автореферат диссертации по технологии, машинам и оборудованию лесозаготовок, лесного хозяйства, деревопереработки и химической переработки биомассы дерева, 05.21.03, диссертация на тему:Терпеноиды бересты и луба березы Betula pendula Roth. Синтез бетулиновой кислоты

Шабанова Наталья Юрьевна /

ГаВ*^

фа*

ТЕРПЕНОИДЫ БЕРЕСТЫ И ЛУБА БЕРЕЗЫ BETULA PENDULA ROTH. СИНТЕЗ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ.

05.21.03: Технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург - 2005

J

я

Шабанова

ша

Наталья Юрьевна ^

} ТЕРПЕНОИДЫ БЕРЕСТЫ И ЛУБА БЕРЕЗЫ BETULA PENDULA ROTH.

' СИНТЕЗ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ

05.21.03: Технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

I

кандидата химических наук

« *-«

Санкт-Петербург - 2005"

Работа выполнена на кафедре Химии древесины, физической и коллоидной химии Санкт-Петербургской государственной лесотехнической академии имени С.М. Кирова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Рощин Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Пономарев Дмитрий Андреевич доктор химических наук, профессор Тритин Юрий Григорьевич

Защита диссертации состоится 31 января 2006 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 212.220.01 в Санкт-Петербургской государственной лесотехнической академии имени С.М. Кирова по адресу: 194021, Санкт-Петербург, Институтский пер., д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной лесотехнической академии.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах с заверенными подписями просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 194021, Санкт-Петербург, Институтский пер., д. 5.

кандидат химических наук, доцент Ведерников Дмитрий Николаевич

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра Химии природных соединений

Авторефесгр^а^а^)^ иииьЬя 2005г.

БИБЛИОТЕКА {

>я 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. На целлюлозно-бумажных и деревообрабатывающих предприятиях (фанерные комбинаты) в результате окорки березовой древесины скапливается большое количество коры, которая не имеет промышленного применения. Проблема комплексной утилизации древесных отходов является актуальной для лесного комплекса и может быть решена путем их химической переработки. Знание состава экстрактивных веществ является научной базой для создания комплексной технологии переработки коры. Несмотря на интерес со стороны исследователей к коре березы, данных по составу соединений экстрактивных веществ недостаточно, известные данные носят отрывочный характер и не позволяют в полной мере оценить состав. Основной компонент (10-30%) экстрактивных веществ коры березы -тритерпеноид бетулин привлекает внимание из-за своих ценных свойств и доступности сырья. Из бетулина химическим путем можно получить бетулиновую кислоту, которая показала специфическую активность против меланомы (рак кожи).

Работа выполнена по государственному контракту № 13.802.1 1.0310 "Разработка технологий и оборудования для глубокой переработки низкосортной древесины, отходов и древесной зелени в ценные продукты лесохимии" и поддержана персональным грантом (стипендией) Президента РФ 2002 года для студентов и аспирантов.

Дель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение состава экстрактивных веществ коры березы и разработка синтеза бетулиновой кислоты из бетулина. Основные задачи работы:

- разработать схемы определения группового состава структурных компонентов и экстрактивных веществ бересты и луба;

- выделить и установить строение индивидуальных соединений углеводородных экстрактов из частей коры;

- определить способ переработки коры березы с получением бетулина для синтеза бетулиновой кислоты;

- разработать синтез бетулиновой кислоты.

Научная новизна. Установлено, что внутренняя и наружная части коры отличаются друг от друга по групповому составу и составу соединений экстрактивных веществ. Липофильные экстрактивные вещества луба представлены ацилглицеринами и терпеноидами этерифицированными жирными кислотами. В состав терпеноидов входят: бетулапренолы, лупсол, (3-ситостерин, 24-метиленциклоартанол, цитростадиенол. Основное содержание экстракта бересты составляют пентациклические тритерпеноиды, среди которых в бересте березы повислой впервые идентифицированы пальмитат и формиат лупеола.

Определено, что в бересте, в отличие от луба, кроме тритерпеноидов присутствуют сесквитерпеноиды. Определены ухмгеводороды: а-сантален, а-транс-бергамотен, Р-транс-бергамотен, Р-кариофиллен, Р-бизаболен, фарнезен; оксиды: оксид а-санталена, оксид а-транс-бергамотена; спирты: 6-гидрокси-Р-кариофиллен, а-бизаболол. Углеводороды луба, в отличие от бересты, состоят из н-алканов, сквалена и впервые выделенных из растительного сырья терпенов С35 и С40 с 18-членным макроциклом.

Предложен способ (Патент РФ № 2190622) получения бетулиновой кислоты, основанный на окислении бетулина пиридиндихроматным комплексом (ПДХК) с последующим восстановлением бетулоновой кислоты до искомого продукта.

Практическая значимость. Предложен способ переработки коры -отхода деревообрабатывающих предприятий, включающий отделение бересты от луба, экстракцию бересты углеводородным растворителем и отделение кристаллов препарата, содержащего 90-95% бетулина и выходом 16-20% от сухого сырья (Патент РФ № 2184120).

Апробация работы. Основные результаты доложены на шести конференциях, в том числе: I, II и Ш Всероссийских конференциях "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2000; Казань, 2002; Саратов, 2004), Международных конференциях: Sixth European Workshop on Lignocellulosics and Pulp (Bordeaux, 2000); 11th International Symposium on Wood and Pulping Chemistry (Nice, 2001); Seventh European Workshop on Lignocellulosics and Pulp (Turku, 2002).

Публикации. По теме диссертации имеется 12 публикаций.

Структура и объем диссертапии. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, общих выводов, заключения, списка литературы (115 наименований) и приложения. Диссертация содержит 9 рисунков и 36 таблиц. Положения, выносимые на защиту:

1. Групповой состав структурных компонентов и экстрактивных веществ бересты и луба березы повислой.

2. Схема анализа экстрактивных веществ коры березы.

3. Состав петролейных экстрактов бересты и луба.

4. Способ получения беоулина.

5. Способ синтеза бетулиновой кислоты.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Методы проведения эксперимента.

Для исследований использовали кору березы повислой Betula pendula Roth., заготовленную в середине ноября 2001 года со свежесрубленного дерева в пос. Песочный (Ленинградская обл.) в виде отрубков длиной 3354 см из разных частей ствола: на высоте 0,1; 0,3; 0,6; 0,9 от общей высоты дерева (26 м). Возраст березы около 55 лет. С каждой части ствола отдельно собрали бересту и луб.

Сырье последовательно экстрагировали диэтиловым эфиром, этанолом в аппарате Сокслета; затем горячей водой, обрабатывали спиртовым раствором КОН для удаления суберина. В остатке после удаления суберина была определена холоцеллюлоза. Содержание лигнина установили по методу Класона после обработки сырья диэтиловым эфиром, этанолом, 3%-ным спиртовым раствором КОН и 1%-ным водным раствором NaOH. Влажность определяли стандартным методом высушивания, зольность — методом сжигания. В лубе содержание целлюлозы устанавливали азотно-спиртовым методом. Фракционирование экстрактов и выделение индивидуальных соединений. Сырье экстрагировали петролейным эфиром (70-100°С) в аппарате Сокслета. Экстракты изучали в соответствии со схемой (рис. 1).

Рис.1. Схема исследования экстрактивных веществ бересты и луба, извлекаемых петролейным эфиром Примечание: в скобках процентное содержание групп веществ от массы экстракта бересты или луба.

Состав кристаллов А и Б определяли методом ГЖХ. Фильтрат Б и нейтральные вещества петролейного экстракта луба методом колоночной хроматографии разделяли на фракции, из которых повторным хроматографированием или перекристаллизацией извлекали индивидуальные соединения. Для колоночной хроматографии использовали силикагель марки АСКГ с размером зерен 100-200 меш (г. Воскресенск), в качестве элюента - петролейный эфир (40-70°С) с постепенной добавкой диэтилового эфира от 1 до 30 %, ацетона от 20 до 100%, а также этанол с изопропанолом (1:1), этанол. Для разделения сесквитерпеновых углеводородов из бересты применяли силикагель с добавкой нитрата серебра (из расчета 10% от массы силикагеля). Строение индивидуальных соединений устанавливали с помощью спектроскопии: и С (CDC13, §-шкала) и масс-спектрометрии.

2. Химический состав бересты и луба. В результате исследования группового состава основных компонентов (табл. 1) определены различия в химическом составе бересты и луба. Береста содержит больше соединений, растворимых в диэтиловом эфире, а луб водорастворимых веществ. Отличительной особенностью бересты является наличие в ней суберина. В лубе содержится больше полисахаридов, чем в бересте. Для луба характерно более высокое содержание лигнина.

