автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.13, диссертация на тему:Метод определения компонент смеси на основе двумерного спектра люминесценции

на правах рукописи

А

Орлова Анна Олеговна

Метод определения компонент смеси на основе двумерного спектра люминесценции

Специальность 05.11.13 - Приборы и методы контроля природных сред, веществ, материалов и изделий

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических

наук

Санкт- Петербург 2003

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном институте точной механики и оптики (Технический университет)

Научный руководитель

доктор физико-математических наук, профессор Золотарев Владимир Михайлович

Научный консультант

доктор физико-математических наук Маслов Владимир Григорьевич

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук Данилов Владимир Васильевич

кандидат технических наук, доцент Котов Вадим Петрович

Ведущая организация

Научно-исследовательский институт физики им. В.А. Фока Санкт-Петербургского Государственного Университета

Защита диссертации состоится

2003 г. в

/^ч

часов

на заседании диссертационного совета Д. 212.227.01 при Санкт-Петербургском Государственном институте точной механики и оптики (Технический университет), по адресу: 197101, г. Санкт-Петербург, ул. Саблинская, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПб ГИТМО (ТУ).

Автореферат разослан " /2 " /г^сЯ^^Ас^- 2003 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д. 212.227^)1 кандидат технических наук доцент

Красавцев Валерий Михайлович

гсо> - н 2с>4?\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Люминесцентный анализ широко применяется для идентификации веществ по их спектрам люминесценции и возбуждения люминесценции. Применение люминесцентного анализа, в отличие от других методов анализа смесей, позволяет определять компоненты смеси без предварительного разделения ее на компоненты. Спектр люминесценции гомогенного вещества не зависит от длины волны возбуждающего света. Следовательно, наличие зависимости спектра люминесценции исследуемого объекта от длины волны возбуждения говорит о том, что данный объект является смесью нескольких веществ.

В настоящее время существуют спектрофлуориметры, позволяющие регистрировать двумерные спектры люминесценции. Под двумерными спектрами подразумеваются спектры люминесценции, зарегистрированные при всех возможных длинах волн возбуждения. Возможность получения двумерных спектров люминесценции позволяет проводить обработку полученных данных, не совмещая ее с процессом измерения и, в принципе, применяя специальные компьютерные методы, полностью автоматизировать анализ. Это обуславливает интерес к методам анализа многокомпонентных смесей по двумерному спектру люминесценции.

Широко известны и распространены методы анализа смесей при условии, что известны спектры люминесценции и/или спектры возбуждения люминесценции компонент смеси. В данной диссертационной работе эти методы не рассматриваются, поскольку они решают другую задачу.

В общем случае, когда отсутствует априорная информация о компонентах смеси, задача определения спектрально-люминесцентных характеристик компонент смеси не имеет однозначного решения. Однако, при выполнении определенных условий, однозначное решение может существовать. Ситуации, когда отсутствует априорная информация о числе компонент и спектрах люминесценции возникает, например, при люминесцентном анализе природных загрязнителей. В ряде случаев к такому типу задач относится анализ биологических объектов.

Известные методы определения спектрально-люминесцентных характеристик компонент смеси по двумерным спектрам люминесценции при отсутствии априорной информации о компонентах смеси не удовлетворяют потребности анализа смесей с любым числом компонент. Это обусловлено тем, что в одном случае методы не позволяют анализировать смеси с числом компонент больше трех, а в другом случае неизвестно, сходится ли метод к нужному решению в общем случае (для любого числа компонент).

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в разработке теоретического метода, позволяющего анализировать двумерные спектры люминесценции при отсутствии априорной информации о компо1Ш1и^д смау^Ду^ый метод

6ИБЛИОТЕКА I 3 СПетерЛрг л гП\

09 «О$ях01/>\

должен позволять определять число компонент смеси, спектры люминесценции и спектры возбуждения люминесценции компонент по двумерным спектрам люминесценции для смесей с любым числом компонент.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить границы применимости разрабатываемого метода. Сформулировать условия, при которых возможно однозначное определение спектров люминесценции компонент смеси.

2. Разработать процедуры определения числа компонент смеси, определения спектров люминесценции компонент смеси, и определения спектров возбуждения люминесценции компонент смеси.

3. Провести анализ влияния типа шума (аддитивный, мультипликативный, сумма аддитивного и мультипликативного) и его уровня в двумерном спектре люминесценции смеси на результат применения разработанного метода.

4. Проверить работоспособность метода на смоделированных и реальных объектах.

Научная новизна работы

1. Впервые, для смесей с любым числом компонент, сформулировано условие неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент смеси, выполнение которого достаточно для однозначного определения их спестров люминесценции.

2. Впервые разработан метод (далее метод "последовательных исключений", метод ПИ) определения спектрально-люминесцентных характеристик компонент смеси по двумерному спектру люминесценции, применимый для анализа смесей с любым числом компонент.

3. Впервые продемонстрирована возможность однозначного определения спектров люминесценции компонент для смесей с числом компонент больше трех.

4. Продемонстрирована работоспособность интерактивной процедуры определения спектров люминесценции компонент смеси для случая, когда в двумерном спектре люминесценции четырехкомпонентной смеси на длинноволновой границе плохо выполнено условие неполного попарного перекрывания.

5. Применение метода "последовательных исключений" позволило впервые in vivo определить спектры люминесценции и возбуждения люминесценции биосинтетических предшественников хлорофилла а у одного из мутантных штаммов хламидомонады (ей/-1).

Практическая значимость работы

Разработанный метод "последовательных исключений" может быть реализован в качестве программного продукта, использующего в качестве исходных данных двумерный спектр люминесценции в цифровом виде, в

результате работы которого должны получаться спектры люминесценции и спектры возбуждения люминесценции компонент смеси. Это позволит значительно расширить область применения люминесцентного анализа для исследования многокомпонентных смесей. Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: Международная конференция молодых ученых и специалистов "Оптика 99", г. С.-Петербург, 1999 г; Российская научно-практическая конференция "Оптика и научное приборостроение - 2000" ФЦП "Интеграция", г. С.-Петербург, 2000г; Санкт-Петербургский государственный институт точной механики и оптики (технический университет). Юбилейная научно-техническая конференция профессорско-преподавательского состава, посвященная 100-летию университета 29-31 марта 2000 года, г. С.-Петербург, 2000 г; XXXII научная и учебно-методическая конференция СПбГИТМО (ТУ), посвященная 300-летию Санкт-Петербурга, г. С.-Петербург, 2003г. Публикации

Материалы, представленные в диссертации, опубликованы в 4 статьях и в 2 тезисах докладов конференций. Личный вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Автором проводилась разработка процедуры, реализующий метод "последовательных исключений", выбор объектов для демонстрации работоспособности метода, анализ данных, полученных в результате применения метода, а также выполнен весь объем спектрально-люминесцентных измерений.

