автореферат диссертации по электронике, 05.27.03, диссертация на тему:Применение дифракции лазерного излучения для определения деформируемости эритроцитов в условиях гипоосмотического гемолиза

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИНСТИТУТ ТОЧНОЙ МЕХАНИКИ И ОПТИКИ (ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)

РГБ ОД

На правах^р^р^пис^

Скворцова Юлия Александровна

УДК 535.4: 616.155.1

ПРИМЕНЕНИЕ ДИФРАКЦИИ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕФОРМИРУЕМОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ГИПООСМОТИЧЕСКОГО ГЕМОЛИЗА

Специальность 05.27.03 - квантовая электроника 14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена на кафедре квантовой электроники и

биомедицинской оптики в Санкт-Петербургском Государственном Институте Точной Механики и Оптики (Техническом Университете)

Научные руководители: Кандидат технических наук, доцент

Владимир Алексеевич Тарлыков Доктор медицинских наук, профессор Станислав Семенович Бессмельцев Официальные оппоненты: Доктор технических наук, профессор

Нагибина Ирина Михайловна Доктор медицинских наук, профессор Дуткевич Игорь Георгиевич

Ведущая организация: ОАО «ЛОМО»

Защита состоится « /£->> 2000 г. в /о_

на заседании диссертационного совета К.053.26.02 при Санкт-Петербургском Государственном Инстшуге Точной Механики и Оптики (Техническом Университете) по адресу 197101, С.-Петербург, ул. Саблинская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного Института Точной Механики и Оптики.

Автореферат разослан « /3 » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Анатолий Александрович Солунин

Р 3 ¿-Г ^ос.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В науке и технике измерения занимают центральное место. Изобретение лазеров расширило возможности оптических методов измерения в силу их основных преимуществ: высокого пространственного разрешения и высокой точности. Особенно высок интерес к применению когерентно-оптических методов измерения в биологии и медицине.

Среди когерентных методов наиболее перспективна лазерная дифрактометрия. Основные достоинства лазерной дифрактометрии -инвариантность, неконтактность, высокая точность (до сотых долей мкм), возможность автоматизации измерения - способствуют широкому ее применению, и в частности, для измерения геометрических размеров эритроцитов. Показатели реологии крови -вязкость, агрегация и деформируемость эритроцитов (ДЭ). Снижение ДЭ является одним из признаков ухудшения снабжения тканей кислородом. При ряде заболеваний системы крови, и в частности, множественной миеломе (ММ), нередко наблюдаются осложнения, в основе которых лежит нарушение реологических свойств крови с расстройством микроциркуляции: гипервискозный синдром, недостаточность кровообращения, острая и хроническая почечная недостаточность и другие, которые существенно ухудшают ее течение и способствуют развитию осложнений. Совершенно очевидно, что их раннее выявление и проведение своевременных лечебных мероприятий будет способствовать предупреждению и даже ликвидации осложнений, стабилизации основного патологического процесса. Так как ДЭ - один из основных параметров, определяющих реологические свойства крови, то его изучение безусловно представляется актуальным. Важно выявить причины ухудшения ДЭ при ММ и определить основные пути по их устранению.

К настоящему времени предложено много прямых и косвенных методов оценки ДЭ, недостатками которых, в одних случаях, можно считать слишком быстро протекающие процессы гемолиза (разрушение эритроцитов), что не позволяет фиксировать момент разрыва мембраны, или, в других методах, слишком большое время выдержки (порядка 24 часов) в гемолизирующих растворах. Кроме

того, фиксирование момента гемолиза осуществляется визуально по изменению цвета суспензии.

В работе предложено использовать для исследования ДЭ в условиях гипоосмотического набухания метод лазерной дифрактометрии. Высокая пространственная когерентность и монохроматичность лазера как источника излучения позволяет с большой точностью проводить измерения радиуса эритроцитов. Регистрация характерного размера эритроцитов осуществляется по изменению линейного размера дифракционных колец.

