автореферат диссертации по технологии, машинам и оборудованию лесозаготовок, лесного хозяйства, деревопереработки и химической переработки биомассы дерева, 05.21.03, диссертация на тему:Синтез биологически активных комплексных соединений на основе дигидрокверцетина - продукта глубокой переработки древесины лиственницы

На правах рукописи

СТОЛПОВСКАЯ Елена Владимировна

СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА - ПРОДУКТА ГЛУБОКОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ДРЕВЕСИНЫ ЛИСТВЕННИЦЫ

05.21.03 - технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

И ОКТ 2015

Иркутск 2015 005563226

005563226

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: Трофимова Наталья Николаевна,

кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории химии древесины ФГБУН Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН

Официальные оппоненты: Васильев Александр Викторович,

доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой химии ФГБОУВПО Санкт-Петербургского государственного лесотехнического университета имени С.М. Кирова

Курзин Александр Вячеславович,

кандидат химических наук, доцент кафедры органической химии ФГБОУВПО Сан кт-Петербургского государственного технологического университета растительных полимеров

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится "17" ноября 2015 года в 11 часов на заседании диссертационного совета № Д 212.231.01 при Санкт-Петербургском государственном технологическом университете растительных полимеров (198095, Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, д.4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технологического университета растительных полимеров и на сайте vvwvv.gturp.spb.ru.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 198095, Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, д.4.

Автореферат разослан 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета

i/¿/¿favcxtf

доктор технических наук МахотинаЛ.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актуальность данной работы обусловлена выполнением тематического Плана научно-исследовательской работы (государственного задания) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Иркутского института химии им Е.А. Фаворского СО РАН V.48.1. «Разработка теоретических основ комплексной переработки биомассы хвойных пород Сибири для создания технологий получения инновационных медицинских и ветеринарных препаратов» (Per. № 01201281998) и работ по проекту Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» на 2013-2014 гг. (№ ФНМ-2012-02) «Разработка инновационного препарата для комбустиологии на основе продуктов комплексной переработки биомассы лиственницы сибирской».

Одним из важнейших направлений исследований химии древесины является изучение химических компонентов древесной биомассы с целью выявления ее практического потенциала. В последние годы пристальное внимание уделяется разработкам химических превращений уже существующих, коммерчески доступных первичных продуктов переработки биомассы растительного сырья, на основе которых можно расширять ассортимент продуктов с полезными свойствами и добавленной стоимостью, что в целом будет способствовать повышению уровня переработки всей растительной биомассы. Основным компонентом флавоноидной фракции (80-85%) древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина (L. gmelinii (Rupr.) Rupr.) является от/7а«с-(+)2/У/?-дигидроквсрцетин (ДКВ), который привлекает к себе неизменный исследовательский и практический интерес, обусловленный как ярко выраженным биологическим потенциалом, так и коммерческой доступностью.

Одним из подходов к расширению арсенала лекарственных средств является направленная модификация структуры базового соединения, для которого уже известна фармакологическая активность. В последнее время флавоноиды часто используются в качестве органических лигандов для получения комплексов металлов с ценными функциональными свойствами, в том числе и усиленной биологической активностью. Комплексы Zn, Cu(II), Fe(II), Fe(III), Al, Ca, Mg, Sn(II) и других металлов с полифенольными лигандами демонстрируют высокую антиоксидантную активность, превосходящую активность исходных флавоноидов. Однако примеры использования (+)-дигидрокверцетина как лиганда для получения новых координационных соединений весьма немногочисленны. Получение ценных биологически активных комплексных соединений с биогенными металлами на основе ДКВ с целью создания новых высокоэффективных медицинских препаратов позволит расширить ассортимент импортозамещающих лекарственных средств и повысить рентабельность химической переработки биомассы лиственницы.

Цель н задачи исследования. Целью данной работы является синтез и оптимизация реакций образования биологически активных комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

- направленный синтез комплексных соединений (КС) цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином с сохранением конфигурации 2R3R аномерных центров и функциональных группировок, отвечающих за проявление антиоксидантной активности исходного соединения-лидера (катехольный фрагмент молекулы флавоноида);

-оптимизация реакций комплексообразования по выходу продукта;

-установление структур полученных соединений;

-оценка электрохимического поведения и антиоксидантной активности КС;

-оценка возможности использования КС цинка с ДКВ в медицине.

Объект исследования - реакции комплексообразования ионов металлов с транс-(+)-2R3R дигидрокверцетином.

Предмет исследования - комплексные соединения цинка, меди (II) и кальция с транс-(+J-2R3R дигидрокверцетином.

Научная новизна. Впервые изучены реакции комплексообразования цинка, меди (II) и кальция с mpmc-(+)-2R3R дигидрокверцетином - флавоноидом древесины лиственницы в водной и водно-спиртовой среде; оптимизированы условия реакций, что позволило с высокими выходами (70-89 %) выделить индивидуальные продукты в виде порошков и установить их строение с применением современных физико-химических методов исследования: ЯМР 'Н и 13С, ИК, масс-спектрометрии DART, элементного анализа, рентгеновского спектрального энергодисперсионного микроанализа (РСЭДМА) и термогравиметрии (ТГ). Разработаны лабораторные регламенты получения комплексов цинка, меди (II) и кальция с ДКВ.