Совместно с научным руководителем Золотаревым В.М. и научным консультантом, Масловым В.Г., сформировано основное научное направление работы, ставился ряд задач и проводился анализ и обсуждение полученных результатов.

Основные защищаемые положения и результаты:

1. Сформулировано условие неполного попарного перекрывания спектров люШшесценции компонент"смеси, при "котором принципиально возможно однозначное определение люминесцирующих компонент по двумерным спектрам люминесценции для смесей с любым числом компонент.

2. Разработан метод "последовательных исключений", который, при выполнении условия неполного попарного перекрывания, позволяет определять спектрально люминесцентные характеристики компонент смеси по двумерным спектрам люминесценции. Метод не имеет принципиальных ограничений для числа компонент смеси.

3. Разработан математический алгоритм, реализующий метод "последовательных исключений".

4. Предложен модифицированный метод "последовательных исключений" для смесей с нарушением условия неполного попарного перекрывания для какой либо одной пары компонент.

5. Показана применимость метода к объектам низкого оптического качества (неоднородным, рассеивающим) на примере биологических объектов; впервые in vivo определены спектры люминесценции и возбуждения люминесценции металлокомплекса протопорфирина и агрегированной формы протопорфирина IX у мутантного штамма хламидомонады. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы, содержащего 33 наименования. Полный объем диссертации составляет 157 страниц и включает 5 таблиц и 62 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение. Во введении обоснована актуальность работы, показана научная новизна и практическая значимость работы, изложены основные защищаемые положения и описана структура диссертации. Глава 1. Литературный обзор.

В этой главе рассмотрены методы, описанные в литературе, которые позволяют определять спектры компонент смеси на основе обработки зарегистрированных спектров смеси. Известные методы предполагают выполнение следующих ограничений: (1) спектры индивидуальных компонент являются линейно-независимыми; (2) спектр смеси представляет собой аддитивную сумму спектров индивидуальных компонент; (3) спектры индивидуальных компонент содержат только положительные значения; (4) исходные спектры смеси являются положительными комбинациями спектров индивидуальных компонент.

Одним из основных методов определения спектральных свойств компонент смеси, описанных в литературе, является метод анализа главных компонент с использованием "самомоделирования" (АГК-СМ) (Principal Component Analysis with Self-Modeling technique) [1], разработанный для анализа двухкомпонентных смесей. В методе АГК-СМ анализ смеси основан на том, что искомые спектры компонент, как и зарегистрированные спектры смеси, являются линейными комбинациями к (к - число компонент смеси) собственных векторов. Таким образом, задача сводится к определению числа собственных "значимых" векторов и определению коэффициентов линейных преобразований, соответствующих собственных векторов. Для определения числа компонент смеси вычисляется матрица ковариаций М =[КТ]/и (где Y(mxn) - матрица, содержащая зарегистрированные спектры смеси, т - число длин волн регистрации, п - количество зарегистрированных спектров смеси). Введение двух ограничений: зарегистрированные спектры смеси и искомые спектры компонент не содержат отрицательных значений, позволяет для

двухкомпонентной смеси определить две области в плоскости коэффициентов линейного преобразования. Для однозначного определения искомых спектров компонент в данном методе введено следующее дополнительное ограничение. На границах зарегистрированных спектров смеси должны существовать, по крайней мере, две точки в которых отличны от нуля первая и вторая компоненты соответственно.

В модификации метода АГК-СМ [2], разработанной для анализа трехкомпонентных смесей это ограничение сформулировано следующим образом: на границах спектров люминесценции смеси должны существовать области, в которых отлична от нуля интенсивность только одной из компонент. Однако из-за наличия шума в зарегистрированных спектрах люминесценции смеси в методе [2] выполнение данного условия не позволяет полностью автоматизировать процедуру определения спектров люминесценции компонент, и для однозначного определения спектров компонент в этом методе применяется интерактивная процедура. Следует отметить, что данный метод принципиально применим для анализа смесей с числом компонент не больше трех.

В первой главе также рассмотрены методы, в которых не используется ограничение, согласно которому на границах зарегистрированных спектров смеси должны существовать две области, где отлична от нуля интенсивность только одной из компонент [3, 4]. В общем случае, если это ограничение не выполняется, то задача не имеет однозначного решения, и указанные методы решают неопределенную задачу, давая в качестве решения наиболее вероятные спектры индивидуальных компонент.

Глава 2. Разработка метода "последовательных исключений" (ПИ), основанного на пошаговых попарных линейны» преобразованиях спектров люминесценции.

Предполагается, что исследуемые смеси удовлетворяют следующим условиям: (I) анализируемая смесь является аддитивной, т.е. спектр смеси представляет собой аддитивную сумму спектров индивидуальных компонент и (2) компоненты, входящие в смесь, должны быть гомогенны. Разработанный нами метод "последовательных исключений" позволяет однозначно определять число компонент смеси, их спектры люминесценции и возбуждения люминесценции при выполнении следующих ограничений.

1. Зарегистрированные спектры люминесценции смеси и искомые спектры люминесценции и возбуждения люминесценции компонент смеси не содержат отрицательных значений.

2. Область возбуждения люминесценции и область регистрации люминесценции смеси не пересекаются друг с другом.

3. Для спектров люминесценции компонент смеси выполняется условие неполного попарного перекрывания. Это означает, что для спектров люминесценции каждой из пары компонент смеси существуют области длин

волн, в которой каждая из компонент люминесцирует по отдельности, т.е. присутствует люминесценция одной компоненты и отсутствует люминесценция другой. В разработанном нами методе "последовательных исключений" используется частный случай условия: для каждой пары компонент смеси существуют области длин волн, непосредственно примыкающие к длинноволновой и коротковолновой границам суммарной области люминесценции обеих компонент, в которых каждая из этих двух компонент люминесцирует по отдельности. В частности, из этого следует, что на границах зарегистрированных спектров люминесценции смеси должна быть отлична от нуля люминесценция не более чем одной компоненты.

