Обработка информации биосенсорных систем на основе бактерий-нефтедеструкторов

Лагунова, Наталия Леонидовна

Системный анализ, управление и обработка информации (по отраслям)

автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.01, диссертация на тему:Обработка информации биосенсорных систем на основе бактерий-нефтедеструкторов

кандидата биологических наук: Лагунова, Наталия Леонидовна
город: Тула
год: 2009
специальность ВАК РФ: 05.13.01

Диссертация по информатике, вычислительной технике и управлению на тему «Обработка информации биосенсорных систем на основе бактерий-нефтедеструкторов»

Автореферат диссертации по теме "Обработка информации биосенсорных систем на основе бактерий-нефтедеструкторов"

00348803 1

На правах рукописи

ЛАГУНОВА Наталия Леонидовна

ОБРАБОТКА ИНФОРМАЦИИ БИОСЕНСОРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ

05.13.01- Системный анализ, управление и обработка информации (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Тула - 2009

003488031

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета ГОУ ВПО «Тульский государственный университет» и в лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) г.Пущино

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук, доцент Понаморева Ольга Николаевна

доктор биологических наук Хромушнн Виктор Александрович

доктор биологических наук, профессор

Еськов Валерий Матвеевич

Ведущая организация:

У РАМН НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН

Защита диссертации состоится « » ____2009 г. в_ на заседании

диссертационного совета Д212.271.06 при ГОУ ВПО «Тульский государственный университет» по адресу: 300026, г.Тула, ул. Болдина, 128.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Тульского государственного университета по адресу: 300600, г. Тула, пр. Ленина, 92.

Автореферат разослан « »_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Борисова О.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Загрязнение окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки представляет особую опасность, что связано с большими масштабами добычи, транспортировки, переработки энергоносителей и несовершенством технологических процессов. Потери нефти только в России достигают 50млн.т/год, из них более трети - за счет аварийных ситуаций; при переработке нефти ежегодно образуется 700тыс.т отходов (Гос.доклад ГП НТЦ,2008). Углеводороды нефтн (УВЫ) приводят в негодность огромные массивы сельскохозяйственных почв вследствие уменьшения их плодородия и негативных изменений в почвенном биоценозе, являются основными загрязнителями внутренних водоемов и морей, создавая различные формы загрязнения - плавающие на воде нефтяные пятна, осевшие на дно тяжелые фракции, что значительно нарушает жизнедеятельность аэробной биоты (Кобзев,2002). Компоненты тяжелых фракций нефти (нафталин, фенантрен) и в особенности их метаболиты, диол- и эпоксипроизводные, представляют собой высокоактивные соединения, являющиеся канцерогенами и мутагенами, т.к. способны образовывать ковалеитные связи с ДНК (Park,2004; 0jo,2007). Именно поэтому нефть и нефтепродукты (НИ) относятся к приоритетным загрязнителям биосферы (Другов,2000; Карпенко,2006).

Перспективным способом очистки почв и вод от НП считается биоремедиация (Widada,2002). Ведущая роль в разложении нефтекомпонентов (НК) принадлежит мик-роорганизмам-нефтедеструкторам родов Pseudomonas и Rhodococcus, широко распространенным в биогеоценозах и отличающихся выраженной способностью к биодеградации УВН в связи с наличием у них широкого набора ферментных систем (ФС) (Van Hamme, 2003; Compant,2005).

Широкому практическому использованию микроорганизмов предшествует стадия фундаментальных исследований, направленная на изучение физиолого-биохимических свойств бактериальных клеток и закономерностей изменений функционирования входящих в них ФС. Обработка информации, полученной при исследовании таких сложных и многофакторных систем, позволяет провести комплексное исследование микробной деградации УВН. С этих позиций становится возможным оценить влияние на интенсивность процессов биоокисления нефти и НП биотических и абиотических факторов: присутствия плазмид деградации, состава микробной популяции, физических и химических свойств ксенобиотиков, колебаний pH среды и температуры, высокой засоленности почв и естественной солености морских акваторий (Margesin,2001; Roling,2004; Zhang,2006).

Для решения поставленных задач необходима разработка методов и алгоритмов определения метаболической активности микроорганизмов (Кузнецов,2006) и прогнозирования поведения бактериальных ФС в реальных условиях. Наиболее перспективными сейчас являются методы биофизической и биохимической диагностики, в частности, биосенсорные технологии, сочетающие чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров (D'Souza,200l; Sakaguchi, 2003; Chang, 2004; Rodriguez-Mozaz,2006; Tizzard,2007; Решетилов,2007). Таким образом, представляется актуальным провести обработку информации биосенсорных систем на основе бактерий-нефтедеструкторов при изменении их окислительной активности под действием эндо- и экзогенных факторов.

Цель исследования: исследовать зависимость дыхательной активности микроорга-низмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus и их ассоциаций от эндо-и экзогенных факторов путем обработки информации биосенсорных систем для совершенствования средств оценки биокаталитических свойств микроорганизмов в условиях биоремедиации.

Задачи исследования:

• Разработать лабораторную модель биосенсорной установки на основе иммобилизованных микробных клеток, позволяющую проводить визуализацию, трансформацию и обработку информации по дыхательной активности аэробных бактерий-деструкторов УВН.

• На основе сравнительного изучения профилей субстратной специфичности (ПСС) ФС бактериальных штаммов проанализировать влияние коньюгативных плазмид деградации нафталина (эндогенный фактор) на изменение окислительного потенциала бактериальных хозяев.

• Оценить изменение окислительной активности нефтедеструкгоров р. Pseudomonas и Rhodococcus в результате воздействия факторов экзогенного характера (природы доступного субстрата, повышенной осмолярности среды, колебаний pH и влажности, низких положительных температур) для прогнозирования деградативных свойств нефтедеструкгоров в условиях биоремедиации.

• Обработать информацию ПСС искусственно составленных ассоциаций микроорганизмов и оценить кооперативный эффект при совместном окислении штаммами УВН в присутствии экстремального фактора и без него.

• Выявить корреляцию между результатами биосенсорных исследований по определению окислительной активности природных и модифицированных штаммов и величинами удельных активностей ключевых ФС этих штаммов, а также их ростовыми и культуральными характеристиками.

• Применить биосенсорные системы для постановки длительного контролируемого экологического эксперимента, натурной концептуальной моделью которого будут иммобилизованные штаммы микроорганизмов и их ассоциации с правом выбора анализируемого фактора в качестве лимитирующего и обработать информацию по трансформации биокаталитических свойств нефтедеструкторов.

Научная новизна работы

Показано, что биосенсорная регистрация дыхательной активности иммобилизованных клеток микроорганизмов обеспечивает оперативность и надежность получаемых данных и является эффективным инструментом оценки деградативных свойств аэробных штаммов в отношении широкого круга УВН и их производных.

Впервые установлено, что биосенсорная оценка субстратной специфичности искусственно составленных микробных ассоциаций позволяет регистрировать возникающий в ассоциациях кооперативный эффект, а также антагонистические взаимодействия микроорганизмов.

Впервые показана возможность использования биосенсорных технологий для экспертного анализа результатов модифицирования нефтедеструкторов плазмидами биодеградации.

Определено, что обработка информации биосенсорных систем может быть использована для экологического мониторинга факторов окружающей среды при оценке их воздействия на окисляющую способность бактерий-деструкторов. Впервые такой подход применен для исследования возникновения адаптации бактериальных клеток к ряду экзогенных факторов.

рующего. Установлено, что обработка информации биосенсорных систем позволяет регистрировать происходящие при этом направленные сукцессионные изменения в микро-боценозе и может лежать в основе метода характеристики биохимического поведения нефтедеструкторов и их ассоциаций в условиях биоремедиации.

Практическая значимость работы

Развит экспрессный, аналитический и безреагентный способ скрининга нефтедеструкторов для быстрой и комплексной оценки эффективности бактериальных штаммов и прогнозирования их полезных свойств в условиях биоремедиации.

Результаты создают основы для использования микробных сенсоров в прикладных исследованиях трансформаций биохимического поведения модифицированных штаммов, а также искусственно составленных ассоциаций в условиях изменения доступности ростовых субстратов и постоянного воздействия абиогенных факторов в течение длительного времени биоремедиации. Это позволит избежать незапланированных потерь активности интродуцируемых биопрепаратов в конкретных условиях.

Выявленные в работе закономерности функционирования биосенсоров на основе бактерий родов Pseudomonas и Rhodococcus могут быть использованы в качестве научной основы при разработке микробных биосенсоров на основе других аэробных микроорганизмов-деструкторов УВН.

Макет микробного биосенсора на основе микроорганизмов-нефтедеструкторов характеризуется экспрессностью, высокой чувствительностью и низким пределом обнаружения токсичных поллютантов. Он может быть использован для количественного определения селективного или совокупного содержания ароматических УВ в реальных образцах посредством одновременного измерения проб двумя сенсорами, модифицированными штаммами с отличающимися окислительными характеристиками в отношении аналитов-НК. Разработанная установка может служить прототипом опытного образца прибора для серийного освоения, а также применяться в учебном процессе, что позволит усовершенствовать экспериментальную и приборную базу университетов и повысить качество образования.

Внедрение.

Результаты исследований внедрены на кафедрах химии и биотехнологии ГОУ ВПО Тульского государственного университета; в ГУП ТО НИИ новых медицинских технологий (г.Тула); в Институте теоретической и экспериментальной биологии РАН (г.Пущино).

Работа выполняюсь при поддержке грантов РФФИ 04-04-96705 «Изучение процессов окисления ксенобиотиков бактериальными штаммами на основе их дыхательной активности», 2004-2005г., 06-04096318 «Особенности механизмов биодеградации углеводородов нефти бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus», 2006г. и 08-04-99019-р_офи «Изучение метаболических особенностей и генетических систем биодеградации микроорганиз-мов-иефтедеструкторов и разработка на их основе подходов к созданию новых биопрепаратов и технологий биоремедиа1[ии почв, загрязненных нефтью и НП», 2009-2010г.; в рамках ФЦП "Интеграция" (проект Л0145), НОЦ «Экобиотехнология» (2005-РИ-16.0/ 025/026 ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006г., госконтракт 02.438.11.7021.), программы ФА по образованию «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008г.)», РНП 2.1.1.7789.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены и обсуждены на: IV Региональной научно-практ. конференции «Современные проблемы экологии и рационального природополь-

зования в Тульской области» (Тула, 2004); IX и X Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006); IV Международной научной конференции «Химия, хим. технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск,2006); II Всероссийской научно-техн. Интернет-конференции «Современные проблемы экологии и безопасности» (Тула, 2006); Всероссийской научно-техн. конференции «Современные проблемы экологии» (Москва-Тула, 2006); V Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); X Юбилейном международном форуме «Высокие технологии XXI века» (Москва 2009).

По теме диссертации опубликовано 4 статьи (в журналах, рекомендованных ВАК), 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Структура и объем работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 226 страницах, содержит 66 рисунков, 12 таблиц и 5 приложений. Список литературы включает 324 источников (109 отечественных и 215 зарубежных).

Основные положения, выносимые на защиту

В соответствии с поставленной целью и задачами, на защиту выносятся следующие положения.

• Лабораторная модель биосенсора для определения концентрации аналитов-НК на основе иммобилизованных нефтедеструкторов и компьютерных методов обработки информации характеризуется высокой операционной стабильностью и экспрессно-стью измерений, а также низким пределом обнаружения токсичных поллютантов.

• Изменения окислительной активности нефтедеструкторов р. Pseudomonas и Rhodo-coccus в результате воздействия факторов экзогенного характера различны - родо-кокки характеризуются высокой степенью толерантности к экстремальным факторам, тогда как быстрая адаптация и быстрый рост псевдомонад обеспечивает им шанс на выживание в условиях биоремедиации.

• Составлены пять ассоциаций микроорганизмов, для двух из них характерен высокий кооперативный эффект в присутствии и без экстремального фактора.

• Постановка длительного контролируемого экологического эксперимента позволяет осуществить экспертный анализ трансформации окислительных свойств штаммов, а также направленность сукцессионных изменений в составе микробного сообщества.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объект исследования

Для исследования выбраны из коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН г.Пухцино 4 природных штамма и 11 штаммов, модифицированных плазмидами биодеградации нафталина (Nah-плазмидами), по признаку высоких деграда-тивных характеристик в отношении УВН. Микроорганизмы культивировали на агаризо-ванной синтетической среде Эванса на чашках Петри при 28°С в парах нафталина (для плазмндосодержащих псевдомонад), с добавлением сукцината (для бесплазмидных) или

в парах дизельного топлива (для родококков) в качестве источника углерода и энергии. Ауксотрофам по цистеину добавляли в среду цистеин, бактериям с плазмидой pNF!42::TnMod-OTc - тетрациклин.

2. Методы исследования

Биосенсорные исследования. В работе применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала, позволяющий производить высокоточные измерения в ианоамперном диапазоне токов, что дает возможность исследовать свойства микрограммовых количеств биомассы. Дыхательную активность микроорганизмов регистрировали с помощью кислородного электрода типа Кларка, на рабочей поверхности которого фиксировали иммобилизованные бактериальные клетки. Электрохимические измерения проводили с помощью

специализированного амперометрического потенциостата LPC2L (ЗАО «Кронас», Россия), интегрированного с персональным компьютером. Преобразователь выполняет функцию регистрации и обработки данных, позволяет производить непрерывную запись сигнала от биообъекта. Ток регистрировали в интервале 0,1-50 нА, в качестве измеряемого параметра (способа обработки сигнала сенсора) использовали амплитуду и максимальную скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов (рис.1).

Иммоб илизацию микроорган изм о в проводили согласно (Арляпов,2009; Зай-цев,2008)

Удельные активности ключевых ферментов бнодеградации нафталина

определяли спектрофотометрически по скорости уменьшения экстинкшш НАДН в реакционной смеси (в случае с нафталин-1,2-диоксигеназой и салицилатгидроксилазой) или по скорости образования хромогенных продуктов реакции окисления катехола - 2-оксимуконового лолуальдегида и цис-цис-муконата и выражали в микромолях образующегося продукта в минуту на 1 мг общего бактериального бедка.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ «1РС2000» (ЗАО«Кронас»,Россия), «Microsoft Excel», статистического пакета «SigmaPlot 9.0».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проблема изучения многообразных свойств биологического объекта и применения их для конкретных нужд требует разработки методики обработки информации, определяющей последовательность этапов проведения анализа и методы их выполнения. Методика обработки информации по влиянию эндо- и экзогенных факторов на окислительную активность бактерий-нефтедеструкторов приведена на рис. 2.

Р.нр. 142№(р№142) на введение 400мкл насыщенного раствора нафталина. Измеряемые параметры: скорость изменения си лы тока (СИСТ) - 0.107 нА/с, амплитуда изменения силы тока (АИСТ) - 8 нА

1.Разработка лабораторной модели биосенсора кюветного типа на основе мик-роорганизмов-нефтедеетрукторов

Принцип работы микробного сенсора кюветного типа основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кислородного электрода микроорганизмами в приэлектродном пространстве измерительной кюветы снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода и преобразуется в аналитический сигнал с последующей обработкой на ЭВМ (рис.3).

мттт.шгв

Аиаян» ътжт жшщшк Факт«

«кмм-ммм тттт<к:т фщтнт»

грщиршюшт

I ОггрййШШШ'" [ амдаитшеда«

бжсенсерзд | I йжсеясррш %_»

ежсЕжо»

(ттшхиШ "ЗВЩнйрт»"'

•/и-ЗЯК.г райк юшзмэд депадщж I <шдргтшай фактор);

Й от^ор

«жжр&тятух }

Рис. 2. Схема обработки информации по влиянию факторов различной природы на окислительную активность бактерий-нефтедеструкторов

Рис. 3. А - схема биосенсора кюветного типа, Б - внешний вид лабораторной модели

Влияние иммобилизации на окислительные характеристики бактерий-иефтедеструкторов

При выборе способа иммобилизации микроорганизмов для получения стабильно работающего рецепторного элемента опробовано 7 разновидностей 3-х основных методов - адсорбции (на стекловолоконном фильтре 6Р/А, на мембране вупрог, предварительно активированной бензохиноном, а также дополнительно модифицированной ДЭАЭ-декстраном), капсулирования (адсорбция в комбинации с диализной мембраной)

и включения в гели ( в агаровый гель и синтетические полимерные гели - полиакрила-мидный гель и поливиниловый спирт). Сравнение экспрессности методов, операционной и долговременной стабильности биосенсоров, а также исследование возникающих диффузионных ограничений позволило выбрать способ иммобилизации нефтедеструк-торов путем упаковки в агар.

