автореферат диссертации по электронике, 05.27.03, диссертация на тему:Когерентная фазовая микроскопия биообъектов

Введение.

Глава 1. Развитие современной оптической микроскопии и проблемы создания метода динамической прижизненной микроскопии

1.1 Современная оптическая микроскопия внутриклеточных процессов.

1.2 Интерферометрические методы.

1.2.1 Многошаговый метод.

1.2.2 Оптическая когерентная томография.

1.2.3 Когерентная фазовая микроскопия.

1.3 Выводы.

Глава 2. Метод Когерентной Фазовой Микроскопии

2.1 Особенности фазовых изображений.

2.2 Описание экспериментальной установки.

2.3 Свойства фазовых изображений КФМ "Эйрискан".

2.4 Метод Динамической Фазовой Микроскопии.

2.5 Выводы.

Глава 3. Сверхразрешение в динамических фазовых изображениях.

3.1 Сингулярные точки динамических фазовых изображений.

3.2 Результаты измерений.

3.3 Выводы.

Глава 4. Мембранный электрооптический эффект в митохондрии

4.1 Показатель преломления митохондрий.

4.2 Подготовка митохондрий к измерениям на КФМ "Эйрискан"

4.3 Влияние среды на фазовую высоту митохондрий.

-34.4 Электрооптический эффект в митохондриях.

4.5 Выводы.

Глава 5. Идентификация функциональных состояний изолированных митохондрий методом динамической фазовой микроскопии

5.1 Подготовка образцов.

5.2 Анализ динамических процессов в митохондриях.

5.3 Результаты измерений.

5.3.1 Корреляция интенсивности флуктуаций и фазовой высоты.

5.3.2 Влияние среды инкубации на пространственно-временную корреляцию.

5.4 Обсуждение.

5.4.1 Влияние энергетического состояния митохондрий на флуктуации фазовой высоты.

5.4.2 Происхождение пространственно-временной корреляции фазовой высоты.

5.4.3 Динамический электрооптический эффект.

5.4.4 Количественная оценка скорости метаболизма.

5.4.5 Возможность идентификации функциональных состояний митохондрий.

5.5 Выводы.

В последние десятилетия все большее значение придается исследованиям динамических процессов на клеточном и молекулярном уровнях [2,4]. В частности, было показано, что исследования и диагностика функциональных состояний в нативных объектах на субклеточном уровне имеют фундаментальное и практическое значение для биологии и медицины [3,5,52]. Среди актуальных фундаментальных проблем следует отметить энергетику и динамику молекулярных моторов, кооперативные явления в мембранах и ферментных комплексах, влияние внешних факторов на энергетические состояния клеток и их органелл, диагностику генетических болезней [5], апоптоз (программированная смерть) и т.п. Но измерения неокрашенных субклеточных структур из-за их малой толщины и слабого контраста традиционными методами микроскопии весьма проблематичны.

Действительно, предназначенные для этих целей микроскопы должны удовлетворять многим требованиям, в том числе, неинвазивно-сти, высокой чувствительности, предельно высоких пространственного и временного разрешений, а также количественного представления результатов [5,9,11,12,55]. Поэтому вполне естественно, что новые знания о кинетике молекулярных моторов [4], о внутриклеточной динамике и в биоэнергетике ферментов [51,56,57] были достигнуты в значительной степени благодаря успехам в области флуоресцентной микроскопии, лазерной и вычислительной техники.

Флуоресцентные методы, несмотря на известные ограничения, пока остаются основным средством исследований динамических явлений на молекулярном и клеточном уровнях [2,4,12,52]. Они позволяют получить дополнительную информацию путем анализа пространственно-временных флуктуации мембранного потенциала [57], но реальные достижения в решении проблемы диагностики функциональных состояний, например, изолированных митохондрий, пока незначительны. Мы это объясняем отсутствием адекватных инструментальных средств и недостатками используемых методов.

