автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.13, диссертация на тему:Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов

На правах рукописи

ГУМЕРОВА Гузель Ильдаровна

МЕТОД КОНТРОЛЯ ПОЛИГАЛО ГЕНИРОВАННЫХ ДИБЕНЗО-и-ДИОКСИНОВ И РОДСТВЕННЫХ ИМ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ

05.11.13 - Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов

и изделий

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

П 3 ДПР 2014

Казань-2014

005546611

005546611

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева - КАИ» на кафедре «Общая химия и экология»

Научный руководитель: Гоголь Эллина Владимировна

кандидат химических наук, ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева - КАИ», доцент кафедры «Общая химия и экология»

Официальные оппоненты: Васильев Андрей Витальевич

доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Тольяттинский государственный университет», заместитель ректора - директор Института химии и инженерной экологии

Будникова Юлия Германовна

доктор химических наук, ФГБУН «Институт

органической и физической химии

им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра

РАН», зав. лабораторией электрохимического

синтеза

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение

Республики Башкортостан «Управление государственного аналитического контроля» (ГБУ РБ УГАК), г. Уфа

Защита состоится 16 мая 2014 г. в 14 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д 212.082.01 в ФГБОУ ВПО «Казанский государственный энергетический университет» по адресу: 420066, г. Казань, ул. Красносельская, 51, зал заседаний Ученого совета, тел./факс (843)562-43-30.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью организации, просим направлять по адресу: 420066, г. Казань, ул. Красносельская, 51, КГЭУ, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.082.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного энергетического университета.

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.ф.-м.н. Калимуллин Рустем Ирекович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Полигалогенированные дибензо-л-диоксины (ПХДД) и родственные им соединения (полихлорированные дибензофураны (ПХДФ), полиароматические углеводороды (ПАУ)) - одни из самых опасных ксенобиотиков: обладая мутагенными и канцерогенными свойствами, они становятся причиной изменений функционирования и существования экологических систем. В связи с этим необходим постоянный контроль содержания подобных соединений в природной среде.

В основе количественного контроля ПХДД/ТТХДФ и ПАУ лежат гибридные методы физико-химического анализа — сочетание хроматографии и масс-спектромстрии. Такое сочетание обеспечивает высокую чувствительность, является способом подтверждения идентичности соединений, но имеет ряд ограничений для целей массового анализа: низкую производительность, невозможность определения некоторых диоксиноподобных соединений, высокую стоимость анализа, зависимость пробоподготовки от происхождения проб объектов природной среды, их компонентного состава и параметров оборудования. Кроме того, среди проблем контроля объектов природной среды есть такие, решить которые затруднительно даже с помощью вышеуказанных методов: аварийные поступления загрязнений от предприятий, арбшражная практика, когда подтвердить аналитическую информации, полученную методами ГХ/МС или ВЭЖХУМС, необходимо результатами, полученными совершенно иным методом контроля (электрохимическим, биохимическим и пр.).

В этой связи разработка ферментных методов определения полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений является актуальной.

Настоящая работа посвящена усовершенствованию метода качественного и количественного определения ПХДЦ/ПХДФ. Автором предложен биохимический метод, который может комбинироваться с методами ГХ/МС или ВЭЖХ/МС, либо использоваться для экспресс-анализа. Он основан на каталитических свойствах монооксигеназных ферментных систем цитохромов Р450. В его основе лежит биохимическая реакция, в ходе которой ПХДД/ТТХДФ разрушаются под действием закрепленной на электрохимическом модифицированном нафионом стеклоуглеродном датчике изоформы фермента цитохрома Р4501А1. В процессе каталитической деградации диоксинов (ПХДД) образуется фенол, концентрация которого измеряется методом инверсионной вольтамперометрии и прямо пропорциональна концентрации диоксинов в исходной смеси. Предложенный метод не требует сложной пробоподготовки и дает возможность во много раз упростить и удешевить контроль диоксинов в объектах природной среды.

Объектом исследования является усовершенствование метода и аппаратных средств контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений в природной среде.

Предметом исследования является методическое обеспечение и приборная реализация метода биохимического контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений.

Цель работы: разработка и реализация метода контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

— изучить токсические свойства полигалогенированных дибензо-л-диоксинов и родственных им соединений, механизм их образования и трансформации в объектах природной среды и методы аналитического контроля;

— подобрать фермент, участвующий в процессе биохимического разложения полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений в объектах природной среды;

— обосновать выбор материала для изготовления биосенсора;

— разработать способ иммобилизации (закрепления) фермента на поверхности биосенсора;

— усовершенствовать метод электрохимического измерения массовых концентраций фенола;

— обосновать метод определения диоксинов в объектах природной среды путем их биохимического разложения до фенолов;

— усовершенствовать систему обработки сигналов биосенсора посредством виртуально -ориентированной среда (виртуального вольтамперометрического анализатора).

Методы исследования. Исследование базируется на электро- и биохимических методах контроля объектов природной среды, методах биотестирования, методах планирования эксперимента, методах графического программирования, методах математической статистики.

Новые научные результаты.

1. Получены модельные растворы полигалогенированных дибензо-и-диоксинов на основе механизма образования их из прекурсоров и трансформации данных соединений в объектах природной среды.

2. Выбран фермент применительно к условиям изготовления биосенсора для контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов.

3. Разработан способ иммобилизации цитохрома Р450 на стеклоуглеродном электроде.

4. Усовершенствована методика измерения концентраций фенола методом инверсионной вольтамперометрии.

5. Создана система обработки сигналов биосенсора с иммобилизованным цитохромом Р450 посредством виртуального вольтамперометрического анализатора.

Практическую значимость работы составляют:

1. Разработанный биосенсор позволяет количественно определить полигалогенированные дибензо-л-диоксины на основании концентрации фенола, образующегося в ходе их ферментативной деградации.

