (Табл. 3,4).

Таблица 1 - Функциональный состав препаратов лигнина

Препарат лигнина S,% Зола, % Функциональный состав, %

ОСНз ОН общ СООН ОН фен С=0

Диоксанлигнин ели * * 15,62 3,12 0,87 1,88 5,66

Сульфатный хвойный лигнин исходный 2,02 2,16 10,20 3,40 2,10 1,30 5,80

Сульфатный хвойный лигнин восстановленный ЫаВНд * * 10,40 3,51 2,16 1,45 1,22

* - не определялось.

Таблица 2 - Характеристика полимолекулярного состава препаратов лигнина

Препарат лигнина Mw, а.е.м. М„, а.е.м. М2, а.е.м. Степень полидисперсности (СП= Mw / М„)

Диоксанлигнин ели 16700 11600 19400 1,44

Сульфатный хвойный лигнин исходный 14600 7800 19200 1,87

б

Таблица 3 - Положение полос поглощения и значения молярных коэффициентов поглощения в спектрах продуктов окисления модельных соединений структурного звена лигнина

Соединение Х,нм е, л/(моль-см)

Гваякол 470 4980

Феруловая кислота 286 6707

Ацетованилон 274 8427

Ванилиновый спирт 230 6085

Таблица 4 - Положение полос поглощения в "спектрах и значения молярных коэффициентов поглощения продуктов окисления различных препаратов лигнина

Вид лигнина X, нм Е, Л/(Г-СМ)

Диоксанлигнин ели (ДЛ) 280 40,54

Сульфатный хвойный лигнин исходный (СХЛ) 420 5,89

Сульфатный хвойный лигнин восстановленный ИаВЫ) (ВСХЛ) 300 26,82

Начальную скорость реакции окисления определяли по тангенсу угла наклона касательной к начальному линейному участку кривой (метод тангенсов) по формуле (1) для гваякола и (2) для феруловой кислоты, аце-тованилона, ванилинового спирта и препаратов лигнина:

если £р> О,

если 8„= О,

то

V. =■

Л 1

{ев-е,)-1

(1)

то У° Д?

_ Ас _ АА __ tga Дг 1е I ■ е.

(2)

где где

tg а - тангенс угла наклона кинетических кривых в tg а - тангенс угла наклона кинетических кривых в координатах оптическая плотность (А) - время (1, координатах оптическая плотность (А) - время (I,

сек); сек);

£ - молярный коэффициент поглощения субстрата (е,) е5 - молярный коэффициент поглощения субстрата

или продукта его окисления (£р) (лмоль'см ); (лмоль'см"1);

/- толщина кюветы (см), /- толщина кюветы (см).

В качестве кинетических параметров определяли: начальную скорость реакции (\'0), эффективную константу Михаэлиса (Кт Эф), эффективную максимальную скорость реакции (УтЭф), эффективную (кЭфф) и каталитическую (ксаО константы реакции.

При статистической обработке экспериментальных данных рассчитывали относительную погрешность результатов исследований, которая составила < 5 %.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Каталитическая активность пероксидазы хрена в реакциях окисления лигнинных веществ

Пероксидаза хрена обладает рядом уникальных свойств, таких как: высокая каталитическая активность в довольно мягких условиях температур, давлений и кислотности среды; и специфичность (избирательность) действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения.

Перечисленные свойства обусловлены структурной сложностью пероксидазы и многостадийностью механизма ее действия; в пероксидазном катализе большую роль играет образование фермент-субстратного комплекса, обеспечивающее сближение и правильное ориентирование реагирующих частиц относительно активных центров фермента.

С целью подтверждения каталитической активности пероксидазы хрена проведено окисление лигнинных веществ как в присутствии, так и в отсутствие катализатора. Выявлено, что окисление субстратов собственно пероксидом водорода не происходит. Это связано с тем, что пероксид водорода в нейтральной среде находится в неионизированной форме, а, следовательно, не способен координироваться с активными реакционными центрами рассматриваемых субстратов, которые также находятся в молекулярной форме (рКаге = 10,04; рКаФК = 9,40; рКаФК (для СООН) = 4,43; РКав&= 9,80; рКаАЦ= 7,90).

Таким образом, окисление лигнинных веществ достигается за счет образования промежуточного фермент-субстратного комплекса (Е-Н2О2), который взаимодействует с окисляемыми субстратами.

2. Кинетика пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда

В качестве объектов исследований использованы гваякол, феруловая кислота, ацетованилон и ванилиновый спирт, моделирующие структурные фрагменты хвойных лигнинов, содержащие различные заместители в пара-положении к фенольному гидроксилу:

где-Н-гваякол;

- СН=СН-СООН - феруловая кислота;

- СО-СНз - ацетованилон;

- СН2-ОН- ванилиновый спирт.

Для оптимизации условий проведения ферментативного окисления, установления основных закономерностей превращений лигнинных веществ в этом процессе и его кинетического описания изучена кинетика

в

к

ОН

окисления модельных соединений структурного звена лигнина пероксидом водорода в водной среде с использованием в качестве катализатора перок-сидазы хрена.

С этой целью исследовано влияние на кинетику окисления: рН раствора, концентраций фермента, субстрата-восстановителя и субстрата-окислителя пероксидазы. Эти факторы оказывают влияние как на механизм и кинетику взаимодействия фермента с модельными соединениями лигнина, так и на его стабильность и активность по отношению к выбранным субстратам вследствие изменения его нативной конформации.

Результаты исследования влияния рН среды (рисунок 1) показали, что рН раствора оказывает значительное влияние на начальную скорость процесса окисления. Оптимальное значение рН, при котором наблюдается максимальная начальная скорость реакции пероксидазного окисления гваякола, феруловой кислоты и ацетованилона равно 6,0.

А Б

Рисунок 1 - Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления модельных соединений от рН раствора; Ацетатный буферный раствор (рН 4,5-5,5), Фосфатный буферный раствор (рН 5,5-8,0); А - окисление гваякола; окисление феруловой кислоты; Б - окисление ацетованилона; окисление ванилинового спирта.

Этот факт объясняется наличием в активном центре фермента ионизованных групп с рКа 3,9, 4,0, 5,5 (карбоксильные группы), обусловливающих существование каталитически активной формы фермента в слабокислой и нейтральной областях. Для ванилинового спирта максимальная начальная скорость реакции максимальна при рН = 7,5, что связано с влиянием природы пара - заместителя на скорость взаимодействия модельного соединения лигнина с активным фермент-субстратным комплексом (Е-Н202).

При изучении влияния концентрации пероксидазы хрена, пероксида водорода и модельных соединений лигнина на скорость реакции окисления последних выявлено, что она сначала линейно возрастает с повышением концентрации всех перечисленных компонентов, а затем выходит на плато (т.е. достигается кажущаяся предельная скорость и дальнейшее увеличение

концентрации фермента не влияет на скорость реакции). Для дальнейших исследований в качестве оптимальных выбраны следующие условия пе-роксидазного окисления, приведенные в таблице 5.

Таблица 5 - Оптимальные условия пероксидазного окисления модельных соединений лигнина

Оптимальные концентрации

Субстраты (РЮН) X, нм в, л /(моль-см) НИР, нмоль/л Н202, ммоль/л РЮН, ммоль/л рН

Гваякол 470 5000 12 5 0,15 6,0

Феруловая кислота 286 6707 50 10 0,05 6,0

Ацетованилон 274 8427 9 6 0,30 6,0

Ванилиновый спирт 230 6085 10 0,0006 0,20 7,5

Кинетические параметры реакции (эффективная максимальная скорость реакции Ут эф, эффективная константа Михаэлиса Кга эф) определяли графическим методом линеаризации уравнения Михаэлиса - Ментен в координатах сЬ0 - с (Табл. 6,7).