Кратко остановимся на инструментальном аспекте рассматриваемой проблемы. Сравнительно низкая чувствительность, малое временное разрешение и отсутствие абсолютного нормирования интенсивности флуоресценции [11,12] ограничивают возможности традиционной флуоресцентной микроскопии в исследовании флуктуаций и определении абсолютных значений мембранного потенциала. Другие недостатки флуоресцентной микроскопии также хорошо известны - это генерация супероксидов и зависимость от условий освещения. С другой стороны, малые размеры митохондрий ограничивают возможность применения электродных [19,38] и зондовых методов, а использование методов светорассеяния на суспензиях дает только некоторые средние статистические характеристики процессов.

Методическая (диагностическая) часть проблемы оказалась значительно сложнее. Связь между оптическими и биофизическими параметрами далеко не однозначна. Поэтому даже в случае надежно установленной корреляции флуктуаций фазовой высоты и мембранного потенциала, интерпретация результатов измерений в терминах функциональных состояний предполагает использование различных, далеко не очевидных, предпосылок, моделей и гипотез. Следовательно, для устранения неоднозначности в интерпретации необходим поиск адекватных алгоритмов и разработка оптической модели объекта. Например, в случае использования митохондрии как динамического объекта, необходимо было установить зависимость, с одной стороны, между измеряемой оптической разностью хода, эквивалентным показателем преломления матрикса и мембран, и с другой - между возможными биофизическими источниками флуктуаций (изменениями структуры, конформационными переходами в макромолекулах, влиянием кооперативных процессов, обусловленных общим мембранным потенциалом).

В диссертации в качестве объекта исследований была выбрана митохондрия печени крысы. Этот выбор был связан с большим опытом возглавляемого академиком Скулачевым В.П. коллектива в области биоэнергетики и с любезно предоставленными профессором Ягужин-ским Л.С. препаратами. Процессы биоэнергетики являются в центре внимания биофизиков в течение многих лет и митохондриям посвящена большая литература. Однако, причины флуктуации мембранного потенциала не вполне ясны. Высказаны предположения, что они связаны со случайным характером работы Н+ помп АТФазы и дыхательной цепи [11,47,50], а также с открытием трансмембранных ионных каналов [30,31] и больших пор [30,31,51]. Но пока не получили адекватного объяснения большие амплитуды флуктуации мембранного потенциала [11,50,56,57], а также механизмы, которые приводят к появлению контрастных спектральных компонент [50] и к пространственной корреляции флуктуаций мембранного потенциала [57]. Не вполне ясно, могут ли эти характеристики быть использованы в качестве значимых параметров для идентификации функциональных состояний митохондрий.

В диссертации показано, что благодаря применению метода Когерентной Фазовой Микроскопии и реализации на его основе метода Динамической Фазовой Микроскопии [24-27], в сочетании с возможностями современной вычислительной техники и пакетами обработки сигналов, удалось получить ответ на ряд вопросов фундаментальных проблем биоэнергетики.

Конкретной целью диссертационной работы было дальнейшее развитие метода Когерентной Фазовой Микроскопии, как основы для новой методологии исследования внутриклеточных динамических процессов. Следовало показать, что, используя достижения современной оптоэлектроники и вычислительной техники можно обеспечить измерения с высоким пространственным разрешением динамических процессов на субклеточном уровне. Конкретным результатом должна была быть принципиально новая информация о пространственно-временной корреляции флуктуаций показателя преломления. В качестве объекта были выбраны митохондрии, по которым в литературе имелись достаточно полные сведения о морфологии и биофизических процессах.

Для решения поставленных задач предстояло провести исследования:

- пространственного и временного разрешения в динамических фазовых изображениях;

- корреляции между изменениями мембранного потенциала и показателем преломления изолированных митохондриях;

- новых алгоритмов анализа флуктуаций фазовой высоты;

- динамических процессов в изолированных митохондриях для определения характерных параметров флуктуаций;

- нового метода диагностики функциональных состояний изолированных митохондрий по характерным параметрам.

