автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.16, диссертация на тему:Математическое моделирование морфо-функциональных изменений митохондрий по результатам экспериментального исследования с использованием модернизированного электронного микроскопа

ИНСТИТУТ «ИЗИКО ТЕХНИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ

На правах рукописи

СИРОТКИН Валерий Васильевич

Математическое моделирование морфо-функциональные изменений митохондрий по результатам экспериментального исследования с использованием модернизированного электронного микроскопа

Специальность 05.13.16. Применение вычислительной техники, математического моделирования и математических методов в научных исследованиях

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

Соискатель В. В. Сироткин ^ 1

Москва - 1992

Работа выполнена п институте физико-технических проблем

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор Л. Н. Лупичёв доктор медицинских наук, профессор |Н- Л Володин

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор В. А. СЬмрнов кандидат медицинских наук Л. А. Беспалова

Ведущая организация Московский Высший Технический Университет им. К Э. Баумана

Защита диссертации состоится "УСУ" ¿>^^^-/1992 г. в часов на заседании Специализированного Совета ССД 109. 02. 01 Института физико-технических проблем, адрес: 119034, Москва, ул. Кропоткинская, д. 13/7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Физико-технических проблем

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь Совета,к.т.:

К Н. Залмчев

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. До настоящего времени объективная интерпретация многих функциональных и структурных изменений клеточных органелл,включая и митохондрии,по электронно-микроскопическим изображениям остается спорной (Ыитюшин В. VI , .Ковырева Е. а 1978; Баласявичус Р. а и др. 1985). Сложившиеся представления о структуре и функции митохондрий базируются на фундаментальных биофизических и электронно-микроскопических исследованиях,большая доля в которых принадлежит использованию описательных методов, причем все большее значение приобретают методы математической обработки электронно-микроскопических изображений ультраструктур клетки. Такая обработка позволила бы широко применись статистические приемы оценки изменений ультраструктур в практике электронно-микроскопических исследований. Однако это сдерживается отсутствием простых и удобных устройств и технических возможностей для проведения морфометрического анализа ультраструктур клеток. Применяемые же методы и аппаратура недостаточно совершенны для практического применения (Яновский К. А. ,1978).

В связи с этим разработка технических устройств для морфометрии электронно-микроскопических изображений с математическим анализом полученных данных, а также комплексное изучение морфо-функциональных свойств митохондрий являются актуальными задачами современной электронной микроскопии и цитологии.

Анализ данных литературы и проведенного патентного ис-

следования показывают,что несмотря на распространение метода морфометрии изображений ультраструктур с фотографий микро-обьектов, полученных с помощью электронного микроскопа, до настоящего времени не предложен эффективный способ получения статистической информации непосредственно с электронно-микроскопических изображений,не реиены вопросы технического оснащения подобных исследований. В частности не выявлены возможности применения метода морфометрии при оценке морфо-фун-кциональных характеристик митохондрий.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка новых технических решений для модернизации электронных микроскопов и создание математической системы для оценки морфометрических характеристик органелл клетки, включая митохондрии.

Конкретными задачами работы являлись:

1. Техническая модернизация сущэствуюцих систем электронных микроскопов с целью оптимизации проведения морфометрических исследований ультраструктур клетки.

2. Разработка статистических методов оценки морфо-функциональных характеристик митохондрий клеток эукариот.

3. Изучение качественных и количественных ультраст-рукгурных изменений митохондрий печени и сердца у облученны> и необлученных животных с использованием морфометрическогс устройства собственной конструкции и статистических методов.

4. Разработка математического способа оценки морфо-функциональных свойств митохондрий на основе статистически) исследований для объективизации их изучения.

Научная новизна исследования. Предложенный вариант технической модернизции конструкции электронных микроскопо]

позволил значительно улучшить регистрацию и обработку морфо-метрической информации при изучении ультраструктур клетки.

Разработаны и апробированы морфометрическая приставка для электронных микроскопов и два типа масштабных систем для ультраструктурометрии, уточнено место введения этих систем в колонну электронного микроскопа. Выведена математическая формула для расчета этих Систем. Новизна этих предложений подтверждается 3 авторскими свидетельствами и решением Госкоми-зобретений СССР о целесообразности их патентования в США,ФРГ и Японии.

Теоретическая и практическая ценность работы. Достигнуто снижение числа промежуточных операций при выполнении морфо-метрического анализа ультраструктур клеток,значительно повы-шакщее производительность труда.