Таблица 1

Групповой состав структурных компонентов и экстрактивных веществ бересты и луба,

% от массы сухого сырья

Группы соединений Береста Луб

Экстрактивные вещества, извлекаемые последовательно диэтаповым эфиром 19,6 3,0

этанолом 9,5 12,8

горячей водой 0,9 5,6

спиртовым раствором КОН (суберин) 33,1 1,4

1%-ным водным раствором ЫаОН 21,2 18,4

Холоцеллюлоза 8,5 38,7

Лшиин 7,1 18,1

Минеральные вещества 0,3 1,5

Азот 0,53 0,45

В бересте содержание основных групп соединений, за исключением веществ, растворимых в горячей воде, увеличивается по высоте ствола, а в лубе - уменьшается, за исключением пентозанов (табл. 2).

Таблица 2

Распределение основных компонентов бересты и луба по высоте дерева, % от массы сухого сырья

Группы соединений Высота, доли от общей высоты ствола

0,1 0,3 0,6 0,9

БЕРЕСТА

Экстрактивные вещества*, извлекаемые диэтиловым эфиром 16,3 19,6 21,5 27,5

этанолом 24,2 29,1 32,0 37,9

горячей водой 1,8 0,9 0,9 0,6

Суберин 26,4 33,1 34,5 39,3

Холоцеллюлоза 7,6 8,5 9Д 9,7

Минеральные вещества 0,28 0,31 0,48 0,51

ЛУБ

Экстрактивные вещества, извлекаемые диэтиловым эфиром 3,2 3,0 2,0 2,5

этанолом 17,3 15,8 14,4 13,6

горячей водой 19,6 19,3 18,9 15,0

Целлюлоза 23,9 23,4 22,6 22,5

Легкогидролизуемые полисахариды 29,9 28,1 27,0 25,6

Пентозаиы 20,0 21,8 23,7 25,5

Лигнин 18,1 18,1 18,5 18,5

Минеральные вещества 1,6 1,5 0,6 0,5

* - содержание экстрактивных веществ определяли в отдельных образцах.

3. Состав соединений петролейных экстрактов бересты и луба представлен в табл. 5.

Алканы. В лубе идентифицированы н-алканы состава С18-С24 с преобладанием углеводорода С2зН48. В бересте н-алканы не обнаружены.

Сесквитерпеноиды. Из фракции углеводородов бересты были выделены три соединения с молекулярной массой 204, которая соответствует брутто формуле сесквитерпенов С15Н24: а-сантален (1), а-транс-бергамотен (2), |3-транс-бергамотен (3). В ИК-спектрах соединений имеются полосы поглощения трехзамещенной двойной связи в области

1670 см"1, а в соединении (3) - экзометиленовой двойной связи 1640 и 3080 см*1. Структуры были установлены на основании данных спектров ЯМР 'Н и "С (табл. 3).

Таблица 3

Данные спектров ЯМР *Н и "С углеводородов бересты (1-3), химический сдвиг в м.д. 5-ппсалы, (1) в Гц

Атом углеро да а-сантален (1) а-транс-бсргамотен (2) Р-транс-бергамотен (3)

ЯМР "С ЯМР 'Н ЯМР "С ЯМР 'Н ЯМР "С ЯМР 'Н

1 27,4 с — 45,4 д 2,02 т (7,5) 50,2 д 2,29 м

2 19,5 д 0,82 д (10) 144,4 с — 152,1 с —

3 31,5 т 1,06 д (15), 1,61 д (15) 116,5д 5,22 ушир. с 27,1т 2,52 дц (5,5)

4 38,2 д 1,62 с 31,6 т 1,19 д (8,6), 2,32 м 23,7 т 1,82 д (8,6), 2,32 м

5 31,0 т 1,04 д (15), 1,59 д (15) 39,0 д 2,17 м 38,7 д 2,05 м

6 19,5 д 0,82 д (10) 41,1с — 43,8 с —

7 45,8 с - 31,2 т 2,21 м 29,7 т 2,29 м, 1,41д (10,5)

8 34,6 т 1,19 м 38,6 т 1,65 м 38,2 т 1,12 м

9 10 17,5 кв 0,83 с 23,9 т 1,99 м 23,5 т 1,92 ушир. дт (7,2; 7,2)

10,7 кв 0,99 с 125, Зд 5,19 т (7) 125,1д 5,15 т (7)

11 23,3 т 1,88 м 130,8 с — 131,1с —

12 125,5д 5,11т (7) 17,4 кв 1,64 с 17,5 кв 1,61с

13 130,8 с — 25,7 кв 1,72 с 25,7 кв 1,69 с

14 25,7 кв 1,67 с 17,5 кв 0,86 с 18,6 кв 0,70 с

15 17,5 кв 1,60 с 23,0 кв 1,68 д (1,3) 106,0 т 4,55 ушир.с, 4,62 ушир. с

Методом хроматомасс-спектрометрии в эфирном масле бересты (выход 0,14% от м.с.с.) были идентифицированы углеводороды: Р-кариофиллен (4), р-бизаболен (5), фарнезен (6) и спирт а-бизаболол (7). Из экстракта бересты были выделены и другие кислородсодержащие сесквитерпеноиды: оксиды а-санталена (8) и а-транс-бергамотена (9), 6-гидрокси-р-кариофиллен (10).

Все сесквитерпеноиды идентифицированы в экстрактивных веществах бересты впервые и, за исключением р-кариофиллена (4) и 6-

гидрокси-Р-кариофиллена (10), не определены в других частях дерева.

Тритерпеноиды (11 - 21) в коре березы представлены несколькими классами соединений. В бересте и в лубе присутствуют лупеол (11), бетулин (12), лупан-3р,20-диол (13), Р-ситостерин (14) и ацетат олеаноловой кислоты (15).

В лубе определен цитростадиенол (16), сквален (17) и бетулиновая кислота (18). Из экстракта бересты выделены: лупенон (19), бетулоновый альдегид (20) и бетулоновая кислота (21).

НО

Сложные эфиры алифатических кислот. Из фракции сложных эфиров бересты было выделено два соединения (А и Б), на спектрах ЯМР *Н которых присутствуют сигналы тритерпеноида лупанового ряда, а именно остатка лупеола: дублеты при 4,56 и 4,67 м.д. относятся к протонам экзометиленовой группы; синглет 1,67 м.д. принадлежит метальной группе, связанной с атомом углерода двойной связи; в области 0,7-1,02 м.д. проявляются сигналы шеста метальных групп. Сигнал протона у С3 тритерпеноида проявляется в виде дублета дублетов при 4,48 м.д. в соединении А и при 4,56 м.д. в соединении Б. На спектре ЯМР 'Н соединения А видны сигналы, относящиеся к фрагментам жирной кислоты: триплет на 2Н при 2,29 м.д. принадлежит СН2-группе в а-положении к сложноэфирной связи, сигналы СНг-групп алифатической цепи проявляются при 1,24 м.д. Отсутствие в спектре сигналов, характерных для протонов при атомах углерода двойной связи, позволил определить кислотную составляющую как насыщенную жирную кислоту. Хроматомасс-спектрометрия кислотной составляющей после омыления эфира А показал наличие во фракции только пальмитиновой кислоты.

В спектре ЯМР *Н соединения Б (белые кристаллы с температурой плавления ТШ1=236-238°С) имеются сигналы, характерные для остатка лупеола и отсутствуют сигналы, характерные для высших жирных кислот. Но в области 8,1 м.д. наблюдается сигнал интенсивностью 1Н в виде синглета. В спектре ЯМР 13С соединения Б видны сигналы 31 атома углерода, 30 из них принадлежат спиртовой составляющей (остаток лупеола). На долю кислотной составляющей остается один атом углерода (ЯМР 13С: 161,1 м.д.) и протон (ЯМР 'Н: 8,1 м.д.) следовательно, кислотный остаток может быть муравьиной кислотой. Строение формиата

лупеола (25) было подтверждено встречным синтезом. Спектр ЯМР 'Н синтезированного формиата лупеола совпал со спектром выделенного соединения. Пальмитат лупеола (22) и формиат лупеола (23) впервые идентифицированы в бересте березы повислой.

Состав сложных эфиров из луба определяли после омыления фракции и разделения продуктов омыления на кислоты и неомыляемые вещества. Компонентами спиртовой составляющей сложных эфиров луба являются лупеол (11) - 8,9%, Р-ситостерин (14) - 36,6%, цитростадиенол (16) -28,5%, 24-метиленциклоартанол - 2,9% (24) и бетулапренолы, состоящие из 6-9 изопреновых звеньев (25) -19,3%.