2. Результаты исследований способов иммобилизации ферментов позволили предложить способ закрепления цитохрома Р450 на модифицированной нафионом поверхности стеклоуглеродного электрода.

3. Усовершенствована методика вольтамперометрического измерения концентраций фенола, что привело к более точным и воспроизводимым результатам.

4. Создание системы сбора и управления данными электрохимической ячейки в виртуально-графической среде Lab VIEW позволяет уменьшить предел определяемых концентраций и дает возможность проводить экспресс - анализы в составе передвижной лаборатории.

На защиту выносятся следующие положения:

1.Для комбинированного или предварительного экспресс-контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений в объектах природной среды предложено использование биосенсора, предполагающего сочетание физико-химического датчика (сенсора) и биообъекта (фермента).

2. Обоснован выбор фермента и материала электрода применительно к условиям изготовления биосенсора для контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов.

3. Разработан способ иммобилизации цитохрома Р450 на стеклоуглеродном электроде, модифицированном ионообменным полимером нафионом.

4. Предложено усовершенствование вольтамперометрической методики измерения концентраций фенола путем изменения процедуры электрохимических измерений.

5. Предложена система обработки сигналов биосенсора с иммобилизованным цитохромом Р450 посредством виртуального вольтамперо-метрического анализатора, обеспечивающая высокую скорость передачи, регистрации и обработки данных электрохимической ячейки с программным вычитанием фонового тока.

Достоверность полученных результатов и обоснованность выводов диссертационной работы обеспечивается совпадением полученных в работе результатов с результатами известных теоретических и численно-модельных исследований других авторов, а также совпадением найденных результатов с известными из литературы данными по влиянию изоформы цитохрома Р4501А1 на полигалогенированные дибензо-и-диоксины и родственные им соединения и подтверждением теории экспериментом. Достоверность также подтверждается использованием апробированных математических методов и оценок, использованных при проведении эксперимента, обработке и анализе регистрируемых данных.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных научных конференциях: XVI - XX «Туполевские чтения», 2008 - 2012, КНИТУ-КАИ, Казань; VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009», МарГУ, Йошкар-Ола, 2009; Международный научно-технический конгресс «Экология и безопасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов» ELPIT-2009, 11 У, Тольятти, 2009; I Международная научно-практическая конференция «Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий», Чебоксары, 2011; III Международный экологический конгресс (V Международная научно-техническая конференция, научный симпозиум «Экологический мониторинг промышленно-транспортных комплексов») «ELPIT 2011. Экология и опасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов» ТГУ, Тольятти, 2011; II Международная заочная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы науки», Тамбов, 2011.

Реализация результатов работы.

Результаты исследований по созданию биосенсоров используются при выполнении лабораторных работ по курсу «Методы и приборы контроля окружающей среды», исследования по механизмам биотрансформации и токсического действия ксенобиотиков на живые организмы используются при чтении курса «Экологическая химия», принципы конструирования измерительных приборов на базе виртуально-ориентированной среды графического программирования используются в курсе «Разработка и проектирование приборов и техники контроля объектов окружающей среды» основной образовательной программы подготовки бакалавров и магистров техники и технологии направления 280700 «Техносферная безопасность» на кафедре «Общей химии и экологии» КНИТУ-КАИ им. А.Н. Туполева, о чем имеются соответствующие акты.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 12 научных публикациях, включая 3 статьи в ведущих научных изданиях, входящих в перечень ВАК, 8 материалов докладов международных конференций, 1 материал доклада на всероссийской конференции.

Личный вклад автора. Результаты, представленные в диссертации и публикациях, получены при непосредственном участии автора работы. Автором лично осуществлены анализ литературных источников, выбор объектов исследования с учетом их специфики, проведение экспериментальных исследований, разработка основных блоков усовершенствуемого вольтамперметра, интерпретация и анализ полученных результатов.

Соответствие диссертации научной специальности.

Диссертация соответствует специальности 05.11.13 - Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий.

Разработка биосенсора для количественного определения диоксинов и способа иммобилизации изоформы фермента цитохрома Р4501А1 соответствует п. 1 «Научное обоснование новых и усовершенствование существующих методов аналитического и неразрушающего контроля природной среды, веществ, материалов и изделий» и п. 4. «Разработка методического, технического, приборного и информационного обеспечения для локальных, региональных и глобальных систем экологического мониторинга природных и техногенных объектов» Паспорта специальности.

Разработка системы обработки сигнала биосенсора с иммобилизованным цитохромом Р4501А1 посредством виртуального вольтамперометрического анализатора, созданного в среде графического программирования, соответствует п. 6 «Разработка алгоритмического и программно-технического обеспечения процессов обработки информативных сигналов и представление результатов в приборах и средствах контроля, автоматизация приборов контроля» Паспорта специальности.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка использованных источников, включающего 165 наименований. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включая 43 рисунка и 22 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы ее цель и задачи, указана научная новизна и практическая ценность, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе рассмотрены полигалогенированные дибензо-и-диоксины как объект исследования, описаны их основные физические и химические свойства, токсичность, пути поступления в окружающую среду и существующие методы определения.

Из-за необходимости определения ультраследовых количеств и неоднородного сложного состава проб, контроль содержания диоксинов в объектах окружающей среды является одним из самых трудоемких методов анализа химических веществ. Основными методами анализа проб объектов природной среды на содержание диоксинов являются гибридные физико-химические инструментальные методы: предварительное хроматографическое разделение компонентов смеси с идентификацией разделенных соединений на масс-спектрометре (Х/МС).

Среди проблем контроля объектов природной среды есть такие, решить которые затруднительно даже с помощью основных гибридных методов Х/МС: кошрсшь залповых сбросов или выбросов предприятий, формирование стоимости земельного фонда на основе данных экологического контроля, страхование рисков загрязнения природной среды, арбитражная практика. Аналитическую информацию, полученную одним из методов, в данном случае требуется подтверждать результатами, полученными совершенно иным методом кошроля (сочетания спектральных и электрохимических, хроматографических и биологических и пр. методов или различных их комбинаций).