Цель и задачи работы: Цель работы: разработка способа лазерной дифрактометрии ДЭ и рассмотрение возможности его использования для диагностики реологических расстройств; оценки эффективности терапии у больных ММ; апробация его в широкой клинической практике. Поставленные задачи:

1 Рассмотреть применимость метода лазерной дифрактометрии ДЭ в процессе гипоосмотического набухания.

2. Провести математическое моделирование дифракции лазерного излучения на эхиноцитозных эритроцитах.

3 Разработать теоретическую модель набухания эритроцита в гипоосмотичсском растворе и создать методику измерения жесткости эритроцитарной мембраны.

4 Экспериментально исследовать методом лазерной дифрактометрии эритроциты доноров и больных с множественной миеломой и аденомой предстательной железы (АПЖ) в условиях гипоосмотического набухания.

Личный вклад автора: Все представленные экспериментальные исследования и теоретические расчеты проведены при личном участии автора.

Научная новизна работы: 1. Впервые метод лазерной дифрактометрии ДЭ использован в условиях гипоосмотического набухания совокупности эритроцитов

2 Предложен способ оценки жесткости эритроцитарной мембраны в условиях гипоосмотического набухания.

3. Экспериментально впервые обнаружен прерывистый механизм набухания сферулированного эритроцита, названный нами «скачком», заключающийся в резком уменьшении диаметра сферулированного эритроцита, предложена модель протекания данного процесса, показана его связь с жесткостью мембраны.

4. Экспериментально подтверждено, что одной из причин ухудшения ДЭ при ММ является высокий уровень парапротеина в крови и показана необходимость использования у таких больных в качестве корригирующего метода лечебного плазмафереза.

Практическая ценность Рассмотрена возможность применения метода лазерной дифрактометрии для исследования эритроцитов крови, оценено влияние параметров лазерного излучения на точность измерения. Предложен и апробирован доступный клинической практике и достаточно информативный метод лазерной дифрактометрии для определения жесткости эритроцитарной мембраны. Применение этого метода у больных ММ уточняет диагностику гемореологических расстройств с блокадой микроциркуляторного русла и позволяет своевременно начать активную терапию. Применение лечебного плазмафереза в комплексной терапии больных ММ позволяет существенно улучшить

ДЭ.

Положения и результаты, выносимые на защиту;

1. Метод лазерной дифрактометрии может быть применен для измерения среднего радиуса совокупности эритроцитов в условиях гипоосмотического набухания и построения гипотонической кривой.

2. Наличие эхиноцитоза - «шипиков» на поверхности эритроцита -не приводит к изменению положения минимумов ДК.

3. Предложена однопараметрическая модель набухания сферулированного эритроцита, где определяющим параметром является средняя жесткость эритроцитарной мембраны, и способ ее определения по гипотонической кривой.

4. Гипотоническая кривая сферулированного эритроцита имеет две особенности: пологий участок и нарушение монотонности -«скачок». Величина "скачка" и его местоположение зависят от жесткости эритроцитарной мембраны.

Апробация работы: Результаты работы обсуждались на семинарах кафедры КЭиБМО, ИТМО, СПб. Основное содержание диссертации докладывалось на VIII международной НТ конф. "Лазеры в науке, технике, медицине", Пушкинские Горы, 1997; Российской НП конф. Оптика - ФЦП "Интеграция", ИТМО, СПб 1999; конф. "Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения", BMA, СПб, 1999; международной конф. молодых ученых и специалистов "Оптика-99", СПб, 1999, Российской НП конф. Оптика - ФЦП "Интеграция", ИТМО, СПб, 2000; Юбилейной НТ конф. профессорско-преподавательской состава ИТМО, СПб, 2000.

Структура и объем работы. Диссертация, отражающая основное содержание проделанной работы, состоит из введения, четырех глав, заключения, списка цитированной литературы и приложений с методикой оценки жесткости эритроцитарной мембраны и экспериментального материала. Изложена на машинописных страницах, включая ¿^рисунков, ^ таблиц и список литературы, содержащий /¿^наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отмечены достоинства лазерной дифрактометрии, показана актуальность работы, сформулированы цель, задачи и основные положения, выносимые на защиту. Отмечено, что известным методам определения ДЭ присущи недостатки: у механических -малая точность; у фильтрационных - фильтрация через нерабочую часть фильтра; у резистентных - быстрый гемолиз и визуальное определение его наступления. Основными достоинствами метода лазерной дифрактометрии осмотического набухания эритроцитов являются: возможность исследования в течение длительного времени, высокая точность определения среднего радиуса эритроцитов (до сотых долей мкм), а также практическое использование методики оценки ДЭ в лабораторных условиях при исследовании состояния больного.