Проведенный с помощью предложенных устройств и методик морфометрический анализ митохондрий интактных животных позволил установить,что полученные параметры соответствуют гамма-закону распределения плопэдей митохондрий. В условиях локального и общего ионизирующего облучения организма происходит тем значительнее отклонение в выраженности морфометри-ческих признаков от данного типа распределения, чем больше доза облучения.

Показано, что характерной реакцией организма на экспериментальное лучевое воздействие является появление набора митохондрий больших размеров. В данных условиях это сопровождается снижением интенсивности окислительного фосфорилирования. Появление вслед за этим мелких митохондрий является отражением компенсаторно-восстановительной реакции на снижение энергетического потенциала клеток.

- б -

Установлено,что облучение приводит к увеличению размеров митохондрий,которое отражается в характере распределений. Эти изменения можно связать с их функциональной активностью, а сдвиги в распределениях - проявлением компенсаторно-приспособительных возможностей митохондрий. Полученные данные отражают закономерности изменения митохондрий,вызываемые лучевым поражением.

На основе произведенного экспериментального исследования предложены принципиально новый способ оценки морфо-функционального состояния популяции митохондрий при изучении их с помощью электронного микроскопа и использованием предложенного математического анализа.

Новизна предложенных технических решений и методических приемов подтверждается 6-ю заявками на изобретения, по четырем из которых к настоящему времени выданы авторские свидетельства и 8-ю рационализаторскими предложениями. Положительный эффект достигнутый от их внедрения подтвержден актами испытаний и внедрений в Центральном ордена Ленина институте Усовершенствования Врачей, во Всесоюзном Научно-исследовательском институте физической культуры и на Сумском заводе электронных микроскопов.

Заводские испытания показали,что введенные в конструкцию современных электронных микроскопов усовершенствования не влияют и не изменяют их основных технических характеристик.

Ввиду отсутствия данного технического решения в современных электронных микроскопах Госкомизобретений СССР в сентябре 1983 года вынес решение о целесообразности патентования наших изобретений в США, ФРГ и Японии.

Апробация работы. Основные результаты и выводы были до-

ложены и обсуждены на следующих конференциях: межлабораторной конференции и-та Биофизики МЗ СССР (Москва, 1974); IX Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Тбилиси, 1973); X Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Ташкент,1976); XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Сумы, 1982); Координационном совеи^шии стран членов СЭВ и СФРЮ по проблемам биофизики (Пущино,1975); 1-ой Всесоюзной конференции по статистическим свойствам микроструктур (Москва,1978); Конференции молодых ученых ЦОЛИУВ (Москва, 1980); У-ом Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуре растений (Кишинев,1983); У1-ом Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуре растений (Чернигов,1988)¡заседании секции электронной микроскопии центрального правления научно-технического общества радиотехники,электроники и связи им. А. С. Попова (Москва,1983); I Всесоюзной конференции "Проблемы хронобиологии, хронопатологии,хронофармокологии и медицины'Ч Уфа,1985); конференции ЦНИЛ ЦОЛИУВ (Москва,1986); 1У-ой научно-практической конференции "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва,1986); 1-ом Всесокином симпозиуме: "Современные методы электронной микроскопии в биологии и медицине" (Звенигород, 1986); межлабораторном научном семинаре ИФГП Минприбора СССР и АН СССР (Москва,1987).

Публикации. По материалам диссертации получено 4 авторских свидетельства, 2 приоритетных номера на предполагаемые изобретения, опубликовано 28 статей и получено 8 удостоверений на рационализаторские предложения.

- О -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Представления о структуре и функции митохондрий базируются на фундаментальных электронно-микроскопических и биохимических исследованиях, большая доля в которых принадлежит использованию описательных методов. Применяемые методы морфологического изучения очень трудоемки и вносят в результат значительную долю субъективизма, поэтому актуальной остается задача подробного количественного описания этих клеточных органелл.

В связи с развитием математических методов интерприта-ции электронно-микроскопических изображений,в последние годы ведутся разработки анализа микроструктур объектов на основе средств электронно-вычислительной техники. В отечественной и зарубежной литературе можно найти ряд конструкций цитоспект-роскопии,счетчиков и анализаторов микрочастиц,однако,несмотря на имеющиеся определенные достижения в целом,существующие методы и аппаратура неприменимы или недостаточно совершенны для широкого круга практического применения.

Необходимость получения морфометрической информации

[

электронно-микроскопических изображений, иногда, заставляет авторов пользоваться трудоемкими и непродуктивными методами, например такими, как весовой способ количественной обработки изображений с его модификациями или копирование электронног-рамм на бумаге с последующими измерениями.

