автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Определение нелетучих органических соединений методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии в токсикологических исследованиях

На правах рукописи

КОРЯГИНА НАДЕЖДА ЛЕОНИДОВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ В у ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Специальность 05 11 11 - Хроматография и хроматографические приборы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007

003176821

Работа выполнена в лаборатории общей токсикологии и гигиенического нормирования НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека Федерального медико-биологического агентства

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Савельева Елена Игоревна

доктор химических наук, профессор Рыбальченко Игорь Владимирович

ФГУ «27 Научный центр МО РФ»

доктор химических наук, старший научный сотрудник Бродский Ефим Соломонович

Институт эволюционной морфологии и экологии животных имени А Н Северцева РАН

„ Санкт-Петербургский

Ведущая организация: „ „

г Государственный Университет

Защита состоится «18» декабря 2007 г в 17 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д 002 259 04 при ИФХЭ РАН по адресу

119991, г Москва, Ленинский пр-т, д 31,корп 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии и электрохимии имени А Н Фрумкина Российской Академии Наук

Автореферат размещен на сайте Института http //phyche ас ru

Отзывы на автореферат (заверенные печатью) просим высылать по адресу 119991, г Москва, Ленинский пр-т, д 31,корп 4, ИФХЭ РАН ученому секретарю диссертационного совета Д 002 259 04

Автореферат разослан » ноября 2007 г

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета/'")

кандидат химических наук ¿¿¿¿Í Коломиец Л Н

Введение. Газовая хроматография (ГХ) с масс-спектрометрическим (МС) детектированием (ГХМС) применяется в качестве базового метода в большинстве лабораторий, специализирующихся в области аналитической токсикологии Круг органических соединений, анализируемых ГХМС, как известно, ограничен летучими или образующими летучие производные соединениями Анализ нелетучих органических соединений в виде производных методами ГХ и ГХМС в современной практике можно рассматривать как самостоятельную задачу, существенно более сложную, чем хорошо разработанные классические подходы к дериватизации летучих соединений (жирных кислот, фенолов и др) в целях улучшения их хроматографических характеристик В настоящей работе объектом анализа являлись маркеры токсического воздействия - высокотоксичные соединения и продукты их трансформации (фтор - или фосфорсодержащие кислоты, полиолы) - полярные и термолабильные Некоторые из них способны давать при алкилировании смесь моно- и диэфиров Реакции дериватизации таких соединений чувствительны к мешающему влиянию матричных компонентов Этим обстоятельством, а также высокой неспецифической сорбционной активностью и низкими степенями извлечения из гидрофильных матриц органическими растворителями этих соединений обусловлены особые требования, предъявляемые к процедурам, предшествующим дериватизации - выделению из матрицы, концентрированию и очистке фракции целевых веществ Разработка унифицированных процедур подготовки к ГХМС анализу таких соединений в матрицах различной природы в большинстве случаев проблематична Рациональным подходом является унификация отдельных стадий анализа

Актуальность темы. Разработка химико-аналитических методов обнаружения, точной структурной идентификации и количественной оценки высокотоксичных веществ и продуктов их трансформации в объектах окружающей среды и биологических пробах человека и животных при токсикологических исследованиях является чрезвычайно актуальной задачей Надежные химико-аналитические методы выявления факта воздействия токсичных веществ, идентификации действующего фактора воздействия и оценки уровня экспозиции необходимы как компонент медицинских и судебно- медицинских мероприятий в случаях возможною применения высокотоксичных соединений в условиях военных конфликтов и террористических актов, а также при аварийных ситуациях на предприятиях по хранению и уничтожению химического оружия и других вредных веществ В соответствии с частью 9 (приложение 46,е-17) «Кон-

венции о запрещении разработки, производства, накопления, применения химического оружия и о его уничтожении» расследования случаев несанкционированного применения отравляющих веществ должны в обязательном порядке включать анализ биологических проб человека и животных (кровь, моча, ткани и др). В то же время до настоящего времени не разработано документов, обобщающих и регламентирующих подходы к идентификации и анализу токсичных химикатов и продуктов их метаболизма в биосредах В ряду токсикологически значимых органических соединений велика доля нелетучих веществ Разработка методик их ГХМС анализа позволила бы решить ряд актуальных задач в области токсикологической экспертизы

Цели и задачи исследования Целью данной работы являлась разработка комплекса методик определения нелетучих высокотоксичных химических соединений и продуктов их превращений в различных средах Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи-

-Исследовать особенности и подобрать условия для количественной деривати-зации нелетучих органических соединений, выделенных из объектов окружающей среды и биологических проб 1

-Подобрать условия твердофазной экстракции (ТФЭ) на стадии пробоподготов-ки в целях создания приемлемых условий для последующей дериватизации 0-алкилметилфосфонатов (О-АМФК)

-Определить возможности и ограничения метода твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ) как альтернативы парофазному анализу (ПФА) в случае пробоот-бора из равновесного пара и альтернативы ТФЭ в режиме пробоотбора при погружении микроволокна в пробу

-Разработать эффективные процедуры дериватизации нелетучих органических веществ при использовании метода ТФМЭ в вариантах пробоотбора из равновесного пара и при погружении микроволокна в пробу

-Оценить возможности создания унифицированных методик для ГХМС анализа нелетучих органических соединений (галоген-, фосфор-, серусодержащих) в матрицах различной природы в рамках методов ТФЭ и ТФМЭ

Научная новизна. Установлены основные принципы унифицированной ГХМС методики определения нелетучих органических соединений при использовании метода ТФМЭ в режиме отбора летучего производного из равновесного пара Установлено, что применение метода ТФМЭ позволяет снизить предел

4

обнаружения этилового эфира фторукеусной кислоты не менее чем в 100 раз в сравнении со статическим ПФА

Найдены корреляционные зависимости между функцией, отражающей влияние стерического эффекта (для неполярных фаз), параметром гидрофобно-сти (для полярных фаз) и коэффициентом извлечения О-АМФК, позволяющие рассчитать эффективность извлечения определенным типом микроволокна химического соединения по структуре заместителя в пределах исследуемого гомологического ряда

Проведен систематический анализ особенностей дериватизации нелетучих токсичных соединений и продуктов их деструкции в различных матрицах Установлено, что дериватизация тиодигликоля (ТДГ), как продукта распада сернистого иприта, в стандартных условиях (при 65°С в течение 30 мин в аце-тонитриле) протекает с низким выходом в результате силилирования по одной гидроксильной группе Увеличение времени реакции относительно стандартных условий и внесение в реакционную смесь пиридина и солей калия предотвращает образование промежуточных продуктов реакции дериватизации

Идентифицированы 9 компонентов мочи и плазмы крови 3-гидроксимасляная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, мочевина, фосфорная кислота, 3-кетовалериановая кислота, 3-гидроксиизовалериановая кислота, пирокатехин, фенилуксусная кислота, пара-крезол, снижающих возможности достоверной идентификации в биожидкостях следовых количеств МФК и О-АМФК, являющихся продуктами метаболизма фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ)

Найден предпочтительный режим элюирования О-АМФК с патронов с сильным анионообменником (SAX)

Предложено использование дейтерированных стандартов О-АМФК для подтверждения первичной идентификации целевых соединений

Практическая значимость. Разработана и оптимизирована новая унифицированная высокочувствительная методика определения фторуксусной кислоты и ее натриевой соли (ФАН) в воде, биологических пробах (моче, плазме крови, гомогенатах тканей), а также в водных вытяжках различных объектов, основанная на этилировании фторуксусной кислоты, ТФМЭ этилфторацетата и последующем ГХ или ГХМС анализе Методика апробирована в опытах m vivo на лабораторных животных и позволила исследовать токсикокинетику и ток-

сикодинамику отравлений ФАН, установить органы-мишени, в первую очередь кумулирующие этот яд Методика была использована при разработке средств эффективной терапии отравлений ФАН, выборе оптимального средства терапии (в настоящее время являющегося объектом патентования) и описании механизмов его действия

Разработана процедура отбраковки и направления на повторный анализ проб, в которых степень извлечения целевых веществ ниже установленного порогового значения

Разработан и опробован на практике высокочувствительный способ определения ТДГ в морской воде (предел обнаружения 1 мкг/л) Методика обнаружения ТДГ в морской воде прошла государственную метрологическую экспертизу и была использована при выполнении работ по корректировке трассы Севере - Европейского газопровода Нордстрим по дну Балтийского моря

Разработаны и опубликованы методические указания «Химико-аналитический и санитарно-химический контроль основных продуктов распада ФОВ» (МУК 4 1-04)

Разработаны и находятся на стадии утверждения методические указания по установлению факта воздействия ФОВ на организм человека и животных по результатам анализа биосред.

Методики идентификации высокотоксичных веществ и продуктов их превращений в биологическом материале рекомендованы Федеральным медико-биологическим агентством (ФМБА России) для применения в токсикологических центрах, находящихся под эгидой ФМБА, при проведении медицинских и судебно-медицинских мероприятий по выявлению факта воздействия отравляющих, токсичных веществ в потенциальных объектах токсикологической экспертизы (вода, почва, биологические пробы)

Методики определения продуктов распада ФОВ методом ГХМС в почве (МВИ № 242/12-04) и воде (МВИ № 242/11-04) прошли метрологическую аттестацию и внесены в Госреестр методик Российской Федерации, рекомендуемых к применению для санитарно-химического сопровождения программы уничтожения химического оружия (УХО) в России В настоящее время МВИ № 242/12-04 испольлуси^я в целях экологического мониторинга санитарно-защитной зоны объектов УХО (Марадыковский, Щучье)

На защиту выносятся:

1 Экспериментальные приемы применения метода ТФМЭ в ГХМС анализе нелетучих органических соединений в токсикологических исследованиях, позволяющие повысить чувствительность, преодолеть матричный эффект и обеспечить более эффективное использование хроматографической и масс-спектрометрической систем

2 Способы дериватизации нелетучих органических соединений - маркеров токсического воздействия, в различных матрицах

3 Результаты исследования зависимости степени извлечения О-АМФК при проведении ТФЭ от природы элюента

4. Иммобилизация определяемого вещества на микроволокне из равновесного пара как способ преодоления матричного эффекта и основа для разработки унифицированной методики анализа

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференции «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (25-30 сентября 2005 г, г Краснодар), на I съезде физиологов СНГ«Физиология и здоровье человека» (19-23 сентября, г Сочи), Annual Meeting of the American Institute of Chemical Engineers (30 октября - 04 ноября, 2005 , г Цинциннати, США), PITTCON (12-17 марта 2006г, Орландо, Флорида, США), Х-ой Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбция и хроматография» (24-28 апреля 2006 г, г Клязьма, Московской обл ), 9lh Internatonal Chemical Weapons Demilitarisation Conferenc, CWD 2006, (15- 18 мая 2006 г, Люнебург, Германия), The Sixth International Chemical and Biological Medical Treatment Symposium (30 апреля-5 мая 2006, SPIEZ, Швейцария), Science workshops and seminars «Analysis of toxic substances method of development and applications» (19-20июня 2006 г, С-Петербург (Пушкин)), 3-ей Международной научно-практической конференции «Новые технологии создания инновационных лекарств. От достижений «постгеномной эры» к национальным фармацевтическим брендам» (1 декабря 2006г, Московская обл, г.о Химки, Центр высоких технологий «ХИМРАР»), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию ФГУП НИИГПЭЧ ФМБА России (15-16 февраля 2007 г, Санкт-Петербург), Международном семинаре по деконтаминации «Очистка зданий и сооружений, загрязненных в результате химического терроризма» (11-13 сентября 2006 г Москва), 4-м Всемирном конгрессе по химическому, биологическому и радиологическому терроризму (15-19 апреля 2007 г ,

Дубровник, Хорватия), Международном конгрессе по управлению отходами Вэйст-Тэк (31 мая - 3 июня 2007 г, г Москва), Международном семинаре МНТЦ «Предупреждение и устранение последствий химически опасных чрезвычайных ситуаций, обусловленных терроризмом и промышленными авариями» (18-20 сентября 2007 г, г Санкт-Петербург), П-ой Всероссийской конференции «Аналитика России» (7-12 октября 2007 г, г Краснодар)

Публикации. По материалам исследований опубликованы 32 научных работы в виде статей, тезисов докладов, методик и методических указаний

