автореферат диссертации по электронике, 05.27.03, диссертация на тему:Лазерное формирование микропипеток

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, МЕХАНИКИ И ОПТИКИ

На правах рукописи

МАРКОВКИНА Наталья Николаевна

ЛАЗЕРНОЕ ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОПИПЕТОК

Специальность 05.27.03 - Квантовая электроника

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена на кафедре "Лазерных технологий и экологического приборостроения" Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Вейко Вадим Павлович Научный консультант: доктор технических наук, профессор

Яковлев Евгений Борисович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Ведущая организация; НИИ "Лазерной физики"

Защита состоится ¿¿*-с*сЯ 2005г. в ч.^^мин. на заседании диссертационного совета Д.212.227.01 Оптические и оптико-электронные приборы и комплексы при САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ УНИВЕРСИТЕТЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, МЕХАНИКИ И ОПТИКИ по адресу: 190000, Санкт-Петербург, пер. Гривцова 14 Автореферат разослан "¿¿¿7" ^¿с^ьЯ- 2005г.

Ваши отзывы и замечания по автореферату ( в двух экземплярах),

заверенные печатью, просим направлять в адрес университета:

197101, Санкт-Петербург, Кронверкский пр.49, секретарю

диссертационного совета Д.212.227.01

Ученый секретарь ^

Диссертационного совета Д.212.227.01,

Тарлыков Владимир Алексеевич кандидат технических наук, в н. с. Воронин Юрий Михайлович

кандидат технических наук, доцент

to i ok M60J<tf

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В настоящее время общая тенденция миниатюризации стимулирует развитие прецизионных технологий и разработку микроинструментария, применяемого в самых разнообразных областях современной жизни.

Необходимость в изготовлении микропипеток (МП) микроинструментов, необходимых для проведения технологических операций на уровне молекул и клеток была вызвана интенсивными исследованиями в нейрофизиологии в середине XX века. Традиционным методом формирования МП является вытяжка с использованием теплового источника До сих пор принцип формирования МП сохранился неизменным, изменяются лишь диапазон размеров воспроизводимых МП и технологические особенности процесса. До последнего времени оставались нерешенными вопросы формирования химически чистых МП с прецизионным воспроизведением размеров в микронном и субмикронном диапазоне, предназначенных для разнообразных приложений. В настоящее время решение этих задач возможно с помощью лазерной технологии формирования МП.

С 2000 года на лазерные источники нагрева перешла компания "Sutter Instrument Со", лидер в изготовлении МП-пуллеров (технологических установок для вытяжки). Однако предложенная технология имеет ряд недостатков, вызванных использованием лазера в схеме с односторонней вытяжкой, предложенной в ранних моделях пуллеров с платиновой нитью накаливания. Вытяжка капилляров различных диаметров осуществляется с помощью разных моделей пуллеров, стоимость каждого составляет 12 500$.

Так или иначе, оптимизация лазерной технологии и разработка

отечественной лазерной установки, обоопочнвакнщй—«вз,

ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА, С1

о»

IMIHVIKM/ 1

■fgswl

г

коммерчески доступных МП различных конфигураций и размеров, и поныне является актуальной задачей формирования МП.

Целью диссертационной работы является разработка лазерной технологии и установки для изготовления МП.

Достижение указанной цели потребовало решения следующих основных задач:

1. Создание установки для вытяжки МП с лазерным нагревом:

• Обоснование и выбор оптимального источника лазерного нагрева

• Разработка оптических систем формирования излучения в зоне нагрева

• Обоснование и выбор механических устройств вытяжки

2. Исследование процесса, разработка и оптимизация технологии лазерной вытяжки МП.

3. Изучение параметров полученных МП и демонстрация их практических приложений.

Для решения поставленных задач были разработаны и выбраны следующие методы исследования:

1. Проведен анализ основных литературных данных по методам изготовления и применению МП.

2. Проведено экспериментальное исследование процесса лазерной вытяжки МП, в том числе с применением видеосъемки.

3. Предложена математическая модель процесса формирования МП на основе модели Ньютона.

4. Использованы методы оптической и электронной микроскопии для оценки качества полученных МП.

Научная новизна диссертации

• Впервые решена математическая задача о вытяжке МП, позволяющая в полной постановке, учитывающей изменение вязкости V темШратурой и температуры во времени, проводить

анализ влияния различных факторов на параметры получаемых МП.

• Впервые проведена микровидеосъемка процесса лазерного формообразования МП и изучена кинетика процесса вытяжки.

• Впервые предложены и разработаны схемные решения в оптике для лазерной вытяжки на базе торического зеркала и гомогенизирующей камеры, позволяющие значительно улучшить качество МП, управляемость и воспроизводимость процесса вытяжки.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Основными параметрами, определяющими качество МП и их форму, являются равномерность зоны лазерного воздействия и ее размеры.

2. Равномерность зоны лазерного воздействия может быть обеспечена либо за счет зеркальной оптики при соблюдении условия перпендикулярности пучка и оси заготовки (торическое зеркало), либо за счет гомогенизатора.

3. Численная модель лазерной вытяжки МП, предназначенная для быстрых оценок параметров процесса, может быть основана на учете деформации капилляра только в горячей зоне.

Практическая ценность работы

• Выявлены оптимальные режимы и технология формирования МП стандартных конфигураций.

• Продемонстрированы наиболее современные и перспективные приложения МП

• Изготовлены различные модификации МП, прошедшие экспериментальную проверку в качестве аппликаторов при глазных операциях в НИИ «Микрохирургии глаза», ближнепольных оптических зондов в ВНЦ ГОИ им. Вавилова.

Реализядия иа практике

Изготовленные образцы МП были опробованы в качестве:

-ближнепольных оптических зондов -световодоводов

-офтальмологических аппликаторов Личный вклад автора:

Все представленные экспериментальные исследования и теоретические расчеты проведены при личном участии автора Апробация работы

Результаты проведенных в работе исследований докладывались на конференциях: ЫАТО-АЯГ(Крит, Греция,2003), ГЬАТА-Ш (Санкт-Петербург, Россия,2003), ПАА-2000 (Санкт-Петербург, Россия, 2000), ППС кафедры ЛТ и ЭП, на Международной школе по оптическим микро-и нанотехнологиям (СПб, 2002), «Современные направления приборостроения, информационных и гуманитарных наук» (СПб, СП6ГУИТМ0.2004) Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ. Список публикаций приведен в разделе "По теме диссертации опубликованы следующие работы" в конце автореферата. Структура и объем

Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Изложена на /ЛО страницах машинописного текста, содержит рисунков, сГ таблиц, списка литературы, включающего наименований, всего /3 Страниц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение содержит обоснование актуальности работы, формулировку цели и основных положений, выносимых на защиту. Представлены существующие технологические установки и методы формирования МП. Выявлены основные требования к лазерным МП-

пуллерам, как наиболее перспективной технике формообразования микроинструментария.

В главе I на основании литературных данных изложены основные сведения о МП и наиболее современных областях их применения. Представлена краткая история развития технологии формирования МП и ее состояние на сегодняшний день.

Отмечена актуальность использования МП для регистрации электрической активности клетки, реализации методов сканирующей микроскопии, клонирования и нанолигографиии.

Указано, что при формировании микропипеток необходимо учитывать их основные эксплуатационные параметры: нетоксичность, термостойкость, механическую прочность, электрическую инертность, возможность использования в широком диапазоне длин волн оптического излучения, эргономичность, коммерческую доступность .