В качестве методов, которые могут использоваться для такой комбинации или предварительного экспресс-анализа проб объектов природной среды, предположительно содержащих ксенобиотики, автором рассмотрены иммуноферменшые и биологические методы. Они предполагают сочетание физико-химического датчика (сенсора) и биообъекта. Подобное сочетание называют биосенсором.

Биосенсоры на основе ферментов наиболее просты в изготовлении и эксплуатации и имеют перспективы широкого применения. Недостатком их является то, что фермент часто денатурирует (изменяет структуру своего белка) под действием химических реагентов, используемых при обработке проб. Решение этой проблемы лежит в области модификации либо структуры самого белка, либо поверхности датчика.

Вторая глава диссертации посвящена конструированию биосенсора для контроля диоксинов и выбору компонентов для его реализации.

Токсический (мутагенный и канцерогенный) эффекты на живые организмы оказывают не сами ПХДЦ и родственные им соединения, а продукты их биохимической активации, катализируемой изоформой фермента цитохрома Р4501А1. При этом происходит их дегалогенирование, расщепление цикла и образование фенольных производных. При этом концентрация диоксинов прямо пропорциональна концентрации образующегося фенола, измерение которого предложено проводить электрохимическим методом анализа.

Исходя из свойств материалов, возможных для использования при конструировании электрода, был выбран стеклоуглерод.

Приведены основные характеристики материалов, с помощью которых модифицируют электроды, и на основании изученных свойств выбран нафион (ТЧайоп), благодаря его низкому удельному электрическому сопротивлению, хорошей адгезии к материалам электродов, стабильности, механической прочности, щдрофильности и наличию гидрофобных полостей для включения органических молекул и катионов.

Описаны методы иммобилизации фермента и проведена апробация различных способов иммобилизации изоформы цитохрома Р4501А1 на поверхности стеклоуглеродного электрода.

Во избежание проблем, возникающих при различных способах иммобилизации, нами была разработана модифицированная методика, сочетающая приемы, использованные при изготовлении накладных мембран и описанные для одноразовых биосенсоров на основе планарных электродов. Она состоит в том, что иммобилизация раствора фермента в буфере производится на химически модифицированную полимером поверхность электрода с закреплением фермент вакуумированием в парах 3% глутарового альдегида, что позволяет сохранить высокую ферментативную активность и снизить расход фермента. В качестве полимера использовалась перфторированная ионообменная мембрана нафион. Такой подход позволил получил, сверхтонкие пленки, сохраняющие высокую активность и не создающие высокого сопротивления переноса реагентов. Кроме того, подобные тонкие пленки не отслаиваются с нафионового слоя и не вызывают подтекания электролита к поверхности сенсора.

На рисунках 1 и 2 представлена зависимость отклика биосенсора от условий нанесения нафионного покрытия — объема раствора полимера и его концентрации. Как видно, при увеличении толщины покровного слоя (увеличении объема раствора) (рис. 1) либо его концентрации (рис. 2) на рабочей поверхности электрода происходит снижение величины регистрируемого тока. Очевидно, это связано с диффузионным ограничением массопереноса продукта реакции, образующегося в ферментной пленке, к электроду. Оптимальное количество нафиона, не вызывающее изменений в токе окисления фенола, но сохраняющее стабилизирующее действие на сенсор, соответствует 2 мкл 0.05 % раствора на электроде.

Соблюдение единообразия при конструировании серии биосенсоров по предлагаемой методике позволяют получать хорошую воспроизводимость результатов и стабильность отклика при их многократном использовании (рис. 3).

Таким образом, аналитические характеристики и операционные свойства биосенсоров на основе стеклоуглеродных электродов, модифицированных нафионом, с иммобилизованной на нем изоформой фермента цитохрома Р4501А1 позволяют предложить данный тип биосенсоров для испытаний с модельными растворами диоксиноподобных соединений и пробами реальных объектов окружающей среды. Биосенсоры показали хорошую воспроизводимость как фонового тока, так и отклика на низкие концентрации диоксинов в пределах 10" — 10"12 М.

12 3 4 5 6 7

Объем, мкл

Рисунок 1. Влияние количества нафиона на отклик биосенсора

-1ов С [М]

Рисунок 2. Влияние концентрации нафиона на отклик биосенсора

11,05 ---

Рисунок 3. Иммобилизация фермента вакуумированием в парах глутарового альдегида

7

1М

В третьей главе описано проведение экспериментов по качественному и количественному определению диоксиноподобных соединений в модельных растворах, имитирующих реальное содержание диоксинов в объектах окружающей среды.

Исходя из того, что фенол является прекурсором образования диоксинов, на первом этапе эксперимента были подготовлены 3 модельные пробы:

1. Из дистиллированой воды, солей (CuCl2, FeCl3) и фенола была подготовлена модельная проба № 1, имитирующая фоновое содержание фенола в Куйбышевском водохранилище (концентрация 0,01 мг/л);

2. Модельная проба № 2, имитирующая обеззараживание питьевой воды хлорированием при водоподготовке, готовилась путем обработки пробы № 1 газообразным хлором, полученным в результате электролиза NaCl;

3. Модельная проба № 3 была получена путем добавления в пробу № 1 раствора NaOCl, в качестве которого использовался хозяйственный отбеливатель, и обработана УФ лампой, что интенсифицировало образование диоксиноподобных соединений, особенно в присутствии ионов железа (Fe3+) и меди (Си2+) в качестве катализатора.

Именно проба № 3 имитировала условия, создаваемые при смешении бытовых стоков с природными водами в летний период. Скрининговый анализ на содержание диоксинов в растворе проводился посредством добавления в пробу индикатора на основе азотистых соединений. При содержании в пробе диоксинов раствор окрашивался в желтый цвет.