Исходный двумерный спектр люминесценции смеси рассматривается как набор векторов Р] = {^,-(4,),У,(ЛД...,К7(Ят)}, где ] = 0,...,к - нумерует длины волн возбуждения; Я,- - длина волны регистрации люминесценции; / = 0,...,т -нумерует длины волн люминесценции. Каждый из данных векторов представляет собой зарегистрированный спектр люминесценции при определенной длине волны возбуждения. При определении спектров возбуждения люминесценции компонент этот набор векторов рассматривается как матрица размерностью кхт, строки которой соответствуют спектрам люминесценции смеси при различных длинах волн возбуждения, а столбцы -спектрам возбуждения люминесценции смеси при различных длинах волн регистрации люминесценции. Для определения спектров люминесценции компонент смеси используются не все векторы К,, входящие в

зарегистрированный двумерный спектр люминесценции смеси, а только п (п -число компонент смеси) векторов, соответствующих репрезентативным спектрам. Под репрезентативными спектрами подразумеваются спектры люминесценции смеси из набора зарегистрированных, которые в наибольшей степени являются линейно-независимыми и наиболее полным образом описывают пространство размерностью и, занимаемое искомыми спектрами люминесценции компонент.

Определение числа компонент смеси в данном случае сводится к задаче определения размерности пространства по его заданным к векторам. Разработанная в данной работе процедура ортогонализации наряду с определением числа компонент смеси позволяет также получить информацию о том, какие из зарегистрированных спектоов люминесценции смеси являются в наибольшей степени линейно-независимыми, и именно они используются в дальнейшем для определения спектров люминесценции компонент. Перед началом процедуры векторы нормируются. Нормы векторов вычисляются по формуле:

(2.1)

где Уj ¡ - элементы вектора Vj, т - размерность вектора. Процедура ортогонализации состоит из к -1 шагов. Перед началом 1 -го шага на место первого вектора К, ставится вектор, имеющий максимальную норму. На каждом (1-ом) шаге производится ортогонапизация всех оставшихся неортогонализованными векторов Vj (у = /,...А, к - общее число векторов):

у]=у]-(У'н-У^-У^ -(у]-2-Уу)-у}-2-...-(Угу,)-У; (2.2>

где У{ = К,, все остальные векторы ортогонализуются относительно вектора У{\

У}-\>У}-2у->У\ " векторы, ортогонализованные на предыдущих шагах.

Затем по формуле (2.1) вычисляются нормы полученных векторов У]. С

увеличением номера шага нормы векторов V] уменьшаются. Для того чтобы

из-за уменьшения норм векторов, получающихся на каждом / шаге, процесс ортогонализации не окончился преждевременно без достижения требуемой точности, из полученных на этом шаге векторов выбирается вектор с наибольшей нормой и ставится на место 1-го. Последовательность, в которой переставляются векторы на каждом шаге, запоминается, чтобы имелась возможность определить, каким порядковым номерам зарегистрированных спектров смеси соответствуют порядковые номера векторов, полученных в результате процедуры ортогонализации. После этого выполняется переход к следующему шагу.

После завершения процедуры ортогонализации осуществляется определение числа люминесцирующих компонент смеси (л). Для этого нами был разработан следующий критерий. Число компонент смеси определяется по максимальному номеру (л) ортогонализованного вектора У^ (у = 1,...,£), для нормы которого еще выполняется система неравенств:

где №„, - значения норм ортогонапизованных векторов V]

(у' = я,...,я + 3); а - эмпирически подбираемый параметр, который в большинстве случаев, рассматриваемых в данной работе, полагался равным 10.

Репрезентативным спектрам соответствуют п зарегистрированных спектров люминесценции смеси, порядковые номера которых совпадают с номерами первых п ортогонапизованных векторов К].

Для определения спектров люминесценции компонент смеси применяется процедура, включающая в себя "прямой" и "обратный" ход.

К+1 ~ N'„+2 > М'п+2 - М'л+3

(2.3)

Перед началом процедуры репрезентативные спектры нормируются по формуле (2.1) и переставляются следующим образом. На первое место ставится спектр, у которого относительная интенсивность люминесценции длинноволновой компоненты максимальна на длинноволновой границе репрезентативных спектров, т.е. спектр, имеющий наибольшую длинноволновую границу. "Прямой" ход состоит из п -1 шагов. На каждом /ом шаге "прямого" хода вычисляются линейные комбинации векторов:

= к/'-|) + т , (2.4)

где - векторы, полученные на предыдущем шаге, а Ко*1-1* - вектор,

выбранный из набора векторов, полученных на предыдущем шаге как имеющий наибольшую длинноволновую границу; на первом шаге данным векторам соответствуют репрезентативные спектры; / - номер шага, 7=1

В конце каждого шага проводится нормировка (2.1) полученных векторов У^. Из этих векторов выбирается вектор, имеющий наибольшую длинноволновую границу, и переставляется с вектором К0(,). После этого осуществляется переход к следующему шагу.

На "обратном" ходе используются все (л-1) векторов К0(,), полученных на "прямом" ходе. В результате "прямого" хода получаем вектор V"'1 = у„, соответствующий спектру люминесценции самой коротковолновой компоненты.

"Обратный" ход также включает в себя и-1 шагов. На каждом /-ом шаге "обратного" хода последовательно через п — 1 промежуточных векторов Уцц получаем вектор V,, соответствующий спектру люминесценции одной из оставшихся компонент:

V - ¿?('-1)

1) = К\(п-п + т„уп

УцпЧ-2) = + тп-\^п-\ (2-5)

где / = и —1,...,1 - номер шага, у„,ул_,,...,у)+| - полученные на предыдущих шагах спектры люминесценции индивидуальных компонент, а К0(,_|) - векторы, полученные на "прямом" ходе.

После этого проводится нормировка полученного вектора V, (2.1) и происходит переход к следующему шагу.

Множители т, входящие в формулы (2.4, 2.5), подбираются таким образом, чтобы векторы, вычисляемые по этим формулам, имели компоненты, близкие к нулю в максимально широкой области спектра, примыкающего к длинноволновой и к коротковолновой границе соответственно. В данной работе для определения множителей т разработаны три способа: интерактивный и два автоматических. Интерактивный способ определения множителей т разработан для тех случаев, когда исходные спектры люминесценции смеси сильно зашумлены и/или для какой-то пары компонент плохо выполнено условие неполного попарного перекрывания. Следует отметить, что разработанные в данной работе варианты не предполагаются единственно возможными и являются одними из возможных вариантов реализации метода последовательных исключений.

Для определения спектров возбуждения люминесценции используется общее соотношение между спектрами люминесценции смеси, спектрами люминесценции компонент и спектрами возбуждения люминесценции компонент [5]:

= (2-6)

/=|

где \vjj- спектр возбуждения люминесценции 1-й компоненты; V, ,- - спектры

люминесценции /-й компоненты индексы у и / нумеруют спектральные точки спектров возбуждения и люминесценции, соответственно; Уj¡

экспериментально зарегистрированные спектры люминесценции смеси для всех длин волн возбуждения; п - число компонент смеси.