Серьезным препятствием для проведения морфометрических исследований на основе объективного изучения процессов является пока еще недостаточность -простых методик-и устройств, расширяющих использование ручных способов морфометрии. Ограниченное использование статистических методов в электронной микроскопии объясняется необходимостью затраты боль-

- У -

шого количества времени для получении достоверных данных и на получение необходимого количества наблюдений.

Целью настоящего исследования являлась разработка новых технических решений для модернизации электронных микроскопов и создание системы для оценки морфометрических характеристик ультраструктур клетки,включая митохондрии. Конкретными задачами работы являлись:

1. Техническая модернизация существующих систем электронных микроскопов с целью оптимизации проведения морфометри-ческих исследований ультраструктур клетки.

2. Разработка статистических методов оценки морфо-функцио-нальных характеристик митохондрий клеток эукариот.

3. Изучение качественных и количественных ультраструктурных изменений митохондрий печени и сердца у облученных и не-облученных животных с использованием морфометрического устройства собственной конструкции и статистических методов.

4. Разработка способа оценки морфо-функциональных свойств митохондрий на основе статистических исследований.

Разработанная нами модификация просвечивающего электронного микроскопа с морфометрической приставкой собственной конструкции позволила значительно упростить процедуру измерения микрообъектов и тем самым повысить эффективность процесса получения количественной информации за счет непосредс ■гвенной регистрации с экрана электронного микроскопа.

Опираясь на теоретические представления о конструкции электронного микроскопа,а также на известные данные о глуби не резкости электромагнитных линз было предложено для повышения точности морфометрического анализа, масштабную систему располагать между проекционной линзой и экраном (Авт. свид. N

1()мг/.)Р.Я от 15.12.83.).

Ят основу масштабной системы была взята известная из литературы квадратная решетка, нанесенная не на стекло или другой прозрачный материал, а выполненная в виде сетки,сплетенной из тонкой ненамагничиваюшейся проволоки.

Изготовленная нами масштабная система выполнена в виде сетки, содержащей две системы прямоугольых я'л-ск, коддая из которых выполнена с одинаковым периодом и расположена внутри ячейки другой системы с большим периодом (Авт. свид. N 1151143 от 1Г>. 12. 84.).

Для ввода и вывода масштабной системы из пучка электронов, не нарушая при этом вакуума в колонне электронного микроскопа, были разработаны два специальных устройства.которые повышали точность отсчета, сокращали время морфометрического анализа объекта, при этом еда повышалось удобство в эксплуатации масштабных систем.

Существующие аналогичные системы использовать в электронных микроскопах практически невозможно. Свободное пространство внутри колонны электронного микроскопа очень ограничено размерами,что не позволяет использовать любой известный механизм ввода и вращения масштабных систем.

В предложенной нами морфометрической приставке к электронному микроскопу механизм переметения позволяет отклонять масиггабную систему под углом,врашать ее относительно объекта в нужном направлений Авт. свид. N 1314875 от 1. 02. 87.).

Точность отсчета достигалась возможностью ориентации масштабной системы относительно продольной оси исследуемого объекта. Повышение удобства эксплуатации при этом достигалось: во первых тем,что использование морфометрической прис-

тавки исключает необходимость разгерметизации колонны электронного микроскопа;во вторых,ручки управления масштабной системой расположены в удобном для оператора месте.

Проведенные испытания и внедрения наших усовершенствований просвечивающего электронного микроскопа показали, что они не влияют и не изменяют основных характеристик прибора, что подтверждается актами испытаний и внедрений их на Сумском заводе электронных микроскопов, во Всесоюзном Научно-исследовательском институте Физической культуры и в Центральном ордена Ленина Институте Усовершенствования Врачей (1981,1983,1986). Испытания этих устройств и внедрение их в различных учреждениях показали следующие преимущества по сравнению с известными способами получения морфометрической информации с использованием электронного микроскопа: значительно экономится время накопления морфометрической информации при электронно-микроскопических исследованиях,а следовательно сокрап^етея и время рентгеновского облучения оператора; отсутствует необходимость использования фотоматериалов при морфометрических исследованиях с помощью электронного микроскопа; повышается качество и точность получения результатов, а также При необходимости, появляется возможность увеличивать выборку для получения статистически достоверных данных; двухпериодная морфометрическая сетка создает условия для исследования разных по величине структур непосредственно с экрана электронного микроскопа; предложенная универсальная масиггабная система позволяет проводить статистический анализ без морфометрического исследования изучаемых объектов.

