автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.07, диссертация на тему:Когерентная фазовая микроскопия

На правах рукописи

Иванов Алексей Борисович

КОГЕРЕНТНАЯ ФАЗОВАЯ МИКРОСКОПИЯ: РАСТРОВЫЙ МЕТОД РЕГИСТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДИНАМИКИ - '

Специальность: 05.11.07 Оптические и оптико-электронные приборы и

комплексы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

- 4 ИЮЛ 2012

Москва - 2012

005046257

005046257

Диссертационная работа выполнена в межвузовской лаборатории «Когерентная фазовая микроскопия» федерального бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный технический университет радиотехники электроники и автоматики»

Научный руководитель: Доктор технических наук,

профессор Тычинский В.П.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук,

профессор Ринкевичюс Б.С.

кандидат технических наук,

младший научный сотрудник Минаев В.Л.

Ведущая органпзацпя: Московский государственный университет приборостроения и информатики (МГУПИ)

Защита состоится «25» сентября 2012 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 212.131.02 в Московском государственном институте радиотехники, электроники и автоматики (техническом университете) по адресу: 119454, Москва, проспект Вернадского, д. 78, МИРЭА, в ауд. В 223.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного института радиотехники, электроники и автоматики (технического университета)

Автореферат разослан и размещен на сайте www.mirea.ru «13» июня 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук, доцент

Вальднер В.О.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Изучение динамических процессов в живых клетках и их органеллах, является одним из фундаментальных направлений биологии. В оптических методах в последние годы особое внимание привлекают методы фазовой или интерференционной микроскопии, которые благодаря уникальным свойствам фазовых изображений открывают новые перспективы получения количественной информации о процессах в живых клетках. Методы фазовой или интерференционной микроскопии привлекают в последние годы особое внимание из-за уникальных свойств фазовых изображений и перспективы получения новой количественной информации о процессах в живых клетках. В этих методах изображения представлены в виде распределения физически значимой величины — оптической разности хода, которая зависит от структуры и свойств объекта. Современные методы фазовой микроскопии неинвазивны, обладают высокой чувствительностью к изменению показателя преломления и параметров структуры объекта. Поскольку живая клетка является важным объектом многих исследований, то для регистрации происходящих в ней процессов были также разработаны различные методы, в т.ч. трек-диаграмм и кадровой съемки. Однако, до настоящего времени не были известны такие изображения объекта, в которых одновременно содержится информация как о структуре, так и о динамических характеристиках объекта. В диссертации представлены результаты разработки растрового метода регистрации динамических процессов (РРДП). Этот метод является дальнейшим развитием метода динамической фазовой микроскопии (ДФМ) и позволяет обнаруживать области динамической активности на фазовых изображениях живых клеток и органелл. В разработанном ранее в МИРЭА методе ДФМ регистрация морфологии и динамики разделялись, и

3

динамические процессы регистрировались в виде трек-диаграмм в точках фиксированной на топограмме линии. Методом ДФМ была получена информация о пространственных и временных характеристиках метаболических процессов в различных клетках. Автором был сделан следующий шаг в решении проблемы одновременной регистрации структуры и локальных процессов в клетке. В его основе лежит использование неизвестного ранее свойства растровых фазовых изображений, которое состоит в возможности разделения пространственных и временных характеристик объекта. Метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) свободен от основного недостатка ДФМ, в котором регистрация динамических процессов производилась только в точках заранее выбранной линии (скан-линии) на фазовом изображении объекта. Реализация метода РРДП позволила одновременно получить информацию в реальном времени о локализации и интенсивности динамических процессов на всем фазовом изображении клетки. Полученная методами фазовой микроскопии информация дополнит фундаментальные знания о процессах в живых клетках и позволит разработать новые методы диагностики и лечения заболеваний на клеточном уровне.

Цель работы и задачи исследования. Целью диссертационной работы является разработка метода обнаружения и регистрации динамических процессов в живых биологических объектах, с помощью КФМ "Эйрискан". Метод должен обеспечить получение новых количественных данных из фазовых изображений, полученных на КФМ "Эйрискан", для определения функционального состояния живых клеток и органелл. Разработанные алгоритмы и программный комплекс должны обеспечить обнаружение и регистрацию внутриклеточных динамических

процессов в реальном времени. Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• разработать метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП), обеспечивающий обнаружение активных областей в изображении объекта и оценку их частотных характеристик;

• определить оптимальные режимы сканирования фазового изображения для регистрации динамических процессов;

• реализовать разработанные алгоритмы в прикладном программном обеспечении WinThlck для исследований динамических процессов в клетке на КФМ «Эйрискан»;

• апробировать метод РРДП на фазовых изображениях биологических объектов — эритроцитах, клетках Т-лимфоцитов, опухолевых клетках НСТ-И6 и т.д. Показать принципиальную возможность получения новой информации о функциональном состоянии объекта.

Методы исследования. Для решения поставленной задачи применялись экспериментальные и теоретические методы. В разработанных автором алгоритмах использовались методы цифровой обработки сигналов и изображений, спектрального анализа дискретных сигналов и расчета дискретных фильтров с заданными свойствами. Для создания автоматизированного программного комплекса исследования динамики живых биообъектов использовались методы объектно-ориентированного программирования и алгоритмы компьютерной графики.

Научная новизна работы 1. Разработан метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) для обнаружения и регистрации локальных областей активности в

статических фазовых изображениях с размерами порядка нескольких пикселей (до 70- 100 нм).

2. Разработанный на основе метода РРДП и КФМ «Эйрискан» программно-аппаратный комплекс позволяет обнаруживать и регистрировать динамические процессы в живых биологических объектах с временным разрешением до 1 мс.

3. Экспериментально показана принципиальная возможность использования метода РРДП для диагностики функционального состояния биообъектов различной природы (клеток и органелл), что свидетельствует об универсальности метода как инструмента исследования функционального состояния и метаболических процессов в живых клетках.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан оригинальный, не имеющий аналогов метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) для обнаружения и регистрации локальных временных процессов в фазовых изображениях живых биологических объектов.

2. Созданный на основе КФМ «Эйрискан» и метода РРДП аппаратно-программный комплекс \VinTluck позволяет обнаруживать локальные динамические процессы в областях с размерами до 70 нм и регистрировать их с временным разрешением до 1 мс.

3. Апробация метода РРДП на живых биологических объектах показала принципиальную возможность применения метода в биологии и медицине.

Практическая зпачимость и реализация научных результатов

1. Полученные в ходе работы результаты показывают перспективу использования метода РРДП в фундаментальных исследованиях метаболических процессов в живых клетках. Дальнейшее развитие метода

РРДП может быть основой для изучения механизмов передачи сигналов в

б

клетках и органеллах, а так же применения в медицине как средства экспресс диагностики функционального состояния клеток и органелл.

2. Важными достоинствами метода РРДП являются: неинвазивность, высокая чувствительность, интерактивность и возможность регистрировать метаболические процессы в реальном времени на участках изображения размерами порядка 20x20 нм.