Таблица б - Линейные зависимости и кинетические параметры в реакции пероксидазного окисления модельных соединений лигнина

Субстрат Уравнение линейной зависимости Я2 Кщэф'Ю3, моль-л'1 Утэф-Ю", моль-л"1-мин'1

Гваякол (0,00)* Н202 у = 0,95х+ 1,93 0,99 20 105

РЮН у = 0,19х + 1,64 0,98 8 538

Феруловая кислота (0,41)* н2о2 у = 0Д0х + 1,19 0,99 119 10

РЮН у = 3,11х + 0,26 0,99 9 3

Ацетованилон (0,81)* Н202 у = 1,11х+ 18,25 0,99 17 90

РЮН у=1,14х + 6,67 0,99 1 88

Ванилиновый спирт (0,08)* Н202 у = 0,10х + 0,И 0,99 14 96

РЮН у = 0,02х + 0,91 0,99 5 500

*- с-константы Гаммета заместителей в и-положении к ОНфе, РЮН - соответствующее модельное соединение лигнина.

Таблица 7 - Кинетические параметры реакции пероксидазного окисления модельных соединений лигнина, характеризующие эффективность ее протекания

Субстрат кэфф-Ю"', л-моль"1-мин"1 ксаГЮ'3, мин'1 кем/ Кш Эф' 10 л-моль'-мин"1

Гваякол Н202 43,8 52,5 2,60

РЮН 224 269 34,10

Феруловая кислота Н202 0,9 0,9 0,01

РЮН 0,3 0,3 0,04

Ацетованилон Н202 0,9 1,5 0,09

РЮН 3,7 7,3 8,70

Ванилиновый спирт Н202 3,8 7,9 0,58

РЮН 5,0 10,0 1,86

ю

Анализ полученных экспериментальных данных показывает, что все соединения окисляются с достаточно высокими скоростями, а наибольшую специфичность пероксидаза проявляет по отношению к гваяколу.

Этот факт можно объяснить с позиций структурных особенностей молекул модельных соединений лигнина, выбранных для исследования. При введении в молекулу пара- заместителей, обладающих сильно выраженными электроноакцепторными свойствами (например -СН=СН-СООН у феруловой кислоты и -СО-СН3 у ацетованилона), электронная плотность в ароматическом кольце понижается, что способствует эффективной дело-кализации избыточного отрицательного заряда кислородного атома в сопряженной системе. Это приводит к упрочнению связи О-Н в фенольном гидроксиле, а значит, к снижению способности модельных соединений окисляться под действием пероксидазы. Однако, если в молекулу ввести пара- заместитель со слабовыраженными электроноакцепторными свойствами (например -СНгОН в ванилиновом спирте), то реакционная способность модельных соединений не понижается.

Таким образом, проведенные исследования по изучению кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина свидетельствуют о том, что введение пара- заместителей с различными электроноакцепторными свойствами в молекулу модельного соединения в значительной степени влияет на активность реакционного центра - фенольной гид-роксильной группы, а, следовательно, и на способность органического соединения к пероксидазному окислению:

гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.

3. Кинетическая модель и механизм пероксидазного окисления модельных соединений лигнина

С целью установления кинетической модели и схемы механизма пероксидазного окисления модельных соединений структурного звена лигнина (гваякола, феруловой кислота, ацетованилона и ванилинового спирта) были выполнены исследования в условиях одновременного варьирования концентрации субстратов; концентрация катализатора (пероксидазы хрена) во всех экспериментах была постоянна и соответствовала ранее установленному оптимальному значению.

Согласно литературным данным, механизм пероксидазного окисления субстратов является трехстадийным, включающим образование двух промежуточных продуктов окисления фермента Срс! I и Срс! И:

Е + Н202 < > СрШ +Н20

СрсИ + РИОН < *2'*-2 > СрсШ + РНО'

СрсШ + РНОН —Е + Р1гО' + Н20

РИО' + РНО' -»Р5

и

где Е - несвязанная форма фермента; Н2О2 - субстрат-окислитель; Cpd I - активный фермент-субстратный комплекс; PhOH - субстрат-восстановитель (модельное соединение лигнина); PhO - феноксирадикалы; Cpd II - активный фермент-субстратный (про-дуктный) комплекс; Ps - продукты реакции.

Однако, механизм действия пероксидаз может быть различным в реакциях с субстратами разной природы. Поэтому, с целью разработки кинетической модели процесса, адекватно отражающей полученные опытные данные, проведена их обработка с помощью методов математического анализа.

Применяя метод стационарных концентраций, для представленной ранее кинетической схемы, можно записать выражение для зависимости начальной скорости реакции (v0) от начальных концентраций субстрата-окислителя (Стог) и субстрата-восстановителя (Срнон)'■

Ь'СН о 'CPh0H (3).

Vq --—- v >

1 + Oj • Снл + аг • CPh0H 4- а3 • С//2о2 • СРЮН

где b, ai, а2 и а3- функции от констант к:, k.h к2, к_2 и к3 соответственно и они равны: Ъ = kik.2k3+ к.,к2кз а, =к,к2 а2 = к_,к2 +к.2к3 а3 = к] к.2к3+к. 1 к2+к | к3+к2к3

Применение уравнения (3) ограничено теорией Михаэлиса-Ментен о упорядоченном механизме присоединения субстратов. Поэтому необходимо проверить справедливость применения этого допущения в конкретном случае пероксидазного окисления выбранных модельных соединений лигнина.

С помощью программы SigmaPlot v. 11.0 (Systat Software Inc. SigmaPlot for Windows) нами рассчитаны коэффициенты этого уравнения и построены зависимости v0=f(CphOH) для каждого фенольного соединения по экспериментальным и расчетным данным, представленные на рис. 2.

А Б

в г

Рисунок 2 - Зависимость \'о от концентрации модельных соединений в реакции окисления их пероксидом водорода в присутствии перокидазы хрена: А- гваякол, Б- феруловая кислота, В- ацетованилон, Г- ванилиновый спирт (1 - кривая, полученная по экспериментальным данным; 2- кривая, полученная расчетным методом (уравнение 3)).

Такая зависимость корректно описывает поведение системы в области низких «ненасыщающих» концентраций субстратов. Однако, если рассматривать их поведение в более широком диапазоне концентраций, то необходимо использовать допущение о неупорядоченном стационарном механизме пероксидазного окисления субстратов.

Основной особенностью этого механизма является одновременное связывание субстрата Н2О2 с ферментом Е и с промежуточным фермент-субстратным комплексом СрсЗ I.

Учитывая это взаимодействие, необходимо привести уравнение (3) в более сложный вид (4):

__(¿1 -сна, •срюн +Ь2С2нл -спа, +Ь3 -СЯ;0! -С2рюи)_

(1+а, • С„л + а2 ■ С1 на, + а3 • Сеюн + а4 ■С1рюн + а5 -Снл ■ Срюн + а6 ■ С2н&г • Срюн + а, • Сяд • Сгрюн)

6/, ¿2. Ьз, ¿¡2, аз, а4, а5, а6, а7-функции от констант к[, к2, к.2, кз, к.з, к4, к.4, к} соответственно и они равны:

Ъ, = к^к^ + к.^]^

Ь2 = к1к3к4к3

Ьз = к2к3 к^

СЧ = к1к.2к.3 + к^гк-д + к1к.2к5 + к.1к_3к4 + к^к^

а2 = к]к.3к4 + к!к(к5

аз = к.]к2к.3 + к1к+2к-4 + к.1к2к5 + к.2к3ки + к.2к3к5

а4 = к2кзк_4 + к2к3к5

= к!к.2к3 + к.1к2к4 + к^зк^ + к2к3к( + к3к4к5

Об = к]к3к4

а7 = к2к31с4

Уравнение (4) является системой второй степени относительно Срьон и СН202> так как субстраты взаимодействуют с ферментом Е и с промежуточными фермент-субстратными комплексами Срс! I, Срс11*. Соотношение

констант в уравнении получено методом Кинга и Альтмана (метод графов для получения уравнения скорости).

С помощью программы 81;*таР1о1 у.11 были рассчитаны коэффициенты в уравнении (4) и построены зависимости Уо=Г(Срьон) Для каждого фенольного соединения по экспериментальным и расчетным данньм (рис.3).

