автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Хроматография, масс-спектрометрия и молекулярно-статистические расчеты адсорбции аминокислот и их производных на углеродных сорбентах

На правах рукописи

Кузнецова Елена Сергеевна

Хроматография, масс-спектрометрия и молекулярно-статистические расчеты адсорбции аминокислот и их производных на углеродных сорбентах

Специальность 05.11.11 -хроматография и хроматографические приборы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2009

003481716

Работа выполнена в лаборатории физико-химических основ хроматографии и хромато-масс-спектрометрии Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук Буряк Алексей Константинович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ланин Сергей Николаевич Московский Государственный "Университет им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

кандидат химических наук Назимов Игорь Владимирович Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН

Защита состоится «10» ноября 2009 года в 13 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 002.259.04 при Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 31, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, г. Москва, Ленинский проспект, 31, корп. 4. Автореферат размещен на сайте института ИФХЭ РАН: http://phyche.ac.ru

Автореферат разослан октября 2009 года.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим высылать по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 31, корп. 4, ИФХЭ РАН, ученому секретарю диссертационного совета Д 002.259.04 Ученый секретарь диссертационного совета, Ь

кандидат химических наук А-^&л&мггМк Коломиец Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Аминокислоты входят в состав пептидов, белков, а также пептидных гормонов и антибиотиков, участвуя в регуляции всех жизненных процессов организма. Свободные аминокислоты играют важную роль в метаболических процессах в организме человека и выполняют функцию биорегуляторов. Важную роль во внутри- и межмолекулярных взаимодействиях аминокислот и олигопептидов, при стабилизации белковых молекул, в общем балансе нековалентных взаимодействий в биохимических системах шрают водородные связи.

Аминокислоты - сложный объект исследований, так как они мало летучи, имеют в структуре кислотные и основные группы, высокополярны и обладают низкими коэффициентами поглощения в УФ области (за исключением ароматических аминокислот). В связи с этим при проведении хроматографического анализа этих веществ используют методы пред- или послеколоночной дериватизации. Вместе с тем по своему электронному и геометрическому строению производные значительно отличаются от исходных аминокислот. Кроме того, при идентификации аминокислот в различных биообъектах и определении пептидной последовательности белков во многих случаях оказывается необходимой информация о характеристиках удерживания свободных аминокислот.

В последнее десятилетие появился ряд работ, показывающих возможность разделения аминокислот, пептидов, гликопептидов, полипептидных антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием пористого графитированного углерода Гиперкарба. Также, в настоящее время интенсивно развиваются исследования, связанные с применением углеродных сорбентов в их различных формах как эффективных материалов для масс-спектрометрии лазерной десорбции/ионизации. Показано,

Л

что широкий спектр веществ можно анализировать при использовании в качестве матрицы таких углеродных материалов, как графит, углеродные волокна, активированный уголь. При проведении хроматографического исследования в сочетании с методами матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ, MALDI) и поверхностно-активированной лазерной десорбции/ионизации (ПАЛДИ, SALDI) важную роль играют свойства поверхности используемого сорбента. Применение при хроматографическом разделении и масс-спектрометрическом анализе материала с одинаковым химическим состоянием поверхности позволяет минимизировать потери вещества за счет необратимой адсорбции на всех стадиях анализа.

Цель и задачи исследований:

Целью диссертационной работы являлось изучение теоретически (молекулярно-статистическим методом) и экспериментально (методом ВЭЖХ и масс-спектрометрией МАЛДИ, ПАЛДИ) термодинамических характеристик адсорбции, хроматографического и масс-спектрометрического поведения аминокислот, их димеров и ассоциатов на углеродных сорбентах разного типа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести молекулярно-статистический расчет термодинамических характеристик адсорбции констант Генри (величины удерживания) и теплот адсорбции аминокислот и пептидов на поверхности графитированной термической сажи (TTC):

- изучить влияние структуры изомерных аминокислот на их адсорбцию на ITC;

- изучить влияние внутримолекулярной водородной связи на адсорбцию серосодержащих аминокислот на поверхности ГТС;

- исследовать влияние структуры димеров, ассоциатов аминокислот и пептидов на их адсорбцию на поверхности ГТС.

2. Исследовать закономерности удерживания аминокислот на пористом графитированном углероде в варианте обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ.

3. Изучить влияние удельной поверхности и химического состояния поверхности углеродных сорбентов при анализе аминокислот и пептидов методом ПАЛДИ.

Научная новизна:

1. Впервые молекулярно-статистическим методом рассчитаны термодинамические характеристики адсорбции аминокислот, их димеров и ассоциатов, а также ди- и трипептидов на ГТС с учетом изменения геометрической структуры за счет внутреннего вращения и внутри- и межмолекулярной водородной связи:

а) аминокислот — глицина, пролина, изомерных — лейцина, изолейцина, норлейцина, серина, изосерина, серосодержащей — цистеина, ароматических — феяилаланина, тирозина, гетероциклической — триптофана;

б) димеров и ассоциатов — димеров глицина, формамвда и уксусной кислоты, ассоциатов глицина и пролина с уксусной кислотой и формамидом; ассоциатов фенилаланина и тирозина с трифторуксусной кислотой (ТФУ); ассоциата глицина с двумя молекулами ТФУ;

в) аминокислот с внутримолекулярной водородной связью — цистеина и метилового эфира цистеина;

г) ди- и трипептидов — диглицина, триглицина.

2. Впервые для анализа аминокислот и пептидов методом ПАЛДИ использовали ГТС, сажи — ПМ-16Э, ПМ-75, Vulcan ХС 72R. Показано, что использование таких углеродных сорбентов позволяет повысить чувствительность и информативность определения соединений за счет образования кластеров [M+Na]+ и [М+К]+.

3. Сопоставлен порядок выхода ароматических аминокислот из колопки с Гиперкарбом и термодинамические характеристики адсорбции этих аминокислот и их ассоциатов с ТФУ на ГТС и получены удовлетворительные корреляции экспериментальных и расчетных величин.

Практическая значимость работы:

Применение графитированных и неграфитированных саж в качестве матрицы позволяет регистрировать группы высокоинтенсивных пиков молекулярного и квазимолекулярного иона М + катион, значительно повышая чувствительность и информативность метода ПАЛДИ. Предложенный способ определения аминокислот и пептидов на поверхности ГТС и углеродных сорбентов — ПМ-16Э, ПМ-75, Vulcan ХС 72R методом ПАЛДИ может стать основой аналитической методики быстрого и эффективного определения этих соединений в их сложных смесях в различных объектах.

Информация о термодинамических характеристиках адсорбции аминокислот, их димеров и ассоциатов на ГТС может быть использована для их идентификации при разделении на Гиперкарбе и концентрировании на других углеродных сорбентах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Рассчитанные молекулярно-статистическим методом термодинамические характеристики адсорбции аминокислот, их димеров и ассоциатов, а также ди- и трипептидов на поверхности ГТС.

2. Результаты сопоставления рассчитанных молекулярно-статистическим методом величин удерживания аминокислот и их порядка выхода из колонки с Гиперкарбом в условиях ОФ ВЭЖХ.

3. Способ определения аминокислот и низкомолекулярных пептидов методом ПАЛДИ, основанный на использовании в качестве подложки (матрицы) углеродных сорбентов ГТС и саж ПМ-16Э, ПМ-75, Vulcan ХС 72R, отличающийся тем, что позволяет повысить чувствительность и информативность определения по сравнению со стандартным анализом.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на III Международной конференции - школе «Масс-спектрометрия в химической

физике, биофизике и экологии» (Звенигород, 2007), XIII Всероссийском симпозиуме с участием иностранных ученых «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (Москва-Клязьма, 2009), III Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Самара, 2009).

В 2007 г. работа заняла 2 место на конференции - конкурсе научных работ молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН (Москва). В 2008 г. работа заняла 1 место на конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Физикохимия - 2008» (ИФХЭ, Москва, 2008). В 2008 г. работа отмечена дипломом за лучший стендовый дохлад Всеухраинской конференции с международным участием, посвященной 90-летию HAH Украины «Химия, физика и технология поверхности наноматериалов» (Киев, 2008). Публикации. По результатам исследования опубликовано 4 статьи и 15 тезисов. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 181 названия приложения на 10 стр. Материал изложен на 199 страницах машинописного текста (в том числе приложение), включает 81 рисунок и 29 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность исследований, сформулирована цель работы и отражена ее практическая значимость. Обоснована необходимость сочетания комплекса методов, включая ВЭЖХ, МАЛДИ и молекулярно-статистических расчетов, при исследовании хроматографического и масс-спектрометрического поведения аминокислот и пептидов на углеродных сорбентах.

Глава 1. Обзор литературы. Проанализированы возможности метода молекулярно-статистических расчетов термодинамических характеристик адсорбции (ТХА) для широкого круга веществ на ГТС. Рассмотрена роль водородной связи в структуре и межмолекулярных взаимодействиях аминокислот, олигопептидов и белков. Показано, что при анализе этих взаимодействий для сложных молекул пептидов и белков корректным является применение в качестве моделей небольших димерных молекул аминокислот. Сравнительный анализ различных хроматографических методов определения аминокислот и пептидов показал эффективное применение в методе ОФ ВЭЖХ нового углеродного сорбента — пористого графитированного углерода для исследования высокополярных соединений, а также разделения геометрических изомеров в широком диапазоне величин рН (0-14), температур и концентраций солей. Из обзора работ по применению методов МАЛДИ и ПАЛДИ следует, что поиск высокоселективных и эффективных материалов в качестве матрицы для анализа низкомолекулярных аминокислот, небольших пептидов и белков связан с применением углеродных сорбентов. Проанализированы особенности пористой структуры и химического состояния поверхности графитированных и неграфитированных саж. Из анализа литературы выбрано основное направление исследований: изучение свойств аминокислот, их производных и пептидов, особенностей их межмолекулярных взаимодействий, хроматографического и масс-спектрометрического поведения на углеродных сорбентах (сажах) с привлечением комплекса методов: ВЭЖХ, МАЛДИ, ПАЛДИ и молекулярно-статистических расчетов.

Глава 2. Экспериментальная часть. В качестве объектов исследования были выбраны следующие соединения: 1. Аминокислоты фирмы «Sigma» (США). 2. Пептиды фирмы «Sigma» (США) - диглицин, триглицин, аланилглутамин, пролиллейцин. Чистота аминокислот и пептидов составляет > 98 %.