5.5 Выводы

Конкретным итогом работы является вывод о возможности получения дополнительной информации о потенциал-зависимых процессах в изолированной митохондрии методом ДФМ. Эти результаты удалось получить благодаря высокой точности и воспроизводимости измерений пространственно-временных флуктуаций фазовой высоты. Корреляция между статическими значениями ФВ и МП позволила сделать вывод о существовании статического ЭОЭ. Здесь показана возможность обобщения этого вывода на корреляцию между флуктуациями ФВ и МП.

Сформулирована гипотеза о возможности кооперативных процессов в ансамблях идентичных комплексов ДЦ и АТФазы, которые проявляются во флуктуациях МП с характерными частотами. По этим признакам, используя высокую чувствительность метода ДФМ можно отождествить различные ФС и оценить скорость метаболизма. Вывод о возможности диагностики ФС по результатам оптических измерений ФВ может иметь фундаментальное значение для биологии. Действительно, потенциал-зависимые процессы в мембранах присущи в разной степени всем биообъектам и вполне естественно предполагать, что флуктуации ФВ могут наблюдаться во многих других органеллах и клетках.

Есть достаточные основания предполагать, что пространственно коррелированные флуктуации ФВ являются достаточно общим явлением, поскольку они наблюдались в других объектах, например, в экстракте эндоплазматического ретикулума ооцита [59], в эритроцитах [40] и ядрах клеток Vero [37], в нейронах [60]. Несмотря на то, что связь флуктуаций ФВ и МП или другими биологически значимыми процессами во многих случаях не была установлена, и есть ряд других открытых вопросов, можно предполагать, что дальнейшие исследования флуктуаций ФВ

-91 позволят получить существенно новую информацию о внутриклеточной динамике митохондрий и других биообъектов.

-92-ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возможность диагностики функционального состояния органелл клетки по результатам измерений оптических параметров, например, фазовой высоты имеет фундаментальное значение для биологии. Действительно, потенциал-зависимые процессы в мембранах присущи в разной степени всем биообъектам и вполне естественно предполагать, что потенциал-зависимые изменения и флуктуации фазовой высоты могут наблюдаться во многих других органеллах и клетках. В этой работе впервые показана возможность определения оптическим методом активности комплексов дыхательной цепи митохондрий. Биофизическая интерпретация результатов оптических измерений оказалась возможной благодаря статическому электрооптическому эффекту и его обобщению на пространственно-временные флуктуации фазовой высоты. В рамках гипотезы о потенциал зависимых кооперативных процессах дано объяснение пространственной корреляции и контрастным компонентам в спектрах флуктуаций.

Подтверждена высокая эффективность метода Динамической Фазовой Микроскопии, как средства получения новой информации о внутриклеточной динамике с высоким пространственным и временным разрешением, точностью и воспроизводимостью измерений.

Есть достаточные основания предполагать, что обнаруженные в митохондриях пространственно коррелированные флуктуации фазовой высоты являются общим явлением, поскольку они наблюдались также в других объектах.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, д.т.н., проф. Тычинскому Владимиру Павловичу за внимание, поддержку и интересную работу. Считаю своим приятным долгом поблагодарит к.ф-м.н. Вышенскую Татьяну Владимировну, за помощь в измерениях и полезные обсуждения, проф. Ягужинского Льва Сергеевича, за любезно предоставленные препараты, необходимую информацию и полезные обсуждения, проф., д.м.н. Ходорова Бориса Израилевича за проявленный интерес и поддержку, а также студентов: Лисовкого Виталия, Юсина Александра, Близнюка Антона и Ильина Александра за помощь в оформлении результатов.

-94-JIMTEPATYPA

1. Scaduto R. C., Grotyohann J. W., Grotyohann L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives // Biophysical J. - 1999. - Vol. 76. - P.469-477.