Анализ ранее существующих методов и техники изготовления МП показал, что принцип формирования МП вытяжкой из капилляра сохраняется, изменяются лишь технологические особенности процесса формообразования.

Опираясь на указанные положения и с учетом накопленного на кафедре "Лазерных технологий и экологического приборостроения" СПбГУИТМО большого опыта по формированию оптических микроинструментов было выявлено, что метод формирования МП с лазерным источником нагрева является оптимальным, так как позволяет обеспечить возможность достижения весьма высоких температур, большую локальность процесса, возможность варьирования размерами нагреваемой зоны, безынерционность нагрева и высокую технологическую чистоту.

Глава П посвящена разработке экспериментальной установки для формирования МП.

Предложена схема экспериментальной установки и технология вытяжки МП с лазерным источником нагрева Установка представляет собой лазерный оптико-механический технологический комплекс, обеспечивающий одновременное воздействие на капилляр лазерного излучения и механических сил. В разрабатываемом комплексе в качестве энергетического источника был выбран ССЬ-лазер с Я=10,6 мкм, которая максимально приближается к резонансной частоте решетки БЮ2 в стекле и хорошо им поглощается.

Особое внимание при создании установки было уделено разработке оптической системы, осуществляющей формирование равномерной зоны лазерного воздействия на поверхности капилляра. В процессе предварительных экспериментов было выявлено, что создание равномерной зоны может быть обеспечено: а) вращением капилляра вокруг собственной оси; б) зеркальной оптикой.

Предполагалось, что вращение капилляра позволит устранить причину неравномерность облучения. Однако, как показали исследования, несмотря на принципиальную возможность получения равномерной зоны облучения заготовки в этом случае возникают проблемы механического происхождения: а) биения оси заготовки из-за сложности юстировки осей малых приводов; б) скручивание заготовки даже при небольшой разнице в скоростях вращения приводов.

Показано, что схемные решения на основе зеркальной оптики позволяют фокусировать лазерное излучение в кольцевой зоне на поверхности капилляра. Экспериментальная установка на базе сферического зеркала, представлена на рис.1.

\ - «-Ч-

5

И I 10 12

10 12

$

Рис.1. Схема экспериментальной установки со сферическим зеркалом.

(1- СОг-лазер, 2-светоделитель, 3-линза, 4-измеритель мощности, 5- линза.6- электромеханический затвор,7-поворотноезеркало, 8-поворотное зеркало с отверстием, 9-сферическое зеркало с отверстием, 10-калилляр, 11,12-растягивающий механизм.)

В представленной установке фокусировка лазерного пучка сферическим зеркалом происходит под довольно острым углом к оси капилляра, что приводит при двухсторонней вытяжке к получению МП различных конфигураций.

Отмечено, что наибольшими преимуществами обладает схема на основе торического зеркала, осуществляющего фокусировку излучения под прямым углом к оси заготовки, представленная на рис.2.

Лазерный пучок преобразуется в расширяющееся кольцо, которое сжимается торическим зеркалом в плоскости, перпендикулярной направлению распространения на поверхность капилляра.

Рис.2 Оптическая схема на базе торического зеркала. (1- конический элемент, 2-поворотное зеркало с отверстием, 3-капилляр, 4- торическое зеркало с отверстием.)

Представлен расчет конструктивных параметров и фокусирующих свойств торического зеркала

Система механической вытяжки представляет собой прецизионное автоматизированное устройство, позволяющее осуществлять фиксацию и центрировку, вращение и растяжение капилляра Отмечено, что способы растяжения капилляра, такие как гравитационная или упругая вытяжка, определяют важные параметры процесса: силу и скорость вытяжки и, как следствие, геометрическую форму МП. Использование электромагнита, как источника усилия вытяжки, является наиболее контролируемыми современным решением.

На основании проведенных экспериментов на разрабатываемой установке показана возможность формирования МП стандартных конфигураций. Представлены опытные образцы МП и методы их формирования.

В качестве исходного материала для изготовления МП было принято натриевое боросиликатное стекло, как удовлетворяющее большинству эксплуатационных и технико-экономических требований для основных приложений.

6 главе Ш представлено экспериментальное и теоретическое исследование процесса вытяжки МП. Выявлены основные закономерности процесса и оптимальный режим формообразования микропипеток.

В процессе экспериментов для определения влияния мощности лазерного излучения и растягивающей силы на форму и размер МП проводилось исследование кинетики лазерной вытяжки и исследование интегральных закономерностей процесса.

Детальное изучение кинетики процесса вытяжки, т.е. измерение временных параметров процесса вытяжки и выявление основных закономерностей формирования геометрии МП от параметров процесса; осуществлялось методом микровидеосъемки с помощью видеокамеры Olimpus с-5050 zoom, скомбинированной с микроскопом МБС-9 с увеличением 32х. Видеосъемка производилась на этапе исследований с оптической схемой, требующей вращения капилляра

Оценка интегральных закономерностей процесса, т.е. измерение конечных геометрических характеристик МП при разных условиях их микроформообразования, была проведена методами оптической и сканирующей электронной микроскопии.

Анализ экспериментальных результантов видеосъемки процесса вытяжки показал, что процесс лазерной вытяжки состоит из четырех стадий (Рис.3):

• нагрев обрабатываемого участка стеклянного капилляра излучением СОг-лазера в течение некоторого промежутка времени без явных изменений диаметра капилляра (рис. За);

• медленное плавное утончение зоны нагрева (рис. 36);

• быстрое уменьшение диаметра (рис. Зв);

• разрыв капилляра с образованием МП (рис. Зг).

Рис3. Стадии формирования МП.

По полученным данным видеосъемки были определены временные параметры процесса вытяжки наконечников МП. На рис. 4 представлены экспериментально полученные зависимости изменения длины Ь и диаметра О капилляра в зоне вытяжки от времени X Влияние мощности излучения на время вытяжки показано на рис 5.

Рис.4. Изменение формы МП в Рис.5. Влияние мощности излучения на

процессе вытяжки время вытяжки

В результате изучения экспериментальных образцов МП методами сканирующей электронной и оптической микроскопии было выявлено влияние параметров процесса на размер формируемых МП.

На рис.6 представлено влияние растягивающей силы Р на размер МП при мощности лазерного излучения Р=8 Вт Влияние мощности

лазерного излучения Р на размер МП при растягивающей силе Р=8.5 Н показано на рис.7.

Приведенные исследования позволили выявить оптимальный режим лазерной вытяжки МП из натриево-боросиликатного стекла. Замечено, что оптимальному режиму формирования МП соответствует соотношение поглощенной мощности лазерного излучения Р в Вт к растягивающей силе Р в Н, равное 1.

М»-1-1-1-

100

• Вцртрся

©-о—

10

11 ИГО

6 В 10 Р(Я)

Рис.6. Зависимость внешнего О и Рис.7. Зависимость внешнего О

внутреннего б диаметров МП от диаметра МП от мощности растягивающей силы Р. излучения Р.

Для проверки экспериментальных закономерностей процесса и оптимизации режима была построена теоретическая модель процесса вытяжки МП. Для этого была проведена оценка размягченной зоны стеклянного капилляра и рассмотрена задача о растяжении капилляра при локальном нагревании.

Оценка размера размягченной области капилляра проводилась методом источников, который позволил определить распределение температуры в развертке кольца стеклянного капилляра.