Спектры возбуждения люминесценции компонент могут быть определены из системы линейных уравнений (2.6) при условии, что известны спектры люминесценции смеси и спектры люминесценции компонент. Суммарное число неизвестных равно } х я, в то время как число уравнений равно числу т точек в спектре люминесценции, в большинстве случаев значительно превышающих число неизвестных. Следовательно, система линейных уравнений (2.6) в этих случаях является избыточной.Такие системы могут быть решены несколькими способами.

Один из возможных способов решения состоит в том, что в системе (2.6) оставляются п уравнений, соответствующих длинам волн регистрации репрезентативных спектров возбуждения люминесценции. Репрезентативные спектры возбуждения люминесценции могут быть получены путем применения процедуры ортогонализации на множестве спектров возбуждения люминесценции смесей, т.е. на столбцах, а не строках исходной матрицы. Такой способ выбора и уравнений из системы (2.6) обеспечивает наилучшую обусловленность системы оставшихся линейных уравнений.

Более простой способ выбора, но также обеспечивающий хорошую обусловленность системы уравнений заключается в следующем: выбирается п

точек, совпадающих с максимумами полос люминесценции компонент или близкие к ним.

В работе изложено обобщение метода "последовательных исключений" на случай нарушения условия неполного попарного перекрывания для какой либо пары компонент смеси. Данная модификация метода позволяет определять число компонент смеси, определять спектры люминесценции и возбуждения люминесценции компонент смеси для которых условие неполного попарного перекрывания спектров люминесценции выполнено.

Предлагаемая модификация не позволяет определять спектры люминесценции и возбуждения люминесценции той пары компонент, для спектров люминесценции которых нарушено условие неполного попарного перекрывания. Для данных компонент спектры определяются с точностью до их линейного преобразования.

Число люминесцирующих компонент смеси, и выбор репрезентативных спектров люминесценции осуществляется так же, как и в методе последовательных исключений.

В процедуре определения спектров люминесценции компонент исключение компонент, для которых выполнено условие неполного попарного перекрывания, осуществляется аналогично тому, как это делается в методе "последовательных исключений". Спектры же пары компонент, для которых это условие нарушено, исключаются одновременно. Для этого в работе предложены два способа определения множителей. В результате получаем п-2 (и - число компонент смеси) векторов, соответствующих искомым спектрам люминесценции компонент, для которых условие неполного попарного перекрывания выполнено. Для пары компонент с нарушенным условием, получаем два вектора, соответствующих линейным комбинациям их спектров люминесценции.

Спектры возбуждения люминесценции компонент определяются так же, как и в методе "последовательных исключений", по формуле (2.6). В результате получаем спектры возбуждения люминесценции компонент, для которых условие выполнено и две линейные комбинации спектров возбуждения для пары компонент с нарушенным условием.

Проведен анализ возможности применения метода "последовательных исключений" в особых случаях: наличие переноса энергии между компонентами смеси и высокие концентрации компонент смеси. Было выяснено, что метод применим в обоих случаях, за исключением ситуации, когда наличие одновременно и реабсорбции, и сильного поглощения возбуждающего света приводит к ложной зависимости регистрируемого спектра люминесценции от длины волны возбуждения.

Глава 3. Применение метода ПИ для исследования гомогенных растворов.

В этой главе разработанный метод применен для анализа смоделированный шестикомпонентной смеси (при отсутствии шумов) и анализа трех- и

четырехкомпонентных растворов, а также проанализировано влияние уровня и типа шума в исходных спектрах люминесценции смеси на результат применения метода.

В моделируемой смеси спектры люминесценции и возбуждения люминесценции компонент смеси полагались равноотстоящими гауссовыми функциями с равными полуширинами полос. В результате применения метода, как и следовало ожидать, были получены спектры люминесценции и возбуждения люминесценции компонент смеси, полностью идентичные смоделированным спектрам.

Трехкомпонентная смесь включала в себя р -метилунбелиферон, флуоресцеин и неизвестную примесь, которая была обнаружена нами при регистрации двумерного спектра люминесценции смеси. В полученном спектре люминесценции неизвестной примеси (из-за низкой интенсивности в двумерном спектре люминесценции смеси) уровень шума на порядок превышал уровень шума в полученных спектрах люминесценции двух оставшихся компонент.

Исследовались три четырехкомпонентные смеси, которые отличались между собой четвертой, длинноволновой компонентой. В качестве первой компоненты в эти смеси входил антрацен. Второй компонентой являлся кумарин и третьей -родамин 6Ж. Для смеси №1 четвертой компонентой был взят родамин Б, для смеси №2 - протопорфирин и для смеси №3 - феофитин а.

Для четырехкомпонентной смеси №1 на длинноволновой границе зарегистрированного двумерного спектра люминесценции из-за сильного перекрывания спектров люминесценции родамина 6Ж и родамина Б плохо выполнено условие неполного попарного перекрывания. Поэтому, в данном случае для определения спектров люминесценции компонент смеси был применен интерактивный способ определения множителей т, входящих в (2.4, 2.5). Для смесей №2 и №3 в процедуре определения спектров люминесценции компонент были применены автоматические способы определения множителей т. Полученные спектры люминесценции компонент смесей, исследованных в данной работе, практически соответствовали измеренным спектрам люминесценции компонент, за исключением шумов. В наибольшей степени оказались зашумлены полученные спектры люминесценции компонент смеси №1, поскольку в зарегистрированном двумерном спектре люминесценции данной смеси, по сравнению со смесями №2 и №3, концентрация веществ была самой низкой и, следовательно, отношение сигнал/шум также было минимальным. Для определения спектров возбуждения люминесценции компонент в системе (2.6) оставлялись уравнения, соответствующие точкам, близким к максимумам полос люминесценции компонент. Полученные спектры возбуждения люминесценции компонент исследованных смесей имели удовлетворительное соответствие с измеренными спектрами, либо с

литературными данными. На рисунках 1 и 2 представлены полученные спектры люминесценции, и возбуждения люминесценции компонент смеси №2.

Анализ влияния типа и уровня шума в исходном двумерном спектре люминесценции смеси на результат применения метода "последовательных исключений" был проведен на смоделированных многокомпонентных смесях (с числом компонент от 2 до 6).

и сиси-

/У

/ \ / ./Ч-Л/

м

до зоо но з» ззо «о 1ч за зя зю

. —I —4

310 320 330 340 14 ЗМ 310 310

Рис. I. Четырехкомпонентная смесь №2. Полученные Рис. 2. Четырехкомпонентная смесь №2. Спектры спектры люминесценции компонент. I - антрацен; 2 возбуждения люминесценции компонент. I - антрацен; 2 -- кумарин: 3 - родамин 6Ж; 4 - протопорфирин. кумарин: 3 - родамин 6Ж; 4 - протопорфнрин.