2. Lu H.P., Xun L., Xie X.S. Single-molecule enzymatic dynamics // Science. - 1998. - Vol. 282. - P. 1877-1882.

3. Szewczyk A., Wojtczak L. Mitochondria as a Pharmacological Target, Parmacological Reviews // - 2002. - Vol. 54. - P. 101-127.

4. Mehta A. D., Rief M., Spudich J. A., Smith D. A., Simmons R. M. Single-Molecule Biomechanics with Optical Methods // Science. -1999. - Vol. 283.-P. 1689-1695.

5. Campaniola P.J., Wei M., Lewis A., Loew L.M. High-resolution nonlinear optical imaging of live cells by second harmonic generation // Bio-phys.J. - 1999. - Vol. 77. - P. 3341-3349.

6. Weiss D.G., Galfe G. Video-microscopic techniques for study the living cytoplasm // Image Analysis in Biology. - CRC Press, Boca Raton, 1992.-P. 135-158.

7. Creath K. Step height measurements using two-wavelength phase shifting interferometry // Ap. Optics. - 1987. - Vol. 26(14). - P. 28101815.

8. Weiss D.G., Tychinsky V.P., Steffen W., Budde A. Digital light microscopy techniques for the study of living cytoplasm II Image Analysis: Methods and Applications. - CRC Press, Boca Raton, 2001. - P. 209239.

9. Farkas D.L., Baxter G., Pane D., Pane J., Patek D.R., DeBiasio R.L., Gough A., Taylor D.L., Nederlof M.A., Ryan K.W., Multimode Light Microscopy and the Dynamics of Molecules; Cells; and Tissues // Annu. Rev. Physiol. - 1993. - Vol. 55. - P. 785-817.

-9510. Hogan H. Cameras are focusing on all microscopy application // Photonics spectra. - 2002. - Vol. 36. - P. 123-128.

H.Zochowski M., Wachowiak M., Falk C., Cohen L. Imaging Membrane Potential With Voltage-Sensitive Dyes // Biol. Bull. - 2000. - Vol.198. -P. 1-21.

12.Bullen A., Saggau P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: Fast Quantitative Measurements with voltage-sensitive dyes // Biophys. J. - 1999. - Vol. 76. - P. 2272-2287.

13. Вишняков Г.Н., Закарян K.C., Левин Г.Г., Стрелецкая Е.А. Исследования оптически прозрачных объектов при помощи томографического микроскопа Линника // Измерительная техника. -1999.-№1,-С. 18-22.

14.Schmit J., Creath К. Fast calculation of phase in spatial n-point phase-shifting techniques // Proc. SPIE. - 1995. - Vol. 2544. - P. 102-111.

15. Dunn G.A., Zicha D. Using the DRIMAPS system of transmission interference microscopy to study cell behavior // Cell Biology: A laboratory handbook. - Academic Press, 1998. - Vol. 3. - P. 44-63.

16. Creath K. Submicron linewidth measurement using an interferometric optical profiler// Proc. SPIE. - 1991. - Vol. 1464. - P. 474-483.

17. Ding Z., Zhao Y., Ren H., Nelson J. Chen Z. Real-time phase-resolved optical coherence tomography and optical Doppler tomography // Opt. Express - 2002. - Vol. 10(5). - P. 236-245.

18.Kowalevicz А., Ко Т., Hartl I., Fujimoto J. Ultrahigh resolution optical coherence tomography using a superluminescent light source II Opt. Express -2002. - Vol. 10(7) - P. 349-353.

19.Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. - М.: Наука, 1990.

20.Zorov D., Filburn C., Klotz L., Zweier J., Sollot S. Reactive oxygen species (ROS)-induced ROS release H Experimental Medicine - 2000. -Vol. 192 (7).-P. 1001-1014.

21.Bernardi P., Scorana L., Collona R., Petronilli V., Di Lisa F. Mitochondria and cell death // Eur. J. Biochem. - 1999. - Vol. 264. - P. 687-701.