3. Реализованный в РРДП подход, разработанные алгоритмы исследования динамических процессов и программное обеспечение были использованы в научных исследованиях в области биологии и медицины.

4. Созданное программное обеспечение позволяет автоматизировать процесс обнаружения внутриклеточных сигналов и диагностики функционального состояния живой клетки на КФМ «Эйрискан». Апробация работы

Основные научные результаты по теме диссертации были представлены на российских и международных научных конференциях: международная научная конференция Laser Applications in Life Sciences (LALS) 2007 Москва, 3-я международная российско-германская студенческая конференция «Информационные технологии в современной жизни» Германия 2008, 56-я Научно - техническая конференция МИРЭА, 3-я Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» Троицк 2008, международная конференция «Topical Meeting on Optoinformatics 2008» Санкт-Петербург, 3-я Всероссийская научно-практическая конференция "Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты" 2010 Москва, 4-ая Троицкая конференция "Медицинская физика и инновации в медицине" 2010 Москва, Роснанофорум 2009. Публикации

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 10

7

научных работах, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и одного приложения. Диссертация содержит 105 страниц машинописного текста, список литературы, включающий 67 наименований, одну таблицу и 46 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснованы актуальность темы диссертации и выбор объекта исследования. Сформулирована цель и очерчен круг решаемых задач. Приведены признаки научной новизны и основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе приведен обзор научно — технической литературы по состоянию проблемы в выбранной сфере исследования. Приведены оптические схемы и описания основных методов микроскопии для получения фазовых изображений живой клетки. Представлен анализ известных методов получения фазовых изображений и их применения для изучения динамических процессов в живых клетках. Рассмотрены достоинства и недостатки современных методов фазовой микроскопии.

В известной нам литературе нет сведений об одновременном измерении морфологии и динамических процессов в живой клетке. Из анализа литературы также следует, что метод КФМ имеет следующие преимущества при исследовании динамических процессов:

• высокое временное разрешение,

• пространственное разрешение, превышающее классический предел,

• высокую чувствительность,

• возможность управления режимом сканирования изображения,

• возможность записи флуктуаций фазовой высоты вдоль выбранного сечения в фазовом изображении. Анализ литературы позволил определить план исследований и сформулировать основную цель работы. Предметом диссертационной работы является дальнейшее развитие метода КФМ для изучения сигналов живых биологических объектов, создание методики анализа сигналов и изображений с целью диагностики состояния живой клетки в реальном времени и регистрации ее отклика на внешние воздействия.

Приводится подробное описание экспериментальной установки, метода КФМ и параметров микроскопа "Эйрискан". Описаны свойства диссектора, обеспечивающие произвольный доступ к точкам изображения. Рассматриваются характерные свойства фазовых изображений, получаемых методом КФМ и режимы работы микроскопа "Эйрискан".

Методы КФМ и ДФМ были разработаны в 1985-90 годах в МИРЭА под руководством профессора Тычинского В.П. Оптическая схема микроскопа «Эйрискан», разработанного на базе интерференционного микроскопа МИИ-4 ЛОМО, является модификацией схемы микроинтерферометра Линника. В нем в качестве источника когерентного излучения используется одномодовый гелий - неоновый лазер с длиной волны X = 632,8 нм. Для регистрации интерференционного сигнала и его аналого-цифрового преобразования в локальные значения фазы используется координатно-чувствительный фотоприемник - диссектор ЛИ-620 и электронный блок. Управление разверткой диссектора позволяет изменять размер и положение области сканирования. Поле зрения микроскопа могло изменяться в пределах 5-50 мкм. Периодичность выборки и скорость ввода изображения определяется частотой модуляции пьезопреобразователя (1000 Гц).

В методе КФМ фазовое изображение объекта (топограмму)

9

получают путем растрового сканирования интерференционного изображения в виде двумерного распределения оптической разности хода:

h(x, у, t) = f(n(x, у, z, t) - n0)dz, (1)

Фаза прошедшей через объект волны определяется компенсационным методом временных интервалов в каждой точке изображения.

Во второй главе приводится обоснование метода РРДП и его формальное описание. Даны определения новым терминам.

Выше отмечалось, что в методе КФМ фазовое изображение объекта (топограмма) получается путем растрового сканирования интерференционного изображения координатно-чувствительным фотоприемником (диссектором). Растровый метод сканирования изображения подобен телевизионной развертке, и схематически показан на рис. 1.

элементов изображения (голограммы) с размерностью М*М. Контролируемые программой параметры сканирования в КФМ

ю

"Эйрискан" позволяют реализовать последовательный ввод элементов изображения с различной скоростью по строкам и столбцам. При сканировании растра ввод элементов изображения производится построчно, начиная с первой строки (рис. 1). При растровом вводе фазового изображения между его соседними элементами появляется временная задержка, которая лежит в основе предлагаемого метода регистрации сигналов (РРДП). Благодаря наличию задержки оказалось возможным локализовать динамические процессы, период которых соизмерим со временем задержки. Поэтому в методе РРДП существенное значение имеют параметры растра: тр - время измерения одного элемента изображения, N — количество элементов в строке изображения. При временной задержке тр между элементами (пикселями) строки, задержка между соседними элементами столбца составляет Лг* тр.

Фазовую высоту в каждой точке изображения (топограммы) можно представить суммой трех слагаемых. Первое Н5(х,у) отображает пространственные статические характеристики структуры объекта, второе - Н0 (х, у, (:) временные изменения (или флуктуации) фазовой высоты объекта, связанные с динамическими процессами, третье — Бр) шумовая компонента с гауссовым распределением:

Н(х,у,0 = Нх(х,у) + Но(х,у,0 +Б(0 (2)

где х,у - пространственные координаты,

Г — момент времени записи элемента топограммы с координатами (х,у)

Разделение статической и динамической компонент фазового изображения осуществляется методом Растровой Регистрации Динамических Процессов (РРДП). В основе метода РРДП лежат следующие предположения:

и

функция Н$(х,у) является «гладкой», ее приращение

(Ау - размер пикселя) по столбцам медленно изменяется по дНй „„,

сравнению с —^-йТ и не испытывает скачков:-

(3)

функция HD(x,y, t) быстроменяющаяся по сравнению с Hs{x,y), временные изменения фазовой высоты с характерными периодами порядка Т= l/(2Nxp) будут оказывать преобладающий вклад в приращение AH(At) на участке Ay=y(i) -y(i-l):

АН№=ЦЬйТ»а±Ау, (4)

динамическая компонента может быть обнаружена, если ее амплитуда выше уровня шума:

^AT>Smax. (5)

Для разделения вкладов динамической и статической компонент фазового изображения был выбран метод цифровой фильтрации столбцов фазового изображения. В методе РРДП столбцы фазового изображения рассматриваются как временные ряды с периодом дискретизации:

AT = Nxp, (6)

структура объекта Hs{x,y) представляет собой низкочастотный сигнал, динамические процессы Hd(x,y,t) зарегистрированные в процессе записи топограммы — высокочастотная компонента. Обе компоненты могут быть разделены путем использования фильтра с частотой среза f. Выбор частоты среза f0 должен обеспечивать подавление компоненты Hs(i,j), f0 зависит от минимального пространственного периода Л структуры объекта. Связь между fo и Л выглядит следующим образом:

fo — L/(MNAtp) (7)