Число компонент смеси Максимально допустимый уровень шума (%)

2 20

3 10

4 8

5 6

6 4

Выяснено, что для каждой смеси существует свой предельно допустимый уровень шума, при котором _еще выполняется _ неравенство (2.3) для правильного значения п (п - число компонент смеси). В таблице 1 приведены предельно допустимые уровни шума для смоделированных смесей.

Для смоделированной шестикомпонентной смеси, при максимально допустимом уровне шума в исходных спектрах люминесценции смеси, были исследованы зависимости уровня шума в получаемых на каждом шаге спектрах и дисперсии множителя от номера шага на "прямом" и "обратном" ходе в процедуре определения спектров люминесценции компонент смеси. На рисунках 3 и 4 представлены зависимости уровня шума в получаемых спектрах от номера шага на "прямом" и "обратном" ходе. Как видно из рисунков, на "прямом" ходе процедуры уровень шума на последовательных шагах линейного преобразования возрастает, хотя не всегда монотонно. На

"обратном" ходе уровень шума в определяемых спектрах люминесценции компонент на последовательных шагах сначала возрастает, но на дальнейших шагах, начиная со второго, уменьшается. Было установлено, что ход зависимости уровня шума от номера шага определяется дисперсией множителя.

Рис. 3. Смоделированная шестикомпонентная смесь. Зависимость уровня шума от номера шага на "прямом" холе. I - аддитивный шум. 2- мультипликативный шум. 3 - сумма аддитивного и мультипликативного шума.

Рис. 4. Смоделированная шестикомпонентная смесь. Зависимость уровня шума от номера шага на "обратном" ходе. I - аддитивный шум, 2 -мультипликативный шум, 3 - сумма аддитивного и мультипликативного шума.

Глава 4. Применение метода ПИ для исследования дисперсных систем, на примере фотосинтезируюших объектов.

В данной главе исследованы спектрально-люминесцентные свойства трех типов мутантных штаммов хламидомонады из коллекции БиНИИ СП 6ГУ [5]: ацетат-зависимые мутантные штаммы, штаммы с нарушенным синтезом каротиноидов и штаммы с нарушенным синтезом хлорофилла а. Все данные штаммы характеризуются нарушенным фотосинтетическим аппаратом, вследствие этого в их спектрах люминесценции наблюдались полосы, принадлежащие биосинтетическим предшественникам хлорофилла а. В спектрах люминесценции клеток ацетат-зависимых (ас-5) мутантных штаммов хламидомонады (сс-1677 и 1656-Id) и мутантных штаммов с нарушенным синтезом каротиноидов (ltsl-164 и ltsl-171), выращенных в темноте, наряду с люминесценцией хлорофилла а наблюдались полосы протохлорофиллида (635 нм) и метапло-комплекса протопорфирина (590 нм).

У штамма с нарушенным синтезом хлорофилла a (chl-1-19) в спектре люминесценции присутствовали полосы протопорфирина IX (635 и 705 нм), метаплокомплекса протопорфирина (590 нм) и агрегированной формы протопорфирина (670 нм). Для анализа спектров люминесценции клеток данного мутантного штамма был применен метод "последовательных исключений". В результате применения метода было установлено, что в данном

штамме присутствуют три люмииесцирующих пигмента, спектры люминесценции которых представлены на рисунках 5 ("а", "б", "в").

I,

»50 700 Хим

Рис. 5 а. Мутантный штамм сМ-1-19. Полученный спектр люминесценции первой компоненты - агрегированной формы протопорфирина IX.

Рис. 5 б. Мутантный штамм chl-l-19. Полученный спектр I люминесценции второй компоненты - протопорфирина IX.

* 1 и о

Рис. 5 в. Мутантный штамм сИМ-19. Полученный спектр Рис. 5 г. Спектры возбуждения люмииесцирующих пигмент) люминесценции третьей компоненты - штамма сМ-1-19. полученные методом последовательных в

металлокомплекса протопорфирина.

исключений: I - агрегированная форма протопорфирина;2 • протопорфирин IX; 3 - металлокомплекс протопорфирина.

Применение метода позволило впервые in vivo определить полный спектр люминесценции металло-комплекса протопорфирина, а также определить спектр люминесценции агрегированной формы протопорфирина. На рисунке 5 "г" приведены полученные спектры возбуждения люминесценции этих пигментов. Полученные спектры люминесценции и возбуждения люминесценции пигментов имеют хорошее качественное соответствие с соответствующими спектрами in vitro, приведенными в литературе.

Метод "последовательных исключений" был применен также для исследования гомогенности хлорофилла а в клетках штамма "дикого типа". В результате процедуры ортогонапизации было установлено, что в данном объекте присутствует только одна люминесцирующая компонента. Это свидетельствует о том, что в данном штамме люминесцирует только одна спектральная форма хлорофилла а.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. V.H. Lawton and Е.А. Sylvestre, Self Modeling Curve Resolution. Technometrics, v,13,1971,pp.617-633.

2. Spalletti, G. Bartocci, F. Masetti, U. Mazzucato and G. Gruciani, Principal-component self-modeling analysis of fluorescence for some trans-diarylethylenes. A compatison with kinetic analysis. Chem. Phys., v. 160,1992, pp. 131-144.

3. N. Ohta, Estimating Absorption Band of Component Dyes by Means of Principal Component Analysis. Anal. Chem., v. 45, № 3, 1973, pp. 553 - 557.

4. M. Dalibart, Multicomponent analysis in luminescence spectroscopy. Talanta, v. 44, 1997, pp. 2231-2235.

5. K.B. Квитко, Т.Н. Борщевская, A.C. Чунаев, B.B. Тугаринов, Петергофская генетическая коллекция штаммов зеленых водорослей Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas. Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Л., 1987, с. 28-57.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа посвящена люминесцентному анализу сложных смесей без использования априорной информации о спектральных свойствах компонент смеси. Были исследованы люминесцентные свойства мутантных штаммов хламидомонады, определены спектры люминесценции и возбуждения люминесценции биосинтетических предшественников хлорофилла а у мутантного штамма с нарушенным синтезом хлорофилла а.

Основные результаты и выводы работы могут быть сформулированы следующим образом:

1. Сформулировано условие неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент смеси, при котором принципиально возможно однозначное определение люминесцирующих компонент по двумерным спектрам люминесценции для смесей с любым числом компонент.