На втором этапе эксперимента проводилось биотестирование (биологический метод контроля) подготовленных модельных проб для подтверждения отсутствия острой токсичности диоксиноподобных соединений и невозможность их определения скрининг - анализом на живых системах.

Биотестирование проводили на инфузориях-туфельках Paramecium caudatum и дафниях Ceriodaphnia affinis. Результаты биотестирования показали, что пробы, содержащие диоксины, являются малоопасными (4 класс опасности), а пробы, содержащие фенол - высокоопасными (2 класс опасности). Следовательно, для ксенобиотиков типа диоксина, которые не обладают острой токсичностью, а являются канцерогенами и мутагенами, данный метод контроля не информативен. Опасными, соединения такого типа, становятся только при попадании в организм и вступлении в метаболизм под действием ферментов.

На третьем этапе эксперимента проводилась отработка методики определения фенола с использованием разработанного биосенсора методом инверсионной вольтамперометрии.

Усовершенствована методика определения фенола в воде по МУ 08-47/189. При проведении ряда анализов по усовершенствованной методике была установлена хорошая воспроизводимость и повторяемость результатов (рис. 4). Минимальная определенная концентрация фенола - 10"9 М.

На четвертом этапе эксперимента предлагаемой методикой проводился анализ модельных проб диоксинов с использованием в качестве рабочегоэлектрода сконструированного биосенсора. Проведение измерения массовых концентраций диоксинов в пробах воды проводилось по методу добавок.

- 3 2

6 5

< 4

I

О

1

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 -1о§С[М]

Рисунок 4. Зависимость силы тока от концентрации фенола

Для сравнительного анализа готовились 2 серии модельных растворов диоксинов:

1. Путем аликвотного разбавления ГСО 7852-2000 смеси растворов ПХДД в диапазоне концентраций 10"6- 10"12 М.

2. Исходя из того, что для образования одной молекулы диоксина

необходимо 2 молекулы фенола, была подготовлена модельная серия

растворов, имитирующая образование диоксинов в объектах окружающей

среды.

Измеряли рабочий сигнал биосенсора для модельных концентраций

диоксина в диапазоне 10"6- 10"14М. Амперометрический отклик биосенсора с

иммобилизованными ферментами изоформы цитохрома Р4501А1 в

присутствии диоксиноподобных ксенобиотиков основан на регистрации

анодного тока окислении фенола, образующегося в результате ферментативной

деградации диоксинов.

Ток окисления регистрировался при фиксированном потенциале (0,6 В). Максимальное отклонение тока от фонового было измерено как отклик биосенсора. Зависимость I (^Сфенола) можно аппроксимировать прямой: у= ах + Ь. Установлено, что все пики окисления являются аналитическими сигналами. Все результаты эксперимента были обработаны, построена зависимость определяемого тока от концентрации фенола, образовавшегося при биодеградации диоксинов, полученных различными способами, указанными выше (рис. 5). Концентрация фенола была измерена в диапазоне 10"3 - 10"7 М, что соответствует изначальной концентрации диоксина в смеси в диапазоне 10"6 -10"14 М.

^Зависимости силы тока от ^ Сфе„ола в интервалах концентраций от 10"3 до

10 М и от 10" до 10" М различаются. Отличие зависимости от линейной при более низких концентрациях может быть связано с адсорбцией ионов электролита стенками ячейки либо конкурентной адсорбцией ОН" пленкой нафиона на электроде. Тем не менее, точность аппроксимации в области малых концентраций остается удовлетворительной.

Рисунок 5. График зависимости определяемого тока от концентрации фенола, полученного при биодеградации двух серий модельных растворов диоксинов

Четвертая глава посвящена усовершенствованию прибора электрохимического контроля - вольтамперометрического анализатора с использованием в качестве основного регистрирующего устройства платы для ввода/вывода данных Advantech-1710L и измерительной платы для усиления сигнала. При этом в качестве регистратора и преобразователя информации предлагается использовать ординарный персональный компьютер и виртуально-ориентированную среду графического программирования Lab VIEW.

Функциональная схема усовершенствованного вольтамперметра показана на рисунке 6. Электрохимическая ячейка в усовершенствуемом приборе подсоединена к измерительной плате (ИП), предназначенной для усиления и измерения сигнала, идущего на плату Advantech-1710L, а от нее на виртуальный вольтамперметр, созданный в среде графического программирования Lab VIEW. Через интерфейс виртуального вольтамперметра задаются параметры анализа, поступающие через плату Advantech-1710L на микроконтроллер ИП, который задает линейно изменяющееся поляризующее напряжение с определенной скоростью развертки и подает сигнал в цифровом виде на источник поляризующего напряжения. Далее сигнал подается на электроды в электрохимической ячейке, где под действием приложенного потенциала начинает происходить электрохимическая реакция, сопровождающаяся переносом электронов.

Сигнал-отклик, получаемый в результате потенциостатического воздействия на ячейку, в виде тока индикаторного электрода преобразуется в пропорциональное току напряжение, которое поступает на усилитель ИП и ФНЧ, который выполняет определенные виды селекции информативной составляющей сигнала. При этом измерение малых токов в ИП выполняется таким образом, что при уменьшении сигнала-отклика последовательно подключаются два дополнительных усилителя, установленных после DA3 (преобразователя тока в напряжение). Первый из них (DD3) включается при снижении силы тока до 10"9 А, а второй (DD4) - до 10"12 А.

Отфильтрованный сигнал поступает на аналогово-цифровой преобразователь (АЦП). Сигнал в цифровом виде, соответствующий определенному информационному параметру сигнала, поступает на микроконтроллер. Это устройство синхронизирует преобразование сигнала с поляризующим воздействием. После этого через выходы ИП сигнал поступает на плату Advantech-1710L и отображается в виде вольтамперограммы на графическом индикаторе программы Lab VIEW, где также происходит автоматический расчет концентрации определяемого вещества по измеренному току.

