автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.13, диссертация на тему:Метод и средства контроля токсичности водных сред по реакции бактерий

На правах

Суворова Татьяна Владиславовна

МЕТОД И СРЕДСТВА КОНТРОЛЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ СРЕД ПО РЕАКЦИИ БАКТЕРИЙ

Специальность: 05.11.13 - Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном электротехническом университете "ЛЭТИ" им. В.И. Ульянова (Ленина)

Научный руководитель -

кандидат технических наук, доцент Захаров И .С.

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Брусакова И.А. кандидат технических наук, доцент Алипов А.Н.

Ведущая организация - Санкт-Петербургский государственный

технологический институт (технический университет)

Защита состоится «ЛХ,» 2004 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 212.23^8.06 Санкт-Петербургского государственного электротехнического университета "ЛЭТИ" им. В.И. Ульянова (Ленина) по адресу: 197376, С.-Петербург, ул. Проф. Попова, 5.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке университета. Автореферат разослан « /3 » МЮЛ^^и 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Юлдашев З.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы.

В связи с постоянно увеличивающейся антропогенной нагрузкой на окружающую среду и возрастанием количества загрязняющих веществ возникает острая необходимость контроля токсичности, биологической вредности, водных сред' питьевой, природной и сточных вод Контроль токсичности с использованием биологических методов, в отличие от химико-аналитических, позволяет учитывать ее изменение при трансформации загрязняющих веществ, образовании различных комплексов и смесей Для получения показателей токсичности водных сред необходимо применять несколько организмов различных системагических групп, объединенных в трофическую цепь. Такими важными звеньями трофической цепи простейших, мелких ракообразных являются бактерии Достоинствами использования бактерий при контроле токсичности являются возможность их получения пользователем в больших количествах для опытов из готовых, широко доступных споросодержащих фармацевтических препаратов медицинского назначения, уменьшение сшимости тестирования по сравнению с применением многоклеточных организмов и получение статистически значимой реакции

Для контроля токсичности водных сред целесообразно использовать количественно регистрируемые реакции организмов с помощью аппаратурных методов Они обеспечивают объективность получения показателей токсичности большого объема проб и снижают трудоемкость Недостаток разработанных в настоящее время методов и средств контроля токсичности заключается в том, что используемые в них организмы не связаны трофически

В качестве возможной количественно измеряемой реакции перспективен полосовой бактериальный хемотаксис Он проявляется в подъеме плоского слоя, проецирующегося на стенку сосуда в виде тонкой полосы. Высота подъема полосы уменьшается при действии токсических веществ Применение этой реакции для аппаратурного контроля токсичности водных сред сдерживается отсутствием удобных для пользователя методов, малой изученностью воздействий токсичных веществ на тест-реакцию, сложностью аппаратуры для ее регистрации

Таким образом, актуальность проблемы, лежащей в основе данной диссертации, обусловлена необходимостью разработки нового экспрессного метода контроля токсичности водных сред и новых аппаратурных средств для регистрации популяционной реакции бактериального хемотаксиса

Целью диссертационной работы является разработка метода аппаратурного контроля токсичности водных сред по экспресс-реакции бактериального полосового хемотаксиса.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1 Обосновать выбор безвредного бактериального организма, обладающего полосовым хемотаксисом и методику его организации для аппаратурного контроля Разработать способ полугения бактериальных организмов для массовых опытов

2 Исследовать воздействие биологических и физических факторов на полосовой хемотаксис, возможность его применения для экспресс-контроля острой токсичности различных водных сред Выделить информативные, аппаратурно-регистрируемые характеристики полосового хемотаксиса, отражающие воздействие на данную реакцию бактерий токсичных водных сред.

3 Разработать и исследовать модели измерительных преобразователей для получения аппаратурно-регистрируемых характеристик полосового хемотаксиса, разработать на их основе аппаратурные средства

4 Провести экспериментальные исследования аппаратурных средств, позволяющие проверить полученный метод и теоретические зависимости

Методы исследования. При выполнении работы использовались методы биотехнологии, физико-математического моделирования, микробиологии, статистики, фотометрии взвесей частиц

Объектами исследования данной работы является метод и средства биотестирования с использованием бактериального организма, предназначенные для применения в области экологического мониторинга

Научные положения, выносимые на защиту: - для контроля токсичности широкого круга природных и техногенных сред с помощью реакции бактериального полосового хемотаксиса следует учитывать взаимодействие биологических и физических факторов, оказывающих влияние на формирование и протекание данной реакции,

концентрация бактериальных клеток в полосе, близкая по распределению к нормальному, мало изменяющаяся в процессе подъема, позволяет производить ее регистрацию с помощью турбидиме¡ричсских измерительных преобразователей на основе линейки фотоприемников или фотоприемника с функциональной маской треугольной формы, для увеличения отношения световых потоков, прошедшего через полосу к фоновому, необходимо учитывать геометрию фотосенсоров

Научные результаты. При выполнении диссертационной работы получены следующие научные результаты

предложены критерии выбора бактериальных организмов для контроля острой токсичное ги водных сред, обладающих реакцией полосового хемотаксиса,

исследованы особенности спектра пропускания бактериального слоя и влияния на реакцию полосового хемотаксиса биологических и физических факторов, позволяющие выявить условия разрушения бактериального слоя при взаимодействии с границами сред,

разработаны модели турбидиметрических измерительных преобразователей для получения количественных характеристик реакции полосового хемотаксиса;

разработан метод экспресс-контроля острой токсичности водных сред с использованием споросодержащих препаратов промышленного производства, основанный на бактериальной реакции полосового хемотаксиса

Практическую ценность работы для экологического мониторинга представляют

методика получения бактериальных организмов с использованием споросодержащих препаратов и организации реакции полосового хемотаксиса для контроля острой токсичности пресной и солоноватых водных сред,

метод экспресс-контроля токсичности природной, питьевой и сточных вод с учетом биологических и физических факторов воздействия на реакцию полосового хемотаксиса;

- рекомендации к выбору источников и приемников излучения, необходимых для контроля реакции полосового хемотаксиса,

структурные схемы аппаратурных средств для контроля реакции полосового хемотаксиса, представляющие собой элемент биотехнической системы,

результаты экспериментальных исследований аппаратурных средств контроля полосового хемотаксиса

Внедрение результатов работы. Результаты теоретических и прикладных исследований, полученных в диссертационной работе, использовались при выполнении в 2002-2004 гг научно-исследовательской работы "Исследование биотехнических проблем создания многоканальных приборов с микробиологическими измерительными преобразователями для контроля сложных сред" номер гас регистрации 01200312014

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных конференциях по Мягким вычислениям и измерениям -Санкт-Петербург, 2002, 2003, 2004, научно-практических конференциях «Проблемы прогнозирования и предотвращения чрезвычайных ситуаций и их последствий» - Санкт-Петербург, 2002, 2003, всероссийской научно-техническая конференции "Информационные технологии и модели в решении современных проблем экологии" - Тула, 2002, восьмой международной научно-технической конференции студентов и аспирантов "Радиоэлектроника, электротехника и энергетика" - Москва, 2002, на III международном конгрессе "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине" и на Научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургского

государственного электротехнического Университета (ЛЭТИ) 2003 и 2004 годов.