Методом циклической вольтамперометрии изучено электрохимическое поведение КС и подтверждены факторы, определяющие их антиоксидантные свойства. Определена антиоксидантная активность КС в экспериментах in vitro на сливной плазме крови здоровых доноров. В опытах in vivo установлены ранозаживляющая и антимикробная активности фармацевтической композиции, разработанной на основе цинкового комплекса ДКВ.

Практическая значимость работы. Результаты оптимизации реакции получения КС дают возможность выдать исходные данные для проектирования и создания экспериментальных установок по наработке опытных партий КС для разработки фармакологических субстанций и нормативной документации. Создание высокоэффективных медицинских препаратов на основе производных ДКВ может существенно увеличить рентабельность химической переработки древесины лиственницы, что в свою очередь будет способствовать развитию отечественного лесопромышленного комплекса Это позволит более полно использовать экстрактивные вещества древесины лиственницы для расширения круга импортозамещающих лекарственных средств, биологически активных добавок и улучшенной косметики. Разработанные лабораторные регламенты получения КС позволят наработать экспериментальные партии для дальнейших биологических исследований.

Достоверность и обоснованность результатов и выводов базируются на применении современных методов анализа, выполнении исследований с использованием аккредитованных лабораторий, поверенных приборов, применении методов математической статистики при обработке данных.

Личный вклад автора. Автором выполнены экспериментальные исследования и разработаны лабораторные регламенты. Автор принимал непосредственное участие в планировании эксперимента, расшифровке спектров и обсуждении структурных и спектральных данных, интерпретации полученных результатов, поиске литературы, формулировке выводов и написании статей.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на VI Международной конференции «Traditional medicine: ways of

integration with modern health саге» (Улан-Удэ, 2013), XXVII Международной научно-технической конференции «Реактив-2013» (Иркутск, 2013), Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Инновационные технологии в фармации» (Иркутск, 2014).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 14 публикациях, из которых 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка цитируемой литературы из 168 наименований и 5 приложений. Работа изложена на 183 страницах, содержит 14 таблиц, 24 рисунка и 4 схемы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность, научная и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи. Первая глава (литературный обзор) посвящена анализу литературных данных о синтезированных комплексных соединениях металлов с флавоноидами, их биологической активности. Во второй главе представлены результаты собственных исследований. В третьей главе приведены подробности проведения эксперимента. В конце рукописи представлены выводы.

1. Оптимизация реакций комплексообразования дигидрокверцетина с ионами цинка, меди (II) и кальция

Для синтеза комплексных соединений в качестве исходных реагентов использовали водорастворимые соли двухвалентных биогенных металлов цинка, меди (II) и кальция и продукт, выделенный из древесины лиственницы, транс-(- )-2/?1К-дигидрокверцетин. ДКВ очищали перекристаллизацией из горячей воды, высушивали в сушильном шкафу при 50 °С до влажности не более 7 %, а затем при 105 °С до постоянной массы. Индивидуальность ДКВ подтверждали соответствием его физико-химических характеристик и данных ВЭЖХ литературным. В УФ-спектре ДКВ содержится полоса поглощения при Amin 247 им, Хпах 292 нм с плечом в области 320-327 нм. По данным ТГ 1 моль ДКВ содержит 0,5 моль воды.

Вследствие диссоциативного характера механизма комплексообразования металлов с флавоноидами и для соответствия фармакологических субстанций критериям безопасности предпочтительно проведение реакций получения КС на основе ДКВ в водной и спиртовой средах. Реакции взаимодействия солей цинка с ДКВ, проведенные в водно-спиртовых растворах при 25 °С, показали низкие выходы продукта (< 20 %), и поэтому реакции ZnCh, ZnSOr7IhO и Zn(CIbC00)2-2H20 с ДКВ проводили в водных растворах при 80 °С (образцы 1-15). Образование комплекса при использовании в качестве цинксодержащей соли Zn(CH3C00)2p2H20 начиналось сразу после смешивания реагентов (рН реакционного раствора 5,1). При использовании солей, содержащих анионы сильных кислот, образование продукта начиналось после доведения рН до 5. Для изучения влияния рН среды на выход КС реакцию Zn(CH3COO)2-2I120 с ДКВ проводили с использованием буферных растворов (табл. 1). Снижение рН до 4 приводит к подавлению диссоциации флавоноида и снижению выхода КС (по литературным данным минимальное значение рКа для ДКВ составляет 7,3±0,1). Увеличение рН раствора предполагает усиление диссоциации фенолыюй гидроксильной группы ДКВ в положении 7 и возможность последующей диссоциации 4'-ОН-группы. В условиях данной реакции снижение выхода продукта с увеличением рН раствора можно объяснить гидролизом

Таблица 1 - Зависимость выхода цинкового комплекса

цинковой соли при рН, близкой к 8 (произведение растворимости ГГР (Zn(OH)2)

3,0-10"13 и 1,2-10"17). Таким образом, с наибольшим выходом получен комплекс, синтезированный при рН 5,1. Далее для оптимизации реакции по выходу КС варьировали концентрации исходных веществ, их мольное соотношение, продолжительность реакции. Влияние концентраций исходных веществ на выход продукта представлено в табл. 2, а исходных мольных соотношений иона металла и флавоноида на выход цинкового комплекса ДКВ - в табл. 3.