Статистический анализ применимости способа иммобилизации микроорганизмов в агар (выявление возможных грубых ошибок по Q-критерию, решение вопроса о принадлежности отдельных выборок одной совокупности по воспроизводимости использованием критерия F-распределения (критерий Фишера), выяснение, есть ли статистически значимая разница между результатами анализов построением нуль-гипотезы) показал, что для достоверности получаемых результатов содержание бактерий в агаровом блоке должно быть 25±2 мг на 1 мл агарового геля. В этом случае данные различных выборок можно объединить и рассматривать их как одну выборочную совокупность. Основываясь на массиве данных, полученном путем объединения 7 выборок, была определена случайная ошибка эксперимента, которая составила 4,5%. Таким образом, способ упаковки биомассы в агаровый гель применим для получения стабильных рецепторных элементов биосеисора с целью количественного сравнения дыхательной активности микроорганизмов.

Градуировочные зависимости биосенсоров на основные сувстраты-НК. уравнения их аппроксимаций

Связь дыхательной активности бактерий с концентрацией субстратов в кювете имеет количественный характер (рис.4) и позволяет получить градуировочные зависимости откликов сенсора от содержания УВН и их производных в пробе.

Регрессионный анализ показал, что полученные зависимости ответов сенсоров от содержания октана, нафталина и фенантрена имеют сигмовдальный вид и аппроксимируются с высокими коэффициентами смешанной корреляции (R2>0,999) трехпараметриче-ским уравнением Хилла (1), описывающим кинетику функционирования аллостериче-ских ФС. При коэффициенте кооперагивно-сти h=l это уравнение превращается в классическое уравнение Михаэлиса-Ментен (2). Сравнение величин значений параметров уравнения Хилла - Km (эффективной константы Михаэлиса, являющейся концентрацией полу насыщения ФС субстратом) и Vmax (максимальной скорости окисления субстрата) дает возможность проводить мониторинг штаммов по эф- д-

фективности в от- , , ,

ношении анализируемых аналитов-НК (рис.5). Эффективная константа Михаэлиса при окислении октана меньше у Р. * гХ

putida BS3701(pBS1141,pBS1142) (рис.5А), следовательно, .

алкангндроксилаза данного штамма требует меньшего коли- [Л |

чества субстрата для достижения максимальной скорости 1 ., г.Д •<.<>

окисления, и этот штамм является более эффективным. Хотя, 'M i* 1

Ж) ¡яг; Ой Ъ№ -И'.< ><:" :<я>

Рис. 4. Отклики микробного сенсора на основе Р. сЫогогарЫз РСЬ1391(рОУ17) на различные концентрации нафталина (1-6,6 мкМ, 2-13,3 мкМ, 3-19,9 мкМ, 426,6 мкМ) в измерительной кювете

необходимо отметить, что максимальная скорость окисления октана выше у Юг. .чр. Б67, что отражается на более высоких деградативных свойствах родококков в отношении ал-канов (Нечаева, 2009). Сравнительный анализ Кт и \'тах биосенсоров на нафталин (рис.5Б), позволил выявить эффективный штамм-деструктор нафталина - Р. яр. 142№(р№142).

0,06

5 0,04

£ 0,02

0,00

3 67 ВЭ3701

РСМЗЭ1 (рО\М7) В8394(рВ5216)

□

0,0

0,1 0,2 0,3 0,4

Содержание субстрата, им

0,07

и 0,06

ч <

1 0,05 я

£< 0,04

ш 0,03 и

Ш 0,02

со I° 0,01

0,00

ФС окисления алканов 567

И,2 =0,9994

Кт, = 0,224 ±0,003 мМ Утах , = 0,064 ± 0,001 нА/с

В83701(рВ81141,рВ8П42)

2 =0,9998 Кт 2= 0,134 ± 0,002 мМ Ушах 2 = 0,0426 + 0,0004 нА/с

РСЫ391(рОУ17)

2 =0,9996 Кт з=0,17± 0,01 мМ Утах з = 0,033 ± 0,001 нА/с

Кш2<Кш3<Кт1; Утах | > Ушах г > Утах}

ФС окисления нафталина

142№(рОТ142)

2 =0,9996 Кт, = 8,9 ± 0,3 мкМ Утах , = 0,071 ± 0,002 нА/с

РСИ391(рВ8216)

2 =0,9995 Кт2= 10,7 ± 0,2 мкМ Утах г = 0,043 ± 0,001 нА/с

Кт 1 < Кт 2; Утах , > Утах 2

5 10 15 20 25 Содержание нафталина, мкМ

А - градуировочные зависимости сенсоров на алканы, Б - на нафталин

Следует отметить, что градуировочные зависимости биосенсоров позволяют определить насыщающие концентрации субстратов-УВН для обеспечения количественного

подхода в получении сравнительных оценок. Насыщающая концентрация для алканов, циклогексана и моноароматических УВ составила в среднем 0,34 мМ, для нафталина - 26,6 мкМ (рис.5).

Зависимость величин ответов сенсоров от концентрации ароматических кислот в измерительной кювете имеет линейный характер и аппроксимируется уравнением (3). Градуировочные зависимости биосенсоров на гексан и

У" г,

ах

(3)

(4)

0,020

толуол имеют вид пика (рис.6) и описываются логарифмическим уравнением (4), что отражает процесс ингибирования ФС бактерий токсичным субстратом. Необходимо отметить, что анализ параметров уравнений аппроксимаций в данных случаях также позволяет провести мониторинг эффективности штаммов и исследовать метаболические особенности бактериального окисления УВН.

> 0,016

? 0,006

I- 0,008

§ 0,012

S 0.010

\ 0,014

0,004

0,012

0,018

0,002 -------•----------т---------,--------,----------rl

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Рабочие параметры и основные аналитические характеристики лабораторной модели биосенсорной установки

Содержание толуола, мм Рис. 6. Градуировочная зависимость сенсора на толуол, Я2 = 0,9994

Для биосенсоров были определены рабочие параметры (рабочим считали значение параметра, при котором величина ответа сенсора была максимальной при наилучшей операционной стабильности):

• иммобилизация бактериальных клеток в агар;

• pH фонового раствора буфера 7,6;

• концентрация солен буферного раствора 33 мМ,

• масса клеток на электроде 25 мг сырого веса/мл,

• величина начального тока для регистрации ответов -25±5нА.

Получены основные аналитические и метрологические характеристики биосенсора кюветного типа на основе штамма Р. sp. 142NF(pNF142), субстрат-нафталин:

• длительность единичного измерения (время отклика и регенерации сенсора) 10-15мин.;

• предел обнаружения - 0,33 мкМ;

• чувствительность - 0,005 нА/мкМ с;

• интервал определяемых концентраций - от 3 до 9 мкМ;

• операционная стабильность (стандартное отклоните по 14 последовательным измере-

ниям при Р=0,95) - 3,4%;

• долговременная стабильность 6 суток (падение активности микроорганизмов на про-

тяжении этого времени не превысило 20%). Лабораторная модель биосенсора на основе Р. sp. 142NF(pNF142) характеризуется высокой операционной стабильностью и экспрессностью измерений, низким пределом обнаружения токсичного поллютанта (в 2 раза ниже, чем у метода ИК-спектроскопии при несравнимо меньших затратах на проведение анализа) и может быть использована для определения концентрации нафталина в водных средах, а также для экспресс-контроля загрязнения вод морей и внутренних водоемов.

В результате скрининга 12 штаммов по способности к окислению фенантрена и стабильности сохранения данного биохимического признака был отобран штамм Р. chlororaphis PCL1391(pOV17) и на его основе получен сенсор для определения концентрации токсичного поллютанта с высокой чувствительностью (0,11 нА/мкМ-с) и низким пределом обнаружения. Предел обнаружения, равный 25 нМ, позволит применить биосенсор для измерения фоновых концентраций фенантрена в водах рыбохозяйственных водоемов, где допустимое содержание фенантрена составляет 0,1 ПДК.

Разработанные биосенсорные системы были применены для обработки информации по влиянию эндо- и экзогенных факторов на окислительную активность бактерий-нефте-деструкторов.

¡жржрсш»

Й.1В

2. Роль плазмид деградации нафталина (эндогенный фактор) в изменении окислительных характеристик бактериальных хозяев

В результате скрининга ростовых и кульгуральных характеристик 11 нефтедесгрук-торов для биосенсорного анализа отобрано 5 штаммов: бесплазмидные Р. ршМа В8394. Р. МогогарШ РС1Л391 и эти же микроорганизмы с перенесенными в них структурно аналогичными №11-плазмидами рВ8216 и рОУ17:

Р. риМа В8394(рВ8216),

Р. сМогогарЫя РСЬ1391(рВ8216) и

Р. сЫоюгарЫэ РС1Л391(рОУ17).

Бесплазмидные штаммы имеют немного отличающиеся ППС по основным субстра-там-УВН. Присутствие ЫаЬ-плазмид не только увеличивает окислительные способности штаммов в отношении ароматических УВ (у Р.сЫогогарЫя РСЫ391 с плазмидой рВ8216 возрастают величины ответов на бензойную и салициловую кислоту, нафталин и 2-метилнафталин - в 3-4 раза, бензол - в 9 раз, толуол - в 13 раз (рис.7)), но и оказывает положительное влияние на жизнеспособность микроорганизмов и совершенствование адаптивных реакций клеток на токсичность НК. Также необходимо отметить повышение энергетического статуса ллазмидосодержащих клеток, выражающегося в увеличении интенсивности окисления энергоемких субстратов, прежде всего глюкозы.

Рис. 7. Сравнительная субстратная специфичность Р. сЫ. РОЛ 391 и Р. сМ.РС1Л391(рВ3216), субстраты: Гл-глюкоза, Эт-этанол, С-сукцинат, Г-гексан, Ок-октан, Г/д-гсксадекан, Ц-цикло-гексан, Б-бензол, Т-толуол, мК-метакрезол, Ск, Бк, Нк-салициловая,

бензойная и 1-ОН-2-нафтойная кислоты, Н-нафталин, мН-2-метилнафталин и Ф-фенантрен

Полученные данные (увеличение селективности биосенсора в отношении ароматических соединений) наглядно иллюстрируют возможность использования биосенсорных технологий для экспертного анализа результатов модифицирования МаЬ-плазмидами штаммов-деструкторов и количественного определения совокупного содержания пол-лютантов ароматической природы в реальных образцах посредством одновременного измерения проб двумя сенсорами, модифицированными бесплазмидным штаммом и штаммом, содержащим ^Ъ-плазмиду.

Штаммы, содержащие одну и ту же ЫаЬ-плазмиду, обладают различающимися окислительными характеристиками, что подразумевает влияние бактериального хозяина на катаболическое поведение трансконьюгантов. Бактериальный хозяин Р. МогогарЫв РСЫ391 является более предпочтительным реципиентом, чем Р. риййа В8394, для плазмиды рВ821б вследствие более высокой окислительной активности Р. сЫогогарЫз РС1Л391(рВ8216) в отношении ароматических субстратов (рис.8). При анализе комбинаций Р. сЫогогарЫя РС1Л391 и структурно аналогичных ИаЬ-ллазмид рВ8216 и рО\;17 установлена дифференцированная компетенция реципиентных клеток бактериального

о,®

т г.-д

хозяина по отношению к плазмидам, т.к. Р. сЫогогарШь РСЬ!391(рОх/17) обладает высокой окислительной активностью в отношении фенантрена и его метаболита - 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты (рис.8). Так же этот штамм отличается высокой "жизнеспособностью в условиях проведения биосенсорных измерений - время жизни бактерий в рецепторном элементе биосенсора в 2 раза выше, чем у Р.сЫогогарЫх РСЬ1391(рВ8216), время жизни в иммобилизованном состоянии - в 5 раз.

0,2 V............................................................................................................-...........................

ш p. putkia 3MfttBS21 №

6 I Ш СИ Ш HK Я ИВ Ф

Рис. 8. Сравнительная субстратная специфичность P. putida BS394(pBS216), P.chlororaphis PCL1391(pBS216) и P.chlororaphis PCL139l(pOV17).

Обозначения субстратов соответствуют сокращениям, приведенным под рис.6.

Учитывая тот факт, что штаммы с лучшей экспрессией генов мета-пути окисления катехола обладают более высокими удельными скоростями роста и повышенной жизнеспособностью (Boronin A.M., 1993), дальнейшей целью стало определить удельные активности основных ФС биодеградации нафталина, в том числе катехолдиоксигеназ (КО). Величины удельных активностей нафталин-1.2-диоксигеназы и салицилатгидрок-силазы, полученные спектрофотометрическим методом, для обоих штаммов статистически одинаковы, что хорошо согласуется с данными по дыхательной активности бактериальных клеток. Коэффициент корреляции между величинами, полученными биосенсорным и спектрофотометрическим способом равен 0,977.

Величины удельных активностей К-1,2-0 также близки (0,022±0,008 и 0,016±0,006 мкмоль/мин-мг белка), активность же К-2,3-0 оказалась почти в 5 раз выше у Р. chlororaphis PCL1391 (pOV17) (0,21+0,01 против 0,045±0,006 мкмоль/мин-мг белка), что свидетельствует о преимущественно мета-путл окисления нафталина у этих бактерий и подтверждает результаты биосенсороных исследований.

Таким образом, при оценке влияния эндогенных факторов на окислительную активность нефтедеструкторов показано, что на эффективность окисления УВН плазмидо-содержащими бактериями оказывает влияние как катаболическая плазмида, так и бактериальный хозяин. Сочетание бактериального хозяина P. chlororaphis PCL1391 и Nah-плазмиды pOV 17 было признано наилучшим из исследованных, данный штамм предложен для использования в рецепторных элементах биосенсоров для определения содержания НК в реальных пробах. Штамм P. chlororaphis PCL1391(pBS2J6) благодаря высоким окислительным характеристикам и ограниченной жизнеспособности может быть рекомендован для дальнейшего изучения и применения для биоремедиации нефтезаг-рязненных территорий. Сравнительный анализ ПСС плазмидосодержащих штаммов в отношении широкого круга субстратов ароматической природы показал, что ФС дегра-

дации нафталина, закодированные на плазмидах рВ8216 и рОУ17, имеют широкую субстратную специфичность (рис.8), что немаловажно для эффективности бактериальных препаратов в реальных условиях биоремедиации.

3. Воздействие природы субстрата на окислительную активность нефтедеструкто-

ров, динамика реакций микробоценоза при сиене селективных субстратов

При изучении влияния фактора природы доступного клеткам субстрата установлено, что он непосредственно воздействует на окислительную активность клеток и лимитирует их жизнедеятельность. В результате исследования все субстраты были условно поделены на 4 группы: достаточные (энергоемкие), недостаточные, восстанавливающие и токсичные; проведена качественная и количественная оценка влияния субстратов различной природы на окислительные характеристики как плазмидосодержащих, так и бес-плазмидных нефтедеструкторов. Для анализа использовались 6 параметров: СИСТ, АИСТ, время развития отклика (с), изменение уровня базового тока (данный параметр количественно отражает уровень эндогенного дыхания клеток) (%), время регенерации

ичины ответа в течение 8 ч.

Для плазмидосодержащих псевдомонад энергоемкими субстратами, достаточными для поддержания жизнеспособности клеток, роста и размножения, являются не только глюкоза, сукцинат, но и ароматические кислоты (рис.9) -салициловая и 1-гидрокси-2-нафтойная, что может бьггь связано с влиянием на процессы катаболизма продуктов экспрессии плазмидного оперона. Алканы нормального строения (гексан, октан, гексадекан) и циклогексан являются недостаточными субстратами для плазмидосодержащих клеток, глюкоза - восстанавливающим.

