автореферат диссертации по электронике, 05.27.03, диссертация на тему:Исследование внутриклеточных процессов методом динамической фазовой микроскопии

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Московский государственный институт радиотехники, электроники и автоматики (технический университет)

На правах рукописи

Никандров Сергей Леонидович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ МЕТОДОМ ДИНАМИЧЕСКОЙ ФАЗОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Специальности: 05.27.03 - Квантовая электроника 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре "Теоретические основы оптической электроники" Московского государственного института радиотехники, электроники и автоматики (технического университета).

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

ТЫЧИНСКИЙ В.П.

Официальные оппоненты: - доктор физико-математических наук, профессор РИНКЕВИЧЮС Б.С.

Ведущая организация: ФГУП Московский научно-исследовательский институт приборостроения.

Защита диссертации состоится 26 декабря 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 063.54.03 в Московском государственном институте радиотехники, электроники и автоматики (техническом университете) по адресу: 117454, г. Москва, просп. Вернадского, д. 78, аудитория Д-412.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИРЭА.

Автореферат разослан " НР^В^Я 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совет;

- доктор биологических наук, в.н.с.

КОТЕЛЕВЦЕВ С.В.

кандидат химических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Применение лазерного интерферометра позволило качественным образом изменить возможности оптической микроскопии. Особое место в создании современных средств исследования клетки отводится разработке и внедрению неинвазивных методов оптической микроскопии, используемых для изучения явлений самоорганизации и регуляции внутриклеточных процессов - одной из фундаментальных задач биологии.

Наиболее широко используемый метод ОЮЛЛсЗео микроскопии [14] позволяет исследовать с хорошим временным (20-40 мс) и с достаточно высоким пространственным разрешением (200-300 нм) внутриклеточную динамику (движение цитоплазмы), изменения цитоскелета и общей морфологии клетки. Существенным недостатком 01С-\Яс1ео метода является трудоемкость обработки данных видеосъемки при количественной оценки информации о параметрах движения, что практически исключает возможность статистического анализа результатов. Отчасти вышесказанное справедливо для современной флуоресцентной микроскопии [5-6], где используются методы видеорегистрации, но возникают дополнительные ограничения, связанные с малой интенсивностью света и меньшим пространственным разрешением.

В настоящее время появилась возможность преодоления этих ограничений методами лазерной фазовой микроскопии, разработанными в МИРЭА. Важным достоинством созданного проф. Тычинским В.П. компьютерного фазового микроскопа (КФМ) «Цитоскан», представляющего одну из последних модификаций данных приборов [710], и метода динамической фазовой микроскопии (ДФМ) [Д1, Д4, Д8] является высокая чувствительность к регистрируемым изменениям оптической разности хода (ОРХ) интерферирующих лучей, что позволяет наблюдать внутриклеточные динамические процессы с высоким временным (до 1 мс) и пространственным (до 100 нм)

разрешением,- Регистрируемый сигнал в произвольных точках объекта (а также, его сечениях) можно обрабатывать в стандартном пакете программ, что позволяет получать его статистические характеристики, в том числе Фурье-спектр. Безусловно, что такие возможности метода ДФМ имеют решающее значение для целого ряда биологических исследований и уже позволили получить первые результаты [Д5-Д7, Д9-Д14, Д16].

В работе рассмотрен метод когерентной фазовой микроскопии, его применение для изучения внутриклеточных динамических процессов, приводятся результаты измерений различных объектов и обсуждаются статистические характеристики наблюдаемых сигналов.

Цель работы: развитие метода ДФМ для неинвазивных исследований внутриклеточных процессов, сбор и анализ данных по спектрально-пространственным характеристикам биообъектов, определение корреляций между ними, а также, интерпретация полученных результатов.

Научная новизна состоит в развитии нового направления в когерентной фазовой микроскопии - динамической фазовой микроскопии. Новизна проведенных исследований заключается также в следующем:

- для исследования биообъектов применен новый фазовый метод оптической микроскопии;

- разработан алгоритм проведения измерений на КФМ «Цитоскан» методом ДФМ (включая инструкцию по работе с программным обеспечением);

- впервые методом ДФМ получены следующие результаты:

• обнаружены частоты, связанные с работой фермента АТФ-азы;

• зарегистрированы ритмические ответы мембранных структур миелинового нервного волокна при пролонгированном возбуждении;

• впервые произведено "картирование" интенсивностей флуктуации ОРХ живой клетки. Практическая ценность работы. Полученные с помощью метода ДФМ результаты могут быть использованы для проведения научных и клинических исследований морфоструктурных состояний нервных клеток и клеток крови в норме и при различных патологических состояниях. Данные по исследованию подвижности бактерий могут быть использованы прм создании установок по обеззараживанию почвы или выращиванию молочно-кислых бактерий. Положения, выносимые на защиту:

1. Возможность получения высокого латерального разрешения в фазовых изображениях непротяженных структур, таких как сферы латекса-100 нм.

2. Соответствие экспериментальных данных, полученных методом динамической фазовой микроскопии, теоретическим при условии наличия адекватной физической «додели.

3. Доказана возможность использования метода динамической фазовой микроскопии при исследовании следующих явлений:

- регистрации ритмических ответов мембранных структур миелинового нервного волокна при пролонгированном возбуждении;

- работы фермента АТФ-азы, встроенного в мембрану липосомы;

- влияния АТФ на характер флуктуации оптической разности хода в мембранных структурах митохондрий;

- процессов, происходящих в клетках на разных стадиях клеточного цикла.

4. Возможность "картирования" интенсивностей флуктуаций ОРХ живой клетки.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных и отечественных научных конференциях: ВЮБ Еигоре'96, Неделя Европейской биомедицинской

оптики, Объединенная конференция Европейской Лазерной ассоциации и Международного Биомедицинского общества (7-10 сентября 1996 г., Вена, Австрия); BiOS Europe'97, Неделя Европейской биомедицинской оптики, Объединенная конференция Европейской Лазерной ассоциации и Международного Биомедицинского общества (4-8 сентября 1997 г., Сан Ремо, Италия); Биологическая подвижность: современные методы исследования, Международный симпозиум (октябрь 1998 г., г. Пущино, Россия); ENDOCYTOBIOLOGY VII, Международный конгресс по эндоцитобиологии, симбиозу и биомедицине "Симбиогенезис и карциногенезис" (5-9 апреля 1998 г., Фрайбург, Германия); 23 Ежегодная конференция Немецкого общества цитологов (14-18 марта ,1999 г., Росток, Германия); Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам (20-23 апреля 1999 г., Москва, Россия); XLVIII научно-техническая конференция МИРЭА (10-17 мая 1999 г., Москва, Россия); 2-й Съезд Биофизиков России (23-27 августа 1999 г., Москва, Россия); XIII Всероссийский симпозиум "Структура и функция клеточного ядра" (19-21 октября 1999 г., Санкт-Петербург, Россия); XLIX научно-техническая конференция МИРЭА (12-19 мая 2000 г., Москва, Россия); IV Европейская конференция по функционированию глиальной клетки в норме и при заболевании (24-27 мая 2000 г., Барселона, Испания); II Международный конгресс "Слабые и гиперслабые поля и излучения в биогогии и медицине" (7-9 августа 2000 г., Санкт-Петербург, Россия); 3й Европейский биофизический конгресс (913 сентября 2000 г., Мюнхен, Германия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ [Д1-Д16].