В последние годы роль математической обработки изображений в электронной микроскопии существенно выросла,а с при-

влечением математического аппарата и алгоритмов, разработанных в теории обработки многомерных сигналов, она становится необходимым инструментом интерпретации и выделения объектов по электронно-микроскопическим изображениям. В настоящее время применение методов морфометрии и статистической обработки в электронной микроскопии ведется с полученных электронно-грамм или микрофотографий.

В своей работе мы использовали разработанный нами способ получения морфометрической информации непосредственно с экрана электронного микроскопа и статистическую теорию принятия гипотез для оценки эмпирических распределений.

Объектом исследования являлись выделенные митохондрии гепатоцитов и митохондрии кардиомиоцитов мышей и крыс,изучение которых проводилось как у интактных животных,так и у животных после однократного облучения разными дозами (6; 7,5; 9; 20 Грей) в разные временные интервалы.

При изучении распределений плонвдей выделенных митохондрий гепатоцитов облученных мышей (в дозе 7,5 Грей) через 5 минут после облучения видно резкое уменьшение величин плода-ди митохондрий и накопление их в первых трех классах (76 X), причем к 1 - 2 классам относятся 68 7. всех митохондрий. Через 30 минут после воздействия видна обратная реакция - в первых двух классах их остается 22 7. от общего количества Однако уже через час после воздействия снова наблюдается концентрация митохонддрий в первых трех классах (71 %). Выявленная цикличность к 4 и 5 часу несколько нивелируется, а процент насыщенности митохондриями, относящимися ко второму классу, приближается к исходному уровню (35 7. относительно контрольного значения (без облучения) - 39 X.

Гистограммы, построенные на основании эмпирических данных контрольных выборок митохондрий, имеют один вид кривой и достоверно не отличались друг от друга. При этом максимальное значение количества митохондрий всегда относилось к второму классу и составляло в среднем 38,6 7.. К первому классу -25,1 X, а начиная со второго класса гистограмма характеризовалась плавным снижением к шестому классу,что соответственно составляло: 19,7 2; 10,1 5,3 7.\ 2,3 X.

Выявленная закономерность нарушается под воздействием облучения,появляются дополнительные максимумы в гистограммах в 1-ом,3-ем,4-ом и 6-ом классах. Вариационные кривые приобретают более ратянутый вид за счет увеличения размеров митохондрий выделенных из печени облученных животных и появляются новые классы (7-ой, 8-ой, 9-ый).

Все выше перечисленное иллюстрируется изменением средних площадей в зависимости от времени после облучения. В контроле средняя площадь всех наблюдаемых митохондрий находилась в одном интервале и достоверно не отличались. В то время, как в опытах с облучением выявленные изменения носили циклический характер. Так,через 5 минут после воздействия облучения показатель среднего размера митохондрий находился на том же уровне,что и в контроле, а через 30 минут после облучения этот показатель увеличился в 2 раза и в последующем продолжал сохранять те же параметры. После облучения величина средней площади митохондрий возрастала вследствие увеличения числа крупных митохондрий, которые повидимому, набухали и в дальнейшем разрушались. Однако полной деградации всех митохондрий не наблюдалось. Более того,в нашем эксперименте с облучением животных в дозе 7,5 Грей,выявлены увеличения колич-

ства мелких размеров митохондрий и концентрация их в 1-ом классе (в 8-ой, 10-ой и 12-ой сериях). Это свидетельствует о регенерационных способностях митохондрий, т. е. о появлении в популяции "юных" форм, благодаря чему, по-видимому,создаются условия для нормального функционирования митохондрий.

В контрольных сериях наблюдаются колебания количества митохондрий в классах через определенные отрг:жи времени, но они незначительны и составляют максимум 7 %, причем максимальная амплитуда их колебаний выявлена для первого класса. Относительное постоянство количества митохондрий,выявлено во 2-ом и 3-ем классах, амплитуда колебаний которых составляет 1,5 г и з

На основании выявленных данных перераспределения митохондрий по классам,в зависимости от времени прошедшего после облучения,установлено,что амплитуда колебаний размеров митохондрий резко увеличивается и в некоторых случаях составляет 2.2. - 43 %, причем при наибольшем разбросе колебаний площадей митохондрий в первых четырех классах. Одновременно выявлено изменение митохондрий, относящихся ко 2 классу, включившему основную массу всех митохондрий. Можно предположить,что этот класс состоит из функционально наиболее активных митохондрий, количество которых в норме составляет 38-39 7. и сохраняется постоянным у контрольных мышей. В опьгге уже через 5 минут количество их резко увеличивается, через 1 час оно падает до 18 после чего к 4 часу наблюдается постепенное восстановление показателя до исходного уровня с последующим сохранением его в течение всего времени наблюдения.