Токсичные субстраты для всех 5 изученных штаммов (раздел 2) одинаковы (бензол, толуол), что предполагает общий механизм их воздействия на клетки гра-мотрицательных бактерий. Микроорганизмы, модифицированные катаболическими плазмидами, характеризуются более совершенными механизмами защиты вследствие возникновения адаптивных состояний, что выражается в постепенном увеличении величины и стабильности ответов сенсоров на токсичные субстраты.

Таким образом, обработку информации биосенсорных систем можно применить для экспресс-получения предварительной ауксонограммы изучаемых штаммов, при этом снижая затратность микробиологического анализа и регистрируя специфику индивидуальных реакций нефтедеструкторов. Использование биосеисорных технологий позволит достаточно быстро получить микроорганизмы, адаптированные к токсичным субстра-там-НП.

Особенности окисления алканов нормального студент с длиной цепи С6-С16

Были исследованы особенности бактериального окисления алканов, связанные с длиной углеродного скелета субстрата (возможное возникновение диффузионных ограничений), растворимостью, токсичностью алкана, а также интермедиатов его микроб-

сенсора после измерения (мин) и изменение вед|

судсгвнш-

rt¡«í'n гтеюш

•fetí J8<!V }!» ;120: 1« 1«

Рис. 9. Отклики микробного сенсора на основе Р. chlororaphis PCL1391(pOV17) на различные субстраты

0,025

0.01

ной трансформации. Самая низкая СИСТ характерна для додекана (рис.10) - алкана с шггермедиатами биоокисления, обладающими бакте-рностатнческнми свойствами. Полученные результаты по закономерностям окисления алканов с длиной цепи С6-С16 хорошо коррелируют с ростовыми и культуральными ха-** 4 | 5 рактеристикамн бактерий на данных 11 субстратах. Действительно, самая Рис.10. Величины СИСТ на алканы с длиной це- низкая интенсивность роста у микро-пи С6-С! 6 (шт. P.chlororaphis PCL 1391 (pOV 17), организмов на додекане, колонии содержание субстратов - 0,34 мМ, объем вводи- практически неразличимы. Наимень-мого дизельного топлива-100 мкл) Ший размер колоний и продолжи-

тельность бактериального роста характерны также для токсичных низкомолекулярных алканов - гексана и октана. Самый интенсивный рост, крупные колонии и наибольшая продолжительность роста P. chlororaphis PCL1391(pOV17) отмечена на гексадекане, что объясняется большей энергоемкостью длинной молекулы при ß-окислении.

Индукция окисления нафтачина у бесплазмидных штаммов

Установлено, что биосенсорные технологии позволяеот регистрировать индукцию окисления нафталина у бесплазмидных штаммов, не способных первоначально не только к росту на данном субстрате, но и к его окислительной трансформации.

Бесплазмидные штаммы P. pudda BS394 и P. chlororaphis PCL1391, выращенные на среде, содержащей сукцикат, первоначально не способны катаболизировать нафталин, отклик биосенсора на введение данного субстрата отсутствует (рис.11А). Однако после окисления бактериями салициловой кислоты - индуктора экспрессии оперонов «верхнего» и «нижнего» иутен деградации нафталина (Van Hamme J.D., 2003) - регистрировали дыхательную активность клеток в присутствии этого субстрата, причем экспозиция индуктора в кювете составляла всего 3-5 минут. Первый ответ на нафталин небольшой по амплитуде (Д1=0,5 пА), с заметными шумами на самом отклике (рис.11Б). Повторное введение нафталина приводило к увеличению амплитуды отклика в 2 раза и уменьшению шумов (рис.11В).

А Б В

Рис. II. Индукция окисления нафталина (шт. Р. сЫогогарЫя РС1Л391, концентрация нафталина 26,6 мкМ). А - вид отклика сенсора при отсутствии ответа на нафталин, Б - появление отклика на нафталин, В - вид отклика при повторном введении

В дальнейшем отклик микробного сенсора на нафталин приобретал классический вид, ответ становился стабильным и сохранялся при смене субстратов, оставаясь неизменным (в пределах ошибки) в течение всего времени работы рецепторного элемента, что исключает случайный характер возникающих катаболических изменений. Получен-

ные результаты можно объяснить наличием на хромосомах множественных генов для сходных ферментов, что широко распространено у бактерий (Ferrero М.,2002). Таким образом, возможно использовать биосенсорные системы для быстрой и качественной индукции имеющихся ФС нефтедеструкторов, т.е. селективного отбора катаболических свойств, не имеющих выражения в фенотипе популяции, но обеспечиваемых ее генетическим ресурсом.

Динамика реакций микробоиеноза в отношении доступных субстратов.

Постановка длительного контролируемого экологического эксперимента

Для экспертного анализа поведения плазмидосодержащих штаммов в реальных условиях биорсмедиации необходимо исследовать не только жизнеспособность культур в условиях изменения доступности ростовых субстратов, но и связанную с этим стабильность поддержания плазмид биодеградации, а также направленность сукцессионных изменений в составе микробного сообщества в течение длительного времени. Подобный анализ важен при оценке трансформации деградативных свойств микроорганизмов, входящих в биопрепарат. Кроме того, внесенный в загрязненную почву или водоем модифицированный штамм не должен нарушить уже существующий микробоценоз и стать доминирующим при смене условий или остаться не в фоновой концентрации после очистки среды от НП.

Биосенсорный анализ является не только высокочувствительным экспресс-методом определения окислительной активности исследуемых биообъектов, но, благодаря электрохимическому способу регистрации сигнала и компьютерной обработке информации дает возможность непрерывно исследовать процессы, протекающие в микробной системе. Таким образом, в биосенсорных системах становится доступным проведение как минимум трехпараметрических (пункт 3) аналитических измерений с количественной точностью, полнотой и информативностью эксперимента, а также изучение не только субстратной специфичности ФС микроорганизмов, но и динамики реакций бактерий на анализируемые субстраты, что предполагает постановку экологических исследований.

В рамках данного исследования определена стабильность поддержания плазмид pBS216 и pOV17 в селективных условиях порционной доступности субстрата биосенсорных систем для Р. chlororaphis PCL1391(pBS216) и Р. chlororaphis PCL1391 (pOV17) в течение 10 недель. Биосенсорное исследование изменения величин скоростей окисления селективных субстратов с одновременной регистрацией эндогенного дыхания клеток позволило зафиксировать сукцессионные изменения микробной популяции в рецеп-торном элементе и предположить, что стабильность поддержания плазмиды pBS216 выше, чем pOV17, что и приводит к гибели клеток Р.chlororaphis PCL1391(pBS216) к концу 4-5 недели эксперимента. В случае с Р. chlororaphis PCL1391(pOV17) был сделан вывод о появлении равновесной популяции из 2-х штаммов - Р. chlororaphis PCL1391(pOV17) и Р. chlororaphis PCL1391. Полученные результаты по стабильности поддержания Nah-плазмид важны для выбора штаммов для биоремедиации в зависимости от степени и состава загрязнения среды, а также состава почв, т.к. Р. chlororaphis PCL1391(pOV17) в богатых органическим веществом почвах будет иметь тенденцию к закреплению в природном микробоценозе.

Для создания натурной концептуальной модели по исследованию долговременной окислительной активности образующегося бактериального ценоза была использована биосенсорная установка с выбранным фактором доступности селективных субстратов в качестве лимитирующего прямодействующего экологического фактора. Поставлен длительный контролируемый эксперимент (20 недель) с целью исследования изменения окислительных характеристик образующегося микробоценоза из Р. chlororaphis

РСЫ391(рОУ17) и Р. МогогарМз РСЫ391 к алканам (гексан, гексадекан) и полиароматическим углеводородам (ПАУ) (нафталин, фенантрен) (рнс.12). Также исследовалась направленность сукцессии популяции, состоящей из клеток с КаЪ-нлазмидами и бес-плазмидных.

.! 11 ? ?! ! ;л и ¡:? ¡4 к и;

ч/^

......

Рис. 12. А - долговременная окислительная активность Р. сЫогогарЫя РС1Л391(рОУ17) в отношении алканов (гексан, гексадекан) и ПАУ (нафталин, фенантрен). 1-9 неделя: порционная доступность алифатических и ароматических субстратов, 10-12 неделя: селективная доступность только алифатических субстратов, 13-18: доступность алифатических и ароматических субстратов. На графике приведены средние величины ответов за неделю. Б - изменение величины начальной (базовой) силы тока в течение 18 недель

С конца 3 недели наступает адаптированное состояние микробной популяции, которое характеризуется установлением относительно постоянного шчааыюго тока - 30±3 нА (рис.12Б), за исключением 12-13 недели, когда количество клеток уменьшается из-за селективной доступности в течение трех недель только алифатических субстратов, недостаточных для роста и развития как плазмидосодержащих клеток, так и бесплазмид-ных.

При индукции окисления алканов на 10-12 неделе посредством селеетивной доступности только этих субстратов происходит возрастание величин ответов сенсора на данные субстраты (рис.12А) при одновременном снижении начального тока, что отражает сукцессионные изменения в микробоценозе, связанные с увеличением относительного количества бесплазмидных клеток Р. сЫогогарЫз РОЛ 391 за счет частичной гибели плазмидосодержащих. При индукции окисления ПАУ на 13 неделе резко возрастают величины ответов на нафталин и фенантрен за счет размножения преимущественно плазмидосодержащих Р. МогогарШ.ч РСЫ391(рОУ17), также быстро повышается уровень начального тока, что отражает увеличение общего количества бактерий в рецеп-

торном элементе. Учитывая, что в природных условиях при изменении состава загрязнения происходят подобные колебания состава микробоценоза, возможно использовать биосенсорный анализ при экспертной оценке бактериальных препаратов, созданных для биоремедиации.

4. Анализ влияния экзогенных факторов абиотической природы на окислительные характеристики природных нефтедеструкторов

Возможность биосенсорного определения ПСС ФС ггефтедесгрукторов, а также динамики реакций бактериальных клеток в ответ на прямое воздействие создает предпосылки для постановки экологического эксперимента по оценке изменения окислительной активности микроорганизмов под влиянием ряда абиогенных факторов. Оценка влияния экзогенных факторов абиотической природы на окислительные характеристики бактерий осуществлялся путем регистрации изменения дыхательной активности иммобилизованных бактериальных клеток в присутствии раствора соли, под воздействием колебаний влажности и рН, под влиянием периодов голода, а также низких положительных температур.

Для изучения данных экстремальных для жизнедеятельности бактерий факторов были выбраны 4 природных психротрофных и галотолерантных штамма из коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, наиболее конкурентно способных, проявляющих высокую катаболическую активность в отношении НК при росте на различных субстратах-УВН (Филонов А.Е. с соавт., патент РФ №2312891, 2006): Rh. sp. Х5, Rh. sp. S67, P. sp. 142NF1, P. putida BS37012. Для выбранных штаммов получены ПСС с помощью биосенсорного анализа (рис.13). Несмотря на то, что каждый

из микроорганизмов способен к окислительной трансформации всех тестируемых субстратов, родококки преимущественно окисляли алканы и нафтен, а также некоторые моноароматические УВ, тогда как псевдомонады являлись более активными в отношении всего ряда ароматических соединений. Rh. sp.X 5 более интенсивно вовлекал в процессы катаболизма алканы, бензол и салициловую кислоту, Rh. sp.S61 - толуол и бензойную кислоту. Оба штамма родококков устойчивы к токсичным алканам, а P. putida BS3701 обладает лучшими окислительными характеристиками среди 5 штаммов, содержащих Nah-плэзмиды.

Величины удельных активностей ключевых ферментов биодеградации нафталина для каждого из 4 природных нефтедеструкторов согласуются с данными по окисяитель-

Рис. 13. Сравнительная субстратная специфичность природных штаммов. Обозначения субстратов соответствуют сокращениям, приведенным под рис.6.

1 P. sp. 142NF- здесь и далее - P. sp. 142NF(pNF142)

2 P. putida BS3701- здесь и далее - P. putida BS370f(pBS 114I,pBSÍ142)

ным способностям микроорганизмов, полученными биосенсорным способом (коэффициент корреляции между величинами, полученными двумя способами равен 0,98), а также их жизнеспособностью и культуральными характеристиками на твердых средах. Совокупный уровень активностей КО выше у Р. sp. 142NF, у Rh. sp.X5 зарегистрировано i наличие невысокой активности К-1,2-0, а у штамма Rh. sp. S67 - К-2,3-0. У родококков , обнаруживаются оба фермента, обычно или один, или второй, причем количество КО может быть от двух до трех в одном штамме (Kulakov, 1998). Именно наличием определенного типа КО могут объясняться отличия в ГТСС, выраженные в предпочтении Rh. sp. Х5 и Rh. sp. S67 определенного спектра ароматических субстратов.

Влияние периодов голода и отсутствия влаги, повышенной осмолярности среды и низких положительных температур на окислительные характеристики нефтедеструкторов родов Rhodococcus и Pseudomonas

Обработка информации биосенсорного анализа динамики реакций псевдомонад и | родококков на поступление субстратов-УВН позволяет сравнивать физиологические параметры культур, непосредственно влияющие на выживаемость и конкурентоспособность бактерий в нефтезагрязненном сайте, например, уровень эндогенного дыхания клеток. Бактерии рода Rhodococcus характеризуются более высокой выживаемостью, чем псевдомонады, благодаря низкому уровню эндогенного дыхания, а также выраженной толерантности к периодам голода и отсутствия влаги. Оба штамма родококков вы- f держивали 4-х недельный период отсутствия влаги и поступления субстратов, сохраняя способность к восстановлению окислительной активности, тогда как 3 - 4 дня таких ус- [ ловий приводили к гибели пегздомонад. .

Родококки характеризуются более высокой степенью гапотолерантности (не происходит снижения интенсивности окисления субстратов различной природы в присутст- i вии 3 и 5% раствора хлорида натрия), причем уровень эндогенного дыхания клеток

увеличивается. Бактерии рода Pseudomonas, наоборот, снижая уровень эндогенного и экзо- ! генного дыхания, что может соответствовать включению системы строгого контроля, в течение 2-3 дней способны адаптироваться к повышенной осмолярности среды (ПОС). Осмотический стресс в первую очередь оказывает негативное влияние на мембранлокализован- , ную ФС биодеградации апканов Гр(-) бактерий (рис.14). Биосенсорные технологии позволяют | не только исследовать особенности воздействия ПОС на функционирование конкретных I ФС, но и осуществлять быстрый скрининг штаммов по признаку галотолерантности.

Влияние низких положительных температур на окислительные характеристики бактерий изучалось для двух наиболее активных деструкторов всех тестируемых соединений: психрофила Р. putida BS3701 и мезофила Р. chlororaphis PCL1391(pBS216). Пред- , варительный анализ показал, что оптимум функционирования ФС деградации алканов и ароматических соединений составляет 28-30°С. При понижении температуры зарегист- I рировано значительное повышение (в 3 раза) потребления бактериями кислорода, что может быть связано с большими энергозатратами клеток для поддержания гомеостаза и тем, что кислород участвует в качестве кофактора в синтезе ненасыщенных жирных

0,0? г

Ш Ц Б и

Рис. 14. Изменение окислительной активности Р. putida BS3701 в присутствии соли

кислот, образующихся в мембранах для увеличения их текучести при холодовом шоке. Анализ ПСС ФС P. putida BS3701 показал, чго дыхательная активность клеток значительно снижалась при 2-4°С по сравнению с 20°С на все тестируемые соединения, кроме нафталина (рис.15). При возвращении температурного режима к исходному (20°С), способность клеток окислять гексан и толуол восстанавливалась частично, в случае с нафталином - полностью. У родококков изменение дыхательной активности было незначительным.

При исследовании дыхательной активности мезофильного штамма P. chlororaphis PCL139!(pBS216) при 2-4°С регистрировали практически полное отсутствие процессов окисления, при смене температурного режима наблюдалась постепенная активация ФС до их частичного восстановления. Таким образом, представляется важным использовать для биоремедиации в условиях Севера не штаммы с наилучшими деградативными характеристиками, а штаммы, наиболее адаптированные к конкретным условиям.