В первой главе анализируются вопросы моделирования форм эритроцитов, оценка их деформируемости и методы измерения механических свойств эритроцитов.

Резистентностью (устойчивостью) эритроцитов к гемолизирующим воздействиям определяется степень его деформируемости (один нз основных критериев жизнестойкости). Проведен обзор гемолизирующих факторов и показана перспективность использования модели гемолиза при осмотическом набухании эритроцитов.

Показано, что такие качества когерентно-оптических методов как минимальное воздействие на объект, инвариантность, возможность одновременной регистрации большого количества частиц свидетельствуют об их перспективном использовании для оценки трансформируемое™ формы частиц при осуществлении внешнего воздействия.

Во второй главе приведен сравнительный анализ различных математических моделей дискоидной формы эритроцита и обосновано описание ее овалами Кассини:

р( ср)=\<?соя(2<р)+т1с4( СОБ (2<р)У + (а4 -с4)

где с, а - параметры, характеризующие форму (рис. 1).

В результате теоретического моделирования построена гипотоническая кривая для различных размеров дискоцита. Определены параметры кривой, характеризующие точку сферуляции и жесткость мембраны (рис. 2).

При среднем диаметре дискоцита 7,7 мкм и толщине по центру 1,2 мкм, расчетный радиус сферы Ксф = 3,37 мкм, следовательно, относительное изменение радиуса клетки на момент сферуляции Ясф/Яо = 0,88, положение точки сферуляции составляет 0,66% №С1.

Расчет набухания сферического эритроцита с учетом жесткости его мембраны проведен на основании уравнения, связывающего относительный радиус эритроцита с параметрами среды (температурой, объемом суспензии, первоначальной осмолярностью внутри эритроцита) и жесткостью эритроцитарной мембраны.

90

Рис. 1 Овал Кассини.

Показано, что изменение относительного радиуса сферулированного эритроцита зависит в основном от жесткости его мембраны. Зависимость относительного радиуса эритроцита от концентрации соли имеет характер, близкий к экспоненциальному. Для однозначной характеристики данной зависимости преобразовали ее к линейной, изменив масштаб по оси абсцисс. С этой целью ввели новые координаты, значения которых являются квадратом экспоненты

от концентрации соли:

Р/Ясф

1,4

Жесткость

1,2

1,0

0,8

0,2 Н/м " 0,5 "0,9 ,6 4,6

0,8 0,7 0,6 0,5 N301, %

Рис. 2 Гипоосмотическая кривая набухания эритроцита.

Z=exp (С), где С -концентрация №С1 и тогда зависимость относительного радиуса в новых координатах

приняв вид (рис. 3):

Ъ/ясф = а+ьг.

Основной характеристикой в новой системе координат является коэффициент наклона Ь.

Выражение для него получено путем подбора аппроксимирующего выражения.

Ь = -0,02 - 0Д4ехр(-ЛТ).

Соответственно, связь

0,2 Н/м

жесткости с коэффициентом наклона (рис. 3):

I -°Д4 .

Предложенная методика

позволяет повысить

достоверность оценки

величины жесткости эритрощггарной мембраны в условиях эксперимента.

Установлено, что в момент сферуляции происходит увеличение дисперсности по размерам почти в 3 раза.

3,75 3,35 2,95 ехр'(С) Рис. 3 Линейная зависимость

Проведенное теоретическое моделирование подтверждено экспериментально на эритроцитах доноров и больных с различными диагнозами.

В третьей главе приведено описание экспериментальной установки, методики приготовления исследуемых образцов, анализ влияния параметров лазерного излучения, погрешностей эксперимента и полученных результатов.

Схема, поясняющая работу установки, приведена на рис. 4.