В исследованиях использовались графитированные сажи: термическая Sterling МТ (ГТС) и печная ПМ-16Э с удельной поверхностью 7.6 и 16 м2/г, соответственно; неграфитированные печные сажи: ПМ-75 и Vulcan ХС 72R с удельной поверхностью 75 и 265 м2/г, соответственно; сорбент Hypercarb (пористый графитированный углерод) с удельной поверхностью 120 м2/г.

В работе использовали следующие приборы:

- жидкостной хроматограф Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, США) с градиентным насосом Quaternary Pump 1200, диодпо-матричггым детектором и программным обеспечением для обработки хроматографических данных ChemStation Rus версия А.10.02 (Agilent Technologies, США);

- MALDI-TOF-времяпролетный масс-спектрометр Bruker UltraFlex II, оснащенный лазером с рабочей длиной волны 337 нм и максимальной энергией 110 мкДж с программным обеспечением для сбора и обработки масс-спектров flexControl и flexAnalys.

Хроматографическое разделение проводили на стальных колонках: Hypercarb 100 х 2.1 мм, 5 мкм, 250 Á (Thermo Scientific, США) и Zorbax Eclipse XDB-C18 150 х 4.6 мм, 5 мкм, 80 A (Agilent Technologies, США). Условия хроматографирования приведены в таблице 1.

Таблица 1. Условия хроматографирования

Подвижная фаза Градиент Скорость подвижной фазы Объем вводимой пробы

0.04% ТФУ в ацетонитриле, 0.04% ТФУ в воде 95% буферный раствор - 5% ацетонитрил с 0.04% ТФУ, затем увеличение ацетонитрила с 0.04% ТФУ до 100% за 10 мин, 11 мин-100% ацетонитрил с 0.04% ТФУ и уравновешивание на начальных условиях. 0.5 мл/мин 5-10 мкл

При проведении эксперимента методами МАЛДИ и ПАЛДИ применяли разные способы нанесения исследуемых аминокислот, пептидов, их смесей: на

поверхность углеродных сорбентов, предварительно закрепленных на мишени (подложки из нержавеющей стали); на подложку из нержавеющей стали; на мишень, предварительно смешав с матрицей. Исследуемые вещества наносили из водных растворов и растворов, состоящих из смеси ацетонитрил - вода. Концентрация растворов составляла 2 мг вещества в 5 мл смеси ацетонитрил/вода в объемном отношении 1:1. В работе использовали матрицы: а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (СНСА) и 2,5-дигидрооксибензойную кислоту (DHB).

Молекулярно-статистический расчет констант Генри и теплот адсорбции проводили, опираясь на полуэмпирическую молекулярно-статистическую теорию адсорбции, разработанную A.B. Киселевым и Д.П. Пошкусом. В расчете использовались литературные данные по молекулярной рефракции молекул первичных аминов, карбоновых кислот и тиолов. Геометрические параметры рассматриваемых молекул получены из кристаллографических данных или на основании закономерностей изменения длин связей и углов для соединений этих классов.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Влияние электронного строения, структуры и водородной связи аминокислот и их производных на их адсорбцию на поверхности ГТС.

Проведен анализ влияния на параметры атом-атомной потенциальной (ААП) функции межмолекулярного взаимодействия атомов О...С (ГТС) и N...C (ГТС) исходных данных для их определения: поляризуемости и равновесного расстояния. В качестве модельного объекта была выбрана молекула глицина как самой простой аминокислоты. Установлено, что значения ТХА аминокислот уменьшаются с увеличением равновесных расстояний Гм...с(гтс) и /"о...с(Гтс)-Показано, что переход молекулы аминокислоты в цвиттер-форму мало влияет на значение константы Генри.

и

Влияние структуры изомерных аминокислот на их адсорбцию на поверхности ГТС. Анализ проводили на примере следующих аминокислот: серина и изосерина - изомерных аминокислот, содержащих функциональную группу ОН в а- и р- положениях, соответственно; лейцина, изолейцина, норлейцина - аминокислот с изомерией в углеродной цепи. Показано, что значения константы Генри К^с чувствительны к положению функциональных групп в аминокислоте. Для серина и норлейцина значения К/ с больше, чем для их изомеров, что обусловлено различием в положении групп ОН и N112 (для серина и изосерина) и групп СН3-СН(СН3)-СН2- СН3-СН2-СН(СН3)-, СН3-(СН2)3-(для лейцина, изолейцина и норлейцина) (Рис.1).

Апализ влияния электронного строения и геометрической структуры стереоизомеров на адсорбцию на поверхности ГТС проведен на примере пролина (внутримолекулярная водородная связь C-0-H""N), (8)-пирролин-5-карбоновой кислоты (производное пролина с двойной связью при атоме N), гидрокси-, дигидроксипролина и их изомеров с одной и двумя гидроксильными группами.

Показано, что в ряду изученных стереоизомеров значения ТХА возрастают с увеличением числа гидроксильных групп, а также при введении заместителей в экваториальное положение.

-з

о

з

Рис. 1. Рассчитанные значения Ь^/.с

адсорбции на ГТС:

1 — изосерина;

2 - серина;

3 — лейцина;

4 - изолейцина;

5 - норлейцина.

Обнаружено, что нейтральная молекула, цвиттер-ион пролина и пролин с внутримолекулярной водородной связью имеют близкие значения константы Генри и теплоты адсорбции.

Роль внутримолекулярной водородной связи в адсорбции аминокислот на поверхности ГТС. Сравнительный анализ ТХА для цистеина и его производных, для разных конформаций этих молекул проведен с учетом образования внутримолекулярной водородной связи и без нее (табл. 2). Таблица 2. Рассчитанные значения ТХА для серосодержащих аминокислот в

интервале температур 489-589 К

Соединение -диЛ кДж -моль"1 -мЛ Дж ■моль'-К"1 \пК,,с мкм

цистеин 53.4 102.2 1.8

цистеин с Б" "Н-0 50.1 103.5 0.9

цвитгер - ион цистеина 51.1 100.9 1.4

метиловый эфир цистеина 60.8 103.5 3.5

цвитгер - ион метилового эфира цистеина 59.4 103.1 3.2

метиловый эфир цистеина с СОО-Ш 61.9 108.9 3.1

метиловый эфир цистеина с 8"'Н-С 56.8 106.6 2.1

Из таблицы 2 видно, что внутримолекулярная водородная связь может стабилизировать неплоские конформации молекул, что существенно изменяет константу Генри и теплоту адсорбции на поверхности ГТС по сравнению с плоскими конформациями.

Рассмотрено влияние углов внутреннего вращения молекул серосодержащих аминокислот на ТХА соединений. Как показано на рис. 2 (а, б), изменение угла внутреннего вращения карбоксильной группы цистеина или его метилового эфира

оказывает большее влияние на константу Генри по сравнению с изменением угла внутреннего вращения аминогруппы.

Рис. 2. Зависимость константы Генри от углов внутреннего вращения для цистеина НБ-СНг-СНСЫЬу-СООН (а) и метилового эфира цистеина

ш-сн2-сн(кн2)-со2сн3 (б).

Влияние межмолекулярной водородной связи на адсорбцию димеров и ассоциатов аминокислот на ГТС. Расчет ТХА для димеров уксусной кислоты и формамида на ГТС с различными значениями длины водородной связи и разными конформациями показал, что полученные данные позволяют различать плоские и неплоские конформации димерных молекул.

Значения константы Генри и теплоты адсорбции больше:

- для димерных молекул, чем для исходных соединений;

- для димеров уксусной кислоты, чем для димеров формамида;

- для ассоциатов пролина с уксусной кислотой и формамидом, чем для соответствующих ассоциатов глицина.

Межмолекулярная водородная связь играет важную роль в адсорбции ассоциатов аминокислот с ТФУ - компонентом элюента при хроматографическом анализе аминокислот. Проанализированы соединения: ТФУ; ароматические аминокислоты - фенилаланин и тирозин; гетероциклические аминокислоты -пролин и триптофан; ассоциаты пролина, фенилаланина и тирозина с ТФУ; ассоциат глицина с двумя молекулами ТФУ с водородной связью КН--0 и

ассоциат глицина с двумя молекулами ТФУ с водородной связью ЫН-О и ОН—О; ди-и трипептиды (таблица 3).

Таблица 3. Рассчитанные значения ТХА для исследованных соединений в

интервале температур 298-398 К.

Соединение -дел", 1п К,.с, (мкм)

кДж-моль"1 Дж-моль"1-К"1

Трифторуксусная кислота 25.2 94.1 -0.1

Глицин 31.3 98.0 1.8

Пролин 53.5 109.4 9.4

Фенилаланин 80.5 120.0 19.0

Тирозин 85.8 121.9 20.9

Триптофан 100.9 125.9 26.5

Ассоциат глицина с ТФУ 57.4 121.9 9.5

Ассоциат пролина с ТФУ 79.5 124.7 18.1

Ассоциат фенилаланина с ТФУ 108.8 129.2 29.4

Ассоциат тирозина с ТФУ 113.9 130.3 31.3

Ассоциат глицина с двумя молекулами ТФУ с водородной связью N№-0 69.0 117.0 14.8

Ассоциат глицина с двумя молекулами ТФУ с водородной связью ЫН—О и он-о 91.5 127.2 22.6

Диглицин 52.6 110.3 9.0

Триглицин 79.7 119.3 18.8

Константы Генри и теплоты адсорбции аминокислот, их ассоциатов с ТФУ, а также ди- и трипептидов возрастают с увеличением молекулярного веса этих соединений. В частности, значение Д£Л°, для ассоциата глицина с двумя молекулами ТФУ с водородной связью ЫН—О и ОН—О больше аналогичного значения для ассоциата глицина с ТФУ и его ассоциата с двумя молекулами ТФУ с водородной связью №1—0 в 1.3 раза.

3.2. Закономерности удерживания аминокислот на пористом графитированном углероде при проведении ОФ ВЭЖХ. Известно, что удерживание на пористом графитированном углероде определяется сочетанием двух факторов: дисперсионными и электростатическими взаимодействиями между сорбатом - подвижной фазой и сорбатом - поверхностью сорбента. Энергия взаимодействия сорбата с сорбентом зависит от размера его молекулы при контакте с поверхностью пористого графитированного углерода, а также от типа и расположения функциональных групп по отношению к поверхности сорбента.

