автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Хроматографические методы в исследовании биологически активных веществ растительных материалов

На правах рукописи

ДЕЙНЕКА ВИКТОР ИВАНОВИЧ

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ИССЛЕДОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РАСТИТЕЛЬНЫХ

МАТЕРИАЛОВ

0034448Э5

Специальность 05.11.11 - хроматография и хроматографические приборы

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

2 4 ИЮЛ 2008

Белгород 2008 г

003444895

Работа выполнена в Белгородском государственном университете

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Ланин Сергей Николаевич МГУ им МВ Ломоносова

доктор химических наук, профессор Карцева Людмила Алексеевна Санкт-Петербургский Государственный университет

доктор химических наук, профессор Курбатова Светлана Викторовна

Самарский Государственный университет

Ведущая организация

Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук

Защита состоится « Д,9» июля 2008 года в 15 час 00 мин

на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.259.04 при Институте физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина Российской академии наук по адресу 119991, г Москва, Ленинский пр-т, д 31, корп 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии и электрохимии им. А Н Фрумкина Российской академии наук

Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии в сети Интернет.

Автореферат разослан « » мая 2008 года

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

кандидат химических наук

Л Н. Коломиец

Общая характеристика работы Актуальность. Биологически активные вещества (БАВ) растительного к животного происхождения в последнее время вызывают возрастающий интерес по нескольким причинам. Как природные продукты, используемые человечеством на протяжении всего времени его существования, они не таяг неопределенности в последействии Это - одно из важнейших различий между ними и синтетическими продуктами Быстрая индустриализация общества за последние сто лет привела к коренным изменениям в рационе питания, приведшим к нехватке важнейших нутриентов, что не могло не отразиться на здоровье населения Одним из важнейших источников БАВ являются различные части растений - от плодов до корней. Исследованиям в данном направлении посвящается заметная доля научных работ во всем мире, издается более десятка специализированных журналов, ежегодно проводится большое число симпозиумов и конференций Известно, что для нормального развития любого растения необходим определенный комплекс условий произрастания, от которых может зависеть набор накопленных в них БАВ С другой стороны исследования накопления биологически активных веществ в растительных объектах России, расположенной во многих чрезвычайно разнообразных климатических зонах, весьма ограничены При этом данные по растениям Центрально-черноземного района, наиболее благоприятного для сельхозпроизводства, практически отсутствуют Это определяет прикладной аспект актуальности настоящей работы

С другой стороны, исследование БАВ относится к достаточно сложной задаче, требующей больших материальных и временных затрат. Это связано, в частности, с тем, что БАВ накапливаются в сложном многокомпонентном комплексе, в состав которого могут входить соединения широкого спектра липофильности, обычно включающие высоко лабильные соединения Очевидно, что одним из лучших методов, которые могуг быть использованы для исследования таких объектов, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) Этот вид хроматографии в настоящее время остается одним из наиболее часто используемых при исследовании состава сложных смесей веществ Это обусловлено его универсальностью, поскольку метод может быть применен для разделения практически любых соединений (кроме высокомолекулярных) - от гидрофобных липидов (таких, как, например, триглицериды) до гидрофильных полифенолов (например, антоцианов) Важно, что метод позволяет добиваться большей воспроизводимости хроматографических параметров по сравнению с нормально-фазовой хроматографией, что позволяет проводить периодические исследования в течение длительного времени - годового цикла растений - без существенных «поправок» в методиках анализа

К настоящему времени выполнено и опубликовано огромное число работ по разделению биологически активных веществ с использованием ОФ ВЭЖХ Однако целый ряд теоретических проблем остается не решенным, включая, например, методы сопоставления данных, полученных на стационарных фазах различных производителей. Это связано с невозможностью при настоящем

3

состоянии технологии получения стационарных фаз (и хроматографических колонок), идентичных выпущенным ранее даже для одного и того же производителя Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение новых методов, пригодных для сравнения результатов, полученных в различных лабораториях мира, позволит использовать огромный банк литературных данных по удерживанию в условиях ОФ ВЭЖХ разнообразных биологически активных соединений Это обусловливает теоретический аспект актуальности работы

Цели и задачи работы. Две основные цели исследования, а) поиск и исследование источников биологически активных веществ в растениях Белгородской флоры и б) разработка корреляционных методов, позволяющих обоснованно анализировать изменение удерживания сорбатов при варьировании хроматографических условий или строения сорбатов Основные задачи исследования: В области поиска БАВ в Белгородской флоре

• поиск источников растительных масел, содержащих (в составе триглицеридов) эссенциальные жирные кислоты, кислоты с конъюгированными двойными связями,

• поиск источников ксантофиллов лютеина, зеаксантина, астаксантина и др.,'

• поиск источников антоцианов и некоторых других фенольных соединений

В области разработки хроматографических методов'

• разработка, обоснование и экспериментальное подтверждение основных положений метода относительного анализа удерживания (метод ОАУ) и основанных на этом методе новых аспектов инкрементного подхода для идентификации и предсказания строения компонентов сложных смесей,

• разработка обобщенных методов анализа и сопоставления свойств хроматографических систем, включая анализ механизмов удерживания в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ;

• практическое применение разработанных методов к исследованию хроматографического поведения и к идентификации компонентов смесей гидрофобных (триглицеридов и каротиноидов) и гидрофильных (антоцианов) сорбатов в экстрактах растительных материалов,

• моделирование хроматографических процессов по методу «теоретических тарелок» с целью установления особенностей применения инкрементного подхода при работе в условиях градиентного элюирования, а также для уточнения методов расчета эффективности систем с идеальными и асимметричными хроматографическими пиками

Научная новизна. В работе впервые получены данные о накоплении ряда биологически активных соединений в большом числе объектов Белгородской флоры, включающие

• данные о видовом составе триглицеридов более 200 масел семян растений семейств Caprifoltaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Lamíales, Pmacea, Ranunculaceae, Rosaceae, Umbelliferae, и др,

• имеющие технологическое значение данные о накоплении диэфиров ксантофиллов в лепестках цветков бархатцев различных сортов, в плодах физалиса декоративного и в плодах ряда других растений,

• данные о качественном составе и количественном уровне накопления антоцианов в плодах нескольких десятков видов и сортов плодов и цветков растений Белгородской флоры.

Разработан и обоснован новый подход к исследованию удерживания веществ в ОФ ВЭЖХ - метод относительного анализа удерживания (ОАУ), применимый для любых подвижных и стационарных фаз С использованием данного метода

• сокращено до минимума (до данных в двух составах подвижных фаз) время, необходимое для построения карты сорбатов сложных смесей в полном диапазоне составов подвижных фаз, показана возможность первичной классификации сорбатов по их строению;

• обосновано сопоставление хроматографических систем, нахождение общих свойств и различий, показана возможность переноса аналитического вида соотношения относительного удерживания малополярных сорбатов с одних хроматографических систем на другие системы, включающие стационарные фазы аналогичного типа других производителей, но при условии использования подвижных фаз одной и той же элюентной системы

• предложен метод определения и учета активности остаточных силанольных групп на удерживание полярных сорбатов, показана возможность нивелирования этих взаимодействий выбором полярного сорбата сравнения

На основе метода ОАУ обоснованы новые аспекты применения инкрементного подхода

• При анализе инкрементных соотношений для хроматографического поведения пары сорбатов в соответствие с данным подходом найдено, что при отсутствии таутомерных равновесий или иных изменений в строении веществ (при варьировании состава подвижной фазы) между инкрементом и удерживанием сорбата сравнения существует линейная взаимосвязь

о Экспериментально показаны и теоретически обоснованы особенности инкрементых соотношений внутри гомологических рядов, с использованием различия координат точек конвергенции для различных гомологических рядов объяснены особенности инкрементных соотношений для псевдогомологов, - групп веществ с одинаковым последовательным изменением структуры, не являющихся гомологами

• Теоретически предсказано и экспериментально подтверждено то, что при отсутствии внутримолекулярных взаимодействий справедлива линейность межинкрементных соотношений, позволяющая переносить закономерности, полученные для исследования троек производных одного базисного соединения, на аналогичные тройки производных другого базисного соединения.

Предложен новый подход к оценке механизмов удерживания сорбатов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ, основанный на сопоставлении удерживания сорбатов в идентичных условиях (по составу подвижной фазы и температуре), но на стационарных фазах с различной длиной привитых углеводородных радикалов.

Предложен и экспериментально подтвержден новый подход к использованию и оценке логарифма коэффициента распределения вещества между 1-октанолом и водой (lgP или LOGP) с использованием данных обращенно-фазовой ВЭЖХ, который может служить первой экспертной системой для оценки надежности программных продуктов, предназначенных для расчета LOGP,

Использование в работе компьютерного моделирования по методу «теоретических тарелок», позволило показать, что при оценке инкрементных соотношений вместо логарифма фактора удерживания сорбатов может быть использовано время удерживания сорбатов в специальных выбранных градиентах по составу подвижной фазы Предложены уточненные уравнения для расчета эффективности хроматографических систем в условиях ВЭЖХ и новый метод исследования уширения пиков, выявляющий особенности хроматографического поведения некоторых сорбатов при изменении составов подвижных фаз

Практическая значимость. В практическом приложении метода ОАУ к исследованию хроматографического поведения ряда биологически активных веществ показано, что во-первых, прекрасно соблюдаются основные закономерности относительного удерживания Разработанные методы позволили провести поиск и обнаружить богатые источники биологически активных веществ в растениях Белгородской флоры:

• масел семян растений, содержащих в том числе и радикалы конъюгированных жирных кислот, обладающие (в отличие от традиционных эссенциальных кислот) ярко выраженной антиканцерогенной активностью и способностью регулировать жировой обмен,

• антоцианов в плодах целого ряда растений, включая редко культивируемые смородину золотистую и смородину американскую При этом установлено, что существуют важные особенности технологии изготовления готовых форм (не всегда учитываемые при, например, производстве препаратов на основе черники), приводящие к значительным потерям антоцианов, предложены новые варианты технологий, сохраняющие эти вещества,

• каротиноидов (в том числе ксантофиллов), которые могут быть использованы в пищевом дизайне Это позволило создать отечественную кормовую добавку для обогащения ксантофиллами желтка куриных яиц (разработка отмечена серебряной медалью на VIII Московском международном салоне инноваций и инвестиций, Москва, 2008 г.)

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты определения биологически активных веществ в растениях Белгородской флоры.

2 Метод относительного анализа удерживания (метод ОАУ) сорбатов как альтернатива известным методам исследования удерживания сложных смесей сорбатов, включая

• экстра термодинамическое обоснование метода, основанного на линейности соотношений свободных энергий;

• способ построения и анализа карты разделения.

3. Методы использования ОАУ в анализе параметров прямолинейных зависимостей- относительного удерживания пар веществ, инкрементных зависимостей пар веществ, межинкрементных соотношений троек веществ

4 Метод использования ОАУ для сопоставления свойств различных хроматографических систем, включая гидрофобные характеристики стационарных фаз и активность остаточных силанольных групп (принципиально может быть использован для сопоставления любых иных свойств систем)

5 Новый метод, основанный на сопоставлении удерживания специально выбранных сорбатов в идентичных условиях (по составу подвижной фазы и температуре), но на стационарных фазах с различной длиной привитых углеводородных радикалов и различными характеристиками исходных силпкагелевых матриц, для определения механизмов удерживания сорбатов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ

6 Способ использования ОАУ для учета или расчета логарифма коэффициента распределения вещества между 1-октанолом и водой в обращенно-фазовой ВЭЖХ в рамках карты разделения с добавлением новой точки, координаты которой определяются соответствующим значениям !аР. Этот подход является единственной к настоящему времени экспертной системой для анализа расчетных значений С1о§Р

7 Результаты компьютерного моделирования хроматографических процессов по варианту «теоретических тарелок», включающие, новый подход к оценке уширения хроматографических пиков, новое эмпирическое уравнение для расчета эффективности хроматографических систем в условиях нелинейных изотерм сорбции

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 22 Всероссийских и международных конференциях и симпозиумах Основные результаты изложены более чем в 100 статьях в научных журналах, из них 60 -в журналах из списка ВАК

Структура и объсг.г диссертации. Диссертация состоит из Введения, восьми глав, заключения и Приложения Объем работы составляет 318 страниц, в том числе- 147 рисунков, 49 таблиц и список литературы из 248 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Биологически активные вещества Белгородской флоры

Растительные масла. Постоянный интерес к поиску новых источников растительных масел, входящих в число важнейших продуктов питания, объясняется несколькими причинами Триглицериды, составляющие основу

большинства растительных масел, важны не только как источники энергии, но и как источники эссенциальных (незаменимых) жирных кислот, используемых организмом для синтеза простагландинов Как показали многочисленные исследования, в ряде случаев важным оказывается поступление в организм и жирных кислот, не относящихся к эссенциальным (типа у-линоленовой). Особое внимание в последнее время уделяется жирным кислотам с конъюгированными двойными связями, которые обладают ярко выраженным антиканцерогенным действием и способностью нормализовать жирнокислотный обмен в организме. В результате проведенных многолетних исследований установлен жирнокислотный состав большого числа масел семян растений Белгородской флоры (из семейств- Berbendaceae, Caprifoliaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Lamíales, Pinacea, Ranunculaceae, Rosaceae, Umbelhferae, и др) а также некоторых растений, которые могут быть интродуцированы в этом регионе, например, Thladianta dubia, Momordrca charantia — прекрасные источники конъюгированных жирных кислот в дополнение к традиционным источникам такого типа кислот, таких как масло косточек вишни, черешни и черемухи, валерианы и календулы. Однако, в работе указывается, что результаты были получены хроматографическим методом после разработки новых методов обработки данных, изложенных в теоретических главах представленной работы.

Исследования также показали, что метод ОФ ВЭЖХ для исследования триглицеридного состава масел имеет ряд преимуществ перед официальным методом, включающим превращение триглицеридов в метиловые эфиры жирных кислот с их последующим определением методом газовой хроматографии. Показано, что не всегда такая пробоподготовка не затрагивает собственно жирные кислоты, особенно в случае высоко лабильных конъюгированных жирных кислот Показано также, что официальный метод не учитывает специфичность распределения жирных кислот по радикалам, поэтому не чувствителен к целому ряду фальсификаций Кроме того, как было установлено в процессе 5-ти летних исследований масел, хроматографический профиль масел (число пиков, их относительное расположение на хроматограмме и соотношение высот или площадей) лишь незначительно изменяется при изменении хроматографических условий Это позволяет ввести в практику исследований метод «отпечатков пальцев» в варианте ОФ ВЭЖХ.

Так по методу отпечатков пальцев можно утверждать, что в подсолнечных маслах, хроматограммы которых представлены на рис 1.1, нет добавок оливкового масла, а различия в профилях связаны с использованием различных сортов подсолнечника, в массе семян одного из которых накапливается повышенное количество радикалов олеиновой кислоты При этом официальный метод анализа не позволит отклонить версию о добавках в подсолнечное масло оливкового. На рис 1.2 приведены хроматограммы типичного коровьего масла, профиль которого практически не зависит от страны производителя, и пальмового масла При этом очевидно, что фальсификат сливочного масла, для которого также приведена хроматограмма, является лишь немногим модифицированным пальмовым маслом Следует 8

отметить, что такая фальсификации ие таит угрозы здоровью, поскольку замена маргарина абсолютно безвредным пальмовым маслом является общемировой тенденцией последних лет.

Наконец, простой анализ хроматографического профиля шести масел под названием «облепиховые», приобретенных в аптеках г. Белгорода, который выполняется по присутствию или отсутствию специфичных для этого объекта триглицеридов, показал, что три из этих масел не имеют отношения к Нгрроркаё гкатпо1с1е5, а являются раствором ¡3-каротияа в подсолнечном масле.

Рис. 1.1. Хроматограммы подсолнечного Рис. 1.2. Хроматограммы некоторых масел и

Сорта масел: 1 - Урожай солнца; 2 - Идеал; 3 - А - сливочное масло; Б - фальсификат сливочного

Слобода; 4 - Алтеро; 5 - Риф. Колонка 250x4 мм; масла; В - пальмовое масло. Колонка 250x4 мм;

Диасфер-110-С18, 5 мкм; элюент 100% ацетон, Диасфер-110-С18, 5 мкм, 10 об. % ацетонитрила в

скорость подачи элюента 1 мл/мин; детектор 401. ацетоне; 1 мл мин, детектор М 401.

Антоцианы. Этот класс соединений был выбран по двум причинам.

Во-первых, антоцианы во всем мире рассматриваются в настоящее время как потенциальные колоранты для пищевой и медицинской промышленности. Они, как показали многочисленные исследования последних лет, обладают высокой и разнообразной биологической активностью - от антиоксидантной до антиканцерогенной. Доклад ВВС Великобритании1 времен Второй мировой войны, в котором сообщалось о положительном влиянии черничного варенья на адаптацию зрительного аппарата к низкой освещенности ночного пространства во время традиционных ночных бомбардировок территории Германии, в конечном итоге привел к появлению на прилавках аптек большого числа препаратов на основе черники. Обнаружение так называемого «французского парадокса»2 - снижения вероятности заболеваний сердечно-сосудистой системы при культуре регулярного умеренного потребления сухого красного вина (как богатого источника именно антоцианов) усилило интерес исследователей к антоцианам. В то же время, несмотря на очевидную ограниченность в производстве винограда для регионов России, Белгородский регион позволяет культивировать альтернативные растения с интенсивной черно-красной окраской, являющейся признаком накопления этих соединений.

масла различных марок

фальсификата

' Muiii Е.К., Laurent Ш, Jasper P. И Altera. Med. Rev. 2000. v.5. P. 164-169

2 Renaud S„ Delorgeril M. // Lancet i. 1992. P. 1523-1526

Во-вторых, антоцианы интересны как объекты для хроматографии как высокополярные соединения, присутствующие, как правило, также в виде комплексов различной сложности Различие строения антоцианов может быть связанным как с изменением строения агликонов, так и с изменением состава гликозидных радикалов, с числом и положением гликозилирования.