Рис. 4 Схема экспериментальной установки: I-лазер (10,63 мкм), 2-зеркало, З-образец, 4, 5-обьективы, 6-вращающиися фильтр, 7-видеокамера, 8-электродвигатель, 9-процессор, 10-монитор, 11-осциллограф

На представленной установке были проведены исследования эритроцитов крови доноров, больных ММ и больных с аденомой предстательной железы (АПЖ). Под нашим наблюдением находилось 47 больных ММ в возрасте от 39 до 76 лет с длительностью заболевания от 1 года до 10 лет.

У всех обнаружен М- компонент (парапротеин), в среднем составивший 35,0 + 2,3 г/л, между тем у 10 (21%) больных уровень парапротеина превышал 40 г/л. Все больные получали лечение по различным программам полихимиотерапии (ПХТ).

Для контроля были исследованы образцы крови 19 доноров крови (практически здоровых людей) и 22 больных с АПЖ. Диагноз АПЖ выбран по некоторым показателям: примерно одинаковый возраст

пациентов, совпадающие реологические расстройства, осложняющие течение основного заболевания (почечная недостаточность, ДВС-синдрои, нарушение микроциркуляции). Основное отличие: наличие парапротеина в крови у больных ММ.

В работе были проведены исследования осмотической резистентности эритроцитов и получены кривые изменения относительного радиуса эритроцитов от концентрации соли в суспензии, которые были преобразованы к линейному виду в соответствие с предложенной моделью и жесткость мембраны оценивали, исходя из ее коэффициента наклона.

Корреляционный анализ жесткости эригроцитарной мембраны больных ММ показал высокий уровень достоверности полученных результатов. В процессе лечения произошло существенное улучшение реологических показателей крови: концентрация общего белка в сыворотке крови уменьшилась до 81±5,0 г/л, а парапротеина до 29,82+3,15 г/л. При этом корреляционно уменьшалась и жесткость мембраны эритроцита (коэффициент корреляции с уровнем парапротеина в крови р=+0,9, уровнем общего белка р=+0,7).

У больных с АПЖ, также как и у доноров, жесткость составляет порядка 0,3-ь1,2 Н/м

При исследовании обнаружено, что изменение радиуса эритроцитов крови имело две особенности (рис. 5). Во-первых, при

избыточном давлении внутри эритроцита

0,6-=-1,4 атм скорость роста радиуса

эритроцита становилась практически нулевой (пологий участок) и у доноров, и у больных с обоими диагнозами. Вероятно, на этом участке эритроцит

демонстрирует устойчивость системы под действием

Рис. 51-дмскоидное состояние, II-набухание сферы, ¡¡¡-пологий участок, ¡V-«скачок»

осмотического давления, которое могло привести к разрыву.

Во-вторых, у больных ММ при концетрации 0,45-0,35% относительный радиус скачкообразно уменьшался на 0,01-0,06 с последующим восстановлением размера. «Скачок» происходил при величине избыточного давления 1,4-2,0 атм. Следовательно наблюдаемый «скачок», возможно, происходит за счет частичного выброса внутреннего содержимого при превышении порога устойчивости эритроцитарной мембраны. ДК наблюдается и после «скачка», что свидетельствует о целостности эритроцита. При уменьшении концентрации происходит дальнейшее увеличение среднего радиуса эритроцитов, что также говорит о целостности эритроцита.

Это можно объяснить свойствами мембраны, способной восстанавливать форму после закрытия каналов. Поэтому, при уменьшении радиуса и предположении, что при сохранившемся осмотическом давлении, давление внутри эритроцита имеет прежнюю величину, величина растягивающего поверхностного напряжения уменьшится, что свидетельствует о переходе эритроцита к более устойчивому состоянию.

Четвертая глава посвящена математическому моделированию дифракции лазерного излучения на совокупности эритроцитов. Исследовалось влияние дисперсности и изменение формы эритроцита на величину контраста ДК и погрешность измерения. Рассмотрена модель дифракции светового пучка на круглых дисках, хаотически расположенных в плоскости, перпендикулярной оси пучка. Данную модель можно применять, если фазовый сдвиг, вносимый частицей, мал. Типовая функция распределения эритроцитов по размерам, экспериментально полученная при микроскопическом измерении образца крови, с достаточной точностью аппроксимируется гауссовым распределением. Задача рассмотрена в приближении дифракции Фраунгофера.