где L [мкм] — размер поля зрения микроскопа, N количество элементов строки топограммы, M — количество строк топограммы, тр — время записи пикселя. В результате применения цифровой фильтрации к столбцам фазового изображения получается массив элементов:

D(x,y) = Hd(x,y, t)+S(t). (8)

Значение элементов D(x,y) зависит от динамических процессов объекта с частотой выше fo и шума прибора S(t). В работе применялся цифровой фильтр со следующими параметрами:

• коэффициент пульсаций АЧХ в полосе пропускания равен 0,5 Дб,

• коэффициент подавления в полосе затухания — 40 Дб,

• порядок фильтра п = 3,

• тип фильтра - БИХ, верхних частот и полосно-пропускающий,

• ширина полосы пропускания wl — w2 = 0,2 — 0,5 Гц (ГТПФ), от 1,5 — 2

Гц (ФВЧ).

При выборе значений параметров фильтра учитывались ограничения, перечисленные в Таблице 1.

Таблица 1. Факторы ограничивающие выбор параметров фильтрации __топограммы_

Параметр Верхний предел Нижний предел

коэффициент пульсаций АЧХ в полосе пропускания, нет 0,05 Дб (если меньше, то возникают искажения фильтрованного сигнала)

коэффициент подавления в полосе затухания 40 Дб, 3-ий порядок фильтра ОДб, аксиальный размер структуры объекта

порядок фильтра, п п< 3 нет

частота среза /о /„ < (2!\тт)-' - для столбцов, /о < (2т)'1 — для строк Л- кол-во элементов строки /„> Ь/(М-КЛ-тр) Ь, М— размеры топограммы, мкм N — количество столбцов, Л — минимальный пространственный период объекта, гр - время записи пикселя

ширина полосы пропускания Л/, (для полосовых фильтров) 4/" </*-/« /ы - частота Найквиста профиля /о — частота среза, которая зависит от парамтеров структуры объекта 4/> 0,2 Гц (если меньше, то возникают искажения фильтрованного сигнала)

Полученные методом РРДП изображения В(х,у) (8) мы обозначили термином Растровое Дифференциальное Изображение (РДИ). РДИ представляет собой пространственное распределение (карту) амплитуд динамических процессов по полю фазового изображения - топограммы. Активными пикселями (АП) Растрового Дифференциального Изображения (РДИ) мы называем все элементы РДИ, значение которых выше заданного порога (П). Поскольку значение каждого элемента РДИ содержит в себе

14

шумовую компоненту S(t), значение порога (П) должно быть больше чем уровень шума прибора Smax. Условие обнаружения АП будет выглядеть следующим образом:

дН(х,у,у+Лу)

-Jt-AT > Smax (9)

Использование Растровых Дифференциальных Изображений (РДИ) позволяет получить следующий набор новых количественных параметров для описания состояния динамического объекта:

• амплитуда и координаты активных пикселей топограммы,

• площадь активных пикселей (АП) объекта.

Для анализа распределения динамических процессов относительно морфологии объекта, функция РДИ изображается в виде контурных линий на исходном фазовом изображении.

Важное методическое значение имеет определение понятия пространственного разрешения метода РРДП и ограничений связанных с регистрацией размеров активных областей. Задача состоит в определении минимально возможного размера области активности. Условие обнаружения активных пикселей состоит в том, что приращение фазовой высоты ЛИ при переходе от одного пикселя к соседнему, должно быть выше уровня шума. При этом между пикселями растрового изображения всегда существует временная задержка А(, которая зависит от их взаимного расположения. Таким образом, если за время А1 между элементами изображения фазовая высота изменилась на величину АН выше заданного порога П, то размер области активности будет равен расстоянию между пикселями. Из этого следует, что размер области активности может определяться площадью одного пикселя изображения, при условии

15

превышения амплитуды изменения ФВ Ah над уровнем шума.

Применение метода РРДП для обработки «статических» фазовых изображений позволяет получить количественные, физически значимые параметры о динамических процессах объекта, такие как: распределение интенсивности флуктуаций на топограмме объекта 1(х,у) и площадь S активных областей.

В третьей главе представлены результаты анализа методом РРДП фазовых изображений биообъектов различной природы, которые изучались в течение 2000 — 2011 гг. в лаборатории Когерентной фазовой микроскопии. При этих исследованиях, ранее, не было оснований предполагать, что в изображениях структуры живого объекта может содержаться информация о динамических процессах. Целью приведенного ниже анализа является иллюстрация возможности восстановления этой информации и ее биофизической интерпретации. Эти результаты получены впервые и мы считаем, что такой способ регистрации динамических процессов недоступен другим методам.

Живая клетка и ее органеллы представляют собой динамическую

систему, оптические параметры которой изменяются во времени. Изучение

динамических процессов в живых клетках является актуальной задачей для

исследования механизмов межклеточных взаимодействий (cell signaling),

экспресс диагностики физиологического состояния на клеточном уровне,

клеточного метаболизма. Изменение оптических параметров клетки,

вызванное ее метаболизмом, носит локальный характер, его

затруднительно зарегистрировать методом ДФМ при отсутствии

априорной информации о локализации динамических процессов на клетке.

Растровый метод регистрации динамических процессов (РРДП) позволяет

обнаружить и локализовать области метаболической активности клеток и

органелл. В ходе апробации метод был применен к различным

16

биологическим объектам: клеткам Т-лимфоцитов, клеткам крови -эритроцитам, раковым клеткам НСТ-116, митохондриям.

Из учебников по иммунологии известно, что основные функции Т-лимфоцитов состоят в создании «сигналов» об опасности в ответ на появление в крови чужеродных белков, токсинов и др. В результате последовательности сложных процессов распознавания внешними рецепторами, передачи команд через определенное время начинается синтез "сигнальных" макромолекул (цитокинов). В современной биологии клетки их регистрация осуществляется сложными и трудоемкими биохимическими методами. Из-за малых размеров, макромолекулы "сигналов" не могут наблюдаться традиционными оптическими средствами.

Процессы выброса цитокинов, в некоторых случаях, могут быть зарегистрированы методом РРДП. Приведенные ниже результаты являются, по нашему мнению, иллюстрацией возможности регистрации таких «сигналов» в активированных Т-лимфоцитах.

Обработка фазовых изображений Т-лимфоцитов производилась с помощью Растрового метода регистрации динамических процессов (РРДП). Метод позволил локализовать на фазовом изображении динамические процессы с частотой выше 2 Гц, а так же элементы структуры с поперечными размерами менее 500-400 нм (для топограммы 12x12 мкм, 128x128 пике.).

На рис. 2 представлено фазовое изображение Т-лимфоцита с активными областями в виде контурных линий равной интенсивности. Области активности располагаются на относительно ровном участке профиля (рис. 2а). Присутствие на вертикальном и горизонтальном фазовых профилях (рис. 2в,г) локальных неоднородностей свидетельствует об их временном характере. Этот пример является иллюстрацией

17

обнаружения области локализации динамических процессов в фазовом изображении Т-лимфоцита.