Описание поведения капилляра при растяжении производилось с учетом модели Ньютона, согласно которой изменение относительной деформации г во времени пропорционально действующему напряжению о и обратно пропорционально вязкости стекла г|.

При постановке задачи считали, что капилляр имеет равномерное распределение температуры Т по сечению и растягивается под

действием постоянной силы Р. При растяжении происходит выход нагретых участков капилляра из области лазерного воздействия из-за увеличения длины капилляра, что приводит к изменению температурного поля. Задача имеет численное решение, так как в полной постановке аналитическое решение задачи невозможно. Тепловая задача решена методом конечных разностей. В расчете использована зависимость вязкости стекла от температуры. При учете деформации во всех нагретых областях капилляра получается результат, приведенный на рис.8.

Для упрощения алгоритма расчета удлинения при вытяжке капилляра, может быть принято, что деформация происходит в размягченной области капилляра, размер которой составляет 500-600 мкм. Численная модель вполне сопоставима с экспериментом и может быть использована для быстрой оценки основных параметров процесса вытяжки

Рис.8. Зависимость внешнего радиуса капилляра от удлинения, (■теория; 0 эксперимент) Глава IV посвящена оптимизации лазерной технологии вытяжки МП Продемонстрированы некоторые перспективные приложения МП.

Отмечено, что основной задачей в современной технологической установке для формирования МП с использованием лазерного теплового источника является равномерное распределение энергии на поверхности капилляра в зоне нагрева. Оптическая схема на основе торического зеркала, осуществляющая фокусировку излучения под

прямым углом к капилляру не устраняет окончательно проблему неравномерности: остается асимметрия МП, вызванную неравномерностью зоны нагрева по кольцу из-за неточности юстировки и плохого качества пучка лазера (отклонение от круглой формы, неравномерности распределения интенсивности в пучке).

В данной главе предложено и разработано новое оптическое решение для лазерной вытяжки - гомогенизирующая камера. Эта идея оптимизации оптической схемы для лазерного формирования МП впервые реализована в лаборатории кафедры JIT и ЭП. Гомогенизирующая камера представляет собой медную камеру с двумя расположенными на торцах элементами со сферическими поверхностями (рис.9). Лазерное излучение попадает внутрь камеры через сквозное отверстие в стенке и в результате отражений от внутренних стенок происходит равномерное распределение лазерного излучения вблизи центра трубки.

Отмечены преимущества представленной оптической системы для лазерной вытяжки.

Для оценки значения энергии в зоне нагрева был проведен расчет распространения лазерного излучения в камере с учетом многократных

а

б

Рис.9 Гомогенизирующая камера (а - внешний вид гомогенизатора, б - распространение излучения внутри гомогенизатора).

отражений. Результаты расчета показали, что мощность в зоне нагрева капилляра составляет 60 % от мощности падающего излучения.

В результате проведенных экспериментов были получены МП, наконечники которых имеют нанометровые размеры, что достаточно трудно получить при использовании схем с вращением образца и зеркальной оптикой. Экспериментальный образец МП, сформированной на установке с гомогенизирующей камерой представлен на рис. 10.

Рис. НШикропипетка, сформированная на установке с гомогенизирующей

Отмечена эффективность использования электромагнита в качестве растягивающего механизма, управление которым может быть реализовано путем введения обратной связи по удлинению капилляра, самым простым и информативным методом контроля процесса вытяжки.

Отмечена востребованность и большой потенциал создаваемых МП. Представлена конструкция и технологические особенности нового комплексного медицинского оптического инструмента - световодовода-. осуществляющего одновременную транспортировку лазерного излучения и растворов. Представлено офтальмологическое применение нового типа МП, предназначенного для отсоса продуктов операции по удалению катаракты.

камерой и ее нано-метровый наконечник.

В заключение диссертации сформулированы основные результаты и перспективы развитая данной работы:

1. Разработана экспериментальная установка для формирования МП из стеклянных капилляров на базе теплового нагрева СОг-лазера и механической вытяжки гравитационным, упругим и электромагнитным способами.

2. Предложены новые оптические схемы на основе торического зеркала и гомогенизирующей камеры для формирования кольцевой зоны нагрева микрокапилляров, обеспечивающие их высокое качество и воспроизводимость параметров. Представлен расчет конструктивных параметров и фокусирующих свойств торического зеркала. Произведена оценка значения энергии в зоне нагрева гомогенизирующей камеры.

3. Проведено исследование кинетики формообразования с помощью видеосъемки. Выявлены четыре основные стадии процесса (1-нагрев без явных изменений диаметра капилляра; 2-медленное уменьшение диаметра капилляра; 3-быстрое уменьшение диаметра капилляра; 4-разрыв капилляра с образованием МП) и их временные зависимости от мощности лазерного излучения и приложенной силы.

4. Разработана математическая модель процесса вытяжки МП, учитывающая нестационарность лазерного нагрева и позволяющая проводить анализ влияния мощности излучения и растягивающей силы на параметры сформированных МП.

5. Сопоставление экспериментальных данных и математической модели процесса позволили выявить оптимальный режим вытяжки МП. В частности показано, что соотношение мощности излучения Р(Вт) к силе вытяжки Р(Н) в оптимальном режиме должно составлять 1: Р/Р=1.

. 6. Предложены и реализованы технологические методы оплавления и вытяжки МП, адаптированные под разные формы микроинструментов.

7. Продемонстрирована практическая возможность применения МП для транспортировки лазерного излучения и жидких сред.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. З.В. Зыонг, Марковкина Н.Н. Микропипетки: основные приложения//Сборник научных трудов конференции, 16-19 февраля 2004г. «Современные направления приборостроения, информационных и гуманитарных наук»- СПб, СПбГУИТМО, 2004. С. 283-288.

2. Zung V.Z., Markovkina N.N., Veiko V.P., Yakovlev E.B. Laserassisted of formation micropipettes for biomedicine //Proc. of the SPIE.2004. Vol. 5399.pp.245-252.

3. 3.B. Зыонг, H.H. Марковкина, Е.Б. Яковлев. Математическое моделирование процесса лазерной вытяжки микропипеток//Изв.вузов. Приборостроение. 2003.Т.46.№ 6.С.42-45.

4. Д.Г. Агапов, В.П. Вейко, С.В. Кухтин, Н.В. Кухтина, Н.Н. Марковкина, А.И. Невестин, Е.А. Шахно. Моделирование процессов лазерной термокоагуляции //Изв.вузов. Приборостроение.2001. Т. 44. № 6.С.52-56.

5. V.P. Veiko, N.B. Voznesensky, YM Voronin, N.N. Voznesenskaja, N.N. Markovkina, V.A. Chuiko. Laser-based micropipettes: design, technology and applications// Proc. of the SPIE. 2001. Vol. 4571.pp.l74-182.

115 15

РЫБ Русский фонд

2006-4 10102

Тиражирование и брошюровка выполнены в Центре «Университетские телекоммуникации». Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14. Тел. (812)233-46-69 Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Введение

Глава 1. Обзор литературы и постановка задачи исследования

1.1 Основные области применения микропипеток

1.1.1 Биотехнологии

1.1.2 Микроскопия

1.1.3 Микроэлектроника

1.2 Требования к микропипеткам

1.3 Техника изготовления микропипеток

1.3.1 Методы и устройства вытяжки МП

1.3.2 Лазерная технология изготовления микропипеток

1.4 Выводы

Глава 2. Разработка экспериментальной установки и технологии с лазерным 40 нагревом для вытяжки МП.