Как известно, эритроциты могут принимать различные формы, в частности наблюдается эхиноцитоз. «Спонтанно», прикрепившись к стеклу, эритроцит через некоторое время превращается в частицу с «шипиками» на поверхности. В силу таких особенностей эритроцитов и условий исследования при помещении эритроцитов в камеру Горяева (изготовленную из стекла), представляет несомненный

интерес расчет влияния эхиноцитоза на результаты дифрактометрии.

В зависимости от степени осмотического набухания можно выделить две основные стадии эхиноцитоза, которые аппроксимируются двумя моделями. В дискоидном состоянии количество довольно крупных «шипиков» составляет порядка 20-30 штук, и их форма приближается к цилиндрической. В качестве геометрической модели эхиноцита дискоидной формы

«8»

¡¿ШЮюш

ОА

« " „Л

1 I т X / , 1 1 С I ^

-о

рассматривается апертура круглой формы с расположенными по

периметру «шипиками» цилиндрической формы, теневое сечение которых представили в виде прямоугольника. По мере набухания сферы размер «шипиков» уменьшается и их форма приближается к

Рис.6 Фото и модель сферического и дискоидиого эхиноцита

сферической. В качестве геометрической модели сфероэхиноцита -две независимые совокупности круглых апертур, одна из которых представляет собой отверстие размером порядка 6-8 мкм и другая - с характерным размером, уменьшающимся от 1 мкм (рис. 6). 3. Проведенное моделирование показало, что наличие эхиноцитов

0,75

0,65

0,55

0,5 0,6 0.7 0,8 0,9 1,0 диаметр ^шипика": 6,7

Рис. 7 Контраст при радиусе сферог{ита 6,7мкм а=3%: I- 10 шипов, 2- 20 шипов, 3- 30 шипов

влияет только на контраст ДК, что совпадает с данными эксперимента о том, что наличие «шипиков» не влияет на положение минимумов ДК. Показано, что контраст изменяется согласно

отношению площадей

«шипиков» и эритроцитов. Наиболее существенное влияние на контраст ДК оказывает количество шипов: чем больше «шипиков», тем

меньше контраст. Кроме того, оказывает влияние размер «шипиков»: при уменьшении размера «шипиков» контраст постепенно увеличивается и достигает значения, присущего совокупности эритроцитов без шипов с определенной дисперсностью по размерам (рис. 7)

Дисперсность по размерам «шипиков» практически не оказывает влияния на контраст ДК.

В заключении диссертации обобщены основные результаты работы:

1. На основании обзора литературы сделан вывод о перспективности использования метода осмотического набухания эритроцитов для определения деформируемости эритроцитов. Исследование деформируемости эритроцитов в процессе лечения особенно важно у больных ММ.

2. Теоретически определены точка сферуляции и относительное изменение радиуса на момент сферуляции. Показано, что определяющим параметром набухания сферулированного эритроцита является жесткость его мембраны. На основе метод лазерной дифрактометрии разработана методика определения жесткости эритроцитарной мембраны.

3. Разработана методика приготовления образцов крови для экспериментального исследования гипоосмотического набухания совокупности эритроцитов.

4. Проведен сравнительный анализ гипоосмотического набухания эритроцитов у доноров, больных ММ и АПЖ. Доказано, что у больных ММ точка сферуляции смещена в сторону меньшей концентрации соли и в процессе эффективного лечения стремится к норме.

5. Методом лазерной дифрактометрии подтверждено, что у больных парапротеинемическими вариантами ММ жесткость эритроцитарной мембраны значительно повышена за счет наличия патологического белка в крови, а у больных с миеломой Бенс-Джонса, АПЖ и доноров жесткость колебалась в пределах нормальных значений.