Публикации по работе. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них - пять статей, тезисы к шести докладам на международных и российских научно-технических конференциях, одно учебное пособие.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, включающего 87 наименований, и 2-х приложений. Основная часть работы изложена на 103 страницах машинописного текста. Работа содержит 10 таблиц и 51 рисунок.

Автор выражает благодарность к.т.н., доц. Пожарову A.B. и к.б.н., доц. Ананьевой Е.П. за оказанную помощь при написании диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цель и задачи исследований, приводится краткое содержание работы по главам.

В первой главе диссертационной работы изложено состояние проблемы оценки токсичности водных сред с использованием аппаратурного биотестирования, основанного на приборной регистрации у тест-объекта - лабораторно выращенного организма тест-реакции -реакции, чувствительной к действию вредных веществ.

Проведен обзор современных аппаратурных биотестовых методов оценки токсичности водных сред с использованием организмов различных систематических групп. Анализ литературных источников позволил выявить в качестве недостатка таких методов - использование в них тест-объектов, живущих в разных по составу водных средах, либо не являющихся звеньями пищевой цепи. Сделан вывод о предпочтительности применения в аппаратурном биотестировании бактерий, как важного звена пищевой цепи различных организмов, обладающих реакцией полосового хемотаксиса как наиболее перспективной реакции для приборной регистрации. При этом необходимо ориентироваться на использование безвредных штаммов спорообразующих бактерий, используемых в фармацевтической промышленности, которые могут служить биологическими моделями для прогнозирования реакций бактериального звена экосистемы.

Проведен обзор методов для исследования бактериальных популяций (нефелометрии, турбидиметрии, лазерной корреляционной спектроскопии) и разработанных на их основе универсальных и специализированных средств, проанализированы их достоинства и недостатки.

В результате проведенного анализа современного состояния разработок аппаратурных биотестовых методов, сделан вывод, что применение реакции полосового хемотаксиса для контроля острой токсичности водных сред сдерживается отсутствием удобных для пользователя метода и аппаратурных средств, малой изученностью воздействий токсичных веществ на тест-реакцию, сложностью приборов для ее регистрации Сформулированы цели и задачи исследования

Во второй главе была разработана структурная схема биотехнической системы для оценки острой токсичности водных сред с применением бактериального тест-объекта (рис I) При разработке учитывалось, что проведение биотестового эксперимента предполагает сравнение тест-реакции тест-объекта на контрольный и опытный стимулы, а также использование линий подготовки 1ест-объекта, принадлежностей и материалов, пробы

Рис ] Биотестовая биотехническая система

где П- проба, ТО - биообъект, использующийся в качестве тест-объекта, ПМ - принадлежности и материалы метода; ТР - тест-реакция, Ь -высота подъема бактериальной полосы ИП - измерительный преобразователь, БТ - блок термостатирования, О - оператор

Тест-реакция

л— - - ~

' Антибиотики I Ультрафиолет I Аминокислоты I Корневые I выделения 1_растений _

Водные Природные Воды Питьевая

растворы воды сточные, вода

солей технологи-

металлов ческие

(Си804,

СоСЬ,

гпБО«,

РЬ(Ш,)2)

Рис. 2 Расширение видов тестируемых проб

Исследование влияния на тест-реакцию линии подготовки тест-объекта проведено в содружестве с кафедрой микробиологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии В качестве тест-объекта были выбраны безвредные спорообразующие бактерии Bacillus subtilis, широко применяемые в микробиологической промышленности, штаммы АТСС 6633 и 534 Было проанализировано и апробировано два пути получения бактерий для опытов из специализированной микробиологической лаборатории, без специализированной лаборатории самим пользователем с использованием готовых коммерческих препаратов, содержащих бактериальные споры Предложена новая методика получения тест-объекта для биотестирования с использованием медицинского препарата "Споробактерин жидкий" и порошкового ГРМ-бульона.

Для организации тест-реакции было использовано наслоение в фотометрической кювете или пробирке пробы тестируемой водной среды на взвесь бактерий

Исследование влияния на тест-реакцию линии подготовки пробы проводилось в три этапа выбор безвредных контрольных сред, опыты с модельными токсикантами, природными водами и промышленными стоками В качестве контрольных сред были апробированы стандартизированные растворы близкие по составу солей к пресным - среда Лозина-Лозинского и слабосоленым водам - физиологический раствор Экспериментально показано, что высота подъема бактериальной полосы пропорциональна времени и не зависит от формы сечения сосуда

Для разработки биотестового метода и аппаратурных средств было произведено исследование влияния на тест-реакцию следующих факторов объема бактериальной культуры, времени сохранения тест-реакции; температуры, концентрации исходной культуры В работе было проведено исследование условий качественного изменения вида полосы Обнаружено, чю даже в безвредной среде происходит ее разрушение при контакте с любыми другими фазами (поверхностью раздела жидкость-воздух, жидкостью другой плотности, металлами), при котором возможны как подъем, так и оседание клеток. Это обусловило необходимость применения для измерения подъема полосы только бесконтактных методов

Исследования показали необходимость применения двухступенчатого температурного режима' при выращивании тест-объекта (33-34°С) и проведении тест-реакции (22-25°С), т к при более высоких температурах из водных сред начинают выделяться растворенные газы, а также искажается структура полосы.

Значения индексов токсичности водных растворов солей металлов Таблица 1

Вещество Тб

0,1, г/л 0,01, г/л 0,001, г/л

СиБ04 0,55±0,05 0,40±0,05 0,20±0,1

'¿а БО« 0,70±0,05 0,55±0,05 0,30±0,05

СоС12 0,50±0,10 0,30±0,05 0,30±0,05

РЬ(Ж)1)2 0,65±0,05 0,35-10,10 0,30±0,05

Значения индексов токсичности промывных вод

ванн гальванического покрытия. Таблица 2

Промывные воды Тб при кратности разведения ккр

ванн к1ф = 8 ккр = 16 ккр ~~ 32

Меднения 0,95±0,05 0,65±0,10 0,35±0,05

Значения индексов токсичности для питьевой и природных вод Таблица 3

Виды тестируемых водных сред Тб

Водопроводная вода 0,45±0,05

Отстоявшаяся водопроводная вода 0,30±0,05

Водопроводная вода, пропущенная через фильтр 0,25±0,10

Большая Невка 0,80±0,05

Карповка 0,70±0,10

Черная речка 0,60±0,15

Для обоснования применения данной тест-реакции для экологического мониторинга проведена серия исследований острой токсичности водных растворов солей металлов и органических соединений, природных, сточных, технологических вод, питьевой воды (рис 2, табл 1-3). Исследование тест-реакции на природные и техногенные водные среды проводилось с целью определения возможностей данного биотеста В данной группе экспериментов акцент делался на наличие выхода бактериальной полосы в среду и зависимость высоты подъема полосы от концентрации исследуемого раствора Оценка токсичности пробы была произведена по относительной

разнице высот подъема бактериальной полосы в контрольной и анализируемой пробе'

у ^ _ ^контроль ~ Ьопыт ^контроль

где Тб - индекс токсичности исследуемой пробы, Иконтршь - высота подъема бактериальной полосы в конфольной среде; И0„ыт - высота подъема бактериальной полосы в анализируемой пробе

Величина индекса токсичности изменяется от нуля до единицы Если величина индекса токсичности равна или близка к единице, пробу необходимо разбавить При этом степень вредности будет соответствоват ь полученному индексу токсичности, умноженному на коэффициент кратности разведения ку$

В результате проведенных экспериментов были сделаны выводы, что возможно обнаружение с помощью тест-реакции полосового хемотаксиса В виЬйЬз ионов металлов Си2+, Со2+, РЬ2+ на уровне ПДК (табл 1), с помощью тест-реакции возможно обнаружение токсичности вод сложного состава (табл 2), при этом необходимо предварительное разбавление для обеспечения выхода бактерий в тестируемую среду, питьевой и природных вод (табл 3).