Личный вклад соискателя. Автор диссертации принимал участие в разработке метода ДФМ, самостоятельно провел измерения на КФМ «Цитоскан» и обработал полученные результаты, внес ряд изменений в алгоритм математической обработки данных, принимал участие в интерпретации результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, библиографического списка использованной литературы и приложения. Содержание диссертации изложено на 167 страницах, иллюстрировано 70 рисунками. Библиографический список включает 90 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении к диссертационной работе дана общая характеристика исследуемой проблемы и ее состояние на современном этапе, обоснована актуальность выбранной темы, сформулирована цель и основные задачи проводимых исследований, приведены основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава носит обзорный характер. В ней приводится краткое описание современных оптических методов микроскопии. Из приведенного обзора следует, что известные автору из публикаций оптические методы дают ограниченную и, в основном, качественную информацию о внутриклеточной динамике. Таким образом, реально существует необходимость в разработке новых неразрушающих методов детального прижизненного изучения слабоконтрастных биологических объектов и происходящих в них динамических процессов.

Во второй главе приводится описание экспериментальной установки, разработанной проф. Тычинским В.П., на которой автор диссертации провел свои измерения - КФМ «Цитоскан». Блок-схема установки приведена на рис.1 [7]. В КФМ используются:

• модифицированный интерференционный микроскоп Линника МИИ-4;

• гелий-неоновый лазер в качестве осветителя (X = 632,8 нм);

• зеркало, управляемое пьезокорректором для модуляции фазы референтной волны;

• диссектор в качестве координатно-чувствительного фотоприемника.

Обьект'=д?УТ

Клетки

Пьвзокерамика

Не-1Ме лазер

Дис

Рис.1. Блок-схема КФМ «Цитоскан» ¡7]

Принцип действия прибора заключается в следующем. Излучение Не-Ые лазера отражается от полупрозрачного слоя на светоделительной пластине. Часть излучения через микрообъектив освещает объект и, после вторичного отражения и вторичного прохождения через светоделитель, попадает на фотокатод диссектора. Второй (опорный) луч освещает референтное зеркало и, пройдя в обратном направлении, проецируется на фотокатод диссектора, где и интерферирует с предметным лучом. Управление колебаниями пьезокорректора, на котором закреплено референтное зеркало, а также разверткой диссектора осуществляется с помощью электронного блока, в котором формируется измерительный интервал и напряжение управления фазой опорной волны, а также производится оцифровка выходного сигнала. Данный сигнал через интерфейс поступает в параллельный порт персонального компьютера, откуда периодически считывается процессором.

В третьей главе приведены принципы ДФМ.

Экспериментальная установка позволяет выделить в интерференционном изображении фазовую информацию в виде оцифрованного двумерного распределения разности фаз, которая

измеряется в единицах длины (ОРХ интерферирующих лучей) в реальном времени в каждой точке изображения. Разность фаз измеряется методом временного интервала, т.е. формированием импульса, длительность которого пропорциональна разности двух сравниваемых фаз, с последующим измерением длительности этого импульса путем его заполнения импульсами известной частоты.

Метод ДФМ основан на последовательных многократных измерениях разности фаз вдоль выбранного сечения - скан-линии. В результате получается двумерный массив данных координата-время, содержащий информацию об изменениях локальных разностей фаз за время измерения - трек-диаграмма. Ее вертикальное сечение по какому-либо столбцу представляет собой изменение ОРХ в точке в течение времени и называется регистограммой. Временное разрешение определяется продолжительностью измерения в одной точке и составляет 1 мс, экспериментально подтвержденное пространственное разрешение составляет 100 нм. Дальнейшая математическая обработка данных осуществляется в стандартном пакете программ.

В данной главе также приведены результаты измерений некоторых объектов, которые могут являться своеобразными тест-структурами для определения разрешения в фазовых изображениях и калибровки размеров поля зрения микроскопа. Ранее таковыми считались аттестованные протяженные сэндвич-структуры с шириной щели 50-400 нм [11]. Автором диссертации были получены фазовые изображения сфер латекса диаметром <1 = 100 нм [Д5], что позволило сделать вывод о возможности достижения значительного для оптических изображений пространственного разрешения непротяженных структур. Проведено исследование фиксированных образцов различных вирусов и риккетсий [Д2-Д4], что позволило получить фазовые изображения реальных биологических объектов с размерами от 0,1 мкм. Опубликованные изображения [12]

исследованных нами вирусов и риккетсий, полученные на сканирующих электронных микроскопах, по размерам и форме соответствуют их фазовым изображениям.

В четвертой главе описаны этапы апробации метода ДФМ.

Исследование процесса испарения тонких слоев жидкостей методом ДФМ [Д15] позволило получить значения их показателей преломления по экспериментальным данным, что подтвердило возможность корректной интерпретации результатов измерений при наличии адекватной физической и математической модели объекта. Таким образом, были подтверждены опубликованные ранее результаты [13], полученные методом лазерной микроинтерферометрии.

Интерференционные явления происходят вследствие сложения амплитуд волн, отраженных от границ раздела в тонком слое жидкости, находящейся на гладкой отражающей подложке. При изменении толщины слоя ОРХ отраженной волны периодически меняется во времени с постоянной средней скоростью, что хорошо видно на регистограмме (рис.2). Данной периодичности соответствует изменение "фазовой" толщины слоя жидкости на величину

^ = Г)

где Я - длина волны излучения, п\ - показатель преломления воздуха, п2 - показатель преломления жидкости. II, мкм

испаряющемся слое жидкости

По результатам измерений было определено значение Ah, подставление которого в формулу (*) дало возможность вычислить величину показателя преломления воды п2 = 1,33, которая с точностью до 1 % совпадает с ее табличным значением.

Далее в главе описана апробация метода ДФМ при изучении движения микрочастиц в цитоплазме клетки лука Allium сера. В частности, здесь наблюдался процесс, типичный только для участка контакта двух клеток вдоль общей стенки протяженностью около 600 нм, которому в томограмме с большой вероятностью соответствовала плазмодесма [Д4]. Изменение ОРХ происходило в виде регулярной серии из 15-20 импульсов длительностью « 100 мс каждый и амплитудой 6-8 нм (рис.3). Продолжительность таких серий составляла 3-5 с.

участке стенки клетки лука

В пятой главе приведены основные результаты экспериментальных исследований.

1. Обнаружена динамика изменений эритроцитов человека под воздействием ионов NO{ in vitro (рис.4а). На графике, представленном на рис.46, видно, что увеличение диаметра происходит в среднем со скоростью 0,33 мкм/с.