рН раствора Выход продукта, % Содержание Zn2+ в комплексе, %

4,01 24,7 8,5

5,1 54,8 7,8

7,5 43.9 10,8

9,18 34,8 11,4

Таблица 2 - Зависимость выхода цинкового комплекса дигидрокверцетина от концентраций

Таблица 3 - Зависимость выхода цинкового комплекса дигидрокверцетина от соотношения

С (Zn2f) хЮ2, моль/л С (ДКВ) х10\ моль/л Выход продукта, % Содержа ние Zn2+. %

1,0 0,67 11.7 9,4

5.0 3,33 32,8 10,3

10.0 6,67 54.8 7,8

16.5 11,0 57,4 8,9

Исходное соотношение Zn2+:flKB, моль Выход продукта, % Содержа ние Zn24", %

1:2 59,6 10,2

1:1 60,3 9,4

2:1 72,1 10.0

3:1 68,2 10,7

Выход продукта при увеличении концентраций исходных веществ в исследуемом диапазоне стабильно повышается. Максимальный выход продукта наблюдается при исходном двукратном мольном избытке ионов Zn2+ по сравнению с ДКВ. Содержание Zn2+ в образцах не зависит от исходного мольного соотношения реагентов и соответствует расчетной структуре КС, в котором комплексообразователь связан с двумя флавоноидными лигандами.

Для определения стабильности стехиометрии цинкового комплекса ДКВ был проведен мониторинг изменения содержания Zn2+ и ДКВ в реакционном растворе в течение 2 ч и рассчитаны содержания компонентов в составе КС во времени (рис. 1).

В водном растворе в первую минуту реакции образуется основная масса комплекса, в котором ион Zn2+ связывает два флавоноидных лиганда, что предполагает возможность усиления антиоксидантных свойств полученного соединения по сравнению с ДКВ, и в течение 2 ч заметных изменений не наблюдается. В результате оптимизации реакции образования цинкового комплекса ДКВ установлено, что максимальный выход КС 72,1 % наблюдается при проведении реакции в водной среде с исходным мольным соотношением Zn2+:flKB 2:1, рН 5,1.

3,5 3 2.5

0.5 О

(I 30 60 90 120

Продолжительность реакции, мин

1 - ДКВ", 2 - 2п2+ Рисунок 1 - Изменение содержания компонентов в составе цинкового комплекса дигидрокверцетина во времени

Оптимизацию реакции образования комплекса меди (II) с ДКВ по выходу продукта изучали при варьировании исходных мольных соотношений Си2+:ДКВ 1:1 и 2:1 в водных и водно-спиртовых растворах ДКВ и Си(СНзСОО)г; оценивали влияние pH на выход комплекса (образцы 16-27).

В условиях двукратного мольного избытка ионов Си2+ наблюдается увеличение выхода комплекса на 7,4-17,4 % по сравнению с выходом продукта при использовании эквимольных концентраций реагентов как в водных, так и в водно-спиртовых растворах. Выход комплекса повышается также и с увеличением доли этанола в составе реакционной среды, что более заметно при проведении реакции в условиях избытка ионов Си2*. Содержание Си2+ во всех образцах характеризует комплекс, в составе которого комплексообразователь связан с флавоноидным лигандом в отношении, близком к 1:1 (табл. 4).

Таблица 4 - Зависимость выхода комплексного соединения меди (II) с (+)-

дигидрокверцетином от исходных соотношений Си2*:ДКВ и растворителя

Исходное соотношение Си2+:ДКВ, моль Растворитель (Этанол/вода, об. %) Темпера тура, °С Выход продукта, % Содержание Си2+, %

1:1 0 80 71,8 12,4

2:1 0 80 77,1 17,1

2:1 50 25 79,5 17,1

1:1 50 25 71,4 12,5

2:1 70 25 86,3 19,1

1:1 70 25 73,5 14,5

Результаты оценки влияния рН раствора на выход КС меди (II) с ДКВ представлены в табл. 5. Реакцию проводили при 70 °С, исходное соотношение Си2+:ДКВ 2:1. Максимальный выход комплекса 88,9-89,4 % наблюдается в диапазоне значений рН 5-6. Незначительное снижение выхода продукта на 2-3 % при увеличении рН раствора до 7-8 можно объяснить гидролизом ацетата меди (II) (ПР (Си(ОН)г) 2,2-10-13 и 2,2-10"20). В более кислой среде (рН 4,3) накопление в растворе протонированной формы флавоноида приводит к уменьшению выхода комплекса.

Для определения стабильности соотношения Met:L (Met - ион металла, L -депротонированный ДКВ) в составе комплекса была отслежена динамика изменения содержания Си2' и ДКВ в реакционном растворе в течение 60 мин. По полученным данным были рассчитаны количества компонентов в составе КС в каждый момент времени (табл. 6).

Таблица 5 - Зависимость выхода комплексного соединения меди (II) с

Таблица 6 - Рассчитанные количества Си2+ и (ДКВ-Н+)"(х10"3 моль) в составе комплексного соединения

рн раствора Выход продукта, % Содержание Си2+ в комплексе, %

4,3 66,5 11,5

5,0 88,9 17,9

6,0 89,4 17,1

7,2 86,8 17,0

8,0 86,2 16,9

Время, мин Си2*, моль ДКВ-НГ, моль

1 2,7 6,1

5 5.2 6,8

10 6,2 7,2

15 6.8 7,4

30 7,6 7,7

45 8,2 7,9

60 8,6 8,0

С первой минуты реакция протекает по пути образования соединения с соотношением Ма:Ь 1:2, которое к пятой минуте синтеза меняется до 1:1,3, после 15 мин устанавливается близким к 1:1 и до конца эксперимента (60 мин) не претерпевает

значительных изменений. Выход полученного комплекса составил 80,9 %, из которых 82,2 % соединения образовалось в течение первых 15 мин.