Кислотная составляющая представлена высшими жирными кислотами, среди которых преобладают ненасыщенные кислоты (табл. 4).

В лубе определены ацилглицерины. Обращает на себя внимание высокое содержание (70,1%) линолевой кислоты во фракции триацилглицеринов (табл. 4). Соотношение насыщенных и ненасыщенных кислот в ди- и моноацилглицеринах составляет примерно 1:3 и 1:1, соответственно.

Таблица 4

Состав и содержание жирных кислот из луба, % от суммы кислот

Кислота Свободные кислоты Сложные эфиры Триацил-глицерины Диацилгли-церины Моноацшх-глицерины

СиНз.СООН (пальмитиновая) 18,3 7,2 8,3 9,5 21,2

С17Н33СООН (стеариновая) 3,6 2,4 1,6 1,9 2,4

С,7Н31СООН (олеиновая) 14,9 9,0 6,2 9,8 9,6

СПН»СООН (лино левая) 39,5 50,2 70,1 50,1 32,7

С,7Н27СООН (линоленовая) 3,1 2,2 6,6 3,5 1,7

С19Н39СООН (арахиновая) 3,8 10,5 0,5 3,1 2,4

С20Н41СООН 2,1 3,8 Следы 0,3 Следы

С21Н43СООН (бегеновая) 6,3 9,0 1,1 3,7 6,1

С22Н45СООН 2,2 1,8 1,3 0,9 2,2

С23Н47СООН (лигноцериновая) 2,1 1,8 2,3 0,3 1,2

С24Н49СООН 0,4 0,3 Следы 0,6 1,8

С25Н51СООН 0,3 Следы Следы 0,2 0,3

Сумма насыщенных кислот 39,1 36,8 15,1 20,5 37,6

Сумма ненасыщенных кислот 57,5 61,4 82,9 63,4 44,0

Неидентифишро-вано 3,4 1,8 2,0 16,1 18,4

Полипренолы представлены в лубе бетулапренолами (25), которые входят в состав спиртовой составляющей сложных эфиров и не обнаружены в свободном виде.

Спектры ЯМР 'Н двух соединений из фракции углеводородов луба отличались от спектра сквалена (11) наличием дублета с центром 4,75 м.д. (СН2=С<) и соотношением сигналов метальных групп в цис- и трансконфигурациях у атомов углерода трехзамещенных двойных связей в области 1,68 и 1,60 м.д. В сквалене это соотношение составляет 1:3 (2 и 6 метилов), в одном соединении это соотношение было 5:2, а в другом - 5:3. Имеется еще одно отличие спектров сквалена и выделенных соединений: наличие в последних сигнала углерода метановой труппы в спектре ЯМР 13С при 42,8 м.д. Наличие в спектрах терпеновых углеводородов групп >СН- и >С=СН2 предполагает образование цикла в выделенных соединениях. Такой цикл в терпеноидах может получиться при атаке карбкатионом трехзамещенной двойной связи с образованием следующего фрагмента:

I I

R,-C=CH—...........R2+-* R.!—С—¿Н—...........R2

СН3 ¿Н2

Масс-спектрометрическое исследование выделенных соединений показало, что соединения, имеющие молекулярные массы 476 и 544 (брутто-формулы Сз5Н56 и С4оНб4), являются гомологами, отличающимися на одно изопреновое звено. В масс-спектрах выделенных соединений наблюдался осколочный ион с массой 299, отсутствующий при распаде ациклических терпеноидов. Ион с массой 299 должен соответствовать 18-членному циклу с четырьмя метальными группами у соответствующих трехзамещенных двойных связей. Моделирование пространственной структуры с минимальной стерической энергией на примере молекулы с брутто-формулой С35Н56 (масса 476,8) с помощью программы ММ2 пакета Chem3D Ultra 8D из ChemOffice 2004 позволило определить, что минимумом энергии (51,02 кДж/моль) обладает молекула с 18 атомами углерода в цикле. Молекулы с 14 и 18 атомами в цикле имеют значение

55,87 и 82,85 кДж/моль, соответственно. Таким образом, выделенные соединения являются циклическими ттолиизопренами с 18 атомами в цикле.

Сообщений о выделении соединений Т\ 4,8,12,16-тетраметил-

1 -([Е]5,9-диметил-1 -метилен-дека-4,8-диенил)-циклоокта-3,7,11,15-тетраена (26) и [Ъ,Ъ,Ъ,Ъ] 4,8,12,16-тетраметил-1-([Е,Е] 5,9,13-триметил-1-метилен-тетрадека-4,8,12-триенил)-циклоокта-3,7,11,15-тетраена (27) из растительного сырья в литературе не найдено.

Из результатов исследования состава экстрактивных веществ коры Betula pendula Roth., извлекаемых петролейным эфиром, следует, что береста и луб имеют как одинаковые, так и различные соединения (табл. 5). Биосинтез тритерпеноидов в бересте Betula pendula Roth, направлен на образование, в основном, пснтациклических тритерпеноидов лупанового типа. В лубе также содержатся пентациклические тритерненоиды, но состав тритерпеноидов луба отличается от бересты болыпим количеством тетрациклических тритерпеноидов, которые находятся в экстракте и в "свободном" виде, и входят в состав сложных эфиров. Если в бересте бетулин - основной компонент экстрактивных веществ, то в лубе его содержание значительно ниже. Экстракт луба отличается от экстракта бересты более высоким содержанием сложных эфиров терпеновых спиртов и алифатических кислот, наличием ацилглицеринов и составом фракций углеводородов. Среди экстрактивных веществ луба не обнаружено фракций карбонилсодержащих соединений.

Таблица 5

Состав экстрактивных веществ бересты и луба, извлекаемых петролейным эфиром

Класс соединений Соединения Содержание, % от экстракта

Береста Луб

Углеводороды 1,32 6,13

Алканы — 0,43

Терпены, в том чцсле: 1,32 5,70

а-Сантален 0,46 —

а-Транс-бергамотен 0,72 —

Р-Транс-бергамотен 0,07 —

Р-Бизаболен Следы —

Фарнезен Следы —

Р-Кариофиллен Следы —

Сквален — 1,35

С35Н56 — 2,54

СадН« — 1,39

Сложные эфиры Сложные эфиры бетулапренолов и высших жирных кислот — 2,66

Сложные эфиры тритерпеноидов и высших жирных кислот — 10,64

Пальмитат лупеола 0,26 —

Формиат лупеола 0,18 —

Триадилглицерины — 37,0

Диацилглицерины — 7,53

Моноацилглицерины — 2,80

Оксиды Оксид а-санталена 0,12 —

Оксид а-транс-бергамотена 0,14 —

Кетоны Лупенон 2,92 —

Альдегиды Бетулоновый альдегид 1,55 —

Спирты Лупеол 12,10 2,98

Р-Ситостерин 1,87 3,33

Цитростадиенол — 0,88

6-Гидрокси-Р-кариофиллен 0,63 —

а-Бизаболол Следа —

Бетулин 74,73 3,41

Лупан-3р,20-диол 1,45 3,94

Кислоты Бетулиновая кислота — 0,26

Бетулоиовая кислота 0,16 —

Ацетат олеаноловой к-ты 0,30 0,70

Высшие жирные кислоты — 4,20

4. Получение бетулина.

Для извлечения бетулина из бересты в качестве экстрагентов были проверены: петролейный эфир (температура кипения 70-100°С), толуол, хлороформ, ацетон, а также их смеси. Было определено, что с увеличением полярности экстрагента выход экстрактивных веществ значительно увеличивается. Содержание бетулина в экстрактах колеблется от 60% (хлороформ) до 90% (петролейный эфир).

Наилучшие результаты были получены при экстракции бересты углеводородным растворителем. Содержание бетулина в кристаллической части, отделенной после охлаждения экстракта, является достаточным для синтеза бетулиновой кислоты и составляет от 90 до 95% с выходом 1620% от сухого сырья. Наработка бетулина для синтеза бетулиновой кислоты проведена на промышленном оборудовании цеха лесобиохимии (Лисино, Ленинградская область). В качестве сырья была использована кора березы (отход Ижорского фанерного завода). Экстракцию проводили бензином в дефлегмационно-оросительном экстракторе. Получено 8,7 кг препарата "Бетулин".

5. Получение бетулиновой кислоты.

Получение бетулиновой кислоты возможно путем окисления бетулина до бетулоновой кислоты с последующим восстановлением карбонильной группы.