а

d, МКМ

20J

10-

0

-1-1-1-1-7

0 10 20 30 t, с

б

Рис.4. Изменения диаметра фазового изображения эритроцита человека под влиянием ионов N02 in vitro: а -топограммы, б- график зависимости (d- диаметр эритроцита, t- время)

2. Известно [14], что подвижность широко распространенное явление у свободно живущих форм бактерий. В некоторых условиях она дает им определенные преимущества, позволяя им, например, уходить из среды, содержащей токсические вещества, или, наоборот, двигаться по направлению к источнику пищи. Поэтому нам представилось интересным получить количественные характеристики подвижности бактерий, которая является показателем состояния данных клеток, что расширяет круг явлений, которые можно исследовать методом ДФМ. На рис.5а показана регистограмма изменений значений ОРХ, связанных с вращением жгутика бактерии Pseudomonas citronellotis. Наблюдаемый дискретный характер флуктуаций является признаком присутствия там гармонической составляющей, что видно на спектре Фурье этого процесса (рис.56). Результаты измерений демонстрируют возможность использования метода ДФМ не только для исследования внутриклеточных процессов, но и для получения характеристик подвижности бактерий, что имеет практическое значение.

h,HM

Рис.5, а - регистограмма изменений ОРХ в точке (h -фазовая высота, t - время измерения); б - спектр Фурье этого процесса, с отмеченными значениями частот и соответствующими им спектральным плотностям (р -спектральная плотность, F— частота)

3. Ритмическое возбуждение (РВ) нервной клетки сопровождается комплексом молекулярных, мембранных и клеточных процессов [15]. Фурье-анализ данных, полученных методом ДФМ на изолированных миелиновых нервных волокнах (nervus ischiadicus) травяной лягушки {Rana temporaria), позволил выделить частоты регулярных составляющих, присутствующих в флукгуациях ОРХ (рис.6а-б) в активных областях перехвата Ранвье [Д11, Д13-14, Д16]. В нормальном состоянии нерва они составили 5,3 и 10,8 Гц (рис.бв). При проведении РВ в уже выявленных активных областях была зарегестрирована еще одна доминирующая компонента на частоте 5,6 Гц (рис.бг). Возможно, регулярные изменения в нодальной области миелинового нерва при РВ обусловлены медленными изменениями состояния аксолеммы (изменение характера латеральной диффузии мембранных фосфолипидов), вызванные развивающимися следовыми изменениями мембранного потенциала аксолеммы. Тот факт, что аналогичные изменения отсутствуют в паранодальной области волокна, может свидетельствовать либо о локализации регулярных структурных изменений в аксолемме (или при взаимодействии аксона и шванновской

клетки), либо о технических сложностях при регистрации полезного сигнала в области миелина.

И,нм 1050

10

И,нм 103

50-

7(Г

4,с

р, нм /Гц 40-

р, нм /Гц

60-

200

о

»1 /¿.Л..^

40-

10 Р, Гц

204 о

10 Р Гц

Рис.6 Регистограммы (а-б) и соответствующие им спектры Фурье (в-г) флуктуации ОРХ в точке активной области перехвата Ранвье: а,в - при нормальном состоянии волокна, б,г -при ритмическом возбуждении (И - разность фаз, < - время, р -спектральная плотность, Г- частота)

4. Методом ДФМ была обнаружена работа встроенных в мембрану липосом ферментов АТФазы (рис.7) [Д5-Д6]. Есть основания полагать [16], что ферментативная активность во многих случаях приводит к появлению в спектрах флуктуаций ОРХ контрастных компонент с характерными частотами (рис.7г), которые могут служить маркерами для локализации ферментов. Липосомы с встроенными ферментами АТФазы являются адекватным объектом для исследования кооперативных процессов в ферментах. Обнаруженные контрастные спектральные компоненты с радиусами корреляции 100-300 нм (рис.7д) являются, по нашему мнению, убедительным доказательством локализации работающего фермента, поскольку других источников когерентных компонент в этой системе нет. Мы полагаем, что дальнейшее развитие метода ДФМ позволит исследовать ферментативную активность в клетке.

ферментом АТФ-азы при АТФ-стимупяции (а - усредненный профиль "фазовой" высоты Ь(Х) скан-линии, б - распределение средней интенсивности флуктуации ОРХ 1(Х), в - спектральный портрет с обозначенными линиями сечений, г - спектр Фурье кроме низкочастотнной, содержит интенсивную компоненту Р -1,2 Гц (вертикальное сечение спектрального портрета), д -протяженность компоненты Р = 1,2 Гц вдоль скан-линии меньше среднего диаметра липосом (горизонтальное сечение спектрального портрета), е - распределение низкочастотной компоненты Р = 0,2 Гц вдоль скан-линии)

5. Результаты исследований митохондрий печени и сердца крысы методом ДФМ [Д6, Д8-Д9] подтвердили присутствие в спектрах Фурье флуктуаций ОРХ частот, характерных для АТФазной активности.

Нами было установлено, что спектры Фурье на различных образцах митохондрий заметно отличались (рис.8).

Рис.8. Спектры Фурье флуктуаций разности фаз на разных образцах митохондрий (в двойном логарифмическом масштабе)

Регистограммы флуктуаций ОРХ и соответствующие им спектры Фурье свидетельствовали о нестационарности процессов за время измерений (15-100 с) и их зависимости от наличия фазы "дыхания". Добавление АТФ приводило к увеличению значений спектральных плотностей частот и их некоторому перераспределению в спектре. Для количественной оценки интенсивности флуктуаций и положения в активной области доминирующих частот оказалось удобным представлять результаты измерений в виде спектральных портретов, которые представляли собой набор Фурье спектров для последовательности точек скан-линии. Типичный трехмерный спектральный портрет АТФ-стимулированной митохондрии показан на рис.96, на котором отмечена одна из доминирующих компонент на частоте 2,25 Гц. Важно отметить, что данная частота была обнаружена ранее в липосомах с встроенной АТФазой, что, по-видимому, характерно для функционирующего фермента АТФазы.

0

Рис.9. Трехмерные изображения спектральных портретов митохондрий: а - без добавления АТФ, б- при добавлении АТФ

6. Применение метода ДФМ позволило получить дополнительную количественную информацию об изменениях в ядре в ходе клеточного цикла и апоптозе, а также о динамике образования дочерних клеток и апоптических телец клеток СПЭВ [Д7, Д10, Д12] (рис.10).

Рис.10. Ядро интерфазной клетки СПЭВ: а - фазовое изображение ядра распластанной клетки, б - трехмерное изображение ядра, на котором отчетливо видны контрастные ядрышки

Здесь нами были получены следующие результаты:

• В ядрах на разных стадиях клеточного цикла обнаружены более высокие частоты флукгуаций ОРХ, чем в цитоплазме.