В результате оптимизации реакции образования комплексного соединения меди (II) с (+)-дигидрокверцетином установлено, что максимальный выход комплекса 89 % наблюдается в условиях двукратного избытка ионов Си2+ при нагревании водного раствора до 70 °С, рН 5-6.

Изучение реакции образования кальциевого комплекса ДКВ проводили с использованием различных солей и растворителей при варьировании начальных концентраций исходных реагентов, их мольных соотношений, продолжительности реакции (образцы 28-38).

Выход продукта в реакции ДКВ с ацетатом и нитратом кальция выше, чем с хлоридом кальция. Выбор водной среды в качестве растворителя повышает выход КС более чем в 4 раза по сравнению с выходом продукта в водно-спиртовой среде и на 16,8 % по сравнению со спиртовой средой (табл. 7).

Таблица 7 - Влияние аниона кальциевой соли и растворителя на выход _кальциевого комплекса дигидрокверцетина__

Используемая соль Растворитель Темпер атура, °С Содержание Са2+ в комплексе, % Выход продук та, %

Данные элементного анализа Данные РСЭДМА

СаСЬ Этанол (70 %) 25 9,7 9,2 3,5

Са(СНзСОО)2'НЮ Этанол (70 %) 25 9,8 10,6 13,2

Са(Ы0з)2-4Н20 Этанол (70 %) 25 9,3 9,7 13,3

Са(МОз)2-4НгО Этанол 25 10,7 11,0 49,4

СаОЮз)2-4НгО Вода 80 10,8 14,2 57,7

Восьмикратное увеличение концентраций исходных реагентов в интервале 0,025-0,200 моль/л при использовании их эквимольного соотношения повышает выход КС в 9 раз. Повышение выхода продукта на 29,8 % наблюдается при использовании трехкратного избытка ионов Са2+ (табл. 8).

Таблица 8 - Влияние концентраций реагентов и исходных мольных

соотношений Са2':ДКВ на выход кальциевого комплекса дигидрокверцетина

С (ДКВ), моль/л Исходное соотношение Са2+:ДКВ, моль Содержание Са2* в комплексе, % Выход продукта, %

Данные элементного анализа Данные РСЭДМА

0,025 1:1 10,6 9,1 6,6

0,050 1:1 10,7 12,2 22,4

0,100 1:1 10,4 11,9 54,1

0,200 1:1 9,3 11,5 58,9

0,100 2:1 11,0 11,7 58,4

0,100 3:1 10,6 11,8 70,2

Рассмотренные параметры реакции не оказывают значительного влияния на содержание металла в составе комплекса, который соответствует соединению со стехиометрическим соотношением Ме1:Ь 1:1.

Анализ содержания компонентов в составе кальциевого комплекса ДКВ в ходе реакции демонстрирует, что стехиометрическое соотношение МеН. с первой минуты устанавливается 1:1 ив течение 2,5 ч существенно не меняется (рис. 2). Основная

масса КС (81 %) образуется в течение первых 60 мин реакции, что позволяет определить оптимальное время проведения синтеза 1 ч (рис. 3).

45 J

i? 40

д 35

8 g 30 I f

25

1 20 1

5 15

10 £ |

2 5 i

— 0 т-

О 30 60 90 120 150 Продолжительность реакции, мин

1 - ДКВ", моль х103, 2 - Са2+, моль х! О3 Рисунок 2 - Изменение содержания ДКВ" и Са2+ в составе комплекса во времени

у = 7,01121п{х)+6,1553 R2 = 0,9435

О 30 60 90 120 150 Продолжительность реакции, мин Рисунок 3 - Зависимость выхода комплексного соединения кальция с (+)-дигидрокверцетином от продолжительности реакции

Во всех представленных экспериментах кальциевый комплекс ДКВ образовывался при условии рН>8. Во избежание процессов рацемизации и окисления ДКВ реакции не проводили при рН выше 9. Спектральные изменения ДКВ в водных и водно-спиртовых растворах при различных значениях рН приведены на рис. 4.

230 250 270 290 310 330 350 370

/„ нм

0,8 0,7 0,6

0,5 • л Ц \\ 5

°'4 \ зч/Д/,Д\

0,3 Д Г/ Уш \

0,2 V^ ¡¡¿3 0,1 ^CS

0 I- ,....... . > .......,

230 250 270 290 310 330 350 370 >„ нм

1 - рН 5,5; 2 - рН 7,7; 3 - рН 8,5; 4 - рН 9,7; 5 - рН 10,9 Рисунок 4 - УФ спектры растворов ДКВ в водной (а) и водно-спиртовой (70% этанол) (б) средах

Как в водной, так и в водно-спиртовой среде при повышении рН растворов происходит батохромный сдвиг максимума поглощения ДКВ. Подобные изменения в спектрах поглощения флавонов и флавонолов объясняются их диссоциацией с образованием соответствующих анионов. Диссоциация ДКВ в водном растворе наблюдается с более низких значений рН (7,7), чем в водно-спиртовом растворе (9,7). Возможно, этим можно объяснить более высокий выход кальциевого комплекса при проведении реакции в водной среде.