2. Разработан метод "последовательных исключений", который, при выполнении условия неполного попарного перекрывания, позволяет определять спектрально люминесцентные характеристики компонент смеси по двумерным спектрам люминесценции. Разработанный метод принципиально применим для исследования смесей с любым числом компонент. Работоспособность метода "последовательных исключений"

продемонстрирована на смоделированной шестикомпонентной смеси (в отсутствии шумов) и на реальных трех- и четырехкомпонентных смесях.

3. Разработана процедура определения спектров возбуждения люминесценции компонент смеси, основанная на выборе из избыточной системы линейных уравнений ограниченного их числа, равного числу компонент смеси. Рассмотрены два варианта выбора уравнений, обеспечивающие наилучшую обусловленность системы оставшихся линейных уравнений. Продемонстрирована работоспособность одного из предложенных вариантов.

4. Предложено обобщение метода "последовательных исключений" на случай смесей с нарушенным условием неполного попарного перекрывания для какой либо пары компонент. Модифицированный метод ПИ позволяет определять спектры люминесценции и возбуждения люминесценции тех компонент смеси, для которых данное условие выполнено. Компоненты, для которых условие нарушено, определяются с точностью до линейного преобразования в образуемом ими подпространстве.

5. Выяснено, что для смесей с различным числом компонент для каждой смеси существует свой допустимый уровень шума в исходных спектрах люминесценции смеси, при котором еще выполняется критерий определения числа компонент для правильного значения' компонент смеси. Данное свойство метода продемонстрировано на модельных объектах (смоделированные смеси с числом компонент от двух до шести). Выяснено, что процедура определения спектров люминесценции компонент осуществляется с накоплением шумов. На модельном объекте (смоделированная шестикомпонентная смесь) продемонстрировано, что зависимость уровня шума от номера шага в процедуре определения спектров люминесценции компонент может иметь сложный нелинейный характер.

6. Впервые in vivo обнаружена люминесценция метаплокомплекса протопорфирина IX (положение главной максимума полосы люминесценции 590 нм). Данный пигмент присутствовал во всех трех типах исследованных

мутантных штаммов--хламидомонады. Применение метода

последовательных исключений для исследования одного из мутантных штаммов (chl-1) позволило впервые полностью определить спектр люминесценции металлокомплекса протопорфирина IX и определить спектры люминесценции и возбуждения люминесценции пигмента с полосой люминесценции 670 нм. Данный пигмент предположительно идентифицирован нами как агрегированная форма протопорфирина IX.

7. Применение метода последовательных исключений позволило установить гомогенность хлорофилла а в штамме "дикого" типа хламидомонады.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. А.О. Орлова, В.Г. Маслов, А. С. Чунаев Изучение пигментного состава фотосинтезирующих объектов с помощью спектрально-люминесцентных методов. // Тезисы докладов Российской научно-практической конференции "Оптика и научное приборостроение - 2000" ФЦП "Интеграция", С.Петербург, СПбГИТМО (ТУ), 2000, с. 13.

2. А.О. Орлова. Способы компьютерной обработки экспериментальных спектрограмм. II Тезисы Юбилейной научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 100-летию университета, С.-Петербург, СПбГИТМО (ТУ), 2000, с 16.

3. А.О. Орлова, В.Г. Маслов, A.C. Чунаев. Исследование спектрально-люминесцентных свойств мутантных штаммов хламидомонады. // Труды молодых ученых и специалистов. Сборник научных статей. Выпуск 1. Часть 1., СПб, СПбГИТМО (ТУ), 2000, с.48.

4. А.О. Орлова, В.Г. Маслов. Метод определения компонентов смеси по двумерным спектрам люминесценции. // Оптический журнал, 2001, т.68, №1, с. 25-28.

5. А.О. Орлова. Анализ многокомпонентной смеси по двумерным спектрам люминесценции. // Современные технологии. Труды молодых ученых ИТМО. Под ред. Проф. С.А. Козлова, СПб, СПбГИТМО (ТУ), 2001, с.24-31.

6. А.О. Орлова, В.Г. Маслов. Применение метода последовательных исключений для определения люминесцирующих компонент фотосинтезирующих объектов. // Оптический журнал, 2002, т.69, №3, с.21-24.

I

I

к

>

!

Тиражирование и брошюровка выполнены в типографии ФГУП «НПО «Аврора» 194021, Санкт-Петербург,ул.Карбышева, 15 (812) 247-23-11 Тираж 80 экз.

2043 1

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Методы определения спектральных свойств компонент смеси для двухкомпонентных систем.

1.2. Обобщение метода АГК-СМ на случай трехкомпонентных систем.

1.3. Методы, учитывающие только положительность спектров.

Люминесцентный анализ широко применяется для решения широкого ряда научных и прикладных задач. С помощью люминесцентного анализа решаются задачи качественного и количественного характера. Он применяется для идентификации вещества по его спектрам люминесценции и спектрам возбуждения люминесценции, для определения концентрации исследуемого объекта, если известны его спектры люминесценции и (или) возбуждения люминесценции. Как известно, существуют и другие методы анализа смесей - например хроматография, экстракция и электрофорез. В данных методах смесь разделяется на компоненты, а затем каждая из компонент отдельно идентифицируется. Люминесцентный анализ позволяет определять компоненты смеси без предварительного их разделения на отдельные компоненты. Как известно, спектр люминесценции гомогенного вещества не зависит от длины волны возбуждающего света. Следовательно, наличие зависимости спектра люминесценции исследуемого объекта от длины волны возбуждения говорит о том, что данный объект является смесью нескольких веществ.

В настоящее время существуют приборы - спектрофлуориметры, которые позволяют регистрировать двумерные спектры люминесценции. Под двумерными спектрами подразумеваются спектры люминесценции, зарегистрированные в широком диапазоне длин волн возбуждения. Возможность получения двумерных спектров люминесценции позволяет проводить обработку полученных данных, не совмещая ее с процессом регистрации. Метод "последовательных исключений", представленный в этой работе, основан на обработке двумерного спектра люминесценции смеси, который содержит всю спектральную информацию.

Для изучения и анализа оптических свойств широкого круга объектов применяются спектрально-люминесцентные методы определения индивидуальных характеристик компонент смеси. Это обусловлено тем, что молекулы обладают индивидуальными спектрами люминесценции. Если спектры индивидуальных компонент известны, то задача определения спектральных свойств компонент смеси в общем случае может быть сведена к решению системы линейных уравнений. Методы, которые решают данную задачу, широко известны и описаны в литературе.