• Предварительные исследования показывают, что клетки, находящиеся в разных периодах клеточного цикла или апоптозе, имеют характерный спектр частот флуюуаций ОРХ. Это позволяет

предположить, что методом ДФМ возможна идентификация положения клетки в клеточном цикле или вхождения в апоптоз.

• При вступлении клетки в митоз наряду с высокими частотами отмечаются появление низких и исчезновение уже в профазе высоких частот флуктуаций ОРХ. Вероятно, что присутствие высоких частот связано . с протекающими в ядрах процессами' транскрипции и репликации.

• Исследования хроматина ядер нормальных и апоптических клеток показали, что в апоптических клетках обнаружена субструктурированность хроматина в виде глобул диаметром 0,4 мкм. Можно предположить, что данный уровень компакгизации хроматина характерен только для апоптических клеток.

• В ядрах апоптических клеток обнаружены более высокие частоты флуктуаций ОРХ, чем в ядрах интерфазных клеток, по-видимому, связанные с биохимическими процессами при деструкции хроматина.

7. Нами впервые была предпринята попытка использовать метод ДФМ для "картирования" интенсивностей флуктуаций ОРХ живой клетки. На рис.11 изображена топограмма распластанной клетки Vero в стадии G, клеточного цикла, на которую нанесены линии одинаковой величины квадрата среднеквадратического отклонения о2 флуктуаций ОРХ в единицах А2. Такое функциональное изображение дает наглядное представление о наличии областей различных изменений ОРХ по всей исследуемой области клетки, что позволяет выявить в ней "активные" зоны. Так на рис.11 видно, что области с максимальной интенсивностью флуктуаций ОРХ находятся на границе ядро-цитоплазма, вероятно, в местах конденсации пристеночного хроматина. Отметим, что повышение значения а2 в центре клетки соответствует локализации ядрышка, и, вероятно, связано с процессом синтеза в нем рибосом. В его окрестности обнаружены следующие частоты флуктуаций ОРХ: 3 Гц (р = 40 нм2/Гц), 4 Гц (р = 20-40 нм2/Гц), 9,5 Гц (р = 40 нм2/Гц) [Д12].

1 мкм

Рис.11. Фазовое изображении клетки Vero в стадии Gi с нанесенными линиями одинаковой величины флуктуаций ОРХ в единицах А2

Заключение содержит основные результаты диссертационной работы и выводы.

В приложение включена инструкция по алгоритму работы в программе tluckml (которая является программным обеспечением КФМ «Цитоскан», а также посредством нее осуществляется взаимодействие пользователя с прибором) при проведении измерений методом ДФМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Разработанный методический подход перспективен для исследования целого ряда клеточных (и межклеточных) процессов, протекание которых отражается на структуре (форме, размере, взаимном расположении органелл) клеток, или связано с микродвижениями органелл или среды вблизи них. Эти процессы сопровождаются флуктуациями показателя преломления, которые приводят к локальным изменениям оптической разности хода лучей в интерференционном изображении объекта.

Метод ДФМ обеспечивает высокое пространственное разрешение (до 100 нм), временное разрешение порядка единиц миллисекунд и точность измерений локальных значений оптической разности хода (или разности фаз) порядка единиц нанометров. Дальнейшая обработка временных изменений ОРХ позволяет получить количественные характеристики локальных динамических процессов. Проведенные нами исследования различных объектов показали наличие характерных частот флуктуации ОРХ и локальных областей кооперативной активности в различных органеллах живых клеток.

В заключение, сформулируем основные выводы диссертационной работы:

1. Экспериментально подтверждена возможность получения высокого пространственного разрешения в фазовых изображениях непротяженных структур, таких как сферы латекса-100 нм.

2. Исследование вирусов и риккетсий позволили получить фазовые изображения биологических объектов с малыми размерами (от 100 нм).

3. Доказано соответствие экспериментальных данных, полученных методом динамической фазовой микроскопии при измерениях испарения жидкостей, теоретическим при условии наличия адекватной физической модели.

4. С помощью метода динамической фазовой микроскопии исследовали:

- влияние ионов ЛЮ2" на размер эритроцитов; .

- подвижность бактерий Pseudomonas-,

- ритмические ответы мембранных структур миелинового нервного волокна на пролонгированное возбуждение;

- работу фермента АТФ-азы, встроенного в мембрану липосомы; -изменения характера флуктуаций оптической разности хода у

митохондрий при АТФ-стимуляции;

- процессы, происходящие в клетках СПЭВ на разных стадиях клеточного цикла;

-проведено "картирование" интенсивностей флуктуаций ОРХ клетки Vera, выявлено характерное распределение областей с одинаковыми значениями а2 флуктуаций по всему исследуемому объекту.

Возможности метода динамической фазовой микроскопии носят уникальный характер и позволят в будущем получить новую информацию в таких областях биологии, как биофизика, биохимия, цитология, токсикология, медицина и др.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dieter G. Weiss and Gunther Galfe. Video-microscopic techniques to study the living cytoplasm // Image Analysis in Biology / Ed. by D.-P. Hader, CRC Press, Boca Raton, pp. 135-158,1992.

2. Weiss D.G., Maile W. Principles, practice and applications of video-enhanced microscopy // Electronic Light Microscopy / New York: Wiley-Liss, pp.105-140, 1993.

3. Dieter G. Weiss. Video-Enhanced Contrast Microscopy II Cell Biology: A Laboratory Handbook / Acad. Press, pp.77-85,1994.

4. Dieter G. Weiss, Vladimir P. Tychinsky, Walter Steffen and Axel Budde. Digital light microscopy techniques for the study of living cytoplasm II (mage Analysis in Biology: Methods and Applications / 2nd edition, Ed. by D.-P. Hader, CRC Press, Boca Raton, 1999.

5. M.Straub and S.W.Hell. Fluorescence lifetime three-dimensional microscopy with picosecond precisions using a multifocal multiphoton microscope II Applied Physics Letters / American Institute of Physics, vol.73, №13, pp.1769-1771,1998.

6. M.A.A.Neil, R.Juskaitis, T.Wilson. Real time 3D fluorescence microscopy by two beam interference illumination // Optics

Communications / Elsevier Science, 153, pp.1-4,1998.

7. Тычинский В.П. Компьютерный фазовый микроскоп I Знание, М„ с. 64, 1989.

8. Tychinsky V., Masalov I., Pankov V., Ublinsky D. Computerized Phase Microscope for Investigation of Submicron Structures // Optical Communications 174, pp. 37-40, 1989.

9. Тычинский В.П., Тавров A.B. Компьютерный поляризационный микроскоп II Письма в ЖТФ / т.5, № 10, с. 36-41, 1989.

10. Тычинский В.П., Тавров А.В. Лазерный компьютерный микроскоп с разрешением 10 нм // Квантовая электроника / №3, с. 264,1990.

11. Тычинский В.П., Тавров А.В., Шепельский Д.О., Щучкин А.Г. Экспериментальное подтверждение возможности сверхразрешения фазовых объектов И Письма в ЖТФ / т.17, №22, с.80,1991.