В результате оптимизации реакции образования кальциевого комплекса ДКВ установлено, что максимальный выход продукта 70,2 % наблюдается при проведении реакции в водном растворе при соотношении Са2+:ДКВ 3:1. рН 8.

Полученные данные позволили оптимизировать по выходу процесс получения комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином и установить их физико-химические характеристики.

2. Установление структур комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигадрокверцетином

Все полученные соединения представляют собой порошки с размерами частиц не более 6 мкм. Установление структур КС проводили на основании данных комплекса различных физико-химических методов.

Для определения количества связанной воды в полученных комплексах на основе ДКВ использовали метод ТГ. Усредненные данные по результатам исследования представлены в табл. 9. В результате расчетов установлено, что количество связанной воды, приходящееся на один моль комплексного соединения, составляет 2, 1 и 1 моль соответственно для КС цинка, меди (II) и кальция с ДКВ.

Таблица 9 - Средние значения температурных интервалов и потери массы при термогравиметрии для ДКВ и образцов комплексных соединений цинка 5-8, меди (И) __16-17 и кальция 36-37 с ДКВ_

Образец т. пл., °С Пик 1 Пик 2

At, °С Дт, % At, °С Дт, %

ДКВ 228 80-126 2,8 - -

5-8 200±5 120-170 3,0±0,86 180-215 2,47±0,90

16-17 241 ±7 110-140 2,0±0,28 190-230 1,14±0,20

36-37 243±5 100-180 5,7 - -

Масс-спектры образцов были получены методом DART после подбора условий анализа в режиме регистрации отрицательных ионов. Анализ КС цинка, меди (II) и кальция с ДКВ в использованных условиях регистрации спектров не позволил напрямую установить молекулярные массы соединений, но однозначно свидетельствует о нативности структуры исходного ДКВ в качестве флавоноидного лиганда в составе КС.

Масс-спектры DART синтезированных соединений не содержат депротонированных молекулярных ионов КС, возможно, из-за их нестабильности даже в условиях «мягкой» ионизации DART. В спектрах КС наиболее интенсивными являются пики с m/z 303 и m/z 301, соответствующие депротонированному ДКВ (ДКВ-Н)" и, по-видимому, продукту элиминирования двух атомов водорода из него (ДКВ-2Н-Н)". Кроме того, в масс-спектрах всех КС содержатся характеристичные пики с m/z 285 и 152, соответствующие фрагментации флаванонолов.

Определение состава, брутто-формул КС и их молярных масс (М) проводили с помощью элементного анализа и подтверждали данными элементного состава с точки поверхности образца методом электронно-зондового энергодисперсионного анализа на электронном микроскопе (РСЭДМА). Статистическую обработку результатов эксперимента проводили в соответствии с требованиями статьи 14 ГФ XII.

При сопоставлении ИК-спектров КС 5-38 со спектрами ДКВ отмечены изменения полос поглощения в областях 600-650, 1700-1350 см-1. В ИК-спектрах образцов КС цинка, меди (II) и кальция с ДКВ появляются новые полосы при 605-616, 616-625 и 597-605 см'1 соответственно, относящиеся к валентному колебанию связи Met-0 и свидетельствующие о формировании связи иона металла с кислородными атомами гидроксильных групп флавоноидного лиганда. На образование комплексов также указывают существенные сдвиги в область низких частот (до 89 см-1) максимумов полос поглощения свободной карбонильной группы и положения полос поглощения гидроксильных групп, связанных внутримолекулярными и межмолекулярными водородными связями в области 3346-3436 см"1.

Структуры комплексов ДКВ, содержащих в своем составе диамагнитные ионы цинка (5) и кальция (37), исследованы методом спектроскопии ЯМР. Полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 'Н и 13С соединений 5 и 37 проведено на основании сравнения с соответствующими сигналами в спектре ДКВ и поддержано данными двумерных экспериментов (COSY, НМВС, HSQC) (табл. 10).

Таблица 10 - Данные ЯМР >3С и 'Н ДКВ и КС (5,37) (ДМСО-ds, б, ХС, м.д., J,

—__м____

Атомы ДКВ (лит] ДКВ 5 37

С Н С Н С Н С Н

2 83,10 4,973, д., 11.1 83,1 4,99, д., 11,3 83,1 4,96, д., 11,0 82,6 4,70, д., 10,4

3 71,62 4,483, д.д„ 6,1 и 11,1 71,6 4,52, д.д., 6,0 и 11,3 71,6 4,47, д.д., 6,2 и 11,0 71,4 4,21, Д.,10,4

4 197,78 - 197,7 - 197,6 - 198,9 -

4а 100,53 - 100,5 - 100,4 - 99,3 -

5 163,37 - 163,3 - 163,4 - 163,2 -

6 96,03 5,898, д., 2 96,0 5,92, д., 2,2 96,1 5,88, уш. с. 96,4 5,41, д., 1,4

7 166,83 - 166,8 - 167,2 - 166,8 -

8 95,02 5,848, д., 2 95,0 5,87, д., 2,0 95,1 5,83, уш. с. 95,8 5,37, с.