2.1 Лазерно-технологический комплекс для формирования МП.

2.1.1.Выбор энергетического источника.

2.1.2. Разработка оптических систем для формирования 47 МП.

2.1.3.Анализ возможностей механических систем вытяжки.

2.2 Выбор материала для формирования МП.

2.3 Выводы

Глава 3. Экспериментальное и теоретическое исследование процесса формооб- 75 разования МП.

3.1 .Экспериментальное исследование процесса формообразования.

3.1.1 Методика эксперимента

3.1.2 Результаты эксперимента.

3.2.Теоретическое исследование процесса формообразования МП.

3.2.1 Анализ процесса лазерного нагревания МП

3.2.2 Математическая модель процесса вытяжки.

3.3. Выводы.

Глава 4. Оптимизация технологии формирования МП и демонстрация 99 практических приложений.

4.1 Требования к современной экспериментальной установке для 99 формирования МП

4.2 Модифицированная установка для вытяжки МП

4.2.1 Оптимизация оптической схемы

4.2.2 Энергетический расчет оптической схемы с гомогенизатором

4.2.3 Оптимизация механической системы

4.3 Оптимизация процесса формирования МП

4.4 Основные модификации МП и методы их формирования

4.5 Практические применения МП

4.5.1 Светово довод

4.5.2 Офтальмология 122 Заключение

Актуальность

В настоящее время исследовательские и производственные микро- и нанотехнологии в самых разнообразных областях современной жизни -от фотоники и микроэлектроники до медицины и генной инженерии- стимулируют разработку компактного и высокоточного инструментария. Для проведения исследований на уровне молекул и клеток необходим инструмент, выполняющий функции универсальной микроиглы - трубочки, позволяющий проводить операции с зонами воздействия микронных и субмикронных размеров [1-5].

Необходимость в создании такого инструмента была вызвана интенсивными исследованиями в области клеточной физиологии, в частности нейрофизиологии, в 40-х годах XX века [6-15]. Серьезным препятствием в исследованиях того времени являлось несовершенство техники изготовления различных модификаций микроинструментов.

Микроинструменты, открывшие новые перспективы решения трудновыполнимых задач науки, в том числе и особенно биомедицины и биотехнологий, стали называться микропипетками (МП), а техника для их изготовления - микропипеточными пуллерами [16].

Создание МП техники - пуллеров, было спровоцировано стремлением к повышению качества формируемых микроинструментов.

Первые МП были изготовлены вручную: посредством кислородной горелки и ручной вытяжки [17]. Полученные таким образом микропипетки могли быть использованы лишь для решения ограниченного класса задач, а для формирования микроинструментов, предназначенных для более деликатных применений, таких например, как нейрофизиология, требовались более контролируемые способы. Переход от ручного метода к МП-пуллерам позволил добиться управления процессом формирования, обеспечивая при этом надежные МП с разумно тонкими стенками, более короткой длиной наконечника и значением апертуры наконечника менее 1 мкм [16,18-23]. Такая конфигурация МП наиболее благоприятна для вне- и внутриклеточных исследований, облегчая проникновение и инъекцию в клетки и ткани. В результате внедрения пуллеров была открыта перспектива формирования МП с разнообразными конфигурациями. МП стали доступными инструментами для измерения мембранных потенциалов клеток, для доставки веществ к труднодоступным зонам воздействия, для идентификации клеток различных тканей. Эволюция МП техники привела к появлению новых типов МП -автоматических высокоточных микропипеток с цифровой индикацией объема. Для этих целей требуются МП с апертурой наконечника от десятков нанометров до нескольких миллиметров.

Как видно из приведенного выше краткого обзора некоторых результатов, достигнутых с помощью техники микропипеток,можно выделить два основных вида таких инструментов - собственно микропипетки (МП) для передачи биологических (или иных) субстратов, и микроэлектроды, т.е. микропипетки с вставленными в трубочку металлическими проволочками для приложения электрического потенциала к исследуемому объекту.

В настоящее время МП находят широкое применение в качестве биосенсоров, микроигл, насадок растров МП головок, ближнепольных зондов, световодоводов. В методе клонирования МП позволяют извлекать ядра из клетки донора и трансплантировать в обезъядренную клетку [1]. МП, наполненные электролитом, осуществляют регистрацию электрической активности клетки [4], а также микроскопическое исследование живых клеток, основанное на сканировании поверхности образца [5]. В сканирующем нанолитографическом методе доставка жидкого фоторезиста на подложку происходит через нанометровую апертуру наконечника МП [2]. В ряде новых аналитических методов в различных сферах человеческой деятельности МП осуществляют точное дозирование, транспортировку и идентификацию проб объемом от пкл до мкл [23-25].

Универсальность МП основана отчасти на использовании в качестве исходного материала стекла, удовлетворяющего требованиям большинства приложений, а отчасти на возможности создания различных конфигураций МП, приспособленных к многообразным областям применениям [26-32].

Для формирования разновидностей МП существуют два основных технологических метода, адаптированные под разные типо-размеры микроинструментов: оплавление и вытяжка. Для получения МП с коротким конусным концом или приталенной МП, предназначенных для отсоса продуктов хирургических операций, применяется метод оплавления. Суть метода заключается в действии центробежных сил одновременно с интенсивным нагревом стеклянного капилляра. Тепловому воздействию подвергается участок заготовки в зависимости от назначения МП: либо торец стеклянного капилляра, либо участок на некотором расстоянии от торца [33].

Формирование МП с удлиненной формой наконечника, предназначенной для безболезненного проникновения в клетки и ткани, осуществляется с помощью метода вытяжки. Этот метод основан на действии мощного теплового источника на капиллярную заготовку с последующим приложением растягивающей силы [33-35].

Традиционным методом изготовления МП является вытяжка стеклянного капилляра при локальном нагреве источником тепла. На этом основан принцип работы пуллера - устройства для вытяжки МП [36-39].

История установок для вытяжки МП начинается с устройства Дю Бойса, разработанного на основе изучения процесса ручной вытяжки [18]. Главными требованиями к создаваемому устройству были подходящая температура стекла в момент формирования наконечника и относительно большая скорость вытяжки. Данные требования были выполнены с помощью платиновой нити накаливания для нагрева узкой зоны стеклянного капилляра, и крепежно-вытяжного механизма, включающего пружину. Степень нагрева платиновой нитью участка стеклянного капилляра регулировалась с помощью тока через нить, а расстояние от стекла до нити сохранялось постоянным. Крепежно-вытяжной механизм обеспечил необходимое натяжение капилляра в процессе вытяжки, параллельность трубки базе устройства и регулировку высоты над базой в момент охлаждения, во избежание деформации сформированной МП. Вытяжка начиналась автоматически с момента достижения температуры, при которой происходит уменьшение вязкости стекла. Конструкция Дю Бойса решила главные проблемы ручной вытяжки и стала прототипом других конструкций.

Пуллер Ливингстона являлся модификацией конструкции Дю Бойса [19]. В этой установке вытяжка МП осуществлялась с помощью пружины, вращающей в противоположных направлениях пару колес с зажимами для капилляра. Скорость вращения определялась напряжением пружины. При вращении колес капилляр опускался в область нагрева нитью накаливания, стекло разогревалось до температуры размягчения, и образовывалась МП. Главными недостатками этого устройства были тенденция к изгибу и излишняя длина наконечника МП.