12. Ж.-К. Ролан и др. Атлас по биологии клетки /М., 1974.

13. Андрущак Е.А., Тычинский В.П. Применение лазерной микроинтерферометрии для изучения оптических и физических свойств тонких пленок II Новые элементы в информационных системах (Межвузовский сборник научных трудов) / МИРЭА, М„ с. 91-106,1977.

14. П. Каппуччинелли. Подвижность живых клеток / Пер. с англ. -М.: Мир, с.10-34,1982.

15. О.Р. Колье, Г.В. Максимов, Ч.Н. Раденович. Биофизика ритмического возбуждения (Механизмы генерации и распространения) / М.: Изд-во МГУ, 208 е., 1993.

16. Hiroyuki Noji, Ryohei Yasuda, Masasuke Yoshida, Kazuhiko Kinosita Jr. Direct observation of the rotation of Fi-ATPase II Nature /386, pp. 299-302,1997.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Д1. V.P. Tychinsky, E.V. Perevedentseva, T.V. Vyshenskaya, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. Imaging of Living Cell in Real Time II Proceedings of SPIE/vol.2926, p.289-296,1996.

Д2. Vladimir P. Tychinsky, Nikolaj V. Kaverin, Tatjana V. Vyshenskaja, Elena V. Perevedentseva, Georgi E. Kufal, Sergei L. Nikandrov. Studies of Influenza Virus Interaction with MDCK-Cells using Computer-aided Phase Microscope "Airyscan" /I Photonics West Conference, Technical Abstract Digest / p.224,1997.

ДЗ. V.P. Tychinsky, N.V. Kaverin, T.V. Vyshenskaja, E.V. Perevedentseva, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. Studies of Influenza Virus Interaction with MDCK-Cells using Computer-aided Phase Microscope "Airyscan" II Proceedings of SPIE 1 vol.3197, p.53-58,1997.

Д4. В.П. Тычинский, Г.Э. Куфаль, T.B. Вышенская, Е.В. Переведенцева, С.П. Никандров. Измерения субмикронных структур на лазерном фазовом микроскопе "Эйрискан" // Квантовая Электроника I т.24, № 8, с.754-758, 1997.

Д5. V. Tychinsky, Т. Vyshenskaja, L. Yagushinsky, S. Nikandrov, A. Kretushev, D. Dontsov. Real-time observation of cooperative F,F0-enzyme activity in single liposome II Biological motility: modern methods for studying / International Symposium Pushchino, Abstracts book, p. 168,1998.

Д6. Tychinsky V.P., Weiss D., Vyshenskaja T.V., Perevedentseva E.V., Yagushinsky L.S., Nikandrov S.L. Real-time observation of cooperative enzyme activity in liposomes and mitochondria II Endocytobiosis & Cell Research / ENDOCYTOBIOLOGY VII, International Congress on Endocytobiology, Symbiosis and

Biomedicine "Symbiogenesis and Carcinogenesis", Book of Abstracts, vol.13, Supplement, p.138,1998.

Д7. Tatjana V. Vyshenskaja, Galina E. Onishchenko, Olga M. Petrashchuk, Vladimir P. Tychinsky, Sergei L. Nikandrov. Chromatin Dynamics Measured by Phase Microscopy in Different Ceil Cycle Stages // European Journal of Cell Biology / 23 Annual Meeting of the Deutsche Gesellschaft fur Zellbiologie, Abstracts, Supplement 49, vol.78, p.29,1999.

Д8. С.Л. Никандров, Регистрация динамических процессов в биообъектах на компьютерном фазовом микроскопе «Цитоскан» II Сборник трудов XLVIII научно-технической конференции МИРЭА / часть 2, с.28-32,1999.

Д9. К.Б. Громадский, С.Л. Никандров, В.П. Тычинский, Л.С. Ягужинский. Изучение энергетических состояний митохондрий методом Динамической Фазовой Микроскопии // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам, Тезисы докладов / с.194,1999.

Д10. Тычинский В.П., Вышенская Т.В., Никандров С.Л., Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Идентификация стадий клеточного цикла методом динамической фазовой микроскопии II 2-й Съезд Биофизиков России, Тезисы докладов / т.2, с.627,1999.

Д11. С.Л. Никандров, Е.С. Лазарева, В.П. Тычинский, Г.В. Максимов. Влияние ритмического возбуждения на флуктуации фазовой высоты участков миелинового нервного волокна II Доклады МОИП. Общая биология / №1844, В-00,1999.

Д12. Г.Е. Онищенко, Т.В. Вышенская, С.Л. Никандров, О.М. Петращук, В.П. Тычинский. Исследование уровня внутриядерных динамических процессов в клетках в разных периодах клеточного цикла методом динамической фазовой

микроскопии // Цитология, Тезисы докладов и сообщения XIII Всероссийского симпозиума «Структура и функция клеточного ядра» (19-21 октября 1999 г., Санкт-Петербург, Россия) / т.42, №3, с.299, 2000.

Д13. С.Л. Никандров, Е.С. Лазарева. Регистрация активности нервного волокна методом динамической фазовой микроскопии // Сборник трудов XLIX научно-технической конференции МИРЭА (12-19 мая 2000 г., Москва, Россия) / с.67-70, 2000.

Д14. Lazareva E.S., Nikandrov S.L., Maximov G.V., Tychinsky V.P. Axoglial dynamic characteristic in myeline nerve researched by Dynamic Phase Microscopy // IV European Meeting On Glial Cell Function In Health And Disease (May 24-27, 2000, Barcelona, Spain), Abstracts / p.213,2000.

Д15. V. Tychinsky, A. Kretushev, S. Nikandrov. The interference effects in a thin layer of evaporating liquid II II International Congress "Weak and hyperweak fields and radiations in Biology and Medicine" (August 7-9, 2000, St-Petersburg, Russia), Abstracts / p. 106, 2000.

Д16. Lazareva E.S., Nikandrov S.L., Maximov G.V., Tychinsky V.P. Use Dynamic Phase Microscopy for investigation of myeline nerve axoglial relation dynamics II European Biophysics Journal with Biophysics Letters / 3rd EUROPEAN BIOPHYSICS CONGRESS (September 9-13, 2000, München, Germany), Abstracts, vol.29, number 4-5, 6C-11, p.353, 2000.

ЛР Jfe 070916 от 04.04.98 r.

Подп. в печ. 20.11.2000 г. Формат 60x88/16 Бум.тип.