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы

Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 24 рисунка, 46 таблиц и список литературы из 152 наименований

Основное содержание работы Оборудование, исходные вещества, методика эксперимента Работа выполнена с использованием хромато-масс-спектрометрических приборных комплексов GCMS 5000 Shimadzu и QP 2010 Shimadzu (Япония), включающих газовый хроматограф, многофункциональный масс-спектрометр с квадрупольным (GCMS 5000) и квадрупольно-октапольным (QP 2010) детекторами и систему обработки данных GCMS Solution Приборы оборудованы инжектором для ввода проб с делением/без деления потока Для разделения летучих производных использовали капиллярные кварцевые колонки DB-5MS (Supelco) 25мх0,2ммх0,33мкм ГХ анализы выполнены на газовом хроматографе HP 5890 (Hewlett Packard) с ионизационно-пламенным детектором с использованием капиллярной колонки НР-5 (Supelco) 25мх0,2ммх0,33мкм Объектами целевого анализа были фторуксусная кислота (ФК) и ФАН, метил-фосфоновая кислота (МФК) и О-АМФК (О-изопропил МФК, О-изобутил МФК, О-пинаколил МФК), а также ТДГ

Для подготовки проб к ГХМС анализу были разработаны подходы, основанные на жидкостной, твердофазной экстракции и твердофазной микроэкстракции Последняя осуществлялась как в режиме отбора проб из равновесного пара, так и в режиме погружения микроволокна в пробу

Для получения летучих производных целевых веществ использовали процедуры дериватизации, производимой в экстрактах, в сухом остатке пробы или на микроволокне

В качестве внутренних стандартов использовали трибутилфосфат, толуол, четыреххлористый углерод, дейтерированные О-АМФК, мета-фторбензойную кислоту, тиодипропанол

Хроматографическое разделение проводили как в изотермическом режиме, так и в режиме программирования температуры В качестве газа-носителя использовали гелий марки «А» (99,99%)

Масс-спектрометрическую регистрацию летучих производных целевых веществ осуществляли в режиме полного ионного тока (ПИТ) или селективного ионного детектирования (СИД) Масс-спектры получали в условиях электронной ионизации (ЭИ) Энергия ионизирующих электронов 70 эВ

Объектами исследования служили водопроводная и морская вода, почва, биологические пробы (плазма крови, гомогенаты тканей, моча) с добавками целевых веществ, пробы почвы, доставленные с объекта УХО, а также биопробы после экспонирования соответствующими токсичными соединениями цельной крови и плазмы крови человека и животных в опытах in vitro, плазма крови, моча и гомогенаты органов и тканей лабораторных животных (кроликов и крыс), полученные при интоксикации животных в опытах m vivo

Особенности следового химического анализа в токсикологической

экспертизе

Целевыми веществами для химического анализа в токсикологической экспертизе могут быть как сами высокотоксичные вещества (например, фторук-сусная кислота (ФК) и ее соли), так и продукты их биогенной и абиогенной трансформации ТДГ, как основной продукт гидролиза сернистого иприта, МФК и О-АМФК, как продукты трансформации ФОВ Анализ маркеров токсического воздействия актуален как в биологических пробах для подтверждения факта отравления и идентификации токсиканта, так и в «небиологических» пробах, через которые возможна опосредованная доставка токсичного агента в организм Маркеры, как правило, бифункциональны, имеют гидрофильную или гидрофильно-гидрофобную природу, часто являются продуктами гидролиза и содержат в своей структуре одну, а преимущественно две и более гидроксиль-ных групп Такие соединения не являются традиционным объектом ГХ анализа, их дериватизация в рамках классических процедур требует особых подходов. В сложных матрицах подтверждающая идентификация, особенно в следовом анализе, является самостоятельной проблемой, не имеющей достоверного решения

9

на основании только хроматографической информации Последнее особенно актуально в отношении биологических проб, при анализе которых, как было подтверждено нами в модельных экспериментах, даже ГХМС в режиме СИД не обеспечивает надежной идентификации В таких случаях требуется либо дополнительная очистка пробы, либо идентификация по полному масс-спектру

Особенности выделения из матрицы, разделения и концентрирования нелетучих органических соединений.

Оценка возможности создания унифицированных методик

Метод жидкостной экстракции находит незначительное применение для извлечения высокополярных аналитов из водных сред Даже при использовании полярных экстрагентов и высаливающих агентов степени извлечения ФК, МФК, О-АМФК и ТДГ из водных растворов не превышают (10 - 40) % Вместе с тем, жидкостная экстракция может быть успешно применена для очистки проб от гидрофобных примесей (очистка водных вытяжек почвы и биологических проб хлористым метиленом в анализе МФК и О-АМФК) Для анализа твердых объектов (почва, стройматериалы, биологические ткани, растертые с сульфатом натрия) может применяться экстракция ацетонитрилом в ультразвуковой ванне (извлечение МФК и О-АМФК из стройматериалов), но более эффективна экстракция щелочными водными растворами (извлечение МФК и О-АМФК из почвы, рН 10). Для подготовки к анализу нелетучих органических соединений в водных средах, к числу которых относятся не только вода, но и водные вытяжки из твердых проб и гомогенатов биологических тканей, моча, де-протеинизованные кровь и плазма, классическим подходом является упаривание досуха и перерастворение в субстанциях, наиболее приемлемых для последующей дерибатизации Если дериватизация нелетучего соединения проводится в сухом остатке, а отбор летучего производного (например, этилового эфира ФК) возможен из равновесного пара, например методом ТФМЭ, характер матрицы малосущественен, и унификации поддаются все стадии анализа. ТФМЭ из равновесного пара сохраняет все преимущества ПФА, но обеспечивает существенно более высокую чувствительность На этой основе для определения ФАН нами предложен новый унифицированный высокочувствительный способ ГХ анализа с ионизационно-пламенным и МС детектированием в воде и биологических пробах, соответственно. Способ основан на упаривании образца (воды или ацетонитрильного экстракта биопробы) досуха, этилировании сухого ос-

10

татка этиловым спиртом в присутствии серной кислоты, отборе этилового эфира ФК из равновесного пара на микроволокно с последующим ГХМС анализом Определены оптимальные условия для проведения ТФМЭ, а также установлено, что применение ТФМЭ для извлечения из матрицы и концентрирования аналита позволяет повысить чувствительность определения на 2 порядка в сравнении со статическим ПФА В табл 1 представлены результаты определения содержания ФАН в водопроводной воде методами ПФА и ТФМЭ Таблица 1. Результаты определения содержания ФАН в водопроводной воде методами ПФА и ТФМЭ

Внесено ФАН, мг/л Найдено, мг/л

ПФА ТФМЭ

10,0 10,4 ± 0,8 9,55 ± 0,68

5,0 4,3 ± 0,8 4,68 ± 0,65

0,5 <5* 0,43 ±0,16

0,005 <5* 0,005 ± 0,002

*- предел обнаружения 5 мг/л

В тех случаях, когда невозможен отбор летучего производного из равновесного пара, дериватизация целевых веществ проводится либо в сухом остатке, полученном после упаривания пробы или соответствующего экстракта, либо на микроволокне В этом случае унификации подлежат отдельные стадии процедур

Выбор режима дериватизации МФК и О-АМФК

Продукты как биогенного, так и абиогенного гидролиза ФОВ - МФК и О-АМФК, методами ГХ и ГХМС могут быть определены только в виде производных При их анализе ГХМС в режиме ионизации электронным ударом наиболее часто используют деривэтизэцию с получением метиловых, триметилсилило-вых, а в последние годы - /яреот-бутилдиметилсилиловых (ТБДМС) эфиров Для выбора процедуры дериватизации в рамках настоящей работы было проведено сравнительное исследование эффективности дериватизации с применением трех указанных выше процедур Интересно отметить, что в виде разных производных О-АМФК обнаруживают различный порядок выхода с хромато-графической колонки со стандартной слабополярной фазой При метилировании О-пинаколил МФК образуются четыре диастереомерные формы, которые

выходят в виде 2-х пиков (группируясь парами), при силилировании МФК и О-АМФК образуются эфиры, дающие одиночные пики на хроматограмме

При выборе процедуры получения производных во внимание принимали ее вклад в обеспечение чувствительности, селективности и воспроизводимости анализа Выбор был сделан в пользу отрети-бутилдиметилсилилирования МФК и О-АМФК с целью их последующего целевого ГХМС анализа Характеристики, необходимые для анализа ТБДМС эфиров О-АМФК, полученные в режиме программирования температуры и при ионизации электронным ударом, приведены в табл. 2. Линейно-логарифмические индексы удерживания рассчитывали с помощью компьютерной программы в формате Q Basic

При анализе проб биохимической природы требуются особые режимы силилирования МФК и О-АМФК с учетом биогенных компонентов плазмы крови Нами установлено, что определению О-АМФК в плазме крови мешают 2-гидроксимасляная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, мочевина, фосфорная кислота, 3-кетовалериановая кислота Введение процедуры предварительной очистки хлористым метиленом подкисленных до рН 2 экстрактов биопроб позволило снизить мешающее влияние компонентов матрицы Таблица 2. Масс-спектры и индексы удерживания (RI) на стандартных слабополярных фазах ТБДМС эфиров МФК и О-АМФК

Соединение Масс-спектр ЭУ RI

МФК 45(12), 73(55), 75(12), 135(12), 153(13), 225(11), 267(100), 268(20), 269(10), 309(5) 1571

О-изопропил МФК 45(7), 73(6), 75(20), 77(4), 121(5), 153(100), 154(10), 155(5), 195(6), 237(3) 1314

О-изобутил МФК 45(6), 57(4), 73(8), 75(19), 77(4), 121(6), 153(100), 154(10), 155(6), 193(1), 195(4), 209(3), 211(2) 1427

О-пинаколил МФК 45(8), 53(9), 55(12), 56(7), 67(8), 69(54), 73(8), 75(20), 84(19), 121(9), 153(100), 154(13), 182(7), 195(7), 211(9), 237(13) 1536

Проведена оценка селективности определения МФК и О-АМФК в биопробах путем сравнительного анализа проб плазмы крови in vitro экспонированной метафосом (инсектицид, применяется в качестве имитатора RVX) и образцов плазмы крови m vitro экспонированных ФОВ (RVX и зоманом) Установлено, что продукты превращения метафоса (RT 26,4 - не идентифицирован, RT 29,1 - шря-нитрофенол) имеют в масс-спектре сигнал, соответствующий m/z 153 аналогично ТБДМС эфирам О-изобутил МФК (продукт метаболизма RVX) и О-пинаколил МФК (продукт метаболизма зомана) и близкое с ними время выхода на хроматографической колонке со стандартной слабополярной фазой. Проведенные исследования свидетельствую! о принципиальной возможности ошибок при диагностике поражений, вызванных антихолинэстераз-ными ядами (RVX, зоман, метафос) при проведении анализа методом ГХМС в режиме СИД без идентификации ТБДМС эфиров О-изобутил МФК и О-пинаколил МФК по полному масс-спектру

Проведено определение органических соединений, мешающих анализу МФК и О-АМФК в моче Установлено, что определению О-изопропил МФК в моче человека практически не мешают компоненты матрицы Определению МФК мешают пара-крезол (в условиях анализа хроматографически не отделяется) и 3-гидроксимасляная кислота; определению О-изобутил МФК мешает 3-гидроксиизовалериановая кислота и бутандиол моноацетат (идентифицирован предположительно), определению О-пинаколил МФК - пирокатехин и фени-луксусная кислота Применение метода ГХМС в сочетании с ТФМЭ позволило преодолеть негативное влияние матричного эффекта.