Результаты исследований источников антоцианов среди растений Белгородской флоры, выполненные спекгрофотометрическим методом и методами ОФ ВЭЖХ после разработки новой технологии анализа хроматографических данных, приведены в табл 1 1

Таблица 1.1 - Антоцианы плодов растений, выращенных в Белгороде

№ Плоды растения Основные антоцианы а*, мг/100 г

1 Amelanchier ovalia Cy-3-Gala, Cy-3-Ara, Cy-3-Glu 150-200

2 Aroma melanocarpa Cy-3-Gala, Cy-3-Ara, Cy-3-Glu 500-600

3 Berberís vulgaris Pg-3-Glu, Cy-3-Glu 20-30

4 Cerasus vulgaris (кожура) Cy-3-201"Rut, Cy-3-Rut, Cy-3-Sopho .

5 Cerasus avium Cy-3-Rut, Cy-3-Glu 200-250

6 Fragaria ananassa Pg-3-Sopho, Cy-3-Glu 20-25

7 Lonicera caerulea (суш) Cy-3-Glu, Cy-3-Rut 750-950

8 Mahoma aquifolio (Dp, Су, Pt, Pn и Mv)-3-Glu и -3-Rut 160-400

9 Malus domestica (кожура) Cy-3-Gala -

10 Morua alba (черноплодя ) Cy-3-Glu, Cy-3-Rut 120-150

11 Prunus domestica (кожура) Cy-3-Rut, Cy-3-Glu, Pn-3-Rut. Pn-3-Glu 600-800

12 Ribes nigrum Dp-3-Rut, Cy-3-Rut, Dp-3-Glu, Cy-3-Glu 150-300

13 Я nigrum (суш кожура) 900-1600

14 Л americanum Cy-3-Rut, Cy-3-Glu, Dp-3-Rut, Dp-3-Glu 280-600

15 R americanum (суш кожура) Cy-3-Rut, Cy-3-Glu, Dp-3-Rat, Dp-3-Giu 3500-5500

16 R rubrum (разл гибриды) Cy-3-K,laRut, Cy-3-Rut, Cy-3-2XylRut 20-280

17 R aurevm Cy-3-Rut, Cy-3-Giu -

18 Rubus idaeus Cy-3-Glu 20-30

19 R nessensis Cy-3-Rut 80-100

20 Sambucus nigrum Cy-3-Sam, Cy-3-Glu 620-840

21 S canadensis Cy-3-(Cmn)Sam-5-Glu 750-860

22 Solanum nigrum Pr-3-(Cum)Rut-5-Glu 200-300

23 Viburnum opulus Cy-3-(Ara)Glu, Cy-3-Glu, Cy-3-Rut 22-29

*- в пересчете на цианадина-3-глюкозид

Прекрасным источником антоцианов является широко распространенная в Белгородской области смородина черная, плоды растения окрашены благодаря 3-рутинозидам и 3-гликозидам цианидина и дельфинидина Важно, что в плодах большинства сортов антоцианы сосредоточены в кожуре плодов, что позволяет разрабатывать технологии комплексной переработки плодов этого растения, поскольку из отделенных семян можно извлекать ценное жирное масло, в состав которого входит довольно редкая в растительном мире, но важная в биологическом отношении эссенциальная у-линоленовая кислота В плодах смородины американской, выращиваемой в Ботаническом саду БелГУ, содержание антоцианов почти вдвое выше, чем в R nigrum Даже превосходят черную смородину по содержанию антоцианов плоды аронии черноплодной и, особенно, бузины обыкновенной и американской А паслен 10

садовый, накапливающий большое количество адилированных производных петунидина, позволяет даже машинный сбор готовой продукции

Каротиноиды. Из этого класса соединений до недавнего времени особым вниманием пользовался только Р-каротин Но в настоящее время пристальное внимание уделяется некоторым ксантофиллам - лютеину и зеаксантину, нехватка которых отвечает за возрастную потерю зрения; а также астаксантину Каротиноиды представляют особый интерес для хроматографических исследований как соединения, в которых возможно варьирование структуры двух концевых групп при большом разнообразии их строения и практически исключенном внутримолекулярном взаимодействии.

Итогом исследований по поиску источников указанных ксантофиллов стал выбор наилучших сортов бархатцев и Physalis alkekengi для создания кормовой добавки (совместно со специалистами медицинского факультета), сбалансированной по соотношению лютеин - зеаксантин Эта кормовая добавка предназначена для птицеводства - для получения куриных яиц с повышенным содержанием ксантофиллов в желтке Как отмечалось ранее эта добавка отмечена серебряной медалью на VIII Московском международном салоне инноваций и инвестиций, Москва, 2008 г

Глава 2 Обращенно-фазовая ВЭЖХ: Зависимость удерживания от

состава подвижной фазы

Особый интерес в хроматографии представляют закономерности типа «удерживание - состав подвижной фазы» В случае двухкомпонентных водно-органических подвижных фаз удерживание сорбата А при изменении концентрации органического модификатора подчиняется простому эмпирическому соотношению3,

Ig*(¿)= Ig^-S Ф (2 1)

где lgk(A) - логарифм фактора удерживания сорбата A, lgk(A)w - логарифм фактора удерживания сорбата А в чисто водном элюенте, S - константа для данной хроматографической системы, Ф - объемная доля органического модификатора

Использование полуэмпирической теории параметра растворимости позволило предсказать несколько более сложную - квадратическую зависимость удерживания от состава подвижной фазы4.

lgi(^)= a+b Ф +с Ф2, (2 2)

где константа Ъ - отрицательное число, по модулю превосходящее положительную константу с Впрочем, известны также варианты более сложных разложений суммарного удерживания по степеням Ф5.

Пусть удерживание сорбата А в обращенно-фазовой хроматографии определяется его распределением между двумя несмешивающимися фазами

¡í (Asp) = l¡ (А,тр)

1 Snyder L Я, Dolan J W, Gant J R. // J Chromatogr 1979 V165.P 3-30

4 Schoenmakers P J , Billet H A H , Tyssen R., de Galan L IIS Chromatogr 1978 v 149 P 519-537

'SchoenmakersP J, BilletH AH,deGalanL III Chromatogr 1981 v218 P 261-284

Для любого элементарного участка хроматографической системы в любое время от ввода пробы фактор удерживания сорбата А равен соотношению его количеств, Ni(A), находящихся в стационарной (sp) и подвижной imp) фазах.

kiA)-„ M^El

N(A,mp)

Если N(mp) и N{sp) - полные количества моль веществ подвижной и стационарной фаз, то не только на элементарных участках перемещающейся зоны сорбата, но и во всей колонке вследствие пропорциональности данного отношения справедливо

N(Asp) _ X(A,sp) N(sp)

N(A,mp) X(A,mp) N{mp) ' ^ 6>

где X - мольные доли сорбата А в стационарной и подвижной фазах, соответственно. Соотношение (2 3) может быть преобразовано

(2 4)

Х(А,тр) N(mp) N{mp) 4 '

В этом выражении фактор удерживания вещества А связан с термодинамической константой распределения сорбата А выражением, которое можно назвать мольным соотношением колонки При изменении состава подвижной фазы могут изменяться как термодинамическая константа, так и мольное соотношение колонки И если изменение термодинамической константы с изменением состава подвижной фазы очевидно и не отрицается ни в одной из работ, то относительно мольного соотношения в уравнении (2.4) в литературе приняты едва ли обоснованные упрощения Так в большинстве работ вместо мольного соотношения используют фазовое соотношение, <р:

kiAy- К{А) уШ" К(А) ? (25>

где К(А) - «константа» равновесия, выраженная через мольные концентрации сорбата в обеих фазах. Но такая замена может быть действительно оправданной при исследовании удерживания различных веществ в одной и той же хроматографической системе - т.е на одной и той же стационарной фазе и в одном и том же составе подвижной фазы (в этом случае rp-const)

Следовательно, в нелинейность зависимости удерживания сорбата от мольной доли органического модификатора может вносить вклад и не термодинамическая составляющая - нелинейность изменения количества моль стационарной фазы Это говорит о большой сложности теоретического объяснения зависимости «удерживание - состав».

Для элюентов системы ацетонитрил - вода зависимости логарифмов факторов удерживания ряда сорбатов от объемной доли адетонитрила очевидно нелинейны, рис 2 1. Перейдем к новому аргументу, квадратично связанному с предыдущим-

/(Ф)= Ф +д Ф2,

где q - параметр, позволяющий линеаризовать зависимость «удерживание -состав подвижной фазы», рис 2 2

Рис 2 1 Зависимость логарифма фактора Рис 2 2 Зависимость логарифма фактора удерживания сорбатов от объемной доли удерживания сорбатов от

ацетонитрила в подвижной фазе модифицированной функции объемной доли

ацетонитрила в подвижной фазе

Следует обратить внимание на то, что уравнение (2 2) часто используется для экстраполяции удерживания на чисто водные этоенты6 Однако линии трендов, во-первых, по квадратичной зависимости более чувствительны к погрешностям определения времен удерживания сорбатов (особенно на краях используемого диапазона) по сравнению с прямолинейной зависимостью Во-вторых, не термодинамический вклад (мольного соотношения колонки) только приближенно описывается квадратичной зависимостью Поэтому надежность получаемых данных в лучшем случае не очевидна.

Глава 3 Метод относительного анализа удерживания Вместо исследования зависимостей «удерживание - состав подвижной фазы», анализ которых осложнен множеством трудноразрешимых проблем, может быть исследована принципиально иная зависимость, не включающая в явном виде состав подвижной фазы Если ввести некоторую функцию состава подвижной фазы _ДФ), при которой для некоторого сорбата А базиса нелинейные соотношения 1пк(А) ух Ф заменяются линейным соотношением 1ЩА) vsf(Ф):

!п*(Л)= р(А)ьд(А) /(Ф) (3.1)

то линеаризация соответствующих соотношений выполняется и для всех остальных сорбатов исследуемого базиса (см рис 2 2) Для сорбата В

1п£(5)= р(В)\ д{В) /(Ф) (3 2)

Тогда, исключая _ДФ) из уравнений (3 1) и (3 2), получаем основное соотношение метода относительного анализа удерживания-

1п к(В) = а(А, В) т Ь(А, В) 1п к(Л) (3 3)

Для построения указанных зависимостей необходимо определить факторы удерживания набора (г) веществ для нескольких различных составов подвижных фаз избранной системы Каждая точка на графике относительного удерживания строится по логарифму фактора удерживания вещества сравнения

'КаЬгапЯ е1аИП ОтопШсцг А, 1999 V 855 Р 455-486

(А), \пк(А), - абсцисса точки, и по логарифму фактора удерживания вещества I, 1пА(/) - ордината точки. Затем через точки для каждого вещества 1, полученные для различных составов подвижных фаз, проводят линию - обычно прямую, рис.3.1 и табл 3.1

Таблица 3.1. Сопоставление удерживания бензола и толуола в условиях

обращенно-фазовой ВЭЖХ в элюентах системы метанол - вода

№ точки на рисЗ 1 Объемная доля СНзОН Логарифмы факторов удерживания сорбатов Отклонение

экспериментальные данные расчетные*

^¿(бензол) 1й#тодуол) ^¿(толуол)

X У

1 0.5 0815 1 153 1 152 -0 001

2 06 0 568 0.863 0 862 -0 001

3 07 0.233 0 464 0 470 0.006

4 08 -0 040 0 152 0 149 -0.004

• - по уравнению прямой линии на рис 3 1

Известно, что в случае обращенно-фазовой хроматографии заметный вклад в удерживание полярных соединений могут вносить их взаимодействия с остаточными силанольными группами неподвижной фазы Но как показывает анализ экспериментальных данных, полученных разными авторами, это не сказывается на линейности соотношения относительного удерживания.

Для сорбатов с крутой зависимостью фактора удерживания от состава подвижной фазы таких, как (-)эпигаллокатехингаллат (БоСв) и (-)эпи-катехингаллат (ЕСв)7, небольшие погрешности в приготовлении подвижных фаз могут сказаться на виде таких зависимостей, рис 3 3; однако в координатах метода ОАУ линейность сохраняется.

Рис 3 1 Удерживание толуола относительно Рис 3 2. Удерживание толуола относительно бензола бензола для различных модификаторов водно-

1X 3,4 - номера точек из табл 21 органических подвижных фаз

7 Шафигулин Р В, Буланова А В , Ро К X // Сорбционные и хроматографические процессы 2006. т 6(5) С 844-850 14

Рис.3.3. Сопоставление удерживания некоторых компонентов экстракта зеленого чая в элюентах системы метанол - вода

Известно, что проблема определения мертвого объема (или мертвого времени, to) сложна и не определены даже однозначные подходы для ее решения. Неточности в определении мертвого объема приведут к погрешностям расчета логарифмов факторов удерживания. Пусть известно точное мертвое время (2 мин) тогда можно исследовать, как изменятся результаты расчетов при 5 %-ной ошибке в определении to. Как видно из представленных в табл.3.2 данных, только при положительных значениях lgk соблюдается линейность между истинным и расчетным значениями этой характеристики. Т.е., для построения надежных зависимостей относительного удерживания следует использовать только точки, построенные по неотрицательным значениям \%к.

В обращенно-фазовой хроматографии удерживание веществ зависит, в том числе, и от остаточных силанодьных групп и от типа модификации сорбента (end-capping или embedding). По этой причине характер относительного удерживания пар веществ в нормально-фазовой хроматографии также представляет интерес.

Таблица 3.2. Влияние погрешностей определения to на значения Igк

tR, мин to - 2.0 мин to = 2.1 мин to - 1.9 мин

к г 1як Igk lfik* Alg Г lg* ~ Alg

10.0 4.00 0.602 0.575 0.575 <0.001 0.630 0.630 <шюГ1

8.0 3.00 0.477 0.449 0.448 <0.001 0.507 0.507 <0.001

6.0 2.00 0.301 "02691 0.269 "^оЖП 0.334 0.334 "<о7ооГ

4.0 1.00 0.000 -0.040 -0.04 0.007 0.043 0.038 -0.006

3.8 0.90 -0.050 -0.090 -0.08 0.008 0.000 -0.010 -0.007

■5.3 0.75 -0.120 -0Л80 -0.16 0.012 -0.070 1 -0.090 -0.011

3.0 -0.300 -0.370 -0.34 0.025 -0.240 -0.260 -0.021

2.5 «.25. -0.600 -0.720 -0.65 0.071 МХ500~ -0.550 -0.054

* расчетные данные по уравнению прямой линии, проведенной через точки с положительными значениями

Пересчет данных, представленных в работе8, рис 3 4, где использованы только данные с факторами емкости больше единицы, подтверждает общий характер линейности относительного удерживания.

Рис 3 4 Удерживание сорбатов относительно фенола (НФ Силасорб 600)

Для выявления взаимозависимости между линейным соотношением величин удерживания в хроматографии и термодинамическими характеристиками распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами воспользуемся простейшей моделью. В условиях изократического элюирования при некотором составе подвижной фазы при предположении о равновесном распределении вещества [ между неподвижной (хр) и подвижной (тр) фазами химические потенциалы вещества I в обеих фазах равны

/»(<.¡р)- Р-(итр).

Коэффициент распределения вещества г равен отношению активностей сорбата 1 в обеих фазах

а(!,тр) Х{1,тр)

где ¡10 - стандартные значения химических потенциалов, X - мольные доли вещества г в соответствующих фазах. Такое соотношение получено с учетом равенства единице коэффициентов активности сор-".Iга г з обеих фазах, см гл. 1

Все термодинамические параметры, включая свободную энергию сольватации сорбата А в обеих фазах, при этом входят в стандартные изменения химических потенциалов; для одного сорбата, А:

Для другого сорбата, В.

ЯПп Кп{В) = КТ\п

Х(Л,тр)

Х(В,*р) Х(В,тр) '

(В)

' Рудаков О Б, Седишев И П, Рудакова Л В // Конденсированные среды и межфазные границы 2003 т5 №3 С 311-317 16

Распространяя идею о линейном соотношешш свободных энергий на изменения °0) при варьировании состава подвижной фазы, предположим соотношение.

4а + откуда получается соотношение:

\пКп(В)---~*ЬЫКг1,{А). (3.4)

Полученное соотношение можно считать термодинамическим обоснованием линейности по соотношению 1пКп(В) vs \пКп (А), Однако коэффициент распределения вещества (Кгъ(А)) и фактор емкости (к(А)) не эквивалентны:

(3 5)

Подставляя выражения типа (3 5) для сорбатов А и В в уравнение (3 4), получаем.

(3 6)

ЯТ Л^р) 4 1

Следовательно, на пути использования идеи о линейном соотношении свободных энергий для объяснения экспериментально подтвержденной линейности по соотношению 1пКп(В) иг 1пКп(А) существует единственная преграда - последний член уравнения (3 6)

К сожалению, как отмечалось ранее, строгих методов расчета мольного соотношения в настоящее время не существует В случае водно-органических подвижных фаз, следует учитывать, что вода является сильно ассоциированным растворителем По этой причине, учет числа моль отдельных молекул и ассоциатов воды да еще и в присутствии органического модификатора составляет самостоятельную проблему Однако при предположении о пропорциональности между указанной «добавкой» и факторами удерживания исследуемых веществ

1пк{А)=а',Ь'Ь(3 7)

исключением мольного соотношения, из уравнений (3.6) и (3 7), получаем линейное соотношение между факторами удерживания-

\пк{В)--~*Ъ' ЫКА), (3.8)

где множители а и Ъ\ могут (если а' и Ъ' не раны нулю) отличаться от множителей а и А в уравнении (3 6) при существовании указанной пропорциональности. Соотношение (3 7) не лишено основания, поскольку, например, при увеличении степени покрытия сорбента октадецилсилановыми лигандами на начальном участке графика "удерживание кг степень покрытия сорбента" (т.е. при увеличении числа моль стационарной фазы) логарифмы факторов удерживания ряда веществ также линейно увеличиваются9.

"ЕщеЫг&Н.ЗтйгетМ ИСЬгота(о£гарЫа 1990 у29 Р 59-68

Уравнение (3 8) является базовым уравнением относительного удерживания. Вычитая из обеих частей уравнения (3.8) логарифм фактора удерживания сорбата А, получаем уравнение (3 9), лежащее в основе относительного инкрементного анализа.

*

Д (А ч В)~ 1п к(В) - 1п к{Л) = — + (Ь* - 1) 1п к(А). (3.9)

КТ

Наконец, базисное уравнение для анализа межинкрементных соотношений-

С), (3 10)

где термодинамический инкремент определяется как разность логарифмов коэффициентов распределения веществ между фазами:

У)= ЬКп(Х)-ЬКп(Х); уравнение (3.10) без оговорок справедливо для хроматографических параметров, поскольку мольные соотношения сокращаются:

Г)= 1п!пк{Х)- ЫЩ)-

Отметим, что существует еще одна особенность применения метода ОАУ, принципиально важная для сопоставления данных полученных в различных условиях. Она связана с необходимостью использования при любых расчетах так называемого мертвого времени, являющегося одной из важных проблем хроматографии В работе подробно обсуждается этот вопрос и отмечается, что определение точного мертвого времени экспериментально в общем случае, строго говоря, мало вероятно по различным причинам Поэтому приходится довольствоваться некоторым простым методом, учитывая, что погрешности в определении факторов емкости практически неизбежны Метод относительного анализа удерживания позволяет в значительной мере уменьшить влияние этих погрешностей на конечный результат

В табл.3 3 представлены (кажущиеся) значения логарифмов факторов удерживания бензола, толуола и о-ксилола, рассчитанные, с использованием мертвого времени, определенного по удерживанию нитрита натрия (для наглядности будем считать их истинными) и с 5%-ными погрешностями как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения этого параметра

Таблица 3 3 Параметры удерживания бензола, толуола и о-ксилола

Об % СНзСЫ в элюенте Логарифмы факторов удерживания веществ при Ь,, мин

Бензол Толуол о-Ксилол

1.62 1 80 1 98 1.62 1.80 1.98 1 62 180 1.98

80 0.105 0 064 0 024 0 247 0211 0.176 0 365 0 332 0 301

70 0.298 0.264 0 231 0463 0.433 0 403 0.599 0 571 0 544

60 0.513 0 484 0.455 0.704 0.677 0.651 0 860 0 835 0 810

50 0.740 0 713 0 688 0 966 0 941 0.917 1.15 1.126 1.104

Колонка 250x4 мм, Диасфер-110-С18, б мкм

При традиционном графическом представлении результатов различие в положении точек на графике vs Ф (где Ф - объемная доля ацетонитрила в

ацетонитрил - водных элюентах) в зависимости от использованного значения 1м достаточно заметно, рис 3.5

удерживания бензола от величины удерживания лары о-ксилол - толуол

использованного значения tu

Разность параметров удерживания на границе этого интервала, Algk, можно рассматривать как возможную «погрешность», связанную с неточностью определения ím Она возрастает для малых времен удерживания, но и при относительно больших временах удерживания, она оценивается в лучшем случае величиной 0 050 логарифмических единиц Нетрудно подсчитать, что при этом неопределенность в обратном пересчете на времена удерживания равна примерно 10 % для всего диапазона времен удерживания, те tR = 30±03 мин; 10 0 ± 10 мин и т д. Но применение метода анализа относительного удерживания при этих же условиях существенно нивелирует указанные различия, рис 3 6.