22. Rollins A.M., Kulkarni M.D., YazdanfarS., Ung-arunyawee R., Izatt J. A. In vivo video rate optical coherence tomography // Opt. Express. -1998, - Vol. 3(6). - P. 219-229.

23. Hitzenberger C.K., Gotzinger E., Sticker M., Pircher M., Fercher A.F. Measurement and imaging of birefringence and optic axis orientation by phase resolved polarization sensitive optical coherence tomography // Opt. Express. - 2001. - Vol.9(9). - P. 780-790.

24.Тычинский В.П., Куфаль Г.Э., Вышенская T.B., Переведенцева Е.В., Никандров C.J1. Измерения субмикронных структур на лазерном фазовом микроскопе «Эйрискан» // Квантовая электроника. - 1997. - Т. 24. - № 8, - С. 754-758.

25.Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов II УФН. - 2001. - Т. 171. - №6. - С. 649-662.

26.Tychinsky V., Masalov I., Pankov V., Ublinsky D. Computerized Phase Microscope for Investigation of Submicron Structures // Opt. Comm. -1989. -Vol. 74. - P. 37-40.

27.Тычинский В.П., Вайсс Д., Вышенская T.B., Ягужинский Л.С., Никандров С. Л., Кооперативные процессы в митохондриях: регистрация методом динамической фазовой микроскопии // Биофизика. -2000. - Т. 45. - С. 870-877.

28.Perkins G.A., Frey T.G., Recent structural insight into mitochondria gained by microscopy // Micron. - 2000. - Vol. 31, -P. 97-111.

-9729. Тавров А.В. Компьютерный фазовый микроскоп для регистрации субмикронных структур поверхности: Дис. на соискание учёной степени канд. тех. наук: 05.27.03 / МИРЭА. - М., 1992.

30. Bernardi P. Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers and permeability transition // Physiol. Rev. - 1999. - Vol. 79(4). - P. 1127-1155.

31. Weiss T.F. Cellular Biophysics // v.2, Ch. 6 Voltage-gated channels. -MIT Press, Cambridge MA. - 1996.

32.Тычинский В.П. Микроскопия субволновых структур // УФН. - 1996. -Т.166. - С. 11.

33. Hianik Т., Passechnik V.I. Bilayer Lipid Membranes: Structure and Mechanical Properties. - Bratislava: Kluwer Academic Publishers, 1995.

34. Кретушев A.B., Тычинский В.П. Сверхразрешение на сингулярных участках фазовых изображений // Квантовая электроника. - 2002. -Т. 32.-№1.-С. 66-70.

35.Yariv A. Introduction to optical electronics. - NewYork: Holt, Reinhart and Winston, 1976.

36. Saraste M. Oxidative Phosphorylation at the fin de siecle // Science. -1999. - Vol. 283. - P. 1488 -1492.

37.Vyshenskaja T.V., Onishchenko G.E., Petrashchuk O.M., Tychinsky V.P., Nikandrov S.L. Chromatin dynamics measured by phase microscopy in different cell cycle stages // Eur.J. Cell Biol. - 1999. - Vol. 78 (49). - P. 79.

38.Либерман E.A., Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций // Мембранный потенциал митохондрий. - М.: Наука, 1972. - С. 99 -107.

39.Емельянов В.Б., Печатников В.А., Ризванов Ф.Ф., Евтодиенко Ю.В. Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций

-98// Исследование изолированных митохондрий и их фрагментов с помощью индикатрис светорассеяния. - М. Наука, 1972. - С. 145.

40.Savushkin A.V., Vasilenko I.A. Morphofunctional changes in rat erythrocytes caused by native poison of red cobra // Bulletin of Exper. Biology and Medicine. - 1998. - Vol. 126(8). - P. 777-779.

41.Salamon Z., Tollin G. Optical anisotropy in lipid bilayer membranes // Biophys. J. -2001, - Vol. 80. - P. 1557-1567.