Результаты исследования зависимости степени извлечения МФК и О-АМФК при проведении ТФЭ от природы элюента

Для подготовки проб к ГХМС анализу ТФЭ используется в режиме удерживания как целевых веществ, так и примесей Для извлечения полярных органических аналитов кислотной природы наиболее эффективно применение сильных анионообменников Катионообменники эффективны для удаления ионов металлов из водных проб, а гидрофобные сорбенты - неполярной органики Для выделения и концентрирования МФК и О-АМФК из воды й предварительно очищенных экстракцией хлористым метиленом водных вытяжек почвы применяли ТФЭ в режиме анионообменной хроматографии с применением сильного анионообменника - силикагеля, модифицированного четвертичными аммоние-

выми группами (БАХ) Элюат упаривали досуха Определение МФК и 0-АМФК проводили в виде силилированных производных

В рамках указанной процедуры наиболее значимой является стадия элюи-рования, условия которой необходимо было оптимизировать

При выборе элюентов руководствовались общими принципами элюиро-вания, характерными для анионообменных процессов В качестве элюентов были опробованы следующие реагенты

-раствор кислоты в органическом растворителе (раствор соляной кислоты в метаноле, растворы муравьиной кислоты в метаноле и ацетонитриле), -раствор основания в органическом растворителе (гидроксид натрия и аммиак в метаноле, диэтиламин в метаноле),

-элюент, содержащий противоион с более высокой специфической селективностью (водный раствор бромида натрия)

Положительный результат был получен только с 5 элюентами из опробованных 12 (табл 3)

Таблица 3. Результаты тестирования различных растворов в качестве элюентов

№ Элюент Результат элюирования

1 0,1 н раствор НС1 в метаноле

2 0,15 н раствор НС1 в метаноле -

3. Муравьиная кислота метанол (0,3 10)

4 Муравьиная кислота ацетонитрил (0,6 10) +

5 0,3 М водный раствор ЫаВг -

6 3% МН3 в метаноле -

7 1,8М раствор диэтщамина в метаноле -

8 0,1 н №ОН в метаноле +

9 0,5 н №ОН в метаноле -

10 1 н ЫаОН в метаноле +

11 3% ЫН3 в метаноле 1 н КаОН в метаноле (9 1) -

12 3% ГчГНз в метаноле 25% ЫН3 в воде (4,5- 0,5) +

* (-) - регистрируемые хроматографические лики определяемых веществ с соотношением сигнал/шум менее 3 1

**(') " р^»йС.рИру^мыс хромаю!рафиЧеышс пики определяемых вещень с ихмношением сигнал/шум более 3 1

Основная проблема возникла при упаривании элюата досуха, так как присутствие нелетучих веществ в пробе снижало выход реакции силилирования

Низкие степени извлечения целевых веществ, выпадение неорганического осадка, препятствующего концентрированию пробы до малого объема, заставили продолжить поиск подходящего элюента Наиболее предпочтительным был признан элюент, содержащий 4,5 мл 3% метанольного раствора ЫН3 и 0,5 мл 25% водного раствора ИНз В табл 4 представлены результаты, полученные при применении данного элюента Параллельно для сравнения, представлены результаты опыта, в котором в качестве элюента был использован 0,1н раствор №ОН в метаноле (лучший из ранее исследованных) В качестве внутреннего стандарта использовали трибутилфосфат, который вносили в пробу перед дери-ватизацией.

Существенным преимуществом выбранного элюента является отсутствие солевого осадка при упаривании элюата, который снижал бы выход реакции дериватизации с использованием Л7,0-бис(триметилсидил)трифторацетамида в качестве силилирующего агента. МФК, обладающая повышенной неспецифической сорбционной активностью, обнаруживает низкие степени извлечения, независимо от используемого элюента

Таблица 4. Зависимость степени извлечения МФК и О-АМФК от природы элюента

Название соединения Степень извлечения О-АМФК, % (п=3)

3% ТЧНз в метаноле 25% ЫН3 в воде (4,5 0,5) 0,1н №ОН в метаноле

МФК 29±21 34±20

О-изопропил МФК 74±37 17±9

О-изобутил МФК 84±38 7±5

О-пинаколил МФК 98±25 17±7

Анализ литературных публикаций показывает, что большинство авторов при подборе условий проведения ТФЭ в режиме ионообменной хроматографии (выбор сорбента, противоиона, элюента) исходят из эмпирических, а не теоретических закономерностей

Преимущества применения метода ТФМЭ в режиме погружения ГмИКрОБОЛОКна б пробу как алыерна1ивы ТФЭ

Метод ТФЭ с применением сильного анионообменника не удалось адаптировать к анализу мочи. В последние годы в качестве альтернативы методу ТФЭ все чаще выступает метод ТФМЭ, позволяющий объединить в пределах

одной стадии анализа процедуры извлечение из матрицы, концентрирование, дериватизацию и ввод пробы в хроматограф Для успешного использования метода ТФМЭ решающее значение имеет правильный выбор микроволокна, условий проведения сорбции (температура, время, режим перемешивания пробы, ионная сила анализируемого раствора) и десорбции (температура, время задержки сброса)

В отличие от некоторых родственных технологий, ТФМЭ на микроволокне предоставляет уникальную возможность экспериментировать с различными типами микроволокон, отличающимися химической природой сорбирующей фазы и размерами микропор

Эффективность того или иного микроволокна для определения конкретных органических соединений в значительной степени зависит от качественного и количественного состава анализируемой пробы в целом Большое значение имеет уровень фонового сигнала в ГХМС анализе, который очень высок в случае полярных микроволокон (на основе полиакриловых полимеров) и мешает определению Кроме того, анализируемые вещества конкурируют между собой и с матричными компонентами в процессе сорбции Итоговый результат этих процессов заранее непредсказуем и может быть получен лишь в эксперименте с реальными пробами

Для анализа МФК и О-АМФК в моче нами было предложена процедура, включающая извлечение МФК и О-АМФК из мочи на микроволокно, их сили-лирование А'-метил-Л'-/и/зе«-бутилдиметилсилилтрифторацетамидом (МТБСТ-ФА) непосредственно на микроволокне, термодесорбция полученных производных в горячем испарителе газового хроматографа, ГХ разделение и МС детектирование в режиме СИД В целях повышения чувствительности метода были проведены исследования по оптимизации ряда экспериментальных параметров

Было опробовано три типа микроволокон различной полярности* сополимер дивинилбензол/карбоксен/полидиметил сил океан (50/30ит БУВ/СагЬо-хеп/РОМБ), карбоксен/полидиметилсилоксан (85ит СагЬохеп/ТОМ8) и карбо-вакс/дивинилбензол (70ит СагЬоугахЛЭУВ) (рис 1) Наиболее предпочтительным оказалось микреволокно на основе сополимера дивинилбензола и поляди-метилсилоксана (50/30ит ОУВ/СагЬохеп/РОМЯ)

Для неполярных микроволокон установлена четкая корреляционная зависимость между параметром ) отражающей влияние стерического эффекта алкильного заместителя в молекуле О-АМФК и коэффициентом извлечения. Для микроволокна 13УВ/СагЬохеп/РВМ8 корреляционная зависимость выражена уравнением (1):

^П- А \ ЛЛ // /

= -5,56 х £" -2,91

К = 0,979 при уровне значимости Р=0,010592.

(1)

12000000

8000000

м 4000000

О"

¿г

кР»

а

! И ДВБ/К арбоксе н/ПДМС

° ______

#

0 Карбовакс ■ Карбоксен/ПДМС

Рис. 1 Эффективность различных микроволокон для определения МФК и О АМФК в виде ТБДМС эфиров

Для микроволокна СагЬохеп/РВМ8 - уравнением (2):

5,

О-АМФК /

= -4,88 х£,и-1,8

(2)

К = 0,981 при уровне значимости Р=0,009671.

Для МФК, имеющей в структуре две полярные ОН - группы, стерический эффект не существенен.

Для полярного микроволокна степень извлечения больше коррелирует не со стерическим эффектом, а с константой распределения О-АМФК в системе 1-октанол вода log Р, являющейся мерой гидрофобности этих соединений в целом Для микроволокна Carbowax/DVB корреляционная зависимость выражена уравнением (3)

(Значения величин log Р для МФК и О-АМФК были рассчитаны по структуре молекул методом молекулярной механики ММ2 с помощью программного обеспечения CS ChemUltra).

Полученные результаты согласуются с классическими представлениями теории сорбционных процессов стерические факторы являются определяющими при удерживании О-АМФК на твердых пористых сорбентах (DVB/Carboxen/PDMS, Carboxen/PDMS), в то время как показатель гидрофобности является определяющим для эффективности удерживания аналитов жидкой фазой Carbowax

Таким образом, найденные корреляционные зависимости позволяют рассчитать эффективность извлечения определенным типом микроволокна, при проведении 1ФМЭ, химического соединения в пределах исследуемого гомологического ряда по структуре заместителя

Остальные параметры процедуры ТФМЭ (табл 5) были оптимизированы последовательно

Экспериментально установлено, что применение ТФМЭ для извлечения из матрицы и концентрирования МФК и О-АМФК позволяет значительно повысить чувствительность определения в сравнении с методом ТФЭ В табл 6 представлены результаты определения содержания МФК и О-АМФК в водопроводной воде методами ТФЭ и ТФМЭ

Максимальная чувствительность определения О-пинаколил МФК, достигаемая при применении как ТФЭ так и ТФМЭ, может быть объяснена преимущественно наибольшей липофильностью этого соединения в исследуемом ряду

(3)

2

R = 0,988 при уровне значимости F==0,01167

Таблица 5. Рекомендуемые параметры метода ТФМЭ для анализа МФК и О-АМФК в моче

Фактор Параметр

Тип микроволокна 50/30 urn DVB Carboxen/PDMS

Режим кондиционирования микроволокна 15 мин в горячем инжекторе и далее 5 минут в парах силилирующего агента при комнатной температуре

Температура сорбции Комнатная

Температура десорбции 250°С

Время сорбции 30 мин

Высаливание Добавка равного объема насыщенного раствора хлористого натрия

Время десорбции 0,5 мин

Режим сорбции Погружение микроволокна в пробу

Режим дериватизации В парах дериватизирующего агента при комнатной температуре

Таблица 6. Средние значения по результатам параллельных определений (п=3)

содержания МФК и О-АМФК в водопроводной воде методами ТФЭ и ТФМЭ

№ Название соединений Внесено, мг/л Найдено, мг/л

п/п ТФЭ ТФМЭ

1 О-изопропил МФК 1 0,7±0,3 0,8±0,4

0,1 <0,2 0,07±0,03

0,01 <0,2 0,005±0,003

0,001 <0,2 <0,005

2 МФК 1 0,3±0,2 0,6±0,4

0,1 <0,4 0,05±0,04

0,01 <0,4 0,006±0,006

0,001 <0,4 <0,01

3 О-изобутил МФК 1 0,6±0,3 0,7±0,4

0,1 <0,2 0,07±0,05

0,01 <0,2 0,006±0,005

0,001 <0,2 <0,005

4 О-пинаколил МФК 1 0,8±0,2 0,9±0,5

0,1 0,07±0,04 0,08±0,04

Л Л1 v,v/ 1 1 — Л ЛЛП-ЬЛ

0,001 <0,1 0,001±0,001

Сочетание аналитических параметров для ГХМС определения ТДГ

При силилировании ТДГ необходимо контролировать и исключать возможность образования моноэфиров в качестве конечных продуктов реакции При силилировании ТДГ в стандартных условиях (растворитель - ацетонитрил, 30 мин, 60°С) преимущественно образуется монопроизводное ТДГ (ТДГ МТБСТФА, m/z 179, 163) Для выбора предпочтительных условий получения диэфира ТДГ [ТДГ (МТБСТФА)2, m/z 189, 293] было опробовано четыре процедуры дериватизации ТДГ с использованием различных растворителей

Проведенные исследования показали, что при дериватизации ТДГ реагентом МТБСТФА получение диэфира с максимальным выходом достигается путем внесения в реакционную смесь неорганических солей калия и проведения реакции в смеси растворителей ацетонитрил пиридин (10 1) при температуре 85°С в течение 1 часа Пиридин и соли калия, по-видимому, выступают в качестве катализатора реакции между монопроизводным ТДГ и МТБСТФА

Обоснование необходимости использования внутренних, или суррогатных, стандартов для проведения количественных определений и устранения ложноотрицательных ответов

В ГХМС анализе нелетучих органических соединений внесение в пробу внутренних или суррогатных стандартов на ранних стадиях анализа не только полезно для уточнения количественного результата, но и необходимо во избежание ложноотрицательных ответов в тех случаях, когда вариации в составе пробы или ошибки в пробоподготовке приводят к тому, что площадь пика внутреннего (суррогатного) стандарта меньше установленного порогового значения и, следовательно, прогноз достижения удовлетворительной степени извлечения целевого вещества неблагоприятен