Проведен сравнительный анализ закономерностей удерживания аминокислот на колонке Гиперкарб и на колонке Zorbax Eclipse XDB-C18 в ОФ ВЭЖХ. Структурное отличие молекулы тирозина от молекулы фенилаланина заключается в наличии гидроксильной ОН-группы, а молекулы триптофана - в наличии пятичленного азотсодержащего гетероцикла. Поэтому анализ влияния строения аминокислот на их удерживание на колонках Гиперкарб и С18 провели, оценив вклад группы (-ОН) и азотсодержащего гетероцикла путем сравнения молекул аминокислот, приняв молекулу фенилаланина в качестве стандарта и оценив разности дифференциальных мольных энергий Гиббса адсорбции веществ по формуле: 5 (AG)12 = - RTln(k¡ / кф.) = - RTlna (Т = 298 К).

Результаты представлены в таблице 4, где приведены также значения молярной массы М, поляризуемости а, дипольного момента D, теплоты адсорбции ДСЛ и логарифма константы Генри 1пАГ/.с молекул. Удерживание тирозина на колонке XDB-C18 слабее, чем фенилаланина, что связано, очевидно, с присутствием в молекуле тирозина функциональной группы ОН (5(AG) = 0.6 кДж/моль) и приводит к более сильному взаимодействию с элюентом, в результате удерживание уменьшается. Наибольшее удерживание наблюдается для триптофана, как и на колонке Гиперкарб, что связано с существенным вкладом в энергию адсорбции пятичленного азотсодержащего гетероцикла (S(AG) = -0.5

кДж/моль), а также и с наибольшим значением молярной массы данной аминокислоты.

Таблица 4. Влияние структурных характеристик аминокислот на межмолекулярное взаимодействие адсорбата и поверхности неподвижной фазы

Сорбат 1с 5 (АО), кДж/моль м, г/моль а, А3 О кДж/моль 1 пК,.с, мкм

Гиперкарб ХОВ-С18 Гиперкарб ХОВ-С18

Фенилаланин 5.0 1.3 Стандарт 165 79.3 2.5 80.5 19.0

Тирозин 5.4 1.0 -0.2 0.6 181 85.5 2.1 .,85.8 20.9

Триптофан 8.1 1.6 -1.2 -0.5 204 176.4 3.5 100.9 26.5

В случае применения колонки Гиперкарб появление в молекуле тирозина функциональной группы ОН не сильно сказывается на сорбции по сравнению с фенилаланином (5(АО) = -0.2 кДж/моль). Существеннее влияние взаимодействия молекулы триптофана с сорбентом, обусловленное наличием неподеленной электронной пары атома азота в гетероцикле (5(ДО) = -1.2 кДж/моль.). Значительное различие поляризуемости молекулы триптофана (в два раза) от поляризуемостей молекул фенилаланина и тирозина приводит к увеличению адсорбции на поверхности графита. Вероятно, взаимодействия поляризуемых функциональных групп в сорбате с графитом, являются существенным дополнением к дисперсионным взаимодействиям. Структура молекулы триптофана, характеризующаяся плоской и поляризуемой группой, обуславливает увеличение удерживания.

Фенилаланин и тирозин имеют близкие параметры удерживания, однако их можно разделить при хроматографическом анализе смеси аминокислот (рис. 3).

•радЧ"». С»м»Д14~1IЭй <Я1йГ*Т®В'сГВГ~

а

4.1

4.3

в

6.3

Рис. 3. Хроматограмма смеси фенилаланина (а), тирозина (б) и триптофана (в) на колонке Гиперкарб в градиентном режиме. Детектирование: 224 нм. Сопоставлены экспериментальные результаты, полученные методом ОФ

ВЭЖХ, и рассчитанные молекулярно-статистическим методом ТХА для исследованных аминокислот на ГТС (рис. 4). Корректность такого сопоставления обусловлена близостью химии поверхности ГТС и Гиперкарба. Как видно из рисунка, наблюдается удовлетворительная корреляция между экспериментальными и расчетными значениями (рис. 4).

Рис. 4. Корреляционная зависимость между параметрами удерживания аминокислот на Гиперкарбе и ТХА на ГТС, рассчитанными молекулярно-статистическим методом.

Коэффициент корреляции составляет 0.99, стандарт - диэтиламин.

-А^,0, кДж/моль теор.

В таблице 3 представлены рассчитанные значения ТХА на ГТС аминокислот, их димеров и ассоциатов с ТФУ. Сопоставление рис. 4 и данных таблицы 3 позволяет предположить, что образование ассоциатов исследованных аминокислот с ТФУ не изменит порядка выхода ассоциатов из колонки Гиперкарб, а только изменит абсолютные величины удерживания.

Проведен сравнительный анализ параметров удерживания аминокислот, рассчитанных молекулярно-статистическим методом, экспериментально

триптофана, орнитина и метионина. В последнем случае эксперимент проводился в градиентном режиме на колонке Гиперкарб (5 мкм, 100 х 0.32 мм) с подвижной фазой, содержащей водный раствор 0.1% муравьиной кислоты и ацетонитрил с 0.1% муравьиной кислотой. Представленная на рис. 5 зависимость между относительным временем удерживания аминокислот и значениями 1пК/с для адсорбции аминокислот на ГТС демонстрирует удовлетворительную корреляцию.

Из литературных данных известен порядок выхода и время удерживания двадцати протеиногенных аминокислот па колонке Гиперкарб (элюент - водный раствор 20 мМ нонафторпентановой кислоты и ацетонитрил). Проведено сопоставление этих экспериментальных данных и рассчитанных констант Генри адсорбции аминокислот на ГТС и получена удовлетворительная корреляция с коэффициентом 0.95.

Таким образом, показана возможность априорного предсказания хроматографического поведения аминокислот в ОФ ВЭЖХ на Гиперкарбе методом молекулярно-статистического расчета констант адсорбционного равновесия.

1. HPLC Analysis of Biomolecules. Technical Guide // Thermo Electron Corporation. 2004.47 P.

определенных в данной работе и в работе1 для аминокислот фенилаланйна,

12 14 18 1В 20 22 24 26

InК1С? (мкм] теор.

Рис. 5. Корреляционная зависимость между относительным временем удерживания аминокислот на Гиперкарбе и 1пЛ0.с адсорбции аминокислот на ГТС: ■ -фенилаланин, тирозин, триптофан (данная работа), □ - орнитин, метионин, фенилаланин, триптофан1. Коэффициент корреляции 0.96.

3.3. Влияние удельной поверхности и химического состояния поверхности углеродных материалов при анализе аминокислот и пептидов методом МАЛДИ. Проанализированы особенности масс-спектрометрического поведения аминокислот и пептидов в традиционном варианте проведения эксперимента, при их нанесении на поверхность нержавеющей стали и на поверхность углеродных сорбентов.

На примере МАЛДИ анализа ароматических аминокислот и ди- и трипептидов в режиме регистрации положительных ионов при традиционном варианте проведения эксперимента (подложка из нержавеющей стали и матрицы СНСА и ОНВ) показано, что в масс-спектрах интенсивность регистрируемых пиков ионов [матрица+Н]+, [матрица+Ка]^ и [матрица+К]+ и фрагментных ионов матрицы в несколько раз (~ в 2-5 раз) выше значений интенсивности аналогичных пиков ионов анализируемых соединений, что значительно затрудняет идентификацию.

Проведен сравнительный анализ масс-спектров для разных классов аминокислот и пептидов при нанесении их на подложку из нержавеющей стали и на графитированные и неграфитированные сажи (рис. 6 и 7).

Показано, что применение графитированных саж приводит к повышению интенсивности регистрируемых пиков в 5 - 10 раз по сравнению с интенсивностью при использовании подложки из нержавеющей стали, особенно резко возрастает интенсивность кластерных ионов щелочных металлов.

Активная генерация ионов с углеродной поверхности графитированных саж обеспечивает получение надежных масс-спектров аминокислот и пептидов в дипазоне низких масс без образования углеродных кластеров. Показано, что ионы кластеров углерода СПН+ не взаимодействуют с анализируемым соединением их пики несоизмеримо малы по сравнению с идентифицируемыми пиками соединений.

¿2000 g 1500 £

£ 1000 soo

3 4000 ^*3000

1001)

[М+НГ [M+Na]+ 137^ £М+К]+ 115.724 I . I . I. 710 f 1. . t 1 .

[м+кГ т IM+H1* [M+N3] 115,733 --- 727 '

. 153 [M+Kf — 1М+Н1+ [M+Na]* 616 f

[M+Na]+ ^ [M+H]* 115.607 1 ^ [M+Kf лдд 586 1

[M+Hf iM+NaJ' П7 115.572 ......'........... 535 [M+KJ+ ^ 50S ' 1 ..............'.....

Рис. 6. Масс-спектры пролина на подложке из нержавеющей стали (а) и на сажах ГТС (б), ПМ-16Э (*), ПМ-75 (г) и Vulcan ХС 72R (д) в режиме регистрации положительных ионов.

^8000

а 6000 ■S «ООО

[M+Hf [M+Na]+ - 189.845 830 227 831 8.05.09AKPEP\3gly 75%laserRP\3Ref - [M+KJ ........- I 1

227 [M+Hf [M+Naf ^ysi 189 785 78fl 8.05.09 *KPEP\3gly-»GTC 75% laser RPttRvf [M+KJ* .. 1 1

[M+Na]* — 838 227 i.. ... 25.05.09V3g!y+ PM16-E75% laser RPV1 Ret 881 — [M+K] .. . ..

[М+Hf ГМ+Ы„Г 211827 227 .54 , 4■И■03«<PE, ■ j [M+KI' 189.663 1 A ' A. i IU. » .. A. . . . »

; [M+H]* [M+Naf" m 189.649 *i'n i . h'-i" IV, ....... 779 22.05.09 AK PEP + 9\3gly+ 9 RP 75% laaert2Ref

190 200 210 220 230 240 250 260

т/2

Рис. 7. Масс-спектры триглицина на подложке из нержавеющей стали (а) и на сажах ГТС (б), ПМ-16Э (в), ПМ-75 (г) и Vulcan ХС 72R (д) в режиме регистрации положительных ионов.

Как видно из рис. 6 и 7, интенсивность пиков при переходе от подложки из нержавеющей стали к углеродной поверхности неграфитированных саж возрастает в 10-20 раз. Применение неграфитированных саж ПМ-75 и Vulcan ХС 72R приводит к резкому возрастанию интенсивности всех типов регистрируемых ионов, особенно кластерных ионов [M+Na]+ и [М+К]+. Большая удельная поверхность неграфитированных саж способствует более равномерному распределению молекул анализируемого соединения, препятствуя агрегации молекул.