8а 162,60 - 162,5 - 162,6 - 163,2 -

Г 128,08 - 128,1 - 128,1 - 128,7 -

2' 115,40 6,868, с. 115,3 6,90, с. 115,4 6,86, с. 114,9 6,80, с.

3' 144,98 - 145,9 - 145,0 - 145,1 -

4' 145,81 - 145.8 - 145,8 - 145.7 -

5' 6' 115,17 119,41 6,72-6,76, 2Н, АВ-система, 8,2 115,2 119,4 6,76, уш.с., 211 115,1 119,4 6,73, уш. е., 211 114,9 119.0 6,66, уш.с.. 2Н

з-он 5,712, д., 6,1 5,78, д., 6,0 5,71, д., 6,2 5,09, уш.с.

5-ОН 11,87, с. 11,90, с. 11,89, с. 12,10, с

7-ОН 10,78, с. 10,88, с. - -

З'-ОН 8,98, с. 9,08, с. 8,99, уш.с. -

4'-ОН 8,93, с. 9,03, с. 8,99, уш.с. -

В спектрах ЯМР 'II цинкового и кальциевого комплексов ДКВ соответствие значений КССВ и химических сдвигов ХС Н-2 и Н-3 для трянс-2Л1/?-2,3-дигидро-2-(3,4-дигидроксифенил)-3,5,7-тригидрокси-4/7-1-бензопиран-4-она свидетельствует о сохранении 2R3R конфигурации аномерных центров С-2 и С-3 в плоскости гетерокольца флавоноидной части молекулы.

Исчезновение в спектре КС цинка с ДКВ сигнала при 5 10,88 м.д., принадлежащего протону 7-ОН группы в молекуле ДКВ, предполагает участие кислородного атома этой группы в координации с ионом цинка. В 2D НМВС спектре протон 5-ОН группы, синглетный сигнал которого находится в самом слабом поле (11,90 м.д.), дает кросс-пики с атомами С-4а, С-5, С-б, в 2D COSY спектре наблюдается четкий кросс-пик протона ОН группы при С-3 с Н-3 (рис. 5, а). Это подтверждает, что координация металла при образовании цинкового комплекса ДКВ не затрагивает данные положения молекулы флавоноида.

В спектре кальциевого комплекса ДКВ присутствуют сигналы протонов гидроксильных групп 3-ОН и 5-ОН, что указывает на отсутствие координации металла по этим положениям. В 2В Н$<ЗС спектре кросс-пики проявляются только для протона 3-ОН, что также исключает связывание металла с флавоноидным лигандом через атом кислорода при С-3 (рис. 5, б).

Рисунок 5 - Наличие С-Н и Н-Н корреляций в структурном фрагменте цинкового КС ДКВ по данным спектроскопии 2D НМВС и COSY (а) и С-Н корреляций кальциевого КС ДКВ по данным спектроскопии 2D HSQC (б)

Наблюдение сигналов протонов гидроксильных групп З'-ОН и 4'-ОН в спектре затруднено вследствие их сильного уширения из-за протонного обмена с остаточной водой, присутствующей в растворителе. Таким образом, можно предположить связывание флавоноидного лиганда ионом кальция с участием кислородного атома гидроксилыюй группы при С-7.

Анализ данных, полученных с помощью комплекса современных физико-химических методов, позволяет предложить наиболее вероятную структуру цинкового комплекса ДКВ ^пЬ2(НгО)2] со стехиометрическим соотношением МеиЬ 1:2, в которой оба флавоноидных лиганда координированы к иону цинка через кислородный атом гидроксильной группы при С-7 кольца А:

Для кальциевого КС предложена структура [СаЬ(ОН)(НгО)] со стехиометрическим соотношением Ме1:Ь 1:1. Флавоноидный лиганд связей с ионом кальция также через атом кислорода гидроксильной группы при С-7 в кольце А.

Образцы КС ДКВ с ионами меди (II) в твердом виде обнаруживают парамагнетизм и дают в спектре ЭПР характерные сигналы, соответствующие аксиально-симметричному окружению центрального иона двухвалентной меди с тетрагональным искажением Электронная конфигурация Зс19, основное

состояние 20. В параллельной ориентации есть слабо разрешенная сверхтонкая структура от Си2*". Отношение ё^/Ан составляет 132-143 см, что попадает в диапазон значений 113-150 см, определенных для квадратно-плоскостной геометрии. Совокупность этих данных свидетельствует об образовании комплекса, в котором ион Си2+ включен в координационную сферу комплекса в качестве центрального иона, во вторую координационную сферу возможно включение молекул воды. Вторым лигандом, участвующим в образовании валентной связи, может являться ОН-группа, присутствие которой объясняется частичным гидролизом ацетата меди (II).

Координация флавоноидов ионами меди осуществляется преимущественно с участием карбонильной группы флавоноида и атома кислорода гидроксильной группы 3-ОН, что более вероятно по сравнению с участием атома кислорода группы 5-ОН ввиду большого ионного радиуса Си2+ (0,80 А). Наиболее вероятная структура комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином представляет собой моногидрат [СиЦОН)(НгО)] со стехиометрическим соотношением Ме1:Ь 1:1, в котором координация центрального иона меди (II) с флавоноидным лигандом осуществляется через атом кислорода 3-ОН и карбонильную группу.