Все точки с координатами по данным, приведенным в табл 3 3, располагаются около одной прямой (R2 > 0 99995 во всех трех случаях)-

lg^o-ксшгол) = 0.1015 + 1.0873 ^толуол) (при íM = 1 80 мин), (3 11) lg^o-ксилол) = 0 1085 + 1.0826 ^¿(толуол) (при tu - 1 62 мин), lgA^o-ксилол) = 0 0944 + 1 0917-1^толуол) (при tM= 1 98 мин) А общее уравнение для объединенного базиса данных-

lg^o-ксилол) = 0.1021 + 1.0858'1^(толуол) позволяет определять параметры удерживания с надежностью почти на порядок выше, чем по традиционному подходу В диапазоне логарифмов фактора удерживания толуола (0 - 1 ед) различие расчетных факторов удерживания о-ксилола при 10%-ной погрешности определения мертвого времени не превышает 0.007 ед при погрешности определения собственно параметра удерживания порядка 0 002 единиц

Если мольное соотношение в уравнении (2 5) для другой колонки будет вдвое больше, чем для первой, то относительное удерживание будет описываться другим уравнением-

lgAío-ксилол) = 0.0753 + 1 0873 ^¿(толуол) (при V0 = 1 80 мл), (3.12)

Абсолютные значения кажущихся факторов емкости одного и того же вещества будут различаться уже на 0 300 единиц, что соответствует увеличению времени удерживания о-ксилола на 8 мин при (я = Ю мин на первой колонке Но, сравнивая уравнения (3.11) и (3.12) можно убедиться в том, что различие составляет лишь 0.026 (те. примерно 0.40 мин) В действительности это различие не столь значительно для различных стационарных фаз, поэтому, линия тренда, рассчитанная по данным10, рис.3 6, по удерживанию пары толуол - о-ксилол для фазы ZorbaxSil ODS практически неотличима от уравнения (3.11)

Карта разделения многокомпонентных смесей сорбатов. В реальной хроматографической практике часто приходится сталкиваться со сложными смесями, в которых при изменении состава подвижных фаз происходит инверсия удерживания некоторых пар веществ Это создает определенные трудности при исследовании многокомпонентных систем по традиционным методам представления результатов в координатах «свойство элюента -удерживание сорбатов» вследствие нелинейности данной зависимости. Метод ОАУ позволяет легко решать такие вопросы построением карты разделения

Для составления карты разделения достаточно записать хроматограммы в двух составах элюентов (на границах приемлемого диапазона), и соединить соответствующие точки прямыми линиями, рис 3 7 Затем можно добавить группу точек посредине выбранного диапазона - для контроля правильности нанесения точек из первых двух серий, или для контроля грубых погрешностей определения координат первой пары точек

На рис 3 7 имеются несколько инверсий порядка элюирования, но они легко предсказываются и не могут осложнить анализ сложной смеси.

При построении карты разделения сложной смеси нет даже необходимости знания строения веществ Наоборот, по характеру хроматографичеекого поведения можно проводить классификацию компонентов смеси Например, при исследовании ацетоновых экстрактов семян наголоватки все компоненты смеси разделились на две группы веществ: одна группа содержала вещества, по изменению удерживания, аналогичные триглицеридам (пунктирные прямые линии на рис 3 8), а во второй (главной) группе содержались вещества, напоминающие по характеру изменения удерживания сквален (сплошные линии)

В случае антоцианов - 3-гликозидов цианидина тангенсы углов наклона линий трендов по уравнению*

lgfo(i) = a + b lg£(Glu) для моногликозидов (рис.3.9, табл 3 4), 3-дигликозидов и 3-тригликозидов заметно различаются, что позволяет проводить предварительную дифференциацию антоцианов по числу гликозидных фрагментов в 3-положении молекулы.

10 Шатц В Д, Сахартова О В Высокоэффективная жидкостная хроматография - Рига Зикатие -1988 -390 с 20

0-КСИЛОЛ ....................

пропилбензоат —........

толуол........................

этил(р-нитробензоат) этил(фенилбензоат) ••• этилбензоат ......

3.8. Карта разделения компонентов ацетонового экстракта семян иппеа эр. ЛгО - дилинолеат-олеат глицерола; Лг -трилннолеат глицерола

зтил(р-гидроксибензоат) ^4(бензол)

Рис.3.7. Удерживание некоторых веществ относительно бензола

Колонка: 250*4 мм Кромасил С18; элюенты системы СИзСЛ-НгО.

Сопоставление карт разделения для различных стационарных фаз.

Исследования, выполненные в данной работе, показали, что относительное удерживание малополярных веществ практически совпадает для ряда стационарных фаз. Это очень важное свойство относительного удерживания, поскольку абсолютные значения параметров удерживания могут различаются не только для однотипных стационарных фаз различных производителей, но и для различных партий сорбентов одного и того же производителя.

Таблица 3.4. Удерживание Су-З-Оу относительно Су-3-С1и

3-гликозид а Ъ 5,*, (п=7)

Оа!а Галактозид -0.093 0.937 0.0034

А га Арабинозид 0.145 0.948 0.0064

Кт Рутинозид 0.064 1.144 0.0043

Бат Самбубиозид -0.071 1.087 0.0062

5орЬо Софорозид -0.218 1.053 0.0071

2°КШ 2' -глюкозилрутинозид -0.235 1.248 0.0053

2х11и1 - 2'-ксилозилрутинозид -0.057 1.226 0.0034

« - среднеквадратичное отклонение.

Пусть уравнение удерживания сорбатов А и В для некоторой стационарной фазы (1) записывается в соответствие с уравнениями:

1п А, (-<>■/(•),

1^(5) = + (А). (3.13)

Пусть другая стационарная фаза (2) химически отличима от стационарной фазы (1), но это отличие может быть описано простым масштабированием коэффициентов (введением множителя к):

\пк2(Л) = р2(Л)+ 9, (/<)•/(•), 1пк2(В)--

Ink2(B)-- Р2(В)-^Р2(Л).

<7lOO q\ (A)

lnk2(B) = a2(A,B)+ Ъ{(А,В)Ы2{А). (3.14)

Рис 3 9 Зависимость удерживания глгокозидов цианидина (i) от удерживания Cy-3-Glu 1 - Су-ЗАга, 2 - Cy-3GaIa, 3 - Cy-3Rut; 4 -- Cy-3Sam, 5 - Cy-3Sopho, 6 - Cy-3aRut, 7 - Cy-32°Rut.

В уравнениях (3 13) и (3 14) одинаковы углы наклона прямолинейных зависимостей, следовательно, возможность масштабирования коэффициентов распределения сорбатов эквивалентна изменению мольного соотношения колонки

Рассмотрим данные для удерживания этилбензола относительно толуола для 41 стационарной фазы различных фирм производителей, представленные в Standart Reference Material®870", в элюенте, предложенном для стандартизации хроматографических колонок. При этом получается практически идеальная линейная зависимость для всех без исключения стационарных фаз, рис.3 10, даже несмотря на включение в базис данных с отрицательными значениями логарифмов факторов удерживания сорбатов

Уравнение этой зависимости (Р=0 95, n=41, R2 = 0 9977) имеет вид

[gkiethylbenzene)^ 0 I4I6± 0 0037+ (1 0393 ± 00162)lg¿(fo/ыепе) Важно также то, что все точки с положительными значениями координат (из рассмотренного базиса данных) хорошо укладываются на прямую линию относительного удерживания этилбензола относительно толуола, построенную для метанол - водных элюентов из работы3, рис.3.11. Впрочем, через эти точки можно провести другую линию тренда, несколько отличающуюся от первой Ее появление может быть связано (в том числе и) с особенностями определения «мертвого» времени. В стандарте США в качестве метчика "мертвого" объема

" Certificate of Analysis SRM 870, Column Performance Test Mixture for Liquid Chromatography, National Institute of Standards and Techology, Gaithersburg. MD 2000 22

рекомендуется урацил, а в работе3 использовано "унифицированное" для всех составов подвижных фаз время 125 с, при увеличении этого времени на 7 % все точки на графике (рисЗ 13, пунктирная линия) совпадают в пределах 0 003 логарифмических единиц Кстати, вследствие возможного влияния на удерживание остаточных силанольных групп корректность использования урацила как универсального метчика мертвого объема проблематична.

Следовательно, полученная линия тренда является хорошим приближением для всех использованных колонок даже, несмотря на то, что приведенном выше сопоставлении не учитывалось возможное различие в мольных соотношениях колонок.

метанола и 20 % фосфатного буфера (рН « 7)"

Полученные результаты позволяют сделать два важных вывода

а) изменение мольных отношений для реальных хроматографических колонок не приводит в ряде случаев к существенным искажениям относительного удерживания по крайней мере для малополярных соединений и использованных в цитированных работах стационарных фаз,

б) при строгом анализе следует сравнивать между собой данные, полученные с использованием одинакового метода определения tM.

В подтверждение примерной общности линий трендов для относительного удерживания малополярных соединений рассмотрим данные по удерживанию этилбензоата и гексилбензоата относительно бензола, полученные на стационарных фазах Кромасил-130-С18 и Диасфер-110-С18 стандартного размера колонок (250x4 мм) и микроколонок (Диасфер-110-С18, 80x2 мм) Общность соответствующих линий тренда была очевидной, но удивительно то, что данные по удерживанию этилбензола, полученные для принципиально иного типа обращенной фазы - С8, оказались на линии тренда дляС18фаз

В таком случае уравнения относительного удерживания пар веществ, полученные на одной колонке, могут быть перенесены на другую В подтверждение данного тезиса была исследована зависимость удерживания н-

С -,-,-.-,-.-гС 0,4 0,8 lgt(TOjiyafl)

Рис 3 10 Удерживание этилбензола относительно толуола Данные для 41 стационарной фазы в элюеите 80 %

РисЗ И Удерживание этилбензола

относительно толуола О- данные работы3, данные стандарта"1

,14

пропил- и к-бутилбегаоатов относительно этилбензоата на колонке размером 250x4 мм с сорбентом Диасфер-110-С18.

Xgk(npomat6eH3oam) - -01065 + 0 9810 ¡gк{этипбензоит), \цк(бутшбензоат) = 0 0246+ 1 0736 Ig к(этилбензоат) С использованием этих уравнений по экспериментально определенному удерживанию этилбензоата в условиях микроколоночной хроматографии на колонке 120x2 мм с сорбентом Сепарон SGX Cl8 рассчитано удерживание пропил- и бутилбензоата - в элюенте с объемным соотношением ацетонитрил -вода 20 3 и пропилбензоата при соотношении растворителей 20 4. Полученные значения 6 40, 7.9б и 18.10 мин близки к экспериментальным. 6 44, 7 68 и 18.40 мин, соответственно Это соответствие можно считать достаточно удовлетворительным, поскольку вследствие конструкционных особенностей внеколоночные объемы в случае Милихрома весьма значительны.

Возможность смены стационарных фаз в случае липофильных соединений удобна при исследовании триглицеринового состава растительных масел, поскольку в литературе имеется обширная информация по результатам исследования этих важнейших компонентов пищи На рис.3 12 я 3.13 представлены результаты разделения смесей, содержащих некоторые триглицериды и сквален на двух стационарных фазах с различающейся примерно в два раза удерживающей способностью, но практически неразличимым относительным удерживанием всех компонентов Это позволило в данной работе исследовать состав более 200 масел семян различных растений без использования труднодоступных стандартов

Известно, что остаточные силанольные группы и способ их нейтрализации (энд-кеппинг) могут вносить большой вклад з суммарное удерживание полярных соединений И если, как отмечалось выше, точки, построенные по данным работы14 для неполярных соединений на 41 стационарной фазе различных марок укладываются на одну прямую линию (рис ЗЛО), то для хинизарина и амитриптилина, содержащих высоко активные по отношению к образованию водородных связей и хелатированию катионов металлов группы, линейная корреляция не обнаруживается Это является следствием существенных различий использованного набора стационарных фаз по активности остаточных сияанольных групп Что и подтверждается использованным в работе тестом

Однако если выбрать соединения, в которых вклад в суммарное удерживание за счет образования водородных связей одинаков или близок, то линейная корреляция относительного удерживания может сохраниться даже при определенных различиях в активности остаточных силанольных групп Это подтверждается анализом данных работы12 по удерживанию 3-фенил-пропанола и иара-пентиланилина относительно бензилового спирта на десяти колонках, заполненных различными обращенными фазами, рис.3 14

12 Wilson N S et al II 1 Chromatogr A 2002 v961 P 171-193 24

Рис.3.12. Удерживание триглицеридов и сквалена относительно Лэ Ъ = триолеат (7), линолеат-диолеат (2)', дшшнолеат-олеаг (3); (а-линоленоат-дилинолеат (4); ди-а-линоленоат-линолеат (5); сквален (б). 0 -координатная биссектриса. Незаполненные знаки -стационарная фаза Диасфер-110-С18; заполненные знаки: Сепарои-130-С18 ЭвХ.

тУ

80

40

—I—I—(—I—I—г—

5 10

мин

Рис.3.13. Разделение смеси сквалена и триглицеридов смеси подсолнечного и оливкового масел Элюент: 30 об.% ацетонитрила в ацетоне, 1 мл/мин.

1 - сквален, 2 - Л,; 3 ■ ■ Л20; 4 - ЛОг; 5 - 03. Стационарные фазы: А-Диасфер-110-С18, 5 мкм; Б — Сепарон-130-С18 БвХ, 5мкм.

< 1=

■а

8*Г

Рис.3.14. Удерживание 3-фенилпропанола (ФП) и пара-яентиланилина (ПА) относительно бензилового спирта (БС)

Сопоставление свойств компонентов подвижных фаз. По

физическому смыслу метод анализа относительного удерживания веществ соответствует отказу от исследования закономерностей изменения удерживания в нелинейных координатах «удерживание - состав подвижной фазы». В предлагаемом пространстве графика \%ЦВ) как функции \%ЦА) каждая точка соответствует конкретной сумме энергий всех видов взаимодействий, характеризующих всю хроматографическую систему. При изменении состава подвижной фазы точка для выбранной пары веществ будет перемещаться в данном пространстве. Причем положение точки и характер ее перемещения

должен зависеть от типа модификатора подвижной фазы, если изменение типа модификатора приводит к изменению вклада различных видов взаимодействий (дисперсионных, ориентационных, индукционных, образования водородных связей и тд) в суммарный энергетический эффект Так как для различных типов модификаторов этот вклад различен, то и линии тренда могут быть различными

Например, для относительного удерживания триглицеридов, образованных радикалами а-линоленовой (Лн), линолевой (JI) и олеиновой кислот (О), различия поведения в системе ацетон - ацетонитрил и ацетон -метанол очевидны (рис.3.15), Можно заметить, что различия увеличиваются пропорционально изменению числа двойных связей в молекулах, что, вероятно, соответствует изменению вкладов я-взаимодействий, отсутствующих при введении метанола, но имеющих место при введении ацетонитрила в подвижную фазу.

Удерживание триглицеридов в элюентах на основе ацетона с добавками ацетонитрила или метанола при увеличении их концентрации (Ф) возрастает, а параметр q соответствует тангенсу угла наклона этой зависимости*

lg*G4)= p*q Ф .

1 - шло j -ЧК-нр) -тл,)

-lgЩнЛ) - \&(ЛнЛ)

РисЗ 15 Зависимость удерживания триглицеридов от Igk(JIa)

Колонка. 250x4 мм, Кромасил С18 Ацетон + X

Пусть в сорбате А„ содержится п С=С- связей, а увеличение концентрации метанола приводит к увеличению удерживания, причем это увеличение пропорционально уменьшению числа двойных связей (те замена групп: -СН=СН- на -СН2-СН2-)-

¿ША) а

<® 'Чп'

Если при этом в сорбате Л„-/ содержится п-1 ОС-связей, то, аналогично:

¿Ш £(/!„_ 1)

—И—= а®

Отсюда с учетом увеличения д при уменьшении п

(3 15)

чно:

(3.16)

с!Ык(Ап)

СИ,ОН Чп

Ацетонитрил в отличие от метанола способен к я-взаимодействиям с сорбатами, поэтому производные (3.15) и (3 16) должны уменьшаться пропорционально числу двойных связей. Отметим, что уменьшение в данном случае связано с тем, что и ацетонитрил и метанол используются как добавки к лучшему растворителю - ацетону, а не к худшему - в случае обычных вводно-органических подвижных фаз Пусть такое уменьшение равно г на каждую двойную связь, тогда.

(Лп к(Ап)

Яп-1 -г(п- 1)

(3 17)

!СН->СЫ Чп'т п

Нетрудно убедиться в том, что при любых (положительных) значениях п и г выполняется соотношение, табл.3 5.

(¿1п к(А„^)\ 1<1\пк(А„_-1)

I ¿1пк(Ап) \cH.CN I ¡СН./)Н

Тогда, во-первых, становится понятным ход прямых на рис 3 15, а, во-вторых, появляется новая возможность для количественного сопоставления свойств растворителей Отметим, что производные логарифмов факторов удерживания триглицеридов по удерживанию трилинолеата равны тангенсам углов наклона прямых относительного удерживания Используя экспериментальные значения тангенсов углов наклонов прямых на рис 3 15 для метанола в качестве модификатора ацетонового элюента методом наименьших квадратов было найдено значение г* = 0 013, которое достаточно хорошо согласует экспериментальные и расчетные параметры для всех четырех триглицеридов, табл 3 5.

_Таблица 3 5 Параметры уравнения (3 17) относительно Л;

Триглицерид

Состав

о2л

ОЛ2 ЛнЛз Лн2Л

¿¡п

<Нак(,А„)

СИ-ЛН

1 072 1 036 0 971 0 944

<*1п*(4,.1)

аЬк(А„)

экспер. 1 108 1 056 0.951 0 916

снгси расч * 1.106 1 053 0.954 0911

п- число двойных связей в триглицериде, * - расчетное значение при оптимальном значении г (0 013)

По формуле (3.17) параметр г* указывает на количественное соотношение между суммарной гидрофобностью и парциальным вкладом ^-взаимодействий между зцетспитрилом и двойными связями триглицеридов Глава 4. Инкрементный подход

Аддитивные схемы, основанные на парциальных составляющих, по надежности получаемых данных могут превосходить, например, квантово-

химические методы13 Структурные парциальные параметры определяют при исследовании свойств специально подобранной группы веществ известного молекулярного строения - «тренировочного ряда» В хроматографии в качестве удобного структурного дескриптора был предложен инкремент, сопоставляющий данному изменению структуры вещества разность соответствующих логарифмов факторов удерживания:

Ь(А-> В)' lg*(B)- lg*(¿). (4.1)

В таком случае если вещество С является продуктом последовательного замещения функциональных групп в ряду:

A -t -) Вг -> Вп-> С с известными для каждой из стадий превращений инкрементами, то удерживание вещества С при выполнении аддитивности свойств" может быть найдено по простой схеме:

Igfc(C) = lg£(/Q+ А(Л-> ВО* Д (В, -> В2)+ + Д (В„ -> С). (4.2)

Очевидно, что обязательное требование для рассматриваемых структур -отсутствие внутримолекулярных взаимодействий При этом отличие экспериментального инкременга от полученного для тренировочного ряда может свидетельствовать об особенности строения исследуемого соединения, например, о наличии внутримолекулярной водородной связи

Значительные успехи школой А В Киселева были достигнуты в газовой хроматографии при исследовании сорбции веществ на графитированной саже14 В жидкостной хроматографии, к сожалению, достижения в области количественной взаимосвязи между строением и хроматографическими характеристиками сорбатов несопоставимо скромнее Инкрементам (или вкладам функциональных групп) в начале развития ВЭЖХ было посвящено множество работ, см. обзор15 и ссылки в нем. Однако у авторов работ не было обоснованного метода оценки или сопоставления результатов Поэтому, к сожалению, результатом этих работ, по сути, было не более чем простое перечисление полученных численных данных и неуверенные попытки их сопоставления Также, к сожалению, обычно в этих работах отсутствовали данные, необходимые для применения метода относительного анализа Вероятно, поэтому в настоящее время вместо инкрементного подхода предложены совершенно другие варианты исследований под названиями QSRR (количественная взаимосвязь между строением и удерживанием веществ) или LFER (линейная взаимосвязь между свободными энергиями)

При графическом представлении инкрементных соотношений по методу ОАУ можно исследовать положение линии для вещества B¡, относительно координатной диагонали (т е относительно удерживания сорбата сравнения, А), те на карте разделения. Возможно также по оси ординат откладывать инкремент для пары сорбатов В и А.