При анализе смеси в некоторых случаях можно определить спектры люминесценции и возбуждения люминесценции, как для известных, так и неизвестных компонент без применения специальных вычислительных методов. Во-первых, это возможно в том случае, если в спектрах возбуждения люминесценции каждой из компонент существует область, при возбуждении в которой люминесцирует только эта компонента. Ко второму случаю относится ситуация, когда спектры люминесценции компонент смеси спектрально разнесены. В данных случаях можно идентифицировать компоненты смеси по их спектрам поглощения, поскольку в большинстве случаев спектр возбуждения люминесценции вещества совпадает с его спектром поглощения.

В случае же, когда спектры возбуждения люминесценции неизвестных компонент смеси сильно перекрываются друг с другом, задача определения индивидуальных свойств неизвестных компонент смеси в общем случае не имеет однозначного решения. Однако, при выполнении определенных условий, задача определения спектров неизвестных компонент смеси может иметь однозначное решение. Методы, которые решают эту задачу, мало распространены и применялись для определения компонент смеси с числом компонент не более трех.

В данной работе разработан "метод последовательных исключений", который позволяет определять спектры люминесценции индивидуальных компонент смеси при отсутствии априорной информации о компонентах, т.е. когда неизвестно число компонент и их спектры люминесценции. Теоретически метод "последовательных исключений" может быть применен к смесям с любым числом компонент. Данный метод применим к смесям, удовлетворяющим следующим условиям: 1) анализируемая смесь является химически и спектрально аддитивной; 2) спектры люминесценции компонент смеси не должны полностью попарно перекрываться. Подробно условие 2) рассмотрено и обосновано в главе 2. Предполагается также, что в анализируемых смесях выполняется закон Вавилова - спектры люминесценции индивидуальных компонент не зависят от длины возбуждения люминесценции.

Ситуации, когда отсутствует априорная информация о числе компонент и спектрах люминесценции возникает, например, при люминесцентном анализе природных загрязнителей. В ряде случаев к такому типу задач относится анализ биологических объектов. Обычно, у фотосинтезирующих организмов существует только люминесценция хлорофилла "а". Люминесценция других пигментов отсутствует, вследствие полного переноса энергии на хлорофилл "а". В данной работе метод последовательных исключений был применен для анализа спектральных свойств мутантного штамма хламидомонады Chl-1. Данный штамм характеризуется нарушенным синтезом хлорофилла а. Из-за дезагрегации пигментного аппарата перенос энергии между другими пигментами сильно ослаблен. Поэтому, в спектрах люминесценции Chi-1, в отличие от "дикого" типа, вместо люминесценции только хлорофилла а наблюдаются несколько полос, принадлежащих предшественникам хлорофилла а. С точки зрения люминесцентных свойств такой объект может рассматриваться как аддитивная многокомпонентная система.

Основные защищаемые положения:

1. Сформулировано условие неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент смеси, при котором принципиально возможно однозначное определение люминесцирующих компонент по двумерным спектрам люминесценции для смесей с любым числом компонент.

2. Разработан метод "последовательных исключений", который, при выполнении условия неполного попарного перекрывания, позволяет определять спектрально люминесцентные характеристики компонент смеси по двумерным спектрам люминесценции. Метод не имеет принципиальных ограничений для числа компонент смеси.

3. Разработан математический алгоритм, реализующий метод "последовательных исключений".

4. Предложен модифицированный метод "последовательных исключений" для смесей с нарушением условия неполного попарного перекрывания для какой либо одной пары компонент смеси.

5. Показана применимость метода к объектам низкого оптического качества (неоднородным, рассеивающим) на примере биологических объектов; впервые in vivo определены спектры люминесценции и возбуждения люминесценции металлокомплекса протопорфирина и агрегированной формы протопорфирина IX у мутантного штамма хламидомонады.

Диссертационная работа имеет следующую структуру. В первой главе изложены и проанализированы представленные в литературе методы определения компонент смеси без использования эталонов. Методы, описанные в литературе можно разделить на две группы. К первой группе относятся методы, которые решают задачу, имеющую единственное решение, и дают истинное решение. Ко второй группе относятся методы, решающие неопределенную задачу и дающие наиболее вероятное решение.

Вторая глава посвящена методу "последовательных исключений". Во-первых, рассмотрены ограничения и область применения метода. Во-вторых, рассмотрен алгоритм определения спектров люминесценции индивидуальных компонент смеси и спектров возбуждения люминесценции. Наряду с двумя автоматическими вариантами определения спектров люминесценции компонент изложен также и интерактивный вариант. Отдельно рассмотрено обобщение метода в случае нарушения условия неполного попарного перекрывания спектров люминесценции для какой либо одной пары компонент смеси.

В третьей главе рассмотрены результаты применения "метода последовательных исключений". Работоспособность метода, во-первых, продемонстрирована на смоделированной шести компонентной смеси при отсутствии шумов, во-вторых, на реальных трехкомпонентной и четырехкомпонентных смесях. Также, в этой главе приведен анализ влияния шумов на результаты применения метода "последовательных исключений".

В четвертой главе рассмотрены особенности люминесценции биологических объектов, приведены результаты спектрально-люминесцентных исследований фотосинтезирующих объектов, которые использовались в данной работы. Также, в ней изложены результаты применения разработанного метода для определения люминесцирующих пигментов мутантного штамма (Chl-1) и "дикого" типа хламидомонады.

Заключение.

По результатам работы можно сделать следующие выводы.

1. Сформулировано условие неполного попарного перекрывания спектров люминесценции компонент смеси, при котором принципиально возможно однозначное определение люминесцирующих компонент по двумерным спектрам люминесценции смеси.

2. Разработан метод "последовательных исключений", который, при выполнении условия неполного попарного перекрывания, позволяет определять спектрально люминесцентные характеристики компонент смеси по двумерным спектрам люминесценции. Разработанный метод принципиально применим для исследования смесей с любым числом компонент. Работоспособность метода "последовательных исключений" продемонстрирована на смоделированной шестикомпонентной смеси (в отсутствии шумов) и на реальных смесях с различным числом компонент, в том числе и для случая четырех компонент.

3. Разработана процедура определения спектров возбуждения люминесценции компонент смеси, основанная на выборе из избыточной системы линейных уравнений ограниченного их числа, равного числу компонент смеси. Рассмотрены два варианта выбора уравнений, обеспечивающие наилучшую обусловленность системы оставшихся линейных уравнений. Продемонстрирована работоспособность одного из предложенных вариантов.

4. Предложена модификация метода "последовательных исключений" для смесей, в которых нарушено условие неполного попарного перекрывания для какой либо пары компонент смеси. Данная модификация позволяет определять спектры люминесценции и возбуждения люминесценции тех компонент смеси, для которых данное условие выполнено. Компоненты, для которых нарушено условие неполного попарного перекрывания, определяются с точностью до линейного преобразования в образуемом ими подпространстве.