Как видно из представленных данных (рис. 3), кривые зависимостей, полученных опытным путем адекватны кривым, полученным при расчете.

А Б

В Г

Рисунок 3 - Зависимость vo от концентрации модельных соединений в реакции окисления их пероксидом водорода в присутствии перокидазы хрена: А- гваякол, Б- феруло-вая кислота, В- ацетованилон, Г- ванилиновый спирт (1 - кривая, полученная по экспериментальным данным; 2- кривая, полученная расчетным методом (уравнение 4)).

Таким образом, показано, что для модельных соединений лигнина гваяцильного ряда (гваякола, феруловой кислоты, ванилинового спирта и ацетованилона), окисляемых в широком диапазоне концентраций пероксидом водорода, полученные экспериментальные результаты невозможно интерпретировать согласно классической теории Михаэлиса - Ментен. Объяснением наблюдаемого отклонения от классического упорядоченного механизма является допущение о неупорядоченности каталитического процесса.

На основании этого предложена и экспериментально доказана кинетическая модель процесса каталитического окисления гваяцильных структур по типу Random Bi Uni с неупорядоченным присоединением субстратов.

Е + Н202< V*-! >СреИ+Н20 СрсЧ + РИОН < 1г'к-г > СреШ+РИО' Е + РИОН < > фаГ + РИСГ СрсИ* +Нг02< к<п-< ) СрШГ +Н20 СрсШ + Ср(Ш'-^2Е + Рз

где Е - несвязанная форма фермента; Н202'- субстрат-окислитель; Срс11 - активный фермент-субстратный комплекс с пероксидом водорода; РЮН - субстрат-восстановитель (модельное соединение лигнина); РЮ* - феноксирадикалы; Срё II - активный фермент-субстратный (продуктный) комплекс с модельным соединением лигнина; Ср<1 I* - активный фермент-субстратный комплекс с модельным соединением лигнина; Срс! II* - активный фермент-субстратный (продуктный) комплекс с пероксидом водорода; Рэ - продукты реакции.

4. Изучение закономерностей пероксидазного окисления препаратов лигнина

С целью исследования процесса пероксидазного окисления лигнина, использовались те же подходы, что и при изучении процесса окисления модельных соединений его структурного звена. Препараты лигнина, выделенные различными методами существенно различаются по целому ряду физико-химических характеристик, что связано с различным соотношением функциональных групп в выделенном образце.

Рассчитав скорость реакции пероксидазного окисления препаратов лигнина и сопоставив полученные значения с данными по функциональному составу, можно сделать вывод о том, что на скорость реакции окисления оказывает существенное влияние содержание в образцах карбоксильных групп и фенольных гидроксилов.

Таблица 8 - Скорость реакции пероксидазного окисления препаратов лигнина

Вид лигнина уо-Ю2, мг/(мл-мин)

Диоксанлигнин ели (ДЛ) 3,0

Сульфатный хвойный лигнин (СХЛ) 2,0

Сульфатный хвойный лигнин восстановленный ЫаВН4 (ВСХЛ) 2,8

Основными реакционными центрами рассматриваемых препаратов лигнина являются фенольные гидроксильные группы. Доступность этих групп определяется не только функциональной природой, но и макромоле-кулярными свойствами (характеристиками полимолекулярного состава, полидисперсностью, формой макромолекул). Поэтому для исследования

пероксидазного окисления лигнинных макромолекул исходный препарат ДЛЕ расфракционировали методом дробного осаждения в системе диоксан «растворитель» - бензол «осадитель» с выделением 7 фракции различной функциональной природы и полимолекулярных характеристик (таблица 9).

Согласно представленным данным, зависимость содержания фе-нольных гидроксилов от значений молекулярной массы фракций ДЛ имеет линейный характер. Полученную зависимость можно объяснить снижением «доступности» окислительных центров с увеличением молекулярной массы образца.

Таблица 9 - Изменение содержание метоксильных и фенольных групп в зависимости от молекулярной массы фракций ДЛ

Диоксан лигнин Ми, а.е.м. ОСНз, % ОН фен, %

Исходный ДЛ 16700 15,62 ±0,10 1,88 ±0,01

1 фракция 28600 14,83 ± 0,40 1,32 ±0,01

2 фракция 17000 14,40 ±0,50 1,56 ±0,01

3 фракция 10700 10,68 ±0,32 2,12 ±0,05

4 фракция 7500 14,59 ±0,30 2,39 ±0,01

5 фракция 4900 12,71 ±0,07 2,42 ±0,03

6 фракция* 3600 - -

7 фракция* 2900 13,38 ±0,21 1,29 ±0,01

* фракция лигнина, не используемая для исследований.

Обнаруженный факт связан с конформационными особенностями лигнинного полимера: лигнин в реакционной среде присутствует в форме разбухшего непротекаемого клубка. Рост молекулярной массы приводит к увеличению взаимного влияния активных реакционных центров (функциональных групп) в макромолекуле, образованию внутримолекулярных и межмолекулярных водородных связей, росту внутреннего сопряжения, вызывающего повышение электронной плотности на фенольных гидроксиль-ных группах.

Следовательно, при увеличении молекулярной массы лигнинных образцов отмеченные факты приводят к обратному эффекту - снижению количества активных фенольных группировок, участвующих в ферментативных окислительных взаимодействиях, при сохранении конформации мак-ромолекулярного клубка.

На рисунке 4 представлена зависимость скорости реакции пероксидазного окисления от молекулярной массы фракций ДЛ.

а.е.м.

Рисунок 4 - Зависимость начальной скорости реакции пероксидазного окисления от молекулярной массы фракций ДЛ.

Таким образом, в результате суммарного влияния рассмотренных факторов, происходит снижение способности лигнина к окислительно-восстановительным взаимодействиям в реакциях его пероксидазного окисления.

Выводы

1. Показано, что пероксидаза хрена является эффективным биокатализатором редокс - превращений лигнинных веществ.

2. Установлены основные закономерности пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда в водной среде (влияние рН раствора, концентраций катализатора, субстрата-окислителя, субстрата-восстановителя); определены оптимальные условия проведения процесса; показано, что основным реакционным центром, участвующим в редокс - превращениях структурных единиц лигнина, является фенольный гидроксил.

3. Изучено влияние электроноакцепторных свойств пара-заместителей на активность фенольного реакционного центра структурных единиц лигнина в процессах ферментативного окисления. Экспериментально определенные кинетические параметры позволяют расположить модельные соединения по способности к пероксидазному окислению в следующий ряд:

гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.

4. Полимолекулярные свойства и форма макромолекул лигнина являются важными факторами, влияющими на процесс биохимического окисления. Зависимость начальной скорости реакции пероксидазного окисления диоксанлигнина от его молекулярной массы носит линейный

характер и выражается уравнением v0 = k-Mw + Ъ (где к = - 4,6-10"4; b = 10,91; R2=0,97).

5. Теоретически обоснована и экспериментально доказана применимость модели неупорядоченного присоединения субстратов по типу Random Bi Uni для интерпретации процесса пероксидазного окисления лиг-нинных веществ в широком диапазоне их концентраций.

Список публикаций по теме диссертации

1.Боголицын, К.Г. Применение ферментативного метода для оценки содержания фенольных компонентов в технологических, сточных и природных водах [Текст] / К.Г. Боголицын, М.А. Айзенштадт, А.С. Почто-валова, Т.Н. Шеховцова // II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России»: Материалы конференции. - Краснодар. - 2007. - С. 318.

2. Айзенштадт, М.А. Методика оценки ингибирующего действия лигнина и его модельных соединений на каталитическую активность пероксида-зы хрена [Текст] / М.А. Айзенштадт, С.А. Покрышкин, К.Г. Боголицын // Всероссийской конференции с международным участием «Северные территории России: проблемы и перспективы развития»: Материалы конференции. - Архангельск. - 2008. - С. 18 - 20.

3. Айзенштадт, М.А. Ферментативное определение модельных соединений лигнина гваяцильного ряда [Текст] / М.А. Айзенштадт, С.А. Покрышкин // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»: Материалы конференции. - Москва. - 2008. - С. 266.