Другим важным аспектом является различие химического состояния поверхности графптированных и неграфитированных саж. Наличие кислотных функциональных групп на поверхности неграфитированных саж, прежде всего карбоксильных (-СООН, -COONa, -COOK), способствует более эффективному образованию аддуктов [M+Na]+ и [М+К]+ в процессе десорбции/ионизации.

Роль удельной поверхности саж в повышении информативности масс-спектров отражает диаграмма, представленная на рис. 8. Она демонстрирует зависимость интенсивности пиков протонированных молекулярных ионов всего массива исследованных аминокислот и пептидов от удельной поверхности саж. Анализ проведен для масс-спектров, определенных в режиме положительных ионов.

Для графитированных саж с удельной поверхностью 7.6 и 16 м2/г интенсивность пиков молекулярных ионов аминокислот различных классов находится в диапазоне — 250 — 500 усл. ед., пептидов — 700 усл. ед. Применение сажи ПМ-75 с удельной поверхностью 75 м2/г увеличивает интенсивность молекулярных ионов исследованных соединений ~ в 5 - 7 раз. Использование сажи Vulcan ХС 72R с удельной поверхностью 265 м2/г повышает интенсивность молекулярных ионов изученных соединений на порядок по сравнению с интенсивностью ионов веществ, определенной на графитированных сажах.

Рис. 8. Диаграмма зависимости интенсивности пиков протонированных молекулярных ионов соединений от удельной поверхности саж. Обозначения: аминокислоты

- моноаминомонокарбоновые, - диаминомонокарбоновые,

- оксимоаминокарбоновые, _ ароматические,

- моноаминодикарбоновые, — гетероциклические,

серосодержащие, - пептиды.

Перспективность применения сажи для анализа смесей аминокислот и пептидов иллюстрирует рис. 9, где представлены масс-спектры смеси пептидов. Как видно из рисунка, использование графитированных саж ГТС и ПМ-16Э приводит к успешному определению пептидов в виде их аддуктов с катионами щелочных металлов [М+Иа]+ и [М+К]+. Интенсивность пиков находится в диапазоне от 500 до 2000-3000 усл. ед.

Метод МАЛДИ позволяет анализировать высоко полярные соединения и их соли. Анализ аминокислот и пептидов в виде солей имеет практическую ценность, например, при их определении в плазме. Присутствие в масс-спектрах помимо молекулярного, квазимолекулярного иона М + катион повышает информативность спектров.

] 14.0S.09 АКРЕР + saga\smea peptid + GTC RP754 1 3+Na 240 256 WC 2+M 1 M f HNa 2+.Va 212 228 M+Na \ 155 1 251 . 1 , . i L. . i 1 <ilasert2R 4+K 2 t ef Raw 67

3 2S.0S.09\smes oeo + PN 1 3+Na 2< а \ ..V 2+Na 2+K.4 1 i i .........1. . . L 16-E75% lai 0 4+Na 251 L......1. er RPURefRaw 256 3+K 4+K 267 Ii i. 1.

i 14.05.09 АКР Я J . 2+Na 21 1 ,, 1+Na 1+K j 1 155 171 i 1 iL . ..I.L. . Л.с1----L. _ . ....... . .._!.. 1.......... EP + &aga\smes peptic 2 2+K.4 228 ..... 1,,. + PM-75 75%lasert2Ref Ravu 2-u 3+Na 256 3+K 4+N« . 25,

1 j L ..jJ.ij ..I.I. 22.05. 2+Na 212 171 189 .. ...llJU_____I.Uv.JL. JLaA.Liu. ........... 09 AK PEP + 9\ame» p. 3 2+K.4 217 228 LaJtu-u..!*..-.!..... p + a RP 75% (aarURefRaw 240 3+Na 4+Na 256 3+K 25! L.....1.....L..I.........

Рис. 9. Масс-спектры смеси пептидов диглицина (1), триглицина (2), аланилглутамииа (3) и пролиллейцииа (4), нанесенные на сажи ГТС (я), ПМ-16Э (б), ПМ-75 (в) и Vulcan ХС 72R (г) в режиме положительных ионов. Таким образом, исследованные в нашей работе сажи могут применяться в

качестве матрицы для быстрого и эффективного МАЛДИ анализа

низкомолекулярных соединений — аминокислот и пептидов.

Выводы:

1. Впервые рассчитаны термодинамические характеристики адсорбции и установлены закономерности адсорбции на ГТС для широкого класса аминокислот, их димеров и ассоциатов, пептидов.

2. Установлены зависимости термодинамических характеристик адсорбции для изомеров и гомологов ряда аминокислот от положения и количества функциональных групп, от наличия заместителей в экваториальном и аксиальном положениях, внутримолекулярной водородной связи и от углов вращения карбокси- и аминогрупп в молекуле.

3. Характеристики удерживаиия аминокислот на углеродном сорбенте Гиперкарбе, определенные методом ОФ ВЭЖХ, MOiyr быть предсказаны на основе термодинамических характеристик адсорбции этих веществ на ГТС, рассчитанных молекулярно-статистическим методом.

4. Впервые в методе ПАЛДИ для анализа аминокислот и пептидов применили графитированные и неграфитированные сажи ГТС, ПМ-16Э, ПМ-75 и Vulcan ХС 72R. Установлено, что увеличение удельной поверхности саж приводит к резкому возрастанию интенсивности регистрируемых пиков протонированных молекулярных ионов и аддуктов с катионами щелочных металлов исследованных аминокислот и пептидов.

5. Предложен способ применения саж в методе ПАЛДИ, который дает возможность получать пики ионов с интенсивностью, на порядок превышающей интенсивность пиков при стандартном варианте проведения эксперимента и повышает информативность анализа за счет образования кластеров [M+Na]+ и

[м+к]+.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Молекулярно-статистический расчет термодинамических характеристик адсорбции изомерных аминокислот на графитированной термической саже. Журнал «Защита металлов». 2008. Т. 44. №3. С. 260 -266.

2. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Молекулярно-статистический расчет адсорбции пролина и его гидроксипроизводных на графитированной термической саже. Журнал «Физическая химия». 2009, том 83, № 4. С. 638 -642.

3. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Варфоломеева В.В., Буряк А.К. Влияние внутримолекулярной водородной связи на адсорбцию серосодержащих аминокислот на графитированной термической саже. Журнал «Физическая химия», 2009, том 83, № 4. С. 633-637.

4. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Исследование влияния структуры димерных молекул, образованных за счет водородных связей, на их адсорбцию на поверхности графитированной темической сажи. Журнал «Фнзикохимия Поверхности и Защита Материалов». 2009, том 45, № 4. С. 395-400.

5. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Сочетание молекулярно-статнстического и масс-спектрометрического (МАЛДИ) методов при исследовании изомерных аминокислот. Материалы 3-ей Международной конференции - школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». 16-21 апреля 2007 г. ИЭПХФ РАН. - Звенигород, 2007. С. 136.

6. Кузнецова Е.С., Буряк А.К., Ульянов А.К. Молекулярно-статистический расчет термодинамических характеристик адсорбции аминокислот на графитированной термической саже. Материалы XI Всерос. Симпозиума с участием иностр. ученых «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности». 16 — 20 апреля 2007 г. ИФХЭ РАН. - Москва-Клязьма, 2007. С. 11 (Стендовый доклад).

7. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Масс-спектрометрическое (МАЛДИ) и молекулярно-статистическое исследование изомерных аминокислот. Тезисы Всерос. Симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». 23 - 27 апреля 2007 г. ИФХЭ РАН. - Москва-Клязьма, 2007. С. 121.

8. Кузнецова Е.С., Голуб C.B., Буряк А.К. Использование метода SALDI при изучении олигомерных полиэтиленгликолей на графитированной термической саже. Материалы II Всерос. Конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 3—7 сентября 2007 г. МГУ им. М.В. Ломоносова. - Москва, 2007. ОС-23.

9. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Сочетание метода SALDI и молекулярно-статистических расчетов для анализа изомерных аминокислот на графитированной термической саже. Тезисы XIX Симпозиума «Современная химическая физика». 22.09 - 03.10 2007 г. ИХФ РАН. Туапсе, 2007. С. 169.

Ю.Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Исследование влияния межмолекулярных взаимодействий димерных молекул на их адсорбцию на поверхности графитированной термической сажи. Материалы XII Всерос. Симпозиума с участием иностранных ученых «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности». 21- 25 апреля 2008 г. ИФХЭ РАН. - Москва-Клязьма, 2008. С. 6

П.Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Молекулярно-статистические расчеты адсорбции пролина и его производных на графитированной термической саже. Тезисы Всерос. Симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». 14-18 апреля 2008 г. ИФХЭ РАН. - Москва-Клязьма, 2008. С. 54.

12. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Варфоломеева В.В., Буряк А.К. Влияние внутримолекулярной водородной связи на адсорбцию серосодержащих аминокислот на графитированной термической саже. Тезисы Всерос.

Симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». 14-18 апреля

2008 г. ИФХЭ РАН. - Москва-Клязьма, 2008. С. 57.

13. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк А.К. Образование ассоциатов аминокислот при адсорбции на поверхности графита. Всеукраинская конференция с международным участием, посвященная 90-летию Национальной академии наук Украины «Химия, физика и технология поверхности наноматериалов». 28-30 мая, 2008 г. ИХП им. О.О.Чуйко HAH Украины. - Киев, 2008. С. 181.

14. Кузнецова Е.С., Голуб C.JL, Буряк А.К. Исследование ассоциатов аминокислот с олигопептидами на поверхности графита методом инициированной матрицей лазерной десорбции/ионизации. Тезисы XX Симпозиума «Современная химическая физика». 15- 26 сентября 2008 г. Пансионат МГУ «Буревестник». Туапсе, 2008. С. 70.

15. Кузнецова Е.С. Масс-спектрометрические и молекулярно-статистические методы в исследовании димеров аминокислот. Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Физикохимия - 2008.» 11-12 ноября 2008 г. ИФХЭ РАН.-Москва. С. 55.

16. Кузнецова Е.С., Ульянов A.B., Буряк A.B. Адсорбция аминокислот и их димеров на поверхности углеродных сорбентов разного типа. Материалы XIII Всерос. Симпозиума с участием иностранных ученых «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности». 20- 24 апреля

2009 г. ИФХЭ РАН: - Москва-Клязьма, 2009. С. 35.