Выяснено, что для смесей с различным числом компонент для каждой смеси существует свой допустимый уровень шума в исходных спектрах люминесценции смеси, при котором еще выполняется критерий определения числа компонент для правильного значения компонент смеси. Данное свойство метода продемонстрировано на модельных объектах (смоделированные смеси с числом компонент от двух до шести). Выяснено, что процедура определения спектров люминесценции компонент осуществляется с накоплением шумов. На модельном объекте (смоделированная шестикомпонентная смесь) продемонстрировано, что зависимость уровня шума от номера шага в процедуре определения спектров люминесценции компонент может иметь сложный нелинейный характер.

Впервые in vivo обнаружена люминесценция металлокомплекса протопорфирина IX (положение главной максимума полосы люминесценции 590 нм). Данный пигмент присутствовал во всех трех типах исследованных мутантных штаммов хламидомонады. Применение метода "последовательных исключений" для исследования одного из мутантных штаммов (chl-l-19) позволило впервые полностью определить спектр люминесценции металлокомплекса протопорфирина IX и определить спектры люминесценции и возбуждения люминесценции пигмента с полосой люминесценции 670 нм у штамма chl-l-19. Данный пигмент предположительно идентифицирован нами как агрегированная форма протопорфирина IX.

Применение метода "последовательных исключений" позволило установить гомогенность хлорофилла а в штамме "дикого" типа хламидомонады.

154

1. V.H. Lawton and Е.А. Sylvestre, Self Modeling Curve Resolution. Technometrics, v.13, 1971, pp. 617 633.

2. J.B. Birks, G. Bartocci, G.G. Aloisi, S. Dellonte and F. Barigelletti, Fluorescence analysis of trans-2-styryInaphthalene in solution. Chem. Phys., v.51, 1980, pp. 113-120.

3. Y. P. Sun, D.F. Sears Jr. and J. Salitel, Three-Component Self-Modeling Technique Applied to Luminescence Spectra. Anal. Chem., v. 59, 1987, pp. 2515-2519.

4. A. Spalletti, G. Bartocci, F. Masetti, U. Mazzucato and G. Gruciani, Principal-component self-modeling analysis of fluorescence for some trans-diarylethylenes. A compatison with kinetic analysis. Chem. Phys., v. 160, 1992, pp. 131-144.

5. Y. P. Sun, D.F. Sears Jr., J. Saltiel, F.B. Mallory, C.W. Mallory and C.A. Buser, Principal Component - Tree Component Self-Modeling Analysis to trans-1,2-Di(2-naphthyl)ethane Fluorescence. J. Am. Chem. Soc., v.l 10, 1988, pp. 6974-6984.

6. J. Saltiel, D.F. Sears Jr., F.B. Mallory, C.W. Malloiy and C.A. Buser, Resolution and Structural Assigment of the Three Components in trans-1,2-Di(2-naphthyl)ethane Fluorescence. J. Am. Chem. Soc., v. 108, 1986, pp. 1688 -1689.

7. G. Gruciani, A. Spalletti and G. Bartocci, A Quantitative Fluorimetric Analysis of a Multicomponent System Based on a Modified PCA-SM Method. Z. Physik. Chem., v. 172, 1991, pp. 227-252.

8. S. Wold, Cross-Validatory Estimation of the Number of Components in Factor and Principal Components Models. Technometrics, v. 20, № 4, 1978, pp. 397 -405.

9. N. Ohta, Estimating Absorption Band of Component Dyes by Means of Principal Component Analysis. Anal. Chem., v. 45, № 3, 1973, pp. 553 — 557.

10. M. Dalibart, Multicomponent analysis in luminescence spectroscopy. Talanta, v. 44, 1997, pp. 2231-2235.

11. Ермолаев B.JT., Бодунов E.H., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения. "Наука", 1977,311 с.

12. С. Паркер, Фотолюминесценция растворов. Москва: изд-во "МИР", 1972, 510с.

13. Физика и техника спектрального анализа. Люминесцентный анализ, под редакцией М.А. Константиновой-Шлезингер, Москва: Государственное издательство физико-математической литературы, 1961,400 с.

14. Э. Клар. Полициклические углеводороды. Изд-во "Химия", М., 1971, в 2-х томах: т.1.- 455с., т.2 455с.

15. Т.А. Шахвердов, Р. Эргашев, Фотофизика металлокомплексов родамина Б. Оптика и спектроскопия, Молекулярная спектроскопия, т. 87, № 2, 1999г., с. 236-242.

16. A.S Chunaev. Genetics of photosynthesis in Chlamydomonas reinhardii. Photosynthetica, v. 24, № 2, 1990, p. 283-308.

17. A.C. Чунаев и др., Генетика биосинтеза фотосинтетических пигментов у Chlamydomonas reinhardii. Вестник Санкт-Петербургского университета, серия 3, вып. 4 (№24), 1999, с. 122-131.

18. Биофизика фотосинтеза. Под редакцией А.Б. Рубина, Изд-во Московского Университета, 1975, 223 с.

19. Б.А. Рубин, В.Ф. Гавриленко. Биохимия и физиология фотосинтеза. Изд-во Московского университета, 1977,326 с.

20. A.S. Chunaev, O.N. Mirnaya, V.G. Maslov and A. Boschetti. Chlorofhyll band Loroxanthin-Deficient Mutants of Chlamydomonas reinhardii. Photosyntetica, v. 25, 1991, pp. 291-301.

21. K.B. Квитко, Т.Н. Борщевская, A.C. Чунаев, В.В. Тугаринов, Петергофская генетическая коллекция штаммов зеленых водорослей Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas. Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Л., 1987, с. 28-57.

22. В.Г. Маслов, А.С. Чунаев, Исследование первичных фотопроцессов в фотосистеме 2 мутантов хламидомонады методом спектроскопии выжигания провалов. Молекулярная биология, т. 16, вып. 3, 1982, с. 604611.

23. М.У. Шалыга, A.M. Чэкунова, А.С. Чунаеу, Н.Г. Аверына, анашз саставу парф1рынау у мутантау chlamydomonas reinhardii. Весщ Акадэмн навук Беларускай ССР. Серыя Б1ялапчных навук, №4, 1990, с.53-57.I

24. Shalygo N.V., Voronetskaya V.V., Averina N.G., Effect of Mn cations on accumulation of early porphyrin precursors of chlorophyll in barley seedlings. Vestsi Akademii Navuk Belarusi, series of biological sciences, v. 1, 1997, pp. 25-29

25. Г.П. Гуринович и др. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Изд-во "Наука и техника", 520 е., Минск, 1968.