4. Bogolitsyn, K.G. Kinetics of enzyme catalyzed oxidation of lignin model compounds by horseradish peroxidase - hydrogen peroxide complex [Text] / K.G. Bogolitsyn, M.A. Aizenshtadt // 10th European Workshop on Lignocel-lulosics and Pulp EWLP 2008: Proceedings. - Stockholm, Sweden. - 2008. -P.384 - 387.

5. Айзенштадт, М.А. Применение методов ферментативного анализа при изучении кинетики окисления ароматических полимеров растительного происхождения [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын, С.А. Покрышкин // Международный форум «Аналитика и Аналитики»: Рефераты докладов. - Воронеж. - 2008. - Т.2. - С. 391.

6. Айзенштадт, М.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын // Химия растительного сырья. - 2009. - № 2. - С. 5 - 18.

7. Айзенштадт, М.А. Каталитическое окисление модельных соединений лигнина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена в качестве катализатора [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын, С.А. Покрышкин // Химия растительного сырья. - 2009. - № 4. - С. 31 - 37.

8. Боголицын, К.Г. Оценка возможности применения методов ферментативного анализа для определения лигнина в технологических средах

ЦБП [Текст] / К.Г. Боголицын, М.А. Айзенштадт // VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика 2009»: Тезисы докладов. - Йошкар-Ола.- 2009. - С. 43-44.

9. Айзенштадт, М.А. Ферментативное определение лигнина по реакции его пероксидазного окисления [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын // III международная конференция Физикохимия лигнина: Материалы конференции. - Архангельск. - 2009. - С. 117-121.

10. Айзенштадт, М.А. Использование ферментов как катализаторов процессов биодеградации лигнина [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын // Международная научно-техническая конференция посвященная 80-летию АЛТИ-АГТУ: Материалы конференции. - Архангельск. - 2009. -С. 112-114.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах с заверенными гербовой печатью подписями просим направлять по адресу: 163002, г. Архангельск, набережная Северной Двины, 17, АГТУ, диссертационный совет Д.212.008.02.

Подписано в печать 16.03.2010. Формат 70x84/16. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ № 36.

Отпечатано в полном соответствии с качеством предоставленного оригинал-макета в типографии ГОУ ВПО «Архангельский государственный технический университет»

163002, г. Архангельск, наб. Северной Двины, 17

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИГНИННЫЕ ВЕЩЕСТВА ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ И СТОЧНЫХ

ВОД ПРЕДПРИЯТИИ ЦБП (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Основные пути образования и трансформации лигнинных веществ в технологических средах ЦБП (на примере ОАО «Архангельский 10 ЦБК»).

1.2. Методы определения лигнинных веществ в жидких средах.

1.3. Применение ферментов для контроля содержания лигнинных веществ в сточных и природных водах.

1.3.1. Общая характеристика пероксидаз.

1.3.2. Особенности строения пероксидаз и обобщенная схема окисления их субстратов.

1.3.2.1. Особенности строения пероксидаз.

1.3.2.2. Обобщенная схема окисления субстратов пероксидазы.

1.3.3. Механизм пероксидазного окисления лигнина и родственных ему соединений.

1.4. Выводы. Постановка цели и задач исследования.

2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Реактивы и Материалы.

2.2. Оборудование.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Спектрофотометрические измерения.

2.3.1.1. Определение характеристических длин волн модельных соединений лигнина.

2.3.1.2. Определение зависимости начальной скорости реакции от рН среды.

2.3.1.3. Определение зависимости начальной скорости реакции от концентрации пероксидазьг хрена.

2.3.1.4. Определение зависимости начальной скорости реакции от концентрации пероксида водорода.

2.3.1.5. Определение зависимости начальной скорости реакции от концентрации модельного соединения лигнина.

2.3.1.6. Методика исследования кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина в условиях одновременного варьирования 54 концентраций субстратов (Н2О и РНОН)

2.3.1.7. Методика исследования процесса пероксидазного окисления препаратов лигнина.

2.3.1.8. Расчет кинетических параметров реакции пероксидазного окисления модельных соединений лигнина / препаратов лигнина.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Каталитическая активность пероксидазы хрена в реакциях окисления лигнинных веществ.

3.2. Кинетика пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда.

3.2.1. Влияние рН раствора на кинетику процесса окисления.

3.2.2. Влияние на кинетику ферментативного процесса концентраций пероксидазы и ее субстратов.

3.3. Кинетическая модель и механизм пероксидазного окисления модельных соединений лигнина.

3.3.1. Исследование кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина при разных постоянных концентрациях пероксида водорода.

3.3.2. Исследование кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина при разных постоянных концентрациях модельных соединений лигнина.

3.4. Изучение закономерностей пероксидазного окисления препаратов лигнина.

3.4.1. Влияние природы и функционального состава препаратов лигнина на эффективность их пероксидазного окисления.

3.4.2. Влияние молекулярно-массовых характеристик выделенных образцов лигнина на их окислительную 116 способность.

4. ВЫВОДЫ.

Существенный вклад в загрязнение рек и других природных водных объектов вносит деятельность предприятий целлюлозно-бумажной промышленности, что обусловлено сложностью и многостадийностью технологического процесса получения целлюлозного полуфабриката. Образующиеся сточные воды содержат широкий спектр загрязняющих веществ, серосодержащих и хлорсодержащих реагентов применяемых для варки и отбелки, продукты их реакций с компонентами древесины -органической и неорганической природы, причем точный состав их, даже качественный, не всегда можно заранее предвидеть.

Одним из основных показателей качества сточных вод целлюлозно-бумажных предприятий (ИБП) является содержание в них лигнинных веществ, которые представляют собой группу родственных высокомолекулярных соединений ароматической природы. Они не относятся к опасным токсичным соединениям. Однако, при попадании в природный водоем группа конденсированных и малотрансформируемых лигнинных веществ склонна к накоплению, а также способствует образованию опасных для здоровья и жизни веществ в условиях протекания вторичных окислительно-восстановительных процессов в водоеме.

Таким образом, актуальными задачами химической технологии древесины являются поиск и создание новых экологически чистых способов химической переработки лигносодержащих материалов и совершенствование системы производственного экологического контроля путем разработки и внедрения новых высокочувствительных, информативных и экспрессных методов анализа.

В соответствии с «Перечнем приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в РФ» и «Перечнем критических технологий РФ» по направлению «Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии», перспективным для решения указанных задач является использование для биотрансформации и биодеградации лигнинных веществ ферментативных систем; создание новых высокоэффективных, стабильных и специфичных биокатализаторов и разработка на их основе ферментативных методов делигнификации и анализа технологических растворов.

Большой интерес в связи с этим вызывают ферменты класса оксидоредуктаз, а именно пероксидазы. Этот класс ферментов широко применяется для контроля примесей в объектах пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности [1-2], в мониторинге окружающей среды, для решения некоторых медицинских и биохимических задач [3-8].

В литературе представлены сведения о возможности применения пероксидаз в ЦБП, а именно в процессе делигнификации древесины [9-11], так как одной из основных биологических функций этих ферментов является окисление фенольных соединений и участие в процессе биосинтеза веществ лигнинной природы. Кроме того, очевидным достоинством этого класса ферментов является их коммерческая доступность. Однако, одним из основных препятствий практического использования пероксидаз в ЦБП является недостаток сведений о механизме действия этих ферментов как на компоненты древесины, так и на лигнин.

В связи с вышеизложенным, основным направлением наших исследований, представленных в данной диссертационной работе, является изучение процесса ферментативного окисления лигнинных веществ.

Работа поддержана грантом Администрации Архангельской области (проект № 04-04 «Ферментативное окисление растительных биополимеров нерегулярного строения и полифункциональной природы», июнь 2009 г.) и выполнена при сотрудничестве с кафедрой аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

4. ВЫВОДЫ

Проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы:

1. Показано, что пероксидаза хрена является эффективным биокатализатором редокс - превращений лигнинных веществ.