ВВА получает команды от блок-схемы, которая является иллюстрированным алгоритмом действий и исходным текстом ВВА (рис. 7).

Далее производилась отладка прибора на реальных пробах с использованием предлагаемого биосенсора в качестве индикаторного электрода. В результате были получены вольтамперные пики, характеристики которых сравнивались с полученными ранее на существующем вольтамперометрическом комплексе СТА-1. Программа записывает в память оригинальный вид вольтамперной зависимости, а на экран выводится амплитуда полезного тока для удобства визуальной фиксации.

Был проведен анализ сходимости результатов, полученных на усовершенствованном вольтамперметре и существующем

вольтамперометрическом комплексе СТА-1 (рис. 8). В качестве объекта исследования в данном эксперименте были взяты серия модельных проб диоксиноподобных соединений, приготовленных из их прекурсора - фенола.

Таким образом, применение современных технологий позволило создать более современную компоновку вольтамперометрического анализатора с большим, чем у существующих приборов, диапазоном определяемых концентраций, что дает возможность использовать его не только в лаборатории стационарно, но и для экспресс-анализов в составе передвижной лаборатории.

Завершающей стадией исследования являлось сличение погрешностей результатов измерений, полученных на усовершенствованном вольтамперметре (поверяемый прибор) и существующем вольтамперометрическом комплексе СТА-1 (образцовый прибор). При непосредственном сличении относительных погрешностей измерений на поверяемом и образцовом приборах были выявлены отклонения не более чем на 0,4%.

В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы.

Рисунок 7. Блок - диаграмма обработки сигнала виртуальным вольтамперметром, созданным в среде графического программирования

ЬаЬУ1Е\¥

Рисунок 8. Регистрируемые токи при проведении экспериментального определения диоксиноподобных соединений на вольтамперметре СТА-1 и усовершенствованном вольтамперметре

-усовершенствованный вольтамперметр

4,5 5,5

•Ьг С [М]

Основные результаты работы.

1. Анализ литературных данных показал, что для количественного определения диоксинов необходимо комбинирование существующих методов контроля с биохимическими методами.

2. Изучение ферментных систем организма, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков, позволило предложить изоформу фермента цитохрома Р4501А1 в качестве биообъекта разрабатываемого биосенсора.

3. Выбран стеклоуглеродный электрод в качестве основы разрабатываемого биосенсора, благодаря разнообразию его электрохимических и механических свойств, легкости включения дополнительных компонентов и стабильности работы в широкой области потенциалов и в вакууме.

4. Разработан способ иммобилизации фермента (изоформы цитохрома Р4501А1) на поверхность стеклоуглеродного датчика, модифицированной ионообменным полимером нафионом, вакуумированием в парах глутарового альдегида и сконструирован электрохимический биосенсор для определения диоксинов в объектах природной среды, основанный на регистрации продукта их ферментативной деградации - фенола.

5. Усовершенствована методика электрохимического определения массовых концентраций фенола в водных растворах, позволяющая отказаться от неполярных органических растворителей и продувки электрохимической ячейки во время анализа инертным газом, что позволило снизить погрешности анализа, уменьшить фоновый ток и упростить ход определения.

6. Впервые методом инверсионной вольтамперометрии с использованием разработанного биосенсора в качестве индикаторного электрода экспериментально определены концентрации диоксинов в диапазоне 10"6- 10"14 моль/л.

7. Усовершенствована система обработки сигнала биосенсора и создан виртуальный вольтамперометрический анализатор на основе среды графического программирования ЬаЬУШХУ, встраиваемой в ПК платы для ввода/вывода данных Аёуа^есЬ-171ОЬ и измерительной платы для усиления и обработки сигнала биосенсора. Это позволило увеличить диапазон определяемых концентраций до 10"12 моль/л, обеспечить высокую скорость передачи, регистрации и обработки данных электрохимической ячейки и создать более современную компоновку вольтамперометрического анализатора, что дает возможность использовать его не только в лаборатории стационарно, но и для экспресс-анализов в составе передвижной лаборатории.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях

1. Гоголь Э.В., Глебов А.Н., Гумерова Г.И. Вольтамперометрический анализатор для определения содержания фенола в пробах воздуха рабочей зоны // Вестник КГТУ им. А.Н. Туполева. - 2009. - № 2. - С. 54-56.

2. Гоголь Э.В., Тунакова Ю.А., Гумерова Г.И., Исхакова М.Н., Богданова Д.А. Экспресс-анализ в экохимии. // Вестник Казанского технологического университета. -2013.- Т.16.-№ 1.-С. 163-167.

3. Гумерова Г.И., Галиева А.Т., Гоголь Э.В. Методика определения диоксиноподобных токсикантов // Вестник КГТУ им. А.Н. Туполева. - 2013. -№ 1.-С. 125-130.

4. Гумерова Г.И., Гоголь Э.В. Микропечатный биосенсор для мониторинга объектов окружающей среды // XVI Туполевские чтения: Международная молодежная научная конференция, 28-29 мая 2008 года: Труды конференции. Том II. - Казань: Изд-во Казан, гос. техн. ун-та, 2008. - С. 171-173.

5. Гумерова Г.И., Николаев Т.А. Использование углеродсодержащих материалов в вольтамперометрии для определения загрязнителей окружающей среды // XVII Туполевские чтения. Международная молодежная научная конференция, 26-28 мая 2009 г: Труды конференции. Том II. - Казань: Изд-во Казан, гос. техн. ун-та, 2009. - С. 50-51.

6. Гоголь Э.В., Гумерова Г.И., Галиева А.Т. Ферментсодержащий сенсор на основе углеродистых материалов для мониторинга загрязнителей окружающей среды // XVIII Туполевские чтения: Международная молодёжная научная конференция, 26-28 мая 2010 года: Материалы конференции. Том III. -Казань: Изд-во Казан, гос. техн. ун-та, 2010. - С. 161-163.