При изучении распределений площадей митохондрий гепато-цитов легко заметить,что соотношение митохондрий первых трех

классов сразу же после облучения резко перераспределяется в своем количественном выражении и со временем стремится к исходным значениям. Количество митохондрий крупных размеров (5-9 классы) остается на довольно высоком уровне. Необходимо также отметить, что если в норме крупные митохондрии располагаются в 5 - б классах и не превышают 10 7., то увеличение размеров митохондрий,вызванное облучением,приводит к появлению дополнительных трех классов, количество которых увеличивается до 35 %.. Последние как можно предположить, разрушаются в дальнейшем. Повидимому.в первое время после облучения идет массовая гибель митохондрий и только в одном случае, через 5 минут, наблюдается снижение количества крупных размеров митохондрий с одновременным увеличением числа мелких. Очевидно происходит сжатие всех митохондрий в первые минуты после облучения. Прослеживается зависимость изменения перераспределений площадей митохондрий по классам в определенные промежутки времени. Таким образом, полученные данные указывают на то, что митохондрии печени -мышей в контрольных сериях лежат в одном интервале и достоверно не отличаются друг от друга. У животных подвергшихся общему облучению выборки площадей митохондрий печени достоверно отличаются друг от друга и от контрольных серий. Средние арифметические размеры площадей митохондрий печени необлученных мышей лежат в одном интервале. У животных подвергшихся общему облучению распределения митохондрий по классам колебались в большем интервале за счет увеличения количества крупных митохондрий. Выявлено увеличение площадей митохондрий печени мышей при облучении с появлением новых трех классов (7,8 и 9). С пятой минуты после облучения появляется дополнительный пик на гра-

фике,характеризующий увеличение количества митохондрий в 4,5 и 6 классах. Выявлена цикличность перераспределения плоиодей митохондрий печени мышей в зависимости от времени после облучения. Результаты статистического исследования площадей митохондрий печени мышей,а также проведенная проверка согласия эмпирического распределения с теоретическими (нормальным, логнормальным и гамма - законами) по критериям согласия Пирсона и Колмогорова показали, что во всех контрольных сериях опытов и в большинстве серий с радиационным облучением эмпирические распределения наиболее согласуются с гамма-законом распределения. Поэтому параметры этого закона распределения можно считать основными информационными показателями изменения состояния митохондрий печени облученных и необлученных животных.

Проведенное морфологическое исследование и статистический анализ данных об изменении размеров изолированных митохондрий печени мышей показал, что облучение в дозе 7,5 Грей приводит к изменению размеров митохондрий (площадей) и может являться следствием нарушения функциональной активности этих клеточных органелл.

По представленным данным можно судить о влиянии разных доз облучения на изменения размеров митохондрий кардиомиоци-тов крыс. Так, если при дозе облучения в 6 Грей наблюдается закономерное снижение среднего арифметического показателя от 32,1 X до 17,9 %, то при увеличении дозы облучения можно судить о рассинхронизации восстановительного процесса. Особенно наглядно это наблюдается в сериях при облучении дозой в 2 Грей. Через 2 часа после локального облучения миокарда крыс показатель среднего арифметического значения плоишей мито-

хондрий составил 22,2 %, через 5 суток он снизился до 15,9Х, а к десятым суткам он резко возрос до 35,1 7. с последующим снижением к году до исходдного уровня. Данные по проверке гипотез однородности случайных выборок митохондрий облученных и не облученных кардиомиоцитов крыс по критерию хи-квадрат подтверждают то, что увеличение дозы облучения сопровождается увеличением отклонений в распределениях митохондрий по площадям. Так, в контрольных трех сериях опытов кривые распределений митохондрий по площадям достоверно не отличаются друг от друга. Минимальное значение хи-квадрат составляет при сравнении распределений контрольных серий опытов 0,3,а максимальное значение этого показателя равняется 0,74. Увеличение дозы облучения сопровождается увеличением этого показателя от 1,7 до 69,9. Если при облучении дозой в 9 Грей (сравнивая 4 серию опытов через 2 часа после облучения с контрольными выборками) максимальный показатель отличия ■= 17,9, то максимальный показатель, полученный при сравнении 5-ой серии опытов (через сутки после воздействия) с контрольными выборками равен 10,9, а к 5 суткам эти отличия становятся практически не достоверны (хи-квадрат = 1,7). Таким образом,при малых дозах облучения (6 и 9 Грей) наиболее поражающее воздействие наблюдается в ранние сроки после облучения, а к пятым суткам выявленные изменения приближаются к исходному уровню. Повидимому,имеет место цикличность восстановительного процесса равная суткам. Облучение дозой 20 Грей приводит к рассинхронизации замеченной закономерности. Максимальные различия выявлены через 10 суток после воздействия (хи-квадрат = 60,9 - 69,9). В отдаленные сроки после облучения этот показатель значительно снижается, через б ме-