бетулин "' бетулиновая кислота

бетулоновая кислота

При окислении бетулина пиридиндихроматным комплексом (в качестве растворителя - диметилформамид с уксусным ангидридом) выход бетулоновой кислоты составил 55%. Спектр ЯМР *Н синтезированного вещества был идентичен спектру бетулоновой кислоты, выделенной из бересты. Было определено, что восстановление бетулоновой кислоты боргидридом натрия идет количественно в пропаноле при комнатной

температуре в течение трех часов. Соотношение соединений с Зр- и За-спиртовой группой в продуктах восстановления бетулоновой кислоты составило 95:5. Перекристаллизация из этанола дала белые кристаллы с температурой плавления 296-298°С, в спектре ЯМР 'Н которых не наблюдались сигналы, соответствующие а-изомеру бетулиновой кислоты. После упаривания фильтрат, содержащий а-изомер и небольшое количество (3-изомера, снова окисляли и восстанавливали.

По результатам работы сделаны следующие основные выводы;

1. Определен химический состав коры березы повислой. Береста содержит больше эфирорастворимых, а луб - водорастворимых и минеральных веществ. В лубе содержится больше полисахаридов, чем в бересте. В бересте содержание основных групп соединений, за исключением веществ, растворимых в горячей воде, увеличивается по высоте ствола, а в лубе -уменьшается, за исключением пентозанов.

2. Предложена схема исследования экстрактивных веществ бересты, растворимых в петролейном эфире, основанная на отделении выпавших кристаллов после охлаждения, перекристаллизации остатка из гептана и анализе кристаллов методом ГЖХ и веществ, растворимых в гептане, методом колоночной хроматографии.

3. Показано, что основными компонентами петролейного экстракта бересты являются тритерпеноиды лупанового типа. Тритерпеноиды составляют 98% от экстракта бересты. Выделено и установлено строение 11 тритерпеноидов лупанового типа и ацетата олеаноловой кислоты. Среди тритерпеноидов установлено строение двух соединений, не найденных ранее в бересте березы повислой (пальмитат и формиат лупеола).

4. В экстракте бересты впервые определены сесквитерпеноиды: а-сантален, а- и р-транс-бергамотены, р-бизаболен, фарнезен, оксиды а-санталена и а-транс-бергамотена, а-бизаболол. Идентифицированные в бересте р-кариофиллен и 6-гидрокси-Р-кариофиллен ранее были найдены в почках березы. Выделенные сесквитерпеноиды относятся к пяти типам строения.

5. Установлено, что основное содержание экстракта луба составляют сложные эфиры и ацилСлицерины, кислотная составляющая которых представлена высшими жирными кислотами с преобладанием ненасыщенных кислот. В спиртовой составляющей сложных эфиров идентифицированы бетулапренолы, 24-метиленциклоартанол, лупеол, цитростадиенол и ß-ситостерин. Последние три спирта присутствуют в экстракте и в "свободном" виде.

6. Установлено строение двух неизвестных ранее углеводородов Сз5 и Сад с 18-членным макроциклом: [Z,Z,Z,Z] 4,8,12,16-тетраметил-1-([Е]5,9-диметил-1 -метилен-дека-4,8-диенил)- циклоокта-3,7,11,15-тетраена и [Z,Z,Z,Z] 4,8,12,1б-тетраметил-1-([Е,Е] 5,9,13-триметил-1-метилен-тетрадека-4,8,12-триенил)-циклоокта-3,7,11,15-тетраена.

7. Предложен экстракционный способ переработки бересты березы с использованием углеводородного экстрагента и получением бетулина и концентрата тритерпеноидов (Патент РФ № 2184120).

8. Разработан способ получения бетулиновой кислоты, основанный на окислении бетулина ПДХК с последующим восстановлением получаемой бетулоновой кислоты боргидридом натрия (Патент № 2190622).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Шабанова Н.Ю., Ведерников Д.Н., Рощин В.И. Сесквитерпены корки Betulapendula Roth. // Растительные ресурсы. - 2003. - Вып. 3- С.106-110.

2. Шабанова Н.Ю., Ведерников Д.Н. Синтез бетулиновой кислоты // Сборник докладов молодых ученых на ежегодной научной конференции Санкт-Петсрбургской лесотехнической академии: Вып. 5, СПб.: СПбЛТА, 2001.-92с.-С. 20-25.

3. Рощин В.И., Шабанова Н.Ю, Ведерников Д.Н. Способ получения бетулина. - Патент № 2184120,2002.

4. Рощин В .И., Шабанова Н.Ю, Ведерников Д.Н. Способ получения бетулиновой кислоты. - Патент № 2190622,2002.

5. Vedernikov D.N., Shabanova N.Y., Galashkina N.G., Migunova Y.V., Roshchin V.l., Krutov S.M. Birch extractives and ways of their utilization // Sixth European Workshop on Lignocellulosics and Pulp, 3-6 September. -Bordeaux, 2000.- P. 641-643.

6. Ведерников Д.Н., Рощин В.И., Шабанова Н.Ю. Выделение бетулина из береста и синтез бетулиновой и бетулоновой кислот// Тез. докл. I Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ", 25-30 сентября. - Сыктывкар, 2000. - С 37.

7. Шабанова Н.Ю, Кошкин А.В., Ведерников Д.Н., Рощин В.И. Переработка коры березы // Актуальные проблемы лесного комплекса: Сб. науч. тр. / БГИТА. - Брянск: БГИТА, 2001. - Вып. 4. - С. 132-135 .

8. Vedernikov D.N., Shabanova N.Y., Roshchin V.I. Birch buds and outer bark petroleum extract new compounds //1 lm International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, 11-14 June-Nice (France), 2001.-Vol. П.-P. 95-97.

9. Шабанова Н.Ю., Ведерников Д.Н., Рощин В.И. Сесквитерпеноиды корки Betula pendula Roth. // Сб. мат. П Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ", 24-27 июня. - Казань, 2002. -С. 38.

10. Shabanova N.Y., Vedernikov D.N., Roshchin V.I. Birch extractives and ways of their utilization // Seventh European Workshop on Lignocellulosics and Pulp, 26-29 August. - Turku, 2002.- P. 517-519r

11. Ведерников Д.Н., Шабанова Н.Ю., Галашкина Н.Г., Карачкина Н.Л., Рощин В.И. Необычные терпеноиды березы повислой Betula pendula Roth. // Тез. докл. Ш Всероссийской конф. "Химия и технология растительных веществ", 7-10 сентября. - Саратов, 2004. - С. 60-61.

12. Ведерников Д.Н., Шабанова Н.Ю, Рощин В.И. Химический состав луба березы повислой Betula pendula Roth. // Строение, свойства и качество древесины - 2004: Труды IV международного симпозиума, 13-16 сентября. -Санкт-Петербург: СПбГЛТА, 2004. - Т. 1. - С. 198-200.

ШАБАНОВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать с оригинал-макета 22.12.05. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. _Уч.-изд. л. 1,0. Печ. л. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ № 324. С 25а._

Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия Издательско-полиграфический отдел СПбГЛТА 194021, Санкт-Петербург, Институтский пер., 3

к

П

1

SYtb

06-812

r

I

I

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Общие сведения о березе повислой.

1.2. Строение коры.

1.3. Химический состав коры березы.

1.4. Состав экстрактивных веществ коры березы.

1.4.1. Нейтральные соединения.

1.4.2. Кислоты.

1.5.Схемы исследования экстрактивных веществ коры березы.

1.6. Биологическая активность и использование экстрактивных веществ коры в медицине, ветеринарии и косметологии.

1.7. Способы выделения бетулина.

1.8. Способы синтеза бетулиновой кислоты.

2. Методическая часть.

2.1. Отбор образцов для исследования.

2.2. Методы определения основных характеристик исходных образцов коры березы.

2.3. Фракционирование петролейных экстрактов бересты и луба и выделение индивидуальных соединений.

2.4. Разработка способа получения бетулина.

2.5. Методы синтеза бетулиновой кислоты.

2.5.1. Синтез через диацетат бетулина.

2.5.2. Синтез через бетулоновую кислоту.

2.6. Химические методы анализа выделенных соединений.

2.7. Инструментальные методы анализа.

3. Экспериментальная часть.

• 3.1. Общая характеристика коры исследуемого дерева березы повислой.

3.2. Определение состава петролейных экстрактов бересты и луба.

3.2.1. Состав углеводородных фракций.

3.2.2. Состав сложных эфиров.

3.2.3. Состав фракций карбонилсодержащих соединений и оксидов.

3.2.4. Состав фракций спиртов и кислот.

3.3. Определение способа получения бетулина.

3.4. Разработка синтеза бетулиновой кислоты.

3.4.1. Получение бетулиновой кислоты по методу Ружички.