рН-оптимум и рН-диапазон ферментных систем псевдомонад и родококков, их адаптивные изменения

Необходимо отметить, что в универсальной базе данных BRENDA (обширная база данных по всем опубликованным ферментам, ферменты классифицированы согласно рекомендациям ЕС (Enzyme Commission)) сведения по рН-оптимуму функционирования ФС деградации УВН большинства представленных псевдомонад (виды aeruginosa, butanovora, fluorescens, putida, sp.) и родококков (виды erythropolis, corallinus, sp.) практически отсутствуют. Для алкангидроксилазы (АГ) родококков их нет вовсе, что может быть связано с трудностью выделения ферментов, ассоциированных с мембраной, также необходимо учесть наличие у родококков устойчивой к разрушению клеточной стенки. Биосенсорный анализ в данном случае обеспечивает не только быстрое определение рН-оптимума и рН-диапазона функционирования мембранлокализованных ФС для культивирования нефтедеструкторов с большим выходом биомассы в условиях низкой растворимости субстратов-УВН, но и регистрацию динамики реакций микроорганизмов на колебания рН бактериального окружения, включая адаптогенные изменения.

рН-оптимум и рН-диапазон функционирования АГ определялись in vivo штаммов Р. s/?.142NF и Rh. sp.S67 (рис.16). Оптимум рН АГ P. sp. 142NF составил 7,6, диапазон широкого оптимума - 6,7-7,8 (падение величин СИСТ в этом интервале рН не превышало 20% от максимального значения). На 4 день эксперимента зафиксировано явление адаптации микроорганизмов, выраженное в расширении интервала оптимума рН до 6,1-8,2, что в 2 раза больше первоначального.

Обработка информации определения рН-оптимума и рН-диапазона АГ in vivo Гр(+) штамма Rh. sp. S67 позволила сделать вывод о том, что родококки способны к эффективному окислению алканов в более широком диапазоне (рис.16). В течение первого дня эксперимента дыхательная активность Rh. sp. S67 в отношении ундекана в диапазоне рН 5,4-8,0 изменялась не более чем на 6-9%. Через 3 дня зарегистрировано общее повышение величин ответов сенсора в диапазоне рН 6,2-8,0, причем только интервал значений

рН 5,4-5,8 не входил в диапазон широкого оптимума, через неделю зафиксировано появление ярко выраженного оптимума рН, равного 7,2, на фоне еще большего повышения интенсивности окислительных процессов. Диапазон широкого оптимума рН АГ in vivo Rh. sp. S67 на 8 день эксперимента составил 6,2-8,0, что соответствует таковому для адаптированных Р. sp. 142NF.

0,022

0,K

! 0,01 s

«5 0,816

i 0.014

u fe 0.012

ß O 0,01

0,003

n rtf.ft

I день 1 день

VjL

-т

5 ё Рн 7 8 5

Рис. 16. Изменение окислительной активности Р. sp. 142NF и Rh. sp. S67 в широком диапазоне pH (субстрат - ундекан, содержание в кювете-0,34мМ)

4. Составление и отбор ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов

Процессы деструкции органических соединений в природных условиях являются результатом действия смешанных бактериальных популяций, т.е. сообществ, для которых характерны отношения кооперации и комменсализма. Предварительный эксперимент по определению окислительных характеристик иммобилизованной в рецепторном элементе смеси культур микроорганизмов родов Rliodococcus и Pseudomonas показал, что бактерии хорошо окисляли все предложенные субстраты вследствие трофического взаимовлияния.

На основе природных штаммов (раздел 4) были составлены 4 консорциума из двух культур и 1 из четырех и проведена оценка ПСС ФС. В комбинациях Rh.sp.X5 +P.putidaBS370l и Rh.sp.S67+Р.putida ВS3701 наблюдается высокая степень кооперации - величина ответов биосенсора, отражающая катаболическую активность ассоциации, превосходила сумму величин ответов обоих штаммов в отдельности (рис. 17).

" 0,08 <

2 0.07'

а 0,06

8 0.05'

g 0.04

а 0.03

Р 0 02

° 0,01 ■

L Rh sp.S57

Л Р pulida 8S3701

fí¡S67<-BS3701

Рис. 17. Кооперативный эффект ассоциации $67+В83701: А - без хлорида натрия, Б -в присутствии хлорида натрия

0,04, i 0,035 'i

5 о.оз'

я" 0.025'

О.

S 0,02

z ,

8 0.015 : | 0,01, O 0.0051

0 ■

~lRh.S67

O P .putida BS3701

3S67+BS3701

Данные ассоциации рекомендованы в качестве наиболее эффективных для интродукции в нефтезагрязненные почвы. Зарегистрировано наличие кооперации в случае ассоциации из всех 4-х штаммов и Rh.sp.S67+P.s¡>. I42NF, а также то, что комбинация Rh.sp.X5+P. sp. 142NF не является симбиотическим сообществом.

Кооперативные эффекты в ассоциации Rh.sp. S67+P.pulida BS3701 сохраняются под влиянием экстремальных факторов (ПОС) (рис.17), что говорит о неизменности трофического взаимовлияния культур в симбиозе при изменении экологических условий. Долговременная стабильность ассоциации в присутствии хлорида натрия составила 20 дней, тогда как для очистки морских акваторий интродукцией биопрепаратов достаточно 10 суток (Коронелли Т.В.,1996). Полученные результаты могут свидетельствовать о высокой степени кооперации микроорганизмов в течение длительного времени в присутствии экстремального фактора.

ВЫВОДЫ

• Обработка информации биосенсорных систем по дыхательной активности микроорганизмов обеспечивает оперативность и надежность получаемых данных и может лежать в основе экспресс-метода характеристики биохимического поведения нефте-деструкторов и их ассоциаций, а также оценки результатов модифицирования штаммов катаболическими плазмидами. Биосенсорные системы применимы для быстрой vi комплексной оценки эффективности бактериальных препаратов и прогнозирования их полезных свойств в реальных условиях биоремедиации.

• Разработана лабораторная модель биосенсора для определения концентрации нафталина и фенантрена на основе Р. sp. 142NF(pNF142) и Р. chlororaphis PCL1391(pOV17), которая характеризуется высокой операционной стабильностью, экспрессностью измерений и низким пределом обнаружения токсичных поллютантов (330 и 25нМ соответственно).

• На эффективность деструкции УВН плазмидосодержащими бактериями оказывает влияние как катаболическая плазмида, так и бактериальный хозяин, причем две структурно аналогичные плазмиды, отличающиеся уровнем активности оксидаз, могут обуславливать различные физиолого-биохимические признаки трансконьюгантов. Сочетание бактериального хозяина Р. chlororaphis PCL1391 и катаболической плазмиды pOV17 является наилучшим из исследованных, этот штамм предложен для использования в рецепторных элементах биосенсоров для количественного анализа совокупного содержания поллютантов ароматической природы.

• Штамм Р. putida BS3701(pBSH41,pBSl 142) обладает лучшими окислительными характеристиками среди 5 плазмидосодержащих штаммов.

• Бактерии рода Rhodococcus характеризуются более высокой выживаемостью, чем псевдомонады, благодаря низкому уровню эндогенного дыхания, выраженной толерантности к периодам голода и отсутствия влаги, токсичности субстратов, повышенной осмолярности среды, низких положительных температур и колебаниям pH бактериального окружения, тогда как бактерии рода Pseudomonas способны адаптироваться к экстремальным условиям.

• Показана высокая корреляция между результатами биосенсорных исследований по определению окислительной активности природных и модифицированных штаммов и величинами удельных активностей ключевых ФС этих штаммов, определенных спектрофотометрически. Коэффициент корреляции между величинами, полученными двумя способами, равен 0,98.

• Оценен кооперативный эффект 5 составленных ассоциаций микроорганизмов при совместном окислении штаммами УВН в присутствии и без экстремального фактора. Комбинации X5+BS3701 и S67+BS3701 признаны наилучшими из исследованных. Высокая степень кооперации микроорганизмов в ассоциации S67+BS3701 сохраняется в присутствии соли.

• Показана возможность использования биосенсорных технологий для постановки длительного контролируемого экологического эксперимента в целях быстрой и качественной индукции ФС нефтедеструкторов, для экспертного анализа возможной трансформации окислительных свойств штаммов, включающего исследование жизнеспособности культур при смене доступных ростовых субстратов, связанную с этим стабильность поддержания плазмид биодеградации, а также направленность сукцес-сионных изменений в составе микробного сообщества в течение длительного времени.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты имеют практическую значимость и могут быть использованы на предприятиях по добыче и переработки нефти, в центрах государственного санитарно-эпидемиологического надзора.

Разработанную лабораторную модель биосенсора рекомендуется использовать в практике экологических исследований для прогноза и биоиндикации состояния экосистем при загрязнении нефтью и НП.

Результаты проведенных исследований рекомендованы к внедрению в учебный процесс в университетах, реализующих подготовку по специальностям «Химия», «Биология», «Экология», «Биотехнология», «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов», «Машины и оборудование природообустройства и защиты окружающей среды».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Журналы по списку ВАК

1. Лагунова Н.Л., Скачков С.А., Понаморева О.Н., Россинская И.В., Нечаева И.А., Филонов А.Е. Сравнительная оценка дыхательной активности иммобилизованных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти и их искусственных ассоциаций // Известия Тул-ГУ. Серия Химия. Вып.6,- Тула: Изд-во ТулГУ, 2006.- С.179-188.

2. Лагунова Н.Л., Скачков С.А., Понаморева О.Н., Петриков К.В., Пунтус И.Ф. Влияние хлорида натрия на дыхательную активность микроорганизмов-нефтедеструкторов Rhodococcus sp.S67 и Pseudomonas putida BS3701(pBSl 141 )(pBSl 142) и их ассоциацию // Известия ТулГУ. Серия Химия. Вып.6.- Тула: Изд-во ТулГУ, 2006,- С.165-172.

3. Лагунова Н.Л., Понаморева О.Н., Филонов А.Е., Пунтус И.Ф. Оценка влияния плазмид биодеградации нафталина на биохимическое поведение бактерий-нефтедеструкторов рода Pseudomonas с помощью биосенсорных технологий // Известия ТулГУ. Серия Естественные науки. Вып.].- Тула: Изд-во ТулГУ, 2007,- С.243-252.

4. Лагунова Н.Л. Биосенсорное определение особенностей микробного окисления алканов нормального строения с длиной цепи С6-С16II Вестник новых медицинских технологий.-Тула: Изд-во ТулГУ, 2009,- T.XVI, № 2,- С.37-39.

5. Скачков С.А., Лагунова H.JI., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Биосенсор на основе бактериального штамма-деструктора углеводородов для оценки загрязнения водных сред нефтепродуктами // Материалы TV региональной научно-практ. конференции "Современные проблемы экологии и рационального природопользования в Тульской области".- Тула: Изд-во ТулГУ, 2004,- С.116-119.

6. Скачков С.А., Лагунова Н.Л. Биосепсор на основе бактериальных штаммов-деструкторов углеводородов для оценки загрязнения водных сред нефтепродуктами // IX Международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука XXI века». Тезисы докладов.- Пу-щино, 2005,- С.363-364.

7. Лагунова НЛ., Скачков С.А., Арляпов В.А. Возможность применения микробных бно-сенсоров для анализа биохимического поведения генетически модифицированных бактерий-деструкторов углеводородов нефти II X Международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука XXI века». Тезисы докладов,- Пущнно, 2006.- С.395.

8. Скачков С.А., Петриков К.В., Дмитриева Е.Д., Лагунова Н.Л., Понаморева О.Н. Экспресс-метод характеристики штаммов-пефтедеструкторов // Материалы IV Международной научной конференции «Химия, хим. технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Том 2. Томск: Изд-во ТПУ, 2006,- С.431-433.

9. Скачков С.А., Лагунова Н.Л., Пырченкова И.А., Понаморева О.Н., Филонов А. Е. Скрининг микроорганизмов-деструкторов углеводородов для биоремедиацин территорий, загрязненных нефтью // Современные проблемы экологии и безопасности: II Всероссийская научно-техническая Интернет-конференция: сб. матер, конф. / под ред. Э.М.Соколова. -Тула: Изд-во ТулГУ, 2006,- С.13-15.

10. Лагунова Н.Л., Скачков С.А., Петриков К.В. Оценка катаболнческой активности микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти и их искусственных ассоциаций // Современные проблемы экологии: Доклады всероссийской научн.техн. конф. Книга 1/ / Под ред.чл.-корр. РАН В.П.Мешалкина.- Москва-Тула: Изд-во ТуГУ, 2006,- С.94-96.

11. Лагунова Н.Л., Понаморева О.Н., Пунтус И.Ф. Экспертный метод оценки влияния ката-болических плазмид на окислительные свойства бактерий // Материалы V съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва, 2-4 декабря 2008 г. / Под ред. Р.Г. Василова,- М.: ИАЦ, 2008,- С.87-88.

12. Лагунова НЛ., Бабкина Е.Е., Филонов А.Е. Биосенсорный анализ изменения окислительных характеристик бактерий-нефтедеструкторов под воздействием факторов различной природы // Материалы конференции X Юбилейного международного форума «Высокие технологии XXI века», 21-24 апреля 2009 г. - М.: ЗАО НПКФ «МаВР», 2009,- С.346-349.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Р. - Pseudomonas Rh. - Rhodococcus АГ - алкапгидроксилаза АИСТ - амплитуда изменения силы тока КО - катехолдиоксигеназа К-1,2-0 - катехол-1,2-диоксигеназа К-2,3-0 - катехол-2,3-диоксигеназа НК - нефтекомпоненты НП - нефтепродукты

Nah-плазмида - плазмида биодеградации нафталина

ПОС - повышенная осмолярность среды

ПСС - профиль субстратной специфичности

СИСТ - скорость изменения силы тока

УВН - углеводороды нефти

ФС - ферментные системы

ЛР № 040905 от 22 июля 1998 г. ПД № 00188 от 3 декабря 1999 г.

Формат бумаги 60x84/16. Бумага офс. Гарнитура «Times New Roman». Печать риз.

Уел. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,21. Тираж 100 экз. Заказ № 1061.

Отпечатано в ОАО «Тульский полиграфист». 300600, г. Тула, ул. Каминского, 33,

Оглавление автор диссертации — кандидата биологических наук Лагунова, Наталия Леонидовна

Список сокращений.

Введение.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Технологии защиты и очистки окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.

1.1. Нефть и нефтепродукты как наиболее распространенные и опасные загрязнители.

1.2. Методы рекультивации окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

1.2.1. Механические методы.

1.2.2. Термические методы.

1.2.3. Физико-химические методы. Применение сорбентов.

Сорбенты.

1.2.4. Микробиологические методы. Биоремедиация.

Биостимуляция (внесение удобрений, биостимуляторов, биоэмульгаторов)

Фитобиоремедиация.

Биоаугментация.

Биопрепараты.

2. Общие закономерности биодеградации углеводородов нефти.

2.1. Основные пути биодеградации нефтекомпонентов.

2.1.1. Биодеградацш алканов.

2.1.2. Биодеградация полиароматических углеводородов.

2.2. Катаболические плазмиды биодеградации. Плазмиды биодеградации нафталина.

3. Методы контроля загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами.

3.1. Стандартные (физико-химические) методы.

3.2. Биоаналитические методы.

3.2.1. Биосенсорные технологии.

3.2.2. Электрохимические микробные биосенсоры для определения нефтекомпонентов.

Введение 2009 год, диссертация по информатике, вычислительной технике и управлению, Лагунова, Наталия Леонидовна

Загрязнение окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки представляет особую опасность, что связано с большими масштабами добычи, транспортировки, переработки энергоносителей и несовершенством технологических процессов. Потери нефти только в России достигают 50 млн.т/год, из них более трети - за счет аварийных ситуаций; при переработке нефти ежегодно образуется 700 тыс.т отходов [57].

Углеводороды нефти (УВН) приводят в негодность огромные массивы сельскохозяйственных почв вследствие уменьшения их плодородия и негативных изменений в почвенном биоценозе, являются основными загрязнителями внутренних водоемов и морей, создавая различные формы загрязнения - плавающие на воде нефтяные пятна, осевшие на дно тяжелые фракции. Компоненты тяжелых фракций нефти (нафталин, фенантрен) и в особенности их метаболиты, диол- и эпоксипроизводные, представляют собой высокоактивные соединения, являющиеся канцерогенами и мутагенами [239,243], т.к. способны образовывать ковалентные связи с ДНК. Именно поэтому нефть и нефтепродукты (НП) относятся к приоритетным загрязнителям биосферы.