2. Установлены основные закономерности пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда в водной среде (влияние рН раствора, концентраций катализатора, субстрата-окислителя, субстрата-восстановителя); определены оптимальные условия проведения процесса; показано, что основным реакционным центром, участвующим в редокс - превращениях структурных единиц лигнина, является фенольный гидроксил,

3. Изучено влияние электроноакцепторных свойств пара - заместителей на активность фенольного реакционного центра структурных единиц лигнина в процессах ферментативного окисления. Экспериментально определенные кинетические параметры позволяют расположить модельные соединения по способности к пероксидазному окислению в следующий ряд: гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.

4. Полимолекулярные свойства и форма макромолекул лигнина являются важными факторами, влияющими на процесс биохимического окисления. Зависимость начальной скорости реакции пероксидазного окисления диоксанлигнина от его молекулярной массы носит линейный характер и выражается уравнением v0 = k-Mw + b (где к = - 4,6-10"4; Ъ = 10,91; R2=0,97).

5. Теоретически обоснована и экспериментально доказана применимость модели неупорядоченного присоединения субстратов по типу Random Bi Uni для интерпретации процесса пероксидазного окисления лигнинных веществ в широком диапазоне их концентраций.

1. Ohshima, Н. On the electrophoretic mobility of biological cell Текст. / H. Ohshima, T. Kondo // Biophys. Chem. 2001.-V. 39. - P. 191 - 198.

2. Malhotra, B.D. Biosensors for clinical diagnostics industry Текст. / B.D. Malhotra, A. Chaubey // Sensors and Actuators B. 2003. - V. 91. - P. 117 - 127.

3. Campbell, C.N. Enzyme-Amplified Amperometric Sandwich Test for RNA and DNA Текст. / C.N. Campbell, D. Gal, N. Cristler, C. Banditrat, A. Heller // Anal. Chem. 2002. - V. 74 (1). - P. 158 - 162.

4. Clark, L.C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery Текст. / L.C. Clark, C. Lyons // Ann. NY Acad. Sci. 1962. - V. 102. - P. 29 -45.

5. Wojciechowski, M. Multichannel electrochemical detection system for quantitative monitoring of PCR amplification Текст. / M. Wojciechowski, R. Sundseth, M. Moreno, R. Henkens // Clin. Chem. 1999. - У. 45. - № 9. - p. 1690 -1693.

6. Лобанов, A.B. Биосенсоры для экологического контроля Текст. / Лобанов A.B., Шувалова Ю.В., Зырина Н.В. и др. // Экологические системы и приборы.- 2001. Том 5. - № 6. - С. 72 - 76.

7. Александрова, Г.П. Биоотбелка сульфатной целлюлозы оксидазными ферментами гриба Daedaleopsis confragosa Текст. / Г.П. Александрова, С.А. Медведева // Химия растительного сырья. 1999. - № 2. - С. 81 - 84.

8. Александрова, Г.П. Технология экологически безопасной отбелки сульфатной целлюлозы Текст. / Г.П. Александрова, С.А. Медведева // II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ: Тезисы докладов. Казань. - 2002. - С. 149 - 150.

9. Александрова, Г.П. Применение ферментов в отбелке жесткой хвойной сульфатной целлюлозы Текст. / Г.П. Александрова, С.А. Медведева, А.П. Синицын // Химия растительного сырья. 2000. - № 2. - С. 23 - 27.

10. Боголицын, К.Г. Современные тенденции в химии и химической технологии растительного сырья Текст. / К.Г. Боголицын // Российский Химический журнал (Ж. Рос. Хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2004. -Т. XLVIII. - № 6. - С. 105 - 123.

11. Почтовалова, A.C. Эколого аналитическая оценка интегрального . показателя химического потребления кислорода сточных вод ЦБП Текст.: дис.канд. хим. наук. - Архангельск. - 2002. - 164 с.

12. Соболева, Т.В. Приоритетные показатели эколого-аналитического контроля состава сточных вод в технологическом нормировании деятельности предприятий ЦБП Текст.: дис.канд. тех. наук. Архангельск. - 2007. - 128 с.

13. Химия и биохимия лигнина, целлюлозы и гемицеллюлоз: по материалам международного симпозиума в Гренобле Текст. Москва: Лесная промышленность, 1969. - 250 с.

14. Никитин, Я.В. Использование воды на целлюлозно-бумажных предприятиях Текст. / Я.В. Никитин, С.И. Поляков. Москва: Лесная промышленность, 1985. -208 с.

15. Слимак, М. Продукты хлорирования лигнинов, их анализ и свойства Текст. / М. Слимак // Химия древесины. 1992. - № 6. - С. 3 - 19.

16. Самылова, O.A. Характеристика редокс свойств лигнина Текст.: дис.канд. хим. наук. - Архангельск. - 2004. - 145 с.

17. Щеголь, Ш.С. Аналитическое определение хлоритов и двуокиси хлора Текст. / Ш.С. Щеголь // Труды по химии. 1958. - № 1. - С. 95 - 135.

18. Непенин, H.H. Технология целлюлозы: монография Текст.: в 3-х т./ H.H. Непенин; Экология. Москва, 1994. - 592 с. - 3 т.

19. Троянская, А.Ф. Влияние процессов переработки растительного сырья на образование и распределение хлорорганических соединений в окружающей среде Текст.: дис.канд. хим. наук. Архангельск. - 1999. - 163 с.

20. Лурье, Ю.Ю. Химический анализ производственных сточных вод Текст. / Ю.Ю. Лурье, А.И. Рыбникова. Москва: Химия, 1974. - 336 с.

21. Карюхина, Т.А. Химия воды и микробиология Текст. / Т.А. Карюхина, И.Н. Чурбанова. Москва: Стройиздат, 1983. - 198 с.

22. Криульков, В.А. Лигнин в природных водоемах Текст. / В.А. Криульков, В.Т. Каплин // Гидрохимические материалы. 1968. - Т. 46. - С. 152 -153.

23. Shin, S.-J. Impact of residual extractives on lignin determination in kraft pulps Текст. / S.-J. Shin // J. Of wood chem. and technology. 2004. - V.24. - № 2. -P. 139-151.

24. Senzyu, R. Untersuchungen über lignin und Zellstoff. II. Eine neue bestimmungmethode des lignin und Zellstoffen durch kolloidtitration Текст. / R. Senzyu // Bull. Soc. Japan. 1953. - V.26. - № 3. - P. 148 - 153.

25. Фукс, В. Химия лигнина Текст./ В. Фукс; пер. A.C. Берилло, С.И. Богданова, В.А. Грабовского, М.Ф. Мартынова. Ленинград: ОНТИ - Химтеорет, 1936.-368 с.

26. Wiles, R.H. Permnganate number of pulp Текст. / R.H. Wiles // Paper trade J. 1934. - V. 98. - № 11. - P. 34 - 36.

27. Schaddenbock, W. Eine neue quantitative ligninbestimmung mit hilfe der UV- Spektrophotometrie Текст. / W. Schaddenbock // Papier (BRD). 1972. - Bd. 26.- № 3. P. 116- 118.

28. Trojanowski, J. Ilosciowe oznaczanie ligniny Bjorkmana w roztoworze przy pomocy reaccji z floroglucyna Текст. / J. Trojanowski // Ann. Univ. M. Curie-Sklodowska. 1962. - V. 17. - P. 121 - 126.

29. Брауне, Ф.Е. Химия лигнина Текст. / Ф.Е. Брауне; пер. с анг. М.И. Чудаковой. Москва: Лесная промышленность, 1964. - 864 с.

30. Сарканен, К.Х. Лигнины Текст. / К.В. Сарканен, К.Х. Людвиг, Г.В. Хергерт и др.; пер. с анг. A.B. Оболенской. Москва: Лесная промышленность, 1975.-632 с.

31. Арзамасцев, А.П. Ультрафиолетовые и инфракрасные спектры лекарственных веществ Текст. / А.П. Арзамасцев. Москва: Химия, 1975. - 151 с.