6. Обнаружено, что в процессе гипоосмотического набухания сферулированного эритроцита наблюдаются две особенности. Во-первых, при достижении избыточного давления внутри эритроцита

0,6-rl ,4 атм скорость роста радиуса эритроцита становится практически нулевой и у доноров, и у больных с ММ и АПЖ. Во-вторых, у больных ММ при концентрации 0,45+0,35 % NaCl при величине избыточного давления 1,4+2,0 атм радиус скачкообразно уменьшается на величину 0,01-5-0,06 с последующим восстановлением размера при уменьшении концентрации NaCl. Выявлена корреляционная связь между жесткостью

эритроцитарной мембраны и относительной величиной "скачка" (р = +0,9).

7. Рассмотрено влияние параметров лазерного излучения на точность измерения Разработан макет лазерной дифракционной установки.

8 При лазерной дифрактометрии эхиноцитозное состояние эритроцита не влияет на погрешность измерения. Наличие "шипиков" приводит только к уменьшению контраста. Контраст зависит от статистического веса "шипиков" по отношению к общему статистическому весу самих эритроцитов и при уменьшении веса "шипиков" стремится к контрасту ДК на совокупности эритроцитов без "шипиков".

9. Использование дифрактометрии эритроцитов в условиях гипоосмотического гемолиза при ММ может быть дополнительным признаком оценки эффективности лечения. При проведении больным ММ лечебного ПА наблюдается выведение низкомолекулярных продуктов распада парапротеина, что ведет к разблокированию функциональной способности эритроцитов и оказывает положительное воздействие на их деформируемость.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Бессмельцев С.С., Александрова Л.А., Скворцова Ю.А., Тарлыков В.А. Дифрактометрическое исследование трансформации эритроцитов в условиях гипоосмотического гемолиза/ Тез. докл. науч. конф., посвященной 200-летию BMA «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения» - СПб BMA, 1999. С. 24-25.

2. Скворцова Ю.А., Тарлыков A.B., Тарлыков В.А. Дифрактометрия трансформации эритроцитов/ Тез. докл. Российской НП конф. Оптика - ФЦП "Интеграция", СПб ИТМО, 1999. С. 19.

3. Лендяев АВ., Скворцоеа Ю.А., Тарлыков В.А. Лазерная дифрактометрия эритроцитов/ Тез. докл. Международной конф. молодых ученых и специалистов «Оптижа-99» - СПб, 1999. С. 13.

4. Бессмелъцев С.С., Скворцоеа Ю.А., Тарлыков В.А. и др. Влияние лечебного плазмафереза на трансформацию эритроцитов больных с множественной миеломой в условиях гилоосмотического гемолиза (метод лазерной дифрактометрии)/ Эфферентная терапия, 1999. Т. 5. № 2. С. 24-28.

5. Скворцоеа Ю.А., Лендяев А.В., Тарлыков В.А. Особенности гилоосмотического набухания сферулированного эритроцита/ Тез. докл. Российской НП конф. Оптика - ФЦП «Интеграция», СПб ИТМО, 2000. С. 19-20.

6. Скворцоеа Ю.А., Баженова К.Г., Тарлыков В.А. Моделирование дискоидной формы эритроцита/ Тез. докл. Российской НП конф. Оптика - ФЦП «Интеграция», СПб ИТМО, 2000. С. 20.

7. Скворцоеа Ю.А., Тарлыков В.А., Магурин В.Г. Исследование влияния эхиноцитоза на Фурье-спектр/ Тез. докл. юбилейной НТ конф. профессорско-преподавательской состава, СПб ИТМО, 2000. С. 63.

8. Скворцоеа Ю.А., Тарлыков В.А. Изменение дисперсии по размерам при осмотическом набухании эритроцитов/ Сборник научных трудов молодых ученых и специалистов, СПб ИТМО, 2000. С. 64-65.

9. Бессмелъцев С.С., Скворцоеа Ю.А., Тарлыков В.А. Исследование жесткости мембраны эритроцитов больных с множественной миеломой (метод лазерной дифрактометрии)/ Эфферентная терапия, 2000. Т. 6. № 1. С. 37-42.

10. Бессмелъцев С.С., Лендяев А.В., Скворцова Ю.А. Лазерная дифрактометрия оптических и механических свойств эритроцитов/ Оптический журанл, 2000. № 4. С. 47-51.