3.4.2. Получение бетулина через бетулоновую кислоту.

3.4.3. Восстановление бетулоновой кислоты и отделение а-изомера бетулиновой кислоты.

Выводы.

Важнейшим направлением рационального природопользования и ресурсосбережения в отраслях лесного комплекса остается увеличение степени использования биомассы дерева. Решение этой проблемы непосредственно направлено на повышение эффективности комплексной переработки биомассы дерева и снижение загрязнения природной среды производственными отходами.

На целлюлозно-бумажных и деревообрабатывающих предприятиях (фанерные комбинаты) в результате окорки березовой древесины скапливается большое количество коры, которая не имеет промышленного применения и в лучшем случае идет на сжигание в качестве топлива. Однако, помимо традиционных продуктов из березы, в том числе из коры, можно получить ряд новых, используя при этом отходы деревообработки.

Содержание коры составляет примерно 12,5% от массы древесины [1]. В зависимости от анатомического строения и физиологической активности ткани коры можно разделить на две группы: внутренний слой (луб) и наружный (береста). Физиологическая функция внутреннего слоя коры заключается в переносе продуктов ассимиляции. Он служит также для хранения резервных питательных веществ. Наружный слой коры, состоящий в основном из мертвых тканей, физиологически неактивен. Его роль заключается в защите древесины от внешних воздействий [2].

Береста давно используется для получения берестового дегтя, который обладает дезинфицирующим свойством и употребляется как наружное средство, особенно в мазях от чесотки (мазь Вилькинского), для лечения ран (входит в состав мази Вишневского) [3]. Береста в народной медицине использовалась в качестве антисептика при лечении ран и кожных заболеваний.

Основное содержание экстрактивных веществ бересты составляет бетулин, придающий корке белый цвет. Бетулин проявляет противовоспалительное, противоопухолевое действие, а также обладает антивирусными и желчегонными свойствами. Из бетулина химическим путем можно получить бетулиновую кислоту, которая показала специфическую активность против меланомы (рак кожи) [4]. Это соединение найдено в коре и листьях многих растений, но ее выделение малорентабельно из-за низкого содержания (менее 1%), тогда как содержание бетулина в бересте достигает 10 — 30% [5]. Бетулин и бетулиновую кислоту можно использовать в пищевой, косметической и фармацевтической промышленностях.

Внутренняя часть коры - луб отличается от бересты составом экстрактивных веществ. Луб содержит больше веществ фенольной природы и может служить сырьем для получения дубильных экстрактов [6, 7]. Резервные питательные вещества, которые накапливаются в лубе в виде жиров, представляют интерес как источник высших жирных кислот для косметологии. Отделение луба от бересты технологически осуществимо [8], что делает возможным раздельную переработку частей коры с получением ряда ценных продуктов.

Несмотря на интерес со стороны исследователей к коре березы, данных по составу соединений экстрактивных веществ недостаточно. Известные данные носят отрывочный характер и не позволяют в полной мере оценить их состав. Для разработки комплексной технологии переработки коры знание состава экстрактивных веществ является научной базой.

Учитывая доступность и потенциальную ценность березовой коры для химической переработки, целью данного исследования являлось изучение состава экстрактивных веществ коры березы и разработка синтеза бетулиновой кислоты из бетулина. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- разработать схемы определения группового состава структурных компонентов и экстрактивных веществ бересты и луба; выделить и установить строение индивидуальных соединений углеводородных экстрактов из частей коры;

- определить способ переработки коры березы с получением бетулина для синтеза бетулиновой кислоты;

- разработать синтез бетулиновой кислоты.

В первой части диссертации представлены литературные данные по строению и химическому составу коры березы. Рассмотрены способы выделения бетулина и синтеза бетулиновой кислоты, а также некоторые данные о биологической активности компонентов березовой коры и их производных.

Вторая часть диссертации посвящена методам, которые применяли в * экспериментальной работе, приведены схемы анализа химического состава и экстрактивных веществ коры березы. Изложены основные характеристики приборов, используемых для идентификации индивидуальных соединений и условия проведения анализов.

В экспериментальной части приведены результаты исследования группового состава, а также качественного и количественного состава углеводородных экстрактов бересты и луба березы. В результате проведенных исследований примерно на 85% изучен состав углеводородных экстрактов бересты и луба. Большую часть экстрактивных веществ луба составляют сложные эфиры терпеноидов (лупеола, Р-ситостерина, цитростадиенола, 24-метиленциклоартанола и бетулапренолов) и высших жирных кислот (13,3%) и ацилглицерины (37,0%). Эти группы веществ отсутствуют в бересте. Кислотная составляющая сложных эфиров и ацилглицеринов представлена высшими жирными кислотами, среди которых преобладают ненасыщенные кислоты С^. Основное содержание экстракта бересты составляет пентациклические тритерпеноиды лупанового ряда -ф бетулин (74,7%), лупеол (12,1%) и другие. В экстракте луба содержание бетулина составило 3,4%.

Наши исследования показали, что в бересте кроме тритерпеноидов присутствуют соединения, относящиеся к другому классу -сесквитерпеноиды. Из углеводородного экстракта бересты был выделен 6-гидрокси-Р-кариофиллен, являющийся одним из основных компонентов эфирных масел почек березы [9]. Из экстракта бересты впервые выделены сесквитерпены: а-сантален, а-транс-бергамотен, Р-транс-бергамотен, а также оксиды выделенных сесквитерпенов. В следовых количествах в бересте идентифицированы (З-кариофиллен, Р-бизаболен, фарнезен и а-бизаболол.

В лубе определены политерпеновые углеводороды С35 и С40 с 18-членным макроциклом: 4,8,12,16-тетраметил-1-([Е] 5,9-диметил-1метилен-дека-4,8-диенил)-циклоокта-3,7,11,15-тетраен и 4,8,12,16тетраметил-1 -([Е,Е] 5,9,13-триметил-1 -метилен-тетрадека-4,8,12-триенил)-циклоокта-3,7,11,15-тетраен.

Предложен способ переработки коры (Патент РФ № 2184120) с получением бетулина (16-20% от массы сухого сырья) и с массовой долей основного вещества 90-95%, позволяющей использовать продукт для синтеза бетулиновой кислоты [10].

Разработан способ получения бетулиновой кислоты (Патент РФ № 2190622), основанный на окислении бетулина с последующим восстановлением бетулоновой кислоты и перекристаллизацией [11]. Предлагается использовать в качестве окислителя пиридиндихроматный комплекс (ПДХК) с уксусным ангидридом (УА) в диметилформамиде (ДМФА). Выход бетулоновой кислоты составляет 60%, а выход бетулиновой кислоты 55% от исходного бетулина.

Автор благодарит за оказанную помощь в работе над диссертацией своих научных руководителей - доктора химических наук, профессора Рощина В.И. и кандидата химических наук, доцента Ведерникова Д.Н., а также всех сотрудников кафедры Химии древесины, физической и коллоидной химии.

1. Литературный обзор

ВЫВОДЫ

На основании результатов проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Определен химический состав коры березы повислой. Береста содержит больше эфирорастворимых, а луб - водорастворимых и минеральных веществ. В лубе содержится больше полисахаридов, чем в бересте. В бересте содержание основных групп соединений, за исключением веществ, растворимых в горячей воде, увеличивается по высоте ствола, а в лубе - уменьшается, за исключением пентозанов.

2. Предложена схема исследования экстрактивных веществ бересты, растворимых в петролейном эфире, основанная на отделении выпавших кристаллов после охлаждения, перекристаллизации остатка из гептана и анализе кристаллов методом ГЖХ, а веществ, растворимых в гептане, методом колоночной хроматографии с установлением строения выделенных соединений или их производных спектральными методами.

3. Показано, что основными компонентами петролейного экстракта бересты являются тритерпеноиды лупанового типа. Тритерпеноиды составляют 98% от экстракта бересты. Выделено и установлено строение 11 тритерпеноидов лупанового типа и ацетата олеаноловой кислоты. Среди тритерпеноидов установлено строение двух соединений, не найденных ранее в бересте березы повислой (пальмитат и формиат лупеола).

4. В экстракте бересты впервые определены сесквитерпеноиды, которые принадлежат к четырем типам: а-сантален, а- и Р-транс-бергамотены, Р-бизаболен, фарнезен, оксиды а-санталена и а-транс-бергамотена, а-бизаболол. Идентифицированные в бересте Р-кариофиллен и 6-гидрокси-Р-кариофиллен ранее были найдены в почках березы.