Для снижения трудоемкости и обеспечения точности измерения токсичности водных сред требуется разработка аппаратурных средств контроля реакции бактериального полосового хемотаксиса

Третья глава посвящена разработке моделей измерительных преобразователей (ИП) тест-реакции с целью разработки биотестовой аппаратурных средств Были смоделированы два основных типа ИП-индикаторный и с функциональной маской треугольной формы

а) б)

Рис 3 Конфигурации фотосенсоров измерительных преобразователей где а) индикаторный, б) с функциональной маской треугольной формы

Индикаторный ИП (рис За) позволяет определять высоту подъема полосы дискретно, количество градаций измеряемой величины зависит от соотношения максимальной высоты подъема и высоты дискретного фотосенсора При его моделировании были получены и исследованы

выражения для полезного сигнала и соотношения сшнал-фон в отсутствии помех и при их воздействии.

В первом приближении полоса бактерий считалась однородной с концентрацией частиц С в единице объема с высотой кп и толщиной слоя частиц Ь Площадь эффективного оптического сечения частиц 5 Фоюсенсор имеет прямоугольную форму Его ширина О и высота Я Освещенность фотосенсора предполагалась одинаковой по площади, равной Ео

Тогда световой поток, прошедший через полосу, равен

ДФи=ЯоГ>2(1-ехр(-С-М)), (1)

гдеД Фц - световой поток, прошедший через полосу, 2 - высота полосы на фотосенсоре

"г = А 0<й</гя

\г = Ип /гц <И< Н -Ъц (2)

г = Я-Ал Н-кп<Ъ<,Н

/2

2

т кр ?

1 -1Р,

К '

где I - сила света источника излучения, / - расстояние между источником и приемником излучения, рг - коэффициент зеркального отражения излучения от границ сред, т - относительный показатель преломления водной среды и воздуха, кр - коэффициент, зависящий от доли расходящегося потока источника излучения

Показатель экспоненты в формуле (1) может быть рассчитан через величину оптической плотности взвеси и коэффициент, определяющий долю концентрации исходной взвеси, образующей бактериальный слой

Отношение световых потоков, прошедшего через полосу к фоновому, равно.

Д Фп/ Ффон = г (1- ехр (- С-8-Ь))1 (Н-г) Из формул (1), (2) можно определить зависимость полученных величин от размеров фотосенсора, концентрации бактерий и размеров кюветы

Для уменьшения неравномерности освещенности фотосенсора необходимо применять оптические системы формирования светового потока

При наклоне кюветы коэффициент зеркального отражения р меняется незначительно при изменении угла ф до 15° Лр ''10^ (при условии однородности материала и малой толщины стенок кюветы) Основной вклад в изменение светового потока, прошедшего через полосу, вносит увеличение длины оптического слоя:

Д ФП(<Р)= ЕйПг(\-ехр [-5СМхкф]) Рассматривалось изменение светового потока ИП при появлении вместо полосы бактерий пузырьков газа, которые образуются на стенках

кюветы в результате нагревания и описываются как частицы, подчиняющиеся зависимостям геометрической оптики, с показателем преломления равным 1 Расчеты показывают, что уменьшение величины светового потока составит не более 8% Проанализировано изменение величины светового потока при линейном температурном дрейфе источника излучения

В случае если проба представляет собой окрашенный раствор, ш '

изменение светового потока определяется по формуле Бугера-Ламберта-Бэра

А Фпом(ел)= Но ОН (1-ехр(-егСПОм Ь) где Б) - коэффициент экстинкции (ослабления) раствора с концентрацией ионов Спом и толщиной слоя Ь

При разрушении бактериальной полосы общее количество бактерий сосредоточенных в ее объеме распределяется по всему объему пробы Этот процесс с учетом (1) описывается как'

А Фи ЕоО г (1- схр (-.9 СЬ г/кГ)) где /)р - высота, которую занимают бактериальные клетки при разрушении полосы Максимальное значение /?р равно высоте слоя пробы

Помимо ослабления вносимого полосой подобный эффект создают клетки, диффундирующие в пространство между полосой и взвесью Примем их концентрацию С-к, где к - доля концентрации диффундирующих клеток. Если взвесь занимает долю х высоты фотосенсора величина светового потока, прошедшего через взвесь диффундирующих клеток, равна:

АФпом ЕоОхН(\-сщ> (-БкС Ь)) (3)

Индикаторный ИП позволяет проводить исследования структуры бактериальной полосы. При этом анализируется процесс изменения оптической плотности полосы по мере подъема. Используется свойство неизменной скорости подъема бактериального слоя в контрольной среде в течение первого часа. При подъеме полосы через интервал времени А? измеряется приращение количества клеток Ап между I-1 и / отсчетом

1п(7м-7> 1п(А7)= БЬАп/А V (4)

где 'Г,.],'/', - коэффициенты пропускания соответствующие (-1 и г отсчету времени, ЬУ-объем микрослоя. ,

Частота распределения доли клеток f в интервале Д1г

ДД/г)=1п(Д1)/Е!п(ДП (5)

Статистические характеристики подобного распределения могут использоваться в качестве дополнительных информативных параметров тест-реакции

Было проведено численное моделирование структуры бактериальной полосы Среда рядом с ФП разбивалась на множество слоев Полоса описывалась к\ ослабляющими слоями с симметричным распределением, окруженная к2 слоями, добавляющих в проходящий поток доли рассеяттого

излучения Взвесь внизу полосы представлялась слоями с одинаковым ослаблением Сигнал ИП моделировался за счет параллельного перемещения вверх многослойной структуры по фотоприемнику

Результаты численного моделирования позволили учесть поглощающие и рассеивающие свойства бактериальной полосы

ИП с функциональной маской треугольной формы (рис 3 б) моделировался с целью отображения непрерывного процесса подъема полосы, посредством ее преобразования в изменение пропускания светового потока Данное изменение происходит за счет рассеяния слоя бактерий

Выражение (1) также справедливо и для ИП с функциональной маской треугольной формы

В общем виде величина светового потока, прошедшего через полосу, равна-

Д Ф = Еи (1 - ехр (-СБА)) (2И 2+ г 2)йё(ф/2) (6)

где ф - угол маски

Тогда отношение световых потоков, прошедшего через полосу к фоновому, равно'

А Ф! Ф0= (1-ехр (СЗЬ)) (2 Иг + ъ 2)/(Н2 -2кг-г2) (7)