17. Кузнецова Е.С., Буряк A.B. Метод МАЛДИ в исследовании аминокислот и солей аминокислот с металлами на углеродных сорбентах. Материалы III Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 18-22 мая 2009 г. МГУ им. М.В. Ломоносова. - Москва, 2009. С. 75.

18. Кузнецова Е.С., Буряк А.К., Ульянов A.B. Исследование адсорбции изомерных аминокислот и пептидов на углеродных сорбентах молекулярно-статистическим и масс-спектрометрическим методами IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». 23-27 июня 2009 г. Учреждение РАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. - Казань, 2009. С. 318.

19. Кузнецова Е.С., Буряк А.К. Хроматография, масс-спекгрометрия и молекулярно-статистические расчеты адсорбции изомерных аминокислот и их производных на углеродных сорбентах Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Хроматография и ианотехнологии». 6-10 июля 2009 г. Российская Академия Наук, ИФХЭ РАН, СамГу. - Самара, 2009. С. 43.

Подписано в печать:

08.10.2009

Заказ № 2679 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.МОЛЕКУЛЯРНО-СТАТИСТИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК АДСОРБЦИИ.

1.2. УГЛЕРОДНЫЕ СОРБЕНТЫ: ПОРИСТАЯ СТРУКТУРА И ХИМИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПОВЕРХНОСТИ.

1.3. РОЛЬ ВОДОРОДНОЙ СВЯЗИ В СТРУКТУРЕ и МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ АМИНОКИСЛОТ, ОЛИГОПЕПТИДОВ И БЕЖОВ.

1.4. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ, ОЛИГОПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ.

1.4.1. ГХ (ГЖХ), ТСХ, электрофорез в исследовании аминокислот, пептидов и белков.

1.4.2. ВЭЖХанализ аминокислот, их производных и белков.

1.4.3. Пористый графитированный углерод в методе ВЭЖХ.

1.5. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ИССЛЕДОВАНИИ

АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. ИССЛЕДУЕМЫЕ ВЕЩЕСТВА.

2.2. РЕАГЕНТЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.

2.3. ИССЛЕДОВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ОФ ВЭЖХ.

2.4. МЕТОД МАЛДИ ПРИ АНАЛИЗЕ АМИНОКИСЛОТ И

ПЕПТИДОВ.

2. 5. МОЛЕКУЛЯРНО-СТАТИСТИЧЕСКИЙ РАСЧЕТ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОННОГО СТРОЕНИЯ, СТРУКТУРЫ И ВОДОРОДНОЙ СВЯЗИ АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

НА ИХ АДСОРБЦИЮ НА ПОВЕРХНОСТИ ГТС.

3.1.1. Влияние разных методов введения поправок в параметры ААП наТХА.

3.1.2. Влияние структуры изомерных аминокислот на их адсорбцию на поверхности ГТС.

3.1.3. Роль внутримолекулярной связи в адсорбции аминокислот на поверхности ГТС.

3.1.4. Влияние межмолекулярной водородной связи на адсорбцию димеров и ассоциатов аминокислот на ГТС.

3.1.5. Влияние структуры ассоциатов аминокислот с ТФУ на их адсорбцию на поверхности ГТС.

3.2. ЗАКОНОМЕРНОСТИ УДЕРЖИВАНИЯ АМИНОКИСЛОТ НА ПОРИСТОМ ГРАФИТИРОВАННОМ УГЛЕРОДЕ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ОФ ВЭЖХ.

3.3. ВЛИЯНИЕ УДЕЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ И ХИМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПОВЕРХНОСТИ УГЛЕРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ ПРИ АНАЛИЗЕ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ МАЛДИ.

3.3.1. Анализ аминокислот и пептидов в традиционном варианте проведения эксперимента методом МАЛДИ.

3.3.2. Исследование аминокислот и пептидов методом ПАЛДИ на поверхности графитированных саж (ГТС ИПМ-16Э).

3.3.3. Исследование аминокислот и пептидов методом ПАЛДИ на поверхности неграфитированных саж (ПМ-75 и Vulcan XC-72R).

3.3.4. Сравнительный анализ масс-спектрометрического поведения аминокислот и пептидов на поверхности саж.

3.3.5. Применение саж для анализа смесей аминокислот и пептидов методом ПАЛДИ.

ВЫВОДЫ.

Аминокислоты^ входят в состав пептидов* белков, а также пептидных гормонов и- антибиотиков, участвуя в регуляции всех жизненных процессов организма. Свободные аминокислоты играют- важную роль в метаболических процессах в организме человека и выполняют функцию1 биорегуляторов. Важную роль во внутри- и межмолекулярных взаимодействиях аминокислот и олигопептидов, при стабилизации белковых молекул, в общем балансе нековалентных взаимодействий ^ биохимических системах играют водородные связи.

Аминокислоты — сложный объект исследований;- так. как:они; мало-летучи; имеют в структуре кислотные и основные группы, высокополярны и обладают низкими коэффициентами поглощения в УФ области (за исключением ароматических аминокислот): В связи- с этим при проведении хроматографического анализа; этих веществч используют методы, пред- или: послеколоночной дериватизации. Вместе с тем по своему электронному и геометрическому строению производные значительно отличаются от исходных аминокислот. Кроме того, при идентификации аминокислот в различных биообъектах и определении пептидной* последовательности белков во; многих случаях оказывается необходимой информация о характеристиках удерживания свободных аминокислот.

В последнее десятилетие появился ряд работ, показывающих возможность разделения аминокислот, пептидов;, гликопептидов,. полипептидных антибиотиков методом ВЭЖХ с использованием пористого графитированного углерода Гиперкарба. Также, в настоящее время интенсивно - развиваются исследования, связанные с применением углеродных сорбентов в их различных формах как эффективных материалов для масс-спектрометрии лазерной десорбции/ионизации. Показано, что широкий спектр веществ можно анализировать при использовании в качестве матрицы таких углеродных материалов, как. графит, углеродные волокна, активированный уголь. При проведении хроматографического исследования в сочетании с методами матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ, MALDI) и поверхностно-активированной лазерной десорбции/ионизации (ПАЛДИ, SALDI) важную роль играют свойства поверхности используемого сорбента. Применение при хроматографическом разделении и масс-спектрометрическом анализе материала с одинаковым химическим состоянием поверхности позволяет минимизировать потери вещества за счет необратимой адсорбции на всех стадиях анализа.

Таким образом, актуальным является изучение теоретически (молекулярно-статистическим методом) и экспериментально (методом ВЭЖХ и масс-спектрометрией МАЛДИ) термодинамических характеристик адсорбции, хроматографического и масс-спектрометрического поведения аминокислот, их димеров и ассоциатов на углеродных сорбентах разного типа.

ВЫВОДЫ

1. Впервые рассчитаны термодинамические характеристики адсорбции и установлены закономерности адсорбции на ГТС для широкого класса аминокислот, их димеров и ассоциатов, пептидов.

2. Установлены зависимости термодинамических характеристик адсорбции для изомеров и гомологов ряда аминокислот от положения и количества функциональных групп, от наличия заместителей в экваториальном и аксиальном положениях, внутримолекулярной водородной связи и от углов вращения карбокси- и аминогрупп в молекуле.

3. Характеристики удерживания аминокислот на углеродном сорбенте Гиперкарбе, определенные методом ОФ ВЭЖХ, могут быть предсказаны на основе термодинамических характеристик адсорбции этих веществ на ГТС, рассчитанных молекулярно-статистическим методом.

4. Впервые в методе ПАЛДИ для анализа аминокислот и пептидов применили графитированные и неграфитированные сажи ГТС, ПМ-16Е, ПМ-75 и Vulcan ХС 72R. Установлена зависимость: увеличение удельной поверхности саж приводит к резкому возрастанию интенсивности регистрируемых пиков протонированных молекулярных ионов и аддуктов с катионами щелочных металлов исследованных аминокислот и пептидов.

5. Предложенный способ применения саж в методе ПАЛДИ дает возможность получать пики ионов с интенсивностью, на порядок превышающей интенсивность пиков при стандартном варианте проведения эксперимента и повышает информативность анализа за счет образования кластеров [M+Na]+ и [М+К]+.

1. Авгуль Н.Н., Киселев А.В., Пошкус Д.П. Адсорбция газов и паров на однородных поверхностях. М.: Химия. 1975. 384 с.

2. Киселев А.В. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции и хроматографии. М.: Высшая школа. 1986. 360 с.

3. Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия. 1986. 272 с.

4. Буряк А.К. Применение молекулярно-статистических' методов расчета термодинамических характеристик адсорбции при хромато-масс-спектрометрической идентификации органических соединений // Успехи химии. 2002. Т. 71. № 8. С. 788 -800.

5. Буряк А.К. Метод введения поправок в параметры атом-атомных потенциалов межмолекулярного взаимодействия, используемых для расчетов термодинамических характеристик адсорбции // Изв. АН. Сер. Химическая. 2000. № 4. С. 681-687.

6. Киселев А. В., Пошкус Д. П., Афреймович А. Я. Статистический расчет термодинамических характеристик адсорбции этана на графите с учетом внутреннего вращения молекул // ЖФХ. 1968. Т. 42. № 10. С. 2553-2555.

7. Киселев А. В., Пошкус Д. П., Афреймович А. Я. Статистический расчет термодинамических характеристик адсорбции СН4, С2Н6, СзН8 на графите. // ЖФХ. 1963. Т. 42. № 10. С. 2546-2552.

8. Kiselev A.V., Poshkus D.P. Molecular-statistical calculation of the thermodynamic characteristics of adsorption of saturated and unsaturated hydrocarbons on graphitized thermal carbon black // J.G.S. Faraday Trans. 2. 1976. V. 72. N. 5. P. 950-966.

9. Грумадас А.Ю., Пошкус Д.П. Разные формы потенциалов межмолекулярного взаимодействия атомов углерода и водорода углеводородов с атомом углерода графита // ЖФХ. 1979 Т. 53. № 9. С. 2405-2406.

10. Киселев A.B., Маркосян Д.Д. Определение параметров потенциальной функции межмолекулярного взаимодействия гидроксильной группы с атомом углерода графита из газо-хроматографических данных // Арм. Хим. ж. 1985. Т. 38. № 1.С. 29-37.