Рис. 2. Локальные динамические процессы Т-лимфоцита. а) Топограмма Т-лимфоцита с областями активности, б) горизонтальное сечение фазового изображения Т-лимфоцита вдоль линии указанной на топограмме. в) вертикальное сечение фазового изображения Т-лимфоцита вдоль линии указанной на топограмме

Следующим объектом были эритроциты мыши. Изучение механических свойств мембраны эритроцита представляет собой важную практическую задачу для диагностики заболеваний крови. Исследованию механических свойств мембраны методами интерференционной

микроскопии посвящено несколько работ зарубежных ученых (G. Popescu Quantitative light imaging laboratory, University of Illinois, USA), было показано, что амплитуда флуктуации для эритроцитов в разных физиологических состояниях - разная. Целью исследования эритроцитов методом РРДГТ было сопоставление оригинальных результатов полученных ранее впервые методом DHM (Digital Holographic Microscopy) с результатами, полученными с помощью метода РРДП.

В ходе экспериментов на эритроцитах мышей наблюдали 3 типа эритроцитов: дискоцит, сфероцит и эхиноцит. На основе данных полученных ранее методом DHM известно, что дискоциты имеют амплитуду флуктуации примерно в 2 раза выше, чем сфероциты. Были исследованы флуктуации мембраны эритроцитов в состоянии дискоцит и сфероцит. Результат применения метода РРДП к фазовым изображениям эритроцитов в различных функциональных состояниях представлен на рис. 3. Амплитуды активных областей эритроцита в состоянии дискоцит и сфероцит отличаются примерно в 2 раза, что согласуется с результатами, полученными профессором G. Popescu (Quantitative light imaging laboratory, University of Illinois, USA). Нами были измерены площади активных областей эритроцита в состояниях дискоцит и сфероцит. Области активности дискоцита занимали в 2-3 раза большую площадь, чем области активности сфероцита.

Рис. 3. Активные области эритроцитов в различных состояниях, а) Дискоцит, площадь активных пикселей 11 мкм2, б) сфероцит, площадь активных пикселей 5 мкм2

Исследование эритроцитов методом РРДП подтвердило достоверность полученных результатов и их согласованность с данными, полученными ранее другими методами интерференционной микроскопии. Метод РРДП позволяет получить значимые параметры, характеризующие свойства мембраны эритроцита, например амплитуду флуктуаций и площадь активных областей Бал-

Следующим объектов исследований были отдельные митохондрии. Результаты обработки методом РРДП фазовых изображений митохондрий показали наличие локальных динамических процессов. Кроме того, нам было известно влияние стимуляторов на мембранный потенциал митохондрий и его изменения во времени. В связи с этим, измерения митохондрий имели большое методическое значение. Под действием стимуляторов мембранный потенциал возрастал, фазовая высота и ее флуктуации также увеличивались. Топограммы митохондрий в гипотонической среде и в среде с ротеноном и АТФ, а так же их профили фазовой толщины вдоль скан-линий показаны на рис. 4 а,в и рис.4 б,г соответственно. Фильтрация топограмм производилась по у-координате (по столбцам) в полосе 1,8-4 Гц. Из сравнения профилей видно увеличение

фазовой толщины при АТФ-стимуляции, что подтверждает существование

20

ранее обнаруженного в лаборатории электро-оптического эффекта. В данном случае более существенным является присутствие в изображении АТФ-стимулированной митохондрии областей активности с протяженностью 100-200 нм вдоль строк (рис 46). Максимальная интенсивность (до 23 нм2) наблюдалась на периферии митохондрии, вблизи участков профиля большой крутизны, где протяженность динамических областей достигала 350-400 нм (рис 4).

0 1 2 х, мкм 0 1 2 х, мкм

Рис. 4. Области активности на отдельных изолированных митохондриях, (а) Митохондрия в изотонической среде, области активности отсутствуют, (б) локализация активных областей митохондрии при АТФ-стимуляции, динамические области наиболее заметны на границах митохондрии, (в) в деэнергизованном состоянии профиль митохондрии имеет низкую (25 нм) фазовую толщину, (г) профиль ФТ митохондрии при АТФ-стимуляции, фазовая толщина митохондрии под действием электрооптического эффекта в мембране увеличилась до 100 нм

Возникновение локальных флуктуаций фазовой толщины в митохондрии при АТФ-стимуляции мы объясняем работой ферментов V-

го комплекса и более высоким мембранным потенциалом. Ранее нами было установлено, что связанные с АТФазной - активностью характерные частоты флуктуаций митохондрий лежат в интервале 1,5-3 Гц. Существенно новым результатом является количественная оценка радиуса корреляции (50-100 нм).

Следующим объектом, на котором был апробирован метод РРДП, были опухолевые клетки НСТ-116. В них синтез пре-рибосом происходит в строго определенной области ядрышек интерфазных клеток на границе с плотным фибриллярным компонентом (ПФК). Согласно косвенным данным и прямым измерениям эти процессы сопровождаются локальными флуктуациями фазовой толщины. Использование метода РРДП позволило получить независимые доказательства локальности флуктуаций в окрестности ядрышка и определить его диагностическую ценность. Наиболее часто активные области наблюдались на периферии органелл или вблизи участков повышенной крутизны профиля. Интенсивность флуктуаций достигала 80 нм2 при размерах активной области от 50 до 200 нм. Возможность регистрации флуктуаций на участках изображения с размерами, меньше диска Эйри, была показана в ранних работах лаборатории Когерентной фазовой микроскопии и была обозначена как сверхразрешение в динамических фазовых изображениях. Размеры ядрышка и связанная с синтезом пре-рибосом интенсивность флуктуаций являются диагностически значимыми параметрами для характеристики функционального состояния клетки. Основные результаты работы

В процессе выполнения диссертационной работы были получены следующие результаты:

1. Разработан новый, не имеющий аналогов, метод одновременной

регистрации структуры и динамических процессов в фазовых

22

изображениях.

2. Разработана математическая модель для описания регистрации локальных динамических процессов на изображении объекта методом КФМ.

3. Показана зависимость регистрируемых методом РРДП параметров динамических процессов от параметров растра, цифровых фильтров и уровня шума. Произведен анализ факторов, влияющих на выбор параметров цифровых фильтров.

4. На основе разработанных алгоритмов создан прикладной программный комплекс WinTluck. Новый прикладной программный комплекс для работы на КФМ «Эйрискан» обеспечил обнаружение и регистрацию локальных динамических процессов в реальном времени.

5. Предложены новые количественные параметры для характеристики функционального состояния живых клеток и органелл на основе их фазовых изображений - интенсивность флуктуаций ОРХ в активных областях, их площадь и координаты в фазовых изображениях объекта.