32. Johnson, D.B. The spectrophotometric determination of lignin in small wood samples Текст. / D.B. Johnson, W.E. Moore, L.C. Zank // Tappi J.- 1961. V.44. - № 11.-P. 793 - 798.

33. Augustin, H.H. Eignung der UV-Absorptionsmessung von sulfitablaugen zur aufschlusskontrolle. Teil 1. Einfluss von nichtligninbestanteilen der ablaugen Текст. / H.H. Augustin // Papier (BRD). 1975. - Bd. 29. - № 9. - P. 398 - 404.

34. Barnes, С.А. A standardired Pearl-Benson or nitrosomethod recommended for estimation of spent sulfite waste liquor concentration in waters Текст. / С.А. Barnes, B.F. Hrutfiord, A. Livingston // TAPPI. 1963. - V. 46 - № 6. - P. 347 - 351.

35. Заликман, П.И. Исследование методом ИК-спектроскопии изменения содержания лигнина в целлюлозе в процессе кислородно-щелочного облагораживания Текст. / П.И. Заликман // Химия древесины. 1984. - № 4. -С". 35 - 37.

36. Хабаров, Ю.Г. Влияние катионов железа на определение концентрации лигносульфоновых кислот Текст. / Ю.Г. Хабаров, Н.Д. Камакина, А.Э. Мансимов // Архангельск: АГТУ, 1998. 13 с. - Деп. в ВИНИТИ 05.10.98, № 2929-В98.

37. Лурье, Ю.Ю. Унифицированные методы анализа вод Текст. / ред. Ю.Ю. Лурье. Москва: Химия, 1973. - 375 с.

38. Хабаров, Ю.Г. Оценка влияния хозбытовых сточных вод и промстоков гидролизного завода на определение концентрации сульфатного лигнина Текст. / Ю.Г. Хабаров, С.Б. Пальмова // Архангельск: АЛТИ, 1986. — 7 с. Деп. в ОНИИТЭХИМ, 31.07.86, № 943-XII-86.

39. Литучина, Т.Ф. Оптимизация нормирования сброса стоков предприятий ЦБП в водотоки Текст. / Т.Ф. Литучина, И.В. Мискевич, О.С. Бровко, М.А. Гусакова. Екатеринбург: УрО РАН, 2005. - 210 с.

40. Ауниныи, Э.А., Лигносульфонаты и природный водорастворимый лигнин в воде р. Лиелупе Текст. / Э.А. Ауниньш, А.Д. Тупурейне // Химия древесины. 1975. - № 6. - С. 91 - 97.

41. Захарьевский, М.С. Оксредметрия Текст. / ред. Б.Н. Никольского, В.В. Пальчевского. Ленинград: Химия, 1967. - 118 с.

42. Боголицын, К.Г. Редокс-свойства лигнина и методы их оценки: Обзор Текст. / К.Г. Боголицын, В.Г. Крунчак. Архангельск: Изд-во АЛТИ, 1986.- 67 с. Деп. в ОНИИТЭхим 21.10.86. № 1277-хп-86.

43. Боголицын, К.Г. Теория и практика применения оксредметрии в химии древесины. 1. Теоретические положения метода восстановительной емкости Текст. / К.Г. Боголицын, В.Г. Крунчак // Химия древесины. 1989. - № 6. - С. 59 -70.

44. Айзенштадт, A.M. Оксредметрия в химии и химической технологии древесины Текст. / А. М. Айзенштадт: Дис.д-ра. хим. наук. Архангельск. -1998. - 329 с.

45. Боголицын, К.Г. Применение косвенной оксредметрии для контроля качества сточных вод сульфит-целлюлозного производства Текст. / К. Г.

46. Боголицын, А. М. Айзенштадт, Т. А. Юлина, Ю. А. Коробовский // Лесной Журнал.- 1991.- № 6. С. 90 - 94.

47. Айзенштадт, A.M. Оксредметрия в химии древесины (теория и практика) Текст. / A.M. Айзенштадт, М.В. Богданов, К.Г. Боголицын, О.С. Бровко. Архангельск: АГТУ, 2008. - 277 с.

48. Преснова, Г.В. Электрохимичкские биосенсоры на основе пероксидазы хрена Текст. / Г.В. Преснова, М.Ю. Рубцова, А. М. Егоров // Рос. Хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2008. - Т. LII. - № 2. - С. 60 - 65.

49. Ruzgas, Т. Peroxidase modified electrodes: Fundamentals and application Текст./ Т. Ruzgas, E. Csoregi, J. Emneus, L. Gorton // Analytica Chimica Acta. -1996.-V. 330.-P. 123 - 138.

50. Kane, S.A. Development of a soil-gel amperometric biosensor for the determination of phenolics Текст./ S.A. Kane, E.I. Iwuoha, Smyth M.R. // Analyst. -1998. V. 123. - № 8. - P. 2001 - 2006.

51. Cosnier, M. Poly(amphiphilicpyrolle) tyrosinase-peroxidase electrode for amplified flow-ingection amperometric detection of phenol Текст. / M. Cosnier, I.G. Popescu // Anal. Chim. Acta. 1996. - V.319. - № 1 - 2. - P. 145 - 151.

52. Lindgren, A. Amperometric detection of phenols using peroxidase-modified graphite electrodes Текст. / A. Lindgren, T. Ruzgas, J. Emneus, L. Gorton // Analytica Chimica Acta.- 1997. V. 347. - P. 51 - 62.

53. Rosatto, S.S. Biosensor for phenol based on the direct electron transfer blocking of peroxidase immobilising on silica-titanium Текст. / S.S. Rosatto, L.T. Kubota, G. De Olivera Neto // Analytica Chimica Acta. 1999. - V. 390. - P. 65 - 72.

54. Ruzgas, T. The development of a peroxidase biosensor for monitoring phenol and related aromatic compounds Текст. / Т. Ruzgas, J. Emneus, L. Gorton, G. Marco-Varga // Analytica Chimica Acta. 1995. - V. 311. - P. 245 - 253.

55. Delvaux, M. Immobilisation of glucose oxidase within metallic nanotubes arrays for application to enzyme biosensors Текст. / M. Delvaux, S. Demoustier-Champagne // Biosens Bioelectron. 2003. - V. 18. - № 7. - P. 943 - 951.

56. Варфоломеев, С. Д. Биосенсоры Текст. / С. Д. Варфоломеев // Соросовский образовательный журнал. 1997. - №1. - С. 45 - 49.

57. Андреева, В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений Текст. / В.А. Андреева.- Москва: Наука, 1988. 128 с.

58. Газарян, И.Г. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений Текст. / И.Г. Газарян, Д.М. Хушпульян, В.И. Тишков // Успехи биологической химии. 2006. - Т. 46. - С. 303 - 322.

59. Young, R.A. Environmentally friendly technologies for paper industry Текст. / R.A. Young, M. Akhtar. Canada: John Wiley &Sons, Inc., 1998. - 307 p.

60. Have, R. Oxidative mechanisms involved in lignin degradation by White- Rot Fungi Текст. / R. Have, P.J. Teunissen // Chem. Rev. 2001. - № 101. - P. 3397 -3413.

61. Левит, M.H. Лигнин и лигниназа Текст. / М.Н. Левит, A.M. Шкроб // Биоорганическая химия. 1992. - Т. 18. - №3. - С. 309 - 345.

62. Беккер, Е.Г. Выделение, свойства и основные закономерности действия лигнолитических ферментов (лакказы, лигниназы, Мп- пероксидазы) Текст./ Е.Г. Беккер: Дис. . канд. хим. наук.- Москва. 1993.- 156 с.

63. Shimada, M. Degradation of lignin Текст. / M. Shimada, L. Higuchi // Wood and cellulosic chemistry. N. Y. and Basel: Mercek Dekker, 1991. - P. 525 -591.

64. Стрельский, B.A. Спектрофотометрическое исследование кинетики окисления модельных соединений и лигнина комплексом пероксидаза-Н202 Текст. / В.А. Стрельский, А.В. Бейгельман, Э.И. Чупка // Химия природных соединений. 1982. - №1. - С. 109 - 112.