11. Gonnord М., Vidal-Madjar С., Guiochon G. Prediction of retention data in gas-solid chromatography methyl' and polymethylbenzenes and naphtalenes on graphitized carbon black// J. Chromatogr. Sci. 1974. V.12. N.12. P.839-844.

12. Vidal-Madjar C., Guiochon G., Dondi F. 1 Prediction- of retention, data* of polychlorbenzenes and naphtalenes on graphitized carbon black // J. of Chrom. 1984. V.291. N.l. P.l-12.

13. Vidal-Madjar C., Bekassy-Molnar E. Molecular statistical theory of adsorption for hydrocarbons on graphite. Effect of polarizability anisotropy in adsorption potential calculation // J. Phys. Chem. 1984. V. 88: P. 232-238.

14. Буряк A.K. Влияние расположения заместителей в изомерных хлорбензолах на их адсорбцию на графите // Изв. АН. Сер. Химическая. 1999. №4. С. 672-676.

15. Киселев А.В., Щербакова К.Д., Яшин Я.И. Определение пространственной структуры молекул методом газовой хроматографии на графитированной саже и нанесенных на нее монослоях плоских молекул // Журн. Структ. Химии. 1969. Т. 10. № 5. С. 951-968.

16. Бобылева М.З., Дементьева JI.A., Киселев А.В., Куликов Н.С. Молекулярно-статистический расчет констант Генри для адсорбцииароматических аминов на графитированной термической саже // ДАН. 1985. Т. 283. № 6. С. 1390-1393.

17. Яшкин С.Н., Григорьева О.Б., Буряк А.К. Экспериментальное и молекулярно-статистическое исследование адсорбции аминоадамантанов на графитированной термической саже // Изв. АН. Сер. хим. 2001. № 6. С. 938-943.

18. Киселев А.В., Даллакян П.Б. Сравнительное изучение адсорбции S- и Se-содержащих органических соединений на графитированной термической саже // ЖФХ. 1985. Т. 59. № 5. С. 1278-1280.

19. Пошкус Д. П., Афреймович А. Я. Молекулярно-статистический расчет удерживаемых объемов низших н-алканов на графите // ЖФХ. 1968. Т. 42. С. 1201-1205.

20. Киселев А. В.,. Пошкус Д. П, Афреймович А. Я. Статистический расчет термодинамических характеристик адсорбции н-бутана и н-пентана на графите //ЖФХ. 1970. Т. 44. С. 981-986.

21. Буряк А.К., Пошкус Д.П. Экспериментальное и молекулярно-статистическое исследование адсорбции галогенпроизводных бензола на графитированной саже // Изв.АН СССР. Сер. Химическая. 1989. № 1. С. 1216.

22. Тихонов А.Н., Гонгарский А.В., Степанов В.В., Ягола А.Г. Регуляризующие алгоритмы и априорная информация. М.: Наука. 1983. 200 с.

23. Буряк А.К., Березин Г.И. Расчет теплот адсорбции некоторых галогенметанов на графитированной термической саже // Изв.АН СССР. Сер. Химическая. 1989. № 8. С. 1721-1723.

24. Лопаткин А.А. Теоретические основы физической адсорбции. М.: Изд-воМГУ. 1982. 344 с.

25. Лопаткин А.А. Сравнение двух термодинамических подходов к описанию адсорбции на твердых поверхностях // Журн. физ. химии. 1989. Т. 63. № 9. С. 2433-2441.

26. Лопаткин А.А. Новые тенденции в термодинамике адсорбции на твердых поверхностях. В сб. Физическая химия. Современные проблемы / Под ред. ЯМ. Колотыркина. М.: Химия. 1987. С. 89-127.

27. Kiselev A.V., Lopatkin A.A., Shulga А.А. Molecular statistical calculation of gas adsorption by silicalite // Zeolites. 1985. V. 5. № 7. P. 261.

28. Безус А.Г., Вернов A.B., Киселев A.B. и др. Расчет потенциальных рельефов и термодинамических характеристик для адсорбции углеводородов цеолитами // ЖФХ. 1984. 58. 188 с.

29. Полинг Л. Обшая химия. М.: Мир. 1974. 847с.

30. Структурная химия углерода и углей. Под ред. В.И. Касаточкина. М.: Наука. 1969. 306с.

31. Фенелонов В.Б. Пористый углерод. Новосибирск: ИК СО РАН. 1995. 513с.

32. Warren В.Е. X-ray diffraction in random layer lattices // Phys Rev. 1941. V. 59. P. 693-698.

33. Marsh H., Rodriguez-Reinoso F. Activated Carbon. Elsevier Science & Technology Books. Amsterdam. 2001. 536p.

34. Marsh H., Rodriguez-Reinoso F. (Eds.). Science of Carbon Materials. Universidad de Alicante, Secretariado de Publications. Spain. 2000. 673 p.

35. Franklin R.E. The structure of graphitic carbons // Acta Crystallogr. 1951. V. 4. P. 252-261.

36. Marsh H. Carbon mesophase. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. Elsevier Science Ltd. Amsterdam. 2001. P. 926-932.

37. Donnet J.-B., Voet A. Carbon Black. Marcel Dekker Inc. N.-Y. 1976. 351 p.

38. Boehm H. Chemical identification on surface group //Adv. Catal. & Relat. Subj. 1966. V. 16. P. 179-274.

39. Тарковская И.А. Окисленный уголь. Киев: Наукова думка. 1981. 196с.

40. Taylor R. Carbon blacks: production, properties and applications. In: Introduction to Carbon Technologies. Eds. Marsh H., E.A. Heintz, F. Rodriguez-Reinoso. Universidad de Alicante. Secretariado de-Publications. 1997. P. 167210.

41. Oberlin A. High-resolution ТЕМ studies of carbonization and graphitization. In: Chemistry and Physics of Carbon. V. 2. Ed. Thrower PA. Marcel Dekker Inc. New York. 1989. P. 1-143.

42. Ларионов О.Г., Белякова Л.Д., Буряк A.K., Татаурова О.Г. Применение и перспективы использования хроматографии в физико-химических исследованиях. В кн. 100 лет хроматографии. М.: Наука. 2003. С.439-477.

43. Heinenreich R.D., Hess N.M., Ban L.L. A test objective for high-resolution electron microscopy // Appl Crystallogr. 1968. V.l. P. 1-19.

44. Щербакова К.Д., Яшин Я.И. Углеродные адсорбенты в хроматографии. В кн. 100 лет хроматографии. М.: Наука. 2003. С. 670-697.

45. Knox J.H., Kaur В. High performance Liquid chromatography. N.-Y.: Wiley. 1989. P. 189-222.

46. Pikunic J., Pellenq R.J.-M., Thomson K.T., Rouzaud J.-N., Levitz P., Gubbins K.E. Improved molecular models for porous carbons // Stud. Surfas. Catal. 2001. V. 132. P. 647-652.

47. Anderson D.J. High-performance liquid chromatography (advances in packing materials) //Anal.Chem. 1995. V.67. N.12. P. 475-486.

48. Билибров B.M. Водородная связь. Внутримолекулярные взаимодействия. Киев: Наукова думка. 1991.314 с.

49. Биологические аспекты координационной химии. Под ред. К.Б. Яцимирского. Киев: Наукова думка. 1979. 268 с.

50. Болотин С.Н., Буков Н.Н., Волынкин В.А., Панюшкин В.Т. Координационная химия природных аминокислот. М.Изд-во ЛКИ. 2007. 238 с.

51. Gu Z., Zambrano R., McDermott A. Hydrogen Bonding of Carboxyl Groups in Solid-State Amino Asid and Peptides: Comparison of Carbon Chemical Shielding, Infrared Frequencies, and Structures // J. Am. Chem. Soc. 1994. 116. P. 6368-6372.

52. Gung B.W., MacKay J.A. and Zou D. Substituent Effect on Intramolecular Hydrogen Bonding in (3-Amino Acid-Containing Polyamides // J. Org. Chem. 1999.64. P. 700-706.

53. Jeffrey G. A. and Mitra-J. Three-Center (Bifurcated) Hydrogen Bonding in the Crystal Structures of Amino Acids // J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106. 19. P. 5546-5553.

54. Wu R., McMahon Т. B. Infrared Multiple Photon Dissociation Spectra of Proline and Glycine Proton-Bound Homodimers. Evidence for Zwitterionic Structure // J. Am. Chem. Soc. 2007. 129. P. 4864-4865.

55. Rajabi K. and Frigen T.D. Structures of Aliphatic Amino Acid Proto-Bound Dimers by Infrared Multiple photon Dissociation Spectroscopy in-the 700-2000 sm"1 Region // J/ Phys. Chem. A. 2008. 112. P. 23-30.

56. Butanoate (monohydrogen succianate) Anions // J. Phys. Chem. A. 2005.109. P. 9076-9082.

57. Gordillo M.C., Lago S. A Monte Carlo Study of the Relative Stability of Protein Helical Forms // Molecular Simulation. 2003. V. 29. Issue 6 & 7. P. 437-441.

58. Carosati E., Sciabola S., and Cruciani G. Hydrogen Bonding Interactions of Covalently Bonded Fluorine Atoms: From Crystallographic Data to a New Angular Function in the GRID Force Field // J. Med. Chem. 2004. 47. P. 51145125.

59. Elmi F. and Hadipour N.L. A Study on the Intermolecular Hydrogen Bonds of a -Glycilglycine in Its Crystalline Phase Using ab Initio Calculated 14N and.2H Nuclear Quadrupole Coupling Constants J. Phys. Chem., Vol. 109, No. 8, 2005, 1729-1733.

60. Кениг JI.JI. Спектроскопия комбинированного рассеяния биологических молекул- // Успехи химии. 1975. Т.44. № 5-6. С. 1109-1166.

61. Костромина Н.А. Исследование комплексообразования< метилглицина с лантаном и лютецием методом протонного резонанса // Журн. Неорган. Химии. 1971. Т. 16. Вып. 11. С. 2966-2970;

62. Ващук А.В., Марусов М.А., Пилюк О.А., Волынкин В.А., Панюшкин В.Т. Изучение внутримолекулярной водородной связи в Р-аланине, пролине, треонине и цистеине методом ЯМР // Журн. общ. химии. 1999: Т. 69. Вып. 10. С. 1699-1701.

63. Woo Н.К., Lau К.-С., Wang Х.-В., and Wang L.-S. Observation of Cystein Thiolate and ~S"H-0 Intermolecular Hydrogen Bond // J. Phys. Chem. 2006. V.110. 46. P. 12603-12606.