Объем Усл. леч. л. 1,2__Тираж 100 экз. _Заказ 448

Отпечатано в печатном цехе ГУП Управления служебными зданиями ГУЭП «ЭФЕС» 107139, Москва, Орликов пер. 1/11, тел.207-80-52

Введение

Глава I. Современные методы прижизненной микроскопии биообъектов

Глава II. Описание экспериментальной установки

2.1. КФМ «Цитоскан»

2.2. Диссектор

Глава III. Принципы динамической фазовой микроскопии

3.1. Количественные данные, получаемые методом ДФМ

3.2. Влияние фокусировки на фазовое изображение сфер латекса

3.3. Получение высокого разрешения на фазовых изображениях вирусов

Глава IV. Апробация метода

4.1. Эксперимент с пьезокерамикой

4.2. Измерения испарения жидкости - модели с измененяющейся оптической разностью хода

4.3. Регистрация активности в клетке лука. Возможность построения динамической модели

Глава V. Основные результаты измерений, полученные методом ДФМ

5.1. Влияние ионов N02~ на фазовое изображение эритроцитов

5.2. Получение динамических характеристик подвижности бактерий Pseudomonas

5.3. Исследование влияния пролонгированного возбуждения на миелиновое нервное волокно

5.4. Регистрация работы кластеров АТФ-азы в мембранах липосом юз

5.5. Исследование активности митохондрий при АТФ-стимулировании

5.6. Регистрация внутриядерной динамики конденсации хроматина клеток СПЭВ в норме и при апоптозе

5.7. "Картирование" активности биологического объекта методом ДФМ 14g

Неинвазивные методы оптической прижизненной микроскопии занимают особое место в арсенале современных средств, поскольку они, в отличие от сканирующей электронной микроскопии и туннельной микроскопии, допускают исследования на клеточном уровне биообъектов в нативном состоянии.

Основные недостатки традиционной оптической микроскопии биообъектов, присущие в различной степени фозоконтрастным и конфокальным микроскопам, состоят в ограниченном пространственном разрешении и в необходимости окрашивания объектов для усиления контраста.

Конформационные изменения и движения органелл сопровождаются, как правило, заметным изменением оптической разности хода (ОРХ) в их интерференционном изображении, в то время как изменение локального поглощения света, регистрируемое в обычных амплитудных изображениях, может быть незначительным и недоступным измерениям.

Также хорошо известно, что наблюдение внутриклеточных динамических процессов является источником очень важной информации о митозе, трансмембранном транспорте, формировании цитоскелета и влиянии на клетку внешних факторов. Видеофильмы дают хорошее общее представление о совокупности процессов в реальном времени, но не позволяют получать локальные количественные характеристики.

В последние годы появилась перспектива преодоления этих ограничений методами лазерной фазовой микроскопии. Здесь следует отметить, что помимо сверхразрешения (при больших числовых апертурах объективов здесь возможно значительное (до 5 раз) превышение над классическим пределом разрешения) не менее важным достоинством компьютерного фазового микроскопа (КФМ) «Цитоскан» и предлагаемого метода динамической фазовой микроскопии (ДФМ) является высокая чувствительность к локальным временным изменениям фазы, что позволило наблюдать внутриклеточные динамические процессы с разрешением по времени до 1 мс, получать Фурьеспектры и другие статистические характеристики в произвольных точках или сечениях объекта. Эта особенность фазового метода имеет решающее значение для биологических применений, что позволило получить ряд новых результатов на различных биообъектах.

Настоящая диссертационная работа посвящена экспериментальному подтверждению возможности исследования биообъектов методом ДФМ на КФМ «Цитоскан», что позволит расширить область применения лазерных интерферометров в биофизике и медицине.

Приведем основные положения, выносимые на защиту:

1. Возможность получения высокого латерального разрешения в фазовых изображениях непротяженных структур, таких как сферы латекса-100 нм.

2. Соответствие экспериментальных данных, полученных методом ДФМ, теоретическим при условии наличия адекватной физической модели.

3. Доказана возможность использования метода ДФМ при исследовании следующих явлений:

- регистрации ритмических ответов мембранных структур миелинового нервного волокна при ритмическом возбуждении;

- работы АТФ-азы, встроенного в мембрану липосомы;

- влияния АТФ на характер флуктуаций ОРХ мембранных структур митохондрий;

- процессов, происходящих в клетках СПЭВ на разных стадиях клеточного цикла.

4. Возможность "картирования" живой клетки методом ДФМ.

Выводы. Основной целью методов прижизненной микроскопии является получение новой количественной информации о внутриклеточных процессах и ее интерпретация в соответствии с современными представлениями. Для установления причинно-следственных связей во временных процессах необходимо одновременно производить измерения в нескольких участках объекта.

Примером фундаментальной задачи, в которой решающее значение имеет изучение последовательности динамических процессов, может служить исследование фаз митотического цикла в ядре. Например, в фазе С1 характерным процессом является интенсивный синтез рибосом в ядрышках. Затем в 8-фазе происходит активный транспорт аминокислот через ядерную мембрану и репликация хромосом. В профазе - образование центриолей и веретена. Многие из этих процессов имеют характерные признаки самоорганизации и пространственно-временной корреляции. Можно предполагать, что кроме хорошо изученных структурных изменений они будут также сопровождаться более быстрыми конформационными изменениями с характерными временными параметрами (амплитудами, периодами).

Поэтому, "картирование" клетки методом ДФМ может стать источником новой важной дополнительной информации для генной инженерии и биотехнологии.

В заключение, сформулируем основные выводы диссертационной работы:

1. Экспериментально подтверждена возможность получения высокого латерального разрешения в фазовых изображениях непротяженных структур, таких как сферы латекса-100 нм.

2. Проведенные измерения фиксированных образцов различных вирусов и риккетсий позволили получить фазовые изображения реальных биологических объектов с размерами от 0,1 мкм, что находится вне обычных пределов оптического разрешения.

3. Апробированы алгоритм проведения измерений и методика обработки данных.

4. Исследование процесса испарения жидкости методом ДФМ показано соответствие экспериментальных данных теоретическим при условии наличия адекватной физической модели.

5. Обнаружены и экспериментально исследованы методом ДФМ следующие явления:

- влияние ионов на NO2 на размер эритроцитов;

- получены численные значения величин, характеризующих подвижность бактерий Pseudomonas;

- ритмический ответ миелинового нервного волокна на пролонгированное возбуждение;

- работа кластеров АТФ-азы, встроенных в мембрану липосомы;

- изменения характера флуктуаций ОРХ у митохондрий при АТФ-стимулировании;

- процессы, происходящие в клетках СПЭВ на разных стадиях клеточного цикла.

6. Проведено "картирование" клетки Vero методом ДФМ, что позволило выявить распределение областей с равной активностью по всему исследуемому объекту.

Данные, получаемые методом ДФМ, в ряде случаев, носят уникальный характер. Это позволит в будущем получить новую дополнительную информацию в таких областях, как биофизика, биохимия, цитология, токсикология, медицина и др. Поэтому есть все основания полагать, что разработанный метод дополнит арсенал средств, находящийся у современного исследователя.

1. Innoue S. Video Microscopy, New York: Plenum, 1986.

2. Dieter G.Weiss, Dieter Seitz-Tutter, George M.Langford. Characteristics of the motor responsible for the gliding of native microtubules from squid axoplasm, J. of cell science, S14, pp. 157-161, 1991.