65. Стрельский, В.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений Текст. / В.А. Стрельский: Дис. . канд. хим. наук. -Ленинград. -1986.-148 с.

66. Hewson, W.D. Oxidation of p-Cresol by Horseradish Peroxidase Compound I Текст. / W.D. Hewson, H.B. Dunford // The Journal of Biological chemistry. 1976. -V. 251. - № 19. - P. 6036 - 6042.

67. Klapper, M.H. The oxidatic activity of horseradish peroxidase. I. Oxidation of hydro- and naphthohydroquinones Текст. / M.H Klapper, D.P. Hackett // The Journal of Biological chemistry. 1963. - V. 238. - № 11. - P. 3736 - 3742.

68. Banci, L. Binding of horseradish, lignin, and manganese peroxidases to their respective substrates Текст. / L. Banci, I. Bertini, T. Bini et al. // Biochemistry. -1993.- V. 32. № 22. - P. 5825 - 5831.

69. Smith, A.T. Substrate binding and catalysis in heme peroxidases Текст. / A.T. Smith, N.C. Veitch // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. - V. 2. - P. 269 - 278.

70. Kuila, D. Resonance Raman spectra of extracellular ligninase: evidence for a heme active site similar to those of peroxidases Текст. / D. Kuila, M. Tien, J.A. Fee, M.R. Ondrias // Biochemistry. 1985. - V. 24. - № 14. - P. 3394 - 3397.

71. Henricsen, A. Structural alignment of rsAPX and CcP Текст. / A. Henricsen, A.T. Smith, M. Gajhede // The Journal of Biological chemistry. 1999. - V. 274. - P. 35005 -35011.

72. Montellano, O. Catalytic sites of hemoprotein peroxidases Текст. / О. Montellano // Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992. - V. 32. - P. 89 - 107.

73. La Mar, G.N. Peroxidase catalyzed polymerization of phenol Текст. / G.N. La Mar, V. Thanabal, J.S. De Ropp // Biochemistry. 1989. - V. 28. - № 4. - P. Л 934.

74. Gold, M.H. Degradation of 2,4- dinitrotoluene by the lignin-degradation fungus Текст. / M.H. Gold, H. Wariishi, K. Valli // ACS Symposium Series. 1989. -V. 389. - P. 127 - 140.

75. Godfrey, B.J. Characterization of a gene encoding a manganese peroxidase from Phanerochaete Chrysosporium Текст. / B.J. Godfrey, M.B. Mayfield, J.A. Brown, M.H. Gold//Gene. 1990. - V. 93. - № 1. - P. 119 - 124.

76. Dunford, H.B., Adeniran A.J. Hammet rho sigma correlation for reactions of horseradish peroxidase Compound II with phenols Текст. / H.B Dunford, A.J. Adeniran // Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 251. - P. 536 - 542.

77. Van Haandel, M.J. Differential substrate behavior of phenol and aniline derivatives during conversion by HRP Текст. / M.J. Van Haandel, M.M. Claassens, N. Van der Hount // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1435. - P. 22 - 29.

78. Schneegab, I. Purification of the main manganese peroxidase isoenzyme MnP2 from the white-rot fungus Nematoloma frowardii Текст. / I. Schneegab, M. Hofrichter, K. Scheibner K., W. Fritsche // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 48.-P. 602-605.

79. Gelpke, M.D.S. Role of arginine 177 in the Mn binding site of manganese peroxidase Текст. / M.D.S. Gelpke, H.L. Youngs, M.N. Gold // Eur. J. Biochem. -2000. V. 267. - P. 7038 - 7045.

80. Bockle, B. Mechanism of peroxidase inactivation in liquid cultures of the ligninolytic fungus Pleurotus pulmonarius Текст. / В. Bockle, M.J. Martinez, F. Guillen, A.T. Martinez// Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - № 3. - P. 923 -928.

81. Marbach, I. Pectin a second inducer for laccase production by Botrytis cinerea Текст. / I. Marbach, E. Harel, A.M. Mayer 11 Phytochemistry. 1985. - V. 24. -P. 2559-2561.

82. Xu, F. Effects of Redox potential and hydroxyl inhibition on the pH activity profile on fungel laccases Текст. / F. Xu // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - № 2. - P. 924 - 928.

83. Tien, M. Steady-state and transident state kinetic studies on the oxidation of 3,4-dimetoxybenzyl alcohol catalyzed by the ligninase of Phanerochaete Chrysosporium

84. Burds Текст. / M. Tien, Т. Kirk, С. Bull, J.A. Fee I I J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - № 4.-P. 1687- 1693.

85. Koduri, R.S. Oxidation of quaiacol by lignin peroxidase. Role of veratryl alcohol Текст. / R.S. Koduri, M. Tien // The Journal of Biological Chemistry. 1995. -V. 270. - № 38. - P. 22254 - 22258.

86. Band, L. Lignin and Mn peroxidase- catalyzed oxidation of phenolic lignin oligomers Текст. / L. Band, S. Ciofi-Baffoni, M. Tien // Ibid. 1999. - V. 38. - №10.-P. 3205 -3210.

87. Renganathan, V. Role of molecular oxygen in lignin peroxidase reactions Текст. / V. Renganathan, M.H. Gold // Biochemistry. 1986. - V. 25. - № 7. - P. 1626 - 1631.

88. Dure, L. Additional of the peroxidase Текст. / L. Dure, M.J. Cormier // J:, Biol. Chem. 1964. - V. 239. - P. 2351 - 2359.

89. Schoemaker, H.E. On the mechanism of enzymatic lignin breakdown Текст. / H.E. Schoemaker, P.J. Harvey, R.M. Bowen, J.M. Palmer // FEBS Lett. -1985.-V. 183. -№ l.-P. 7- 12.

90. Koduri, R.S. Oxidation of quaiacol by lignin peroxidase. Role of veratryl alcohol Текст. / R.S. Koduri, M. Tien // The Journal of Biological Chemistry. 1995. -V. 270. - № 38. - P. 22254 - 22258.

91. Ward, G. Inactivation of lignin peroxidase during oxidation of the highly reactive substrate ferulic asid Текст. / G. Ward, Y. Hadar, C.G. Dosoretz // Enzyme Microb. Technol. 2001. - V. 29. - № 1. - P. 34 - 41.

92. Tompson D., Norbeck K., Olsson L., Constantin-Teodosiu D. Peroxidase-catalyzed oxidation of Eugenol: formation of a carbotoxic metabolite (s) // The Journal of Biological Chemistry. 1989. V. 264. №2. P. 1016-1021.

93. Laszlo, J. A. Comparison of peroxidase activities of hemin, cytochrom С and microperoxidase-11 in molecular solvents and imidasolum based ionic liquids Текст. / J.A. Laszlo, D.L. Compton // J. Mol. Cat. B. - 2002. - V. 18. - P. 109 - 120.

94. Kurek, B. Influence of the physical state of lignin on its degradability by the lignin peroxidase of Phanerochaete Chrysosporium Текст. / В. Kurek, В. Monties, E. Odier // Enzyme Microb. Technol. 1990. - V. 12. - № 10. - P. 771 - 777.

95. Hammel, K.E. Depolymerization of a synthetic lignin in vitro by lignin peroxidase Текст. / K.E. Hammel, M.A. Moen // Enzyme Microb. Technol. 1991. -V. 13.-№ 1. - P. 15 - 18.

96. Khindaria, A. Evidence for formation of the veratryl alcohol cation radical by the lignin peroxidase Текст. / A. Khindaria, T.A. Grover, S.D. Aust // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 6020 - 6025.

97. Holmgren, A. Biochemical control aspects in lignin polymerization Текст. / A. Holmgren: Doctoral thesis.- 2008. Royal Institute of Technology. - Stockholm.-182 p.

98. Kirk, Т.К. Biochemistry and genetics of cellulose degradation Текст. / Т.К. Kirk// Acad. Press. Inc. 1988. - P. 315-332.