Ввиду возможного частичного перекрывания пиков внутреннего стандарта и матричных компонентов пробы, при анализе ФАН в биологических пробах использовали два внутренних стандарта (толуол и четыреххлористый углерод) Поскольку содержание ФК в анализируемой пробе не может быть предсказано, один из внутренних стандартов (четыреххлористый углерод) вносили в пробу в количестве, близком к нижней границе линеиного диапазона, другой (толуол) -в количестве, близком к верхней границе линейного диапазона

Для контроля правильности проведения химических анализов морской воды на содержание ТДГ в пробу вносили в качестве внутреннего стандарта

20

.меиш-фторбензойную кислоту В тех случаях, когда площадь пика внутреннего стандарта была меньше заданной пороговой величины, или его время удерживания не попадало в заданный интервал, пробы направлялись на повторный ГХМС анализ Если удовлетворительная площадь пика и (или) время удерживания внутреннего стандарта не достигалась и в этом случае, пробы готовили повторно Из 46 проанализированных проб морской воды 8 были направлены на повторный анализ, тк площадь пика внутреннего стандарта не достигала порогового значения

Для повышения надежности идентификации О-АМФК в моче были использованы дейтерированные стандарты О-АМФК На рис 2 представлена масс-фрагментограмма ТБДМС эфиров дейтерированных стандартов О-АМФК

Int SC 7 С 6С 5 4 ЗС 2 1 0.( Э-этил Л R.T7 341 I | 1 1 Г J м ljo-изопр RT7 701 0- K-d3 t. опил МФ изобутил RT9 220 k 1 K-d3 мфк -аз О-пинаколил МФК-йЗ RT10 633

75 100 12 5 15 0 17 5 ,мин

Рис. 2 Масс - фрагментограмма ТБДМС эфиров дейтерированных О-АМФК

При ГХМС-СИД анализе ТБДМС эфиров О-АМФК проводится регистрация интенсивностей сигналов ионов с массовым числом ш/z 153 Как видно из рис 2, дейтерированные стандарты также дают сигналы с m/z 153 с интенсивностью в среднем 10 % по отношению к интенсивности основного сигнала в их масс-спектрах (иона m/z 156) Поэтому внесение в пробу дейтерированных (d3) стандартов может приводить к искажению результатов количественного анализа и послужить источником ложно-положительных ответов при идентификации. При обнаружении О-АМФК в следовых количествах в биоматрицах повторный ГХМС анализ с внесением дейтерированных стандартов позволяет подтвердить ГХ и MC идентификацию

Выводы

1 Показано, что в случае, когда возможна дериватизация нелетучего аналита непосредственно в пробе, а отбор летучего производного производится из равновесного пара (например, этилового эфира ФК) характер матрицы малосущественен, и унификации поддаются все стадии анализа В остальных случаях унификации подлежат отдельные стадии анализа (режим ГХМС анализа, дери-ватизации и др)

2 Изучены варианты дериватизации МФК и О-АМФК различными реагентами, показано, что для дериватизации МФК и О-АМФК предпочтительным является «г/?е/и-бутилдиметилсилилирование Проведен выбор режима силилирования О-АМФК с учетом биогенных компонентов плазмы крови и мочи Установлено, что определению О-АМФК в плазме крови мешают 2-гидроксимасляная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, мочевина, фосфорная кислота, 3-кетовалериановая кислота Установлено также, что определению О-изопропил МФК в моче человека практически не мешают компоненты матрицы, определению МФК мешают пара-крезол и 3-гидроксимасляная кислота, определению О-изобутил МФК мешает 3-гидроксиизовалериановая кислота и бутандиол моноацетат (идентифицирован предположительно), определению О-пинаколил МФК - пирокатехин и фенилуксусная кислота

3 Для элюирования О-АМФК с патрона с сильным анионообменником из 12 опробованных элюентов наилучшие результаты были получены с использованием в качестве элюента смеси 3% метанольного раствора ИНз и 25% водного раствора №13 в соотношении 9 1 Разработанная процедура анализа О-АМФК была положена в основу методики определения продуктов распада фосфорор-ганических отравляющих веществ в почве

4. Показано, что маркеры воздействия на организм ФОВ (О-алкилметилфосфонаты) и сернистого иприта (тиодигликоль) методом ГХМС в режиме ионизации электронным ударом эффективно определяются в виде /ире/й-бутилдиметилсилиловых эфиров Однако для О-алкилметилфосфонатов предпочтительным является /ярет-бутилдиметилсилилирование парами дери-ватизирующего агента на микроволокне, а для тиодигдиколя - дериватизация в упаренной досуха и перерастворенной в смеси ацешншрила и пиридина пробе 5 Экспериментально подтверждено, что при разработке методик на основе ГХМС-ТФМЭ решающее значение имеет подбор таких параметров как тип микроволокна, температура и время пробоотбора, ионная сила раствора Влия-

22

ние указанных факторов в равной мере проявляется как в случае пробоотбора из равновесного пара (этиловый эфир ФК), так и при погружении микроволокна в пробу и дериватизации аналитов непосредственно на нем парами силили-рующего агента (определение О-алкилметилфосфонатов в воде и моче) По результатам экспериментальных исследований показано, что наиболее эффективным является микроволокно на основе сополимера полидиметилсилоксана -дивинилбензола Найдены корреляционные зависимости между функцией, отражающей влияние стерического эффекта (для неполярных фаз), параметром гидрофобности (для полярных фаз) и коэффициентом извлечения О-АМФК, позволяющие рассчитать эффективность извлечения определенным типом микроволокна химического соединения в пределах исследуемого гомологического ряда по структуре заместителя

6 Установлено, что при алкилировании тиодигликоля необходимо контролировать и исключать возможность образования промежуточных продуктов дериватизации В случае трет-бутилдиметилсилилирования ТДГ получение диэфира с максимальным выходом достигается путем внесения неорганических солей калия и проведения реакции в смеси растворителей ацетонитрил пиридин

7 Предложено использование дейтерированных (й?з) стандартов О-АМФК для подтверждения первичной идентификации в следовом анализе этих соединений независимо от используемого метода подготовки проб

\t

Список муоликации по теме диссерт ации f

1 Koryagma N L , Saveheva EI, Khlebnikova N S , Goncharov N V , Jenkins R О , Radilov A S Determination of fluoracetic acid in water and biological samples by GC-FID and GC-MS in combination with solid-phase microextraction // J Anal Bioanal Chem -2006 -V 386 -No 5 -P 1395-1400

2 Корягина H Л, Савельева E И , Гончаров H В , Хлебникова Н С , Радилов А С Применение метода газовой хроматографии с ионизационно-пламенным и масс-селективным детектированием для определения содержания фторацетата натрия в воде и биомедицинских пробах // Токсикологический вестник - 2007 - №1 - С 29-36

3 Корягина Н J1, Савельева Е И , Радилов А С Сравнение эффективности статического парофазного анализа и твердофазной микроэкстракции при газохроматографи-ческом определении фторацетата натрия в питьевой воде // Сорбционные и хромато-графические процессы - 2007 - Т 7 - Вып 3 - С 420-424

4 Рембовский В Р , Ермолаева Е Е. Савельева Е И, Гончаров Н В , Цибульская Е А , Корягина Н JI, Хлебникова Н С , Цимбал Ф А Токсиколого-гигиеническая оценка опасности отходов бывших предприятий по производству и использованию отравляющих веществ // Российский химический журнал - 2007 - Т LI - №2 - С 77-82

5 Корягина Н Л , Савельева Е И , Радилов А С Определение метаболитов фосфорор-ганических отравляющих веществ в плазме крови // Тезисы докладов на конференцию «Разделение и концентрирование в аналитической химии» г Краснодар 25 -ЗОсентября 2005 г С 406

6 Корягина Н Л , Савельева Е И , Хлебникова Н С , Фельд В Э , Радилов А С Установление факта воздействия зомана на организм по результатам анализа мочи // X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» г Клязьма, Московская область 24 - 28 апреля 2006 г С 291

7 Saveheva ЕI, Koryagma N L , Khlebnikova N S , Feld V E , Radilov A S Establishment of exposure of an organism to soman by chemical analysis of urine // 1Ъе Sixth International Chemical and Biological Medical Treatment Symposium SPIEZ, Швейцария 30 апреля - 5 мая 2006 г С 64

8 Корягина Н Л , Савельева Е И , Хлебникова Н С , Радилов А С Разработка процедур анализа биологических жидкостей и тканей для установления факта воздействия высокотоксичных химических соединений // Science workshops and seminars «Analysis of toxic substances method of development and applications» г Санкт-Петербург (Пушкин) 19-20июня 2006 г С 73-78

9 Корягина Н Л, Савельева Е И, Радилов А С , Хлебникова Н С , Хрусталева В С , Фельд В Э Установление факта воздействия фосфорорганических отравляющих ве-шр^тп ня орГаЧИЗЧ ПО р©3уЛЬТЗТЙМ ЙНЗЛКЗЙ биОЖВДКОСТСЙ методом ГЗЗОВОЙ ХрОМйТО~ графии-масс-спектрометрии в сочетании с твердофазной микроэкстракцией // Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 45-летию ФГУП НИИГ-ПЭЧ ФМБА России г Санкт-Петербург 15-16 февраля 2007 г С 111-112

10 Savel'eva E.I., Koryagma N L , Radilov A S , Khlebnikova N S Development of Procedures for the Analysis of Components of Dumped Chemical Weapons and Their Principal Transformation Products m Sea Water ^ Тезисы 4 Зсеми"ного конгресса по химическому, биологическому и радиологическому терроризму г Дубровник, Хорватия 1619 апреля 2007 г С 15.

12 11 07 г Зак 229-120 РТП Ж «Синтез» Московский пр, 26

1 .Введение

2.0бзор литературы

Газовая Хроматография - Масс-спектрометрия в токсикологических

2.1 .Введение.

2.2.Возможности метода газовой хроматографии-масс- 10 спектрометрии (ГХМС) в аналитической токсикологии.

2.3. Целевые вещества в токсикологических исследованиях.

2.3.1. Фторацетат натрия.

2.3.2.Алкилметилфосфоновые

2.3.3.Тиодигликоль.

2.4.Дериватизация. Характеристика дериватизации как метода. За- 17 дачи дериватизации

2.4.1. Дериватизация фторуксуной кислоты

2.4.2.Дериватизация метилфосфоновой кислоты и ее кислых эфиров.

2.4.3.Дериватизация тиодигликоля.

2.5.Характеристика методов подготовки проб к ГХ анализу. Специ- 30 фические особенности пробоподготовки в токсикологических исследованиях.

2.5.1.Жидкостная экстракция.

2.5.2.Статический парофазный анализ.

2.5.3.Твердофазная экстракция.

2.5.4.Твердофазная микроэкстракция.

Газовая хроматография (ГХ) с масс-спектрометрическим (МС) детектированием (ГХМС), часто называемая «золотым сечением» органического анализа, применяется в качестве базового метода в большинстве лабораторий, специализирующихся в области аналитической токсикологии. Круг органических соединений, анализируемых ГХМС, как известно, ограничен веществами, обладающими достаточной летучестью, либо веществами, образующими летучие производные. Анализ нелетучих органических соединений в виде производных методами ГХ и ГХМС в современной практике можно рассматривать как самостоятельную задачу, существенно более сложную, чем хорошо разработанные классические подходы к дериватизации летучих соединений (жирных кислот, фенолов и др.) в целях улучшения их хроматографических характеристик. Нелетучие органические соединения - высокополярпые и часто полифупкциональпые, должны быть дериватизированы с высоким выходом и образованием единственного типа производных, а пс смеси продуктов. В настоящей работе объектом анализа являлись маркеры токсического воздействия - высокотоксичные соединения и продукты их трансформации (фтор - или фосфорсодержащие кислоты, полиолы) - полярные и термолабильные. Некоторые из них способны давать при алкилировании смесь мопо-и диэфиров. Реакции дериватизации таких соединений особенно чувствительны к мешающему влиянию матричных компонентов. Этим обстоятельством, а также высокой песпеци-фичсской сорбционной активностью и низкими степенями извлечения из гидрофильных матриц органическими растворителями этих соединений обусловлены особые требования, предъявляемые к процедурам, предшествующим дериватизации - выделению из матрицы, концентрированию и очистке фракции целевых веществ. Разработка унифицированных процедур подготовки к ГХМС анализу таких соединений в матрицах различной природы в большинстве случаев проблематична. Рациональным подходом является унификация отдельных стадий анализа.