64. Adalsteinsson H., Maulitz A. H., and Bruice Т. C. Calculation of the Potential Energy Surface for Intermolecular Amide Hydrogen Bonds Using Semiempirical and Ab Initio Methods // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. 33. P. 7689-7693.

65. Grabowski Sl.J., Sokalski W.A., Leszezynski J. The Possible Covalent Nature of N—H—О Hdrogen Bonds in Formamide Dimer and Related SystemsA An Ab Initio Study // J. Phys. Chem. A. 2006. V. 110. 14. P. 4772-4774.

66. Scheiner S., Kar Т., and Pattanayak J. Comparison of Various Types of Hydrogen Bonds Involving Aromatic Amino Acids // J. Am. Chem. Soc. V. 124. 44. 2002. P. 13257-13264.

67. Scheiner S. Relative Strengths of NH'O and CH О Hydrogen Bonds Between Polypeptide Chain Segments // J. Phys. Chem. B. 2005. 109. P. 16132-16141.

68. Meot-Ner (Mautner) M. The Ionic Hydrogen Bond. 4. Intramolecular and Multiple Bonds. Protanation and Complees of Amides and AMINO Acid Derivatives //J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106. 2. P. 278-283.

69. Huyghues-Despointes B.M. P. and Baldwin R.L. Ion Pair and Charged Hydrogen-Bond Interactions between Histidine and Aspartate in a Peptide Helix //J. Biochemisttry. 1997. V. 36. 8. P. 1965-1970.

70. Mandell D.J., Chorny I., Groban E.S., Wong S.E., Levine E., Rapp C.S., and Jacobson. M.P. Strengths of Hydrogen Bonds Involving Phosphorylated Amino Acids Side Chains // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. 4. P. 820-827.

71. Scheiner S., Kar Т., and Pattanayak J. Comparison of Various Types of Hydrogen Bonds Involving Aromatic Amino Acids // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. 44. P. 13257-13264.

72. Остерман JI.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. 1985. 535с.

73. Коултер Д.Р., Ханн К.С. Газовая хроматография аминокислот // В кн. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Под ред. Ю.А. Овчинникова. Пер. с англ. М.: Мир. 1974. С. 85-141.

74. Сунозова Е.Н., Трубников В.И., Сакодынский. К.И. Газовая хроматография аминокислот. М.: Наука. 1976. 83с.

75. Dallakian P., Budzikiewcz Н. Gas chromatography-chemical ionization mass spectrometry in amino acid analysis of pyoverdins // J. Chromatogr. A. 1997. 787. P. 195-203.

76. Molnar-Perl 1. and Katona Zs.F. GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl//-butyldimethylsilyl derivatives: in model solutions III. Chromatographia (suppl.). 2000. V. 51. P. 228-236.

77. Labadarios D., Moodie I. M., Burger J., Shephard G. S. Gas chromatography of amino acids: Use of a fused-silica capillary column in the determination of plasma amino acids // Journal of High Resolution Chromatography. 1986. V. 9. Issue 10. P. 555-560.

78. Дегтярев E.B., Тяглов Б.В., Красиков В.Д., Малахова И.И., Гаевский А.В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе биологически активных веществ. В кн. 100 лет хроматографии. Ред. Б.А. Руденко. М.: Наука. 2003. С. 233-268.

79. Cserhati Т. Chromatography of amino acids and short peptides // Biomedical Chromatography. 2007. V. 21. Issue 8. P. 780-796.

80. Wawrzycki S. and. Руга E. Detection, separation and analysis of a-amino acids by means of TLC using by 4-diethylaminoazabenzene-4'-isothiocyanate (DEABITC) // Chromatographia (suppl.). 2000: V. 51. P. 309-312.

81. Nabi S.A. and Khan M.A. Selective TLC separation of lysine and threonine in pharmaceutical preparations // Acta Chromatographica. 2003. V. 13. P. 161-171.

82. Hess B.and Sherma J. Quantication of arginine in dietary supplement tablets and capsules by silica gel high performance thin-layer chromatography with visible mode densitometry // Acta Chromatographica. 2004. V. 14. P. 60-69.

83. Cox J.R. Concepts in biochemistry: teaching noncovalent interactions in biochemistry curriculum through molecular visalization: the search for p-interactions // Journal of Chemical'Education. 2000. V. 77. P. 1424-1428.

84. Tanahashi H. and Tabira T. Alzheimer's disease-associated presenilin 2 interacts with DRAL, and LIM domain protein // Human Molecula Genetics. 2000. V. 9. P. 2281-2289.

85. Cserhati T. and Forgacs E. Binding of amino acids and peptides to bovine serum albumin studied by charge transfer chromatography // International Journal of

86. Bio Chromatography. 2000. V. 5. P. 11-16.

87. Devult G.L., Sepaniak M.J. Two-Dimensional Capillary Electrophoresis-Thin Layer Chromatography Separations of Amino Acid Enantiomers Using Electro-Filament Transfer // J. Microcolumn Separation. 2000. V. 12. 7. P. 419-428.

88. Даванков B.A. Лигандообменная хроматография прорыв в области энантиоселективных технологий. В кн. 100 лет хроматографии. Ред. Б.А. Руденко. М.: Наука. 2003. С. 212- 232.

89. Mistry К., Griberg N. Separation of peptides and proteins by capillary electrochromatography // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2005. V. 27. Issui 7-9. P. 1179-1202.

90. Bhushan R., Ali 1. and Shalini S. A Comparative Study of HPLC and TLC Separation of Amino Acids Using Си (II) Ion // Biomedical chromatography. 1996. V. 10. P. 37-39.

91. Qu Y., Slocum R.H., Fu J., Rasmussen W.E., Rector H.D., Miller J.B. and Coldwell J.G. Qantitative amino acid analysis using a Beckman system Gold HPLC 126AA analyzer // Clinica Chimica Acta. 2001. V. 312. P. 153-162.

92. Хеншен А., Хупе К.П., Лотшпах Ф., Велтер В. ВЭЖХ в биохимии. М.: Мир, 1988. 688с.

93. Aoyama C., Santa Т., Tsunoda M., Fukushima Т., Kitada C. and Imai K. A fully automated amino acid analyser using NBD-F as a fluorescent derivatization agent// Biomedical Chromatography. 2004. V. 18. P. 630-636.

94. Golden K.D., Williams O.J. and Bailey-Shaw Y. High-performance liquid chromatographic analysis of amino acids in fruit with emphasis on the toxic amino acid hypoglycine A // Journal of Chromatographic Science. 2002. V. 40.1. P. 441- 446.

95. Boros В., Kovacs K. and Ohmacht R. Fast separation of amino acid phenylhydantoin derivatives by HPLC on a non-porous stationary phase // Chromatographia (suppl.). 2000. V. 51. P. 202-204.

96. Gioia M.G., Gatti R., Vannini M. and Hudaib M. 4,7-Phenantroline-5,6-dione: a new labelling reagent for liquid chromatographic analysis of amino acids // Chromatographia. 2002. V. 56. P. 289-294.

97. Краснова И.Н., Черкас Ю.В., Денисенко T.B., Карпова JI.A. Количественный анализ аминокислот в сыворотке крови методом изократической- обращенно-фазовой ВЭЖХ // Журн. Клиническая лабораторная диагностика. 1999. 7. С. 11-14.

98. Hvass A., and Skelbaek-Pedersen В: Determination of protamine peptides in insulin drug products using reversed phase high performance liquid chromatography // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005. V. 37. P. 551-557.

99. Kamysz W., Okroj M., Lempicka E., Ossowski T. and Lukasiak J. Fast and ef.cient puri.cation of synthetic: peptides by solid-phase extraction // Acta Chromatographica. 2004. V. 14. Pf 180-186.

100. Yoshida Т., Okada Т., Hobo T. and Chiba R. Calculation. of amino acid hydrophobicity indices for retention of peptides on amide, diol and silica columns in normal-phase liquid chromatography // Chromatographia. 2000. V. 52. P. 418-424.

101. Shibue M., Mant C.T. and Hodges R.S. Effect of anionic ion-pairing reagent concentration (1-60 mM) on reversed-phase liquid chromatography elutionbehavior of peptides // Journal of Chromatography. A. 2005b. V. 1080. P. 5867.

102. Chen S. The HPLC enantioresolution of phenyl isothiocyanated amino acids on vancomycin bonded phase using the acetonitrile-based mobile phase: a comparison to the teicoplanin phase // Journal of Chinese Chemical Society. 2003b. V. 50. P. 1177-1181.

103. Азарова H.H., Кучкина А.Ю., Барам Г.И., Гольберг E.JT. Предсказание объемов удерживания пептидов в градиентной обращенно-фазовой ВЭЖХ // Журн. Биоорганическая химия. 2008. Т. 43. 2. С. 171-176.

104. Mendol S., Faustinol N.A., Sarmentol А.С., Amado F., Moir A.J.G. Purification and characterization of a new peptide antibiotic produced by a thermo tolerant Bacillus licheniformis strain // Biotechnology Letters. 2004. V. 26, P. 115-119.

105. Grande C., Falcon M.S.G., Perez-Lamela C., Cornesana M.R., Gandara J;S. Quantitative Analysis of Colistin and Tiamulin* in Liquid and Solid Medicated Premixes by HPLC with Diode-Array Detection // Chromatographia. 2001. V. 53. Suppl. P. 460-463.

106. Chaimbault P., Petritis K., Elfakir C., Dreux M. Ion-pair chromatography on a porous graphitic carbon stationary phase for the analysis of twenty underivatized protein amino acids // Journal of Chromatography A. 2000. V. 870. Issues 1-2. P. 245-254.

107. Nemeth-Kiss V., Forgacs E., Cserhati T. Anomalous retention behavior of peptides on porous graphitized carbon column // J. Chromatogr. A 1997. V. 776. P. 147- 152.

108. Ross P. and Knox J. H. Carbon-Based Packing Materials for Liquid Chromatography, Applications // In Advances in Chromatography. V. 37., Marcel Dekker, Inc., New York. 1997. P. 120.

109. Barrett D. A., Pawula M., Knaggs R.D., Shaw P. N. Retention Behavior of Morphine and its Metabolites on a Porous Graphitic Carbon Column // Chromatographia. 1998. V. 47. 11/12. P. 667-672.