Из формулы (7) видно, что отношение световых потоков, прошедшего через полосу к фоновому, не зависит от угла маски

Результаты моделирования ИП индикаторного типа и с функциональной маской треугольной формы позволили дать рекомендации по выбору оптимальной геометрии приемников излучения

В четвертой главе диссертации показаны проведенные экспериментальные исследования разработанных измерительных преобразователей Было разработано два типа ИП индикаторный, позволяющий проводить измерение высоты подъема бак! ериадьной полосы при помощи линейки дискретных фотоприемников, и с функциональной маской треугольной формы, при помощи которого возможно отслеживать динамику движения полосы в процессе ее подъема Данные измерительные преобразователя были реализованы в виде экспериментальных макетов, структурные схемы аппаратуры приведены на рис.4-5 Для разработки макета ИП индикаторного типа с использованием линейки фотоприемников потребовалось экспериментально смоделировать и построить макеты двух вспомогательных ИП индикаторного типа' ИП с использованием одного фотоприемника с фотосенсором малой площади и ИП с закрепленным на движке переменного резистора фотоприемником

Для разработки измерительных преобразователей было проведено исследование оптических свойств бактериальной полосы Она диафрагмировалась, а коэффициент пропускания измерялся с помощью спектрофотометра "$ресо1-11" Установлено, что ослабление увеличивается с уменьшением длины волны падающего излучения Значение ослабления, вносимого полосой, составило более 20%, что обусловило вывод о применимости для измерения турбидиметрических методов Исследование

оптических свойств бактериальной полосы позволило сделать вывод о целесообразности использования двух типов источников излучения, работающих в синем и красном участках спектра Для поверки ИП были предложены колориметрические растворы

Бактериальные тест-объекты для аппаратурных экспериментов получены способами, описанными в гл 2

Экспериментальные исследования проводились для подтверждения теоретических зависимостей моделей ИП, разработанных в гл 3

Первоначально были проведены экспериментальные исследования макета биогестовой аппаратуры с ИП индикаторного типа

Экспериментально смоделирован элемент индикаторного ИП с помощью фоюдиода ФД-265-01А с малой площадью фотосенсора (1,4x1,4 мм) В качестве источников излучения были выбраны светодиоды типа ЕЬ383-2иВС и НЬ3831ЖС-3, работающие на длинах волн 470±30 нм и 660±40 нм Эта элементная база позволяла проверить возможности обнаружения полосы с помощью дешевых, технологичных оптоэлектронных устройств.

С помощью данною ИП проведен анализ процесса подъема полосы, теоретически описывающегося зависимостями (1, 2) Выявлена возможность обнаружения полосы по уменьшению проходящего светового потока Проанализированы особенности фаз подъема и спада, причиной которых является многослойная структура полосы и диффундирующие клетки в пространство между полосой и взвесью

С помощью данного ИП полоса была исследована, согласно модели, теоретически описанной формулами (4, 5) Экспериментально выявлено, что в контрольной среде бактериальная полоса тест-объекта представляет собой распределение микрослоев с центральным максимумом, близкое к нормальному.

Для изучения изменения оптического пропускания исходно! о бульона, содержащего взвесь бактериальных клеток, по высоте кюветы была разработана модификация ИП индикаторного типа, фотоприемник которого закреплен на движке переменного резистора. Построена калибровочная зависимость между измеряемым напряжением и высотой перемещения фотоприемника

На этом макете проведено исследование пропускания оптического слоя между исходным бульоном и полосой Результаты экспериментов показали, что над исходным бульоном и под полосой находится взвесь клеток, создающая остаточное ослабление потока, описанного формулой (3).

Были получены экспериментальные зависимости оптического пропускания исходного бульона, содержащего взвесь бактериальных клеток, по высоте до и после формирования полосы Формирование полосы происходит за счет верхних слоев, оптическое пропускание которых увеличивается. Впоследствии в верхние слои на место ушедших диффундируют клетки из нижних слоев Для того чтобы этот эффект не

влиял на оптический сигнал необходимо диафрагмировать исходный бульон С помощью данного ИП проведены исследования минимального коэффициента пропускания бактериальной полосы в участке спектра 470 ±30 нм При движении полосы в течение часа многократно измерялось выходное напряжение ИП, соответствующее минимуму проходящего потока Значение минимума коэффициента пропускания составило 0,56±0,02 Эксперименты показали, что концентрация бактерий в полосе во время движения меняется незначительно, что соответствовало теоретической зависимости (1)

|Ш>|фпуГ|

ИИ

[ФГМНФПУ1Ь»

км

ст

А1

цв

А1А1,

А1

ОС |

СИ

сброс

Рис. 4 Структурная схема индикаторного измерительного преобразователя, где ФП1 . ФШ - фотоприемники, КМ - коммутатор, Г -генератор; ИИ - источник излучения с оптической системой; ФПУ1 . ФПУ1 фотопреобразующие усилители, СТ - счетчик; А1 .А) адреса, РГ -регистр, ОС - дешифратор, ЦВ - цифровой вольтметр; СИ - система

Рис 5 Структурная схема измерительного преобразователя с функциональной маской треугольной формы, где ФП - фотоприемник, КМ - коммутатор, ИИ - источник излучения с оптической системой, ФПУ фотопреобразующий усилитель, ЦВ - цифровой вольтметр, М -функциональная маска треугольной формы

и, в

Рис 6 Подбор функциональной зависимости ИП

Проведенные исследования дали возможность разработать прибор с использованием в качестве фотосенсора линейки фотоприемников Структурная схема макета приведена на рис 4 Полученные в результате экспериментов зависимости позволили предложить для описания полосового хемотаксиса посредством численного моделирования При помощи индикаторного ИП, построенного с использованием линейки дискретных фотоприемников, производится регистрация высоты подъема бактериальной полосы посредством преобразования потока фотоприемника в аналоговый сигнал (напряжение) и выдача на выход одновременно с дискретным кодом фотоприемника

Для получения десяти градаций реакции при подъеме бактериальной полосы на высоту 10 мм требуется использовать линейку фотоприемников, высота фотосенсоров которых составит 1 мм. При использовании приборных методов для регистрации высоты подъема бактериальной полосы точность измерения будет повышена

Дискретный характер сигнала индикаторного ИП не в полной мере позволяет отслеживать динамику подъема бактериальной полосы тест-объекта Поэтому был разработан и исследован ИП с использованием фотодиода большей плошади (ФД-263) с треугольной маской С помощью данного ИП удалось получить хемотаксограммы, те графики зависимости изменения сигнала от времени при непрерывном подъеме бактериальной полосы, теоретически описанные формулой (6) Участок спада сигнала, соответствующий уменьшению пропускания потока при подъеме полосы, был исследован с помощью регрессионною анализа (рис 6) Была подтверждена высокая линейность хемотаксограммы Проявляющиеся участки нелинейности обусловлены процессами появления полосы в зоне фотосенсора и выхода из нее Хемотаксограмма позволяет получать новые характеристики изменения скорости подъема при воздействии вредных веществ Высота подъема бактериальной полосы с помощью ИП с функциональной маской треугольной формы может быть измерена с точностью не менее 0,5 мм.