7. Гоголь Э.В., Гумерова Г.И., Ханнанова А.Р. Способы определения полигалогенированных диоксинов, дибензофуранов и бифенилов в объектах окружающей среды // XIX Туполевские чтения: Международная молодёжная научная конференция, 24-26 мая 2011 года: Материалы конференции. - Казань: Изд-во Казан, гос. техн. ун-та, 2011. - С. 186-189.

8. Гоголь Э.В., Гумерова Г.И., Галиева А.Т., Глебов А.Н. Ферментсодержащие сенсоры для мониторинга следовых количеств органических токсикантов // Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий: Сборник научных статей I Международной научно-практической конференции / Под ред. A.B. Димитриева, Е.А. Синичкина. -Чебоксары: Новое время, 2011. - С. 131-132.

9. Гоголь Э.В., Гумерова Г.И., Галиева А.Т., Ханнанова А.Р. Электрохимический сенсор для обнаружения стойких органических загрязнителей в объектах окружающей среды // ELPIT 2011. Экология и опасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов: сборник трудов III Международного экологического конгресса (V Международной научно-технической конференции), научный симпозиум «Экологический мониторинг промышленно-транспортных комплексов», 21-25 сентября 2011 года, Тольятти- Самара, Россия. Т. 4. - Тольятти: ТГУ, 2011. - С. 87-91.

10. Гоголь Э.В., Гумерова Г.И., Ханнанова А.Р. Проблемы детектирования ПХДЦ/ПХДФ в объектах окружающей среды // II Международная заочная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы науки»: Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции, 27 сентября 2011 г. - Тамбов: Изд-во ТРОО «Бизнес-Наука-Общество», 2011. - С. 42.

11. Гоголь Э.В., Гумерова Г.И. Модернизация методов определения диоксиноподобных экотоксикантов. // XX Туполевские чтения: Международная

молодёжная научная конференция, 22-24 мая 2012 года: Материалы конференции. - Казань: Изд-во: КНИТУ-КАИ, 2012. - С. 235-238.

12. Гумерова Г.И., Гущина А.Л., Богданова Д.А. Высокочувствительные ферментные электроды для контроля фенола в объектах окружающей среды // XX Туполевские чтения: Международная молодёжная научная конференция, 22-24 мая 2012 года: Материалы конференции. - Казань: Изд-во: КНИТУ-КАИ, 2012.-С. 240-241.

Подписано к печати 28.02.2014 г. Формат 60x84/16 Гарнитура «Times» Бумага офсетная Физ. печ. л. 1,0 Усл. печ. л. 0,93

_Тираж 100 экз. Заказ № Г13_

Копи-центр КНИТУ-КАИ. 420111, Казань, ул. К. Маркса, 10

КАЗАНСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. А.Н. ТУПОЛЕВА (КНИТУ-КАИ)

На правах рукописи

04201457926

Гумерова Гузель Ильдаровна

МЕТОД КОНТРОЛЯ ПОЛИГАЛОГЕНИРОВАННЫХ ДИБЕНЗО-//-ДИОКСИНОВ И РОДСТВЕННЫХ ИМ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДИСТЫХ

МАТЕРИАЛОВ

Специальность: 05.11.13. - Приборы и методы контроля природной среды,

веществ, материалов и изделий

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук,

доцент кафедры общей химии и экологии КНИТУ-КАИ Гоголь Эллина Владимировна

Казань, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение........................................................................... 4

1 Методы контроля диоксиноподобных ксенобиотиков.............. 10

1.1 Гибридные методы определения диоксинов.............................. 13

1.2 Фотометрический метод определения диоксинов........................ 21

1.3 Иммуноферментные и биологические методы анализа................. 21

2 Разработка биосенсора для определения полигалогенированных дибензо-я-диоксинов и родственных им соединений................ 27

2.1 Обоснование выбора изоформы цитохрома Р4501А1 как биорецептора 27 ПХДД/ПХДФ......................................................................

2.2 Обоснование выбора материала электрода как основы биосенсора.......................................................................... 35

2.3 Выбор способа модифицирования электрода полимерными материалами....................................................................... 48

2.4 Выбор способа иммобилизации фермента для включения в состав стеклоуглеродного электрода................................................ 53

2.4.1 Способ иммобилизации путем смешивания раствора мономера с ферментом........................................................................ 57

2.4.2 Способ иммобилизации фермента на водонерастворимых твердых носителях механическим перемешиванием............................... 58

2.4.3 Способ иммобилизации путем обработки органического носителя водным раствором фермента................................................................................................59

2.4.4 Иммобилизация фермента путем включения его в структуру полимера 60

2.4.5 Способ фиксации фермента на материале - носителе посредством глутарового альдегида................................................................................................................61

2.4.6 Способ иммобилизации изоформы фермента цитохрома Р4501А1 вакуумированием в парах глутарового альдегида..........................................62

3 Экспериментальная часть................................................... 68

3.1 Экспериментальное определение токсичности модельного раствора фенола и раствора, содержащего диоксины.............................. 69

3.2 Усовершенствование методики определения фенола вольтамперометрическим методом..................................................................................73

3.3 Использование разработанного биосенсора для определения диоксинов........................................................................ 79

4 Разработка виртуального вольтамперометрического анализатора..................................................................... 86

4.1 Описание платы Ас1уап1ес11- 1710Ь........................................... 95

4.2 Виртуально-ориентированная среда графического программирования ЬаЬУ1Е\¥........................................................................... 99

4.3 Структура разрабатываемого вольтамперометрического анализатора........................................................................ 105

4.4 Оценка погрешностей экспериментального определения содержания диоксиноподобных соединений на усовершенствованном

вольтамперметре................................................................. 116

Выводы............................................................................ 123

Список сокращений и условных обозначений......................... 125

Список использованной литературы..................................... 127

ВВЕДЕНИЕ

Полигалогенированные дибензо-я-диоксины (ПХДД) и родственные им соединения (полихлорированные дибензофураны (ПХДФ), полиароматические углеводороды (ПАУ)) - одни из самых опасных ксенобиотиков: обладая мутагенными и канцерогенными свойствами, они становятся причиной изменений функционирования и существования экологических систем. В связи с этим необходим постоянный контроль содержания подобных соединений в природной среде.