Актуальность темы. Разработка химико-апалитических методов обнаружения, точной структурной идентификации и количественной оценки высокотоксичпых веществ и продуктов их трансформации в объектах окружающей среды и биологических пробах человека и животных при токсикологических исследованиях является чрезвычайно актуальной задачей. Надёжные химико-аналитические методы выявления факта воздействия токсичных веществ, идентификации действующего фактора воздействия и оценки уровня экспозиции необходимы как компонент медицинских и судебно- медицинских мероприятий в случаях возможного применения высокотоксичпых соединений в условиях военных конфликтов и террористических актов, а также при аварийных ситуациях па предприятиях по храпению и уничтожению химического оружия и других вредных веществ. В соответствии с частью 9 (приложение

46,е-17) «Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления, применения химического оружия и о его уничтожении» расследования случаев несанкционированного применения отравляющих веществ должны в обязательном порядке включать анализ биологических проб человека и животных (кровь, моча, ткани и др.). В то же время Организацией по запрещению химического оружия (ОЗХО) до настоящего времени не разработано документов, обобщающих и регламентирующих подходы к идентификации и анализу токсичных химикатов и продуктов их метаболизма в биосредах. В ряду токсикологически значимых органических соединений велика доля нелетучих веществ. Разработка методик их ГХМС анализа позволила бы решить ряд актуальных задач в области токсикологической экспертизы.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка комплекса методик определения нелетучих высокотоксичных химических соединений и продуктов их превращений в различных средах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-Исследовать особенности и подобрать условия для количественной дериватизации нелетучих органических соединений, выделенных из объектов окружающей среды и биологических проб.

-Подобрать условия твердофазной экстракции (ТФЭ) на стадии пробоподготовки в целях создания приемлемых условий для последующей дериватизации 0-алкилметилфосфонатов (О-АМФК).

-Определить возможности и ограничения метода твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ) как альтернативы парофазному анализу (ПФА) в случае пробоотбора из равновесного пара и альтернативы ТФЭ в режиме пробоотбора при погружении микроволокна в пробу.

-Разработать эффективные процедуры дериватизации нелетучих органических веществ при использовании метода ТФМЭ в вариантах пробоотбора из равновесного пара и при погружении микроволокна в пробу.

-Оцепить возможности создания унифицированных методик для ГХМС анализа нелетучих органических соединений (галоген-, фосфор-, серусодержащих) в матрицах различной природы в рамках методов ТФЭ и ТФМЭ.

Научная новизна

Продемонстрирована возможность разработки унифицированной ГХМС методики определения нелетучих органических соединений при использовании метода ТФМЭ в режиме отбора летучего производного из равновесного пара. Установлено, что применение метода ТФМЭ позволяет снизить предел обнаружения этилового эфира фторуксуспой кислоты не менее чем в 100 раз в сравнении со статическим ПФА.

Найдены корреляционные зависимости между функцией, отражающей влияние сте-рического эффекта (для неполярных фаз), параметром гидрофобпоети (для полярных фаз) и коэффициентом извлечения О-АМФК, позволяющие рассчитать эффективность извлечения определенным типом микроволокна химического соединения в пределах исследуемого гомологического ряда по структуре заместителя.

Проведен систематический анализ особенностей дериватизации нелетучих токсичных соединений и продуктов их деструкции в различных матрицах. Установлено, что деривати-зация тиодигликоля (ТДГ), как продукта распада сернистого иприта, в стандартных условиях (при 65°С в течение 30 мип в ацетонитриле) протекает с низким выходом в результате си-лилирования по одной гидроксильной группе. Увеличение времени реакции относительно стандартных условий и внесение в реакционную смесь пиридина и солей калия предотвращает образование промежуточных продуктов реакции дериватизации.

Идентифицированы 9 компонентов мочи и плазмы крови: З-гидроксимасляпая кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, мочевина, фосфорная кислота, 3-кетовалериановая кислота, 3-гидроксиизовалериановая кислота, пирокатехин, фенилуксусная кислота, пара-крезол, снижающих возможности достоверной идентификации в биожидкостях следовых количеств МФК и О-АМФК, являющихся продуктами метаболизма фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ).

Выбран предпочтительный режим элюирования О-АМФК с патронов с сильным анионообмепником (SAX).

Предложено использование дейтерированпых стандартов О-АМФК для подтверждения первичной идентификации целевых соединений.

Практическая значимость.

Разработана и оптимизирована новая унифицированная высокочувствительная методика определения фторуксусной кислоты и ее натриевой соли (ФАН) в воде, биологических пробах (моче, плазме крови, гомогенатах тканей), а также в водных вытяжках различных объектов, основанная на этилировании фторуксусной кислоты, ТФМЭ этилфторацетата и последующем ГХ или ГХМС анализе. Методика апробирована в опытах in vivo на лабораторных животных и позволила исследовать токсикокипстику и токсикодинамику отравлений ФАН, установить органы-мишепи, в первую очередь кумулирующие этот яд. Методика была использована при разработке средств эффективной терапии отравлений ФАН, выборе оптимального средства терапии (в настоящее время являющегося объектом патентования) и описании механизмов его действия.

Разработана процедура для отбраковки и направления па повторный анализ проб, в которых степень извлечения целевых веществ ниже установленного порогового значения.

Разработан и опробован па практике высокочувствительный способ определения ТДГ в морской воде (предел обнаружения 1 мкг/л). Методика обнаружения ТДГ в морской воде прошла государственную метрологическую экспертизу и была использована при выполнении работ по корректировке трассы Северо - Европейского газопровода Нордстрим по дну Балтийского моря.

Разработаны и опубликованы методические указания «Химико-аналитический и сани-тарно-химический контроль основных продуктов распада ФОВ» (МУК 4.1-04).

Разработаны и находятся па стадии утверждения методические указания по установлению факта воздействия ФОВ на организм человека и животных по результатам анализа биосред.

Методики идентификации высокотоксичпых веществ и продуктов их превращений в биологическом материале рекомендованы Федеральным медико-биологическим агентством (ФМБА России) для применения в токсикологических центрах, находящихся под эгидой ФМБА, при проведении медицинских и судебно-медицинских мероприятий по выявлению факта воздействия отравляющих, токсичных веществ в потенциальных объектах токсикологической экспертизы (вода, почва, биологические пробы).

Методики определения продуктов распада ФОВ методом ГХМС в почве (МВИ № 242/1и воде (МВИ № 242/11-04) прошли метрологическую аттестацию и внесены в Госреестр методик Российской Федерации, рекомендуемых к применению для сапитарно-химического сопровождения программы уничтожения химического оружия (УХО) в России. В настоящее время МВИ № 242/12-04 используется в целях экологического мониторинга са-нитарпо-защитной зоны объектов УХО (Марадыковский, Щучье).

На защиту выносятся:

1. Особенности применения метода ТФМЭ в ГХМС анализе нелетучих органических соединений в токсикологических исследованиях в целях повышения чувствительности, преодоления матричных эффектов и обеспечения более эффективного использования хромато-графической и масс-спектрометрической систем.

2. Особенности дериватизации нелетучих органических соединений - маркеров токсического воздействия, в различных матрицах.

3. Результаты исследования зависимости степени извлечения О-АМФК при проведении ТФЭ от природы элюента.

4. Способы унификации методик в зависимости от характера матрицы, условий про-боотбора и пробоподготовки.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены па конференции «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (25-30 сентября 2005 г, г. Краснодар), на I съезде физиологов СНГ«Физиология и здоровье человека» (19-23 сентября, г. Сочи), Annual Meeting of the American Institute of Chemical Engineers (30 октября - 04 ноября, 2005., г.Ципцинпати, США), PITTCON (12-17 марта 2006г., Орландо, Флорида, США), Х-ой Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбция и хроматография» (24-28 апреля 2006 г., г. Клязьма, Московской обл.), 9th Internatonal Chemical Weapons Demilitarisation Conferenc, CWD 2006, (15 - 18 мая 2006 г., Люнебург, Германия), The Sixth International Chemical and Biological Medical Treatment Symposium (30 апреля-5 мая 2006, SPIEZ, Швейцария), Science workshops and seminars «Analysis of toxic substances: method of development and applications» (19-20июпя 2006 г., С-Петербург (Пушкин)), 3-ей Международной научно-практической конференции «Новые технологии создания инновационных лекарств. От достижений «постгеномной эры» к национальным фармацевтическим брендам» (1 декабря 2006г, Московская обл, г.о. Химки, Центр высоких технологий «ХИМРАР»), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию ФГУП НИИГПЭЧ ФМБА России (15-16 февраля 2007 г., Санкт-Петербург), Международном семинаре по декоптаминации «Очистка зданий и сооружений, загрязненных в результате химического терроризма» (11-13 сентября 2006 г. Москва), 4-м Всемирном конгрессе по химическому, биологическому и радиологическому терроризму (15-19 апреля 2007 г., Дубровник, Хорватия), Международном конгрессе по управлению отходами ВэйсгТэк (31 мая - 3 июня 2007 г., г. Москва), Международном семинаре МНТЦ «Предупреждение и устранение последствий химически опасных чрезвычайных ситуаций, обусловленных терроризмом и промышленными авариями» (18-20 сентября 2007 г., г. Санкт-Петербург), И-ой Всероссийской конференции «Аналитика России» (7-12 октября 2007 г., г. Краснодар).

Публикации. По материалам исследований опубликована 32 научных работы в виде статей, тезисов докладов, методик и методических указаний.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

5. ВЫВОДЫ

1. Показано, что в случае, когда возможна дериватизация нелетучего аналита непосредственно в пробе, а отбор летучего производного производится из равновесного пара (например, этилового эфира ФК) характер матрицы малосущественен, и унификации поддаются все стадии анализа. В остальных случаях унификации подлежат отдельные факторы (режим ГХМС анализа, дериватизации и др.).

2. Изучены варианты дериватизации МФК и О-АМФК различными реагентами; показано, что для дериватизации МФК и О-АМФК предпочтительным является трет-бутилдиметилсилилировапие. Проведен выбор режима силилирования О-АМФК с учетом биогенных компонентов плазмы крови и мочи. Установлено, что определению О-АМФК в плазме крови мешают 2-гидроксимасляная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, мочевина, фосфорная кислота, 3-кетовалериаповая кислота. Установлено также, что определению О-изопропил МФК в моче человека практически не мешают компоненты матрицы, определению МФК мешают «ара-крезол и 3-гидроксимасляпая кислота, определению О-изобутил МФК мешает 3-гидроксиизовалериановая кислота и бутапдиол мопоацетат (идентифицирован предположительно), определению О-пинаколил МФК - пирокатехин и фепилуксусная кислота.

3. Для элюирования О-АМФК с патрона с сильным анионообменником из всех испробованных подходов наилучшие результаты были получены с использованием в качестве элюента смеси 3% метапольного раствора N113 и 25% водного раствора Ь1Нз в соотношении 9:1. Разработанная процедура анализа О-АМФК была положена в основу методики определения продуктов распада фосфорорганических отравляющих веществ в почве.

4. Показано, что маркеры воздействия на организм фосфорорганических отравляющих веществ (О-алкилметилфосфонаты) и сернистого иприта (тиодигликоль) методом ГХМС в режиме ионизации электронным ударом эффективно определяются в виде трет-бутилдиметилсилиловых эфиров. Однако для О-алкилметилфосфонатов предпочтительным является /ире/и-бутилдиметилсилилировапие парами дериватизирующего агента на микрово-локие, а для тиодигликоля - дериватизация в упаренной досуха и перерастворенной в смеси ацетонитрила и пиридина пробе.

5. Экспериментально подтверждено, что при разработке методик па основе ГХМС-ТФМЭ решающее значение имеет подбор таких параметров как тип микроволокпа, температура и время пробоотбора, ионная сила раствора. Влияние указанных факторов в равной мере проявляется как в случае пробоотбора из равновесного пара (этиловый эфир ФК), так и при погружении микроволокна в пробу и дериватизации апалитов непосредственно на нем парами силилирующего агента (определение О-алкилметилфосфонатов в воде и моче). По результатам экспериментальных исследований показано, что наиболее эффективным является микроволокно на основе сополимера полидиметилсилоксана - дивинилбепзола. Найдены корреляционные зависимости между функцией, отражающей влияние стерического эффекта (для неполярных фаз), параметром гидрофобности (для полярных фаз) и коэффициентом извлечения О-АМФК, позволяющие рассчитать эффективность извлечения определенным типом микроволокна химического соединения в пределах исследуемого гомологического ряда по структуре заместителя.