6. Показана возможность регистрации локальных динамических процессов в клетках кровн (эритроцитах и лимфоцитах), в опухолевых клетках (HCT-116), в клетках дрожжей и изолированных митохондриях. Показана принципиальная возможность диагностики функционального состояния этих объектов на основе новых количественных параметров.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов А.Б., Кретушев A.B., Игнатьев П.С., Вышенская Т.В., Тычинский В.П., Растровый метод локализации манометровых областей активности в фазовых изображениях клеток // Российские нанотехнологии, 2, М. 2007 ,

№ 5-6 (июнь), стр. 120-125.

2. Иванов А.Б., Кретушев А.В., Вышенская Т.В.. Тычинский В.П., Морфо — функциональная диагностика на клеточном уровне методом растровой фазовой микроскопии (РФМ) // Альманах клинической медицины М» 17(2) 2008, стр 63-64.

3. Иванов А.Б, Кретушев А.В., Стогов О.М., Вышенская Т.В., Тычинский В.П., Когерентная фазовая микроскопия: исследование внутриклеточных сигналов // сб. тр. 3-го Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика 2010», Т. 3 с. 9-11, 2010 Москва.

4. Ivanov A., Ignatyev P., Kretushev A., Tychinsky V., Coherent Phase Microscopy: New technique for location of intracellular dynamic processes // Сб. тр. международной конференции Laser Applications in Life Sciences (LALS) Москва 2007 г.

5. Ignatyev P., Ivanov A., Kretushev A., Tychinsky V., Dynamic phase microscopy: a new method of the interactive real-time investigations of local metabolic activity // Сб. тр. международной конференции Laser Applications in Life Sciences (LALS) Москва 2007 г.

6. Ivanov A., Kretushev A., Ignatiev P., Tychinsky V., Digital phase image processing of live cells: mapping of metabolic active areas // Сб. тр. международной конференции Inernational Topical Meeting on 0ptoinformatics'08 Санкт-Петербург.

7. Тычинский В.П., Кретушев A.B., Клемяшов И.В., Вышенская Т.В., Иванов А.Б., Игнатьев П.С., Филиппова Н.А., Райхлин Н.Т., Штиль А.А., Снижение фазовой толщины — характерная реакция ядрышек на токсические воздействия при исследовании методом когерентной фазовой микроскопии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, №4: стр. 473-477 2007.

8. Иванов А.Б., Кретушев А.В., Вышенская Т.В., Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия: локализация внутриклеточных динамических процессов // труды Ш-ей Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты 2010», Москва 2010.

9. Иванов А.Б., Вышенская Т.В., Кретушев А.В., Клемяшов И.В, Тычинский В.П. Регистрация нанометровых областей активности в живых клетках методом динамической фазовой микроскопии // материалы форума Роснанофорум 2009, Москва.

10. Метелин В.Б., Кастрикина И.С., Артемов Д.В., Иванов А.Б. Биотестирование адресного воздействия наночастиц на клетки-мишени в режиме реального времени // материалы форума Роснанофорум 2009, Москва.

Подписано в печать 18.06.2012. Формат 60x84 1/16. Бумага офисная. Печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 142.

Отпечатано с готового оригинал-макета Типография ООО «КИРА» 163061, г. Архангельск, ул. Поморская, 34, тел. 65-47-11. e-mail: oookirafSatnet.ru

Введение.

1 Обзор методов фазовой микроскопии для изучения динамики живых клеток.

1.1 Метод Когерентной фазовой микроскопии (КФМ) и Динамической фазовой микроскопии (ДФМ).

1.2 Интерферометрические методы исследования структуры и динамики живых клеток и органелл.

1.2.1 Фурье фазовая микроскопия.

1.2.2 Гильберт фазовая микроскопия.

1.2.3 Дифракционная фазовая микроскопия.

1.2.4 Цифровая голографическая микроскопия.

1.2.5 Когерентная фазовая томография.

1.3 Выводы.

2 Метод Растровой Регистрации Динамических Процессов (РРДП)

2.1 Растровый метод ввода фазового изображения на КФМ "Эйрискан"

2.2 Регистрация временных процессов в растровых фазовых изображениях.

2.3 Методы обнаружения локальных динамических процессов в фазовых изображениях.

2.3.1 Локализация локальной динамики методом цифровой фильтрации столбцов топограммы.

2.3.2 Локализация локальной динамики методом кадровой съемки.

2.3.3 Анализ локализации частотных компонент методом оконного Фурье преобразования столбцов топограммы.

2.3.4 Регистрация быстрых процессов методом РРДП.

2.4 Цифровая фильтрация растровых фазовых изображений. Выбор параметров и проектирование цифровых фильтров.

2.5 Шумы фазовых изображений. Выбор порога обнаружения локальной динамики.

2.6 Пространственное разрешение метода РРДП.

2.7 Иллюстрация применения метода РРДП при исследовании митохондрий и лимфоцитов.

2.8 Программный комплекс для исследования динамических процессов на КФМ «Эйрискан».

2.8.1 Задачи и назначение создаваемого программного комплекса.

2.8.2 Алгоритм обнаружения и регистрации динамических процессов в клетках и органеллах. Обработка полученных экспериментальных данных

2.8.3 Критерии определения артефактов при обработке экспериментальных данных.

2.9 Выводы.

3 Обнаружение активных областей и регистрация динамических процессов в живых клетках и органеллах.

3.1 Фазовые изображения биологических объектов.

3.1.1 Описания выбранных объектов. Основные метаболические процессы.

3.2 Исследование динамических процессов в эритроцитах.

3.3 Растровая регистрация динамических процессов в митохондриях

3.3.1 Растровая регистрация областей метаболической активности митохондрий в нормальном состоянии.

3.3.2 Локализация динамических процессов митохондрий в энергизованном состоянии.

3.3.3 Активные области в деэнергизованной митохондрии.

3.4 Локальные динамические процессы Т-лимфоцитов.

3.4.1 Подготовка образцов к измерениям на КФМ «Эйрискан».

3.4.2 Измерение Активации Т-лимфоцитов Не-№ лазером.

3.5 Результаты применения метода РРДП на других живых биообъектах.

3.5.1 Флуктуации в ядрышке клеток НСТ116.

3.5.2 Клетки щитовидной железы.

3.5.3 Флуктуации в клетке дрожжей БассИагогшсез Сегеу1ае.

3.6 Выводы.