Максимальный угол ср функциональной маски составит 45° Это связано с ограничением ее ширины - шириной кюветы, а высота - максимальной высотой подъема бактериальной полосы

Результаты экспериментальных исследований макетов позволяют обосновать возможность обнаружения тест-реакции и ее измерения с помощью технологичных ИП оптического типа, построенных на основе математических моделей.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1 Проведен анализ применения бактерий для биотестирования токсичности водных сред и обоснована актуальность создания широкодоступных приборов для измерения популяционной реакции полосового хемотаксиса как наиболее информативной и аппаратурно-

регистрируемой Произведен выбор безвредного бактериального тест-объекта, обладающего необходимой тест-реакцией, и разработана методика его получения для массовых опытов с использованием споросодержащих коммерческих препаратов.

2 Исследовано влияние на тест-реакцию биологических и физических факторов Обосновано ее применение для экологического мониторинга путем проведения серии исследований острой токсичности водных растворов солей металлов и органических соединений, природных, сточных, технологических вод, питьевой воды

3 Выделены аппаратурно-регистрируемые информативные характеристики тест-реакции полосового хемотаксиса и предложены турбидиметрические методы регистрации.

4 Предложены модели турбидиметрических измерительных преобразователей для измерения ослабления светового потока, вносимого бактериальной полосой, проведено исследование параметров полезного сигнала и зависимости его изменения от ряда мешающих факторов. На основе моделей датчиков синтезированы структурные схемы измерителей высоты подъема бактериальной полосы, позволяющих выделить полезный сигнал на фоне помех Предложен способ поверки и контроля работоспособности аппаратуры

5 На макетах приборов проведены экспериментальные исследования сигналов от времени при подъеме бактериальной полосы, подтверждающие основные положения модели

6 Разработаны и исследованы метод и аппаратурные средства биотестового контроля водных сред на основе бактериального хемотаксиса Предложены варианты способы приготовления тест-объекта и выполнения биотестирования для условий практических лабораторий

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Гурская Т В , Березина В А Сравнительный анализ физико-химических аналитических и биологических методов контроля качества сточных вод// Всероссийская научно-техническая конференция "Информационные технологии и модели в решении современных проблем экологии' Тез докл - Тула, 2002 - С 1-2

2 Гурская Т В, Березина В А Принципы организации аппаратного контроля водных сред на основе реакций бактерий //Восьмая международная научно-техническая конференция студентов и аспирантов "Радиоэлектроника, электротехника и энергетика"' Тез докл 28 февраля - 1 марта 2002 -М 2002 - С. 136-137.

3 Пожаров А В , Папутская Н И , Гурская Т В, Ананьева Е П , Захаров И С , Глядкин С В Бактериальный хемотаксический тест для оценки токсичности водных сред //Научно-практическая конференция «Проблемы прогнозирования и предотвращения чрезвычайных ситуаций и их последствий» Тез докл. - СПб, 2002 - С 23-25

4 Пожаров А.В , Гурская Т В , Ананьева Е П , Захаров И С Быстрый токсикологический метод, основанный на эффекте «бактериальной шкалы» // Международная конференция по мягким вычислениям и измерениям- Докл.конф 25-27 июня 2002 - С-Пб, 2002 - Т 2 С 230-233.

5 Захаров И С , Суворова Т В , Пожаров А В , Ананьева Е П Слабые зарядовые эффекты движущегося бактериального слоя // III международный конгресс Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине Тез докл ) -4 июля 2003 - СПб, 2003 - С 70

6 Захаров И С . Пожаров А В, Гурская Т В, Финогенов А Д Биосенсорные системы в медицине и экологии Учеб пособие/ СПбГУТ СПб, 2003, С 41-55

7 Суворова Т.В., Захаров И С, Ананьева Е П, Пожаров А В Устройство для исследования биотеста на основе хемотаксической «бактериальной шкалы» // Международная конференция по мягким вычислениям и измерениям Докл конф - СПб, 2003 - Т 2 - С 202-204

8 Пожаров А В , Суворова Т В., Ананьева Е П , Захаров И С, Голядкин С В Оценка возможности использования бактериального хемотаксиса для аппаратурного биотестового анализа //Вестник Северо-Западного регионального отделения Академии медико-технических наук - СПб, 2003 -Вып 7-С 198-201

9 Пожаров А В , Суворова Т В, Захаров И С , Голядкин С.В Новые биотестовые методики для оценки токсичности водных сред // Научно-практическая конференция «Проблемы прогнозирования и предотвращения чрезвычайных ситуаций и их последствий» Тез докл 20-21 ноября - СПб, 2003 - С 64-67

10 Суворова Т.В., Ананьева ЕП, Захаров И С Исследование оптических датчиков для котроля бактериальной популяции с целью оценки токсичности водных сред // Научно-практическая конференция «Проблемы прогнозирования и предотвращения чрезвычайных ситуаций и их последствий»'Тез докл 20-21 ноября - СПб, 2003-С 67-69

11 Суворова Т В , Захаров И С Применение концепции мягких измерений при оценке этологических реакций организмов // Международная конференция по мягким вычислениям и измерениям' Докл конф - СПб, 2004- Т2 - С. 18-20.

12 Суворова Т В Биотехническая биотестовая система // Известия СПбГЭТУ «ЛЭТИ». - 2004 - № 2 - С 68-72

Подписано в печать 17.11.04. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 125.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С.-Петербург, ул. Проф. Попова, 5

РЫБ Русский фонд

2006-4 3277

Введение.

1. Основы аппаратурного биотестирования.

1.1. Контроль токсичности водных сред.

1.2. Необходимость разработки биотестовых методов и средств с использованием бактерий.

1.3. Аппаратурно-регистрируемые реакции популяции бактерий

1.3.1. Рост-размножение.

1.3.2. Биолюминесценция.

1.3.3. Хемотаксис.

1.4. Биотестовый метод и средства как элементы биотехнической системы (БТС).

1.4.1. Общие понятия.

1.4.2. Особенности организации биотестового t эксперимента.

1.4.3. Особенности бактериального тест-объекта.

1.5. Методы исследования бактериальных популяций.

1.5.1. Оптические методы исследования взвесей частиц.

1.5.2. Универсальные приборы.!.

1.5.3. Специализированные измерительные преобразователи.

Ф 1.6. Методы обработки данных биотестирования.

1.7. Выводы.

-32. Разработка и исследование биотехнической биотестовой системы

2.1. Обобщенная схема биотестовой биотехнической системы

2.2. Линия подготовки тест-объекта.

2.2.1. Выбор тест-объекта.

2.2.2. Исследование влияния линии подготовки тест-объекта на тест-реакцию.

2.3. Исследование особенностей возникновения тест-реакции

2.3.1. Методика формирования и регистрации тест-реакции

2.3.2. Исследование факторов, оказывающих влияние на тест-реакцию.

2.4. Линия подготовки пробы.

2.4.1. Выбор контрольной среды для тест-реакции.

2.4.2. Исследование возможности расширения видов тестируемых проб.

2.5. Сервисные элементы БТС.

2.5.1. Линия подготовки принадлежностей и материалов.

2.5.2. Блок термостатирования.

2.6. Концепция полосового хемотаксиса.

2.7. Выводы.

3. Модели измерительных преобразователей и их исследование.