3. Weiss D.G., Maile W. Principles, practice and applications of video-enhanced microscopy, Chapter in Electronic Light Microscopy, New York: Wiley-Liss, pp. 105-140, 1993.

4. Hiroyuki Noji, Ryohei Yasuda, Masasuke Yoshida, Kazuhiko Kinosita Jr. Direct observation of the rotation of FrATPase // Nature / vol. 386, pp. 299-302, 1997.

5. Evert L. de Beer, Annamiek M.A.T. Sontrop, Miklos S.Z.Kellermayer, Czaba Galambos, Gerald H. Pollack. Actin-filament motion in the in vitro motility assay has aperiodic component, Cell Motility, 38, pp. 341-350, 1997.

6. C. Rotsch, K. Jacobson, M. Rademacher. The dynamic of active and stable edges in motile fibroblasts investigated by atomic force microscopy, Proc. Natl. Acad. Sci. 96, pp. 921-926, 1999.

7. Rademacher M. Measuring the elastic properties of biological samples with the atomic force microscopy, IEEE Eng. In Med. And Biol., 16 (2), pp. 47-57, 1997.

8. M.Straub, S.W. Hell. Fluorescence lifetime three-dimensional microscopy with picosecond precision using a multiphoton microscope, Appl. Phys. Lett., vol. 73, 13, pp. 1769-1771, 1998.

9. Андрущак E.A., Левинсон Г.Р., Тычинский В.П. Активный лазерный профилограф, Новые элементы в информационных системах, МИРЗА, М., с. 85-90, 1977.

10. Андрущак Е.А., Тычинский В.П. Применение лазерной микроинтерферометрии для изучения оптических и физических свойств тонких пленок, Новые элементы в информационных системах, МИРЭА, М., с. 91-106, 1977.

11. Тычинский В.П., Бабенко В.П., Панков В.Л. Прецизионный лазерный измеритель микроперемещений, Новые элементы в информационных системах, МИРЭА, М., с. 107-109,1977.

12. Бабенко В.П., Панков В.Л., Тычинский В.П. Интерферометр для наблюдения медленных процессов деформации и релаксации материалов, Заводская лаборатория, т.45, № 8, с. 770-772, 1979.

13. Андрущак Е.А., Тычинский В.П. Цифровая фазометрическая система счета целой и дробной доли полосы для гомодинного микроинтерферометра, ПТЭ, с. 169-173, 1980.

14. Андрущак Е.А., Тычинский В.П. Устройство реверсивного счета полос для гомодинного интерферометра, ПТЭ, с. 173-175, 1980.

15. Фунтиков А.И., Андрущак Е.А., Орехова Т.С., Тычинский В.П., Эршлер Л.Б. Интерферометрический метод измерения электромодуляции фазы световой волны, отраженной от электрода, Электрохимия, т. 17, с. 1763-1770, 1981.

16. Андрущак Е.А., Вилков С.А., Поддубняк В .Я., Тычинский В.П. Измеритель топографии ультразвуковых колебаний поверхности, Электронная промышленность, вып. 7, с. 103, 1981.

17. Андрущак Е.А., Вилков С.А., Мазалов И.Н., Тычинский В.П. Лазерно-интерферометрический измеритель спектров сложных механических колебаний, Электронная промышленность, вып. 8, с. 104, 1981.

18. Андрущак Е.А. Квазиоптимальная лазерно-интерферометрическая система для топографирования вибрационных полей, Вибрационная техника, М., с.78-82, 1984.

19. Андрущак Е.А., Силин И.В., Тычинский В.П. Поликвадратурный гомодинный лазерный виброметр, Вибрационная техника, М., с.82-83, 1984.

20. Андрущак Е.А. Лазерно-интерферометрический виброметр диффузных объектов, Вибрационная техника, М., с.83-88, 1984.

21. Андрущак Е.А., Силин И.В. Корреляционный метод лазерной интерферометрии для измерения амплитуд колебаний диффузных объектов, Лазерн. средства измерений и перспективы их прим-я, Киев, с. 3-8, 1985.

22. Андрущак Е.А., Носов С.А., Гладышев В.В. Лазерное профилографирование поверхности, Лазерн. средства измерений и перспективы их прим-я, Киев, с. 110-115, 1985.

23. И.Н.Мазалов, К.Б.Самсонов, В.П.Тычинский. Измерительный комплекс для объективного контроля микрорельефа полупроводниковых структур. Электронная промышленность, № 5, с. 54, 1987.

24. Тычинский В.П. Компьютерный фазовый микроскоп, Знание, М., с. 64, 1989.

25. Tychinsky V., Masalov L, Pankov V., Ublinsky D. Computerized Phase Microscope for Investigation of Submicron Structures, Optical Communications, 74, pp. 37-40, 1989.

26. Тычинский В.П., Тавров А.В. Компьютерный поляризационный микроскоп, Письма в ЖТФ, т.5, № 10, с. 36-41, 1989.

27. Тычинский В.П., Тавров А.В. Лазерный компьютерный микроскоп с разрешением 10 нм, Квантовая электроника, № 3, с. 264, 1990.

28. С.С.Ветохин, И.Р.Гулаков, А.Н.Перцев. Одноэлектронные фотоприемники, Э н ер го атом из дат, 1986.

29. Y.P. Tychinsky, E.V. Perevedentseva, T.V. Vyshenskaya, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. The method of measurements of living cell dynamics. Proceedings of SP1E, 1995.

30. V.P. Tychinsky, E.V. Perevedentseva, T.V. Vyshenskaya, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. Imaging of Living Cell in Real Time. Proceedings of SPIE, vol.2926, p.289, 1996.

31. C.JI. Никандров. Регистрация динамических процессов в биообъектах на компьютерном фазовом микроскопе «Цитоскан» // Сборник трудов XLVIII научно-технической конференции МИРЭА / часть 2, с.28, 1999.

32. В.Г. Потемкин. Система MATLAB, Справочное пособие, М., 1997.

33. В.П. Тычинский, Г.Э. Куфалъ, Т.В. Вышенская, Е.В. Переведенцева, С.Л. Никандров. Измерения субмикронных структур на лазерном фазовом микроскопе "Эйрискан" // Квантовая Электроника / 24, № 8, с.754-758, 1997.

34. V.P. Tychinsky, N.V. Kaverin, T.V. Vyshenskaja, E.V. Perevedentseva, G.E. Kufal, S.L. Nikandrov. Studies of Influenza Virus Interaction with MDCK-Cells using Computer-aided Phase Microscope "Airyscan", Proceedings of SPIE, vol.3197, p.53, 1997.

35. Ж.-К. Ролан, А. Селоши, Д. Селоши. Атлас по биологии клетки, М., 1974.

36. К. Вилли, В. Детье. Биология, М., 1974.

37. В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин. Структура и биология вирусов животных, Наука, М., 1983.ч

38. М. Борн, Э. Вольф. Основы оптики / Изд. 2-е, Пер. с англ., М.: Наука, 1973.

39. Ю.Ю. Стойлов. Колебания жидкостей при испарении и парадоксы испаляторов, УФН, т. 170, №1, с. 41-56, 2000.