13 Баскин И И, Палолин В А , Зефиров НС// Вестн Моск. Ун-та. Сер 2 Химия 2001 Т 42 № б С 387-3S9

" Киселев А В., Пошкус Д П, Яшин Я И Молекулярные основы адсорбционной хроматографии -М Химия, 1986 -272 с

"SmithR.M //J Chromatogr А 1993 v656 Р 381-415 28

Метиленовая селективность относится к числу наиболее важных и наиболее часто исследуемых параметров хроматографических процессов Этот параметр имеет принципиальное значение в обращенно-фазовой (т е. гидрофобной) хроматографии по понятной причине - основными функционально активными поверхностными фуппами сорбента в этом случае являются именно алкильные радикалы Все остальные поверхностные группы в случае обращенно-фазовой хроматографии рассматриваются как, к сожалению, неизбежные артефакты.

Метиленовая селективность рассчитывается по параметрам удерживания двух веществ, различие в строение которых состоит в добавлении одной мстиленовой группы (А = R-Ri) и (В = R-CH2-Ri), двумя способами:

а (СЯ2)= ^ и Iga ОСН2)-- ЦА-* В) = Igk(B)- 1 gk(A)

Отметим, что метиленовая селективность входит в число параметров, определяемых при характеризации стационарных фаз16

Метиленовая селективность в пределах одного ряда гомологов. Для исследования инкрементов удобнее воспользоваться концентрационной зависимостью параметров удерживания с аргументом, выраженным через логарифм активности компонентов подвижной фазы по уравнению, предложенному в главе 1-

!пк(А)- inK(A)± In f (А)- л, \па(5,)- «а1пa(S2)- InЩтр),

ill

где учитывается также изменение свободной энергии поверхности сорбента (AG„) при сорбции сорбата, активности воды (Si) и органического модификатора (&) и числа сольватации сорбата этими компонентами, т и т, соответственно

Если вещество А' - следующий член гомологического ряда, то

1п*(Л')= InК(А) + Infmp{A')-n,\na(Sx)- n2\na(S2)- 1пЛ\mp) Kl

и инкремент, соответствующий введению метиленовой группы, равен

Д (Л-» А')= Inк(А')-Inк(А): InК(А')- InК(А)\ A In fmp(A)- &п, Ina(S,). (4 3)

Соотношение (4.3) выведено при предположениях о том, что

• метиленовые группы сольватируются только молекулами неполярного компонента подвижной фазы - Si, (An) - изменение числа таких молекул при добавлении СНг-группы в структуру сорбата А;

• поскольку (и если) эта группа будет внедрена в обращенную фазу, то ее влиянием на изменение избыточной поверхностной энергии можно пренебречь.

Если предположить, что и сольватация (во второй координационной сфере) сольватного комплекса A(solv) равномерно изменяется при последовательном добавлении С НЬ-групп в ряду гомологов, те А\п/тр(А) = const, то при равенстве последовательных Дп можно предполагать равенство последовательных инкрементов.

"ЯщинЯ.И Физико-химические основы хроматографического разделения М Химия 1976 216 с

Но для равенства последовательных инкрементов необходимо, прежде всего, равенство разностей последовательных термодинамических параметров сольватации членов гомологического ряда в обеих фазах. В полуэмпирических расчетах термодинамических свойств веществ достаточно строго одинаковые вклады вносят только атомы одинакового вида А в ряду бензол - толуол -этилбензол - пропилбензол - .. добавляемые СНг-группы являются группами одинакового вида только начиная с пары этилбензол - пропилбензол Поэтому обычно по хроматографическому поведению бензол выпадает из ряда гомологов, и, строго говоря, из него следует исключить и толуол Эти выводы в данной работе подтверждены сопоставлением литературных термодинамических данных (по энтальпии переноса) и хроматографических параметров поведения алкилбензоатов в системе ацетонитрил - вода на стационарной фазе Kromasil Cl8 в элюенте состава 80 % ацетонитрила в воде. Инкремент, приходящийся на одну метиленовую группу, был рассчитан по удерживанию пары веществ »-пропилбензоат и к-бутилбензоат Применяя полученное значение для прогнозирования удерживания н-гексилбензоата, получили расчетное значение логарифма фактора удерживания, равное 0.745. Экспериментально определенный IgA^H-гексилбензол) оказался равным 0.743, что сопоставимо с погрешностью определения этого параметра удерживания. Это позволяет использовать указанную выше пару в качестве количественного дескриптора метиленовой селективности. Аналогичная зависимость была получена ддя метил, этил, пропил и бутилбензоатов в более «медленном» элюенте, При определении инкремента (0 166) по удерживанию пропил и бутилбензоатов расчетный параметр удерживания этилбензоата (^¿(этилбензоат) = 0,250) оказался лишь на 0 001 меньше экспериментального значения, хотя для метилбензоата расхождение достигает 0 007 логарифмических единиц. Отметим, что определенные в тех же условиях инкременты, соответствующие замене метального радикала на этильный для других основ - толуола и анизола, - имеют другие значения- 0.144 и 0 158, соответственно.

Однако не только при малом количестве метиленовых групп следует ожидать неодинаковости метиленовых инкрементов в ряду гомологов В работе17 при анализе квадратичной селективности (« = -¡Kn!K-i ) как функции и в гомологических рядах обнаружена нелинейность. Точка перегиба найдена при п ~ 12 - 13 даже в достаточно гидрофобных элюентах (составленных из хлороформа и ацетонитрила) Для объяснения полученных данных авторы использовали «эффект проникновения» в стационарную фазу Однако, как было установлено в данной работе при анализе удерживания рядов гомологов на различных стационарных фазах (включая такие, для которых «эффект проникновения» лишен смысла) влияние возможных информационных превращений сорбатов в подвижной фазе представляется более вероятным При этом очевидно, вследствие снижения гидрофобности элюентов (при переходе к

17 Martin M, Thevenon G , Tchapla A Hi Chromatogr 1988 v452 P 157-173 30

водно-органическим подвижным фазам) точка перегиба должна смещаться в сторону уменьшения п

Метиленовая селективность в гомологических рядах: некоторые особенности. Вероятно, наибольший прогресс в методе обращенно-фазовой хроматографии был достигнут при исследовании удерживания гомологических рядов соединений при разнообразных вариациях хроматографических условий. При выполнении этих работ был обнаружен целый ряд важнейших закономерностей удерживания таких соединений Прежде всего, к общим закономерностям можно отнести найденную зависимость удерживания от числа атомов углерода в алкильных радикалах трех рядов гомологов алканов, алкилбензолов и метиловых эфиров жирных кислот18

(4 4)

При этом величины коэффициента р были, в общем случае, различными для различных гомологических рядов, а соотношения между ними зависели от составов метанол - водной подвижной фазы В следующем сообщении19 был расширен набор гомологов и органических модификаторов подвижных фаз, но единственным результатом стала нелинейность метиленовой селективности от состава подвижной фазы Но наиболее интересными представляются выводы работы20, в которой показано пересечение всех прямых линий для данного типа гомологов, полученных для различных соотношений органический модификатор - вода, в одной точке Эта точка названа точкой конвергенции Существенно то, что ордината точек конвергенции для различных рядов гомологов (метиловых эфиров, алканов и алкилбензолов) имела примерно одно и то же значение для всех рядов гомологов К сожалению, авторы работы отказались от выяснения физического смысла абсциссы этой точки, да и физический смысл ординаты оказался спрятанным за рассуждения об индексах взаимодействия

В работе21 предложено уравнение, учитывающее установленные факты линейности не только по числу атомов углерода в алкильных радикалах, но и линейности зависимости удерживания от массовой доли воды

1 А\ В и+ С х+ И п х

где х - массовая доля воды в элюенте, а А, В, С и Б - константы для данного гомологического ряда. Указанное уравнение предполагает также пересечение всех линий зависимости типа (4 4) в одной точке для данной хроматографическон системы Важно, что в этой работе предложен физический смысл точки конвергенции - как точки с отсутствием различий между двумя фазами по отношению к некоторому условному члену гомологического ряда. Этот очень важный момент предлагалось использовать для характеризации колонок (стационарных фаз) Поскольку удерживание сорбатов на реальных стационарных фазах определяется не только привитой фазой, но целым рядом других свойств, включая определенную активность остаточных силанольных

18 Со1т Н, СиюсЬоп в /И Сгогшйо^ Ба 1980 V 18 Р 54-63

"Со1гаН е1а!/П СЬгогпаЮёг Эа ¡983 v21 Р 179-1X4

тСо1тН е!я/У/СЬготаЮгеарЫа 1983 V 17 Р 9-15

"ЕпееИагЛН //РигеАрр! СЪет 1989 УбЦП) Р 2033-2036

групп, то не следует рассчитывать на равенство абсцисс точек конвергенции различных гомологических рядов

На рис. 4 1 представлены линии трендов для логарифмов факторов удерживания ряда ароматических производных в «линеаризованных» концентрационных координатах по уравнению (3.1) на колонке 80x2 мм, Сепарон SGX С18 в подвижных фазах системы «метанол-вода». Точки пересечения имеют, как и следовало ожидать, примерно равные ординаты, но заметно смещены по оси абсцисс

удерживания ряда соединений от функции некоторых веществ относительно бешола

состава подвижной фазы 1 - бензол, 2- толуол, 3 - этилбекзол, 4-21 - фенол, 2 - /)-крезол, 3 - эталбензоагг; 4 - пропил- металфеиол, 5 - фенол Элюенты системы бензоат, 5 - бутилбензоат, 6 - бензол, 7 - толуол «ацетанитрил - вода»

Общая тенденция смещения точки конвергенции - абсцисса тем меньше, чем выше полярность вещества, что не противоречит предложенному физическому смыслу точки Действительно, чем выше полярность молекулы, тем меньше требуется органического модификатора для подавления гидрофобности вещества. Кстати, в методе относительного анализа удерживания различие координат точек конвергенции для различных гомологических рядов проявляется в виде смещения точек также по оси абсцисс, если в качестве образца сравнения во всех относительных параметрах используется одно и то же вещество, рис 4 2.

Подчеркнем, что между однотипными инкрементами (на одну СИг-группу) для различных гомологических рядов существуют сложная взаимосвязь Так, в работе24 для метанола в качестве элюента инкременты оказались равными 0.100,0 110 и 122 для алкилбензолов, алканов и метиловых эфиров жирных кислот, соответственно Но для элюента, содержащего 90 об % метанола они сравнялись - по 0.151; и вновь для следующего состава подвижной фазы (80 об % метанола) стали различными- 0 183, 0.198 и 0 201 в том же порядке. Инкременты не совпадают при любом составе подвижной фазы для данных, приведенных на рис.4.1. Не одинаковы также и разности в углах наклона соответствующих прямых для пар веществ- 0 486 для пары

бензол - толуол, 0 454 - пары фенол - п-крезол, 0 505 (этнлбензоаг - п-пропилбензоат) и 0.559 (и-пропилбензоат - п-бутилбензоат)

В настоящей работе при исследовании диэфиров ряда каротиноидов, образованных жирными кислотами, содержащими более 10 углеродных атомов углерода в цепи, найдено хорошее совпадение инкрементной разности для диэфиров лютеина, образованных кислотами от лауриновой до стеариновой, рис 4.3 и 4 4

" ' Ьи(14+1б)

и(1б+1б) 15> ;

Ьи(14+14)

°'5 lgW£tf(14+]4))

° Lu(12+14) eLu(14+16) •I пЛй+Ш

'Ш16+18)

Рис 4 4 Удерживание диэфиров лютеина относительно Ьи(14+14) Подвижные фазы системы ацетон - ацетонитрил Ьи - лютеин Цифры - число атомов углерода в радикалах жирных кислот

Рис 4 3 Разделение диэфиров лютеина лепестков цветков Tagetes sp Колонка. 250*4 мч, Кромасил-С18, 5 мкм Подвижная фаза ацетон - метанол (68 32 об %), 1 мл/мин, детектор 450 нм Важно, что лепестки бархатцев любой окраски (от желтой до оранжевой) содержат в качестве основных каротиноидов только диэфиры лютеина, поэтому удобны для использования для расчетов инкрементных соотношений. Найденные с использованием такого образца эфиров ксантофиллов инкременты могут быть использованы для поиска различных рядов гомологов в других, обычно более сложных смесях ксантофиллов, экстрагируемых из лепестков других цветков,

Неравенство однотипных (метиленовых) инкрементов для различных гомологических рядов в данной работе объяснено сольватационными эффектами В качестве основной причины указанных различий предлагается учесть особенности энтропии сольватации молекул сорбатов, что экспериментально подтверждается основным вкладом именно неравенства энтропийных составляющих свободных энергий переноса членов различных гомологических рядов. Сольватная оболочка членов гомологических рядов не гомогенна, поэтому энтропия сольватации сорбатов в подвижной фазе меньше по сравнению со случаем гомогенного распределения компонентов подвижной фазы на энтропию смешения сольватной оболочки. Показано также, что выводы, получаемые при таком допущении, качественно согласуются с экспериментальными данными. Тогда очевидно, что для различных рядов высоко липофильных гомологов метиленовая разность должна быть достаточно близкой.

Это положение было экспериментально подтверждено в настоящей работе при исследовании хроматографического поведения каротинидов различных природных объектов. Более того, оказалось, что внутри рядов гомологов соблюдалось подобие жирнокяслогного состава диэфиров, рис.4.5.

ю

15 Vм™

■ 1 1

Б | JL. V

Рис.4.5. Моделирование разделения диэфиров ксантофиллов в условиях ОФ ВЭЖХ Образец: смесь экстрактов лепестков цветков Senecio sp. и Tagetes sp. Условия: 250x4 мм, Кромасил С18, подвижная фаза CH3CN - CHjCOCHj 17:83 об., ) .0 мл/мин. Моделирование разделения диэфиров различных гомологов и Б - суммарной хроматограммы. На хроматограмме А выделены пики диэфиров лютеина и зеаксантина из экстракта 1

Справедливость предложенного выше подхода была подтверждена в настоящей работе также с использованием двухмерной хроматографии. Разделение сложной смеси в условиях нормально-фазовой ТСХ (на пластинах с силикагелем) определяется числом активных по отношению к образованию водородных связей полярных групп и практически не зависит от длины углеводородного радикала (для достаточно длинных радикалов). Поэтому возможно разделение ксантофиллов по числу функциональных групп - с последующей записью хроматограммы для гомологов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ. Например, для экстрактов плодов красного перца были получены «индивидуальные» хроматограммы диэфиров зеаксантина, капсантина и капсорубина - с близкими «метиленовыми» инкрементами, а также некоторых моноэфиров, с инкрементной разностью уже заметно (и предсказуемо) отличавшейся от полученной для диэфиров.

Существенно то, что для рядов веществ, с последовательным одинаковым изменением структуры, но не относящихся к одному ряду гомологов, названных в данной работе «псевдогомологами», равенство последовательных инкрементов, строго говоря, не очевидно.

К таким рядам можно отнести, например, ряд триацилглицидов: Оз, ЛСЬ, Л20 и Лз - от триолеата с последовательной заменой по одному радикалу олеиновой кислоты на радикал линолевой кислоты - до трилянолеата. Эти четыре вещества относятся к различным рядам гомологов. Но, как было показано ранее, абсциссы точки конвергенции в таком ряду (постепенное добавление одной двойной связи) изменяются на одинаковое значение.

тУ

100

ло

ло, л,с+

ЛОП О

л л

доступные рис 4 6

Тогда не трудно подсчитать, что при одинаковом изменении тангенса угла наклона линий относительного удерживания (вследствие одинакового

изменения сольватации молекул в подвижной фазе) инкременты в рассмотренном ряду должны также быть примерно равными. На этом основании инкрементный подход был применен для расчета состава триглицеридов, причем в качестве своеобразных стандартов для расчета инкрементов могут быть использованы повсеместно

дешевые растительные масла, например, подсолнечное масло,

ЛОС+ оп

10

15

V мин

Рис 4 6 Разделение триацилглицеролов

подсолнечного масла Колонка 250*4 мм, Диасфер-110-С18, 5 мкм, Элюент 10 об % ацетонитрила в ацетоне, 1 мл/мин

Таблица 4 1 Инкрементные соотношения между триглицеридами

подсолнечного масла

№ Состав ТАГ Параметр удерживания Инкременты

и, мин 1йк Д(Л—О) Д(0—П) Д(П—С)

1 Лз 8.21 0 464

2 Л20 9 95 0 573 0.109 (1-2)

3 Л2П 10.5 0 601 0 028 (2-3)

4 ло2 12 2 0 683 0 110(2-4)

5 Л2С 12 6 07 0 099 (3-5)

6 ЛОП 12 9 0.710 0 109 (3-6) 0 028 (5-6)

7 ЛПг 13.7 0 741 0 030 (6-7)

8 о3 15 1 0.791 0 109(4-8)

9 ЛОС 15 7 0 809 0 109 (5-9) 0 099 (8-9)

10 од 16.0 0 820 0 110(6-10) 0.028 (8-ю)

11 ЛПС 16.6 0.838 0 029 (9-п) 0 097(7-11)

12 02С 195 0 919 0.110(6-10) 0 099 (ю-12)

Найденный в данной работе состав триглицеридов всегда совпадал по порядку элюирования и по относительной интенсивности пиков на хроматограммах с описанным в литературе и полученным с использованием масс-спекрометрических детекторов В ряде случаев жирнокислотный состав подтверждали выделением фракций индивидуальных триглицеридов, омылением их и определением жирных кислот после получения фенацильных производных Присутствие в масле радикалов необычной кислоты X легко детектируется по сопоставлению инкрементов с данными, полученными при исследовании масел с известным составом. Например, масла семян калины и нигеллы дамасской имеют как одинаковые, так и различающиеся

триглицериды, табл 4.2. X - в данном случае радикал 1!-цис, 13-г/«с-эйкозеновой кислоты, довольно редкой, специфичной для нигеллы кислоты

Таблица 4 2. Параметры удерживания масел семян калины и нигеллы

Масло семян Инкременты

№ Состав калины нигеллы

U, мин 1кк Д(Л—>0) Д(Л-ОС) Д(0-*П) Д(П—С)

1 Л3 5 00 4 99 0211

2 Л2Х 5.47 0.274 0 063

3 Л20 5 70 5 69 0 299 0.089

4 Л2П 5.95 0.329 0.030

5 ЛОХ 6 30 0 365 0 065

6 Л02 6 57 6 55 0.389 0 089

7 ЛОП 6.89 0 419 0 030

8 0:Х 7 29 0.453 0 064

9 Оз 7 64 7 63 0.479 0 091

10 ЛОС 7 84 0.495 0 076

11 о2п 8 05 0.510 0 031

12 ОП2 8.54 0 544 0 033

13 о2с 9.24 0 587 0 077

14 опс 9.78 0.618 0 031

Глава 5 Методы стандартизации хроматографических систем

В данной главе рассмотрены важнейшие методы стандартизации хроматографических систем и предложены новые, основанные на методе ОАУ.

Для стандартизации удерживающей способности предлагается использовать пересечение линий относительного удерживания гомологов в одной точке - в точке конвергенции Например, для удерживания толуола, о-ксилола и псевдокумола" тенденция пересечения соответствующих прямых линий в одной точке очевидна для различных систем подвижных фаз, рис 5.1 и рис 5 2.

Общность линий трендов для алкилбензолов и вероятная их общность для обращенных фаз различных производителей позволяет ввести количественную шкалу гидрофобности колонок, основанную на свойствах пучка лучей, исходящих из одной точки Для этого в тестовую систему следует ввести не один состав подвижной фазы, а два, что позволит найти точку пересечения линий трендов гомологов, (хо,уо) на графике 1 ¿Цэтилбензол) vs lgк(толуол) (с координатной диагональю).

При этом количественная мера удерживающей способности колонки, CS (column strength), может быть найдена для некоторого, избранного в качестве стандартного, состава подвижной фазы по соотношению

CS = lg к(толуол) -у0 (5 1)

Очевидно, что для такого способа индексация удерживающей способности хроматографической системы (а при стандартизации подвижной фазы - стационарной фазы) следует стандартизовать и набор гомологов Кроме того в данном случае этот параметр не чувствителен также и к активности 36

остаточных силанольных групп, т.е. для стандартизации подходит любой набор гомологов вне зависимости от строения начального члена гомологического ряда.