110. Orwa J.A., Van Gerven A., Roets E., Hoogmartens J. Development and Validation of a Liquid Chromatography Method for Analysis of Colistin Sulphate // Chromatographia. 2000. V. 51. 7/8, P. 433-436:

111. Csiktusnadi-Kiss G.A., Sagi G., Tegyei Z. Hypercarb — Effect of chemical structure on the chromatographic retention characteristics // Chemia-Analityca. 1999. V. 44. 5. P. 795-804.

112. Anderson D.J. High-performance liquid chromatography (advances in packing materials) // Anal. Chem. 1995. V. 67. 12. P. 475-486.

113. Forgacs E. Retention characteristics and practical applications of carbon sorbents // J. of Chromatography A. .2002. V. 975. Issue 2. 1. P. 229-243.

114. Echols K.R., Gale R.W., Feltz K., Olaughlin J., Tillitt D.E., Schwartz T.R. Hypercarb Loading capacity and chromatographic behavior // J. of Chromatography A. 1998. V. 811 (1-2). P. 135-144.

115. Ayrton J., Evans M.B., Harris A.J. and Plumb R.S. Porous graphitic carbon shows promise for the rapid chromatographic analysis of polar drug metabolites // J: of Chromatography B. 1995. V. 667. Issue 1. P. 173-178.

116. Koivisto P., Stefansson M. Retention Studies of Sulphated Glycosaminoglycan Disaccharides on Porous Graphitic Carbon Capillary Columns // Chromatographia. 2003. V. 57. P. 37-45.

117. Nazir F.T., Gould L.A., Marriott C., Martin G.E., Brown M.B. High Performance Liquid Chromatography of a Cyclosporin A Formulation on a Porous Graphitic Carbon Column // Chromatographia. 1997. V. 46. 11/12. P. 628-636.

118. Бейнон Дж. Масс-спектрометрия и ее применение в органической химии. М.: Мир. 1964:

119. Вульфсон Н.С., Заикин В.Г., Микая А.И. Масс-спектрометрия органических соединений. М.: Химия, 1986.

120. Michael Т. Bowers, Alan G. Marshall, and Fred W. McLafferty. Mass Spectrometry: Recent Advances and Future Directions // J. Phys. Chem. 1996. 100 (31). P. 12897-12910.

121. Заикин В.Г., Варламов A.B., Микая А.И. Основы масс-спектрометрии органических соединений. М.: МАИК "Наука/Интерпериодика". 2001.г

122. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2003.

123. Neubauer G., and Anderegg R. J. Identifying Charge States of Peptides in Liquid Chromatography/Electrospray Ionization Mass Spectrometry // Anal. Chem., V. 66 (7), 1994, P. 1056-1061

124. Chen Yu-Chie. In Situ Determination of Organic Reaction Products by Combining Thin Layer Chromatography with Surface-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry //Rapid Commun. Mass Spectrom. 13. 1999. P. 821-825.

125. Wan E. Chun-hong, Ho CL, Wai-mei Sin D., Wong Yiu-Chung. Detection of residual bacitracin A, colistin A, and colistin В in milk and animal tissues byliquid chromatography tandem mass spectrometry // Anal Bioanal. Chem., 2006, Vol. 385. P.181-188.

126. Strupat K., Kampmeier J., Horneffer V. Investigations of 2,5-DHB and succinic acid as matrices for UV and IR MALDI. // Intern. J. of Mass Spectroscopy and ion Processes. 1997.169-179. P.43-50.

127. Allwood D. A., Dreyfus R. W., Perera I. K. Optical absorption of matrix compounds for laser-inducted desorption and ionization (MALDI). // Applied Surface Science. 1997.109/110. P. 154-157.

128. Meier M. A. R., Adams N., and Schubert Ul. S. Statistical approach to understand maldi-tofms matrices: discovery and evaluation of new maldi matrices. // Anal. Chem. 2007. 79. P. 863-869.

129. Hillenkamp F. and Peter-Katalinicr J. MALDI MS A Practical Guide to Instrumentation, Methods and Applications. 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. 346 p.

130. Sunner J., Dratz E., and Chen Yu-Chie. Graphite surface-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of peptides and proteins from liquid solutions. // Anal. Chem. 1995. 67. № 23. P. 4335-4342.

131. Wei S., Buriak J. M. and Siuzdak G. Desorption-ionization mass spectrometry on porous silicon. // Letters to nature. 1999. 399. P. 243-246.

132. Budimir N., Blais J.-Cl., Fournier F. and Tabet J.-Cl. The use of desorption/ionization on porous silicon mass spectrometry for the detection of negative ions for fatty acids // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006. 20. P. 680-684.

133. Dale M. J., Knochenmuss R., and Zenobi R. Graphite/Liquid Mixed Matrices for Laser Desorption/ionization Mass spectrometry. // J. Anal. Chem. 1996. 68. № 19 P. 3321-3329.

134. Chen Y., Chen H., Aleksandrov A., and Orlando Т. M. Roles of Water, Acidity, and Surface Morphology in Surface-Assisted Laser desorption/Ionization of Amino Acids. // J. Phys. Chem. C. 2008. 112. № 17. P. 6953-6960.

135. Dally J.E., Gornian J. Quantitation of Underivatized Free Amino Acids in Mammalian Cell Culture Media Using Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. // Anal. Chem. 2003. 75. № 19. P. 5046-5053.

136. Woods A.S., and Huestis M. A. A Study of Peptide-Peptide Interaction by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001. 12. P. 88-96.

137. Cohen L.H., Gusev A. I. Small molecule analysis by MALDI mass spectrometry. //Anal. Bioanal. Chem. 2002. 373. P. 571-586.

138. Beavis R.C. and Chait B.T. High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry // Anal. Chem. 1990. 62. P. 1836-1840.

139. Karas M., and Kriiger R. Ion Formation in MALDI: The Cluster Ionization Mechanism. // Chem. Rev. 2003. 103. № 2, P. 427-439.

140. Dreisewerd K. The Desorption Process in MALDI. // Chem. Rev. 2003. 103. № 2. P. 395-425.

141. Gliickmann M., Pfenniger A. at all. Mechanisms in MALDI analysis: surface interaction or incorporation of analytes? // International Journal of Mass Spectrometry. 2001. 210/211. 2001. P. 121-132.

142. Xu S., Li Y. Carbon Nanotubes as Assisted Matrix for Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry // Anal. Chem. 2003. 75, №22. P. 6191-6195.

143. Pan С., Xu S., Zou H., Guo Z., Zhang Yu, and Guo B. Carbon Nanotubes as Adsorbent of Solid-Phase Extraction and Matrix For Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005. 16. P. 263-270.

144. Pan C., Xu S., Hu L. at all. Using Oxidized Carbon Nanotubes as Matrix for Analysis of Small Molecules by MALDI-TOF MS. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005. 16. P. 883-892.

145. Najam-ul-Haq M., Rainer M., Srabo Z., Valiant R., Huck C.W., Boun G. K. Role of carbon nano-materials in the analysis of biological materials by laser desorption/ionization-mass spectrometry. // J. Biochem. Biophys. Methods.2007. 70. P. 319-328.

146. Chen Wei-Yu, Wang L.-S., Chin H.-T., and Chen Yu-Shie. Carbon Nanotubes as Affinity Probes for Peptides and Proteins in MALDI MS Analysis. // J. Am. Soc. Mass Spectrom.2004. 15. P. 1629-1635.

147. Zhang J., Wang H.-Y., Guo Y.-L. Amino Acids Analysis by MALDI Mass Spectrometry Using Carbon Nanotube as Matrix. // Journal of Cmemistry. 2005. 23. P. 185-189.

148. Gimon-Kiusel H., Preston-Schaffter L. M., Kinsel G. R., Russell D. H. Effects of Matrix Structure/Acidity on Ion Formation in Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. // J. Am. Chem. Soc. 1997. 119. № 10. P. 2534-2540.

149. Якубке Х.Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки; М.: Мир; 1985. — 456 с.

150. Крейчи М., Паюрек Я., Комерс Р. Вычисления и величины в сорбционной колоночной хроматографии. М.: Мир, 1993. 208 с.

151. Иоффе Б.В. Рефрактрометрические методы химии. JL: Химия. 1974. С. 400.

152. Краткий справочник физико-химических величин / Под ред. Равделя А.А., Пономаревой A.M. С.-П.: Специальная литература. 1999. 232с.

153. Зефиров Ю.В., Зоркий П.М. Новые применения ван-дер-ваальсовых радиусов в химии // Успехи химии. 1995. Т.64. 5. С. 446-449.

154. Гурская Г.В. Структура аминокислот. М.: Наука. 1966. С. 158.

155. Кузнецова Е.С., Ульянов А.В., Буряк А.К. Молекулярно-статистический расчет термодинамических характеристик адсорбции изомерных аминокислот на графитированной термической саже // Защита металлов. 2008. Т. 44. № 3. С. 260 266.

156. Rodrigues V. Н., Paixao J. A., Costa М. М. R. R.and Beja A.M. Glyciniunr trifluoroacetate // Acta Cristallographica Section C. 2002. 58. P. 658-660.20.

157. Белякова Л.Д., Буряк A.K., Ларионов О.Г. Применение хроматографии в физико-химических исследованиях // В сб. Современные проблемы физической химии. М.: Издательский дом «Граница», 2005. С. 264.

158. Яшкин С.Н., Курбатова С.В., Петрова Е.И., Буряк А.К. Адсорбция изомерных адамантанолов на графитированной термической саже // Изв. АН, Сер. хим. 2001. №>5. С. 787-791.

159. Кузнецова Е.С., Ульянов А.В., Варфоломеева В.В., Буряк А.К. Влияние внутримолекулярной водородной связи. на адсорбцию серосодержащих аминокислот на графитированной термической саже. Журнал «Физическая химия», 2009, том 83, № 4. С. 633-637.

160. Варфоломеева В.В., Терентьев А.В., Буряк А.К. Влияние внутримолекулярной водородной связи на адсорбционные свойства ароматических спиртов и тиолов // Журн. физ. хим. 2008. Т. 82. № 6. С. 1033-1038.

161. Кузнецова Е.С., Ульянов А.В., Буряк А.К. Молекулярно-статистические расчеты адсорбции пролина и его гидроксипроизводных на графитированной термической саже // Журнал Физической химии. 2009. Т. 83. №4. С. 638-642.

162. HPLC Analysis of Biomolecules. Technical Guide // Thermo Electron Corporation. 2004. 47 P.