В основе количественного контроля ПХДД/ПХДФ и ПАУ лежат гибридные методы физико-химического анализа - сочетание хроматографии и масс-спектрометрии. Оно обеспечивает высокую чувствительность, является способом подтверждения идентичности соединений, но имеет ряд ограничений для целей массового анализа: низкую производительность, невозможность определения некоторых диоксиноподобных соединений, высокую стоимость анализа, зависимость пробоподготовки от происхождения проб объектов природной среды, их компонентного состава и параметров оборудования. Кроме того, среди проблем контроля объектов природной среды есть такие, решить которые затруднительно даже с помощью вышеуказанных методов : аварийные поступления загрязнений от предприятий, арбитражная практика, когда подтвердить аналитическую информации, полученную методами ГХ/МС или ВЭЖХ/МС необходимо результатами, полученными совершенно иным методом контроля (электрохимическим, биохимическим и пр.).

В этой связи разработка ферментных методов определения полигалогенированных дибензо-я-диоксинов и родственных им соединений является актуальной.

Настоящая работа посвящена усовершенствованию метода качественного и количественного определения ПХДД/ПХДФ. Автором предложен биохимический метод, который может комбинироваться с методами ГХ/МС или ВЭЖХ/МС, либо использоваться для экспресс-анализа. Он основан на каталитических свойствах

монооксигеназных ферментных систем цитохромов Р450. В его основе лежит биохимическая реакция, в ходе которой ПХДД/ПХДФ разрушаются под действием закрепленной на электрохимическом модифицированном нафионом стеклоуглеродном датчике изоформы фермента цитохрома Р4501А1. В процессе каталитической деградации диоксинов (ПХДД) образуется фенол, концентрация которого измеряется методом инверсионной вольтамперометрии и прямо пропорциональна концентрации диоксинов в исходной смеси. Предложенный метод не требует сложной пробоподготовки и дает возможность во много раз упростить и удешевить контроль диоксинов в объектах природной среды.

Объект исследования: усовершенствование метода и аппаратных средств контроля полигалогенированных дибензо-я-диоксинов и родственных им соединений в природной среде.

Предмет исследования: методическое обеспечение и приборная реализация метода биохимического контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений.

Цель работы: разработка и реализация метода контроля полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучить токсические свойства полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им " соединений, механизм их образования и трансформации в объектах природной среды и методы аналитического контроля;

- подобрать фермент, участвующий в процессе биохимического разложения полигалогенированных дибензо-и-диоксинов и родственных им соединений в объектах природной среды;

- обосновать выбор материала для изготовления биосенсора;

- разработать способ иммобилизации (закрепления) фермента на поверхности биосенсора;

- обосновать метод определения диоксинов в объектах природной среды путем их биохимического разложения до фенолов;

- усовершенствовать метод электрохимического измерения массовых концентраций фенола;

- усовершенствовать систему обработки сигналов биосенсора посредством виртуально-ориентированной среды (виртуального вольтамперометрического анализатора).

Методы исследования. Исследование базируется на электро- и биохимических методах контроля объектов природной среды, методах биотестирования, методах планирования эксперимента, методах графического программирования, методах математической статистики.

Новые научные результаты:

1. Получены модельные растворы полигалогенированных дибензо-и-диоксинов на основе механизма образования их из прекурсоров и трансформации данных соединений в объектах природной среды.

2. Выбран фермент применительно к условиям изготовления биосенсора для контроля полигалогенированных дибензо-гс-диоксинов.

3. Разработан способ иммобилизации цитохрома Р450 на стеклоуглеродном электроде.

4. Усовершенствована методика измерения концентраций фенола методом инверсионной вольтамперометрии.

5. Создана система обработки сигналов биосенсора с иммобилизованным цитохромом Р450 посредством виртуального вольтамперометрического анализатора.

Практическую значимость работы составляют:

1. Разработанный биосенсор позволяет количественно определить полигалогенированные дибензо-и-диоксины на основании концентрации фенола, образующегося в ходе их ферментативной деградации.

2. Результаты исследований способов иммобилизации ферментов позволили предложить способ закрепления цитохрома Р450 на модифицированной нафионом поверхности стеклоуглеродного электрода.

3. Усовершенствована методика вольтамперометрического измерения концентраций фенола, что привело к более точным и воспроизводимым результатам.

4. Создание системы сбора и управления данными электрохимической ячейки в виртуально-графической среде ЬаЬУ1Е\\^ позволяет уменьшить предел определяемых концентраций и дает возможность проводить экспресс - анализы в составе передвижной лаборатории.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Для комбинированного или предварительного экспресс-контроля полигалогенированных дибензо-я-диоксинов и родственных им соединений в объектах природной среды предложено использование биосенсора, предполагающего сочетание физико-химического датчика (сенсора) и биообъекта (фермента).

2. Обоснован выбора фермента и материала электрода применительно к условиям изготовления биосенсора для контроля полигалогенированных дибензо-л-диоксинов.

3. Разработан способ иммобилизации цитохрома Р450 на стеклоуглеродном электроде, модифицированном ионообменным полимером нафионом.

4. Предложено усовершенствование вольтамперометрической методики измерения концентраций фенола путем изменения процедуры электрохимических измерений.

5. Предложена система обработки сигналов биосенсора с иммобилизованным цитохромом Р450 посредством виртуального вольтамперометрического анализатора, обеспечивающая высокую скорость передачи, регистрации и обработки данных электрохимической ячейки с программным вычитанием фонового тока.