В установке Александра-Настука пружина заменяется соленоидом [20]. Зажимы располагаются с одной стороны капилляра в двух точках с некоторым интервалом, на котором осуществляется нагрев платиновой нитью накаливания. Требуемый поток через сформированную в петлю полосу платины контролируется выключателем. В результате односторонней вытяжки из одного капилляра сформированы наконечники с различными длинами, не удовлетворяющими многим применениям.

Особой модификацией пуллеров является вертикальная установка, устраняющая проблемы формирования МП в горизонтальных пуллерах связанные с влиянием силы тяжести [22]. В вертикальном пуллере тяготение стало важным положительным фактором вытяжки,позволишим избежать изгиба МП и сократить длину получаемых наконечников.

До настоящего момента было предложено достаточное количество конструкций установок. Однако, несмотря на определенные успехи в совершенствовании МП-пуллеров оставались нерешенными вопросы, связанные с формированием высокоточных, химически чистых МП различных модификаций, предназначенных и доступных для разнообразных приложений.

Основными недостатками ранее существующих методов являлись низкая производительность и сложность контроля. В связи со значительным расширением сферы использования, повышением требований к точности производимых работ, а также быстрым износом МП, появилась потребность в существенной оптимизации технологии изготовления МП. В настоящее время эти задачи решаются с помощью современной технологии формирования МП с использованием лазерного нагрева [33,40].

С 1950г. изготовлением технологических установок для формирования МП - пуллеров-, занимается компания "Sutter Instrument Со", которая вышла в мировые лидеры и к концу 90-х годов перешла на лазерные источники нагрева [40]. Предложенная технология вытяжки в пуллерах этой фирмы является несовершенной, так как лазер установлен напрямую в той же схеме, где ранее в качестве теплового источника нагрева применялась платиновая нить накаливания. Простейшая оптическая схема пуллера с односторонним нагревом приводит к заметному браку, а иногда и просто к растрескиванию заготовки, особенно у пипеток малого диаметра из-за склонности к изгибу конца МП. К недостаткам данного устройства можно отнести ограничение при работе с внешним диаметром капилляров, предназначенных для формирования МП: для формирвоания МП из капилляров различных диаметров используются модели пуллеров P-2000/G и P-2000/F. Стоимость каждой модели пуллера составляет 12 250 $. Представленные модели пуллеров предназначены для формирования МП методом вытяжки.

Таким образом, оптимизация лазерной технологии и разработка прототипа отечественной лазерной установки, обеспечивающей создание коммерчески доступных МП различных конфигураций и размеров, и поныне является актуальной задачей формирования МП.

Цель и задачи работы

Цель работы: исследование, разработка и оптимизация лазерной технологии формирования МП.

Достижение указанной цели потребовало решения следующих основных задач:

1. Создание установки для вытяжки микропипеток с лазерным нагревом;

2. Исследование процесса, разработка и оптимизация технологии лазерной вытяжки микропипеток;

3. Изучение параметров полученных микропипеток и демонстрация их практических применений.

Для решения поставленных задач были разработаны и выбраны следующие методы исследования:

1.Проведен анализ основных литературных данных по методам изготовления и применению микропипеток.

2.Проведено экспериментальное исследование процесса лазерной вытяжки микропипеток, в том числе с применением видеосъемки.

3.Предложена математическая модель процесса формирования микропипеток на основе модели Ньютона.

4. Использованы методы оптической и электронной микроскопии для оценки качества полученных микропипеток.

Личный вклад автора

Все представленные экспериментальные исследования и теоретические расчеты проведены при личном участии автора. Научная новизна диссертации

• Впервые решена математическая задача о вытяжке МП, позволяющая в полной постановке, учитывающей изменение вязкости с температурой и температуры во времени, проводить анализ влияния различных факторов на параметры получаемых МП.

• Впервые изучена кинетика процесса лазерного формообразования МП методом вытяжки с использованием микровидеосъемки.

• Впервые предложены и разработаны схемные решения в оптике для лазерной вытяжки на базе торического зеркала и гомогенизирующей камеры, позволяющие значительно улучшить качество МП, управляемость и воспроизводимость процесса вытяжки.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Основными параметрами, определяющими качество МП и их форму, являются равномерность зоны лазерного воздействия и ее размеры.

2. Равномерность зоны лазерного воздействия может быть обеспечена либо за счет зеркальной оптики при соблюдении условия перпендикулярности пучка и оси заготовки (торическое зеркало), либо за счет гомогенизатора.

3. При реализации численной модели лазерной вытяжки МП, предназначенной для быстрых оценок параметров процесса, достаточно учесть деформацию капилляра только в самой горячей зоне облучения.

Практическая ценность работы

• Выявлены оптимальные режимы и технология формирования МП стандартных конфигураций.

• Продемонстрированы наиболее современные и перспективные приложения МП

• Изготовлены различные модификации МП, прошедшие экспериментальную проверку в качестве аппликаторов при глазных операциях в НИИ «Микрохирургии глаза», ближнепольных оптических зондов в ВНЦ ГОИ им. Вавилова.

Реализация на практике

Изготовленные образцы МП были опробованы в качестве:

-ближнепольных оптических зондов

-световодоводов

-офтальмологических аппликаторов

Апробация работы

Результаты проведенных в работе исследований докладывались: на международных конференциях NATO-ASI (Крит, Греция, 2003), ILATA-III (Санкт-Петербург, Россия, 2003), ILAA-2000 (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на Международной школе по оптическим микро-и нанотехнологиям OMAN (Санкт-Петербург, Россия, 2002); на конференциях ППС СПбГУИТМО, «Современные направления приборостроения, информационных и гуманитарных наук» (Санкт-Петербург, СПбГУИТМО, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 статей, опубликованных в научно-технических журналах и сборниках трудов.

Основные результаты и перспективы развития данной работы:

1. Разработана экспериментальная установка для формирования МП из стеклянных капилляров на базе теплового нагрева СОг-лазера и механической вытяжки гравитационным, упругим и электромагнитным способами.

2. Основными параметрами, определяющими качество МП и их форму, являются равномерность зоны лазерного воздействия и ее размеры.

3. Равномерность зоны лазерного воздействия может быть обеспечена либо за счет зеркальной оптики при соблюдении условия перпендикулярности пучка и оси заготовки, либо за счет многократных отражений от внутренних стенок гомогенизатора. Предложены новые оптические схемы на основе торического зеркала и гомогенизирующей камеры для формирования кольцевой зоны нагрева микрокапилляров, обеспечивающие их высокое качество и воспроизводимость параметров. Представлен расчет конструктивных параметров и фокусирующих свойств торического зеркала. Произведена оценка значения энергии в зоне нагрева гомогенизирующей камеры.

4. Проведено исследование кинетики формообразования с помощью видеосъемки. Выявлены четыре основные стадии процесса (1-нагрев без явных изменений диаметра капилляра; 2-медленное уменьшение диаметра капилляра; 3-быстрое уменьшение диаметра капилляра; 4-разрыв капилляра с образованием МП) и их временные зависимости от мощности лазерного излучения и приложенной силы.

5. Разработана математическая модель процесса вытяжки МП, учитывающая нестационарность лазерного нагрева и позволяющая проводить анализ влияния мощности излучения и растягивающей силы на параметры сформированных МП. Численная модель лазерной вытяжки МП, предназначенная для быстрого моделирования экспериментальных ситуаций, основана на учете деформации только в самой горячей зоне.