В результате направленного синтеза комплексных соединений ионов двухвалентных металлов с продуктом глубокой переработки древесины лиственницы (+)-

дигидрокверцетином получены соединения с соотношением Ме1:Ь 1:1 и 1:2 с различными сайтами связывания металла с флавоноидным лигандом. Различия в структурах комплексных соединений предполагают различия в их

свойствах.

На основе оптимизированных условий синтеза созданы лабораторные регламенты получения новых соединений в водной среде.

3. Изучение электрохимической активности комплексных соединений цинка, меди (И) и кальция с дигидрокверцетином

Методом циклической вольтамперометрии проведен сравнительный анализ электрохимического поведения синтезированных соединений с поведением дигидрокверцетина. Предварительно была проведена оценка электрохимических свойств ацетатных солей металлов, используемых для синтеза комплексов. Циклические вольтамперограммы растворов ДКВ и КС в ДМСО представлены на рис. 6.

Цинковый комплекс в растворе ДМСО не только сохраняет электрохимическую активность, присущую ДКВ, но и превосходит ее.

Электрохимическая активность комплексных соединений меди и кальция в растворе ДМСО ниже, чем активность исходного ДКВ. Такое различное

электрохимическое поведение КС в растворе ДМСО может быть связано как с различными структурами соединений, так и с различными способами

взаимодействия комплексов с рабочей поверхностью

графитового электрода.

0.06 э

0,05 1 0,04 | 0,03 4 0.02 ; 0.01 ;

о: -0.01 ^ -0.02 I

1000 1200 1400

Рисунок 6 - Циклические вольтамперограммы, измеренные на графитовом

электроде в ДМСО - растворах ДКВ (2) и комплексов цинка (1), меди (II) (4) и кальция (3). Скорость развертки потенциала V 50 мВ/с, С = 5-10"5 М

4. Определение антиоксидантной активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином

Изучение антиоксидантной активности КС цинка, меди (II) и кальция с ДКВ проводилось в экспериментах in vitro на сливной плазме крови здоровых доноров. Определяли влияние КС на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови. Предварительно для всех КС были определены их действующие концентрации. Состояние ПОЛ оценивали по содержанию в плазме крови малонового диальдегида (МДА), диеновых и триеновых конъюгатов (ДК, ТК) (рис. 7). Исследовали растворы ДКВ и КС в ДМСО в концентрации 0,005 %.

1 - Контроль, 2 - ДКВ, 3 - 5, 4 - 27, 5 - 37 Рисунок 7 - Влияние комплексных соединений цинка (5), меди (II) (27) и кальция (37) с дигидрокверцетином на показатели ПОЛ в плазме крови

Цинковый комплекс снижает содержание МДА в плазме крови на 14,9 % по сравнению с контролем, что превосходит в 2 раза этот показатель для ДКВ (7,5%). КС меди (II) и кальция с ДКВ снижают содержание МДА в плазме крови на 11,2 % и 3,7% соответственно. Снижение содержания ДК и ТК по сравнению с контролем сопоставимо с показателями для ДКВ.

5. Перспективы использования комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином для лечения ожоговых ран

На основе комплексного соединения цинка с (+)-дигидрокверцетином разработана оригинальная фармацевтическая композиция для лечения ожоговых ран с использованием цинкового комплекса дигидрокверцетина в качестве действующего вещества, содержащая в качестве гидрофобной основы лиственничный воск. В ФГБНУ «ИНЦХТ» на базе научного отдела экспериментальной хирургии с виварием на модели термического ожога 2 и ЗА степени в экспериментах in vivo показана высокая ранозаживляющая активность и выраженное положительное влияние на микрофлору ожоговой раны разработанной композиции. Таким образом, разработанное на основе продукта комплексной переработки биомассы лиственницы сибирской новое средство для лечения ожогов, содержащее цинковый комплекс ДКВ, является перспективным препаратом для применения в комбустиологии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучены реакции образования комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с mpaHc-(+)-2R3R дигидрокверцетином - продуктом глубокой переработки древесины лиственницы, в водной и водно-спиртовой средах, приводящие к образованию КС с сохранением конфигурации 2R3R аномерных центров и функциональных группировок молекулы флавоноида, отвечающих за проявление биологической активности.

2. Оптимизированы условия синтеза комплексных соединений по выходу целевых продуктов: 72 % КС цинка с ДКВ при двукратном избытке ионов Zn2+ в водной среде, pH 5,1; 89 % КС меди (И) с ДКВ при двукратном избытке ионов Си2+ в водной среде, pH 5-6; 70 % КС кальция с ДКВ при трехкратном избытке ионов Ca2' в водной среде, pH 8.

3. Впервые установлены структуры комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с mpaHC-(+)-2R3R дигидрокверцетином как [Zn(CisHu07)2(H20)2], [Cu(C,5Hii07)(0H)(H20)] и [Ca(Ci5Hu07)(0H)(H20)] с определением сайтов связывания иона металла с флавоноидным лигандом.

4. Методом циклической вольтамперометрии на графитовом электроде проведена оценка электрохимических свойств синтезированных комплексов.

5. Определена антиоксидантная активность комплексных соединений в экспериментах in vitro на сливной донорской плазме крови. Установлено, что комплексные соединения цинка, меди (И) и кальция с ДКВ снижают содержание МДА в плазме крови на 14,9 %, 11,2 % и 3,7 % соответственно.