/-толуол 2 — о-ксилол

3 - псевдокумод ' /у

1ЁЦ6сюол) -1 -0,5 //У/* 3 Ж'' ж "°'5

/У 'Ж /у? /У/ 0 1 '

Рис 5 1 Удерживание алкилбензолов относительно бензола Элюегсш системы СН)СЫ - Н20

Рис 5 2 Удерживание алкилбензолов относительно бензола Элюенты системы С2Н5ОН - НгО

Уравнение (5 1) предполагает использование координат точки конвергенции, которые получают экстраполяцией далеко за диапазон экспериментальных данных Но результаты экстраполяционной процедуры весьма чувствительны к погрешностям определения параметров базисных точек. С учетом равенств нулю логарифма «метиленовой селективности» в точках конвергенции и простых соотношений отрезков, получаемых пересечением лучей угла параллельными прямыми можно предложить иной подход к сопоставлению гидрофобности (СБ) колонок, заполненных различными стационарными фазами Для этого можно воспользоваться отношением однотипных инкрементов, найденных в одинаковых подвижных фазах.

СУ, _ МЛ-» Я)

СУ2 Д2(Л-> В) * ■)

Именно этот прием (уравнение 5 2, но без обоснования) был использован в работе15 для расчета относительных параметров гидрофобности различных обращенных фаз Возражение вызывает только выбор пар веществ - в качестве веществ В (отнесенных к «идеальным», при А - этилбензол) использованы не только другие алкилбензолы, но и полярные соединения, среди которых анизол и бензонитрил, чувствительность которых к полярным взаимодействиям со стационарной фазой легко подтверждается сопоставлением относительного удерживания соответствующих пар сорбатов.

Оценка активности остаточных силанольных групп Известно, что для полностью гидратированного силикагеля поверхностная концентрация силанольных групп составляет 4 8 групп/им2, а при модифицировании силикагелей монохлорсиланами плотность прививки якорных групп в лучшем случае лишь немногим превосходит 2 0 групп/нм2, т.е. более половины

исходных ОН-групп оказываются свободными в готовой обращенной фазе В общем случае остаточные силанольные группы проявляют активность в отношении разделяемых молекул, способных к образованию водородных связей Эта активность, которая во многом определяется условиями синтеза обращенных фаз, является одной из причин неэквивалентности (или некоторой невоспроизводимости) свойств готовых фаз не только для различных марок, но и среди различных партий одних и тех же марок сорбентов

Если для пар сорбатов, не склонных к образованию водородных связей общность относительного удерживания уже была продемонстрирована ранее, то аналогичный подход для пар веществ (фенол - анилин), склонных к образованию водородных связей, приводил иному результату, рис 5.3

Рис 5 3 Удерживание анилина относительно Рис 5 4 Удерживание анилина относительно фенола фенола на двух стационарных фазах

1 - данные полученные для одной колонки в трех 1 - с и 2 - без эндкеппинга

различных составах элюеита, 2 — координатная биссектриса, (* ) -данные из работы"

С использованием двух стационарных фаз (Диасфер-110-С18) с и без эндкеппинга было установлено, что включение полярных взаимодействий хорошо аппроксимируется параллельным переносом прямых линий на графике относительного удерживания, рис 5 4 При этом найдено, что,

• во-первых, более чувствительной (по сравнению с парой «фенол-анилин») является, например, пара сорбатов «^-крезол - р-толуидин»;

• во-вторых, более полная характеристика может быть получена при использовании пары сорбатов, один из которых обязательно относится к малополярным,

• в-третьих, предложен и подробно исследован иной подход, свободный от неопределенности, связанной с неучетом различий в мольных соотношениях сопоставляемых стационарных фаз по изложенному выше подходу

Глава 6. Общие вопросы обращенно-фазовой ВЭЖХ

В главе рассмотрены два общих вопроса, касающиеся теории обращенно-фазовой ВЭЖХ.

^ЗАпЛ А.ЗгереэуЬ 1П СЬгота1оцг А 1998 у 818 Р 1-17 38

О механизмах удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ В данной главе известный в литературе метод сопоставления свойств различных стационарных фаз, модифицирован специальным выбором сорбатов для получения прямых ответов на поставленные вопросы Предлагается использовать несколько различных стационарных фаз, некоторые из которых построены на одной и той же силикагелевой матрице, но отличаются длиной привитого алкильного радикала кремнийорганического модификатора, а некоторые должны быть построены на другой силикагелевой матрице (для наблюдения за ролью удельной поверхности или пористости)

Логарифмическая форма уравнения (1 4) для удерживания сорбата (/) на стационарной фазе А, к(1,А), при данном составе подвижной фазы имеет вид:

(6 1)

При том же составе подвижной фазы на другой стационарной фазе, В-

1 ёк(,,В)= IВКЛ0.В)* (6.2)

Эквивалентность химических свойств стационарных фаз А и В обозначает равенство термодинамических констант уравнений (6 1) и (6 2), поэтому исключением этих членов, получаем простое соотношение.

Л(тр) И(тр)

Логарифмы мольных соотношений могут быть не равными, особенно, если стационарные фазы синтезированы на различных силикагелевых матрицах. При изменении состава подвижных фаз логарифмы мольных соотношений сопоставляемых колонок пропорционально изменяются, поэтому их разность превращается в константу (а), так что следует предполагать прямолинейную зависимость удерживания сорбата г на стационарной фазе В относительно стационарной фазы А'

ШиВ)-- а+\%к{1,А). (6 3)

Если хроматографическое поведение вещества / на стационарной фазе В отличается от поведения на стационарной фазе А, то в простейшем случае можно предположить масштабирование термодинамической константы распределения с коэффициентом р

Подставим это соотношение в уравнения (6.1) и (6.2) и исключим термодинамическую константу, получая соотношение-

А'(тр)

Несмотря на то, что при этом разность членов, связанных с мольными соотношениями колонок, уже не полностью компенсируется при изменении составов подвижных фаз, относительное изменение удерживания вещества на колонке В по сравнению с колонкой А может быть представлено в линейной форме по уравнению 6.4-

а+6 \gkO.A) (6.4)

Основание такого предположения - обычно близкая к линейной зависимость фактора удерживания сорбата от состава подвижной фазы В уравнении (6 4) константа Ь учитывает не только масштабирование термодинамической константы распределения при переходе от фазы А к фазе В (р), но и некоторое изменение разности фазового соотношения при изменении составов подвижных фаз

Для сильно полярных соединений, вероятность погружения которых в глубь обращенной фазы мала, следует ожидать независимости сорбционных характеристик стационарных фаз от длины привитого радикала Это должно соответствовать Ъ s 1 в координатах уравнения (6 4), и примерному постоянству а для стационарных фаз, построенных на одних и тех же силикагелевых матрицах и, наоборот, другому значению а при переходе к фазам, построенным на других матрицах. При использовании резвератрола (транс-3,5,4'-тригидроксистильбена), который по строению не должен внедряться в стационарную фазу, действительно, получены результаты, соответствующие высказанным предположениям

[gk(i,СА)= 0 888 lg£(i,C18)- 0066, lgk(i,C8)= 0928 lgi(i,C18)- 0 062 Здесь С4 (бутильная) и С8 (октальная) фазы построены на одном и том же силикагеле (марка Диасорб), а фаза С18 (октадецильная) - на другом (марка Диасфер). Отклонение от единицы соответствующего коэффициента может быть связано с усиливающимся влиянием остаточных силанольных групп или поля полярного силикагеля с уменьшением толщины углеводородного слоя на поверхности. Близкие интерсепты свидетельствуют о примерно одинаковой удельной поверхности сорбентов, построенных на Диасорбе, при этом существенно отличающейся от удельной поверхности для сорбента на основе Диасфера

Триглицеридами называются сложные эфиры глицирина и высших жирных кислот, составляющие (как правило) основу масел семян растений Трнглицериды относятся к сильно гидрофобным веществам - они не растворяются не только в воде, но даже и в ацетонитриле Для них проникновение молекул внутрь иммобилизованной обращенной фазы кажется весьма вероятным, тогда удерживание триглицеридов может зависеть от длины иммобилизованного углеводородного радикала.

Удерживание трех основных триглицеридов масла - Лз - трилинолеата, Л20 - дилинолеат-олеата и Л02 - линолеат-диолеата, на использованных фазах в этом случае оказалось весьма различным, если состав подвижной фазы хорош (факторы удерживания в диапазоне 4-10) для разделения триглицеридов на С18 - фазе, то в том же составе подвижной фазы удерживание триглицеридов на колонках С8 и С4 было небольшим При снижении элюирующей силы подвижной фазы до достижения приемлемых факторов удерживания по триглицеридам на фазе С4 (или С8) удерживание этих сорбатов на фазе С18 становилось слишком большим с заметным искажением форм пиков

Это неудобно в первую очередь тем, что велика погрешность определения параметров удерживания сорбатов по крайней мере на одной из

сопоставляемых колонок Результаты исследований, выполненных с использованием ацетон - ацетонитрильных фаз, суммированы в уравнениях.

!g*№,C4)= 0570 lg Л3, С18) - 0 637; )%к(Л3,СЩ= 0 680 1ёА(Л3,С18)- 0 379. lg*(-tf20,C4)= 0620 lgк(Л2О,CIS) - 0 722; lg*(J720,C8) = 0746 \%к(Л20,СЩ- 0481. 1ёк(Л02,С4)? 0635 \%к(Л02,СЩ- 0 706; 1^/с(Л02,С8) = 0 764 \^к{Л02,СЩ- 0 450.

В данном случае тангенсы углов наклона прямых линий весьма далеки от единицы, причем они уменьшаются при переходе от С18 к С4 - фазе Это находится в полном соответствии с высказанным выше предположением о проникновении молекул в объем стационарных фаз Более того, анализ полученных результатов показал, что по величине параметра b можно установить длину привитого радикала по линейной зависимости между этими параметрами.

Существенно, что исследование хроматографического поведения пары «толуол - этилбензол» на этих же стационарных фазах показало нечувствительность относительного удерживания к длине привитого радикала стационарной фазы

Роль и место CLOGP в ОФ ВЭЖХ В поисках взаимосвязи между удерживанием вещества в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ (или ТСХ) и его биологической активностью или его строением (QSRR или QSAR) большое значение уделяется корреляции между величинами удерживания веществ и логарифмами коэффициентов распределения этих веществ (logP) между 1-октанолом и водой Для полуэмпирического расчета этого параметра предложено несколько программных продуктов, в том числе CLogP, SciLogP, KOWWIN, XLogP, ACD/LogP и ряд других. При этом корреляцию между параметрами ищут в простейшем случае в виде линейной зависимости'323

Ig*(i) = ai b logPO)24 (6.5)

или

logp(0= Я+ b \gk(i) (6 6)

Однако, надежность такого метода не высока, что не удивительно Например, хорошо известно, что для ряда веществ наблюдается инверсия порядка элюирования при изменении состава подвижной фазы (даже без изменения состояния ионизации), которая не может быть предсказана по уравнениям (6 5) и (6 6) поскольку LogP = const. Стандартизация условий в виде аппроксимации времен удерживания на чисто водные подвижные фазы7, кажется частично оправданной. Но возникают, например, проблемы в надежности аппроксимации, поскольку данные для водно-метанольных и водно-ацетонитрильных элюентов различаются7, мягко говоря, существенно. Метод быстрого градиента25 также является оригинальной стандартизацией без использования экстраполяции

11 Cunha S С, Ohveira МБРР //FoodChem 2006 v95 Р 518-524

м logP (вместо lgР) - общепринятое в иностранной литературе обозначение десятичного логарифма

коэффициента распределения вещества между октаколом-1 и водой

" Donovan S F, Pecsatore М С // J Chromatogr А 2002 V952 Р 47-61

Параметры удерживания группы гомологов (^¿(А,)), построенных на некоторой основе А (А1, Аг, .А„), в зависимости от линеаризованной функции состава подвижной фазы укладываются на прямые линии (для удерживания при различных соотношениях компонентов выбранной системы подвижной фазы, например, метанол - вода), которые пересекаются в одной точке - точке конвергенции Тогда, выполнение соотношения (6 5) и (6 6) эквивалентно выполнению в некотором гипотетическом (*) составе подвижной фазы другого соотношения:

£огР(г)= (6.7)

В работе обсуждаются возможные причины неравенства нулю параметра а*, в том числе и в зависимости от типа органического модификатора подвижной фазы Так, экспериментально было подтверждено, что для хроматографического метода определения 1о§Р не рекомендуется систему метанол - вода заменять на систему ацетонтрил - вода28, действительно, для ацетонитрила пренебрежение яг-взаимодействиями (отсутствующими в случае 1-октанола) вряд ли можно считать обоснованным Во ест между веществами существует соотношение.

(6 8)

то, подставляя параметры из уравнения (6 8) в уравнение (6 7), получаем

а+ Ъ а*(Ь- 1) (6 9)

Если а* невелико или равно нулю, то точка, определенная по уравнению 6 9 принадлежит прямой по уравнению 6 8' Это предположение является основой предлагаемого в данной работе нового метода, который не включает аппроксимаций по сложным криволинейным законам и для получения результата требует чрезвычайно ограниченный набор экспериментальных результатов — достаточно данных, полученных в двух (') составах подвижных фаз Обратная сторона метода при его справедливости - для построения графика относительного удерживания достаточно данных, полученных в одном составе подвижной фазы' Отметим, что при заранее известных координатах точек конвергенции - вообще не нужны предварительные экспериментальные данные

На рис 6 1 приведены линии трендов для удерживания толуола и этилбензола относительно бензола, построенные по литературным данным3 Все данные по 1о§Р, использованные в данной работе, получены интерактивным расчетом на сайте httptfH6.l07.217 178ЛаЬ/а1оср5^

Отклонение линий трендов от точек Ьо!*Р* не превышает 2,5 % Что не так уж и велико, если учесть известные сложности в экспериментальном определении 1о£»Р и заметный разброс экспериментальных значений для одного и того же соединения Кстати, из набора данных по удерживанию 32 веществ, не относящихся к одному ряду гомологов, представленных в работе3, хорошее (с погрешностью не более 2,5 %) совпадение линий трендов с точками Ъо^Р* получено для 10 веществ при использовании в качестве реперного соединения бензола

Известно, что основной проблемой при работе с обращенными фазами являются остаточные силанольные группы сорбента. Это является причиной большого расхождения между расчетными и табличными значениями LogP для полярных веществ (в диапазоне от 20 до 50 %) при использовании в качестве вещества сравнения бензола. Однако, при замене бензола на бензиловый спирт (или введением поправки на полярное взаимодействие) о 1 ^(бензол) достигнуто отличное совпадение

Рис 6 1. Удерживание веществ хроматографических и экспериментальных относительно бензола значений LogP для полярных соединений.

Глава 7 Некоторые аспекты применения метода теоретических тарелок в хроматографии

Данная глава посвящена исследованию применения компьютерного моделирования хроматографического процесса для решения целого ряда фундаментальных вопросов. В основе моделирования использована методология пошаговой модификации в варианте метода теоретических тарелок. Особенностью разработанного подхода стала возможность моделирования процессов в условиях любого профиля градиента подвижной фазы при любой криволинейной зависимости удерживания от состава подвижной фазы. В главе рассмотрены и подтверждены методом моделирования некоторые аспекты инкрементных характеристик в условиях градиентного элюирования а также методы определения эффективности в жидкостной хроматографии в том числе при асимметрии пиков вследствие нелинейности изотерм адсорбции.

Глава 8 Применение метода АОУ и инкрементного подхода Данная обширная глава посвящена практическому приложению предложенных в работе методологий

Вначале с позиций ОАУ и инкрементного подхода рассмотрено хроматографическое поведение триглицеридов растительных масел и жирных кислот, их образовавших Показано достаточно строгое выполнение инкрементных и межинкрементных соотношений, отличающихся большей общностью по сравнению с традиционно используемым в мировой практике подходом (различные варианш эквивалентных углеродных чисел) Тщательный анализ полученных инкрементов в данном случае показал высокий потенциал метода в отношении взаимосвязи структура - удерживание. Метод ОАУ позволил предложить чисто хроматографический способ определения числа двойных связей в молекуле триглицерида При этом показано, что инкрементных подход позволяет рассчитывать триглицеридный состав масел без использования догостоящего оборудования Показана также возможность

предсказания изменения удерживания триглицеридов при изменении положения двойных связей по инкрементному подходу. Прикладная значимость работы в этом отношении состоит в обнаружении источников эссенциальных жирных кислот (включая кислоты с конъюгированными двойными связями) среди растений Белгородской флоры

Затем рассматривается хроматографическое поведение каротиноидов При этом акцент сделан на ксантофиллы, имеющие особое значение в настоящее время как профилактические и лечебные субстанции В растениях Белгородской флоры обнаружены богатые источники лютеина, зеаксантина, астаксантина и некоторых других каротиноидов Показано хорошее выполнение инкрементных соотношений, позволяющее проводить идентификацию компонентов сложных смесей без предварительного омыления Полученные выводы подтверждены использованием двухмерной хроматографии

Наконец, большое внимание уделено исследованию хроматографического поведения антоцианов, вызывающих все больший интерес, как натуральные красители с широким спектром лечебного действия Установлены стандартные и необычные инкрементные соотношения, позволяющие выполнять анализ сложных смесей без труднодоступных стандартных веществ но с использованием данных, полученных в других лабораториях мира и найденных закономерностей удерживания В исследованиях по данному направлению также определены наиболее важные источники антоцианов среди растений Белгородской флоры

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

I Показано, что введение модифицированного аргумента ДФ) (функции состава подвижной фазы) позволяет линеаризовать зависимость удерживания всех сорбатов исследуемой выборки, от Л®) в условиях обращено-

фазовой хроматографии

2. Впервые представлены основные положения метода относительного анализа удерживания (ОАУ), особенность метода - уход от прямой взаимосвязи параметров удерживания каждого индивидуального соединения от состава подвижной фазы Линейность удерживания всех сорбатов относительно одного из них, выбранного в качестве реперного, позволяет сократить до минимума (до набора данных для двух составов подвижных фаз) необходимый базис данных для построения карты разделения сорбатов сложных смесей Характер соотношений относительного удерживания позволяет проводить предварительную классификацию сорбатов и сопоставлять свойства органических модификаторов подвижных фаз

3 На основе найденных закономерностей предложен системный подход к использованию инкрементов и инкрементных соотношений как альтернатива существующим вариантам (281111. Предложен также усовершенствованный подход к расчету и использованию логарифма распределения вещества между октанолом-1 и водой в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4 Разработаны системные методы стандартизации стационарных фаз и сорбатов по гидрофобности и по активности остаточных силанольных групп в обращенно-фазовой ВЭЖХ

5. Предложена оригинальная методология выяснения механизма удерживания сорбатов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ, основанная на сопоставлении удерживания липофильных (с длинноцепочечными радикалами) и гидрофильных сорбатов на наборе стационарных фаз с изменяющейся длиной алкильных радикалов.