6. Сопоставление экспериментальных данных и математической модели процесса позволили выявить оптимальный режим вытяжки МП. В частности показано, что соотношение мощности излучения Р(Вт) к силе вытяжки F(H) в оптимальном режиме должно составлять 1: P/F=l.

7. Предложены и реализованы технологические методы формирования МП оплавленной, вытянутой и приталенной формы, необходимые для реализации различных этапов офтальмологических операций.

8. Предложен новый многофукциональный медицинский оптический инструмент - световодовод - на базе МП с металлическим покрытием, предназначенный для транспортировки лазерного излучения одновременно с перемещением растворов.

9. Продемонстрирована практическая возможность применения МП для транспортировки лазерного излучения и жидких сред.

Заключение

1. Корочкин Л.И. Клонирование животных// Соросовский Образовательный Журнал. 1999, №4.С. 10-16.

2. Hong М.-Н., Kim К. Н., Bae, J., Jhe W. Scanning nanolithography using a material-filled nanopipette// Applied Physics Letter. 2000.- Vol. 77, № 16. P. 2604-2606.

3. Korchev Y.E., Raval M., Lab M.J., Gorelik J., Edwards C. R.W., Rayment Т., Klenerman D. Hybrid Scanning Ion Conductance and Scanning Near-Field Optical Microscopy for the Study of Living Cells// Biophysical Journal. 2000. -Vol. 78. P. 2675-2679.

4. Чизмаджев Ю.А. Как сливаются биологические мембраны// Соросовский Образовательный Журнал. 2001.Т.7, № 5.С.4-9.

5. Andrew I. Shevchuk et al. Simultaneous Measurement of Ca2+ and Cellular Dynamics: combined Scanning Ion Conductance and Optical Microscopy to Study Contracting Cardiac Myocytes// Biophysical Journal. -Vol. 81. P. 1759-1764.

6. Brown K.T., Flaming D.G. Advanced micropipette techniques for cell physiology // John Wiley and Sons , New York, 1995.

7. Graham J., Gerard R.W. Membrane potentials and excitation of impaled single muscle fibers// J. Cell. Сотр. Physiol. 1946.-Vol. 28. P. 99-107.

8. Ling G., Gerard R.W. The normal membrane potential of frog sartorious fibers// J. Cell. Сотр. Physiol. 1949.-Vol.34. P. 383-396.

9. Hodgkin A.L., Huxley A.F. Resting and action potentials in single nerve fibers// J. Physiol., Lond.1945.-Vol. 104. P.176-195.

10. Nastuk W.L., Hodgkin A.L. The electrical activity of single muscle fibers// J. Cell. Сотр. Physiol.1950.-Vol.35. P.39-73.

11. Nastuk W.L. Membrane potential changes at a single muscle end plate produced by acetylcholine//Fed. Proc. 1951.-Vol. 10. P.96.

12. Nastuk W.L. Membrane potential changes at a single muscle end-plate produced by transitory application of acetylcholine with an electrically controlled microjet// Fed. Proc.1953.-Vol.12. P.102.

13. Del Castillo J., Katz B. On the localization of acetylcholine receptors// J. Physiol., Lond.1955.-Vol. 128. P.157-181.

14. Brock L.G., Coombs J.S., Eccles J.C. The recording of potentials from motoneurons with an intracellular electrode// J. Physiol., Lond.1952.-Vol. 117. P.431-460.

15. Stretton A.O.W., Kravitz E.A. Neuronal geometry: Determination with a technique of intracellular dye injection// Science.1968.-Vol. 162. P. 132-134.

16. Frank K., Becker M.C. Microelectrodes for recording and stimulation// Physical Techniques in Biological Research, Academic Press, New York. 1964. -Vol. V. P.22-87.

17. Du Bois D. A machine for pulling glass micropipettes and needles//Science. 1931.-Vol. 73. P.344-345.

18. Livingston L.G., Duggar B.M. Experimental procedures in a study of the location and concentration within the host cell of the virus of tobacco mosaic// Biol. Bull.1934.-Vol. 67. P.504-512.

19. Alexander J.T., Nastuk W.L. An instrument for the production of microelectrodes used in electrophysiological studies//Rev. Scient. Instrum.1953.-Vol. 24. P.528-531.

20. Bertrand D., Cand P., Henauer R., Bader C.R. Fabrication of glass microelectrodes with microprocessor control // J.Neuroscience Methods. 1983.-Vol. 7. P.171-183.

21. Winsbury G.J. Machine for the production of microelectrodes// Rev. Scient. Instrum.1956.-Vol. 27. P.514-516.

22. Flaming D.G., Brown K.T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter// J. Neuroscience Methods. 1982.-Vol. 6. P.91-102.

23. Евгеньева И.И. Планарная хромотография и анализ органических веществ// Соросовский Образовательный Журнал. 1999. №11. С.50-55.

24. Cheung V.G., Morley М., Aguilar F., Massimi A., Kucherlapat R., Childs G. Making and reading microarrays// Nature genetics supplement. 1999. -Vol. 21. P. 15-19.

25. Warren B.E. X-ray diffraction study of the structure of glass// Chem. Reviews. 1940.-Vol. 26. P.237-255.

26. Morey G.W. Properties of Glass// Reinhold Publishing Corp., New York, 1954.

27. Volf M.B. Technical Glasses// Sir Isaac Pitman and Sons, Ltd., London, 1961.

28. Бартенев Г.М. Механические свойства и тепловая обработка стекла.- М.: Стройиздат, 1960.

29. Стекло. Справочник под ред. Н.М. Павлушкина. -М.: Стройиздат, 1973.

30. Карслоу Г., Егер Д. Теплопроводность твердых тел.- М.: Наука, 1964.

31. Мачулка Г.А. Лазерная обработка стекла.-М.:Советское радио, 1979.

32. Veiko V.P., Voznesensky N.B., Voronin Y.M., Voznesenskaja N.N., Markovkina N.N., Chuiko V.A. Laser-based micropipettes: design, technology and applications// 2001. -Vol. 4571.P.174-182.

33. Зыонг 3.B., Марковкина H.H., Яковлев Е.Б. Математическое моделирование процесса лазерной вытяжки микропипеток//Известие вузов. Приборостроение. 2003.Т.46,№ 6.С.42-45.

34. Zung V.Z., Markovkina N.N., Veiko V.P., Yakovlev E.B. Laser-assisted of formation micropipettes for biomedicine // Proceedings of SPIE. 2004. -Vol. 5399. P.245-252.

35. Chowdhury Т.К. Fabrication of extremely fine glass micropipette electrodes// J. Scient. Instrum. 1969.Series2.-Vol. 2. P.1087-1090.

36. Brown K.T., Flaming D.G. Beveling of fine micropipette electrodes by a rapid precision method//Science.l974.-Vol. 185. P.693-695.

37. Brown K.T., Flaming D.G. Instrumentation and technique for beveling fine micropipette electrodes// Brain Res. 1975.-Vol. 86. P. 172-180.

38. Brown K.T., Flaming D.G. New microelectrode techniques for intracellular work in small cells//Neuroscience. 1977.-Vol. 2. P. 813-827.40. http:www.sutter.com- Sutter Instrument Co, USA, 2003.

39. Paesler M.A., Moyer P.J. Near-Field Optics: Theory, Instrumentation and Applications// John Wiley and Sons, New York, 1996.