6. Показана ранозаживляющая активность и выраженное положительное влияние на микрофлору ожоговой раны фармацевтической композиции на основе комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином в эксперименте in vivo на модели термического ожога, что открывает перспективы для использования в медицине.

7. Разработаны лабораторные регламенты получения комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Трофимова, H.H. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 2. Оптимизация реакции комплексообразования цинка с дигидрокверцетином в водной среде / H.H. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин II Хгшия растительного сырья. - 2013. -№3.-С. 91-97.

2. Трофимова, H.H. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 3. Изучение кинетики реакции комплексообразования меди с дигидрокверцетином / H.H. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин II Химия растительного сырья. - 2013. - № 4. - С. 37-43.

3. Трофимова, H.H. Строение и электрохимические свойства комплексных соединений металлов с дигидрокверцетином / H.H. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин, C.B. Федоров, Г.А. Калабин, C.B. Горяинов, Е.Е. Золотарев, А.Ю. Сафронов, A.B. Кашевский, Р.Г. Житов II Хгшия растительного сырья. - 2014. - № 3. -С. 121-131.

4. Столповская, Е.В. Исследование методов синтеза, строения и свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов. Сообщение 4. Изучение реакции комплексообразования ионов Са2+ с дигидрокверцетином / Е.В. Столповская, H.H. Трофимова, В.А. Бабкин II Химия растительного сырья. - 2014. - №4. — С. 125-130.

5. Пат. 2553428 РФ. Способ получения моно- и билигандных комплексных соединений ионов двухвалентных металлов - цинка, меди (II) и кальция, с дигидрокверцетином, обладающих усиленной антиоксидантной активностью / H.H. Трофимова, В.А. Бабкин, Е.В. Столповская. - Заявка № 2013121728, приоритет изобретения от 08.05.2013; опубл. 10.06.2015; Бюл. № 16. - 14 с.

6. Stolpovskaya, E.V. Research and development of new derivatives based on products of larch wood processing for use in medicine / E.V. Stolpovskaya, N.N. Trofimova, V.A.

/6'

Babkin // Traditional medicine: ways of integration with modern health care: proceedings of the VI international scientific conference. - Ulan-Ude, 2013. - P. 51.

7. Столповская, E.B. Разработка технологии получения новой фармацевтической субстанции с противогриппозной активностью / Е.В. Столповская, Н.Н. Трофимова,

B.А. Бабкин II Инновационные технологии в фармации. - Иркутск, 2014. - С. 66-67.

8. Столповская, Е.В. Оптимизация реакций комплексообразования ионов Zn2+ и Си2" с (+)-дигидрокверцетином / Е.В. Столповская, Н.Н. Трофимова, В.А. Бабкин // Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии: мат. XXVII Международной научно-технической конф. "Реактив-2013". - Иркутск, 21-25 октября 2013.-С. 31.

9. Гоголь. Е.С. Новые средства для лечения ожогов / Е.С. Гоголь, В.В. Даваа, Я. А. Костыро, С.А. Лепехова. Е.В. Коваль, Н.Н. Трофимова, Н.В. Иванова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин II Экологическая безопасность и перспективы развития аграрного производства Евразии. - Ч. 1. - Иркутск, 2013. - С. 161-166.

10. Gogol-, E.S. Research and development of pharmacological activity of unique and natural pharmacological compositions for combustiology/ E.S. Gogol-, V.V. Davaa, Ya.A. Kostvro, S.A. Lepekhova. E.V. Kovah N.N. Trophimova, E.V. Stolpovskaya, N.V. Ivanova, V.A. Babkin // Traditional medicine: ways of integration with modem health care: proceedings of the VI international scientific conference. - Ulan-Ude, 2013. - P. 76.

11. Гоголь. Е.С. Изучение раздражающего действия воска лиственницы и оригинальных фармацевтических композиций на его основе при наружном применении / Е.С. Гоголь, В.В. Даваа, Я.А. Костыро, С.А. Лепехова, Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, Н.В. Иванова, В.А. Бабкин // XX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва, 2013. - С. 317-318.

12. Гоголь, Е.С. Исследование ранозаживляющей активности оригинальных препаратов для комбустиологии / Е.С. Гоголь, В.В. Даваа, Я.А. Костыро, С.А. Лепехова. Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская. Н.В. Иванова, В.А. Бабкин // IX Всеросс. конф. "Химия и медицина" с мол. научн. школой: материалы. - Уфа, 2013. -

C. 163.

13. Коваль. Е.В. Исследование влияния оригинальных фармацевтических композиций на микробиологическую чистоту ожоговых ран в эксперименте / Е.В. Коваль. Е.С. Гоголь, В.В. Даваа, Я.А. Костыро, С.А. Лепехова, Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская. Н.В. Иванова, В.А. Бабкин // IV Междисциплинарная конф. "Биологические активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения": материалы. - Новый Свет (Крым, Украина), 2013. -Т.2.-С. 181.

14. Трофимова, Н.Н. Изучение реакции комплексообразования Си2" с дигидрокверцетином / Н.Н. Трофимова, Е.В. Столповская, В.А. Бабкин // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции (с международным участием) «Успехи синтеза и комплексообразования». - Москва, РУДН, 21-25 апреля 2014. - С. 301.

Подписано в печать 25.09.2015 г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печать Riso. Усл. печ. л. 0,93. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 105 экз. Заказ 25

Отпечатано в Институте земной коры СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 128