6 Использование компьютерного моделирования хроматографических процессов впервые позволило сопоставить инкрементиые соотношения в градиентных и изократических условиях а также предложить альтернативный вариант исследования причин уширения пиков. Предложены формулы для расчета эффективности хроматографических систем в условиях относительно большого объема вводимой пробы, и в случае асимметричных пиков

7 В рамках установления количественной взаимосвязи между строением и свойством сорбатов исследованы частные инкрементные и межинкрементные соотношения на примере удерживания триглицеридов, жирных кислот, каротиноидов и антоцианов. Предложен хроматографический метод, построенный на методологии метода ОАУ, позволяющий определять число двойных связей в радикалах кислот триглицеридов и предсказывать удерживание триглицеридов Предложена система распознавания состава диэфирных фракции ксантофиллов, экспериментально подтвержденная методом двухмерной хроматографии Найдены основные закономерности элюирования антоцианов в условиях изократической ОФ ВЭЖХ, позволяющие с высокой эффективностью устанавливать состав многокомпонентных смесей

8 Применение предложенного метода анализа хроматографического поведения веществ позволило без использования труднодоступного оборудования выявить среди растений Белгородской флоры богатые источники биологически активных веществ, эссенциальных и конъюгированных жирных кислот, эфиров важнейших ксантофиллов - лютеина, зеаксантина и астаксантина, и антоцианов, возможное использование которых - медицинская и пищевая промышленности, кормление животных (птицеводство) для реализации программы пищевого дизайна

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Результаты данной работы опубликованы в более чем 100 публикациях (доложены на 22 конференциях и симпозиумах), из них в журналах, рекомендованных ВАК

1 Дейнека В И, Староверов В М, Фофанов Г М, Балятинская Л Н Инкрементный подход при определении состава триглицеридов // Хим -фарм ж 2002, ТЗб №7 С 44-47

2 Дейнека В И, Фофанов Г М, Хлебников В А, Балятинская Л Н Инкрементный подход в расчете жирнокислотного состава триглицеридов // Хранение и переработка сельхозсырья 2002 №11 С 20-23

3 Дейнека В И, Дейнека Л А , Габрук Н.Г Фофанов Г М, Манохина Л А , Свдельникова Н А Анализ растительных масел с использованием ВЭЖХ // Ж. аналит, химии 2003. Т 58 №12 С 1294-1299

4 Дейнека В И, Григорьев А М, Староверов В М, Борзенко О Н Инкрементный подход в анализе антоцианов//Химия природн соединен 2003 №2 С 137-139

5 Дейнека В И Эффективность хроматографических колонок в ВЭЖХ // Ж. физ химии 2004 Т 78 №1 С 144-147

6 Дейнека В И, Григорьев А М Относительный анализ удерживания гликозидов цианидина // Ж физ химии 2004 Т 78 №5 С 923-926

7 Дейнека В И, Савотченко С Е, Фофанов Г М, Балятинская J1Н Метод компьютерного моделирования процесса в ВЭЖХ с градиентным элюированием компонентов сложных смесей IIЖ физ химии 2004 Т 78 №11 С 2054-2058

8 Дейнека ВИ, Григорьев AM Определение антоцианов методом ВЭЖХ Некоторые закономерности удерживания // Ж аналиг химии 2004 Т.59 №3. С 305-309

9 Дейнека В И, Дейнека ЛЛ., Фофанов Г М, Балятинская Л Н Идентификация жирных кислот в составе триглицеридов масел семян растений с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ//Растит ресурсы 2004 Т40 №1 С 104-112

10 Дейнека В И, Григорьев А М, Борзенко О Н, Староверов В М, Трубицын М.А ВЭЖХ в анализе антоцианов исследование цианидиновых гликозвдов плодов растений рода Prunus // Хим -фарм ж 2004 Т38 №8 С 29-31

11 Дейнека ВИ, Дейнека Л А Анализ растительных масел методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии // Ж. аналит химии 2004 Т59 №9 С 895-898

12 Дейнека В И, Григорьев А М Исследование удерживания антоцианов в элюентах системы ацетонитрил - муравьиная кислота - вода И Ж физ химии 2005 Т 79 №5 С 900-903

13 Дейнека В И , Григорьев А М , Дейнека Л А, Ермаков А М, Сиротин А А, Староверов В М Анализ компонентного состава антоцианов плодов и жирных кислот масел семян некоторых видов семейства Rosaceae методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Растительные ресурсы 2005 Вып 1 С 91 -98

14 Дейнека В И Экспериментальное обоснование метода относительного анализа удерживания в ВЭЖХ//Ж физ химии 2006 Т80 №3 С 507-510

15 Дейнека В И Карта хроматографического разделения и инкрементные зависимости в методе относительного анализа удерживания в ВЭЖХ // Ж физ химии 2006 Т 80 №3 С 511-516

16 Дейнека В И Метод относительного анализа удерживания в ВЭЖХ Сопоставление инкрементных зависимостей //Ж физ химии 2006 Т80 №4 С 704-708

17 Дейнека В И Метод относительного анализа удерживания в ВЭЖХ и термодинамика процессов разделения//Ж физ химии 2006 Т 80 №7 С 1333-1335

18 Дейнека В И Метод анализа относительного удерживания в ВЭЖХ Определение, применения и роль параметра IgP системы н-октанол - вода // Ж физ химии 2006 Т 80 №6 С 1083-1088

19 Дейнека В И, Григорьев А М, Дейнека Л А, Шапошник Е И , Староверов В М Исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее основе // Зав лаб 2006 №3 С 16-20

20 Дейнека В И, Дейнека Л А Инкрементный подход в анализе каротиноидов методом ОФ ВЭЖХ Разделение диэфиров ксантофиллов II Сорбц и хроматограф процессы 2006 Т 6 №3 С 366-375

21 Дейнека В И Некоторые термодинамические аспекты поведения веществ в условиях обращенно-фазовой хроматографии // Сорбц и хроматограф процессы 2006 Т 6 №4 С. 571-580

22 Дейнека В И Метод относительного анализа удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ Стандартизация колонок//Сорбц и хроматограф процессы 2006 Т.6 №4 С 596-601

23 Дейнека В И Гидрофобность стационарных фаз и сорбатов в обращенно-фазовой ВЭЖХ //Сорбц ихроматогр процессы 2006 Тб Вып6 ч4 С 1439-1449

24 В И Дейнека Оценка влияния остаточных силанольных ipynn на суммарное удерживание в обращенно-фазовой хроматографии // Ж физ химия 2007. Т 81 №3 С 473-476

25 Дейнека В И Метиленовая селективность в условиях обращенно-фазовой хроматографии одного ряда гомологов // Сорбц и хроматогр процессы 2007 Т 7 Вып 2 С 236-243

26 Дейнека В И Новый метод оценки влияния остаточных силанольных групп на суммарное удерживание в обращенно-фазовой ВЭЖХ // Ж аналит химии 2007 Т 62 №7 С 740744

27 Дейнека В И Моделирование формы хроматографического пика по методу теоретических тарелок /УЖ физич химии 2008 Т82 №1 С 120-124

28 Дейнека В И , Габрук Н Г, Дейнека Л А, Манохина Л А Триглицеридный состав масел косточек семи родов семейства розовых // Химия природн соединен 2002 №5 С 333335

29 Дейнека В И, Дейнека Л А Исследование триглицеридного состава масла Pinns Sibirica Du Tour II Химия природн соединен 2003 Ш С 126-128

30 Дейнека В И , Маслов А М, Борзенко О Н, Сиротин А А, Дейнека Л А Изменение триглицеридного состава масел семян Cucurbitaceae и Taraxacum officinalis по мере созревания//Химия природных соединений 2003 №4 С 255-256

31 Дейнека В И, Маслов А В , Староверов В М, Дейнека Л А Исследование масел из семян растений семейства Cucurbitaceae //Масложировая промышленность, 2003 №1 С 34-35

32 Дейнека В И, Григорьев А.М, Староверов В М , Сиротин А А Основные антоцианы некоторых растений семейства Grossulariaceae // Химия природных соединений 2003 №4 С 324-325

33 Дейнека В И, Григорьев А М, Староверов В М, Фесенко В В. Основные антоцианы лепестков семи сортов Tuhpa // Химия природных соединений 2003 №5 С 414

34 Дейнека В И, Григорьев А М, Ермаков А М Антоцианы некоторых растений Белгородской флоры//Химия природных соединений 2003 №5 С 412-413

35 Дейнека В И Триглицеридный состав масел семян некоторых растений // Химия природных соединений 2003 №6 С 433-436

36 Deineka VI, Deineka L A Triglyceride Types of Seed Oils I Certain Cultivated Plants of the Solanaceae Family // Chemistry of Natural Compounds 2004 V40 №2 P 184-185

37 Deineka VI, Deineka L A Type Composition of Triglycerides from Seed Oils II Triglycerides from Certain Cultivated Plants of the Rosaceae Family II Chemistry of Natural Compounds 2004 V 40 №3. P 293-294

38 Deineka VI, Sirotin A A , Ospishcheva N V Type Composition of Triglyceride Seed Oils III Triglycerides from Certain Plants of the Ranunculaceae Family II Chemistry of Natural Compounds 2004 V 40 № 3 P 295-296

39 Дейнека В И, Хлебников В А, Симаков С В , Шапошников А Ю , Савотченко С Е Обращенно-фазовая ВЭЖХ некоторых производных индола // Ж физ химии 2004 Т 78 №10 С 1886-1890

40 Староверов В М, Дейнека В И, Григорьев А М, Прохода Е Ф, Покровский М В , Иванов В В ВЭЖХ-анализ водорастворимых витаминов в составе поливитаминного сиропа «Олиговит» // Хим -фарм ж 2004, Т 38. №3 С 54-56

41 Дейнека ВИ, Григорьев AM, Староверов ВМ ВЭЖХ в исследовании фтавоноидов Определение рутина II Хим.-фарм ж 2004 Т38 №9 С 31-33

42 Владимиров В Л, Шапошников А А, Дейнека Д В , Вострикова С И, Дейнека В И Исследование каротиноидного состава желтка куриных яиц Н Доклады РАСХН 2005 №6 С. 46-48

43 Deineka VI, Sorokopudov V N, Deineka L A , Shaposhmk EI, Koltsov S V Anthocyans from Fruit of Some Plants of the Caprifoliaceae Family // Chemistry of Natural Compounds. 2005 v41.№2 P. 162-164

44 Demeka VI, Deineka LA, Sirotm A.A Anthocyans from Fruit of Certain Plants of the Genus Prunus И Chemistry of Natural Compounds 2005 v41 №2 P 230-231

45 Сорокопудов В H, Хлебников В А, Дейнека В И Антоцианы некоторых растений семейства Berberidaceae // Химия растительного сырья 2005 №4 С 57-60

46 Сорокопудов В Н, Дейнека В И, Лукина И П , Дейнека Л А Антоцианы плодов некоторых видов рода Rubus L из коллекции ботанического сада БелГУ II Химия растительного сырья 2005 №4 С 61-65.

47 Дейнека В И, Дейнека Л А, Шапошник Е И, Сорокопудов В Н Сиротин А А Антоцианы черной смородины экстракция и сушка II Известия Вузов Сер Химия и химическая технология 2006 Т 49 выл 11 С 77-80

48 Сорокопудов В Н, Хлебников В А, Дейнека В И Опыт интродукции магонии падуболистной и перспективы ее использования//Вестник РАСХН 2006 №3 С 35-36

49 Дейнека Л А., Сорокопудов В Н, Дейнека Л А , Сиротин А А, Шапошник Е И, Головков А В Антоцианы плодов растений опыт экстракции и сушки II Хранение и переработка сельхозсырья. 2006 №4 С 28-31

50 Дейнека В И, Дейнека Л А Кедровое масло (масло семян Ptnus sibinca) анализ и установление фальсификации методом ВЭЖХ И Химия растительного сырья 2006 №3 С 21-26

51 Дейнека В И, Сиротин А А, Дейнека Л А , Сиротина С С, Шаркунова НА Сезонная динамика накопления астаксантина в лепестках Adorns aestivalis (Ranunculáceas) при выращивании в условиях черноземной зоны России (г Белгород) // Растительные ресурсы 2007 Т43 №4 С 75-82

52 Дейнека В И , Хлебников В А, Перистый В А, Гостищев И А, Проворная Т В Особенности хрочатографическоло поведения берберива в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ // Сорбц и хроматогр процессы 2007 Т7 Вып2 С 228-235

53 Дейнека В И, Лебедева О Е, Лазебная М А, Анисимович И П Сорбция солей органических азотистых оснований на глинистых минералах II Сорбц и хроматогр процессы 2007 Т 7. Вьш 3 С 473-480

54 Дейнека В И, Сорокопудов В Н, Дейнека Л А, Третьяков М Ю Исследование цветков Tagetes sp как источника лютеина // Хим -фарм ж 2007 Т.41 №10 С 30-32.

55 Дейнека В И, Хлебников В А , Чулков А Н , Дейнека Л А, Перистый В А , Сорокопудов В Н Антоцианы и алкалоиды Особенности сорбции природными глинистыми минералами//Химия растительного сырья 2007 №2 С 63-66

56 Дейнека В И «Распределение или адсорбция» как основная дилемма ОФ ВЭЖХ II Ж физ химии 2008 т 82 №6 С 1028-1032.

57 Дейнека В И, Дейнека Л А, Анисимович И П, Перистый В А , Туртыгин А В Использование обращенно-фазовой ВЭЖХ в установлении подлинности жиров и масел // Зав лаб 2008. Т 74. №3 С 15-19

58 Дейнека В И, Дейнека Л А, Туртыгин А В Обращенно-фазовая ВЭЖХ триацилглицеролов масел таману и ши //Масложировая промышленность, 2008 №1 С 17-19

59 Дейнека В И, Хлебников В А , Сорокопудов В Н, Анисимович И П Хлорогеновая кислота плодов и листьев некоторых растений семейства Berberidaceae П Химия растительного сырья. 2008 Na 1 С 57-61

60 Дейнека В И, Сорокопудов В Н, Дейнека Л А , Третьяков М Ю, Фесенко В В Исследование плодов Physalis alkekengi L как источника ксантофиллов II Хим -фарм Журнал 2008 Т 42 № 2 С 36-37

Подписано в печать 12 05 2008 Формат 60x84/16 Гарнитура Times Уел п л 2 0 Тираж 100 экз Заказ 112 Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в издательстве Белгородского государственного университета 308015 г Белгород, ул Победы, 85

Список сокращений и обозначений

Введение

Основные выводы

1. В работе показано, что введение модифицированного аргумента ДФ) (функции состава подвижной фазы) позволяет линеаризовать зависимость удерживания всех сорбатов исследуемой выборки, от ДФ) в условиях обращено-фазовой хроматографии.

2. Впервые представлены основные положения метода относительного анализа удерживания (ОАУ), особенность метода - уход от прямой взаимосвязи параметров удерживания каждого индивидуального соединения от состава подвижной фазы. Линейность удерживания всех сорбатов относительно одного из них, выбранного в качестве реперного, позволяет сократить до минимума (до набора данных для двух составов подвижных фаз) необходимый базис данных для построения карты разделения сорбатов сложных смесей. Характер соотношений относительного удерживания позволяет проводить предварительную классификацию сорбатов и сопоставлять свойства органических модификаторов подвижных фаз.

3. На основе найденных закономерностей предложен системный подход к использованию инкрементов и инкрементных соотношений как альтернатива существующим вариантам С)8И1. Предложен также усовершенствованный подход к расчету и использованию логарифма распределения вещества между октанолом-1 и водой в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4. Разработаны системные методы стандартизации стационарных фаз и сорбатов по гидрофобности и по активности остаточных силанольных групп в обращенно-фазовой ВЭЖХ.

5. Предложена оригинальная методология выяснения механизма удерживания сорбатов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ, основанная на сопоставлении удерживания липофильных (с длинноцепочечными радикалами) и гидрофильных сорбатов на наборе стационарных фаз с изменяющейся длиной алкильных радикалов.

6. Использование компьютерного моделирования хроматографических процессов впервые позволило сопоставить инкрементные соотношения в градиентных и изократических условиях а также предложить альтернативный вариант исследования причин уширения пиков. Предложены формулы для расчета эффективности хроматографических систем в условиях относительно большого объема вводимой пробы, и в случае асимметричных пиков.

7. В рамках установления количественной взаимосвязи между строением и свойством сорбатов исследованы частные инкрементные и межинкрементные соотношения на примере удерживания триглицеридов, жирных кислот, каротиноидов и антоцианов. Предложен хроматографический метод, построенный на методологии метода ОАУ, позволяющий определять число двойных связей в радикалах кислот триглицеридов и предсказывать удерживание триглицеридов. Предложена система распознавания состава диэфирных фракций ксантофиллов, экспериментально подтвержденная методом двухмерной хроматографии. Найдены основные закономерности элюирования антоцианов в условиях изократической ОФ ВЭЖХ, позволяющие с высокой эффективностью устанавливать состав многокомпонентных смесей.

8. Применение предложенного метода анализа хроматографического поведения веществ позволило без использования труднодоступного оборудования выявить среди растений Белгородской флоры богатые источники биологически активных веществ: эссенциальных и конъюгированных жирных кислот, эфиров важнейших ксантофиллов -лютеина, зеаксантина и астаксантина, и антоцианов, возможное использование которых -медицинская и пищевая промышленности, кормление животных (птицеводство) для реализации программы пищевого дизайна.

Заключение

1. Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000. - 469 с.

2. Meka Р.К., Tripathi V., Singh R.P. Synthesis of biodiesel fuel from safflower oil using various reaction parameters // J. Oleo Sci. 2007. v.56. P. 9-12.

3. Yang В., Kallio H. Analysis of triacylglycerols of seed and berries of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) of different origins by mass spectrometry and tandem mass spectrometry // Lipids. 2006. v.41. P. 381-392.

4. Manninen P., Laakslo P. Capillary supercritical fluid chromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry of triacylglycerols in berry oils // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1997. v.74. P. 1089-1098.

5. Miyake Y., Yokomizo K., Matsuzaki N. Determination of unsaturated fatty acid composition by high-resolution nuclear magnetic resonsns spectrometry // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1998. v.75. P. 1091-1094.

6. Sato Т., Uezono I., Morishita Т., Tetsuka T. Nondestructive estimation of fatty acid composition in seeds of Brassica napus L. by near-infrared spectroscopy // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1998. v.75. P. 1877-1881.

7. Умаров А.У., Мирзабаева M. Масло косточек Cerasus vulgaris и С. erythracarpa И Химия природы, соединен, 1970. №6. С. 756-757.

8. Ozgtil-Yucel S. Determination of conjugated linolenic acid content of selected oil seeds grown in Turkey // J. Amer. Oil Chem. Soc. 2005. v.82(12). P. 893 897.

9. Tsevegsiiren N., Aiyzetmiiller K. y-Linolenic and stesridonic acids in Mongolian Boragineceae II J. Amer. Oil Chem. Soc. 1996. v.73. P. 1681-1684.

10. Wolff R.L., Christie W.W., Coakley D. Bishomopinolenic (7,11,14-20:3) acid in Pinaceae seed oils // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1997. v.74. P. 1583-1586.

11. Болотов B.M., Рудаков О.Б. Химические пути расширения эксплуатационных свойств природных красителей из растительного сырья России. // Химия растительного сырья. 1999. №4. С. 35-40

12. Muth E.R., Laurent J.M., Jasper P. The effect of bilberry nutritional supplementation on night visual acuity and contrast sensitivity. // Altern. Med. Rev. 2000. v.5. P. 164-169

13. Renaud S., Delorgeril M. Wine, alcohol, platelet, and the French paradox for coronary heart disease. // Lancet i. 1992. P. 1523-1526

14. Dorsey J.G., Dill K.A. The molecular mechanisms of retention in reversed-phase liquid chromatography // Chem. Rev. 1989. v.89. P. 331-346.

15. Yailaya A., Horvath C. Retention in reversed-phase chromatography: partition or adsorption? //J. Chromatogr. A. 1998. v.829. P. 1-27.