6. Установлено, что основное содержание экстракта луба составляют сложные эфиры (13,3%) и ацилглицерины (47,3%), кислотная составляющая которых представлена высшими жирными кислотами с преобладаниями ненасыщенных кислот. В спиртовой составляющей сложных эфиров идентифицированы бетулапренолы, 24-метиленциклоартанол, лупеол, цитростадиенол и Р-ситостерин. Последние три спирта присутствуют в экстракте и в свободном виде.

7. Из экстракта луба выделены терпеновые углеводороды: сквален и два неизвестных ранее углеводорода С35 и С40 с 18-членным макроциклом:

12,16гтетраметил-1 -([Е]5,9-диметил-1 -метилен-дека-4,8-диенил)-циклоокта-3,7,11,15-тетраен и [г,Ъ,Ъ, 4,8,12,16-тетраметил-1-([Е,Е] 5,9,13-триметил- 1-метилен-тетрадека-4,8,12-триенил)-циклоокта-3,7,11,15-тетраен.

8. Предложен способ переработки коры, включающий отделение бересты от луба, экстракцию бересты углеводородным растворителем и отделение кристаллической части с получением бетулина и концентрата тритерпеноидов. Выход препарата, содержащего 90-95% бетулина, составил 16-20% от сухого сырья (Патент РФ № 2184120).

9. Разработан способ получения бетулиновой кислоты, основанный на окислении бетулина пиридиндихроматным комплексом с последующим восстановлением бетулоновой кислоты боргидридом натрия. Выход бетулиновой кислоты составляет 55% от исходного бетулина (Патент РФ № 2190622).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования определены различия в групповом составе структурных компонентов и экстрактивных веществ бересты и луба березы повислой. Экстрактивные вещества бересты, извлекаемые петролейным эфиром, на 98% состоят из тритерпеноидов, среди которых в бересте березы повислой впервые идентифицированы пальмитат и формиат лупеола. В лубе также содержатся тритерпеноиды, но в отличие от бересты основное содержание экстракта (60%) составляют сложные эфиры терпеноидов с высшими жирными кислотами и ацилглицерины. Впервые определено: в бересте, в отличие от луба, кроме тритерпеноидов присутствуют сесквитерпеноиды, в лубе идентифицированы новые природные терпены С35 и С40 с 18-членным макроциклом.

На основании полученных данных по составу экстрактивных веществ отдельных частей коры березы предлагается схема переработки коры с получением биологически активных препаратов (рис. 9).

Но, несомненно, при любых вариантах переработки коры, бетулин является ценным продуктом, состоящим из индивидуального соединения. Бетулин относится к биологически активным веществам и имеет широкие перспективы применения в медицине, фармакологии и косметической промышленности, а также может быть использован для синтеза производных, в частности, бетулиновой кислоты.

Результаты опытно-промышленной выработки показали, что получение бетулина из коры березы возможно. Отделение бересты от луба технологически осуществимо [8]. После измельчения сырья нам удалось отделить бересту от луба. В качестве экстрагента был выбран углеводородный растворитель, так как он позволяет получать экстракт с содержанием бетулина в кристаллической части от 90 до 95%, что является достаточным для синтеза бетулиновой кислоты. При использовании более полярных растворителей (хлороформа, этанола) выход экстрактивных веществ увеличивается, но содержание бетулина в экстракте уменьшается и составляет 70-85%. Для синтеза бетулиновой кислоты необходима дополнительная перекристаллизация экстракта.

Так как растворимость бетулина в бензине низкая и бетулин начинает кристаллизоваться непосредственно в экстракторе, то необходимо изменить конструкцию дефлегмационно-оросительного экстрактора или проводить экстракцию ступенчато.

Для получения бетулиновой кислоты нами был проверен многостадийный способ Ружички, основным недостатком которого является низкий выход бетулиновой кислоты (30%). Модификации отдельных стадий привели к незначительному увеличению выхода продукта (до 35%). Двухстадийная схема получения бетулиновой кислоты оказалась предпочтительнее, и прежде всего из-за увеличения выхода продукта. При окислении бетулина пиридиндихроматным комплексом в диметилформамиде с уксусным ангидридом с последующим восстановлением бетулоновой кислоты боргидридом натрия выход бетулиновой кислоты составил 55% от исходного бетулина.

Таким образом, в результате проведенного исследования изучен состав экстрактивных веществ частей коры, определен способ получения бетулина и бетулиновой кислоты и предложена схема переработки коры березы с получением биологически активных веществ.

1. Кислицын А. Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, применение. Обзор // Химия древесины. 1994. - № 3. - С. 3-28.

2. Азаров В.И., Буров A.B., Оболенская A.B. Химия древесины и синтетических полимеров: Учебник для вузов. СПб.: СПбГЛТА, 1999. -628с.

3. Дары нашего леса. / Сост. Капорейко О.П. Екатеринбург, 2000. - 496с.

4. Pisha Е., Chai H., Lee I-S. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis // Nat. Med. -1995.-№10.-P. 1046-1051.

5. Семенченко В.Ф., Кудрин C.B. Содержание бетуленола во внешней коре березы // Фармация. 1992.- T. XLI-№ 4.- С. 24-27.

6. Демченко Е.А., Некрасова В.Б. Экстрактивные вещества коры осины и луба березы // Химическая и механическая переработка древесины и древесных отходов: Межвуз. сб. науч. тр.: Ленинград: ЛТА, 1977. Вып. III.-С. 45-47.

7. Воскресенский В.Е. Обоснование эффективной технологии и параметров оборудования для разделения березовой коры на компоненты: Дис. .д-ра техн. наук.-СПб., 1998.-351с.

8. Kaneko N., Ishii H. Caryophylladienes and their uses as oral bactericides and for flavor or fragrance preparations. JP 03 56, 410 91 56, 410., 12 Mar 1991.

9. A.c. 2184120 РФ Способ получения бетулина / В.И. Рощин, Н.Ю. Шабанова, Д.Н. Ведерников . 2002. - Бюл. № 18 (II ч).

10. A.c. 2190622 РФ Способ получения бетулиновой кислоты / В.И. Рощин, Н.Ю. Шабанова, Д.Н. Ведерников. 2002.- Бюл. № 28 (II ч).

11. Иванов А.Ф., Дерюгина Т.Ф., Кравченко JI.B. Биология древесных растений Минск, 1975- 264 с.

12. Черняева Г.Н., Долгодворова С.Я., Бондаренко С.М. Экстрактивные вещества березы. Красноярск, 1986.- 123 с.

13. Раскатов П.Б. Анатомия вегетативных органов древесных растений. -Воронеж, 1974.-104 с.

14. Хиллис В.Э. Экстрактивные вещества древесины и их значение в целлюлозно-бумажной промышленности. М., 1965. - 504 с.

15. Шарков В.И., Белявский И.А. К вопросу о химическом составе древесной коры (сообщение 1) // Лесохимическая промышленность. -1932.-№3-4.-С. 30-33.

16. Шарков В.И., Белявский И.А. К вопросу о химическом составе древесной коры (сообщение второе) // Лесохимическая промышленность. 1932.-№5-6.-С. 8-11.

17. Шарков В.И., Калнина В.Н., Собецкий С.В. О химическом составе древесной коры (сообщение 6) // Лесохимическая промышленность. -1938.-№5.-С. 8-12.

18. Шарков В.И., Куйбина Н.И., Соловьева Ю.П., Павлова Т.А. Количественный химический анализ растительного сырья. М., 1976. -72 с.

19. Ukkonen К., Erä V. Birch bark extractives // Kemia-Kemi. 1979. - Vol. 6. -№5.-P. 217-220.

20. Павлова Т.А., Куйбина Н.И., Иванова Л.Я., Медведева Е.Н., Шарков В.И. Химический состав коры и древесины хвойных и лиственных пород // Гидролизная и лесохимическая промышленность. 1977. - № 4. - С. 911.

21. Ekman R. The suberin monomers and triterpenoids from the outer bark of Betula verrucosa Ehrh. // Holzforschung. 1983. - Bd. 37 - № 4. - S. 205211.

22. Habiyaremye I., Stevanovic-Janezic Т., Riedl В., Garneau F-X., Jean F-I. Pentacyclic triterpenes of yellow birch bark from Quebec // Sixth European Workshop on Lignocellulosics and Pulp. 3-6 September. - Bordeaux, 2000. -P. 355-359.V

23. Ekman R. Lipophilic extractives of the inner bark of birch, Betula verrucosa Ehrh. // Finn. Chem. Lett. 1983. - № 7-8. - P. 162-165.

24. Lindgren B.O. Homologous aliphatic C30 C45 terpenols in birch wood // Acta Chem. Scand. - 1965.-Vol. 19.-№6.-P. 1317-1326.