Актуальность работы. Изучение динамических процессов в живых клетках и органеллах, является одним из наиболее фундаментальных направлений клеточной биологии. Оптические методы исследования живых систем на клеточном и субклеточном уровнях широко используются в настоящее время в биологии и медицине. Методы фазовой или интерференционной микроскопии привлекают в последние годы особое внимание из-за уникальных свойств фазовых изображений и перспективы получения новой количественной информации о процессах в живых клетках [41,43,21-24]. В этих методах изображения представлены в виде распределения физически значимой величины - оптической разницы хода, которая зависит от структуры и свойств объекта. Современные методы фазовой микроскопии неинвазивны, обладают высокой чувствительностью к изменению показателя преломления и параметров структуры объекта. Поскольку живая клетка является важным объектом исследований, то для регистрации происходящих в ней процессов были также разработаны различные оптические методы, в т.ч. трек-диаграмм и кадровой съемки. Однако, до настоящего времени не были известны такие изображения объекта, в которых одновременно содержится информация, как о структуре, так и о динамических характеристиках объекта. В диссертации представлены результаты разработки растрового метода регистрации изображений клеток, в которых также представлена информация о динамических процессах. В разработанном в МГТУ МИРЭА методе Динамической фазовой микроскопии (ДФМ) динамические процессы регистрировались в виде трек-диаграмм - периодических во времени записях ОРХ вдоль фиксированной на топограмме линии сканирования. Методом ДФМ была получена информация о пространственных и временных характеристиках метаболических процессов в различных клетках [21]. Автором был сделан следующий шаг в решении проблемы одновременной регистрации структуры и локальных 4 динамических процессов в клетке [28]. В его основе лежит использование неизвестных ранее свойств растрового фазового изображения, которые состоят в возможности разделения пространственных и временных характеристик объекта. Метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) свободен от основного недостатка ДФМ, в котором регистрация динамических процессов производилась только в точках заранее выбранной скан-линии на фазовом изображении объекта. Его реализация позволила получить информацию в реальном времени о локализации и интенсивности динамических процессов на всем фазовом изображении клетки. Полученная методами фазовой микроскопии информация дополнит фундаментальные знания о процессах в живых клетках и позволит разработать новые методы диагностики и лечения заболеваний на клеточном уровне.

Цель работы и задачи исследования. Целью диссертационной работы является разработка метода обнаружения и регистрации динамических процессов в живых биологических объектах с помощью КФМ "Эйрискан". Метод должен обеспечить получение новых количественных данных в фазовых изображениях, полученных на КФМ "Эйрискан", для определения функционального состояния живых клеток и органелл. Разработанные алгоритмы и программный комплекс должны обеспечить обнаружение и регистрацию внутриклеточных динамических процессов в реальном времени. Для реализации поставленных целей были решены следующие задачи:

1. разработан метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП), обеспечивающий обнаружение активных областей в изображении объекта и оценку их частотных характеристик;

2. определены оптимальные режимы сканирования фазового изображения для регистрации динамических процессов;

3. разработанные алгоритмы реализованы в прикладном программном обеспечении \УтТ1иск для исследований динамических процессов в клетке на КФМ «Эйрискан»;

4. метод РРДП апробирован на фазовых изображениях биологических объектов - эритроцитах, клетках Т-лимфоцитов, опухолевых клетках НСТ-116 и т.д. Показана принципиальная возможность получения новой информации о состоянии объекта.

Методы исследования. Для решения поставленной задачи применялись экспериментальные и теоретические методы. В разработанных алгоритмах использовались методы цифровой обработки сигналов и изображений, спектрального анализа дискретных сигналов и расчета дискретных фильтров с заданными свойствами. Для создания автоматизированного программного комплекса исследования динамики живых биообъектов использовались методы объектно-ориентированного программирования и алгоритмы компьютерной графики.

Научная новизна работы:

1. Разработан метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) для обнаружения и регистрации локальных областей активности в статических фазовых изображениях с размерами порядка нескольких пикселей (до 70 - 100 нм).

2. Разработанный на основе метода РРДП и КФМ «Эйрискан» программно-аппаратный комплекс позволяет обнаруживать и регистрировать динамические процессы в живых биологических объектах с временным разрешением до 1 мс.

3. Экспериментально показана принципиальная возможность использования метода РРДП для диагностики функционального состояния биообъектов различной природы (клеток и органелл), что свидетельствует об универсальности метода как инструмента исследования функционального состояния и метаболических процессов в живых клетках.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод растровой регистрации динамических процессов (РРДП) для обнаружения и регистрации локальных временных процессов в живых биологических объектах на основе их фазовых изображений.

2. Созданный на основе КФМ «Эйрискан» и метода РРДП аппаратно-программный комплекс \¥тТ1иск позволяет обнаруживать локальные динамические процессы в областях с размерами до 70 нм и регистрировать их с временным разрешением до 1 мс.

3. Апробация метода РРДП на живых биологических объектах показала принципиальную возможность применения метода в биологии и медицине.

Практическая значимость и реализация научных результатов:

1. Полученные в ходе работы результаты показывают перспективу использования метода РРДП в фундаментальных исследованиях метаболических процессов в живых клетках. Дальнейшее развитие метода РРДП может быть основой для изучения механизмов передачи сигналов в клетках и органеллах и применений в медицине как средства экспресс диагностики функционального состояния клеток и органелл.

2. Важным достоинством метода РРДП являются: неинвазивность, высокая чувствительность, интерактивность и возможность регистрировать метаболические процессы в реальном времени на площади порядка одного пикселя.

3. Реализованный в РРДП подход, разработанные алгоритмы исследования динамических процессов и программное обеспечение были использованы для научных исследований в области биологии и медицины.

4. Созданное программное обеспечение позволяет автоматизировать процесс поиска динамических процессов и диагностики функционального состояния живой клетки на КФМ «Эйрискан».

Апробация работы

Основные научные результаты по теме диссертации были представлены на российских и международных научных конференциях: на международной научной конференции Laser Applications in Life Sciences (LALS) 2007, на 3-ей международной российско-германской студенческой конференции «Информационные технологии в современной жизни» Германия 2008, на 56-ой Научно - технической конференции МИРЭА, на 3-ей Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» Троицк 2008, на международной конференции «Topical Meeting on Optoinformatics 2008», на 3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты" 2010, на 4-ой Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине" 2010. Публикации

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 10 научных работах, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК.

3.6 Выводы

Метод Растровой Регистрации Динамических Процессов апробирован на фазовых изображениях живых биологических объектов - клетках и органеллах. Исследуемыми объектами были: эритроциты, митохондрии, Т-лимфоциты, опухолевые клетки НСТ-116, клетки щитовидной железы, клетки дрожжей. На эритроцитах наблюдали флуктуации ФТ, интенсивность этих флуктуаций зависела от формы эритроцита - дискоцит или сфероцит, что хорошо согласуется с данными из литературы [50]. У дискоцитов интенсивность активных областей выше, чем у сфероцитов. На фазовых изображениях митохондрий в нормальном и энергизованном состояниях наблюдаются активные области, которые мы связываем с метаболическими процессами в митохондриях - синтезом АТФ. Оценка спектра динамических процессов митохондрий в различных состояниях методом каскадной фильтрации позволила определить преобладающие частотные компоненты, на которых происходили динамические процессы. Значения спектральных компонент динамических процессов, полученные методом РРДП, сопоставимы со значениями спектральных компонент, полученными методом Динамической фазовой микроскопии (ДФМ), что позволяет судить о достоверности метода.