16. Horvath C., Melander W., Molnar I. Solvophobic interactions in liquid chromatography with nonpolar stationary phases // J. Chromatogr. 1976. v.125. P. 129-156

17. Ко J., Ford J.C. Comparison of selected retention models in reversed-phase liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2001. v.913. P. 3-13

18. Sentell K.B., Dorsey J.D. Retention Mechanisms in the Reversed-Phase Chromatography. Stationary Phase Bonding Density and Solute Selectivity // J. Chromatogr. 1989. v.461. P. 193207

19. Dzido Т.Н. Modifier influence on selectivity of reversed-phase HPLC systems. // J. Liq. Chrom. RT. 2000. v.23. P. 2773-2788

20. Nikitas P., Pappa-Louisi A., Agrafiotou P. Effect of the organic modifier concentration on the retention in reversed-phase liquid chromatography. II. Tests using various simplified models. // J. Chromatogr. A. 2002. v.946. P. 33-45

21. Boehm R.E., Martire D.E. // A Unified Theory of retention and selectivity in liquid chromatography. 1. Reversed-phase liquid chromatography with chemically bonded phases. // J. Phys. Chem. 1983. v.87. P. 1045-1062

22. LePree J.M., Cancino M.E. Application of the phenomenological model to retention in reversed-phase high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1998. v.829. P. 41-63

23. Snyder L.R., Dolan J.W., Gant J.R. Gradient elution in high-performance liquid chromatography. I. Theoretical basis for reversed-phase systems // J. Chromatogr. 1979. v. 165. P. 3-30.

24. Valko K., Snyder L.R., Glajch J.L. Retention in reversed-phase liquid chromatography as a function of mobile-phase composition. // J. Chromatogr. A. 1993. v.656. P. 501-520.

25. Рудаков О.Б., Востров И.А., Федоров С.В., Филиппов А.А., Седеменев В.Ф., Приданцева А.А. Спутник хроматорафиста. Методы жидкостной хроматографии. -Воронеж, Изд-во «Водолей». 2004. 528 с.

26. Шатц В.Д, Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатне. - 1988. - 390 с.

27. Melander W.R., Horvath С. Reversed-phase chromatography. / In: High-performance liquid chromatography. V.2. Academic press. 1980. P. 113-319.

28. Lough W.J., Wainer I.W. High performative liquid chromatography. Fundamental principles and practice. Blackie Academic & Professional. London Glasgow-Weinheim-New York-Tokio-Melboume-Madras

29. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир.- 1980 -245 с.

30. Schoenmakers P.J., Billet Н.А.Н., Tijssen R., de Galan L. Gradient selection in reversed-phase liquid chromatography //J. Chromatogr. 1978. v. 149. P. 519-537.

31. Schoenmakers P.J., Billet H.A.H., de Galan L. Influence of organic modifiers on the retention behaviour in reversed-phase liquid chromatography and its consequences for gradient elution//J. Chromatogr. 1979. v. 185. P. 179-195.

32. Schoenmakers P. J., Billet H.A.H., de Galan L. Systematic study of ternary solvent behaviour in reversed-phase liquid chromatography // J. Chromatogr. 1981. v.218. P. 261-284.

33. Новак И. Физико-химические основы процесса хроматографического удерживания в системах жидкость-жидкость и жидкость твердое тело / Жидкостная колоночная хроматография. Под ред. 3. Дейла, К. Мацека и Я. Янака. М.: Мир. 1978. С.65-79.

34. Dill К.A. The mechanism of solute retention in reversed-phase liquid chromatography // J. Phys. Chem. 1987. v.91. P. 1980-1988.

35. Roth M. Thermodynamics of modifier effects in supercritical fluid chromatography. // J. Phys. Chem. 1996. v. 100. P. 2372-2375.

36. Дуров B.A., Агеев Е.П. Термодинамическая теория растворов. М.: Едиториал УРСС. 2003.-248 с.

37. Lochmuller С.Н., Reese С., Aschman A.J. Current strategies for prediction of retention in high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1993. v.656. P. 3-18.

38. Wysocki J. What drives a separation the stationary phase or the mobile phase? // LC GC 2001. v.19. P. 1150-1159.

39. Janjic T.J., Vuckovic G., Celap M.B. Theoretical consideration and application of the SP ans SP' scales in RP chromatographic systems in which Everett's equation is valid. // J. Serb. Chem. Soc. 2002. v.67. P. 179-186.

40. Dolan J.W., Snyder L.R., Blane Т., Van Heukelem L. Selectivity differences for CI 8 and C8 reversed-phase column as a function of temperature and gradient steepness. I. Optimizing selectivity and resolution // J. Chromatogr. A. 2000. v.897. P. 37-50.

41. Miyabe K., Nomura N., Morishita F., Kurata S., Asamura H., Imada Y. Retention behaviour of p-alkylphanols in reversed-phase liquid chromatography using ethanol/water mixtures // Anal. Sci. 1998. v.14. P. 355-359

42. Colin H., Guiochon G. Interaction indexes and solvent effecte in reversed-phase liquid chromatography // Anal. Chem. 1983. v.55. P. 442-446.

43. Szântô J.I., Veress T. Comparative study on the thermodynamic retention models in HPLC // Chromatographic 1985. v.20. P. 596-600

44. Przybyciel M., Majors R.E. Phase collapse in reversed-phase LC. // LC GC Europe. 2002. October. P. 2-5.

45. Nagae N., Enami T., Doshi S. The retention behaviour of reversed-phase HPLC columns with 100% aqueous mobile phase. // LC GC North America. 2002. v.20. P. 964-972.

46. Bereznitski Y., Jaroniec M. Liquid chromatography studies if acetonitrile sorption on silica-based octylphases. //J. Liq. Chrom. RT. 1999. v.22(13). P. 1945-1964

47. Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.1 / Ред.кол.: Кнунянц И.Л. и др. М.: Сов. энцикл. 1988.- 623 с.

48. Torres-Lapasiô J.R., Garcia-Alvarez-Coque М.С., Rosés M., Bocsh E. Prediction of the retention in reversed-phase liquid chromatography using solute-mobile phase-stationary phase polarity parameters. // J. Chromatogr. A. 2002. v.955. P. 19-34.

49. Geng X.D., Regnier F.E. Stoichiometric displacement of solvent by non-polar solutes in reversed-phase liquid chromatography //J. Chromatogr. 1985. v.332. P. 147-168.

50. Murakami F. Retention behaviour of benzene derivatives in bonded reversed-phase columns //J. Chromatogr. 1979. v.178. P. 393-399.

51. Коган В.Б., Фридман B.M., Кафаров B.B. Равновесие между жидкостью и паром. 1965. Л.: Наука. 642 с.

52. Сычев С.Н. Полуэмпирическая теория удерживания в нормально фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (НФ ВЭЖХ) на адсорбционно-модифицированном силикагеле // Сорбционные и хроматографические процессы. 2003. Т.З. Вып. 4. С. 446 454.

53. Сычев С.Н., Сычев К.С., Ланин С.Н. Оценка напряженности электростатического поля адсорбционно-модйфицированного силикагеля // Ж.физ. химии. 2000. Т.74. № 3. С. 511-513.

54. Dolan J.W., Snyder L.R., Jupille Т.Н., Wilson N.S. Variability of column selectivity for reversed-phase liquid chromatography. Compensation by adjustment of separation conditions. // J. Chromatogr. A. 2002. v.1960. P. 51-67.

55. Claessens H.A., van Straten M.A., Cramers C.A., Jezierska M., Buszewski B. Comparative study of test methods for reversed-phase columns for high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A.1998. v. 826(2). P. 135-156.

56. Щафигулин P.B., Буланова A.B., Po K.X. Хроматографический анализ флавоноидов, содержащихся в чае. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. т.6(5). С. 844850.

57. Cooper W.T., Lin L.-Y. Effect of stationary-phase polarity on retention in reversed bonded phase HPLC columns. // Chromatographia. 1986. v.21(6). P. 335-341.

58. Layne J. Characterization and comparison of the chromatographic performance of conventional, polar-embedded, and polar-endcapped reversed-phase liquid chromatography ststionary phases. // J. Chromatogr. A. 2002. v.957. P. 149-164.

59. Рудаков О.Б., Седишев И.П., Рудакова ji.b. Элюирующая способность бинарных подвижных фаз в нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Конденсированные среды и межфазные границы. 2003. т.5. №3. С. 311-317.

60. Дейнека В.И., Староверов В.М., Селюкова Т.А. Микроколоночная ВЭЖХ ненасыщенных спиртов полупродуктов синтеза витамина А // Хим.-фарм. ж. 1989. №.3. С. 354-357.

61. Гамет JI. / Основы физической органической химии. М.: Мир. 1972. 534 с.

62. Карапетьянц М.Х. / Методы сравнительного расчета физико-химических свойств. М.: Наука. 1965.

63. Engelhardt Н., Jundheim М. Comparison and characterization of reversed-phases // Chromatographia. 1990. v.29(l/2). P. 59-68.

64. Dominguez J.A.G., Diez-Masa J.C. Retention parameters in Chromatography. Part A. Holdup volume concept in column chromatography. // Pure Appl. Chem. 2001. v.73. P. 971-980

65. Rimmer C.A., Simmons C.R., Dorsey J.G. The measurement and meaning of void volumes in reversed-phase liquid chromatography. // J. Chromatogr. A., 2002. v.965. P. 219-232.

66. Knox J.H., Kaliszan R. Theory of solvent disturbance peaks and experimental determination of thermodynamic dead-volume in column liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1985. v.349. P. 211-234.

67. Levin S., Grushka E. Calculation of Capacity Ratios of the Mobile-Phase Components and Column Void Volumes through System Peaks // Anal. Chem. 1989. v.61. P. 2428-2433.

68. Scott R.P.W. Liquid chromatography column theory. Ed. R.P.W. Scott and C. Sinpson. John Willey & Sons. Chichester New York Brisbane Toronto Singapore. 271 p.

69. McCormick R.M., Karger B.L. Distribution phenomena of mobile-phase components and determination of dead volume in reversed-phase liquid chromatography. // Anal. Chem. 1980. v.52. P. 2249-2257.

70. Yonker C.R., Zweir T.A., Burke M.F.Comparison of stationary phase formation in RP-18 for methanol-water systems. //J. Chromatogr. 1982. v.241. P. 257-268.

71. Yonker C.R., Zweir T.A., Burke M.F. Investigation of stationary phase formation for RP-18 using various organic modifiers. // J. Chromatogr. 1982. v.241. P. 269-280.

72. Katz E.D., Ogan K., Scott R.P.W. Distribution of a solute between two phases. The basic theory and its application to the prediction of chromatographic retention. // J. Chromatogr. 1986. v. 352. P. 67-90.

73. Loeser E., Drumm P. Investigation of Anion Retention and Cation Exclusion Effects for Several C18 Stationary Phases //Anal. Chem. 2007. v.79. P. 5382-5391.

74. Зенкевич И.Г. Общие закономерности изменения физико-химических свойств органических соединений в гомологических рядах // Ж. орг. химии. 2006. Т.42. Вып. 1. С. 9-20.

75. Зенкевич И.Г. Расчет температур кипения органических соединений по данным для предшествующих гомологов с использованием рекуррентных соотношений. // Ж. физ. химии. 2006. Т.80. №.10. С. 1841-1848.

76. Rivas J.D.L. Reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation of lutein fatty acid esters from marigold flower petal powder // J. Chromatogr. 1989. v.464. P. 442-447.

77. Certificate of Analysis. SRM 870, Column Performance Test Mixture for Liquid Chromatography, National Institute of Standards and Techology, Gaithersburg. MD. 2000.

78. Wilson N.S., Nelson M.D., Dolan J.W., Snyder L.R., Wolcott R.G., Carr P.W. Column selectivity in reversed-phase liquid chromatography. I. A general quantitative relationship // J. Chromatogr. A. 2002. v.961. P. 171-193.

79. Дейнека В.И., Хлебников B.A., Симаков C.B., Шапошников А.Ю., Савотченко С.Е. Обращенно-фазовая ВЭЖХ некоторых производных индола. // Ж. физ. химии. 2004. т. 78. №10. С. 1886-1890.

80. Яшин ЯМ. Физико-химические основы хроматографического разделения. М.: Химия. 1976.216 с.

81. Ettre L.S. Nomenclature for chromatography. (IUPAC Recommendations 1993). // Pure Appl, Chem. 1993. v.65(4). P. 819-872.

82. Руководство по газовой хроматографии: В 2-х ч. 4.1. Пер. с нем./ Под ред. Э. Лейбница, Х.Г. Штруппе. М.: Мир, 1988. - 480 с.

83. Руководство по газовой хроматографии: В 2-х ч. 4.2. Пер. с нем./ Под ред. Э. Лейбница, Х.Г. Штруппе. М.: Мир, 1988. - 510 с.

84. Березкин В.Г. Роль газа-носителя в газо-жидкостной хроматографии. // Рос. Хим. Ж. 2003. Т.67(1). С. 35-43.

85. Smith R.M., Hurdley T.G., Gill R, Moffat A.C. Application of retention indices based on the alkylarylketone scale to the separation of the local anaesthetic drugs by high-performance liquid chromatography. // J Chromatogr. 1986. v.355(l). P. 75-85.

86. Bogusz M., Aderjan R. Improved standardization in reversed-phase high-performance liquid chromatography using 1-nitroalkanes as a retention index scale. // J Chromatogr. 1988. v.435(l). P. 43-53.

87. Elliott S.P., Hale K.A. Development of a high-performance liquid chromatography retention index scale for toxicological drug screening // J. Chromatogr. B. 1997. v.694(l). P. 99-114.

88. Smith R.M. Characterization of reversed-phase liquid chromatography columns with retention indexes of standards based on an alkyl aryl ketone scale // Anal. Chem. 1984. v.56. P. 256-262.

89. Podlaha O., Toregard B. Some new observations on the equivalent carbon numbers of triglycerides and relationship between changes in equivalent carbon numbers and molecular structure // J. Chromatogr. 1989. v.482. P. 215-226.

90. Selouane A., Vaccher C., Villa P., Postel D., Len C. Enantiomeric d4T analogues and their structural determination // Tetrahedron: Asymmetry. 2002. v. 13. P. 107, 407-413.

91. Татевский B.M. Теория физико-химических свойств молекул и веществ. М.: Изд-во МГУ, 1987. 240 с.

92. Benson S.W., Cruickshank F.R., Golden D.M., Haugen G.R., O'Neal H.E., Rodgers A.S., Shaw R., Walsh R. Additivity rules for the estimation of thermochemical properties // Chem. Rev. 1969. v.69(3). P. 279-324.

93. Bader R.F.W., Bayles D. Properties of Atoms in Molecules: Group Additivity // J. Phys. Chem. A, 2000. v.l04(23). P. 5579 -5589.

94. Wu H. Chemical property calculation through JavaScript and applications in QSAR // Molecules. 1999. v.4. P. 16-27.

95. Mannhold R., Rekker R.F., Dross K., Bijloo G., de Vries G. The lipophilic behaviour of organic compounds: 1. An updating of the hydrophobic fragmental constant approach // QSAR. 1998. v,17(6). P. 517-536.

96. Wang R., Fu Y., Lai L. A new atom-additive method for calculating partition coefficients // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1997. v.37. P. 615-621.

97. Junkes B.S., Amboni R.D.M.C., Yunes R.A., Heinzen V.E.F. Semiempirical Topological Index: A Novel Molecular Descriptor for Quantitative Structure-Retention Relationship Studies // Internet Electron. J. Mol. Des. 2003. v.2. P. 33^19.

98. Баскин И.И., Палюлин B.A., Зефиров H.C. Прогнозирование энтальпий образования алифатических полинитросоединений. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2.Химия. 2001. Т.42. № 6. С. 387-389.

99. Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия, 1986. - 272 с.

100. Smith R.M. Functional group contributions to the retention of analytes in reversed-phase high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1993. v.656. P. 381-415.

101. Wang A., Carr P.W. Comparative study of linear solvation energy relationship, linear solvent strength theory, and typical-conditions model for retention prediction in reversed-phase chromatography. // J. Chromatogr. A. 2002. v.965. P. 3-23.

102. Colin H., Guiochon G., Yun Z., Diez-Masa J.C., Jandera J. Selectivity for homologous series in reversed-phase LC: III. Investigation of nin-specific selectivity. // J. Chromatogr. Sci. 1983. v.21.P. 179-184.

103. Hanai Т., Ahmed F., Rustamov I., Babusis D. Selectivity of phenyl-bonded silica gel for liquid chromatography. // J. Liq. Chromatogr. RT. 1999. v.22(4). P. 501-511.

104. Татевский B.M. / Строение молекул. M., Химия, 1977. 511 с.

105. Cheong W.J., Kim C.Y., Коо Y.M. Thermodynamic properties of the solute transfer from the aqueous acetonitrile mobile phase to the stationary phase monitored by HPLC. // Bull. Korean Chem. Soc. 2000. v.21. N.l. P. 105-109.

106. Martin M., Thevenon G., Tchapla A. Comparison of retention mechanisms of homologous series and triglicerides in non-aqueous reversed-phase liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1988. v.452. P. 157-173.

107. Hanai Т., Hubert J. Selectivity of phenyl-bonded silica gel // J. Chromatogr. 1984. v.291. P. 81-89.

108. Morel D., Serpinet J., Letoffe J.M., Claudy P. Liquid chromatographic retention of homologous alkanes in the two states of C18-bonded reversed-phase silicas // Chromatographia 1986. v.22. P. 103-108.

109. Scott R.P.W. The thermodynamic properties of methanol-water association and its effect on solute retention in liquid chromatography. // Analyst. 2000. v. 125. P. 1543-1547.

110. Colin H., Guiochon G. Selectivity for homologous series in reversed-phase liquid chromatography. I. Theory// J. Cromatorg. Sci. 1980. v.18. P. 54-63.

111. Colin H., Krstulovic A.M., Gonnord M.-F., Guiochon G. Investogation of selectivity in reversed-phase liquid chromatography effects of stationary and mobile phases on retention of homologous series. // Chromatorgaphia. 1983. v.17(1). P. 9-15.

112. Engelhardt H., Chromatographic characterization of surfaces. // Pure Appl. Chem. 1989. v.61(ll). P. 2033-2036.

113. Chen Z., Nakayama Т., Nakagama Т., Uchiyama K., Hubo T. Thermodynamic approaches to intermolecular interaction and retention behaviour in liquid chromatography. // J. Liq. Chromatogr. RT. 2003. v.26(17). P. 2809-2838.

114. Bosch E., Bou P., Roses M. Linear description of solute retention in reversed-phase liquid chromatography by a new mobile phase polarity parameter // Anal. Chim. Acta. 1994. v.299. P. 219-229.

115. Rohrschnerider L. Prototypical test substances for a reversed phase in a retention parameter model // J. High Resol. Chromatogr. 1999. v.22. P. 454-458.

116. Euerby M.R., Petersson P. Chromatographic classification and comparison of commercially available reversed-phase liquid chromatographic columns using principal component analysis // J. Chromatogr. A. 2003. v.994. P. 13-36.

117. Sander L.C., Pursch M., Wise S.A. Shape Selectivity for Constrained Solutes in Reversed-Phase Liquid Chromatography //Anal. Chem. 1999. v.71. P. 4821-4830.

118. Wilson N.S., Nelson M.D., Dolan J.W., Snyder L.R., Carr. P.W. Column selectivity in reversed-phase chromatography. 2. Effect of a change in conditions. // J. Chromatogr. A. 2002. v. 961. P. 195-215

119. Epler K.S., Sander L.C., Ziegler R.G., Wise S.A., Craft N.E. Evaluation of reversed-phase liquid chromatographic columns for recovery and selectivity of selected carotenoids // J. Chromatogr. 1992. v. 595. P. 89-101.

120. Химия привитых поверхностных соединений / Под ред. Г.В. Лисичкина. М.,: ФИЗМАТЛИТ, 2003. - 592 с.

121. Nahum A., Horvath С. Surface silanols in silica-bonded hydrocarboneous stationary phases. I. Dual retention mechanism in reversed-phase chromatography // J. Chromatogr. 1981. v. 203. P. 53-63. ■

122. Rogers S.D., Dorsey J.G. Chromatographic silanol activity test procedures: the quest for a universal test.// J. Chromatogr. A. 2000. v.892. P. 57- 65.

123. Sandi A., Szepesy L. Characterization of various reversed-phase columns using the linear free energy relationship. I. Evaluation based on retention factors. // J. Chromatogr. A. 1998. v.818.P. 1-17.