25. Luckner M. Secondary metabolism in microorganisms, plants and animals. -Veb Gustav Fisher Verlag, Jena. 1984. - 576 p.

26. Ekman R., Sjoholm R. Betulinol 3-caffeate in outer bark of Betula verrucosa Ehrh. // Fin. Chem. Lett. 1983. -№ 5. - P. 134-136.

27. Похило Н.Д., Уварова Н.И. Изопреноиды различных видов рода Betula!I Химия природных соединений. 1988. - № 3. - С. 325-341.

28. Cole B.J.W., Bentley M.D., Hua Y., Bu L. Triterpenoid constituent in the outer bark of Betula alleghaniensis (Yellow birch) // Journal of wood chemistry and technology. 1991. - Vol. 11. - № 2. - P. 209-223.

29. Bergman J., Lindgren B.O., Svahn C.M. Lupan-Зр, 20-diol and lupan-3p, 20, 28-triol in bark from birch bark Betula verrucosa Erhr. // Acta Chem. Scand. -1966. Vol. 20. - № 6. - P. 1720-1721.

30. Маркова Н.П., Рощин В.И., Ковалев B.E. Состав экстрактивных веществдревесины березы // Химия древесины. 1983. - № 4. - С. 51-55.

31. Hannus К., Pensar G. Polyisoprenols in Pinus sylvestris needles // Phytochemistry. 1974. - Vol. 13. - P. 2563-2566.

32. Рощин В.И., Фрагина A.C., Соловьев B.A. Токоферолы и полипренолы из хвои ели Picea abies (L.) Karst. // Растительные ресурсы 1986. - Т. 22. - № 4. - С. 530-537.

33. Cole B.J.W., Bentley M.D., Hua J. Triterpenoid extractives in the outer bark of Betula lenta (Black birch) II Holzforschung. 1991. - Vol. 45. - № 4. - P. 265-268.

34. Fuchino H., Konishi S., Satoh Т., Yagi A., Saitsu K. Chemical evaluation of Betula species in Japan. II. Constituents of Betula platyphylla var. japonica II Chem. Pharm. Bull. 1996. - Vol. 44. - № 5. p. 1033-1038.

35. Похило Н.Д., Махнев A.K., Уварова Н.И. Состав тритерпеновой фракции экстрактов внешней коры берез Betula pendula и Betula pubescens II Тез. докл. совещания "Лесохимия и органический синтез". Сыктывкар, 1994. -С. 36.

36. Hayek E.W.H., Jordis U., Moche W., Sauter F. A bicentennial of betulin // Phytochemistry. 1989. - Vol. 28. - № 9. - P. 2229-2242.

37. Штанько Н.Г. Получение бетулина и синтез сложноэфирных пленкообразователей на его основе. Автореф. дис. . канд. техн. наук. -М.:, 1953.-Юс.

38. Jaaskelainen P. Betulinol and its utilisation // Paperi ja Puu. 1981. - № 10. -P. 599-603.

39. Одинокова Л.Э., Малиновская Г.В., Похило Н.Д., Уварова Н.И. Тритерпеноиды коры и веточек Betula davurica И Химия природных соединений. 1985. - № 3. - С. 414.

40. Rimpler Н., Kuhn Н., Leuckert Ch. Die triterpene von Betula pendula Roth, und Betula pubescens Ehrh // Archiv der pharmazie. 1966. - Bd. 299. - № 5. - S. 422^128.

41. Похило Н.Д., Малиновская Г.В., Кочергина Т.Ю., Одинокова Л.Э., Уварова Н.И. Изопреноиды внешней коры дальневосточных берез // Тез. докл. совещания "Лесохимия и органический синтез".- Сыктывкар, 1994. -С. 11.

42. Fuchino Н., Satoh Т., Tanaka N. Chemical evaluation of Betula species in Japan. I. Constituents of Betula ermanii II Chem.Pharm.Bull. 1995. - Vol. 43. -№ 11.-P. 1937-1942.

43. Fuchino H., Satoh Т., Shimizu M., Tanaka N. Chemical evaluation of Betula species in Japan. IV. Constituents of Betula davurica II Chem.Pharm.Bull. -1998.-Vol. 46.-№ l.-P. 166-168.

44. Hua J., Bentley M.D., Cole B.J.W., Murray K.D., Alford A.R. Triterpenes from the outer bark of Betula nigra И Journal of wood chemistry and technology. 1991. - Vol. 11. - № 4. p. 503-516.

45. Ветчинникова Л.В., Шуляковская Т.А., Канючкова Г.К. Жирнокислотный состав суммарных липидов различных органов Betula pendula Roth и В. pubescens Ehrh, произрастающих в Карелии // Растительные ресурсы. 2000 - Том 36. - Вып. 2.- С. 85-92.

46. Молотков Л.К., Косая Г.С., Звездина Л.К., Бирбровер Н.М., Кожевников А.А., Блехерт Г.П. Изменение свойств березовой древесины и сульфатнойвискозной целлюлозы в процессе хранения щепы // Химия древесины. -1980.-№5.-С. 31-37

47. Wood extractives and their significance to the pulp and paper industries. Edited by W.E. Hills.- 1962.-514 p.

48. Похило Н.Д, Махнев A.K., Деменкова JI.H., Уварова Н.И. Состав тритерпеновой фракции экстрактов коры Betula pendula и Betula pubescens II Химия древесины. 1990. - № 6. - С. 74-77.

49. Рапп О.А., Пашинский В.Г., Чучалин B.C. Сравнительная оценка фармакологической активности экстрактов коры березы, приготовленных на этаноле различной концентрации // Хим. фарм. журнал. 1996. - № 6. -С. 23-24.

50. Kitada Y. Application of Betula platyphylla to cosmetic // Bio-Industry. — 1998.-№3.-P. 30-37.

51. Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М., Коноплева Г.Е., Парфентьева Е.П., Скульте И.В. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1993. - Том 56. - № 4. - С. 53-55.

52. Материалы по испытанию фитокомплекса "бетуленол" из коры березы. Пятигорский Химико-фармакологический институт. - 1993.

53. Материалы 49 Региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров. Пятигорский Химико-фармакологический институт. - 1994. - С. 71-73.

54. Fulda S., Friesen С. and others Betulinic acid triggers CD95(APO-l/Fas) and p53-independent apoptosis via activation of caspases in neuroectodermal tumour // Cancer Research. 1997. - № 57. - P. 4956-4964.

55. Kashiwada Y., Hashimoto F., Cosentino L.M., Chen C-H., Garrett P.E., Lee K-H. Betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives as potent anti-HIV agents // J. Med. Chem. 1996. - № 39. - P. 1016-1017.

56. Fujioka Т., Kashiwada Y. Anti-AIDS agents, 11. Betulinic acid and platanic acid as anti-HIV principles from Syzigium claviflorum, and the anti-HIV activity of structurally related triterpenoids // J.Nat.Prod. 1994. - Vol. 57 - № 2.-P. 243-247.

57. Патов С.А., Пунегов В.В., Сычев Р.Л., Кучин А.В., Кодесс М.И. Синтез гликозидов бетулина и экдистероидов // Сб. мат. II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ", 24-27 июня. -Казань, 2002.-С. 35.

58. Флехтер О.Б., Медведева Н.И., Карачулина JI.T., Балтина JI.A., Зарудий Ф.С., Галин Ф.З., Толстиков Г.А. Синтез и противовоспалительная активность новых ацилпроизводных бетулина // Химико-фармацевтический журнал 2002 - Том. 36 - № 9- С. 29-32.

59. Кузнецова С.А., Щипко М.Л., Кузнецов Б.Н., Левданский В.А., Вепринкова Е.В., Ковальчук Н.М. Получение и свойства энтеросорбентов из луба березовой коры // Химия растительного сырья. 2004. - № 2. - С. 25-29.

60. Eckerman С., Ekman R. Comparison of solvents for extraction and crystallisation of betulinol from birch bark waste // Paperi ja Puu. 1985. - № 3.-P. 100-106.

61. A.c. 2138508 РФ Способ выделения бетулинола / Кислицын А.Н., Сластников И.И., Трофимов А.Н. // БИ. 1999. - № 27 (И ч). - С. 263.

62. Садриева O.A., Селянина Л.И. Кинетика извлечения бетулина из отходов переработки березы // Сб. мат. II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ", 24-27 июня. Казань, 2002. - С. 43.

63. Селянина Л.И. Экстракция бетулина из отходов переработки березы органическими растворителями // Тез. докл. III Всероссийской конф. "Химия и технология растительных веществ", 7-10 сентября. Саратов, 2004. - С. 247-248.