Локализация активных областей Т-лимфоцита в состоянии активации Не-Ые лазером показала наличие наиболее интенсивных активных областей в начале процесса активации со 2-ой по 8-ую минуты с момента начала измерений. Интенсивность флуктуаций и площадь активных областей уменьшались спустя 8 минут после начала облучения

Не-№ лазером. Известно [49], что наиболее интенсивно процессы активации лимфоцита лазером происходят в течении 3-6 мин с начала облучения. Отсутствие, на прежнем уровне, областей активности Тлимфоцита через 20 минут с начала облучения может быть объяснено уменьшением интенсивности метаболических процессов, связанных с активацией лимфоцита. Появление активных областей на фазовых

97 изображениях Т-лимфоцита в процессе его активации может быть объяснено изменениями его структуры в процессе активации, работой митохондрий, выделением гормонов (циотокинов) во внешнюю среду.

Применение метода на других объектах: раковых клетках НСТ-116, клетках тироцитов, клетках дрожжей показало универсальность данного подхода к исследованию динамических процессов в живых биологических объектах. На этих объектах тоже были обнаружены области активности, которые мы связываем с известными метаболическими процессами, происходящими в этих объектах. Появление активных областей в области ядрышек клеток НСТ-116 может быть вызвано синтезом пре-рибосом в ядрышках. На топограммах клеток щитовидной железы - тироцитах, области активности могут быть вызваны выделением секреторных гормонов во внешнюю среду. В клетках дрожжей наличие активных областей мы связываем с выделением пузырьков С02 во внешнюю среду.

Заключение

В процессе выполнения диссертационной работы были получены следующие результаты:

1. Разработан новый, не имеющий аналогов, метод одновременной регистрации морфологии и динамических процессов в фазовых изображениях.

2. Разработана математическая модель для описания регистрации локальных динамических процессов объекта на КФМ "Эйрискан".

3. Показана зависимость регистрируемых методом РРДП параметров динамических процессов от параметров растра, цифровых фильтров и уровня шума. Произведен анализ факторов, влияющих на выбор параметров цифровых фильтров.

4. На основе разработанных алгоритмов создан прикладной программный комплекс АЛ^пИиск. Новый прикладной программный комплекс для работы на КФМ «Эйрискан» обеспечивает обнаружение и регистрацию локальных динамических процессов в реальном времени.

5. Предложены новые количественные параметры для характеристики функционального состояния живых клеток и органелл на основе их фазовых изображений - интенсивность флуктуаций ОРХ в активных областях, их площадь и координаты в фазовых изображениях объекта.

6. Показана возможность регистрации локальных динамических процессов в клетках крови (эритроцитах и лимфоцитах), опухолевых клетках (НСТ-116), клетках дрожжей и изолированных митохондриях. Показана принципиальная возможность диагностики функционального состояния этих объектов на основе новых количественных параметров.

Благодарности

Автор считает своим долгом выразить благодарность научному руководителю Тычинскому Владимиру Павловичу за интересные идеи, работу и ценные критические замечания по существу работы, Кретушеву Александру Викторовичу за помощь в решении поставленных задач и обсуждение полученных результатов, а так же сотрудникам лаборатории «Когерентная фазовая микроскопия»: Клемяшову Ивану Валерьевичу, Вышенской Татьяне Владимиревне, Стогову Олегу, Орловой Анастасии.

Список сокращений и условных обозначений

КФМ - когерентная фазовая микроскопия ДФМ - динамическая фазовая микроскопия ФВ - фазовая высота

РРДП - растровая регистрация динамических процессов АП - активный пиксел

РДИ - растровое диффиренциальное изображение

1. Ikeda Т, Popescu G, Dasari RR, Feld MS. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems, Optics Letters, Vol. 30, Issue 10, pp. 1165-1167 2005.

2. Mann C., Yu L.F., Lo C.M., Kim M.K. High-resolution quantitative phase-contrast microscopy by digital holography. Optics Express Vol. 13, Iss. 22, pp. 8693-8698 2005

3. Park YK, Popescu G, Badizadegan K, Dasari RR, Feld MS. Diffraction phase and fluorescence microscopy. Opt Exp Vol. 14: pp. 8263, 2006. Optics Express Vol. 14, pp. 8263 2006

4. Popescu G, Badizadegan K, Dasari RR, Feld MS. Observation of dynamic subdomains in red blood cells. J Biomed Opt Lett 11: 040503, (Ikeda T, 2005)2006.

5. Popescu G, Deflores LP, Vaughan JC, Badizadegan K, Iwai H, Dasari RR, Feld MS. Fourier phase microscopy for investigation of biological structures and dynamics. Opt Lett 29: 2503-2505, 2004.

6. Popescu G, Ikeda T, Best С A, Badizadegan K, Dasari RR, Feld MS. Erythrocyte structure and dynamics quantified by Hilbert phase microscopy. J Biomed Opt Lett 10: 060503, 2005.

7. Popescu G, Ikeda T, Dasari RR, Feld MS. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt Lett 31: 775-777, 2006.

8. Popescu G, Park Y, Choi W, Dasari RR, Feld MS, Badizadegan K. Imaging red blood cell dynamics by quantitative phase microscopy. Blood Cells Mol Dis 41: 10-16, 2008.

9. N. Lue, W. Choi, K. Badizadegan, R. R. Dasari, M. S. Feld and G. Popescu, Confocal diffraction phase microscopy of live cells, Opt. Lett., 33, 2074 (2008).

10. N. Lue, W. Choi, G. Popescu, K. Badizadegan, R. R. Dasari and M. S. Feld, Synthetic aperture tomographic phase microscopy for 3D imaging of live cells in translational motion, Optics Express, Vol. 16, Issue 20, pp. 16240-16246 (2008)

11. Brown F.L. "Regulation of protein mobility via thermal membrane undulations" Biophis. J. 84, 842-853 (2003)

12. Rappaz В., Marquet P., Cuche E., Emery Y., Depeursinge C., Magistretti P. J. "Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cells with digital holographic microscopy" Opt. Express 13 (23), 9361-9373 (2005)

13. Г.Г. Левин "Компьютерная томография" http://www.tomoscan.ru (дата обращения 21.01.2012)

14. Тычинский В П "Сверхразрешение и сингулярности в фазовых изображениях" УФН 178 1205-1214(2008)

15. Тычинский В П "Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли "диалог" с клеткой?" УФН 177 535-552 (2007)

16. Тычинский В.П. «Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов» УФН 171 649 (2001)

17. Тычинский В.П. «Микроскопия субволновых структур» Успехи физических наук 166 1219 (1996)

18. Кретушев А.В., Тычинский В.П. Сверхразрешение на сингулярных участках фазовых изображений // Квантовая электроника. -2002.-Т. 32.-№ 1.-С. 66-70.

19. Karu T.I., Mitochondrial Signaling in Mammalian Cells Activated by Red and Near-IR Radiation. Photochemistry and Photobiology, 2008, 84: 1091-1099

20. Сергеенко А.Б. "Цифровая обработка сигналов" Учебник для ВУЗов, изд-во Питер, 2005

21. Рангайан P.M. "Анализ биомедицинских сигналов" Москва Физматлит 2007.

22. Иванов А.Б., Кретушев А.В., Игнатьев П.С., Вышенская Т.В., Тычинский В.П., «Растровый метод локализации нанометровых областей активности в фазовых изображениях клеток, Российские нанотехнологии», 2(5-6): 54-59 (2007).