40. Дряхлушин В.Ф., Климов А.Ю., Рогов B.B., Филатов Д.О. Зонды для сканирующего ближнепольного микроскопа// Сборник материалов всероссийского совещания «Зондовая микроскопия-99» -Н. Новгород, 1999. С.121-124.

41. Betzig Е., Trautman J.K. Near-field optics: microscopy, spectroscopy and surface modification beyond the diffraction limit// Science. 1992.- VoI.257.P.189-195.

42. Hecht B. Forbidden light scanning near-field optical microscopy// Ph.D. thesis, University of Basel, Hartung-Gorre, Konstanz, 1996.

43. Novotny L., Pohl D.W., Regli P. Light propagation through nanometer-sized structures: the 2-D aperture SNOM// J.Opt. Soc. Am. A.1994.-Vol .11. P. 1768-1779.

44. Abbe M, Archiv. Microscop // Anat. Entwicklungsmech.1873. -Vol. 9. P.413.

45. Hecht В., Sick В., Wild U.P., Deckert V., Zenobi R., Martin O.J.F., Pohl D.W. Scanning near-field optical microscopy with aperture probes: fundamentals and applications // J. Chem. Phys.2000.- Vol. 112, №18. P.7761-7774.

46. Lewis A., Radko A., Ben-Ami N., Palanker D., Lieberman K. Near-field scanning optical microscopy in cell biology// Trends in Cell Biology. 1999. Vol. 9. P. 70-73.

47. Hsu J.W.P. Near-field scanning optical microscopy studies of electronic and photonic materials and devices// Materials Science and Engineering.2001. -Vol.33. P. 1-50.

48. Valaskovic G.A., Holton M., Morrison G.H. Parameter control characterization and optimization in the fabrication of optical fiber near-field probes// Applied Optics. 1995. -Vol.34. P.1215-1228.

49. Williamson R.L., Miles M.J. Melt-drawn scanning near-field optical microscopy probe profiles// Appl. Phys.1996. -Vol. 80. P.4804-4812.

50. Борен К., Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами.- М.: Мир, 1986.

51. Атласов К.А., Вейко В.П., Калачев А.И., Капорский JI.H., Яковлев Е.Б. Экспериментальные и теоретические исследования процесса лазерной вытяжки оптических ближнепольных зондов// Изв. РАН. Сер. физ. 2001. Т.65, №6. С. 941 -945.

52. Atlasov K.A., Kalachev A.I., Veiko V.P., Yakovlev E.B., Kaporsky L.N. Laser technology of shaping the near-field optical probes with submicron scale tip// Proceedings of SPIE. 2001. Vol. 4157. P. 166-173.

53. Kalachev A.I., Smirnov I.B., Veiko V.P. et al. Pecularities of laser-assisted drawing-out processing of optical probes for SNOM// Proceedings of SPIE. 1999. -Vol. 3822. P. 199-206.

54. Kalkbrenner Т., Graf M., Durkan C., Mlynek J., Sandoghdar V. A high-contrast topography-free sample for near-field optical microscopy// Appl. Phys. Lett. 2000. — Vol.76. P.1206-1208.

55. Hoppener C., Molenda D., Fuchs H., Naber A. Simultaneous topographical and optical characterization of near-field optical aperture probes by way of imaging fluorescent nanospheres//Appl. Phys. Lett. 2002. -Vol.80. P. 1331.

56. Drezet A., Huant S., Woehl J.C. In situ characterization of optical near-field probes in aperture NSOM// Abstracts of conference "Near-Fields Optics -7" — Univ. Rochester (USA), 2002. P.90.

57. Obermuller C., Karrai K. Far field characterization of diffracting circular apertures// Appl. Phys. Lett. 1995. -Vol. 67, № 23. P.3408-3410.

58. Bouhelier A., Toquant J., Tamaru H., Guntherodt H.-J., Pohl D.W. Electrolytic formatioin of nanoapertures for scanning near-field optical microscopy// Appl. Phys. Lett. 2001. -Vol. 79, №5.P.683-685.

59. Sekatskii S.K., Mironov B.N., Lapshin D.A. et al. Analysis of fiber probes of scanning near-field optical microscope by field emission microscopy// Ultramicroscopy. 2001. Vol. 89. P. 83-87.

60. Seebacher S., Osten W., Juptner W., Veiko V.P., Voznesensky N.B. Determination of geometric properties of SNOM tips by means of combinated far-field and near-field evaluation//Proceedings of SPIE. 1999.-Vol. 3740. P.312-322.

61. Seebacher S., Osten W., Veiko V.P., Voznesensky N.B. Inspection of nano-sized SNOM-tips by optical far-field evaluation// Optics and Lasers in Engineering. 2001. P. 1-23.

62. Бубякин Г.В., Левинсон Г.Р., Смилга В.И., Тычинский В.П. Технологическое применение газовых лазеров. -Л.:ЛДНТП, 1970.

63. Gagliano F.P., Lumply R.H., Watkins L.S. Lasers in Industry//Proceedings IEEE. 1969. -Vol.57, №2.

64. Лыков A.B. Теория теплопроводности.-M.: Высшая школа, 1967.

65. Исаченко В.П., Осипова В.А., Сукомел А.С. Теплопередача.- М.: Энергия, 1969.

66. Шорин С.Н. Теплопередача.-М.: Высшая школа, 1964.

67. Вейко В.П., Либенсон М.Н. Лазерная обработка.- Л.:Лениздат, 1973.

68. Голубев B.C., Лебедев Ф.В. Физические основы технологических лазеров.-М.: Высшая школа, 1987.

69. Григорьянц А.Г. Основы лазерной обработки материалов. — М.: Машиностроение, 1989.

70. Рэди Дж.Ф. Действие лазерного излучения .-М.: Мир, 1974.

71. Лазеры в технологии. Под ред. Стельмаха.—М.: Энергия, 1975.

72. Рыкалин Н.Н., Углов А.А., Кокора А.Н. Лазерная обработка материалов.-М.:Машиностроение, 1975.

73. Мазурин О.В., Стрелыдана М.В., Швайко-Швайковская Т.П. Свойства стекол и стеклообразующих расплавов//Справочник. Т.З. —Л.: Наука, 1977.

74. Ходаковский М.Д., Задорожная Т.Д. и др. //Физика и химия стекла. 1976. Т.2, №2. С.186.

75. Вейко В.П., Шахно Е.А. Сборник задач по лазерным технологиям. СПб, СПбГУИТМО, 2003.

76. Лансберг Г.С. Оптика. М. :Наука, 1976.

77. Матвеев А.Н. Оптика. М. :Высшая школа, 1985.

78. Bom М., Wolf Е. Principles of optics 6-th ed. Pergamon. Oxford. 1970.

79. Калачев А.И. Кандидатская диссертация. Разработка и исследование лазерной технологии вытяжки БОЗ. СПбГИТМО (ТУ). 2002.

80. Huang Н., Miura R. М., Ireland W. P., Puil Е. Heat-induced stretching of a glass tube under tension: Applications to glass microelectrodes// CAMS Report 0203-26.23 2003.

81. Purves R.D. The mechanics of pulling a glass micropipettes// Biophys. J. 1980.- Vol.29. P.523-530.

82. Tasaki K., Tsukahara Y., Ito S., Wayner M.J., Yu W.Y. A simple direct and rapid method for filling microelectrodes// Physiol, and Behavior. 1968.- Vol. 3. P. 1009-1010.