64. A.c. 2074867 РФ. Способ получения бетулина / Кузнецов Б.Н., Левданский В.А., Полежаева Н.И., Шилкина Т.А., Репях С.М. // БИ-1997.-№7.-С. 179.

65. A.c. 2131882 РФ. Способ получения бетулина / Левданский В.А., Полежаева Н.И., Еськин А.П., Винк В.А., Кузнецов Б.Н. // БИ- 1999 № 17.-С. 350.

66. A.c. 382657 СССР Способ выделения бетулина и суберина / Федорищев Т.И., Калайков В.Г. // БИ. 1973. - № 23. - С. 66-67.

67. Ruzicka L., Lamberton А. & Christie C.W. Zur kenetnic der thiterpene oxydation des betulin-mono-acetats mit chromotrioxyd zu sauren produkten // Heiv.Chim. Acta. 1938. - № 21. - P. 1706-1717.

68. Kim D.S.H.L., Chen Z., Nguyen T., Pezzuto J.M., Qiu S., Lu Z-Z. A concise semi-synthetic approach to betulinic acid from betulin // Synthetic communication. 1997. - № 27. - P. 1607-1612.

69. Шон Л.Б., Каплун А.П., Шпилевский A.A., Адрия-Правдивый Ю.Э., Алексеева С.Г., Григорьев В.Б., Швец В.И. Синтез бетулиновой кислоты из бетулина и исследование ее солюбилизации с помощью липосом // Биоорганический журнал.- 1998- Том. 24-№ 10-С. 787-793.

70. Когай Т.И., Кузнецов Б.Н., Левданский В.А. Усовершенствованный метод синтеза бетулиновой кислоты из бетулина // Тез. докл. III Всероссийской конф. "Химия и технология растительных веществ", 7-10 сентября. Саратов, 2004. - С. 114-116.

71. Калимуллина Л.Я., Петухова Н.И., Флехтер О.Б., Галин Ф.З., Зорин В.В. Скрининг микроорганизмов для политрансфорации бетулина // Башкирский химический журнал. 2004. - Том 11. - № 1. - С. 48-50.

72. Митрофанов Д.В., Петухова Н.И., Флехтер О.Б., Галин Ф.З., Зорин В.В. Окисление бетулина микроорганизмами в хлороформе и двухфазной системе буфер : хлороформ // Башкирский химический журнал. - 2004. -Том 11.-№1.-С. 42-45.

73. Оболенская А. В., Ельницая З.П., Леонович A.A. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: Учеб. пособие для вузов. М.: Экология, 1991.-320 с.

74. Laks P.E. Chemistry of bark // Wood and cellulose chemistry. 1988. - P. 257-330.

75. Рощин В.И., Ковалев B.E., Дьяченко Л.Г., Некрасова В.Б. Смолистые вещества древесины некоторых сибирских пород и продуктов ее сульфатной варки. 1. Групповой состав смолистых веществ древесины // Химия древесины. 1978. - № 2 . - С. 37-41.

76. Coney E.J., Sehmidt G. Useful procedures for the oxidation of alcohols involving pyridinium dichomated in aprotic midia // Tetrahedron Letters. -1979.-№5.-P. 399-402.

77. Беккер Г., Бергер В., Домшке Г. Органикум. Практикум по органической химии.- Москва, 1979 Т. 2. - 442 с.

78. Вейган-Хильгетаг Методы эксперимента в органической химии. -Москва, 1969.-944с.

79. Pulkkinen Е., Nurmesniemi Н. Studies on the chemical composition of the inner bark of Betula verrucosa II Paperi ja Puu. 1980. - № 4. - P. 285-288.

80. Жученко А.Г., Черкасова А.И. Химический состав бересты березы // Сб. тр. СвердНИИПДрев. М.: Лесн. пром-сть, 1969. - Вып. 4. - С. 86-93.

81. Laks Р.Е., Pruner M.S Chemical constituents of black locust bark and their biological activity // Holzforschung. 1989. - Vol. 43. - № 4. - P. 219-224.

82. Sholichin М., Yamasaki К., Kasai R., Tanaka О. 13С nuclear magnetic resonance of lupan-type triterpenes, lupeol, betulin and betulinic acid // Chem. Pharm. Bull. 1980. - Vol. 28. - № 3. - P. 1006-1008.

83. Siddiqui S., Hafeez F., Begum S., Siddiqui B.S. Oleanderol, a new pentacyclic triterpene from the leaves of Nerium Oleander II J. Nat. Prod. -1988. ^ Vol. 51. № 2. - P. 229-233.

84. Gopichand Y., Schmitz F.J. Marine natura products: two new acyclic sesquiterpene hydrocarbons from the gorgonian Plexaurella grisea H J.Org.Chem. 1980. - Vol. 45. - №12. - P. 2523 - 2526.

85. Demole E., Demole C., Enggist P. A chemical investigation of the volatile constituents of East Indian sandalwood oil (Santalum album L.) // Helvetica Chimica Acta. 1976. - Vol. 59.- № 75-76.- P. 131-141.

86. Wu T-Sh., Niwa M., Furukawa H. Sesquiterpenes from Severinia buxifolia // Phytochemistry. 1984. - Vol. 23.- №3.- P. 595-597.

87. Larsen S.D., Monti S.A. Total synthesis of racematic a-trans- and a- cis-bergamotene and a-pinene // J. Am. Chem. Soc. 1977. - Vol. 99. - № 24. -P. 8015- 8020.

88. Cane D.E., King G.G.S. The biosynthesis of ovalicin isolation of P-trans-bergamotene // Tetrahedron Letters 1976. - № 51. - P. 4731 - 4740.

89. Vedernikov D.N., Roschin V.I. Sesquiterpenes from Betula pendula Roth, buds // International Conference on natural products and physiologically active substances, 30 Nov 6 Dec 1998. - Novosibirsk. - 1998.

90. Племенков B.B. Введение в химию природных соединений. Казань, 2001.-376с.

91. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. М: Мир, 1979. - 548с.

92. Григорьева Н.Я., Моисеенков A.M. Физиологическая активность полиизопреноидов обзор патентных данных. // Хим. Фарм. Журнал. -1989. Т. 23. - № 2. - С. 144-155.

93. А.с. 2017782 Способ переработки древесной зелени / В.И.Рощин, С.Н. Васильев, И.С. Павлуцкая, JI.A. Колодынская, 1991.

94. А.с. № 875776 Способ получения бетулапренолов / В.И. Рощин, В.Е. Ковалев, Н.П. Маркова, В.Б. Некрасова, 1982.

95. Schmidt J., Lien N.T., Khoi N.H., Adam G. Lupeol long-chain fatty acid esters and other triterpenoid constituent from Plumería obtusifolia II Phytochemistry. 1983. - Vol. 22. -№ 4. - P. 1032-1033.

96. Toriumi Y., Kakuda R., Kikuchi M., Yasunori Y., Kikuchi M. New triterpenoids from Gentiana lútea II Chem. Pharm. Bull. 2003. - Vol. 51. -№1.-P. 89-91.

97. Серебряков Э.П., Нигматов А.Г. Биологически активные производные полипренилуксусных кислот и родственные им соединения обзор. // Хим. Фарм. Журнал. 1990. - № 2. - С. 104-112.

98. Paasonen Р.К. On the extractives of birch wood and sulfate pulp // Paperi ja puu. — 1967. -Vol. 49. -№ 1.-P. 3-15.

99. Рощин В.И. Состав, строение и биологическая активность терпеноидов ели, сосны и пихты. Дисс. .д-ра хим. наук. СПб, 1995. - 431с.

100. Clericuzio М., Toma L., Vidari G. Isolation of new caryophyllane ester from Lactarius suhumbonatus: conformational analysis and absolute configuration // Eur. J. Org. Chem. 1999. - P. 2059-2065.

101. Patra A., Chaudhuri S.K., Panda S.K. Betulin-3-caffeate from Quercus suber. 13C-NMR spectra of some lupenes // Journal of natural products. 1988. - Vol. 51,-№2.-P. 217-220.

102. Andersson F., Samuelsson B. Pyridinium dichromate acetic anhydride: a new and highly effecient reagent for the oxidation of alcohols // Carbohydrate Reseach.- 1984. -Vol. 129.

103. Хейнс А. Методы окисления органических соединений: пер. с англ. -М.: Мир, 1988.-с. 78-79.

104. Firouzabadi H., Seddighi M., Mottaghineiad E. Barium permanganate, Ba(MnC>4)2, a versatile and mild oxidzing agent for use under aprotic and nonaqueous conditions // Tetrahedron. 1990. - Vol. 46. - № 19. - P. 68696878.