42. Берестовский Г.Н., Луневский B.3., Ражин В.Д. Оптические измерения в нерве при одиночном возбуждении // Труды Московского Общества испытателей природы. - 1970. - Т. VLV. -С. 58-62.

43.Noji Н., Yasuda R., Yoshida М., Kinosita К. Direct observation of the rotation of F1-ATPase // Nature. - 1997. - Vol. 386. - P. 299-302.

44.Красинекая И.П., Литвинов И.С., Захаров С.Д., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С. Два качественно различных структурно-функциональных состояния митохондрий // Биохимия. - 1989. -Т. 54.-№9.-С. 1550-1556.

45.Jonston D., Lardy Н.А. Isolation of mitochondria // Methods of Enzy-mology. - 1967. - Vol. 10. - P. 94-96.

46. Rapp E. An atlas of cellular oscillators // J. Exp. Biol. - 1979. - Vol. 81. -P. 281-306.

47. Kindmark H. Glucose-induced oscillations in cytoplasmic free Ca2+ concentration precede oscillations in mitochondrial membrane potential in the pancreatic beta-cell // J. Biol. Chem. - 2001. - V. 276(37). - P. 345-306.

48.Shimizu H., Haken H. Co-operative Dynamics in Organelles // J. Theor. Biology. - 1983. - Vol. 104. - P. 261-273.

-9949. Evtodienko Y.V. Sustained oscillations of transmembrane Ca2+ fluxes in mitochondria and their possible biological significance // Biological membrane. - 2000. - Vol. 17(1). - P. 5-17.

50. Thiffault C., Bennett J.P. Alterations in mitochondrial calcium cycling underlie the inability of Alzheimer's disease cybrid mitochondria to exhibit flickering II Abstract, Neuroscience Meeting san Diego. - 2001. -Program Number 651.3.

51.Hueser J., Rechenmacher C., Blatter L. Imaging the permeability pore transition in single mitochondria // Biophys. J. - 1998. - Vol. 74. - P. 2129-2137.

52.Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival // Physiol. Rev. - 2000. - Vol. 80. - P. 315-360.

53. Wallace D.C., Mitochondrial diseases in man and mouse // Science. -1999. - Vol. 283. - P. 1482-1493.

54.Wart M.W., Rego A.C., Frenguelli B.G., Nicholls D.G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells // J. Neuroscience. - 2000, - Vol. 20(19). - P. 7208-7219.

55. Farkas D.L. Non-invasive image acquisition and advanced processing in optical bioimaging // Computerized Med. Imaging and graphics. -1998,-Vol. 22.-P. 89-110.

56. Buckman J.F., Reynolds I.J. Spontaneous changes in mitochondrial membrane potential in cultured neurons // J.of Neurosci. - 2001, - Vol. 21(14).-P. 3034-3065.

57. Diaz G., Falchi A.M., Gremo F., Isola R., Diana A. Homogeneous longitudinal profiles and synchronous fluctuations of mitochondrial transmembrane potential // FEBS Letters. - 2000. - Vol. 475. - P. 218-224.

58. Rego A.C., Ward M.W., Nicholls D.G. Mitochondria control AMPA/Kainatte receptor-induced cytoplasmic calcium deregulation in

-100 rat cerebellar granule cells // J.Neurosci. - 2001, - V. 21(6). - P. 18931901.

59.Vyshenskaja T., Tychinsky V., Weiss D., Stefen W., Kuznetsov S Monitoring of periodic oscillations during formation of endoplasmic reticulum by dynamic phase microscopy (in print).

60.T.A. Бриндикова, C.M. Новиков, A.H. Шалыгин, Г.В. Максимов, T.B Вышенская, В.П. Тычинский, А.В. Кретушев, А.Б. Рубин Исследование состояния плазматической мембраны нейрона методом динамической фазовой микроскопии // Биологические мембраны. -2001. - Том 18. - №5. - С. 359-362.