сяцев он колеблется от 6,3 до 8,8, через 12 месяцев от 12,3 до 16,9. Указанные значения хи-квадрат свидетельствуют о том, что через год после облучения дозой 20 Грей хотя и наблюдается приближение характера распределений митохондрий к исходному уровню,тем не менее, окончательного восстановления его не замечено. Все серии опытов с облучением кардиомиоцитов крыс достоверно отличаются от контрольных серий.

Таким образом, значения средних арифметических величин размеров митохондрий миокарда крыс в контрольных сериях опытов близки друг другу и могут быть представлены в виде прямой линии. Серии опытов с локальным облучением сердца крыс указывают на то,что увеличение дозы облучения с 6 Грей до 2( приводит к увеличению разброса. Значения моды в контрольны) сериях опытов подтверждает нал*« 'ичество митохонд-

рий, относящихся по размерам ко второму классу,а при увеличении дозы облучения моды увеличиваются за счет появлени: крупных митохондрий. При этом наблюдается увеличение количес тва митохондрий в старших классах и появление новых тре классов (7 - 9). Установлено четкое соответствие эмпиричес ких контрольных данных с теоретически рассчитанными по гам ма-закону распределения. Воздействие облучения несколько из меняет выявленную закономерность распределения митохондрий однако учитывая, что в большинстве случаев в митохондрия кардиомиоцитов нормальных и облученных животных гамма расл ределение апроксимирует лучше экспериментальные данные, т параметры этого закона можно считать основными информацион ними показателями изменения состояния митохондрий'кардиомис цитов у облученных животных. В контрольных сериях обнаружен преимущественное накопление митохондрий кардиомиоцитов

первых трех классах с максимальным значением, относящимся ко 2-му классу. При облучении дозой 6, 9 и 20 Грей содержание их в первых трех классах колеблется в широком интервале: 6 Грей - от 16 % до 39 %, 9 Грей - от 13 7. до 47 % и 20 Грей от 97. до Г>7 7„. Расхождение распределений площадей митохондрий контрольных и облученных животных характеризуется максимальным значением дивергенции при облучении дозой в 20 Грей. С увеличением дозы облучения значение дивергенции возрастало.

Примененная нами в эксперименте морфометрическая методика изучения митохондрий позволила провести корреляционный анализ изменения размеров митохондрий гепатоцитов с их функциональной активностью у животных, подвергнутых облучению.

Результаты показали,что увеличение количества митохондрий крупных размеров сопровождается снижением их дыхательной активности. Наиболее активными являются митохондрии первых трех классов. Общий уровень энергетической активности определяется не одним классом, а соотношением количества митохондрий всех классов. При этом наиболее интенсивно реагируют самые мелкие митохондрии (1 класс), что очень существенно в ■ изменении общей энергетической активности всей популяции ми-тохондри. Они если и не несут основную функциональную нагрузку, то способны наиболее быстро пополнять собой классы функционально активных митохондрий. Митохондрии 2-3 классов являются наиболее функционально активными. Увеличение плода-дей митохондрий,вызванное облучением,сопровозедается снижением дыхательной активности. Изменение функциональной активности при облучении можно объяснить перераспределением площадей митохондрий,т.е. изменением соотношения митохондрий с разными размерами и увеличением относительного числа крупных ми-

тохондрий со сниженной дыхательной функцией.

Распределение количества площадей митохондрий в норме и перераспределение их размеров при радиационном облучении животных можно охарактеризовать,как изменение функции Г = г( х) Построенные экспериментальные гистограммы,характеризующие из менения размеров митохондрий гепатоцитов и кардиомиоцитов у облученных животных с появлением двух экстремумов, является выражением эффекта на поражающее воздействие облучения. По нашему мнению первое максимальное значение точки экстремума является показателем количества функционально активных митохондрий, вторая точка экстремума характеризует появление увеличения количества гибнущих, набухших форм митохондрий прк облучении животных. Этот вывод подтверждается результатам! корреляционного анализа

Установленное нами изменение соотношения митохондрий ( увеличением числа крупных органелл под влиянием облученш может свидетельствовать об их функциональной неполноценное^ и вероятно является причиной энергитического дефицита кле ток. Увеличение количества митохондрий мелких размеров можш рассматривать, как проявление усиления компенсаторно-присно собительных механизмов энергообеспечения субклеточных струк тур.