83. Леко B.K., Мазурин O.B. Свойства кварцевого стекла. Л.: Наука, 1985.

84. Господинов П.Н., Русинов В. М., Радев С. П. , Ярин А. Л. Вытягивание стеклянных микрокапилляров: теория и эксперимент// Инженерно-физический журнал. 1992. Т. 63, №6. С 722-727.

85. Шахно Е.А. Математические методы описания лазерных технологий.- СПб.: СПбГИТМО (ТУ), 2002.

86. Camper S.A. Research applications of transgenic mice// BioTechniques. 1986. -Vol. 5. P. 638-650.

87. Cleveland D.W., Pittenger M.F., Feramisco J.R. Elevation of tubulin levels by microinjection suppresses new tubulin synthesis// Nature. 1983. -Vol.305. P. 738-740.

88. Gordon J.W., Ruddle F.H. Gene transfer into mouse embryos: Production of transgenic mice by pronuclear injection// Meth. Enzymol. 1983. -Vol. 101. P. 411-432.

89. Graessmann M., Graessmann A. Microinjection of tissue culture cells // Meth. Enzymol. 1983. -Vol. 101. P. 482-491.

90. Hammer R.E., Pursel V.G., Rexroad C.E., Wall Jr.R.J., Bolt D.J., Ebert K.M., Palmiter R.D., Brinster R.L. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection// Nature. 1985. -Vol. 315. P. 680-683.

91. Hogan В., Constantini F., Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo- A Laboratory Manual. Gold Spring Harbor Press, NY, 1986.

92. Hoppe P.C. Techniques of fertilization in vitro. In R.L. Dixon (Ed), Reproductive Toxicology, Raven Press, NY, 1985.

93. Howlett S.K., Bolton V.N. Sequence and regulation of morphological and molecular events during the first cell cycle of mouse embryogenesis // J.Embryol. Exp. Morph.1985.-Vol. 87.P. 175-206.

94. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning A Laboratory Manual.-Gold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982.

95. Scheer U., Hinssen U.H., Franke W.W., Jackusch B.M. Microinjection of actin — binding proteins and actin antibodies demonstrates involvement of nuclear actin in transcription of lampbrush chromosomes// Cell. 1984. Vol. 39. P.l 11-122.

96. Murphy D., Hanson J. The production of transgenic mice by the microinjection of cloned DNA into fertilized one cell eggs. In D.M. Glover (Ed), DNA Cloning, Vol. Ill, IRL Press, Washington, DC, 1987.

97. Крылов К.И., Прокопенко В.Т., Митрофанов А.С. Применение лазеров в машиностроении и приборостроении.-JI.: Машиностроение, 1978.

98. Лазерное технологическое оборудование. Обзор. "Радиоэлектроника за рубежом", вып. 13, 1976.

99. Вейко В.П., Либенсон М.Н., Мелючев A.M., Таипов Р.А., Чельный А.А. Лазерная технология.-М.: ЦНИИ, Электроника, 1970.

100. Вейко В.П., Метев С.М. Лазерные технологии в микроэлектронике.- София: Издательство Болгарской АН, 1991.

101. Миркин Л.И. Физические основы обработки материалов лучами лазера.- М.: МГУ, 1975.

102. Применение лазеров. Под ред. М. Росса. — М.: Мир, 1974.

103. Тархов Г.Н. Обработка материала сфокусированным излучением ОКГ.-М.:ЭНИМС,1965.

104. Аллен Л., Джонс Д. Основы физики газовых лазеров. М.: Наука, 1970.

105. Газовые лазеры. Сборник статей. Под ред. Н.Н.Соболева. — М.: Мир, 1968.

106. Калева Т.Ф., Огнин В.Н., Соболев Н.Н. СОг-лазер при комнатной температуре//Квантовая электроника. Под ред. Н.Г. Басова. — М.: Сов. Радио, 1973.

107. Вейко В.П., Либенсон М.Н. Обработка материалов излучением оптических квантовых генераторов. Л.: ЛДНТП, 1969.

108. Вейко В.П. Лазерная обработка пленочных элементов. Л.: Машиностроение,1986.

109. Яковлев Е.Б. Аномальный характер изменения вязкости стекла при лазерном нагревании//Изв. Вузов. Приборостроение. 2001. Т.44.№6. С.26-31.

110. Яковлев Е.Б. Лазерное оборудование, автоматизация и контроль технологических процессов. Конспект лекций. Часть 1. Учебное пособие. -СПб.: СПбГИТМО (ТУ), 2002.

111. Кошкин Н.И., Ширкевич М.Г. Справочник по элементарной физике. М.: Наука, 1988.

112. Кошкин Н.И. Элементарная физика: справочник. М.: Наука, 1991.

113. Таблицы физических величин. Справочник под ред. акад. И.К. Кикоина. — М.:Атомиздат,1976.

114. Мачулка Г.А., Гурьянов В.М., Муратова Л.П. Лазерная резка стекла// Стекло и керамика. 1972, №10.

115. Белоусов Е.К., Кондратенко B.C., Мачулка Г.А., Чуйко В.А. Управляемое термораскалывание стекла лазерным излучением диапазона 10,6 мкм // Электронная промышленность. 1978, №9.

116. Болынов В.Ф., Гурьянов В.М., Мачулка Г.А. Муратова Л.П. Лазерная технологическая установка для резки профильного стекла//Квантовая электроника. Под ред. Н.Г. Басова. №6.- М.: Сов.радио, 1971.

117. Weidmann G.W., Holloway D.G. Slow crack propagation in glass//Phys. And Chemistry of Glasses. 1974. -Vol.l5.№5.

118. Борода В.И., Вартарьянц А.Ц., Карпов H.H., Мачулка Г.А. Термораскалывание стеклянных труб с помощью лазерного излучения диапазона 10,6 мкм//Электронная промышленность. 1976, №1.

119. Chui G.K. Laser cutting of hot glass//Ceramic Bulletin, 1975, -Vol.45, №5.

120. Вейко В.П., Березин Ю.Д., Чуйко В.А. Лазерные технологии формирования волоконно-оптических инструментов//Изв. РАН. Сер.физ.1997.Т.61, №8.С.1627-1631.

121. Яковлев Е.Б. Изменение структуры стекла при лазерном нагревании/Юптич. журн. 1996. №2.С.5-9.

122. Закрытое Акционерное Обществоit1. УНП Лазерный центр ИТМО"пер. Гривцова, д. 14, Санкт-Петербург, 190000 Тел.:(812)595-4160, (812)595-4163 • Факс:(812)315-7133. Эл. почта: lc@grv.ifmo.ru ИНН 7826159870, КПП 782601001 ОКПО 59497728, ОГРН 1037851005444

123. УТВЕРЖДАЮ» яеральный директор ЦН Лазерный центр ИТМО»1. А.Г. Фатеев1. А.Г. Фатеев2005 г.1. АКТо внедрении результатов диссертационной работы Н.Н. Марковкиной на предприятии ЗАО «УНП Лазерный центр ИТМО»

124. Результаты работы и опытные образцы микропипеток были использованы в ЗАО «УНП Лазерный центр ИТМО» при создании офтальмологических аппликаторов для клиники «Микрохирургия глаза».1. Члены комиссии:1. А.В.Беликов1. А.В.Скрипник1. В.Л.Селиванов