124. Lopez L.A., Rutan S.C. Comparison of methods for characterization of reversed-phase liquid chromatographic selectivity // J. Chromatogr. A. 2002. V. 965. P. 301-314.

125. Melander W., Stoveken J., Horvath C. Stationary phase effects in reversed-phase chromatography I. Comparison of energetics of retention on alkyl-silica bonded phases // J. Chromatogr. 1980. v.199. P. 35 56.

126. Pesek J.J., Matyska M.T., Yu R.J. Synthesis and characterization of endcapped C-18 stationary phases using a silica hydride intermediate // J. Chromatogr. A. 2002. V. 947. P. 195203.

127. Lochmuller C.H., Wilder D.R. Reversed-phase liquid chromatography with chemically bonded phases // J. Chromatogr. Sci. 1979. v. 17. P.575-578.

128. Dorsey J.D., Cooper W.T. Retention mechanisms of bonded-phase liquid chromatography // Analit. Chem. 1994. v.66. P. 857A-867A

129. Martire D.E., Boem R.E. Unified heory of retention and selectivity in liquid chromatography. 2. Reversed-phase liquid chromatography with chemically bonded phases // J. Phys. Chem. 1983. v.87. P. 1045-1062.

130. Bohmer M.R., Koopal L.K., Tijssen R. Partitioning and adsorption of chain molecules at chemically modified surfaces in reversed-phase liquid chromatography // J. Phys. Chem. 1991. v.95. P. 6285-6297.

131. Sander L.C., Glinka C.J., Wise S.A. Determination of bonded phase thickness in liquid chromatography by small angle neutron scattering // Anal. Chem. 1990. v.62. P. 1099-1101

132. Cunha S.C., Oliveira M.B.P.P. Discrimination of vegetable oils by triacylglycerols evaluation of profile using HPLC/ELSD // Food Chem. 2006. v.95. P. 518-524

133. Kaliszan R. QSRR: Quantitative Structure-(Chromatographic) Retention Relationships // Chem. Rev. 2007. v. 107. P. 3212-3246

134. Mirrless M.S., Moulton S.J., Murphy C.T., Taylor P.J. Direct measurement of octanol-water partition coefficients by high-pressure liquid chromatography. // J. Med Chem. 1976. v.19. P. 615-619.

135. Bosque R., Sales J., Bosch E., Roses M., Garcia-Alvarez-Coque M.C., Torres-Lapasio J.R. // A QSPR study of the p solute polarity parameter to estimate retention in HPLC // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2003. v.43. P. 1240-1247

136. Hansch C., Fujita T. p-a-u Analysis. A Method for the Correlation of Biological Activity and Chemical Structure. 1964. v.86. P. 1616 1626

137. Leo A., Hansch C., Elkins D. Partition coefficient and their uses // Chem. Rev. 1971. v.71. P. 525-616.

138. Chou J.T., Jurs P.C. Computer-Assisted Computation of Partition Coefficients from Molecular Structures Using Fragment Constants // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1979. v.19. P. 172178

139. Reijenga O., Lee H.K. Software and internet resources for capillary electrophoresis and micellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr.A. 2001. v.916. P. 25-30

140. Meylan W. M., Howard P. H. Atom/fragment contribution method for estimating octanol-water partition coefficients //J. Pharm. Sci. 1995. V.84. P.83-92

141. Gombar V.K., Enslein K. Assessment of «-Octanol/Water Partition Coefficient: When Is the Assessment Reliable? // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1996. v.36. P. 1127-1134.

142. Hanai T. Chromatography and Computational Chemistry for Drug Discovery //Anal. Sci. 2001. v.17, supplement, p. Í217-219

143. Alvarez-Zapeda A., Barman B.N., Martire D.E. Thermodynamic study of the marked differences between acetonitrile/water and methanol/water mobile-phase systems in reversed-phase liquid chromatography // Anal. Chem. 1992. v.64. P. 1978-2984.

144. Donovan S.F., Pecsatore M.C. Method for measuring the logarithm of the octanol-water partition coefficient by using short octadecyl-poly(vinyl alcohol) high-performance liquid chromatography columns // J. Chromatogr. A. 2002. V.952. P.47-61

145. Метцнер К. Физико-химичекие основы хроматографического разделения. // В кн. Руководство по газовой хроматографии: В 2-х ч. 4.1. / Под ред. Э. Лейбница, Х.Г. Штруппе. М.: Мир, 1988. - 480 с.

146. Нао W., Zhang X., Нои К. Analytical solutions of the ideal model for gradient liquid chromatography // Anal. Chem. 2006. v."76. P. 7828-7840.

147. Snyder L.R., Dolan J.W., Lommen D.C. Drylab® computer simulation for highperformance liquid chromatographic method development I. Isocratic elution //J. Chromatogr. 1989. V. 485. P.65-89.

148. Dolan J.W., Lommen D.C., Snyder L.R. Drylab® computer simulation for highperformance liquid chromatographic method development II. Gradient Elution // J. Chromatogr. 1989. v.485. P. 91-112

149. Чижков В.П., Стерхов H.B. Метод оценки эффективности и разделительной способности хроматографических колонн //Журн. физ. химии. 2002. т.76. №2. С. 350-351

150. Jonsson J.A. Dispersion and peak shapes in chromatography / In Chromatographic Theory and Basic Princirpes. J.A. Jonsson ed. Chromatographic Science Series, v.38. Marcel Dekker, Inc. New York and Basel. 1987. P. 27

151. Gritti F., Guiochon G. General HEPT equation for the study of mass-tranfer mechanisms in RPLC // Anal. Chem. 2006. V. 78. P. 53.

152. Knox J., Scott H.P. В and С terms in the Van Deemter equation for liquid chromatography // J. Chromatogr. 1983. v.282. P. 297-313.

153. Wang J.D., Li J.Z., Bao M.S., Lu P.C. Influence of the Eluent Composition on Column Efficiency in Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography J. D. Wang // Chromatographia. 1983. v. 17(5). P. 244-248

154. Тжещтньский E., Дзечиол M. Новый метод оценки эффективности хроматографической колонки //Ж. аналит. химии. 2005. Т.60. №8. С. 815-819

155. Тейлор Д. Введение в теорию ошибок. М.: Мир. 1985. 272 с.

156. Goto Т. Structure, stability and colour variation of natural anthocyanins // Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 1987. v.52. P. 113-158.

157. Hale M.L., Francis F.J., Fagerson I.S. Detection of Enocyanin in Cranberry Juice Cocktail by HPLC Anthocyanin Profile // J. Food Sci. 1986. v.51. P. 1511-1513.

158. Ito F., Tanaka N., Katsuki A., Fujii T. Why do flavylium salts show so various colors in solution? Effect of concentration and water on the flavylium's color changes // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 2002. v. 150. P. 153-157

159. Grushka E. Chromatographic peak shares. Their origin and dependence on the experimental parameters // J. Phys. Chem. 1978. V. 76. P. 2586-2593

160. Papai Zs., Pap T.L. Analysis of peak asymmetry in chromatography // J. Chromatogr. A. 2002. v.953.P. 31-38.

161. Foley J.P., Dorsey J.G. Equation for calculation of chromatographic figures of merit for ideal and skewed peaks // Anal. Chem. 1983. V. 55. P. 730-737.

162. Geeraert E., De Schepper D. Structure elucidation of triglycerides by chromatographic techniques. Part 2: RPHPLC of triglycerides and brominated triglycerides // J. High Resol. Chromatogr. CC. 1983. v.6. P. 123-132.

163. Lin J.-T., Snyder L. R, McKeon T.A. Prediction of relative retention times of triacylglycerols in nonaqueous reversed-phase high-perfprmance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 1998. v.808. P. 43-49.

164. Stolyhwo A., Colin H., Guiochon G. Analysis of triglycerides in oil and fats by liquid chromatography with the laser light scattering detector// Anal. Chem. 1985. v.57. P.1342-1354

165. Andrikopoulos N.K. Chromatographic and spectroscopic methods in the analysis of triacylglycerol species and regiospecific isomers of oils and fats // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2002. v.42. P. 473-505.

166. Sakaki K., Sudo Y., Kudo S. Influence of carbon content and end-capping of ODS stationary phases on the separation behaviour of triacylglycerols in LC and SFC // J. Liq. Chrromatogr. RT. 2004. v.27. P. 387-405.

167. Wolf. J.P., Mordret F.X., Dieffenbacher A. Determination of triglycerides in vegetable oils in terms of their partition numbers by high performance liquid chromatography. // Pure Appl. Chem. 1991.V.63.P. 1173-1991.

168. Дейнека В.И., Дейнека JI.А., Габрук Н.Г. Фофанов Г.М., Манохина Л.А., Сидельникова Н.А. Анализ растительных масел с использованием ВЭЖХ // Ж. аналит. химии. 2003. Т.58. №12. С. 1294-1299.

169. Andrikopoulos N.K. Trigliceride species composition of common edible vegetable oils and methods used for their identification and quantification // Food Rev. Intern. 2002. v. 18(1). P. 71102

170. Andrikopoulos N.K., Chiou A., Mylona A. Triacylglycerol species of less common edible vegetable oils // Food Rev. Intern. 2004. v.20(4). P. 389-405

171. Дейнека В.И., Фофанов Г.М., Хлебников В.А., Балятинская Л.Н. Инкрементный подход в расчете жирнокислотного состава триглицеридов. // Хранение и переработка сельхозсырья. 2002. №11. С. 20-23

172. Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Фофанов Г.М., Балятинская Л.Н. Идентификация жирных кислот в составе триглицеридов масел семян растений с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ. // Растит, ресурсы. 2004. Т.40. №1. С. 104-112.

173. Лобанова А.А., Сысолятин С.В., Сакович Г.В., Зимина В.Г. Масло плодов Viburnum opulus L. // Химия растительного сырья. 1999. №4. С. 101-103.190. http://www.bagkf.de/

174. Lassner M.W., Lardizabal К., Metz J.G. Pruducing wax esters in transgenic plants by expression of genes derived from jojoba. / In. Perspectives on new crops and new uses. J. Janick (ed.), ASHS Press, Alexandria, VA. 1999

175. Medvedovici A., Lazou K., d'Oosterlinck A., Zhao Y., Sandra P. Analysis of jojoba oil by LC-coordination ion spray-MS (LC-CIS-MS) // J. Sep. Sci. 2002. v.25(3). P. 173-178

176. Juaneda P. Utilisation of reversed-phase high-performance liquid chromatography as an alternative to silver-ion chromatography for the separation of cis- and trans-ClS:l fatty acid isomers // J. Chromatogr. A. 2002. v.954. P. 285-289.

177. Nikolova-Damyanova B. Quatitative thin-layer chromatography of triacylglycerols. Principles and application. //J. Liq. Chrom. RT. 1999. v. 22(10). P. 1513-1537

178. Nikolova-Damyanova В., Momchilova Sv. Silver ion HPLC for the analysis of positionally isomeric fatty acids. //J. Liq. Chrom. RT. 2002. v. 25(13-15). P. 1947-1965

179. Shimizu S., Nakano M. Structural characterization in several oils containing gamma-linolenic acid // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. v.67. P. 60-67

180. Дейнека В.И., Дейнека JI.А. Кедровое масло (масло семян Pinus sibirica): анализ и установление фальсификации методом ВЭЖХ // Химия растительного сырья. 2006. №3. С. 21-26

181. Жукова Е.Е., Будаева В.В., Егорова Е.Ю., Ерохина Г.В., Бизюкова А.В. Масло кедрового ореха и его возможности использования. // Масла и жиры. 2005. №2. С. 9-10.

182. Дейнека В.И, Дейнека Л.А. Анализ растительных масел методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Ж. аналит. химии 2004. т.59. №9. С. 895-898.

183. Comes F., Farines М., Aumelas A., Soulier J. Fatty acids and triacylglycerols of cherry seed oil //J. Amer. Oil Chem. Soc. 1992. v.69. P. 1224. (http://www.bagkf.de/).

184. Joh Y.-G., Kim S.-J., Christie W.M. The structure of triacylglycerols, containing punicic acid, in the seed oil of Trichosanthes kirilowii // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1995. v.12. P. 10371042.

185. Adlof R.O., Menzel A., Dorovska-Taran V. Analysis of conjugated linoleic acid-enriched triacylglycerol mixtures by isocratic silver-ion high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2002. v.953. P. 293-297.

186. Tsuzuki Т., Tokuyama Y., Igarashi M., Miyazawa T. Tumor growth suppression by {alpha}-eleostearic acid, a linolenic acid isomer with a conjugated triene system, via lipid peroxidation // Carcinogenesis. 2004. v.25. P. 1417-1425.

187. Дейнека В.И., Шапошников A.A., Дейнека Л.А., Сорокопудова О.А., Федлюк П.П., Сорокопудов В.Н. Эссенциальные жрные кислоты в растениях Белгородской флоры //

188. Feltl L., Pacâkovâ V., Stulik K. Volka K. Reliability of carotenoid analyses: A review // Current Analytical Chemistry. 2005. v. 1. P. 93 102

189. Deli J., Matus Z., Szabolcs J. Carotenoid composition in the fruits of black paprika (Capsicum annuum variety Longum nigrum) diring ripening // J. Agric. Food Chem. 1992. v.40. P. 2072-2076

190. Moss G.P. Nomenclature of carotenoids. / IUPAC Commission on Nomenclature of Organic Chemistry and IUPAC Comission on Biochemical Nomenclature. http:/www.chem.qmul.ac.uk/iupac/carot/

191. Pfander H., Riesen R., Niggli U. HPLC and SFC of carotenoids scope and limitations // Pure Appl. Chem. 1994. v.65. N5. P. 947-954.

192. Hadden W.L., Watkins R.H., Levy L.W., Regaldo E., Rivadeneira D.M., van Breemen R.B., Schwartz S.J. Carotenoid composition of marigold (Tagetes erecta) flower extract used as nutritional supplement // J. Agric. Food Chem. 1999. v.47. P. 4189 4194

193. Bosma T.L., Dole J.M., Maness N.O. Optimizing marigold (Tagetes erecta L.) petal and pigment yield // Corp. Sci. 2003. v.43. P. 2118-2124

194. Дейнека В.И. Триглицеридный состав масел семян некоторых растений. //Химия природн. соедин. 2003. №6. С. 433-436

195. Deli J., Matus Z., Tôth G. Carotenoid composition in the fruits of Capsicum annuum cv. Szentesi Kosszarvu during ripening I I J. Agric. Food Chem. 1996. v.44. P. 711-716

196. Kim H.P., Kim S.Y., Lee E.J., Kim Y.C., Kim Y.C. Zeaxanthin dipalmitate from Lycium chinense has hepatoprotective activity // Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 1997 v.97. P. 301-14.

197. Khachik F., Beecher G.R. Separation of carotenol fatty acids esters by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1988. v.449. P. 119-133

198. Deli J., Matus Z., Molnâr P., Tôth G. Separation and identification of carotenoids from different coloured paprika (Capsicum annuum) by reversed-phase high-performance liquid chromatography // Eur. Food Res. Technol. 2001. v.213. P. 301-305

199. Naguib Y.M.A. Antioxidant Activities of Astaxanthin and Related Carotenoids // J. Agric. Food Chem. 2000. v.48. P. 1150-1154.

200. Rodrigues-Amaya D.B., Kimura M. HarvestPlus handbook for carotenoid analysis. HarvesPlus Technical Monograph 2. Washington, DC and Cali: IFPRI and CIAT. 2004. 48 p.

201. Higuers-Ciapara I., Félix-Valenzuella L., Goycoolea F.M. Astaxanthin: A Review of its Chemistry and Application. // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2006. v.46. P. 185-196.

202. Seybold, A., Goodwin, T.W. Occurrence of astaxanthin in the flower petals of Adonis annua L. // Nature. 1959. v.184. P. 1714-1715.

203. Renstrom B., Berger H., Liaaen-Jensen S. Esterified, optical pure (3S, 3'^-astaxanthin from flowers of Adonis annua II Biochem. System. Ecol. 1981. v.9, № 4. P. 249-250.

204. Egger K. Die ketocarotinoide in Adonis annua L. // Phytochem. 1965. vol. 4, № 4. P. 609618.

205. Kamata T., Simpson K.L. Study of astaxanthin diester extracted from Adonis aestivalis. II Compar. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 1987. v.86. № 3. P. 587-591

206. Lotocka M., Styczyñska-Jurewicz E., Blçdzki L.A. Changes in carotenoid composition in different developmental stages of copepods: Pseudocalanus acuspes Giesbrecht and Acartia spp. //J. Plankton Research. 2004. v.26. P. 159-166.

207. Yuan J.-P., Chen F. Chromatographic separation and purification of trans-astaxanthin from the extracts of Haematococcuspluvialis. II J. Agrie. Food Chem. 1998. v.46. P. 3371-3375.

208. Yuan J.-P., Chen F. Isomerization of Zram-astaxanthin to c«'-isomers in organic solvents. // J. Agrie. Food Chem. 1999. v.47. P. 3656-3660.

209. Deli J., Molnár P., Matus Z., Tóth G. Carotenoid composition in the fruits of red paprika (Capsicum annuum var. lycopersiciforme rubrum) during ripening; biosynthesis of carotenoids in red paprika // J. Agrie. Food Chem. 2001. v.49. P. 1517-1523

210. Howard L. R., Talcott S.T., Brenes C.H., Villalon B. Changes in Phytochemical and Antioxidant Activity of Selected Pepper Cultivars (Capsicum Species) As Influenced by Maturity L. R. Howard // J. Agrie. Food Chem. 2000. v.48. P. 1713-1720

211. Hornero-Méndez D., J. Costa-García, Mínguez-Mosquera M.I. Characterization of carotenoid high-producing Capsicum annuum cultivars selected for paprika production // J. Agrie. Food Chem. 2002. v.50. P. 5711-5716

212. Ittah Y., Kanner J., Granit R. Hydrolysis Study of Caroteno id Pigments of Paprika (Capsicum annuum L. Variety Lehava) by HPLC/Photodiode Array Detection // J. Agrie. Food Chem. 1993.V.41.P. 899-901

213. Maoka T., Fujiwara Y., Hashimoto K., Akimoto N. Isolation of a Series of Apocarotenoids from the Fruits of the Red Paprika Capsicum annuum L. Takashi Maoka // J. Agrie. Food Chem. 2001. v.49. P. 1601-1606

214. Wu X., Prior R.L. Systematic Identification and Characterization of Anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in Common Foods in the United States: Fruits and Berries // J. Agrie. Food Chem. 2005. v.53. P. 2589-2599

215. Harborne J.B., Williams C.A. Anthocyanins and other flavonoids // Natur. Prod. Rep. 1998. P. 631-652

216. Harborne J.B., Williams C.A. Anthocyanins and other flavonoids // Natur. Prod. Rep. 2001. P.310-333

217. Torskangerpoll K., Borve K.J., Andersen 0.M., Saethre L.J. Color and substitution pattern in anthocyanidins. A combined quantum chemical-chemometrical study // Spectrochim. Acta P.A. 1999. v.55.P. 761-771

218. Goiffon J.-P., P.P. Mouly, E.M. Gaydou. Anthocyanic pigment determination in red fruits, concentrated juices and syrups usind liquid chromatography // Anal. Chim Acta. 1999. v.382. P. 39-50

219. Goiffon J.-P., M. Bran, M.-J. Bourrier. High-performance liquid chromatography of red fruit anthocyanins//J. Chromatogr. 1991. v.537. P. 101-121

220. Zhang Z., Kou X., Fugal K., Mclaughlin J. Comparison of HPLC methods for determination of anthocyanins and anthocyanidins in bilberry extracts // J. Agrie. Food Chem. 2004. v.52. P. 688-691

221. Дейнека В.И., Григорьев A.M., Ермаков A.M. Антоцианы некоторых растений Белгородской флоры. // Химия природн. соедин. 2003. №5. С. 412-413.

222. Сорокопудов В.Н., Хлебников В.А., Дейнека В.И. Антоцианы некоторых растений семейства Berberidaceae II Химия растит, сырья. 2005. №4. С. 57-60