3.1. Измерительный преобразователь (ИП) индикаторного типа

3.1.1. Вывод зависимости отношения световых потоков,

Ф прошедшего через полосу к фоновому.

3.1.2. Исследование зависимости отношения световых потоков, прошедшего через полосу к фоновому.

3.1.3. Передвижной индикаторный ИП.

3.1.4. Измерительный преобразователь для исследования структуры полосы.

3.2. Измерительный преобразователь для измерения высоты подъема бактериальной полосы.

3.3. Выводы.

4. Экспериментальные исследования измерительных преобразователей.

4.1. Исследование спектра ослабления тест-объекта.

4.2. Исследование измерительных преобразователей.

4.2.1. ИП индикаторного типа.

4.2.2. ИП для регистрации высоты подъема бактериальной полосы с функциональной маской треугольной формы.

4.3. Выводы.

В связи с постоянно увеличивающейся антропогенной нагрузкой на окружающую среду и возрастанием количества загрязняющих веществ возникает острая необходимость контроля токсичности - биологической вредности водных сред: питьевой, природной и сточных вод. Контроль токсичности с использованием биологических методов, в отличие от химико-аналитических, позволяет учитывать ее изменение при трансформации загрязняющих веществ, образовании различных комплексов и смесей. Для получения показателей токсичности водных сред необходимо применять несколько организмов различных систематических групп, объединенных в трофическую цепь. Такими важными звеньями трофической цепи простейших, мелких ракообразных являются бактерии. Достоинствами использования бактерий при контроле токсичности являются возможность их получения пользователем в больших количествах для опытов из готовых, широко доступных споросодержащих фармацевтических препаратов медицинского назначения, уменьшение стоимости тестирования по сравнению с применением многоклеточных организмов и получение статистически значимой реакции.

Для контроля токсичности водных сред целесообразно использовать количественно, регистрируемые реакции организмов с помощью аппаратурных методов. Они обеспечивают объективность получения показателей токсичности большого объема проб и снижают трудоемкость. Недостаток разработанных в настоящее время методов и средств контроля токсичности заключается в том, что используемые в них организмы не связаны трофически.

В качестве возможной количественно измеряемой реакцииперспективен полосовой бактериальный хемотаксис. Он проявляется в подъеме плоского слоя, проецирующегося на стенку сосуда в виде тонкой полосы. Высота подъема полосы уменьшается при действии токсических веществ. Применение этой реакции для аппаратурного контроля токсичности водных сред сдерживается отсутствием удобных для пользователя методов, малой изученностью воздействий токсичных веществ на тест-реакцию, сложностью аппаратуры для ее регистрации.

Таким образом, актуальность проблемы, лежащей в основе данной диссертации, обусловлена необходимостью разработки нового экспрессного метода контроля токсичности водных сред и новых аппаратурных средств для регистрации популяционной реакции бактериального хемотаксиса.

Целью диссертационной работы является - разработка метода у аппаратурного контроля токсичности водных сред по экспресс-реакции бактериального полосового хемотаксиса.

Задачи работы, связанные с достижением поставленной цели:

1. Обосновать выбор безвредного бактериального организма, обладающего полосовым хемотаксисом и методику его организации для аппаратурного контроля. Разработать способ получения бактериальных организмов для массовых опытов.

2. Исследовать воздействие биологических и физических факторов на полосовой хемотаксис, возможность его применения для экспресс-контроля острой токсичности различных водных сред. Выделить информативные, аппаратурно-регистрируемые характеристики полосового хемотаксиса, отражающие воздействие на данную реакцию бактерий токсичных водных сред.

3. Разработать и исследовать модели измерительных преобразователей для получения аппаратурно-регистрируемых характеристик полосового хемотаксиса, разработать на их основе аппаратурные средства.

4. Провести экспериментальные исследования аппаратурных средств, позволяющие проверить полученный метод и теоретические зависимости.

Объектами исследования данной работы является метод и средства биотестирования с использованием бактериального организма, предназначенные для применения в области экологического мониторинга.

Методы исследования. При выполнении работы использовались методы биотехнологии, физико-математического моделирования, микробиологии, статистики, фотометрии взвесей частиц.

Научные положения, выносимые на защиту:

• для контроля токсичности широкого круга природных и техногенных сред с помощью реакции бактериального полосового хемотаксиса следует учитывать взаимодействие биологических и физических факторов, оказывающих влияние на формирование и протекание данной реакции;

• концентрация бактериальных клеток в полосе, близкая по распределению к нормальному, мало изменяющаяся в процессе подъема, позволяет производить ее регистрацию с помощью турбидиметрических измерительных преобразователей на основе линейки фотоприемников или фотоприемника с функциональной маской треугольной формы; для увеличения отношения световых потоков, прошедшего через полосу к фоновому, необходимо учитывать геометрию фотосенсоров.

Научные результаты. При выполнении диссертационной работы получены следующие научные результаты:

• предложены критерии выбора бактериальных организмов для контроля острой токсичности водных сред, обладающих реакцией полосового хемотаксиса;

• исследованы особенности спектра пропускания бактериального слоя и влияния на реакцию полосового хемотаксиса биологических и физических факторов, позволяющие выявить условия разрушения бактериального слоя при взаимодействии с границами сред;

• разработаны модели турбидиметрических„измерительных

--преобразователейдг!я получения количественных характеристик реакции полосового хемотаксиса;

• разработан метод экспресс-контроля острой токсичности водных сред с использованием споросодержащих препаратов промышленного производства, основанный на бактериальной реакции полосового хемотаксиса.

Практическую ценность работы для экологического мониторинга представляют:

• методика получения бактериальных организмов с использованием споросодержащих препаратов и организации реакции полосового хемотаксиса для контроля острой токсичности пресной и солоноватых водных сред;

• метод экспресс-контроля токсичности природной, питьевой и сточных вод с учетом биологических и физических факторов воздействия на реакцию полосового хемотаксиса;

• рекомендации к выбору источников и приемников излучения, необходимых для контроля реакции полосового хемотаксиса;

• структурные схемы аппаратурных средств для контроля реакции полосового хемотаксиса, представляющие собой элемент биотехнической системы;

• результаты экспериментальных исследований аппаратурных средств контроля полосового хемотаксиса.

Внедрение результатов работы. Результаты теоретических и прикладных исследований, полученных в диссертационной работе, использовались при выполнении в 2002-2004 гг. научно-исследовательской работы "Исследование биотехнических проблем создания многоканальных приборов с микробиологическими измерительными преобразователями для контроля сложных сред" номер гос. регистрации 01200312014.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных конференциях по Мягким вычислениям и измерениям -Санкт-Петербург, 2002, 2003, 2004, научно-практических конференциях «Проблемы прогнозирования и предотвращения чрезвычайных ситуаций и их последствий» - Санкт-Петербург, 2002, 2003, всероссийской научно-техническая конференции "Информационные технологии и модели в решении современных проблем экологии" - Тула, 2002, восьмой международной научно-технической конференции студентов и аспирантов "Радиоэлектроника, электротехника и энергетика" - Москва, 2002, на III международном конгрессе "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине" и на Научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургского государственного электротехнического Университета (ЛЭТИ) 2003 и 2004 годов.