Достоверность полученных результатов и обоснованность выводов

диссертационной работы обеспечивается совпадением полученных в работе результатов с результатами известных теоретических и численно-модельных исследований других авторов, а также совпадением найденных результатов с известными из литературы данными по влиянию изоформы цитохрома Р4501А1

на полигалогенированные дибензо-и-диоксины и родственные им соединения и подтверждением теории экспериментом. Достоверность также подтверждается использованием апробированных математических методов и оценок, использованных при проведении эксперимента, обработке и анализе регистрируемых данных.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международной молодежной научной конференции «XVI Туполевские чтения» 2829 мая 2008 года, Казан, гос. техн. ун-т., Казань; VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009» 21-27 июня 2009 года, Маар. гос. ун-т., Иошкар- Ола; XXI Всероссийской межвузовской научно-технической конференции «Электромеханические и внутрикамерные процессы в энергетических установках, струйная акустика и диагностика, приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий» 12-14 мая 2009 года, Казань; Международной молодежной научной конференции «XVII Туполевские чтения» 26-28 мая 2009 года, Казан, гос. техн. ун-т., Казань; Международном научно-техническом конгрессе «Экология и безопасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов» ELPIT-2009 24-27 сентября 2009 года, ТГУ, Тольятти; Международной молодежной научной конференции «XVIII Туполевские чтения» 26-28 мая 2010 года, Казан, гос. техн. ун-т., Казань; Международной молодежной научной конференции «XIX Туполевские чтения» 2426 мая 2011 года, КНИТУ-КАИ, Казань; I Международной научно- практической конференции «Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий» февраль 2011 года, Чебоксары; III Международном экологическом конгрессе (V Международной научно- технической конференции, научный симпозиум «Экологический мониторинг промышленно- транспортных комплексов») «ELPIT 2011. Экология и опасность жизнедеятельности промышленно- транспортных комплексов» 21-25 сентября 2011 года, ТГУ, Тольятти; Региональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты окружающей среды в химической промышленности и смежных областях» март 2011 года, Новочебоксарск; II Международной заочной научно- практической конференции

«Актуальные проблемы науки» 27 сентября 2011 года, М-во обр. и науки РФ, Тамбов.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 17 научных публикациях, включая 3 статьи в ведущих научных изданиях, входящих в перечень ВАК, 15 материалов докладов международных конференций, 1 материал доклада всероссийской конференции.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка использованных источников, включающего 165 наименований. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включая 43 рисунка и 22 таблицы.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ДИОКСИНОПОДОБНЫХ

КСЕНОБИОТИКОВ

Вещества, содержащиеся в окружающей среде, но не входящие в биотический круговорот (чуждые живым организмам) называют «ксенобиотиками». Эти химические вещества, содержащиеся в объектах окружающей среды, можно рассматривать как источники формирования ксенобиотического профиля экосистемы [1], оказывающего токсическое действие на живые организмы, в связи с чем возникает необходимость его качественного и количественного экологического контроля [2]. Наиболее опасные ксенобиотики называют приоритетными, к их числу относят диоксины [3].

Диоксины или диоксиноподобные соединения - собирательный термин для галогенированных шестичленных ароматических углеводородов, содержащих в своем составе дба атома кислорода. Наибольшую опасность из этого класса соединений представляют полихлорированные дибензо-я-диоксины (ПХДД), такие как 2,3,7,8-тетрахлордибензо-и-диоксин, полихлорированные дибензофураны (ПХДФ) и полихлорированные бифенилы (ПХБ) (рисунок 1.1.) [4]. Диоксины относятся к стойким органическим загрязнителям благодаря их канцерогенности, мутагенности, длительному периоду полураспада, способностью к биоаккумуляции из-за липофильности (или гидрофобных свойств) и трансграничному переносу [5].

В гомологический ряд полихлордибензо-я-диоксина входят 75 соединений, а полихлордибензофурана - 135. Кроме того, существуют 75 различных конгенеров бромпроизводных дибензо-я-диоксинов и 135 конгенеров бромпроизводных дибензофуранов. Только 7 из 75 конгенеров хлор- и бромпроизводных обладают диоксиноподобной активностью, т.е. особо токсичны для окружающей среды. Из 135 возможных конгенеров хлор- и бромпроизводных дибензофуранов только 10 имеют сходную активность. А из 209 конгенеров ПХБ 13 обладают диоксиноподобной токсичностью [6].

С1

С1

С1

С1

С1

С1

С1

2,3,7,8-тетрахлордибензо-я-диоксин

2,3,4,7,8-пентахлордибензофуран

С1

а

С1

С1

а

3,3',4,4',5-пентахлорбифенил

Рисунок 1.1. Структурные формулы диоксиноподобных соединений

Все соединения диоксинового ряда характеризуются высокой температурой плавления (> 800 °С), низкой растворимостью в воде (0,2 мкг/л) и хорошей растворимостью в неполярных растворителях, устойчивостью к агрессивным средам и окислителям в отсутствии катализаторов, высокой способностью к адгезии к любым поверхностям. Как следствие, накопление или адсорбция этих веществ происходит в донных отложениях, взвешенных твердых частицах, золе, саже и жировых тканях организма, тогда как в водных средах в значительных количествах они не обнаруживаются. Эти свойства важны для прогнозирования образования диоксинов в ряде производственных процессов, а так же для определения методов анализа и очистки [7].

Диоксины присутствуют в природной среде в виде сложных смесей, каждый из компонентов которых имеет разную токсичность, в связи с чем в пробах реальных объектов природной среды сложно определить их общую токсичность и оценить экологическую опасность смеси.

Согласно стандартам ВОЗ токсичность каждого соединения ряда диоксинов определяется фактором токсической эквивалентности (ФТЭ) по отношению к наиболее токсичной форме (2,3,7,8-ТХДД) и называется диоксиновым эквивалентом (ДЭ) размерностью нг/кг [8], который рассчитывает