Перспективным способом очистки почв и вод от НП считается биоремедиация, осуществляемая путем стимуляции аборигенной микрофлоры, селекции и последующей интродукции нефтедеструкторов, фиторемедиации и биоаугментации [311]. Ведущая роль в разложении нефтекомпонентов (НК) принадлежит микроорганизмам-нефтедеструкторам родов Pseudomonas и Rhodococcus, широко распространенным в биогеоценозах и отличающихся выраженной способностью к биодеградации УВН в связи с наличием у них широкого набора ферментных систем (ФС) [143,297].

Необходимо отметить, что широкому практическому использованию микроорганизмов предшествует стадия фундаментальных исследований, направленная на изучение физиолого-биохимических свойств бактериальных клеток и закономерностей функционирования входящих в них ФС. Большинство современных исследований, в том числе биологических, основано на системном подходе к изучаемым проблемам. Обработка информации при таком подходе позволяет провести комплексное исследование проблемы микробной деградации УВН в экосистемах. С этих позиций становится возможным оценить влияние на интенсивность процессов биоокисления нефти и НП биотических и абиотических факторов: присутствия плазмид деградации, состава микробной популяции, физических и химических свойств ксенобиотиков, колебаний рН среды и температуры, высокой засоленности почв и естественной солености морских акваторий [12,221,264,320].

Для решения данных задач необходима разработка методов и алгоритмов определения метаболической активности клеток [45] и прогнозирования поведения ФС в реальных условиях. Наиболее перспективными сейчас являются методы биофизической и биохимической диагностики, в частности, биосенсорные технологии, сочетающие чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров [79,140,145,260,269]. В связи с этим представляется актуальным применить биосенсорные технологии для изучения закономерностей функционирования бактерий-деструкторов УВН и оценить влияние на эти процессы факторов различной природы.

Цель исследования: исследовать зависимость дыхательной активности микро-организмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus и их ассоциаций от эндо- и экзогенных факторов путем обработки информации биосенсорных систем для совершенствования средств оценки биокаталитических свойств микроорганизмов в условиях биоремедиации.

Задачи исследования:

• На основе сравнительного изучения профилей субстратной специфичности ФС бактериальных штаммов проанализировать влияние коньюгативных плазмид деградации нафталина (эндогенный фактор) на изменение окислительного потенциала бактериальных хозяев.

• Оценить изменение окислительной активности нефтедеструкторов p. Pseudomonas и Rhodococcus в результате воздействия факторов экзогенного характера (природы доступного субстрата, повышенной осмолярности среды, колебаний рН и влажности, низких положительных температур) для прогнозирования деградативных свойств нефтедеструкторов в условиях биоремедиации.

• Обработать информацию профилей субстратной специфичности искусственно составленных ассоциаций микроорганизмов и оценить кооперативный эффект при совместном окислении штаммами УВН в присутствии экстремального фактора и без него.

Научная новизна работы

Определено, что обработка информации биосенсорных систем может быть использована для экологического мониторинга факторов окружающей среды при оценке их воздействия на окисляющую способность бактерий-деструкторов. Впервые такой подход применен для исследования возникновения адаптаций бактериальных клеток к ряду экзогенных факторов.

Впервые показана принципиальная возможность использования биосенсорных систем для постановки длительного контролируемого экологического эксперимента, натурной концептуальной моделью которого являются иммобилизованные штаммы микроорганизмов и их ассоциации с правом выбора анализируемого фактора в качестве лимитирующего. Установлено, что обработка информации биосенсорных систем позволяет регистрировать происходящие при этом направленные сукцессионные изменения в микробоценозе и может лежать в основе метода характеристики биохимического поведения нефтедеструкторов и их ассоциаций в условиях биоремедиации.

Практическая значимость работы

Макет микробного биосенсора на основе микроорганизмов-нефтедеструкторов характеризуется экспрессностыо, высокой чувствительностью и низким пределом обнаружения токсичных поллютантов. Он может быть использован для количественного определения селективного или совокупного содержания ароматических УВ в реальных образцах посредством одновременного измерения проб двумя сенсорами, модифицированными штаммами с отличающимися окислительными характеристиками в отношении аналитов-НК. Разработанная установка может служить прототипом опытного образца прибора для серийного освоения, а также применяться в учебном процессе, что позволит усовершенствовать экспериментальную и приборную базу университетов и повысить качество образования.

Внедрение.

Работа выполнялась при поддержке грантов РФФИ 04-04-96705 «Изучение процессов окисления ксенобиотиков бактериальными штаммами на основе их дыхательной активности», 2004-2005г., 06-04096318 «Особенности механизмов биодеградации углеводородов нефти бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus», 2006г. и 08-04-99019-рофи «Изучение метаболических особенностей и генетических систем биодеградации микроорганизмов-нефтедеструкторов и разработка на их основе подходов к созданию новых биопрепаратов и технологий биоремедиации почв, загрязненных нефтью и НП», 2009-20Юг.; в рамках ФЦП "Интеграг{ия" (проект JI0145), НОЦ «Экобиотехнология» (2005-РИ-16.0/ 025/026 ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 20022006г., госконтракт 02.438.11.7021.), программы ФА по образованию «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008г.)», РНП 2.1.1.7789.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены и обсуждены на: IV Региональной научно-практической конференции «Современные проблемы экологии и рационального природопользования в Тульской области» (Тула, 2004); IX и X Международной Пу-щинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущи-но, 2005, 2006); IV Международной научной конференции «Химия, хим. технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006); II Всероссийской научно-технической Интернет-конференции «Современные проблемы экологии и безопасности» (Тула, 2006); Всероссийской научно-технической конференции «Современные проблемы экологии» (Москва-Тула, 2006); V Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2008); X Юбилейном международном форуме «Высокие технологии XXI века» (Москва 2009).

Заключение диссертация на тему "Обработка информации биосенсорных систем на основе бактерий-нефтедеструкторов"

выводы

Обработка информации биосенсорных систем по дыхательной активности микроорганизмов обеспечивает оперативность и надежность получаемых данных и может лежать в основе экспресс-метода характеристики биохимического поведения нефтедеструкторов и их ассоциаций, а также оценки результатов модифицирования штаммов катаболическими плазмидами. Биосенсорные системы применимы для быстрой и комплексной оценки эффективности бактериальных препаратов и прогнозирования их полезных свойств в реальных условиях биоремедиации. Разработана лабораторная модель биосенсора для определения концентрации нафталина и фенантрена на основе P. sp. 142NF(pNF142) и P. chlororaphis PCL1391(pOV17), которая характеризуется высокой операционной стабильностью, экспрессностью измерений и низким пределом обнаружения токсичных поллю-тантов (330 и 25нМ соответственно).

На эффективность деструкции УВН плазмидосодержащими бактериями оказывает влияние как катаболическая плазмида, так и бактериальный хозяин, причем две структурно аналогичные плазмиды, отличающиеся уровнем активности оксидаз, могут обуславливать различные физиолого-биохимические признаки трансконью-гантов. Сочетание бактериального хозяина P. chlororaphis PCL1391 и катаболиче-ской плазмиды pOV17 является наилучшим из исследованных, этот штамм предложен для использования в рецепторных элементах биосенсоров для количественного анализа совокупного содержания поллютантов ароматической природы.

Штамм P. putida BS3701(pBS1141,pBS1142) обладает лучшими окислительными характеристиками среди 5 плазмидосодержащих штаммов.

Бактерии рода Rhodococcus характеризуются более высокой выживаемостью, чем псевдомонады, благодаря низкому уровню эндогенного дыхания, выраженной толерантности к периодам голода и отсутствия влаги, токсичности субстратов, повышенной осмолярности среды, низких положительных температур и колебаниям рН бактериального окружения, тогда как бактерии рода Pseudomonas способны адаптироваться к экстремальным условиям.

Показана высокая корреляция между результатами биосенсорных исследований по определению окислительной активности природных и модифицированных штаммов и величинами удельных активностей ключевых ФС этих штаммов, определенных спектрофотометрически. Коэффициент корреляции между величинами, полученными двумя способами, равен 0,98.

• Показана возможность использования биосенсорных технологий для постановки длительного контролируемого экологического эксперимента в целях быстрой и качественной индукции ФС нефтедеструкторов, для экспертного анализа возможной трансформации окислительных свойств штаммов, включающего исследование жизнеспособности культур при смене доступных ростовых субстратов, связанную с этим стабильность поддержания плазмид биодеградации, а также направленность сукцессионных изменений в составе микробного сообщества в течение длительного времени.

Заключение.

Получены профили субстратной специфичности пяти искусственно составленных ассоциаций микроорганизмов и оценен кооперативный эффект при совместном окислении штаммами УВН в присутствии экстремального фактора и без него.

Комбинации Rh. sp. Х5+Р. putida BS3701 и Rh. sp. S67 +P. putida BS3701 признаны наилучшими из исследованных. Высокая степень кооперации микроорганизмов в ассоциации Rh. sp. S67+P. putida BS3701 сохраняется в присутствии соли. Ассоциация была жизнеспособна и давала стабильные ответы на субстраты-УВН в присутствии 3% раствора хлорида натрия в течение 20 дней. В ассоциации зарегистрированы направленные сукцессионные изменения, выраженные в колебании численности Р. putida BS3701(pBS1141,pBS1142). Таким образом, биосенсорные технологии возможно применить для экспертного анализа эффективности бактериальных препаратов и прогнозирования их полезных свойств в реальных условиях биоремедиации.

Библиография Лагунова, Наталия Леонидовна, диссертация по теме Системный анализ, управление и обработка информации (по отраслям)

1. Адаптивные реакции микроорганизмов. Режим доступа http://vet-fak.nsau.edu.ru/new/microbiology/stu/bacter/ecologia/adaptmo.htm.

2. Акатова Е.В., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г., Сахаровский В.Г. Деградация нафталина в условиях высокой солености среды сообществом микроорганизмов. Мат.конф. Режим доступа http://bioscience.ru/Conference/Ecology 2004/Biotex.

3. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды / Под ред. Л.Г.Подуновой. М.: Фед.центр Госсанэпиднадзора Минздрава РФ. 1999. 107с.

4. Арзамасцев А.А. Скорость эндогенного дыхания клеток Pseudomonas II Микробиология. 1988. Т.57. Вып.6. С.977-982.

5. Арляпов В.А. Применение низкоселективных биосенсоров для определения биохимического потребления кислорода и селективного анализа многокомпонентных смесей. Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2009. 189 с.

6. Аушева Х.А. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок. Автореф. канд. тех. наук. Москва. 2007. 21 с.

7. Ахметов Л.И. Роль горизонтального переноса плазмид биодеградации в микробной деструкции полициклических ароматических углеводородов. Автореф. канд. биол. наук. Пущино. 2006. 22 с.

8. Ахметов Л.И., Иванова У.С., Пунтус И.Ф., Есикова Т.З. с соавт. Горизонтальный перенос плазмиды биодеградации нафталина в процессе микробной деструкции дизельного топлива и нефти в открытом проточном биореакторе. Биотехнология. 2006. № 4. С.79-86.

9. Ю.Балашова Н.В., Кошелева И.А., Филонов А.Е. с соавт. Штамм Pseudomonas putida BS3701 деструктор фенантрена и нафталина // Микробиология. 1997. Т.66. С.488-493.

10. П.Барышникова Л.М., Аминов Р.И., Окороков J1.A., Головлев E.JI. Транспорт глюкозы и кинетика роста Rhodococcus minimus. Микробиология. 1985. Т.54. Вып.6. С.905-909.

11. Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах // Прикл. био-хим. и микробиол. 2004. Т.40. № 3. С.312-316.

12. Берман С.С., Соколова И.М., Матвеева И.А., Петров А.А. О составе насыщенных углеводородов фракции 150-175°С нефтей парафинового основания // Нефтехимия. Т.24. 1984. №6. С.743-747.

13. Борисов И.А. Лобанов А.В., Решетилов А.Н., Курганов Б.И. Количественный анализ калибровочных зависимостей биосенсоров // Прикл. биохим. и микробиол. 2000. Т.36. № 3. С.256-262.

14. Воронин A.M. Биология плазмид // Успехи микробиологии. 1983. Вып. 18. С.143-163.

15. Булатов А.И., Макаренко П.П., Шеметов В.Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности. М.: Недра, 1997. 483с.

16. Бутаев A.M., Кабыш Н.Ф. О роли углеводородокисляющих микроорганизмов в процессах самоочищения прибрежных вод Дагестанского побережья Каспийского моря от нефтяного загрязнения // Вестник Дагестанского Науч. Центра РАН. 2002. №11. С.24-36.

17. Буткова О.Л., Гончаров А.И. Содержание нефтепродуктов индикатор качества подземных и поверхностных вод//Партнеры и конкуренты. 2001. №1. С.32-35.

18. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.гФаир-Пресс. 1999. 720 с.

19. Варфоломеев С.Д., Евдокимов Ю.М., Островский М.А. Сенсорная биология, сенсорные технологии и создание новых органов чувств человека // Вестник российской академии наук. 2000. Т.70. № 2. С.99-108.

20. Ветрова А.А., Нечаева И.А., Игнатова А.А., Пунтус И.Ф., Аринбасаров М.У. с соавт. Влияние катаболических плазмид на физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas и эффективность биодеструкции нефти // Микробиология. 2007. Т.76. №3. С.310-316.

21. Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Филонов А.Е., Пунтус И.Ф., Воронин A.M. Деструкция нефти бактериями рода Pseudomonas, содержащими различные плазмиды биодеградации // Известия ТулГУ. Естественные науки. Тула: Изд-во ТулГУ. 2008. Вып. 2. С.200-207.

22. Волкова О.В., Анохина Т.О., Пунтус И.В., Кочетков В.В. с соавт. Влияние плазмид биодеградации нафталина на физиологические характеристики ризосферных бактерий рода Pseudomonas II Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т.41. №5. С.525-529.

23. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.:Мир. 2002. С.127-128.

24. Гузев B.C., Халимов Е.М., Волде М.И., Куличевская И.С. Регуляторный эффект глюкозы на углеводородокисляющие микроорганизмы почвы // Микробиология. 1997. Т.66. №2. С.154-159.

25. Демидиенко А .Я., Демурджан В.М. Пути восстановления нефтезагрязненных почв черноземной зоны Украины // Восст. нефтезаг. почв, экосистем. М.:Наука, 1988. С.197-206.

26. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. Пер. с нем. М.: Мир. 1994. 268 е., ил.

27. Дорохова Е.Н., Прохорова Г.В. Задачи и вопросы по аналитической химии. М.: Мир. 2001. 267с., ил.

28. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. Практическое руководство. СПб. 2000. 248с.

29. Иванова Е.С., Есикова Т.З., Гафаров А.Б., Шкидченко А.Н. Мониторинг ин-тродуцированных микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытых системах // Биотехнология. 2006. № 3. С.74-78.

30. Игнатова А.А., Ветрова А.А., Лисов А.В., Филонов А.Е. с соавт. Динамика численности и взаимодействие псевдомонад, стимулирующих рост растений и разрушающих нафталин в ризосфере горчицы белой // Биотехнология. 2006. №6. С.35-43.

31. Исмаилов Н.М., Ахмедов А.Г., Ахмедов В.А. Рекультивация нефтезагрязнен-ных земель сухих субтропиков Азербайджана // Восст. нефтезаг. почв, экосистем. М.:Наука. 1988. С.206-221.

32. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Автореф. д-ра биол. наук. СПб. 1996. 25 с.

33. Китова А.Е., Кувичкина Т.Н. с соавт. Биосенсор реакторного типа на основе клеток Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 для определения 2,4-динитрофенола // Прикл. биохим. и микробиол. 2002. Т.5. №38. С.585-590.

34. Кобзев Е.Н. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов микробными ассоциациями в модельных системах. Дисс. канд. биол. наук. Оболенск. 2002. 179 с.

35. Колпакова С.Д., Колпакова Г.А. Исследование особенностей динамики развития бактериальной популяции в условиях слабого стационарного магнитного поля //

36. Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. Самара: Изд-во СамГУ. 2005. №5(39). С.179-187.

37. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т.32. Вып.6. С.579-585.

38. Кочетков В.В. Плазмиды биодеградации нафталина у бактерий рода Pseudomonas. Дисс. канд. биол. наук. Пущино. 1985. 145 с.

39. Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Научные основы экобиотехнологии. М.:Мир. 2006. 504 е., ил.

40. Кузнецов Б.А., Хлупова М.Е., Шлеев С.В. с соавт. Электрохимический метод измерения метаболической активности и количества клеток // Прикл. биохим. и микробиол. 2006. Т.42. № 5. С.599-608.

41. Левчук А.А., Булыга И.М., Измалкова Т.Ю., Севастьянович Я.Р., Кошелева И.А., с соавт. Характеристика Nah-плазмид группы 1псР-9 природных штаммов Pseudomonas И Молекулярная биология. 2006. №5. С.835-843.

42. Макаренко А.А. Биосенсоры для детекции сульфоароматических и феноль-ных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas деструкторов л-толуолсульфоната и фенола. Автореф. канд. биол. наук. Саратов. 2007. 24 с.

43. Маркарова М.Ю. Использование углеводородокисляющих бактерий для восстановления нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего севера // Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. 1987. 157с.

44. Месяц С.П. Восстановление нарушенных земель при освоении газовых месторождений Севера // Тезисы докладов III Межд. конференции "Освоение Севера и проблемы рекультивации". Сыктывкар, 1996. С.41-42.

45. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С. с соавт. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий нефтяных месторождений Татарстана // Микробиология. 1998. Т.67. С.208-214.

46. Мусаев И.А., Курашова Э.Х., Симанюк Р.Н., с соавт. Исследование углеводородов западносибирской нефти // Нефтехимия. Т.25. 1985. №3. С.315-321.

47. Оборин А.А., Калачникова И.Г., Масливец Т.А., Базенкова Е.И. с соавт. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таёжной зоны // Восст. нефтезагр. почв, экосистем. М.:Наука, 1988. С.140-159.

48. Общая токсикология / Под ред. А.О.Лойта. СПб.: ЭЛБИ-СПб. 2006. 224с.

49. Основные методики определения концентраций масел и нефтепродуктов в воде. Режим доступа http://www.prpc.ru/actual/south/examinat.

50. Пат. RU 2111246, С1, МКИ 6 C12N1/20. Дербышев В.В., Глухов Н.Н., Клыков С.П. и др. Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов. Опубл. 1998.05.20.

51. Пат. RU 2292391, С2 МПК C12N1/20 Воробьев А.В., Руднева О.А., Марченко С.А. и др. Штамм бактерий Pseudomonas putida, используемый для очистки почв,грунтовых и поверхностных вод от тринитротолуола. Опубл. 2007.01.27.

52. Пат. RU 2312891, С1, МПК C12N1/20. Филонов А.Е., Кошелева И.А., Шкид-ченко А.Н., Пырченкова И.А. и др. Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде. Опубл. 2007.12.20.

53. Петров А.А. Химия алканов. М., 1986. 394 с.

54. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. М.: Изд-во МГУ. 1993. 182 с.

55. Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н., Турковская О.В. Получение нефтеокис-ляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т.41. №6. С.634-639.

56. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Кошелева И.А., Пунтус И.Ф., с соавт. Бактерии деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология. 2001. Т.70. №1. С.61-69.

57. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Демаков В.А. Штамм бактерий Rhodococcus ruber деструктор полихлорированных бифенилов. Патент № 2262531. Опубликован 20.10.2005 г.

58. Понаморева О.Н., Алферов В.А. с соавт. Количественное определение крахмала в муке с помощью микробного сенсора // Известия ТулГУ. Тула: Изд-во ТулГУ. 2004. №4. С.112-119.

59. Попов Е.И., Амбросов В.А. Применение культивирования с подпиткой субстратом для оптимизации роста E.coli НВ 1100 продуцента рестриктазы. В кн.: Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов, ч. 2. Киев:Наукова думка. 1981.335с.

60. Применение ГХ-МС в национальных лабораториях. Режим доступа http://www.disbak.ru/php/content.

61. Пурмаль А.П. Антропогенная токсикация планеты // Соросовский образовательный журнал. 1998. №9. С.39-51.

62. Пырченкова И.А., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Воронин A.M. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикл. биохим. и микробиол. 2006. Т.42. № 3. С.298-305.

63. Рабкина Е.В. Поверхностный метод сбора нефти из вод со льдом // Сборник тез. докл. междунар. конф. "Новые технологии для очистки нефтезагрязнённых вод, почв, переработки и утилизации нефтешламов". 10-11 декабря 2001г., г.Москва. С.48-49.

64. Рафикова Г.Ф., Григориади А.С. Экология и деструкционная активность микроорганизмов, окисляющих углеводороды нефти // Сборник тезисов III Межд. молод, школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». 22-23 ноября 2007г, Москва. 147с.

65. Решетилов А.Н. Биосенсоры в России: монография / А.Н. Решетилов, В.А. Алферов, Т.А. Решетилова, О.Н. Понаморева. Тула: Изд-во ТулГУ. 2007. 111с.

66. Решетилов А.Н. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для экологического мониторинга и контроля биотехнологических процессов // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т.41. №5. С.504-513.

67. Рождественский Ю.Ф., Сарапульцев И.Е. О применении взрывов в качестве метода рекультивации залитых нефтью болот в ПО "Ноябрьскнефтегазгеология" //

68. Тезисы докладов III Межд. конференции "Освоение Севера и проблемы рекультивации". Сыктывкар, 1996. С.34-35.

69. Российская И.В. Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов е-капролактама и их применение для экологического контроля и биотехнологических исследований. Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2008. 127 с.

70. Российская И.В., Есикова Т.З., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н. Биосенсорная оценка катаболической активности штаммов-деструкторов s-капролактама с различными сочетаниями «САР-плазмида бактериальный хозяин» // Биотехнология. 2008. № 4. С.44-47.

71. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. СПб: Изд-во СПбГТУ. 2002.

72. Семенчук И.Н., Таранова Л.А. с соавт. Влияние различных способов иммобилизации на стабильность микробного биосенсора на основе Pseudomonas rathonis Т при детекции поверхностно-активных веществ // Прикл. биохим. и микробиол. 2000. Т.36. №1. С.80-84.

73. Современная микробиология. Прокариоты. В 2-х томах: Пер.с англ./ Под ред. Й.Ленгелера, Г.Древса, Г.Шлегеля. М.:Мир. 2005. 1152 с.

74. Содержание нефтяных углеводородов и других загрязняющих веществ в водах Черного и Печорского морей. 1999-2003гг. Режим доступа http://esimo.oceanog-raphy.ru/esp2/index/index/espid/5/sectionid/8/menuid/4.

75. Соловьев В.И., Кожанова Г.А., Гудзенко Т.В. с соавт. Биоремедиация как основа восстановления нефтезагрязненных почв // Проблемы сбора, переработки и утилизации отходов: сб.науч.статей. ОдессаЮЦНТЭИ. 2001. С.339-345.

76. Справочник химика / Под ред. Грива З.И., Коц В.А., Пиастро В.Д. Т.2. 1167с.

77. Стабликова Е.В., Селезнева М.В., Дульгенов А.Н. Иванов В.Н. Применение препарата "Лестран" для очистки почвы от углеводородов нефти // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т.32. №2. С.219-223.

78. Тарасович Ю.И. Природные сорбенты в процессах очистки воды. Киев: Нау-кова думка. 1987. 286 с.

79. Телеграф информационного интернет-издания «Вокруг света». Режим доступа http://vmw.vokrugsveta.rU/print/telegraph/theory/5 86/.

80. Технологии восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Справочник. М.:РЭФИА. 2001. 185 с.

81. Титок М.А. Плазмиды грамположительных бактерий. Автореф. докт. биол. наук. Минск. 2004. 36 с.

82. Турковская О.В, Дмитриева Т.В., Муратова А.Ю. Штамм Pseudomonas aeruginosa продуцент биоПАВ // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. Т.37. №1. С.80-85.

83. Филонов А. Е., Ахметов JI. И., Пунтус И. Ф., Есикова Т. 3. с соавт. Конструирование и мониторинг маркированных плазмидосодержащих штаммов-деструкторов нафталина в почве // Микробиология. 2005. Т.74. № 4. С.526-532.

84. Филонов А.Е., Кошелева И.А., Самойленко В.А., Шкидченко А.Н. и др. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения. Заявка №2007125403 о выдаче патента РФ на изобретение, 05.07.2007.

85. Филонов А.Е., Нечаева И.А., Гафаров А.Б., Аринбасаров М.У. с соавт. Биодеградация нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами и ее адсорбция растительным сорбентом в жидкой минеральной среде // Биотехнология. 2007. №2. С.31-39.

86. Фомин С. Вода. Контроль химической, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам. Энциклопед. спр. Зе изд. М. 2000. 840с.

87. Холоденко В.П., Чугунов В.А., Жиглецова С.К., Родин В.Б. с соавт. Разработка биотехнологических методов ликвидации нефтяных загрязнений окружающей среды//Рос. Хим. Ж. 2001. T.XLV. С.135-141.

88. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А., Нетрусов А.И. Микроорганизмы продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение //

89. Прикл. биохим. и микробиол. 2006. Т.42. №2. С.133-143.

90. Штруппе Х.Г., Янке X., Дойч К., Грунов С. Общая физико-химическая характеристика и структурно-групповой углеводородный состав вакуумного газойля (350-540°С) промышленной западносибирской нефти // Нефтехимия. Т.27. 1987. №1. С.3-12.

91. Экологические катастрофы. Режим доступа http://www.rosbalt.ru/.

92. Ягафарова Г.Г. Разработка биотехнологии очистки воды и почвы от некоторых хлорорганических соединений и углеводородов нефти. Дисс. д-ра техн. наук. Уфа. 1994. 258с.

93. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.И. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis II Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т.32. №2. С.224-227.

94. Янкевич М.И., Хадеева В.В. с соавт. Комплексная биотехнология очистки воды промышленных предприятий от нефтезагрязнений // Тез. докл. III Междунар. конф. "Освоение Севера и проблемы рекультивации". Сыктывкар, 1996. С.234-235.

95. Abed R.M.M., Safi N.M.D., Koster J., deBeer К., etc. Microbial diversity of a heavily polluted microbial mat and its community changes following degradation of petroleum compounds // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V.68. P.1674-1683.

96. Alexander M. Biodegradation and bioremediation. 2nd ed. Academic Press, London. 1999. 134p.

97. Alkorta I., Garbisu C. Phytoremediation of organic contaminants in soils // Bio-res. Technol. 2001. V.79. P.273-276.

98. Annweiler E., Materna A., Safmowski M., Kappler A., etc. Anaerobic degradation of 2-methylnaphthalene by a sulfate-reducing enrichment culture // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P.5329-5333.

99. Anokhina Т.О., Volkova O.V., Puntus I.F., Filonov A.E., V.V. Kochetkov, etc. Plant growth-promoting Pseudomonas bearing catabolic plasmids: naphthalene degradation and effect on plants // Process Biochemistry. 2006. V.41. P.2417-2423.

100. Aronstein B.N., Alexander M. Surfactants at low concentrations stimulate biodeg-radation of sorbed hydrocarbons in samples of aquifer sands and soil slurries // Environ. Toxicol. Chemistry 1992. V.ll. №9. P.1227-1233.

101. Atlas R.M. Bioremediation of petroleum pollutants // Int. Biodet. Biodeg. 1995. V.35.P.317-327.

102. Beam H.W., Perry J J. Microbial degradation and assimilation of n-alkyl-substituted cycloparaffms // J. Bacteriol. 1974. V.118. №2. P.394-399.

103. Beyersdorf-Radeck В., Riedel K., Karlson U., Bachmann T.T., etc. Screening of xenobiotic compounds degrading microorganisms using biosensor techniques // Microbiol. Res. 1998. V.153. №3. P.239-245.

104. Bhushan В., Halasz A., Spain J.C., etc. Initial reaction(s) in biotransformation of CL-20 is catalyzed by salicylate 1-monooxygenase from Pseudomonas sp. strain ATCC 29352 // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. P.4040-4047.

105. Biocatalysis/Biodegradation Database: Microbial biocatalytic reactions and biodegradation pathways primarily for xenobiotic, chemical compounds. University of Minnesota. Режим доступа http://umbbd.msi.umn.edu/.

106. Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria // Current Opinion Plant Biol. 2001.V.4. № 4. P.343-350.

107. Bogardt A.H., Hemmingsen B.B. Enumeration of phenantrene degrading bacteria by an overlayer technique and its use in evaluation of petroleum contaminated sites // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. №8. P.2579-2582.

108. Booth I.R., Jones M.A., NcLaggan D., Nikolaev Y., Ness L., etc. Bacterial ion channels. In eds: Konings W.N.,etc. / Handbook of biological physics. Amsterdam:Elsevier. V.2. P.693-729.

109. Boronin A.M., Filonov A.E., Gayazov R.R., Kulakova A.N., etc. Growth and plasmid-encoded naphthalene catabolism of Pseudomonas putida in batch culture // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V.113. P.303-308.

110. Bosch R., Garcia-Valdes E., Moore E.R.B. Complete nucleotide sequence and evolutionary significance of a chromosomally encoded naphthalene degradation lower pathway from Pseudomonas stutzeri AN10 // Gene. 2000. V.245. P.65-74.

111. Bosch R., Garcia-Valdes E., Moore E.R.B. Genetic characterization and evolutionary implications of a chromosomally encoded naphthalene degradation upper pathway from Pseudomonas stutzeri AN10 // Gene. 1999. V.236. P.149-157.

112. Bredford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantity of protein utilizing the principle of proteindye binding // Ann. Biochem. 1976. V.72. P.248-254.

113. BRENDA: The Comprehensive Enzyme Information System. Режим доступа http://www.brenda-enzymes.info/.

114. Brucheim P., Bredholt H., Eimhjellen K. Bacterial degradation of emulsified crude oil and the effect of various surfactants // Can. J. Microbiol. 1997. V.43. №1. P. 17-22.

115. Bruheim P., Eimhjellen K. Chemically emulsified crude oil as substrate for bacterial oxidation: differences in species response // Can. J. Microbiol. 1998. V.44. №2. P. 195199.

116. Burd G., Ward O.P. Involvement of a surface-active high molecular weght factor in degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas marginalis // Can. J. Microbiol. 1996. V.42. №8. P.791-797.

117. Candidus S., VanPee K.H., Lingens F. The catechol 2,3-dioxygenase gene of Rhodococcus rhodochrous CTM nucleotide sequence, comparison with isofunctional dioxygenases and evidence for anactive-site histidine // Microbiology. 1994. V.140. P.321-330.

118. Canosa I., Sanchez-Romero J.M., Yuste L., Rojo F. A positive feedback mechanism controls expression of AlkS, the transcriptional regulator of the Pseudomonas oleo-vorans alkane degradation pathway // Mol. Microbiol. 2000. V.35. P.791-799.

119. Carmichael L.M., Pfaender F.K. Polynuclear aromatic hydrocarbon metabolism in soils: relationship to soil characteristics and preexposure // Environ. Toxicol. Chem. 1997. V. 16. №4. P.666-675.

120. Cavalca L., Dell'Amico E., Andreoni V. Intrinsic bioremediability of an aromatic hydrocarbon-polluted groundwater: diversity of bacterial population and toluene monoxy-genasegenes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V.64. V.576-587.

121. Chang B.V., Chang I., Yuan S. Anaerobic degradation of phenanthrene and pyrene in mangrove sediment // Bull, of Environ. Contam. and Toxic. 2008. V.80. №2. P.145-149.

122. Chang S., Jang J.K., Gil G.C., Kim M., etc. Continuous determination of biochemical oxygen demand using microbial fuel cell type biosensor // Biosensors & Bioelec-tronics. 2004. V.19. №6. P.607-613.

123. Chee G.J., Nomura Y., Karube I. Biosensor for the estimation of low biochemical oxygen demand // Analytica Chimica Acta. 1999. V.379. P. 185-191.

124. Chen C.I., Taylor R.T. Thermophyllic biodegradation of BTEX by two consortia of anaerobic bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V.48. №1. P.121-128.