Учитывая выявленную закономерность подчинения расиреде лений митохондрий гамма-закону, как для выделенных митохонд рий гепатоцитов, так и для митохондрий клеток кардиомиоци тов.а также синхронность в перераспределениях размеров мито хондрий при облучении,одинаковый характер распределения плс щадей митохондрий,выделенных и изученных в клетках интактнь животных мы полагаем,что по изменению распределения размере

митохондрий можно судить об их функциональном состоянии. Таким образом, морфометрическая оценка изменения размеров митохондрий должна учитываться при электронно-микроскопическом изучении клеток для оценки морфо-функциональных свойств популяции этих клеточных органелл. Результаты электронно-микроскопического, морфологического и биофизического анализа состояния митохондрий гепатоцитов и кардиомиоцитов после однократного облучения животных показало, что облучение приводит, в целом, к ухудшению энергообеспечения клеток печени и сердца и проявляется в увеличении количества крупных форм митохондрий со сниженными функциональными способностями. Проведенный корреляционный анализ, а также доказанное появление дополнительных трех классов митохондрий при облучении убедительно свидетельствуют в пользу этого вывода.

Используя закон распределения размеров митохондрий, а также параметры этого закона,полученные при облучении животных разными дозами, появилась возможность прогнозирования состава популяции митохонддрий в зависимости от времени и дозы облучения. Эти параметры являются основными информационными показателями изменения морфо-функциональных свойств популяции митохондрий.

Проведенное экспериментальное исследование и выявленная закономерность подчинения распределений случайных выборок площадей митохондрий гамма-закону распределения, позволяют предложить способ оценки морфо-функционального состояния митохондрий по электронно-микроскопическим изображениям.

Способ определения морфо-функциональной активности митохондрий при внешнем воздействии основан на определении функциональной активности митохондрий и изучении перераспре-

делений их размеров. По размерам плоиодей митохондрий определяют статистическую закономернось распределения и выявляют параметры характеризующие данное распределение. Определяют математическую функциональную зависимость изменения этих параметров от дозы и времени прошедшего после воздействия с последующим определением и прогнозированием морфо-функциональной активности-митохондрий. Если статистичскую закономерность распределения плоишей митохондрий принять из начальных условий, гамма-распределения площадей митохондрий, то с целью сокращения времени исследования можно проводить толькс морфометрическое исследование (Авт. свид. N 1488720 от 22. 02.89.). При этом определяют их количество и плоишь, пс которым рассчитывают среднее значение и дисперсию (парамет[ масштаба и параметр формы. По отклоненю дисперсии (параметре формы) в меньшую иди большую сторону от 1 определяют изменение морфо-функциональной активности популяции митохондрий. Пс изменению функции распределения этого параметра в зависимости от времени и дозы осуществляют прогнозирование измененш популяции этих клеточных органелл в определенном типе ткане!

Использование предложенного способа оценки морфофункцио-нального состояния митохондрий клеток жизненно важных биохимических объектов имеет важное теоретическое и прикладно( значение не только для радиобиологии,но и ряда других напрш лений медико-биологических исследований, связанных с воздействием различных внешних факторов (физических и химических; на живые системы.

Учитывая вышесказанное,а также достаточно высокую чувст вительность митохондрий к физическим воздействиям следует ]

комендовать использование предложенного способа определения морфо-функциональной активности митохондрий в качестве тест-системы для оценки возможного поражающего действия электромагнитных излучений как высоких, так и низких уровней интенсивности. При этом целесообразно проводить оценку реакций митохондрий как при облучении целостного организма, так и воздействии ЭМИ на клеточные структуры.

В результате выполнения подобных исследований с использованием предложенного способа оценки морфо-функциональной активности митохондрий клеточных структур жизненно важных органов биологических объектов будут получены результаты как функционального характера (механизмы взаимодействия живых систем и ЭМИ), так и прикладного значения (оценка эффективности поражающего действия ЭМИ). Определённую роль использование данного способа может иметь в радиоэкологических и других исследованиях, связанных с повреждающим воздействием факторов внешней среды на живые системы.

выводи.

1. Для объективизации изучения ультраструктур клеток впервые разработана и внедрена в практику морфометрическая приставка к электронному микроскопу, которая позволила получать необходдимые морфометрические параметры непосредственно с экрана микроскопа, что значительно ускорило время получения количественной информации о динамике изменений митохондрий.

2. При анализе изменений плоивдей митохондрий клеток печени и серддца интактных мышей и крыс получено распределение их в норме, включающее в себя 6 классов. В условиях как локального, так и общего облучения животных наблюдалось увеличение числа классов крупных митохондрий.