40. В.П. Тычинский. Микроскопия субволновых структур, УФН, т. 166, №11, 1996.

41. Irene К. Lichtcheild, Dieter G. Weiss. Visualization of submicroscopic structures in the cytoplasm of Allium сера inner epidermal cells by video-enhanced contrast light microscopy, European Journal of Cell Biology, 46, pp. 376-382, 1988.

42. П. Каппуччинелли. Подвижность живых клеток, Мир, М., с. 10-34, 1982.

43. J. Salanki. Neurobiolohy of invertebrates // Mechanisms of rhythm regulation / Budapest, p.252, 1973.

44. Латманизова Л.В. Возрастная микроэлектрофизиология/ Л., 1973.

45. Monnier A.M. S.R. / Soc. Seances Biol. Ses. Fil., vol.114, pp.1295-1297, 1933.

46. P. Колье, Г.В. Максимов, Ч.Н. Раденович. Биофизика ритмического возбуждения (механизмы генерации и распространения) / М.: Изд-во МГУ, 208 е., 1993.

47. С.Л. Никандров, Б.С. Лазарева, В.П. Тычинский, Г.В. Максимов. Влияние ритмического возбуждения на флуктуации фазовой высоты участков миелинового нервного волокна // Доклады МОИГ1. Общая биология / № 1844, В-00, 1999.

48. С.Л. Никандров, Е.С. Лазарева. Регистрация активности нервного волокна методом динамической фазовой микроскопии // Сборник трудов XL1X научно-технической конференции МИРЭА / Тезисы, 2000 (в печати).

49. LazarevaE.S., Nikandrov S.L., Maximov G.Y., Tychinsky V.P. Axoglial dynamic characteristic in myeline nerve researched by Dynamic Phase Microscopy // IV European Meeting On Glial Cell Function In Health And Disease, Abstracts / 2000.

50. Matti Saraste. Oxidative Phosphorylation at the fin de siecle // Science / vol. 283, pp. 1488-1492, 1999.

51. В.П. Скулачев. Енергетика биологических мембран / М.: Наука, 1989.

52. Manfred Auer, Gene A. Scarborough, Werner Kulbrandt. Three-dimensional map of the plasma membrane H+ -ATPase in the open conformation // Nature / vol. 392, pp. 840-843, 1998.

53. Hongyun Wang, George Oster, Energy transduction in the Fi motor of ATP synthase 11 Nature / vol. 396, pp. 279-282, 1998.

54. Shmuel Tuvia, Shlomo Levin, Arkady Bitler, Rafi Korenstein. Mechanical Fluctuations of the Membrane-Skeleton are Dependent on F-actin ATPase in Human Erythrocytes // Journal of Cell Biology / vol. 141, pp. 1551-1561, 1998.

55. Shimizu H., Haken H. Cooperative Dynamics in organelles // J.Theor.Biol. / vol. 104, pp. 261-273, 1983.

56. Шольц Х.Ф., Лагутина JI.C., Мамаев Д.В. Простой и быстрый метод получения больших однослойных липосом, пригодных для реконструкции мембранных белков // II съезд биофизиков России. Тезисы докладов / т. 2, стр. 574, 1999.

57. Дж. Бендат, А. Пирсол. Измерение и анализ случайных процессов / Пер. с англ., М.: Мир, 1974.

58. Д.Метцлер. Биохимия /М.: Мир, 1980.

59. М.В. Волысенштейн. Биофизика / Учеб. рук., 2-е изд., М.: Наука, 592 е., 1988.

60. Skulachev V.P. Molecular Mechanisms in Bioenergetics / Ernster L. ed., Elsevier,1. Amsterdam, p.37-73, 1992.

61. D.G. Weiss. Computer-aided light microscopy: New techniques for measuring physiological parameters in living cells // Eur. J. Physiol. / Pflugers Archiv, 426, Suppl. R157, 1994.

62. Dieter G.Weiss. Video-Enhanced Contrast Microscopy // Cell Biology: A Laboratory Handbook / Academic Press, pp.77-85, 1994.

63. Krasinskaia LP., Yagushinsky L.S. // FEBS / Lett. 167 , pp. 176-180, 1984.

64. Von Richard C. Duke, David M. Ojcius and J.Ding-E Yong. Die Apoptose-Regeln und Fehler beim Zellselbmord // Spektrum der Wissenschaft / ss. 26-35, 1997.

65. Программированная клеточная гибель / Под ред. Новикова B.C., Санкт-Петербург: Наука, 1996.

66. Б. Албертс, Д. Бей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон. Молекулярная биология клетки / т.З, М.: Мир, 1994.

67. Тычинский В.П., Вышенская T.B., Никандров СЛ., Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Идентификация стадий клеточного цикла методом динамической фазовой микроскопии // 2-й Съезд Биофизиков России, Тезисы докладов / т.2, с.627, 1999.

68. Angus 1. Lamond, William С. Earnshaw. Structure and Function in the Nucleus // Science / vol. 280, pp. 547-553, 1998.

69. Ясуо Кагава. Биомембраны / Пер. с яп. A.A. Селищевой, М.: Высш. шк., 303 е., 1985.

70. Л.П. Ярославский. Введение в цифровую обработку изображений / М.: Сов. радио, 312 с., 1979.

71. Л.П. Ярославский. Цифровая обработка сигналов в оптике и голографии: введение в цифровую оптику / М.: Радио и связь, 296 е., 1987.

72. Э.А. Витриченко, В.П. Лукин, Л.А. Пушной, В.А. Тартаковский. Проблемы оптического контроля / Новосибирск: Наука, 351 е., 1990.

73. М.Я. Шульман. Автоматическая фокусировка оптических систем / Л.: Машиностроение, 224 е., 1990.

74. Цифровые и оптико-цифровые методы обработки изображений // Межвузовский научно-технический сборник / Научн. ред. В.А. Кочегуров, Томск, изд. ТПИим. С М. Кирова, 169 е., 1985.

75. The Center for Frontier Sciences at Temple University: Frontier Perspectives / Volume 8, Number 1, 1999.

76. David M. Shotton. An Introduction to Electronic Light Microscopy // Cell Biology: A Laboratory Handbook / Second Edition, Vol. 3, p. 75, 1998.

77. Lance A. Ladic. The Use of Internet Graphics Software for the Processing and Display of Digital Microscopy Data // Cell Biology: A Laboratory Handbook / Second Edition, Vol. 3, p. 189, 1998.

78. Dieter Seitz-Tutter. Organellentransport und Eigenbewebgung der Mikrotubuli im Axoplasma des Tintenfisch-Riesenaxons // Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultat fur Biologie der Ludwig-Mzximilians-Universitat München / München, 1990.

79. Ф.А. Кузин. Кандидатская диссертация. Методика написания, правила оформления и порядок защиты / Практическое пособие для аспирантов и соискателей ученой степени, М.: «Ось-89», 208 е., 1999.