6. Установлено, что при алкилировапии тиодигликоля необходимо контролировать и исключать возможность образования промежуточных продуктов дериватизации. В случае я7/>ет-бутилдиметилсилилирования ТДГ получение диэфира е максимальным выходом достигается путем внесения неорганических солей калия и проведения реакции в смеси растворителей ацетоиитрил : пиридин.

7. Предложено использование дейтерированных (с13) стандартов О-АМФК для подтверждения первичной идентификации в следовом анализе этих соединений.

6.УСЛ0ВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ГХ-МС Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией

ГХ-МС-ЭУ Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией с ионизацией электронным ударом

ВЭЖХ-МС Высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией

ВЭЖХ-МС-МС Высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандем-масс-спектрометрией

ГХ-МС-МС Газовая хроматография в сочетании с тандем-масс-спектрометрией

ЭИ Ионизация электронным ударом

ХИ Химическая ионизация

СИД Селективное ионное детектирование

ПИТ Регистрация по полному ионному току

ДМФА Диметилформамид

ТБФ Трибутилфосфат мФБК Метафторбензойная кислота

ИК Инфракрасная спектрометрия

КЭФ Капиллярный электрофорез

ЛД5о Среднесмертельная доза г ЛД5о Половина среднесмертельной дозы

МФК Метилфосфоновая кислота

О-АМФК Алкилметилфосфонаты, алкилметилфосфоновые кислоты

ФАН Фторацетат натрия

ФК Фторуксусная кислота

ТДГ Тиодигликоль (бис-2-гидроксиэтилсульфид)

Зоман О-пинаколилметилфторфосфонат

Зарин О-изопропилметилфторфосфонат

RVX 0-изобутил-8-(2-диэтиламиноэтил)метилтиофосфонат

Иприт 2,2'-дихлордиэтилсульфид

03X0 Организация по запрещению химического оружия

УХО Уничтожение химического оружия

ФОВ Фосфорорганические отравляющие вещества

ОВ Отравляющие вещества

ХО Химическое оружие

SAX Сильный анионобменник

DOWEX Катионообменник

БСТФА N, 0-бис(триметилсилил)трифторацетамид

БСА N, 0-бис(триметилсилил)ацетамид

МТБСТФА Л^-метил-Л^/ире/и-бутилдиметилсилилитрифторацетамид

PFBBr Пентафторбензоилбромид

ТМС Триметилсилиловый эфир

ТБДМС Трет-бутилдиметилсилиловый эфир

ТФЭ Твердофазная экстракция

ТФМЭ Твердофазная микроэкстракция

ЖЖЭ Жидкость-жидкостная экстракция

ЖЭ Жидкостная экстракция

ПФА Парофазный анализ

Трилон Б Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

2.6. Заключение

Задачи химико-аналитического контроля в рамках судебно-медицинских экспертиз относятся к задачам наивысшей категории сложности, которые кратко можно сформулировать как необходимость структурной идентификации заранее непредсказуемых веществ в составе сложных (иногда неизвестных) матриц в отсутствие образцов сравнения и справочных данных.

Не менее важной задачей является разработка методов анализа биопроб на содержание высокотоксичных соединений и продуктов их превращения в организме. Ретроспективное выявление экспозиции высокотоксичными веществами позволяет надежно установить сам факт воздействия па организм того или иного вещества, оценить его дозу и выбрать схему лечения. Для различных ядов эти схемы также будут различными. Ретроспективный анализ биопроб при его обязательном сочетании с ретроспективным анализом «пебиологиче-ских» объектов должен также проводиться в составе мероприятий по выявлению случаев нарушения Конвенции по запрещению химического оружия. Техническим секретариатом ОЗХО пока не предложены «рекомендуемые рабочие процедуры» (recommended operating procedures) для анализа биопроб, поскольку даже в рамках мирового сообщества пока не па-коплен необходимый экспериментальный материал по этой проблеме. Процедуры анализа биопроб для работы в соответствии с целями и задачами Конвенции должны еще быть разработаны, прежде чем их можно будет применять на практике.

Очень важно отметить, что, несмотря на стремительное развитие жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза, ГХМС остается базовым методом анализа ТХ и их метаболитов пе только в объектах окружающей среды, по и в биологических средах. Основной причиной этого следует считать тот факт, что па сегодняшний день только в рамках метода ГХМС существуют обширные компьютерные базы данных по справочным МС и ГХ характеристикам и алгоритмы обращения к ним. Это обстоятельство дает возможность проводить идентификацию неизвестных соединений при полном или частичном отсутствии априорной информации. Дериватизация нелетучих апалитов пе только делает их пригодными для ГХМС анализа, но предоставляет важную информацию о присутствии тех или иных функциональных групп в молекулах идентифицируемых соединений.

При подготовке к ГХМС анализу в настоящее время отдается предпочтение микрометодам подготовки проб, позволяющим избежать применения органических растворителей, которые не только вносят дополнительные артефакты в пробу за счет имеющихся в их составе примесей, по и сами экологически небезопасны. Одним из таких методов является метод ТФМЭ, находящий все более широкое применение в зарубежной химико-апалитической практике, но пока мало известный в отечественных лабораториях. Метод ТФМЭ существенно расширяет возможности ГХМС в части чувствительности и селективности анализа, а также ввиду уникальных возможностей по преодолению матричного эффекта позволяет разрабатывать универсальные процедуры анализа токсичных соединений в воде, напитках, пищевых продуктах, объектах окружающей среды и биологических пробах (плазма крови, моча, гомогенаты органов и тканей). Последнее очень важно для практической деятельности судебно-медицинских и криминалистических лабораторий.

РОССИЙСКАЯ t ГОСУДАРСТВЕННА«! БИБЛИОТЕКА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1.Оборудование

Работа выполнена с использованием хромато-масс-спектрометрических приборных комплексов GCMS 5000 Shimadzu (прибор исследовательского класса) и QP 2010 Shimadzu (прибор высокого класса) (Япония), включающих газовый хроматограф, многофункциональный масс-спектрометр с квадрупольно-октапольным детектором и систему обработки данных GCMS Solution. Приборы оборудованы инжектором для ввода проб с делением/без деления потока. Часть работы выполнена на газовом хроматографе IIP 5890 (Hewlett Packard) с ионизациопно-пламеппым детектором.

Установка для твердофазной микроэкстракции (Supelco код по каталогу № 57333

U).

Центрифуга ОС-6М. Пробирки стеклянные центрифужные вместимостью 25 мл с круглым или коническим дном в комплекте (ТУ 5.375-4263-80) Центрифуга «Eppendorf» (США) Вакуумный концентратор фирмы Labconco (США)

Нагревательное устройство "Multi-blok heater" (Supelco, код по каталогу 33318-U) Установка ультразвуковая «Серьга» УЗМ 001 (ТУ СУР 3.836.007).

3.2.Материалы 3.2.1 .Хроматографические материалы Для разделения летучих производных использовали капиллярную кварцевую колонку IIP-5MS(Supelco) 25мх0,2ммх0,33мкм с привитой неподвижной фазой (5% фенил 95% диме-тилполисилоксаи) (Supelco, код по каталогу 24166) и НР-5 (Supelco) 25мх0,2мм><0,33мкм.

Для ТФЭ применяли картриджи Supelclen LC-Sax (Змл/500мг) (Supelco код по каталогу 57017), BOND ELUT (Varian 9100/9010/9050), DOWEX 50WX8-100 (ACROS Lot: A0174472201), ENVI-18, 3ml tubes (Supelko код по каталогу 57063)

Для ТФМЭ использовали микроволокна Carboxen/PDMS 75 цт (Supelco # 57344-U), Polyacrylate Coating 85um (Supelco # 57304-ü), Carboxen/PDMS StableFlex 85 цт (Supelco # 57334-U).

3.2.2.Химические материалы Ацетопитрил «о.с.ч.», метилен хлористый «о.с.ч.», толуол «о.с.ч» («Криохром», С-Петербург).

Этанол (ГОСТ Р 51652-2000). Аммиак водный, 25% ч.д.а. (ГОСТ 3760).

3% раствор аммиака в метаноле (код 34,142-8 по каталогу фирмы Aldrich). Фтористоводородная кислота концентрированная «ч» (ТУ 6-09-2622-77)

Фторид натрия ч.д.а. (ГОСТ 4463-76)

Гидроксид натрия, ч.д.а. (ГОСТ 4328).

Серная кислота, о.с.ч, (ГОСТ 4204-77).

Фторацетат натрия синтезировали по стандартной процедуре в НИИ гигиены, проф-патологии и экологии человека. Содержание основного вещества, по данным ХМС, не менее 98 %.

Метилфосфоиовая кислота (Aldrich, код по каталогу 28,986-8).

О-этил МФК, О-изопропил МФК, О-пинаколил МФК и О-изобутил МФК синтезированы НИИ химии Санкт-Петербургского Госуниверситета:

Меченые d3 О-этил МФК, О-изопропил МФК, О-пинаколил МФК и О-изобутил МФК синтезированы НИИ химии СПб госуниверситета.

Бис(2-гидроксиэтил)сульфид (ТДГ) (Aldrich, Cat №16,678-2).

Трибутилфосфат, 98 % (Aldrich, код по каталогу 15,861-5).

ЧО-бис(триметилсилил)трифторацетамид (Supelco, код по каталогу 33035-U).

А^/ирет-бутил-диметилсилил-Л^-метил-трифторацетамид + 1 % трет-бутилдиметилхлорсилана (Fluka Wa 10814).

Лг,0-бис(триметилсилил)ацетамид (Supelco, код по каталогу 33037-U). jV-нитрозодиметилмочевина (Синтезирована НИИ химии СПб госуниверситета).

Гидроокись триметиланилиния (SERVA 37060).

Йодистый метил (MERK 806064).

3.3.Объекты исследования 3.3.1.Объекты исследования при определении фторацетата натрия Экологические объекты

В качестве объектов исследования использовались вода, в которую вносили ФАН непосредственно перед анализом.

Биомедицинские объекты

Постановка опытов с биопробами, содержащими добавки ФАН.

В качестве биологических проб использовали бланковые пробы плазмы крови и мочи, содержащие добавки ФАН.

В 1 мл бланковой пробы плазмы (мочи) вносили определенное количество водного раствора ФАН известной концентрации. Пробу обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин.

Постановка опытов in vivo

В качестве биологических проб использовали пробы, полученные после интоксикации животных (белых крыс Wistar) ФАН в дозе 0,8 мг/кг О/2ЛД50) и 2 мг/кг (ЛД50). Режим введения ФАН - пероральный. В работе были исследованы следующие биологические пробы: плазма крови, гомогенаты органов: мозга, печени, почек, сердца, моча. Плазму крови получали по стандартным процедурам с использованием гепарина в качестве антикоагулянта. Гомогенаты органов готовили растиранием навески биологического материала с равным по массе количеством воды в жидком азоте и хранили до начала анализа в замороженном виде пе более 7 суток. В ходе эксперимента были также проанализированы контрольные пробы, отобранные от животных, пе получавших ФАН. Мочу отбирали у затравленных животных через 6, 24 и 48, 72 и 120 часов после интоксикации.

Вскрытие животных и взятие образцов крови и тканей производились после декапитации.

3.3.2.Объекты исследования при определении метилфосфоновой кислоты и ее кислых эфиров Экологические объекты В качестве экологического объекта исследования использовали почву, отобранную в экологически чистой лесной зоне, в которую перед анализом вносили добавки О-АМФК, а также образцы почвы, отобранные в санитарпо-защитных зонах объектов УХО.

Биомедицинские объекты В качестве биологических объектов использовали плазму крови и мочу с внесенными О-АМФК; плазму крови человека и животных (белых крыс), полученную после экспозиции ФОВ (in vitro)', плазму крови и мочи, полученные в опытах на лабораторных животных (in vivo).