3. Выявлена прямая корреляционная зависимость между изменениями размеров митохондрий гепатоцитов и кардиомиоци-тов и их функциональной активностью.

4. Описаны закономерности ритмичных адаптационных и патологических изменений митохондрий клеток печени и сердца и выявлены фазы появления и исчезновения крупных форм митохондрий в процессе развития лучевого поражения клетки.

5. Предложенный математический аппарат позволяет охарактеризовать скорости процессов гибели и репродукции функционально активых митохондрий клеток исследдуемых органов, что позволяет прогнозировать их долевое участие в клеточной популяции при общем облучении животных.

6. Выявленная закономерность подчинения площадей митохондрий гамма-закону распределения позволила предложить способ оценки морфо-функционального состояния митохондрий с использованием электронного микроскопа.

10. Применение электронного микроскопа для морфометрических исследований. // Ультраструктурная организация растений. - Кишинев. - 1983.- С. 146-147.

11. Просвечивающий электронный микроскоп. // Автор, свид. -N 1086988. -СССР. -1983. (соавт. Лебкова Н. П. , Автандилов Г. Г.).

12. Просвечивающий электронный микроскоп. // Автор, свид. N 1151143.- СССР. - 1984. (соавт. Автандилов Г. Г. , Кобыляков

B. А. ,Гладких Т.П.).

13. Хронопатология гисто- и ультраструктур миокарда при локальном облучении. //Проблемы хронобиологии, хронопатологии, хронофармокологии и хрономедицины. -Уфа. 1985.-Том.-1.

- С. 56-58 (соавт. Автандилов Г. Г. , Лебкова Н. П. , Зейтлёнок).

14. Способ получения морфометрической информации с экрана электронного микроскопа. // Мед. реф. журнал. -1981. - разд. ХХП.

- N 12. - публ. 1985.

15. Влияние облучения на размеры изолированных митохондрий печени. //Бюл. экспер. биол. - 1986. - N 4. - С. 409-411. (Автандилов Г. Г. , Довженко Ю. М. , Лобзин А. П.).

ю. Морфометрическая приставка к электронному микроскопу. // Автор, свид. N 1314875.- СССР.-1987. (соавт. Мартынов А. Н.)

17. К вопросу о морфо-функциональной гетерогенности митохондрий. // Ультраструктура растений.- Киев.-1988. - С. 28.

18. Морфометрическая приставка к электронному микроскопу. // Ультраструктура растений. - Киев. - 1988. - С. 246.

19. Влияние радиационного облучения на размеры митохондрий кардиомиоцитов крыс. // Бюл. экспер. биол. - 1988. - N 12. -

C. 751-754. (соавт. Автандилов Г. Г. , Володин Н. Д. ).

20. Способ оценки морфо-функционального состояния митохондрий. //Автор, свид. N 14887200.- СССР.-1989.

ЫАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖНЫ В СЛЕДУХЩХ ПЕЧАТНЫХ РАБОТАХ

1. Использование морфометрии негативно контрастированных тохондрий для оценки их функционального состояния. // Всесоюзная конф. по электронной микроскопии. - М. , 19' С. 389-390. (соавт. Митюшин К М. , Козырева Е. В. )

2. Циклические изменения дыхания, окислительного фосфор] рования и ультраструктуры митохондрий. // Регуляция эне] тического обмена и физиологическое состояние организма 1978. -С. 173-176 (соавт. Митюшин В. М. .Козырева Е. В.).

3. Морфометрия негативно контрастированных митохондрий оценки их функциональных состояний. // Статистиче свойства микроструктур. - Ы. ,1978. - С. 192-193.

6. Морфофункциональная характеристика митохондрий печ мышей (морфофогическое и биохимическое исследова //Бюл. экспер. биол. -1981. - N 8. - С. 96-97. (соавт. Авта лов Г. Г. , Козырева Е. Е ).

7. Ыорфометрическая оценка функциональной активности су пензии митохондрий печени интактных и облученных мь //Мед. реф. журнал. - 1981,- разд. ХХП. - N 12.-публ. 1981.

8. Количественная оценка субклеточных изменений в миок крыс с помощью морфометрического устройства для элега ного микроскопа // ХП Всесоюзная конф. по электронной роскопии. - Ы. ,1982. -С. 262. (соавт. Лебкова ЕП.).

9. Морфометрическое устройство для электронных микроскс //ХП Всесоюзная конф. по электронной микроскопии. - М. , 1

л 64-65. (соавт. Лебкова К П., Автан""""" г р 1