Публикации по работе. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них - пять статей, тезисы к шести докладам на международных и российских научно-технических конференциях, одно учебное пособие.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, включающего 87 наименований, и 2-х приложений. Основная часть работы изложена на 103 страницах машинописного текста. Работа содержит 10 таблиц и 51 рисунок.

Основные результаты диссертационной работы:

1. Проведен анализ применения бактерий для биотестирования токсичности водных сред и обоснована актуальность создания широкодоступных приборов для измерения популяционной реакции полосового хемотаксиса как наиболее информативной и аппаратурно-регистрируемой. Произведен выбор безвредного бактериального тест-объекта, обладающего необходимой тест-реакцией, и разработана методика его ф получения для массовых опытов с использованием споросодержащих коммерческих препаратов.

2. Исследовано влияние на тест-реакцию биологических и физических факторов. Обосновано ее применение для экологического мониторинга путем проведения серии исследований острой токсичности: водных растворов солей металлов и органических соединений, природных, сточных, технологических вод, питьевой воды.

3. Выделены аппарату рно-регистрируемые информативные характеристики тест-реакции полосового хемотаксиса и предложены турбидиметрические методы регистрации.

4. Предложены модели турбидиметрических измерительных преобразователей для измерения ослабления светового потока, вносимого бактериальной полосой, проведено исследование параметров полезного сигнала и зависимости его изменения от ряда мешающих факторов. На основе моделей датчиков синтезированы структурные схемы измерителей высоты подъема бактериальной полосы, позволяющих выделить полезный сигнал на фоне помех. Предложен способ поверки и контроля работоспособности аппаратуры.

5. На макетах приборов проведены экспериментальные исследования сигналов от времени при подъеме бактериальной полосы, подтверждающие основные положения модели.

-1256. Разработаны и исследованы метод и аппаратурные средства биотестового контроля водных сред на основе бактериального хемотаксиса.

Предложены варианты способы приготовления тест-объекта и выполнения биотестирования для условий практических лабораторий.

-124-ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Аксененко М.Д., Бараночников М.Л., Смолин О.В. Микроэлектронные фотоприемные устройства. - М.: Энергоатомиздат, 1984. - 208 с.

2. Бациллы. Генетика и биотехнология. М.: Мир, 1992. - 345 с.

3. Беспамятнов Г. П., Кротов Ю. А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Л.: Химия, 1985. - 528 с.

4. Биотестирование природных и сточных вод. М.: «Лёгкая и пищевая промышленность», 1981. - 516 с.ф 5. Биотехнические системы: Теория и проектирование / Под. ред.

5. В.М.Ахутина. Л.: Изд-во ЛГУ, 1981.-220с.

6. Воронин A.M. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений//Соросовский образовательный журнал. 1998. - №10. -С.25-31.

7. Будников Г.К. Биосенсоры как новый тип аналитических устройств//Соросовский образовательный журнал. 1996. - №12. -С.26-32.

8. Варфоломеев С.Д. Биосенсоры//Соросовский образовательный журнал.1997. №1. -С.45-49.

9. Варфоломеев С.Д., Евдокимов Ю.М., Островский М.А. Сенсорнаябиология, сенсорные технологии и создание новых органов чувств человека/УВестник российской академии наук 2000. - Т. 70 - №2. - С.99-108.

10. Воропай Е.С., Карась В.И., Торпачев П.А. Оптимизация пары фотодиод-усилитель для измерений слабых световых потоков//Измерительная техника 1985. - №3. - С. 19-21.

11. Воропай Е.С., Торпачев П.А. Техника фотометрии высокого амплитудного разрешения. Минск, 1988. - 198 с.

12. Ганшин В.М., Чебышев А.В., Фесенко А.В. Комплексные системы мониторинга токсикологической и экологической безопасности//Специальная техника 1998., - № 4 - С.2-10.

13. Громов Б.В. Поведение бактерий//Соросовский образовательный журнал -1997. №6. - С.28-32.

14. Дмитриев М.Т. и др. Санитарно-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей среде. — М.: Химия, 1989. 306 с.

15. Жуков А.И., Карелин Я.А., Колобанов С.К., Явлев С.В. Канализация. М.: Изд-во Литературы по строительству, 1969 - 590 с.

16. Захаров И.С., Пожаров А.В. Биотехнические методы охраны окружающей среды. СПб.: СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2001. - 80 с.

17. Захаров И.С., Пожаров А.В., Папутская Н.И. Качество воды качество жизни//Мониторинг - 1995. - №1. - С.39-42.

18. Захаров И.С., Пожаров А.В., Гурская Т.В., Финогенов А.Д. Биосенсорные системы в медицине и экологии. СПб: СПбГУТ, 2003. - 120 с.

19. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды. — М.: Гидрометеоиздат, 1984. 560 с.

20. Исидоров В.А. Введение в химическую экотоксикологию. СПб.: «Химиздат», 1999. - 144 с.

21. Исмаилов А.Д., Погосян С.И., Митрофанова Т.И., Егоров Н.С., Нетрусов А.И. Ингибирование бактериальной биолюминесценции хлорфенолами//Прикладная биохимия и микробиология Т. 36. - №4. -С.469-473.

22. Карпов Ю.А. Методы пробоотбора и пробоподготовки. Учебное пособие для ВУЗов. М.: Бином, 2003,. -243 с.

23. Кендалл М., Стьюарт А. Статистические выводы и связи. М.: Наука, 1973.-899 с.

24. Купер Дж., Макгилем К. Вероятностные методы анализа сигналов и систем. М.: Мир, 1989. - 376 с.

25. Курдиш И.К. Закономерности взаимодействия микроорганизмов с твердыми материалами. // М1кробюл. журн. 2001. - Т. 63 -№6. -С.71-88.

26. Ляликов Ю.С. Физико-химические методы анализа. М.: «Химия», 1973. -536 с.

27. Мазур И.И., Молдаванов О.И., Шишов В.Н. Инженерная экология. Общий курс. Т.1. М.: «Высшая школа», 1996. - 637 с.

28. Методические основы биотестирования и определения генетической опасности отходов, поступающих в окружающую среду. РД 64-085-89. -М.,1990.

29. Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118-02-90. — М.: Госкомприрода СССР, 1991.

30. Методы общей бактериологии. Т. 1. -М.: Мир, 1983. -428 с.

31. Могилевский В.Д. Методология систем: вербальный подход. М.: ОАО «Издательство «Экономика», 1999. 360 с.

32. Методика определения токсичности воды по хемотаксической реакции инфузорий. ПНДФТ 14.1:2:3:4.2-98. -М., 1998.

33. Николис Г., Пригожин И. Познание сложного. Введение. М.: Мир, 1990.344 с.

34. Новиков Ю.Ю., Ласточкина К.С., Болдина З.Н. Методы исследования качества воды водоемов. М.: Медицина, 1990. - 263 с.

35. Пожаров А.В., Шелемотов С.А. Использование экспресс-биотестирования для оценки антропоэкологической ситуации//Экология (РАН) 1992. - №2. - С.94-95.

36. Ф. 45.Пожаров А.В., Суворова Т.В., Ананьева Е.П., Захаров И.С, Голядкин С.В.