Постановка опытов in vitro Для опытов in vitro кровь отбирали путем декапитации крыс или из локтевой вены добровольцев, используя пробирки, смоченные насыщенным водным раствором Трилона Б. После отбора крови к 0,9 мл крови добавляли 0,1 мл раствора, содержащего ФОВ в физиологическом растворе ФОВ, перемешивали несколько раз, выдерживали 15 (или 30 минут) при 37° С, затем центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g. Отбирали плазму в специальные пробирки и замораживали.

Постановка опытов in vivo В опытах in vivo белым крысам внутримышечно вводили растворы ФОВ в дозе '/г ЛД50 (0,075 мг/кг - зарина, 0,045 мг/кг - зомана, 0,0144 мг/кг - RVX) приготовленные путем разведения ФОВ в физиологическом растворе. После введения ОВ через определенное время крысу декапитировали, отбирали кровь, центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g. Плазму отбирали в специальные пробирки и замораживали.

Мочу отбирали у затравленных животных через 6, 24 и 48 часов после интоксикации.

З.З.З.Объекты исследования при определении ТДГ Экологические объекты

В качестве объекта исследования на стадии разработки метода применялась морская вода с внесенным ТДГ. Разработанная методика была опробована при анализе глубинных проб морской воды Балтийского моря, отобранных в местах дислокации затопленного химического оружия во время второй мировой войны.

3.4. Методики исследования 3.4.1. Процедуры обнаружения ФАН в различных матрицах Определение ФАН в воде

В хроматографическую виалу для ПФА вместимостью 10 мл (4 мл для ТФМЭ) вносили 1 мл водопроводной воды, упаривали досуха при 60 "С.

Условия проведения дериватизации и отбора пробы при ГХ-ДИП- ПФА.

К сухому остатку добавляли 30 мкл концентрированной серной кислоты и 70 мкл раствора толуола в этаноле с концентрацией 200 мкг/мл в качестве внутреннего стандарта. Виалу с реакционной смесью герметично укупоривали, обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут, выдерживали 30 минут в нагревательном устройстве при 60°С и отбирали 1 мл равновесной паровой фазы для ГХ анализа. Газовую пробу объемом 1 см3 вводили с делением потока 1:30.

Условия проведения дериватизации и отбора пробы при ГХ-ДИП- ТФМЭ.

К сухому остатку добавляли 30 мкл концентрированной серной кислоты и 70 мкл раствора толуола в этаноле с концентрацией 2 мкг/мл. Реакционную смесь выдерживали при температуре 60°С при постоянном перемешивании в герметично укупоренной нале в течение 15 мин., после чего через пробку виалы в газовую фазу над реакционной смесью вводили микроволокно СагЬохеп/РОМБ 81аЬ1еПех 85 иш и выдерживали в течение Юмин.

Термодесорбцию аналитов проводили в испарителе газового хроматографа. Ввод пробы без деления потока, время задержки сброса 0,3 мин.

Условия ГХ анализа

ГХ анализ проводили в изотермическом режиме. Температура колонки 50°С, инжектора и детектора - 200°С. Калибровочные определения проводили путем внесения известных количеств ФАН в водопроводную воду. Обработку проб проводили по методу внутреннего стандарта.

Определение ФАН в биомедицинских пробах

Подготовка проб плазмы крови.

К 1 мл плазмы крови добавляли 3 мл ацетонитрила, тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин. при 12000 g. Надосадочную жидкость переносили в хроматографиче-скую виалу объемом 4 мл. Белковый осадок взбалтывали с 1 мл смеси ацетонитрил:вода (3:1) и центрифугировали в том же режиме. Объединенную надосадочную жидкость упаривали досуха.

Подготовка проб гомогенатов органов.

К гомогенатам органов после размораживания добавляли ацетопитрил в количестве 4 мл на 1 г навески органа, взятой на анализ, и центрифугировали 15 мин при 7000 об/мин, надосадочную жидкость сливали в хроматографическую виалу для парофазного анализа, а к осадку добавляли (2x1мл) водно-ацетонитрильпой смеси (3:1) и центрифугировали в том же режиме. Объединенную надосадочную жидкость упаривали досуха.

Подготовка пробы мочи

Аликвоту мочи (1мл) упаривали досуха в хроматографической виале для анализа ТФМЭ, объемом 4 мл.

Дериватизация.

Этилирование ФК в сухом остатке этиловым спиртом в присутствии серной кислоты и определение этилового эфира ФК в равновесной паровой фазе методом ТФМЭ при анализе воды, гомогенатов органов и плазмы крови производили в идентичных условиях: к сухому остатку добавляли 30 мкл концентрированной серной кислоты и 70 мкл этилового спирта, содержащего четыреххлористый углерод и толуол в диапазоне концентраций 2-20 мкг/мл в качестве внутренних стандартов. Далее процедура аналогична определению ФАН в воде.

ГХМС анализ производили с использованием двух внутренних стандартов (толуол, четыреххлористый углерод). Анализ проводили в режиме программирования температуры: от 40°С (1 мин.) со скоростью 5° /мин. до 200°С. Съемку масс-хроматограмм проводили в режиме электронного удара с регистрацией избранных ионов (см. табл. З.1.). Условия ГХМС анализа: температура инжектора и детектора 280НС, ввод пробы без деления потока, время задержки сброса (БрНИезэ) - 0.3 мин.

1. Витенберг А.Г. Статический парофазный анализ. Физико-химические основы и области применения. Рос.хим.журнал, t.XLVII, №1,2003.с.7-23

2. Денисов Е.Т. Кинетика гомогенных химических реакций. Москва, Высшая школа. -1988. -С. 180-184.

3. Другов Ю.С., Родин A.A. Мониторинг приоритетных органических загрязнителей природной среды. Практическое руководство. С-Петербург, Анатолия, 2003.

4. Другов Ю.С., Родип A.A. Пробоподготовка в экологическом анализе. С-Петербург, Анатолия, 2002.С 283.

5. Ермолаева Е.Е., Радилов A.C., Нагорный C.B., Рембовекий В.Р., Савельева Е.И., Гончаров Н.В., Цибульская Е.А., Тидген В.П., Хлебникова Н.С., Меньшиков Н.М., Глашкина Л.М.,

6. Иванов В.А., Горшков В.И., 70 лет производства ионообменных смол, Сорбционные и хро-матографические процессы.2006.т.6.Вып.1, с.5-31

7. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хромато-масс-спектрометрию, М.: Мир. 1993. Байерман К., Определение следовых количеств органических веществ М.: Мир, 1987.

8. Руденко Б.А., Руденко Г.И., Высокоэффективные хроматографические процессы, Москва, Наука.2003. с.100-125

9. Савельева Е.И., Корягина H.JI., Хлебникова Н.С., Пшеничная Г.В. Методика выполнения измерений массовой концентрации продуктов распада фосфорорганических отравляющих веществ в почве хромато-масс-спектрометрическим методом. // № 242/12-04.2004г.

10. Шаталов И.Ф., Воронин А.В., Пурыгин П.Н. Химико-токсикологический анализ «летучих» и «лекарственных» ядов. // Уч.пособие. Самара: ООО «Содружество Плюс»: ГОУВПО «Сам-ГМУ». 2004.

11. Эммануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. Москва, Высшая школа. -1984. С180-182.

12. AllenderW.J. Determination of sodium fluoroacetate (Compound 1080) in biological tissues // J. Anal. Toxicol. 1990. - V.14. - P. 45 - 49.

13. Amijee M., Cheung J., Wells R.J. Direct on-column derivatisation in gas chromatography II. Comparison of various on-column methylation reagents and the development of a new selective methy-lation reagent. // J.Chromatogr. A 1996. - V.738. - P.43-55.

14. Anderson, S. Liquid-phase microextraction combined with capillary electrophoresis, a promising tool for the determination of chiral drugs in biological matrices . // J.Chromatogr.A 2002. -V.963.-P.303-312.

15. Arellano M., Malet-Martino M., Martino R., Gires P. The anti-cancer drug 5-fluorouracil is metabolized by the isolated perfused rat liver and in rats into highly toxic fluoroacetate // Br. J. Cancer. -1998.-V. 77. P.79 - 86.

16. Arthur, C.L.; Pawliszyn, J. Solid phase mieroextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers. // J.Anal. Chem. 1990. - V.62. - P.2145-2148.

17. Baltussen, E., Cramers, C.A. Stir bar sorptive extraction (SBSE), a novel extraction technique for aqueous samples: theory and principles. // J.Microcol.Sep. 1999. - V.l 1. - P.737-747.

18. Baltussen,E.; Cramers, C.A. Sorptive sample preparation a review. // Anal.Bioanal.Chem. - 2002. -V.373.-P.3-22

19. Beck N.V., Carrick W.A., Cooper D.B., Muir B. Extraction of thiodiglycol from soil using pressurised liquid extraction. // J.Chromatogr. A 2001. -V.907. - P.221-227.

20. Black R.M., Holden I., Reid M., in: Proceedings of the Seventh International Symposium on Protection Against Chemical and Biological Warfare Agents, Stockholm, June, 2001.

21. Black R.M., Morton I., Riches J. (manuscript in preparation).

22. Black R.M., Muir R.W. Derivatisation reactions in the chromatographic analysis of chemical warfare agents and their degradation products. // J. Chromatogr. A 2003. - V.l000 - P.253-281.

23. Blau K., Halket J. (Eds.), Handbook of Derivatives for Chromatography, Wiley, Chichester, 1993

24. Braverman Y. Experiments on direct and secondary poisoning by fluoroacetamide (1081) in wildlife and domestic carnivores // J. Wildl. Dis. 1979. - V. 15. - No. 2. - P.319 - 325.

25. Campins-Falko P., Herraez-Hernandez R., Sevillano-Cabeza A., Trumpler I. Derivatization of amines in solid-phase extraction supports with 9-fluorenylmethyl chloroformate for liquid chromatography. // Ana.Chim. Acta. 1997,-V.344. -P.125-136.

26. Capacio B.R., Smith J.R., DeLion M.T., Dana R. Monitoring sulfur mustard exposure by gas chro-matography-mass spectrometry analysis of thiodiglycol cleaved from blood proteins. // J. Anal. Toxicol. 2004 - V.28 - P.

27. Chen X.H., Wijsbeek J. A Single-Column Procedure on Bond Elut Certify for Systematic Toxico-logical Analysis of Drugs in Plasma and Urine. // J.Forensic Sci. 1992. - V.37. - P.61-71

28. Creasy W.R., Rodriguez A.A., Stuff J.R., Warren R.W. Atomic emission detection for the quantitation of trimethylsilyl derivatives of chemical-warfare-agent related compounds in environmental samples. // J.Chromatogr. A 1995. - V.709. - P.333-344.

29. Crenshaw M.D., Cummings D.B., in: Proc. ERDEC Sci. Conf. Chem. Biol. Def. Res. 1998, 1999. p.715.

30. Cummins M.D., Wells R.J. Gas chromatographic determination of organic acids from fruit juices by combined resin mediated methylation and extraction in supercritical carbon dioxide. // J. Croma-togr. B 1997. - V. 785. - P.251-261.

31. D Agostino P.A., Provost L.R. Determination of chemical warfare agents, their hydrolysis products and related compounds in soil. //J.Chromatogr. A 1992. - V.589 - P.287-294.

32. Degel F. Comparison of new solid-phase extraction methods for chromatographic identification of drugs in clinical toxicological analysis. // Clin.Biochem. 1996. - V.29. - P. 529-540.

33. Demarchi A.C.C.O, Menezes M.L.,Mercadante A, Vassillief I. Determination of sodium mon-ofluoroacetate in serum by gas chromatography // Chromatographia 2001. - V. 54,- P.402-404.

34. Desmoulin F., Gilard V., Malet-Martino M., Martino R. Metabolism of capecitabine, an oral fluorouracil prodrug: (19)F NMR studies in animal models and human urine // Drug Metab Dispos. -2002,- V. 30.- No. 11.- P.1221-1229.

35. Drasch G., Kretschmer E., Kauret G.and L. von Meyer. Concentrations of mustard gas bis(2-chloroethyl)sulfide. in the tissues of a victim of vesicant exposure. // J. Forensic Science. 1987. -P.1788-1793.

36. Driskell W.J., Shih M., Needham L.L., Barr D.B. Quantitation of Organophosphorus Nerve Agent Metabolites in Human Urine Using Isotope Dilution Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. // J.Anal. Toxicol. 2002. - V.26. - P.6-10.