125. Compant S., Duffy В., Nowak J., etc. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V.71. № 9. P.4951-4959.

126. D'Souza S.F. Microbial biosensors // Biosensors & Bioelectronics. 2001. V.16. P.337-353.

127. Daane L.L., Harjono I., Zylstra G.J., Haggblom M.M. Isolation and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria associated with the rhizosphere of salt marsh plants // Appl. Env. Microbiol. 2001. V.67. № 6. P.2683-2691.

128. De Bont J.A.M. Solvent-tolerant bacteria in biocatalysis // Trends Biotechnol. 1998. V.16.P.493-499.

129. Delille D., Pelletier E., Delille В., Coulon F. Effect of nutrient enrichments on the bacterial assemblage of Antarctic soils contaminated by diesel or crude oil // Polar. Record 2003. Y.39. №4. P.309-318.

130. Dennis J., Zylstra G. Complete sequence and genetic organization of pDTGl, the 83 kilobase naphthalene degradation plasmid from Pseudomonas putida strain NCIB 9816-4 II J. Mol. Biology. 2004. V. 341. №3. P.753-768.

131. Denome S.A., Stanley D.C., Olson E.S., Young K.D. Metabolism of dibenzothio-phene and naphthalene in Pseudomonas strains: complete DNA sequence of an upper naphthalene catabolic pathway 11 J. Bacteriol. 1993. V.175. P.6890-6901.

132. Desomer J., Vereecke D., Crespi M., Van Montagu M. The plasmid-encoded chloramphenicol-resistance protein of Rhodococcus fascians is homologous to the transmembrane efflux proteins // Mol. Microbiol. 1992. V.6. P.2377-2385.

133. Dobbelaere S., Vanderleyden J., Okon Y. Plant growth-promoting effects of di-azotrophs in the rhizosphere // Crit. Rev. Plant Sci. 2003. V.22. P. 107-149.

134. Dua R.D., Meera S. Purification and characterization of naphthalene oxygenase from Corynebacterium renale II Eur. J. Biochem. 1981. V.120. P.461-465.

135. Duncan K., Levetin E., Wells H., Jennings E., etc. Managet bioremediation of soil contaminated with crude oil. Soil chemistry and microbial ecology three years later // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V.63. P.879-889.

136. Dunn N.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida // J. Bacteriol. 1973. V.l 14. P.974-979.

137. Duque E., Segura A., Mosqueda G., Ramos J.L. Global and cognate regulators control the expression of the organic solvent efflux pumps TtgABC and TtgDEF of Pseudomonas putida II Mol. Microbiol. 2001. V.39. P.l 100-1106.

138. Ensley B.D., Gibson D.T. Naphthalene dioxygenase: purification and properties of a terminal oxygenase component // J. Bacteriol. 1983. V.155. P.505-511.

139. Ensley B.D., Haigler E.B. Naphthalene dioxygenase from Pseudomonas NCIB 9816 //Methods Enzymol. 1990. V.188. P.46-52.

140. Eulberg D., Golovleva L.A., Schlomann M. Characterization of catechol catabolic genes from Rhodococcus erythropolis 1CP // J. Bacteriol. 1997. V.179. P.370-381.

141. Evans C., Herbert D., Tempest D. The continiuous cultivation of microorganisms // Methods in Microbiology. 1970. V.2. № 4. P.277-327.

142. Fan S., Scow K.M. Biodegradation of trichloroethylene and toluene by indigenous microbial populations in soil // Appl: Environ. Microbiol. 1993. V.59. №6. P.1911-1918.

143. Flyvbjerg J., Jorgensen C., Arvin E., Jensen В., Olsen S.K. Biodegradation of or-tho-cresol by a mixed culture of nitrate-reducing bacteria on toluene growing // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. №7. P.2286-2292.

144. Fuenmayor S.L., Wild M., Boyes A.L., Williams P.A. A gene cluster encoding steps in conversion of naphthalene to gentisate in Pseudomonas sp. strain U2 // J. Bacteriol. 1998. V.180. P.2522-2530.

145. Fukumori F., Hirayama H., Takami H., Inoue A., Horikoshi Y. Isolation and transposon mutagenesis of a Pseudomonas putida KT2442 toluene-resistant variant: involvement of an efflux system in solvent resistance // Extremophiles. 1998. V.2. P.395-400.

146. Furtado M.A.L. The effect of a syntetic surfactant on the rate of degradation of a model petroleum in marine enviroments // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1996. V.37. №1. P. 122-125.

147. Galinski E.A., Truper H.G. Microbial behavior in salt-stressed ecosystems // FEMS Microbiol. Rev. 1994. V.15. P.95-108.

148. Gao Y., Zhu L. Plant uptake, accumulation and translocation of phenanthrene and pyrene in soils // Chemosphere. 2004. V.55. P.l 169-1178.

149. Geerdinc M.J., van Loosdrecht M.C.M., Luyben K.C.A.M. Model for microbial degradation of nonpolar organic contaminants in a soil slurry reactor // Environ. Sci. Tech-nol. 1996. V.30. №3. P.779-786.

150. Ghosh B.B., Banerjee A.K. Hydrocarbon utilization by Aeromonas, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia and Serratia spp II Curr. Sci. 1983. V.51. №22. P. 1072-1075.

151. Gibson D.T., Resnick S.M., Lee K., Brand J.M., Torok D.S., etc. Desaturation, dioxygenation, and monooxygenation reactions catalyzed by naphthalane dioxygenase from Pseudomonas sp. strain 9816-4 // J. Bacteriol. 1995. V.177. P.2615-2621.

152. Golovleva L.A., Aharonson N., Greenhaigh R., Sethunathan N., Vonk J.W. The role and limitations of microorganisms in the conversion of xenobiotics // Pure and Appl. Chem. 1990. V. 62. №2. P.351-364.

153. Grant W.D., Mwatha W.E. Bacteria from alkaline, saline environments. In: Hat-tori Т., Ishida Y., Maruyama Y., Morita R.Y., and Uchida A. (ed.) Recent advances in microbial ecology. Tokyo:Scient. Societ. Press. 1989. P.64-67.

154. Griffith G.R., Ruettinger R.T., McKenna E.J., Coon M.J. Fatty acid omega-hydroxylase (alkane hydroxylase) from Pseudomonas oleovorans II Methods Enzymol. 1978. V.53.P.356-360.

155. Grund E., Denecke В., Eichenlaub R. Naphthalene degradation via salicylate and genetisate by Rhodococcus sp. strain B4 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P.1874-1877.

156. Guerin W.F., Boyd S.A. Maintenance and induction of naphthalene degradation activity in Pseudomonas putida and an Alcaligenes sp. under different culture conditions // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. №11. P.4061-4068.

157. Gulensoy N., Alvarez P.J. Diversity and correlation of specific aromatic hydrocarbon biodegradation capabilities // Biodegradation. 1999. V.10. P.331-340.

158. Haigler B.E., Gibson D.T. Purification and properties of NADH-ferredoxinNAP reductase, a component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816 //J. Bacteriol. 1990. V.172. P.457-464.

159. Hamamura N., Yeager C.M., Arp D.J. Two distinct monooxygenases for alkane oxidation in Nocardiodes sp. strain CF8 // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. №11. P.4992-4998.

160. Hanrahan G., Patil D.G., Wang J. Electrochemical sensors for environmental monitoring: design, development and applications // J. Environ. Monit. 2004. V.6. №8. P.657-664.

161. Harder H., Kurzelseidel В., Hopner T. Hydrocarbons biodegradation in sediments and soils. Systematic examination of physical and chemical conditions // Erdol & Kohle Erdgas Petrochem. 1991. V.44. №2. P.59-62.

162. Hart S. In situ bioremediation: defining the limites // Environ. Sci. Technol. 1996. V.30. № 9. P.398-401.

163. Heipieper H.J., Weber F.J., Sikkema J., Keweloh H., de Bont J.A.M. Mechanisms of resistance of whole cells to toxic organic solvents // Trends Biotechnol. 1994. V.12. P.406-416.

164. Heiser D. Bioremediation of petroleum pollutants in cold environments // Restoration and Reclamation Review. On-Line Jour. 1999. V.5. Режим доступа ("http://hoticul-ture.cfans.umn.edu/vd/h5015/99fpapers/heiser.htm.

165. Hill K.E., Top E.M. Gene transfer in soil systems using microcosms // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 25. P.319-329.

166. Hubert C., Shen Y., Voordouw G. Composition of toluene-degrading communities from soil at different concentration of toluene // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. №7. P.3064-3070.

167. Ishige Т., Tani A., Sakai Y., Kato N. Long-chain aldehyde dehydrogenase that participates in n-alkane utilization and wax ester synthesis in Acinetobacter sp. strain M-l // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P.3481-3486.

168. Isken S., de Bont J.A.M. The solvent efflux system of Pseudomonas putida S12 is not involved in antibiotic resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V.54. P.711-714.

169. Issakov D.A., Iossel J.Y., Sakson V.M., Kazarov G.S., etc. Cleaning capillary/ porous media of oil and petroleum product contamination. Patent № 9802600, 22.01.98.

170. Jeffrey A.M., Yeh H.J., Jerina D.M., Patel T.R., etc. Initial reactions in the oxidation of naphthalene by Pseudomonas putida И Biochemistry. 1975. V.14. P.575-584.

171. Junker F., Ramos J.L. Involvement of the cis/trans isomerase Cti in solvent resistance of Pseudomonas putida DOT-TIE // J. Bacteriol. 1999. V.181. P.5693-5700.

172. Kamin H., White-Stevens R.H., Presswood R.P. Salicylate hydroxylase // Methods Enzymol. 1978. V.53. P.527-543.

173. Kampfer P., Steiof M., Becker P.M., Dott W. Characterization of chemohetero-trophic bacteria associated with the in situ bioremediation of a waste oil contaminated site // Microbial Ecoiogy. 1993. V.26. P.161-188.

174. Kaplan C.W., Kitts C.L. Bacterial succession in a petroleum land treatment unit // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. №3. P. 1777-1786.

175. Kato C., Inoue A., Horikoshi K. Isolating and characterizing deep-sea marine microorganisms // Trends Biotechnol. 1996. V.14. № 1. P.6-12.

176. Keren Embar K., Forgacs H., Sivan A. The effect of hydrophobic aggregates on the bioremediation of crude oil in soil // 12th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium. July 14-18, Prague. 2002. P.42.

177. Kerry E. Bioremediation of experimental petroleum spills on mineral soils in the Vestfold Hills, Antarctica // Polar Biology. 1993. V.13. №3. P. 163-170.

178. Kieboom J., Dennis J J., de Bont J. A.M., Zylstra G.J. Identification and molecular characterization of an efflux pump involved in Pseudomonas putida S12 solvent tolerance // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.85-91.

179. Rniemeyer O., Heider J. Ethylbenzene dehydrogenase, a novel hydrocarbon-oxidizing molybdenum/iron-sulfur/heme enzyme // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.21381-21386.

180. Kostal J., Suchanek M., Klierova H., K. Demnerova, etc. Pseudomonas C12B, an SDS degrading strain, harbours a plasmid coding for degradation of medium chain length n-alkanes // Int. Biodet. Biodeg. 1998. V.42. P.221-228.

181. Kulakov L.A, Larkin M.J., Kulakova A.N. Cryptic plasmid pKA22 isolated from the naphthalene degrading derivative of Rhodococcus rhodochrous NCIMB13064 // Plasmid, 1997. V.38. P.61-69.

182. Kulakov L.A., Delcroix V.A., Larkin M.J., Ksenzenko V.N. Cloning of new Rhodococcus extradiol dioxygenase genes and study of their distribution in different Rhodococcus strains // Microbiology. 1998. V.144. P.955-963.

183. Kulakova A.N., Reid K.A., Larkin M.J., Allen C.R. Isolation of Rhodococcus rhodochrous NCIMB13064 derivatives with new biodegradative abilities // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V.145. P.227-231.

184. Lanyon Y.H., Marrazza G., Tothill I.E., Mascini M. Benzene analysis in workplace air using an FIA-based bacterial biosensor // Biosens. Bioelectron. 2005. V.15. №20. P.2089-2096.

185. Laurie A.D., Lloyd-Jones G. The phn genes of Burkholderia sp. strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon catabolism // J. Bacteriol. 1999. V.181. P.531-540.

186. Lee J.H., Mitchell R.J., Kim B.C., Cullen D.C., Gu M.B. A cell array biosensor for environmental toxicity analysis // Biosens. Bioelectron. 2005. V.21. P.500-507.

187. Lee K., Gibson D.T. Toluene and ethylbenzene oxidation by purified naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4 // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.3101-3106.

188. Lee N., Hwang M., Jung G., Kim Y., Min K. Physical structure and expression of alkBA encoding alkane hydroxylase and rubredoxin reductase from Pseudomonas malto-philia И Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V.218. P.17-21.

189. Lei Y., Chen W., Mulchandani A. Microbial biosensors. Review // Anal. Chim. Acta. 2006. V.568. P.200-210.

190. Li X.Z., Poole K. Organic solvent-tolerant mutants of Pseudomonas aeruginosa display multiple antibiotic resistance // Can. J. Microbiol. 1999. V.45. P.18-22.

191. Li Y.F., Li F.Y., Ho C.L., Liao V.H. Construction and comparison of fluorescence and bioluminescence bacterial biosensors for the detection of bioavailable toluene and related compounds //Environ. Pollut. 2008. V.152. №1. P.123-132.

192. Liu J., Mattiasson B. Microbial BOD sensors for wastewater analysis // Water Research. 2002. №36. P.3786-3802.

193. Liu L., Jiang C.Y., Liu X.Y., Wu J.F. Plant-microbe association for rhizoremedia-tion of chloronitroaromatic pollutants with Comamonas sp. strain CNB-1 //Environ. Microbiol. 2007. V.9.P.465-473.

194. Lovley D.R., Lloyd J.R. Microbes with a mettle for bioremediation // Nat. Biotechnol. 2000. V.18. P.600-601.

195. Масек Т., Mackova M., Kas J. Exploitation of plants for the removal of organics in environmental remediation // Biotechnol. Adv. 2000. V. 18. P.23-34.

196. MacNaughton S.J., Stephen J.R., Venosa A.D., Davis G.A., etc. Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. P.3566-3574.

197. Margesin R. Potential of cold-adapted microorganisms for bioremediation of oil-polluted alpine soils // Int. Biodet. Biodeg. 2000. V.46. P.3-10.

198. Margesin R., Schinner F. Biodegradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme environments //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.56. P.650-663.

199. Margesin R., Schinner F. Efficiency of indigenous and cold-adapted soil microorganisms for biodegradation of diesel oil in alpine soil // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. №7. P.2660-2664.

200. Margesin R., Schinner F. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology // Extremophiles. 2001. V.5. P.73-83.

201. Marin M.M., Yuste L., Rojo F. Differential expression of the components of the two alkane hydroxylases from Pseudomonas aeruginosa И J. of Bacteriology. 2003. V.185. №10. P.3232-3237.

202. McKenna E.J., Coon MJ. Enzymatic omega-oxidation. IV. Purification and properties of the omega-hydroxylase of Pseudomonas oleovorans И J. Biol. Chem. 1970. V.245. P.3882-3889.

203. Meagher R.B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. V.3. P.153-162.

204. Menn F.M., Applegate B.M., Sayler G.S. NAH plasmid-mediated catabolism of anthracene and phenanthrene to naphthoic acids // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. P.1938-1942.

205. Miller K.J., Wood J.M. Osmoadaptation by rhizosphere bacteria // Annual Rev. Microbiol. 1996. V.50. P.101-136.

206. Miller R.M., Bartha R. Evidence from liposome encapsulation from transport-limited microbial metabolism of solid alkanes // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V.55. P.269-274.

207. Mishra S., Jyot J., Kuhad R.C., Lai B. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily sludge-contaminated soil // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. P.l675-1681.

208. Mohn W.W., Stewart G.R. Limiting factors for hydrocarbon biodegradation at low temperature in Arctic soils // Soil Biol. Biochem. 2000. V.32. P.l 161-1172.