99. Wang, R.H. A probable lignin structure by conformational analysis Текст. / R.H. Wang, J.F. Kennedy, E.H.M. Melo // Carbohydrate polymers. 1989. - V. 10. -№1. - P. 15-30.

100. Kirk, Т.К. Enzymatic «combustion»: the microbial degradation of lignin Текст. / Т.К. Kirk, R.L. Farrel // Ann. Rev. Microbiol. 1987. - P. 125 - 131.

101. Pepper, J.M. The isolation and properties of lignin's obtained by the acidolysis of spruce and aspen woods in dioxan-water medium Текст./ J.M. Pepper, P.E. Baylis, E. Adler // Canad. J. Chem. 1959. - № 8. - P.1241 - 1248.

102. Bogolitsyn, K. G. Application of Ionic Liquids as solvent in lignin chemistry Текст./ ICG. Bogolitsyn, Т.Е. Skrebetc, T.A. Makhova // Proceedings 10th EWLP.-Stocholm, Sweden.- 2008.- P. 153 156.

103. Отчет о НИР 972. Разработка технологических процессов получения лигниновых продуктов.- 1994. Архангельск: АЛТИ.- 72 с.

104. Закис, Г.Ф. Методы определения функциональных групп лигнина Текст. / Г.Ф. Закис, Л.Н. Можейко, Г.М. Телышева. Рига: Зинатне, 1975 - 176 с.

105. Закис, Г.Ф. Функциональный анализ лигнинов и их производных Текст. / Г.Ф. Закис.- Рига: Зинатне, 1987. 230 с.

106. Schmidt, A. Mechanistic and Molecular Investigations on Stabilization of Horseradish Peroxidase С Текст. / A. Schmidt, J.T. Schumacher, J. Reichelt, H.-J. Hecht, U. Bilitewski // Anal. Chem. 2002. - № 74. - P. 3037 - 3045.

107. Klapper, M. The Oxidatic Activity of Horseradish Peroxidase Текст. / M. Klapper, D.P. Hackett // The Journal of Biological Chemistry. 1963. - V. 238. -№11. -P. 3736-3742.

108. Лебедева, О.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена Текст. / О.В. Лебедева, Н.Н. Угарова, И.В. Березин // Биохимия. 1977. - Т. 42. - вып.8. -С. 1372 - 1379.

109. Соколов, О.М. Определение молекулярных масс лигнинов на ультрацентрифуге и методом гель-фильтрации: учебное пособие Текст. / О.М. Соколов. Ленинград, 1978. - 75 с.

110. Смит, А. Прикладная ИК-спектроскопия Текст. / А. Смит; пер. с анг. -Москва, 1982.-328 с.

111. Справочник биохимика Текст. / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К.М. Джонс; пер. с анг. Москва, 1991. - 544 с.

112. Боголицын, К.Г. Химия сульфитных методов делигнификации древесины Текст. / К.Г. Боголицын, В.М. Резников.- Москва: Экология, 1994.288 с.

113. Алпеева, И.С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе Текст. / И.С. Алпеева: Дис. . канд. хим. наук. Москва. - 2007.- 136 с.

114. Диксон, М. Ферменты Текст.: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб; пер. с анг. JI.M. Гинодмана, М.И. Левянт, под ред. В.К. Антонова, А.Е. Браунштейна. -Москва: Мир, 1982. 389 с. - 1 т.

115. Угарова, Н.Н. Пероксидазный катализ и его применение Текст./ Н.Н. Угарова, О.В. Лебедева, А.П. Савицкий.- Москва: МГУ, 1981.- 92 с.

116. Брауне, Ф. Э. Химия лигнина Текст. / Ф. Э. Брауне, Д. А. Брауне; пер. с анг. Москва: Лесная промышленность, 1964 - 865 с.

117. Справочник химика Текст.: в 3 т. Ленинград, 1964. - 1008 с. - 3 т.

118. Пальм, В.А. Основы количественной теории органических реакций Текст. / В.А. Пальм.- Ленинград, 1977. 360 с.

119. Ермакова, М.И. Сравнение ОН-кислотности родственных лигнину фенолов в воде, спиртах и водно-спиртовых смесях Текст./ М.И. Ермакова, М.Ф. Кирюшина, М.Л. Зарубин // Химия древесины. 1984. - № 5. - С. 23 - 29.

120. Горбова Н.С. Кислотно-основные свойства родственных лигнину фенлов в системе вода-апротонный растворитель Текст./ Н.С. Горбова: дис. канд. хим. наук. Архангельск. - 2002. - 120 с.

121. Shindler, J.S. Peroxidase from Human Cervical Mucus Текст. / J.S. Shindler, R.E. Childs, W.G. Bardsley // Eur. J. Biochem. 1976. - № 65. - P. 325 - 331.

122. Childs, R.E. The steady-state kinetics of peroxidase with 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline 6 - sulphonic acid) as chromogen Текст. / R.E. Childs, W.G. Bardsley // Biochem. J. - 1975. - № 145. - P. 93 - 103.

123. Pettersson, J. Kinetics of enzymatic formation of products submitted to firstorder decomposition Текст. / J. Pettersson // Acta Chem. Scand. — 1969. V.23. - P. 979 - 987.

124. Pettersson, J. Statistical methods for determination of empirical rate equations for enzyme reactions Текст. / J. Pettersson // Acta Chem. Scand. 1970. -V.24. - P. 1275 - 1286.

125. Gulbinsky, J.S. Kinetic studies of Escherichia coli galactokinase Текст. / J.S. Gulbinsky, W.W. Cleland // Biochemistry. 1968. - V.7. - P. 1275 - 1286.

126. Куприянович, Ю.Н. Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов Текст. / Ю.Н. Куприянович: Автореф дис.канд. хим. наук. Иркутск. -2009.- 18 с.

127. Келети, Т. Основы ферментативной кинетики Текст. / Т. Келети. -Москва: Мир, 1990. 350 с.

128. Галимова, М.Х. Ферментативная кинетика: Справочник по механизмам реакций Текст. / М.Х. Галимова. Москва: КомКнига, 2007. - 320 с.

129. Боголицын, К.Г. Структурная организация и физико-химические свойства природного лигнина Текст. / К.Г. Боголицын, A.M. Айзенштадт, Т.Э. Скребец, Д.С. Косяков // «Зеленая» химия в России: сборник статей.- Москва: Изд-во МГУ, 2004.- С. 107 127.

130. Боголицын, К.Г. Физическая химия лигнина Текст. / под ред. К.Г. Боголицына, В.В. Лунина. Архангельск: Изд-во АГТУ, 2009. - 489 с.

131. Боголицын, К.Г. УФ-спектроскопия лигнина: Обзор Текст. / К.Г. Боголицын, Ю.Г. Хабаров // Химия древесины. 1985. - № 6,- С. 3 - 29.

132. Фенгел, Д. Древесина: химия, ультраструктура, реакции Текст. / Д. Фенгел, Г.М. Вегенер; пер. с англ.- Москва: Лесная пром-сть, 1988,- 512 с.

133. Базарнова, Н.Г. Методы исследования древесины и ее производных Текст. / Н.Г. Базарнова, Е.В. Карпова, И.Б. Катраков; под ред. Н.Г. Базарновой.-Барнаул: изд-во Алт. ун-та, 2002.- 160 с.

134. Беллами, Л. Инфракрасные спектры молекул Текст. / Л. Беллами; пер. с англ. В.М. Акимова, Ю.А. Пентина, Э.Г. Тетерина, под ред Д.Н. Шигерина. -Москва: Изд-во иностранной лит-ры, 1957.- 444 с.

135. Махова, Т.А. Гидродинамические характеристики диоксанлигнина в ионной жидкости Текст. / Т.А. Махова, Т.Э. Скребец, К.Г. Боголицын // III

136. Международная конференция Физикохимия лигнина: Материалы конференции. -Архангельск. 2009. - С. 34 - 36.

137. Шкаева, Н.В. Физикохимия поведения диоксанлигнина сосны в протонных растворителях Текст. / Н.В. Шкаева: Дис. . канд. хим. наук. -Архангельск. 1998. - 128 с.