37. Оценка возможности использования бактериального хемотаксиса для аппаратурного биотестового анализа//Вестник Северо-Западного регионального отделения Академии медико-технических наук. СПб, 2003 -Вып. 7.-С. 198-201.

38. Пожаров А.В., Папутская Н.И., Захаров И.С. Быстрый токсикологический тест с использованием хемотаксиса Paramecium саис!а1;ит//Межд. заочн. научно-практической конф. «Инфузории в биотестировании»: Сб. тез. докл. Окт. 1997. СПб: 1998. С. 45.

39. Попова Л.Ю., Медведева С.Е., Могильная О.А., Пузырь А.П., Печуркин Н.С. Использование светящихся бактерий для создания тест-системы нагексахлоранциклогексан//Прикладная биохимия и микробиология 1991. -Т. 27.-Вып. 6. - С.905-910.

40. Рубенчик JI. И. Микроорганизмы биологические индикаторы. - Киев: Здоровье, 1972. - 90 с.

41. Рубин А.Б. Биофизичесие методы в экологическом мониторинге//Соросовский образовательный журнал 2000. - Т. 6. - №4. -С.7-13.

42. Симонов А. И., Цыбань А. В. Микроорганизмы и загрязнение морской среды//Всес. симпозиум «Вопросы смешения сточных вод и самоочищение водоёмов 1975. - С. 44-150.

43. Скулачев В.П. Электродвигатель бактерий//Соросовский образовательный журнал 1998. - №9. - С.2-7.

44. Стадницкий Г. В., Родионов А. И. Экология. СПб: Химия, 1995. - 240 с.

45. Тест-система для определения антибактериальных субстанций в моче: А.С. 2164946/ Султанов 3.3., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г. № 99110285/13; Заявл. 11.05.1999// Открытия. Изобретения. - 2001.

46. Толковый словарь по охране природы/Под ред. д-ра биол. наук В.В. Снакина. —М.: Экология, 1995. — 191 с.

47. Чувствительность и устойчивость водных организмов к токсическим веществам//Филенко О. П., Лебедева Т. Д., Путинцев А. И. и др./ Экспериментальная водная токсикология (Рига): Сб. статей, 1986. Рига: Зинатне.-С. 29-30.

48. Шеховцова Т.Н. Биологические методы анализа//Соросовский образовательный журнал 2000. - Т. 6. - №11. - С. 17-21.

49. Шмыков А.Ю. Исследование средств для комплексной эколого-токсикологической оценки воздействия флокулянтов на водные объекты: Автореф. дисс. . канд. техн. наук. СПб.: СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2002. - 16с.

50. Экологическая химия. М.: Мир, 1997. - 396 с.

51. Юрин В.М. Основы ксенобиологии. М.: Новое знание, 2002. - 267 с.

52. Adler Y., Dahl М.М. A Method for Measuring the Motility of Bacteria and Comparing Random and Non random Motility//Y. gen. Microbiol. - 1967(66). -№46.-pp. 161-173.

53. Banks G., Schaefer D.W., Alpert S.S. Light-scattering study of the temperature dependence of Escherichia coli motility//Biophys J. 1975. - vol. 15 - №3. -pp. 253-261.

54. Berk S.G. Reversal of Phenol and Naphthalene Chemoattraction of Ciliates//Bull. EnV. Cont. Toxicol. 1990. - V. 44. - pp. 181.

55. Culshaw B. and Dakin (1989) Optical Fiber Sensor, Vol 1, 2, Artech House, Norwood.

56. Keller EF, Segel LA. Traveling Bands of Chemotactic Bacteria: A Theoretical Analysis//Journal of Theoretical Biology 1971. - v. 30. - № 2. - pp. 235-248.

57. Greenberg E.P., Canale-Parola E. Chemotaxis in Spirocheata aurantia//Journal of bacteriology 1977. - vol. 130. - №1. - pp. 485-494.

58. Horak J. Chemotaxe bakterii//Biologicke listy 1976 - r. 41. - c. 4. - s. 269-279

59. Holz M, Chen SH. Spatio-temporal structure of migrating chemotactic band of Escherichia coli. I. Traveling band profile//Biophys J. 1979. - May;26(2). -pp.243-261.

60. Ingolia T.D., Koshland D.E. Response to a metal ion-citrate complex in bacterial sensing//J. Bacteriol. 1979. -Dec;140(3). -pp.798-804.

61. Judith P. Armitage, D.P. Josey and D.R. Smith A simple, quantitative method for measuring chemotaxis and motility in bacteria//Journal of general microbiology 1977. - vol. 102 - pp. 199-202.

62. Kihara М., Macnab R.M. Chemotaxis of Salmonella typhimurium towardcitrate//Journal of bacteriology 1979. - vol. 140 - №1. - pp. 297-300

63. Langer R. et al. A simple method for studying chemotaxis using sustained release of attractants from inert polymers//Canadian Journ. of Microbiology -1980. vol. 26. - № 2. - pp. 274-278.

64. Lapidus IR, Schiller R. A model for traveling bands of chemotactic bacteria. // Biophys J. 1978. - Apr; 22(1) - pp. 1-13.

65. Lawler D. M. (1995) "Turbidimetry and Nephelometry" / Encyclopedia of Analytical Science (s. ed. Worsfold), Academic Press Ltd, UK.

66. Lenger I. Chemotaxis bei gramnegativen Bakterien.//Biologische Zeitschrift1977 Vol. 7. -№ 1. - S. 15-20.

67. Maeda K. et. al. Effect of Temperature on Motility and Chemotaxis of Escherichia coli//Journal of Bacteriology 1976. - v. 127 -№ 3 - pp. 139-146.

68. R. Nossal Growth and movement of rings of Chemotactic Bacteria//Experimental cell research. 1972 - v. 75. - pp. 138-142.78.0rdal GW, Gibson KJ. Chemotaxis toward amino acids by Bacillus subtilis//J

69. Bacteriol. 1977. - Jan;129(l) -pp.151-155 79. Ordal GW, Villani DP, Rosendahl MS. Chemotaxis towards sugars by Bacillussubtilis//J Gen Microbiol. 1979. - Nov;l 15(1). - pp.167-72.

70. Ordal G. Control of Tumbling in Bacterial Chemotaxis by Divalent

71. Concentration Gradients in Agar Suitable for Studying Chemotaxis on a Solid

72. Surface. // Canadian Journ. of Microbiology 1979 - v. 25 - № 12 - pp. 14601467.

73. Tardiff R.G. In vitro methods of toxicity evaluation//Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol- 1978.-v. 18.-pp. 357-369

74. Wang PC, Chen SH. Quasielastic light scattering from migrating chemotactic bands of Escherichia coli. II. Analysis of anisotropic bacterial motions.//Biophys J. 1981. - Oct;36(l) - pp.203-219.

75. Ward J.S., Parrish P.R. Toxicity Tests. In: Manual of methods in aquatic environment research, Rome, 1982., pp. 1-23

76. Zimmer MA, Szurmant H, Saulmon MM, Collins MA, Bant JS, Ordal GW. The role of heterologous receptors in McpB-mediated signalling in Bacillus subtilis chemotaxis//Mol Microbiol. 2002. - Jul;45(2). - pp.555-568.