209. Moody J.D., Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E. Degradation of phenanthrene and anthracene by cell suspensions of Mycobacterium sp. strain PYR-1 // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. P.l476-1483.

210. Mosqueda G., Ramos J.L. A set of genes encoding a second toluene efflux system in Pseudomonas putida DOT-TIE is linked to the tod genes for toluene metabolism // J. Bacteriol. 2000. V.182. P.937-943.

211. Mueller J.G., Devereux R., Santavy D.L., Lantz S.E., etc. Phylogenetic and physiological comparisons of РАН-degrading bacteria from geographically diverse soils // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. V.71. P.329-343.

212. Mulligan C.N., Yong R.N., Gibbs B.F. Surfactant-enhanced remediation of contaminated soil: a review // Eng. Geol. 2001. V.60. P.371-380.

213. Neumann G., Teras R., Monson L., Kivisaar M. Simultaneous degradation of atrazine and phenol by Pseudomonas sp. strain ADP: effects of toxicity and adaptation //

214. Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. №4. P.1907-1912.

215. Nicholson C.A., Fathepure B.Z. Biodegradation of benzene by halophilic and halotolerant bacteria under aerobic conditions // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. №2. P.1222-1225.

216. Olusola Abayomi Ojo. Molecular strategies of microbial adaptation to xenobiot-ics in natural environment // Biotech, and Molec. Biol. Review. 2007. V.2. №1. P.1-13.

217. Oudot J., Dupont J., Haloui S., Roquebert M.F. Biodegradation potential of hydrocarbon assimilating tropical fungi // Soil Biol. Biochem. 1993. V.25. №9. P. 1167-1173.

218. Padan E., Schuldiner S. Molecular physiology of Na+/H+ antiporters key transporters in circulation of Na+ and H+ in cells // Biochim. Biophis. Acta. 1994. V.l 185. P.129-151.

219. Paitan Y., Biran D., Biran I., Shechter N., Babai R., Rishpon J., Ron E.Z. On-line and in situ biosensors for monitoring environmental pollution // Biotechnol. Adv. 2003. V.22. №1-2. P.27-33.

220. Park W., Jeon C.O., Cadillo H., DeRito C., Madsen E.L. Survival of naphthalene-degrading Pseudomonas putida NCIB9816-4 in naphthalene-amended soils: toxicity of naphthalene and its metabolites // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V.64. P.429-435.

221. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. Proton-dependent multidrug efflux systems //Microbiol. Rev. 1996. V.60. P.575-608.

222. Peterson J.A., Kusunose M., Kusunose E., Coon M.J. Enzymatic omega-oxidation. II. Function of rubredoxin as the electron carrier in omega-hydroxylation // J. Biol. Chem. 1967. V.242. P.4334-4340.

223. Pieper D.H., Reineke W. Engineering bacteria for bioremediation // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V.ll. P.262-270.

224. Pingsheng J., Wilson M. Enhancement of population size of a biological control agent and efficacy in control of bacterial speck of tomato through salicylate and ammonium sulfate amendments // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V.34. P.1290-1294.

225. Pospisil M., Voldrich M., Marek M., Gerovsky M. Bioremediation of soil contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1996. V.37.№3. P. 259-264.

226. Prabhu Y., Phale P.S. Biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas sp. strain PP2: novel metabolic pathway, role of biosurfactant and cell surface hydrophobicity in hydrocarbon assimilation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.61. P.342-351.

227. Ramos J.L., Duque E., Godoy P., Segura A. Efflux pumps involved in toluene tolerance in Pseudomonas putida DOT-TIE // J. Bacteriol. 1998. V.180. P.3323-3329.

228. Ramos J.L., Duque E., Rodriguez-Herva J.J., Godoy P., etc. Mechanisms for solvent tolerance in bacteria // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.3887-3890.

229. Raskin I. Role of salicylic acid in plants II Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. V.43. P. 439-463.

230. Reshetilov A.N., Iliasov P.V. et al. Pseudomonas putida as a receptor element of microbial sensors for naphthalene detection // Process Biochemistry. 1997. V.32. № 6. P.487-493.

231. Reshetilov A.N., Trotsenko J.A., etc. Characteristics of Gluconobacter oxydans B-1280 and Pichia methanolica MN4 cell based biosensors for detection of ethanol // Process Biochemistry. 2001. V.36. P.1015-1020.

232. Resnick S.M., Gibson D.T. Regio- and stereospecific oxidation of fluorene, dibenzofiiran, and dibenzothiophene by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strainNCIB 9816-4 //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.4073-4080.

233. Rishpon J. Electrochemical biosensors for environmental monitoring // Rev. Environ. Health. 2002. V.17. №3. P.219-247.

234. Rodrigues E.G.C., Menezes E.P., Santa-Anna L.M.M., etc. Oil degrading microorganisms // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1996. V.37. №1. P.l 19-123.

235. Rodriguez-Mozaz S., Lopez de Alda M.J., Barcelo D. Biosensors as useful tools for environment alanalysis and monitoring // Anal. Bioanal. Chem. 2006. 17c.

236. Rodriguez-Valera F., Ventosa A., Juez G., Imhoff J.F. Variation of environmental features and microbial populations with salt concentrations in a multi-pond saltern // Mi-crob. Ecol. 1985. V.ll. P.107-115.

237. Rojas A., Duque E., Mosqueda G., Golden G., etc. Three efflux pumps are required to provide efficient tolerance to toluene in Pseudomonas putida DOT-TIE // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P.3967-3973.

238. Rojo F. Specificity at the end of tunnel: understanding substrate length discrimination by the AlkB alkane hydroxylase // J. Bacteriol. 2005. V.187. P. 19-22.

239. Romine M.F., Fredrickson J.K., Li S.M.W. Induction of aromatic catabolic activity in Sphingomonas aromaticivorans strain F199 // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.23. P.303-313.

240. Ron E.Z. Biosensing environmental pollution // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V.18. №3. P.252-258.

241. Rosenberg E., Ron E.Z. High- and low-molecular-mass microbial surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.52. P. 154-162.

242. Rybnikova V.I., Tetakaeva E.A. Procedure for treatment of waste, geothermal and oil processing waters. Patent № 2108983, 20.04.98.

243. Sakaguchi Т., Kitagawa K., Ando Т., Murakami Y., etc. A rapid BOD sensing system using luminescent recombinants of Escherichia coli II Biosensors & Bioelectronics. 2003. V.19. №2. P.l 15-121.

244. Salt D.E., Smith R.D., Raskin I. Phytoremediation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V.49. P.643-668.

245. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M.H., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralization of naphthalene, phenanthrene, and anthracene // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59.P.1931-1937.

246. Sato S., Nam J., Kasuga K., Nojiri H., Yamane H., etc. Identification and characterization of genes encoding carbazole-l,9a-dioxygenase in Pseudomonas sp. strain CA10 // J. Bacteriol. 1997. V.179. P.4850-4858.

247. Sayler G.S., Rip S. Field applications of genetically engineered microorganisms for bioremediation processes // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V.l 1. P.286-289.

248. Schreiner A., Fuchs K., Lottspeich F., Poth H. Degradation of 2-methylaniline in Rhodococcus-rhodochrous -cloning and expression of 2 clustered catechol 2,3-dioxygenase genes from strain CTM11 J. Gen. Microbiol. 1991. V.l 37. P.2041-2048.

249. Selifonov S.A., Grifoll M., Eaton R.W., Chapman P.J. Oxidation of naphtha-lenoaromatic and methyl-substituted aromatic compounds by naphthalene 1,2-dioxygenase //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.507-514.

250. Sheng X.F., He L.Y., Zhou L., Shen Y.Y. Characterization of Microbacterium sp. FlOa and its role in poly cyclic aromatic hydrocarbon removal in low-temperature soil 11 Can. J. Microbiol. 2009. V.55. №5. P.529-535.

251. Sikkema J., de Bont J.A.M., Poolman B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons // Microbiol. Rev. 1995. V.59. P.201-222.

252. Smith C.A., Hyman M.R. Oxidation of methyl tert-butyl ether by alkane hydroxylase in dicyclopropylketone-induced and n-octane-grown Pseudomonas putida GPol / Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. P.4544-4550.

253. Smith M.J., Lethbridge G., Burns R.G. Bioavailability and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V.l52. №1. P.141-147.

254. Sole S., Alegret S. Environmental toxicity monitoring using electrochemical bio-sensing systems // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2001. №4. P.256-264.

255. Sorensen S.J., Burmolle M, Hansen LH. Making biosense of toxicity: new developments in whole-cell biosensors // Curr. Opin. Biotechnol. 2006 V.l7. №1. P.l 1-16.

256. Tam N.F., Guo C.L., Yau W.Y., Wong Y.S. Preliminary study on biodegradation of phenanthrene by bacteria isolated from mangrove sediments in Hong Kong // Mar. Pollut. Bull. 2002. V.45.P.316-324.

257. Tani A., Ishige Т., Sakai Y., Kato N. Genetic structure and regulation of the alkane hydroxylase complex in Acinetobacter sp. strain M-l // J. Bacteriol. 2001. V.183. P.1819-1823.

258. Timur S., Pazarlioglu N., Pilloton R., Telefoncu A. Detection of phenolic coum-paunds by thick film sensors based on Pseudomonas putida // Talanta. 2003. №.61. P.87-93.

259. Tizzard A.C., Lloyd-Jones G. Bacterial oxygenases: In vivo enzyme biosensors for organic pollutants // Biosensors & Bioelectronics. 2007. V.22. P.2400-2407.

260. Tongpim S., Pickard M.A. Cometabolic oxidation of phenanthrene to phenanthrene trans-9,10-dihydrodiol by Mycobacterium strain SI growing on anthracene in the presence of phenanthrene // Can. J. Microbiol. 1999. V.45. P.369-376.

261. Treadway S.L., Yanagimachi K.S., Lankenau E., Lessard P.A., etc. Isolation and characterization of indene bioconversion genes from Rhodococcus strain 124 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.51. P.786-793.

262. Tsitko I.V., Zaitsev G.M., Lobanok A.G., Salkinoja-Salonen M.S. Effect of aromatic compounds on cellular fatty acid composition of Rhodococcus opacus II Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. P.853-855.

263. Tsuda M., lino T. Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon II Mol. Gen. Genet. 1990. V. 223. P.33-39.

264. Uz I., Duan Y.P., Ogram A. Characterization of the naphthalene-degrading bacterium Rhodococcus opacus M213 //FEMS Microbiol. Lett. 2000. V.185. P.231-238.

265. Van Beilen J.B., Panke S., Lucchini S., Franchini A.G., etc. Analysis of Pseudomonas putida alkane degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes //Microbiology. 2001. V.147. P.1621-1630.

266. Van Beilen J.B., Smits Т.Н., Roos F.F., Brunner T. Identification of an amino acid position that determines the substrate range of integral membrane alkane hydroxylases //J. Bacteriol. 2005. V.l 87. P.85-91.

267. Van Beilen J.B., Wubbolts M.G., Witholt B. Genetics of alkane oxidation by Pseudomonas oleovorans И Biodegradation. 1994. V.5. P.161-174.

268. Van Hamme J.D., Singh A., Ward O.P. Recent advances in petroleum microbiology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol.67. № 4. P.503-549.

269. Van Hamme J.D., Ward O.P. Influence of chemical surfactants on the biodegradation of crude oil by a mixed bacterial culture // Can. J. Microbiol. 1999. V.45. P.130-137.

270. Von Wallbrunn A., Richnow H.H., Neumann G., Meinhardt F. Mechanism of cis-trans isomerization of unsaturated fatty acids in Pseudomonas putida И J.Bacteriol. 2003. V. 185. P.1730-1733.

271. Walter M.V., Nelson E.C., Clayton M.J. Effect of surfactanat and bacterial amendments to enhance biodegradation of hydrocarbons // Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1996. V. 96. P.437-442.

272. Wanekaya A.K., Chen W., Mulchandani A. Recent biosensing developments in environmental security // J. Environ. Monit. 2008. V.10. № 6. P.703-712.

273. Weber FJ., Isken S., de Bont J.A.M. Cis/trans isomerization of fatty acids as a defence mechanism of Pseudomonas putida strains to toxic concentrations of toluene // Microbiology. 1994. V.140. P.2013-2017.

274. Weber F.J., Ooijkaas L.P., Schemen R.M.W., Hartmans S. Adaptation of Pseudomonas putida S12 to high concentrations of styrene and other organic solvents // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. P.3502-3504.

275. Welbaum G., Sturz A.V., Dong Z., Nowak J. Fertilizing soil microorganisms to improve productivity of agroecosystems // Crit. Rev. Plant Sci. 2004. V.23. P. 175-193.

276. Werlen C., Jaspers M.C., van der Meer J.R. Measurement of biologically available naphthalene in gas and aqueous phases by use of a Pseudomonas putida biosensor // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. №1. P.43-51.

277. White-Stevens R.H., Kamin H. Studies of a flavoprotein, salicylate hydroxylase // J. Biol. Chem. 1972. V.247. P.2358-2370.

278. Whyte L.G., Bourbonniere L., Greer C.W. Biodegradation of petroleum hydrocarbons by psychrotrophic Pseudomonas strains possessing both alkane (alk) and naphthalene (nah) catabolic pathways // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. P.3719-3723.

279. Whyte L.G., Greer C.W., Inniss W.E. Assessment of the biodegradation potential of psychrotrophic microorganisms // Can. J. Microbiol. 1996. V.42. P.99-106.

280. Widada J., Nojiri H., Kasuga K., Yoshida Т., Habe H., etc. Molecular detection and diversity of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from geographically diverse sites // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V.58. P.202-209.

281. Willardson B.M., Wilkins J.F., Rand T.A., etc. Development and testing of a bacterial biosensor for toluene-based environmental contaminants // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. №3. P.1006-1012.

282. Willett H.A., Willett C.A. Oil absorption apparatus using kenaf fiber and core portions. Pat. USA 5271691, 20.10.96.

283. Yamamoto S., Katagiri M., Maeno H., Hayaishi O. Salicylate hydroxylase, a monooxygenase requiring flavin adenine dinucleotide // J. Biol. Chem. 1965. V.240. P.3408-3413.

284. Yang L., Lai C.-T., Shieh W.K. Biodegradation of dispersed diesel fuel under high salinity conditions // Water Res. 2000. V.34. P.3303-3314.

285. Yang Y., Chen R.F., Shiaris M.P. Metabolism of naphthalene, fluorene, and phenanthrene: preliminary characterization of a cloned gene cluster from Pseudomonas putida NCIB 9816//J. Bacteriol. 1994. V.176. P.2158-2164.

286. Yang Z., Suzuki H., Sasaki S., Karube I. Disposable sensor for biochemical oxygen demand //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V.46. №1. P. 10-14.

287. Yateem A., Balba M.T., Nawawy A.S., Al-Awandhi N. Plants-associated microflora and the remediation of oil-contaminated soil // Int. J. Phytorem. 2000. V.2. P. 183-191.

288. Yuste L., Rojo F. Role of the crc gene in catabolic repression of the Pseudomonas putida Gpol alkane degradation pathway // J. Bacteriol. 2001. V.l83. P.6197-6206.

289. Zhang X.X., Cheng S.P., Zhu C.J., etc. Microbial РАН-degradation in soil: degradation pathways and contributing factors // Pedosphere. 2006. V.16. №5. P.555-565.

290. Zhang Y.M., Miller R.M. Effect of a pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell hydrophobicity and biodegradation of octadecane // Appl. Environ. Micriol. 1994. V.60. №6. P.2101-2106.

291. Zhao H., Chen D., Li Y., Cai B. Overexpression, purification and characterization of a new salicylate hydroxylase from the naphthalene-degrading Pseudomonas sp. strain ND6//Microbiol. Res. 2005. V.l60. P.307-313.

292. Zhenrong Qian, Tan T.C. Response characteristics of a dead-cell BOD sensor // Wat.Res. 1998. V.32. № 3. P.801-807.

293. Zylstra G J., Wang X.P., Kim E., Didolcar V.A. Cloning and analysis of the genes for polycyclic aromatic hydrocarbon degradation. In: Recombinant DNA Technology II. An. of the N.Y.Acad, of Sciences. 1994. V.721. P.386-398.

Похожие работы

Информатика, вычислительная техника и управление
05.13.00