23. Кретушев А.В. "Когерентная фазовая микроскопия биообъектов" Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук, МИРЭА 2003.

24. Гонсалес Р., Вуде Р., Эддинс С., "Цифровая обработка изображений в среде Matlab" Техносфера Москва 2006.

25. Tychinsky V., Tavrov A., Shepelsky D., Three-dimensional living cell imaging with super-Rayleigh resolution. Proc. SPIE Confer, v 1660. Biomedical Image Processing, 1992.

26. Reshetnikova I., Tychinsky V., Shepelsky D., Vyshenskaya Т., Investigation of Fungi cell wall structure with computer phase microscope, Microbiología, 61(5): 880-886.

27. Weiss . D.G., Tychinsky V.P., Steffen W., Budde A., Digital light microscopy techniques for the study of living cytoplasm, In: Image Analysis in Biology: Methods and Applications, 2nd. ed. D.-P Haeder Ed., CRC Press, Boca Raton, 1999.

28. Tychinsky V.P. , Kretushev A.V., Vyshenskaya T.V., Tikhonov A.N. , A dynamic phase microscopic study of optical characteristics of individual chloroplasts, Biochim Biophys Acta, 1665(1-2): 57-64 (2004).

29. Tychinsky V., Kretushev A., Vyshenskaja Т., Mitochondria optical parameters are dependent on their energy state: a new electrooptical effect? Eur Biophys. J.33(8): 700-705 (2004).

30. Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Klemyashov I.V., Vyshenskaya T.V., Shtil A.A., Zatsepina O.V, Coherent phase microscopy, a novel approach to study the physiological state of the nucleolus, Doklady Biochemistry and Biophysics 405(4): 432-436 (2005).

31. Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Luskinovich P.N., Dynamic phase microscopy: measurements of translational displacements at sub-nanometer scale. 2006 Optical Society of America.

32. Тычинский В.П., Кретушев А.В., Клемяшов И.В., Вышенская Т.В. Филиппова Н.А., Райхлин Н.Т., Штиль А.А., Исследование оптических параметров ядрышек при действии ингибиторов транскрипции методом когерентной фазовой микроскопии.

33. Лопарев А.В., Кретушев А.В., Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия: новый метод идентификации внутриклеточных структур по их оптическим и морфометрическим параметрам, Биофизика, 53 , 2 , 299-304

34. Mir М., Wang Z., Tangella К., Popescu G., Diffraction Phase Cytometry: Blood on a CD-Rom, Opt. Exp. 17, 2579-2585(2009).

35. Popescu G. Quantitative phase imaging of nanoscale cell structure and dynamics, in Methods in Cell Biology, Edited by B. Jena (Elsevier, 2008).

36. Popescu G. Quantitative phase imaging of nanoscale cell structure and dynamics, in Methods in Cell Biology, Edited by B. Jena (Elsevier, 2008).

37. Park Y. К., Diez-Silva M., Popescu G., Lykorafitis G., Choi W., Feld M.S., Suresh S., Refractive Index Maps and Membrane Dynamics of Human Red Blood Cells Parasitized by Plasmodium falciparumProc Natl Acad Sci USA, 105, 13730 (2008).

38. Wang Z., Millet L.J., Gillette M.U., Popescu G., Jones phase microscopy of transparent and anisotropic samples, Opt Lett, 33, 1270 (2008).

39. Lue N., Choi W., Popescu G., Ikeda Т., Dasari R.R., Badizadegan K., Feld M.S., Quantitative phase imaging of live cells using fast Fourier phase microscopy, Appl. Opt. 32, 811(2007)

40. Тычинский В.П., Куфаль Г.Э., Вышенская Т.В., Переведенцева Е.В., Никандров

41. С.Л. Измерения субмикронных структур на лазерном фазовом микроскопе «Эйрискан» // Квантовая электроника. Т. 24. -№ 8, С. 754-758. 1997.

42. Тавров А.В. Компьютерный фазовый микроскоп для регистрации субмикронных структур поверхности: Дис. на соискание учёной степени канд. тех. наук: 05.27.03 / МИРЭА.-М., 1992.

43. Weiss D.G., Galfe G. Video-microscopic techniques for study the living cytoplasm // Image Analysis in Biology. CRC Press, Boca Raton, P. 135-158, 1992.

44. Мантефель B.M., Андрейчук Т.Н., Кару Т.И. Реакция митохондрий лимфоцита в ответ на лазерное излучение и митоген ФГА. Молекулярная биология, 25, 273-280, 1991

45. Andreev V.A., Indukaev K.V., The problem of subrayleigh resolution in interference microscopy, Journal of Russian Laser Research, Volume 24, Number 3, 2003

46. Bunkin N.F., Ninham B.W., Ignatiev P.S., Kozlov V.A., Shkirin A.V., Starosvetskij A.V. Long-living nanobubbles of dissolved gas in aqueous solutions of salts and erythrocyte suspensions Journal of biophotonics Vol. 4, Issue 3, pages 150-164, March 2011

47. Balagopalan L, Sherman E, Barr V, Samelson L., Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action Nature reviews. Immunology Vol 11, Issue 1, pages 21-332011

48. Hell S.W., Far-field optical nanoscopy Science: Vol. 316 no. 5828 pp. 1153-1158 2007 57.Stephens D.J., Allan V.J., Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging, Science Vol. 300 no. 5616 pp. 82-86 2003:

49. Digman M.A., Brown C.M., Sengupta P.,* Wiseman P.W., Horwitz A.R., Gratton E., Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope, Biophysical Journal Vol. 89 pp. 1317-1327 2005

50. Rossow M.J., Sasaki J.M., Digman M.A., Gratton E., Raster image correlation spectroscopy in live cells, Nature Protocols 5, pp.1761-1774 2010

51. Pham H, Ding H., Sobh N., Do M., Patel S., Popescu G., Off-axis quantitative phase imaging processing using CUDA: toward real-time applications, Biomedical Optics Express Vol. 2 No. 7 Page 1781 2011

52. Wang R, Ding H., Mir M., Tangella K., Popescu G., Effective 3D viscoelasticity of red blood cells measured by diffraction phase microscopy, Biomedical optics express, March 2011 / Vol. 2, No. 3 / pp. 485-490

53. Ченцов Ю.С., Введение в клеточную биологию, ИКЦ «Академкнига», М 2004.

54. Тычинский В.П., Кретушев А.В., Клемяшов И.В., Вышенская Т.В., Штиль А.А., Зацепина О.В., Когерентная фазовая микроскопия новый подход к исследованию физиологического состояния ядрышка, ДАН405(4): 432-436 (2005).

55. Raska I., Shaw P., Cmarko D., Structure and function of the nucleolus in the spotlight, COCEBI18: 1-10, (2006).

56. Mayer C., Bierhoff H., Grummt I., The nucleolus as a stress sensor, Genes&Development,19:933-941, 2005.

57. Grummt, Life on a planet of its own: regulation of RNA polymerase I transcription in the nucleolus, Gen&Dev 17:1691-1702, 2003.67. http://www.thyroidmanager.org/ (дата обращения 2.12.2011)