37. Driskell W.J., Shih M., Needham L.L., Barr D.B. Quantitation of organophosphorus nerve agent metabolites in human urine using isotope dilution gas chromatography-tandem mass spectrometry. // J. Anal. Toxicol. 2002 - V.26 - P.6-10.

38. Dubey D.K., Pardasani D., Gupta A.K. Hollow fiber-mediated liquid-phase microextraction of chemical warfare agents from water. // J.Chromatogr.A 2006. - V.l 107 - P.29-35.

39. Eisert, R.; Pawliszyn, J. Automated In-Tube Solid-Phase Mieroextraetion Coupled to HighPerformance Liquid Chromatography. // J.Anal.Chem. 1997 - V.69. - P.3140-3147.

40. Engvist J., Rautio M. (Eds.) B.2 Identification of Degradation Products of Potetial Organophospho-rus Warfare Agents. An Approach for the Standartisation of Techniques and Referens Data. The Ministry for Foreign Affairs of Finland, Helsinki, 1980.

41. Enggvist J., Rautio M. (Eds), Trace Analysis of Chemical Warfare Agents. 1. An Approach to the Environmental Monitoring of Nerve Agents, The Ministry for Foreign Affairs of Finland, Helsinki,1981.

42. Franke J.P., de Zeeuw R.A. Solid-phase extraction procedures in systematic toxicological analysis. // J.Chromatogr.B 1998. - V.713. - P.51-59.

43. Gershon H., Renwick J.A.A. Gas chromatography of fluorinated fatty acids : II. Separation and identification of the methyl esters of 2-fluorofatty acids to 18 carbons // J. Chromatogr. 1967. - V. 28. - P.399^103.

44. Ho T.S.; Halvorsen, T.G. Liquid-phase microextraction of hydrophilic drugs by carrier-mediated transport. // J.Chromatograph.A 2003. - V. 998. - P.61-72.

45. Huzek P. Chloroformâtes in gas chromatography as general purpose derivatizing agents. // J. Cro-matogr. B 1998. - V.717. - P.57.-91.

46. Kataoka H. Recent Advances in Solid-Phase Microextraction and Related Techniques for Phama-ceutical and Biomedical Analysis. -Current Pharmaceutical Analysis. -2005. -V.l -P.65-84.

47. Kostiainen R., Bruins A.P., Hakkinen V.M.A. Identification of degradation products of some chemical warfare agents by capillary electrophoresis—ionspray mass spectrometry. // J. Chroma-togr. 1993.-V.634-P.113-118.

48. Mercier J.-P., Ph. Morin, M. Dreux, Chimia 53 (1999) 511.

49. McDonald P.D., Bouvier E.S.P. Solid Phase Extraction Applications guide and Bibliography, A Resource for Sample Preparation Methods Development.,Waters, Milford, MA, 1995.

50. Minero C., Vincenti M., Lago S., Pelizzetti E. Determination of Ethylene Glycol in Aqueous Matrix by Direct Derivatization with Hexyl Chloroformate. Ann. Chim. 1993 - V.83 - P.511-520.

51. Minero C., Vincenti M., Lago S. Pelizzetti E. Determination of trace amounts of hightly hydrophilic compounds in water by direct derivatization and gas chromatography-mass spectrometry. // Fresen-ius, J.Anal.Chem. 1994. - V.350. - P.403.

52. Minnaar P.P. et al. A high-performance liquid chromatographic method for the determination of monofluoroacetate // J. Chromatogr. Sci. 2000. - V. 38. - P.36-20.

53. Mori M., Nakajima H., Seto Y. Determination of fluoroacetate in aqueous samples by headspace gas chromatography // J. Chromatogr.A 1996. - V. 736. - P. 229-234.

54. Mullen, W.M.; J.Pawliszyn. Direct Determination of Benzodiazepines in Biological Fluids by Restricted-Access Solid-Phase Microextraction. // J.Anal. Chem. 2002. -V.74. - P. 1081-1087.

55. Munro N. Environmental Health Perspectives //1999. V.107. - №12.

56. Noort D., Benshop H., Black R. Biomonitoring of Exposure to Chemical Warfare Agents: A Review. // Arch.Toxicol. 2002. - V.184. - P. 116-126.

57. Noort D., Benschop H.P., Black R.M. Biomonitoring of Exposure to Chemical Warfare Agents: A Review. // Toxicology and Aplied Pharmacology 2002. - V.184. - P. 116-126

58. Ohie T. et al.Gas Chromatography-mass-spectrometry with tert-butyldimethylsilyl derivatisation: use of the simplitied sample preparation and the automated data system to screen for organic acidemias. J. Chrom. AB. - 2000. -V.746 -P.63-73.

59. Ohsawa I., Kanamori-Kataoka M., Tsuge K., Seto Y.Determination of thiodiglycol, a mustard gas hydrolysis product by gas chromatography-mass spectrometry after tert-butyldimethylsilylation // J. of Chromatogr.A 2004. - V. 1061. - P.235-241.

60. Okuno I., Meeker D.L. Gas-liquid chromatographic determination of sodium fluoroacetate (Compound 1080) // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1980,- V. 63. - P.49-55.

61. Okuno I., Meeker D.L., Felton R.R. Modified gas-liquid chromatographic, method for determination of compound 1080. Hi. Assoc. Off. Anal. Chem. 1982. - V.65. - P.l 102-1105.

62. Opstad A.M., Tornes J. A. Identification and quantification bygc-ms of sulphur mustard and related compounds after long timestorage in sea water ffi/rapport-2002/03237.

63. Ozawa H., Tsukioka T. Gas chromatographic determination of sodium monofluoroacetate // Anal.Chem. 1987. - V. 59. - P.2914-2917.

64. Pawliszyn J. Solid Phase Microextraction:Theory and Practice.Wiley-VCH. New York.USA.1997.

65. Peterson J.E. A gas chromatographic method for sodium fluoroacetate (compound 1080) in biological materials // Bull. Environ.Contam.Toxicol. 1975. - V. 13. - P. 751 - 757.

66. Polletini A. Systematic toxicological analysis of drugs and poisons in biosamples by hyphenated chromatographic and spectroscopic techniques // J. of Chromatograph. B 1999. - 733 - P.47-63.

67. Psillakis, E.; Kalogerakis, N. Trends Anal.Chem., 2002,21,53.

68. Rautio M. (ed.). Recommended Operating Procedures for Sampling and Analysis in the Verification of Chemical Disarmament, The Ministry for Foreign Affairs of Finland, Helsinki, 1994.

69. Ray A.C., Post L.O., Reagor J.C. A sensitive high pressure liquid chromatographic method was developed for the sodium fluoracetate // J. Assoc. of. Anal. Chem. 1981.-V. 64. -P. 19-24.

70. Rosenfeld J.M. Solid-phase analytical derivatization: enhancement of sensitivity and selectivity of analysis. // J. Cromatogr. A 1999 - V.843 - P. 19-27

71. Saha M., Saha J., Giese R.W. 4-(Trifluoromethyl)-2,3,5,6-tetrafluorobenzyl bromide as a new elec-trophoric derivatizing reagent. // J.Chromatogr.A 1993. - V.641. - P.400-404.

72. Sarrion M.N., Santos F.J., Galseran M.T. In situ derivatisation/solid phase microextraction for the determination of haloacetic acids in water. // Anal. Chem. - 2000. - V. 72. - P.4865- 4873.

73. Sarrion M.N., Santos F.J., Galseran M.T. Solid -phase microextraction coupled with gas chromatography for the analysis of haloacetic acids in water. // J. Chromatogr. A. 1999. - V. 859. -P.159-171.

74. Savelieva E.I., Koryagina N.L, Goncharov N.V., Radilov A.S. New Method for Fluoroacetate Identification and Quantitative Determination in Biologycal Samples // PITTCON, 12-17 марта 2006г., Орландо, Флорида, ClIIA).c.

75. Seheurer J., Moore C.M. Solid Phase Extraction of Drugs from Biological Tissues A Review. // J.Anal.Toxicoh - 1992. - V. 16. - P. 264-269

76. Sega G.A., Tomkins B.A., Griest W.H. Analysis of methylphosphonie acid, ethyl methylphos-phonic acid and isopropyl methylphosphonie acid at low microgram per liter levels in groundwater. // J.Chromatogr. A 1997. - V.790. - P. 143-152.

77. Shih M.L., Smith J.R., McMonagle, J.D, Doizine T.W., Gresham V.C. Detection of metabolites of toxic alkylmethylphosphonates in biological samples. // Biol. Mass Spectrom. 1991. - V.20. -P.717-723.

78. Sng M.T., Ng W.F. In-situ derivatisation of degradation products of chemical warfare agents in water by solid-phase microextraction and gas chromatographic-mass spectrometric analysis. // J.Chromatogr. A 1999 - V.832. - P. 173-182.

79. Sporkert F. Headspace solid-phase microextraction with 1-pyrenyldiazomethane on-fibre derivatisation for analysis of fluoroacetic acid in biological samples // J. Chromatogr.B 2002. - V. 772. -P.45-51.

80. Stahr H.M. Sodium Fluoroacetate. //J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1977. - V. 60. - P. 1434-1435.

81. Stashenko, E.E.; Martinez, J.R. Derivatization and solid-phase mieroextraetion. // Trends Anal.Chem. 2004. - V.23 - P.553-561.

82. Stevens H.M., Moffat A.C., Drayton J.V. The recovery and identification of fluoroacetamide and fluoroacetic acid from tissues // Forensic Sci. 1976.- V. 8. - P. 131 -137.

83. Taguchi V.Y., in: R.E.Clement (Ed.), Cas Chromatography: Biochemical, Biomedical and Clinical Applications, Wiley, New York, 1990, p. 129

84. Tannock J. Rhod. High pressure liquid chromatographic determination of sodium -fluoracetate // J Agric. Res. 1975. - V. 13. - P. 67 - 72.

85. Tecle B. and Casida J.E. Enzymatic defluorination and metabolism of fluoroacetate, fluoroacetamide, fluoroethanol, and (-)-erythro-fluorocitrate in rats and mice examined by 19F and 13C NMR. // Chem. Res. Toxicol. 1989. - V. 2. - No.6 - P.429-435.

86. Tienpont, B. Stir bar sorptive extraction-thermal desorption-capillary GC-MS applied to biological fluids. // Anal.Bioanal.Chem. 2002 - V.373 - P.46-55.

87. Tomkins B.A., Sega G.A. Determination of thiodiglycol in groundwater using solid-phase extraction followed by gas chromatography with mass spectrometric detection in the selected-ion mode. // J.Chromatogr. A 2001. - V.911. - P.85-96.

88. Tornes J.Aa., Johnsen B.A. Gas chromatographic determination of methylphosphonic acids by me-thylation with trimethylphenylammonium hydroxide. // J.Chromatogr. A 1989. - V.467. - P. 129138.

89. Vartiainen T., Kauranen P. The determination of traces of fluoroacetic acid by extractive alkyla-tion, pentafluorobenzylation and capillary gas chromatography-mass spectrometry. // Anal. Chim. Acta 1984.-V. 157. - P.91-97.

90. Wells R.J. Recent advances in non-silylation derivatization techniques for gas chromatography. // J.Chromatogr, A 1999. - V.843. - P. 1-18.

91. Wils E.R.J., Hulst A.G., Fresenius J.Anal. Chem. 321 (1985) 471.

92. Worek F., Koller M., Thiemann H., Szinicz L. Diagnostic aspects of organophosphate poisoning. Toxicology -2005. V.214. - P. 182-189.

93. Wu, J.Pawliszyn. Preparation and applications of polypyrrole films in solid-phase microextraction. //J.Chromatogr. A 2001.-V.909.-P.37-52

94. Yeh K.H. and Cheng A.L. Acute confusion induced by a high-dose infusion of 5-fluorouracil and folinic acid. // J. Formos. Med. Assoc. 1994,- V. 93. - No. 8. - P. 721-723.

95. Yuan.H.; Mullen, W.M.; J.Pawliszyn. Biological sample analysis with immunoaffinity solid-phase extraction. // J.Analyst. // 2001 V.126 - P.1456-1470.

96. Yu, J.; Wu, C.; Xing, J. Development of new solid-phase microextraction fibers by sol-gel technology for the determination of organophosphorus pesticide multiresidues in food. // J.Chromatograph. A 2004. - V.1036. - P.101-111323-333.