автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.06, диссертация на тему:Гелеобразующие композиции на основе хитозана и производных нуклеотидов

На правах рукописи

Азарова Анна Игоревна

ГЕЛЕОБРАЗУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Специальность: 05.17.06-Технология и переработка полимеров и

композитов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 0 ЬДи Жіі

005017002

На правах рукописи

Азарова Анна Игоревна

ГЕЛЕОБРАЗУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Специальность: 05.17.06 - Технология и переработка полимеров и

композитов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена на кафедре аналитической, физической и коллоидной химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина»

Научный руководитель: доктор химических наук профессор

Кильдеева Наталия Рустемовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук профессор

Зеленецкий Александр Николаевич, заведующий лабораторией твердофазных химических реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт синтетических полимерных материалов имени Н.С. Ениколопова РАН

доктор химических наук профессор Вихорева Галина Александровна, профессор кафедры технологии химических волокон и наноматериалов федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт элементоорганических соединений имени А.Н.Несмеянова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «¿¿^ » мая 2012 года в-^^ часов на заседании диссертационного совета Д 212.139.01 при Московском государственном текстильном университете имени А.Н. Косыгина по адресу: 119071, Москва, Малая Калужская, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина»

Автореферат разослан « » апреля 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Л'

к.х.н. Алексанян К.Г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Разработка биологически активных полимерных систем с заданными свойствами имеет большое значение для создания новых материалов, предназначенных для применения в медицине, биотехнологии, экологии и других областях. Одним из наиболее перспективных полимеров для создания таких материалов является биосовместимый и биодеградируемый аминополисахарид хитозан. В отличие от других доступных полисахаридов элементарное звено хитозана содержит аминогруппу, которая обладает большей реакционной способностью по сравнению с гидроксильными группами, поэтому хитозан может быть легко модифицирован с целью придания различных свойств.

В последние десятилетия все возрастающий интерес вызывают полимерные гидрогели, на основе которых разрабатываются материалы различной физической формы и назначения (биосорбенты, матрицы для выращивания клеток, носители для иммобилизации ферментов, системы с контролируемым выделением лекарственных соединений, раневые покрытия). Ковалентное сшивание хитозана бифункциональными реагентами приводит к формированию непрерывной сетки геля, обладающей прочностью и в то же время обеспечивающей свободную диффузию воды. Наиболее эффективным сшивающим реагентом является глутаровый альдегид (ГА). В процессе его взаимодействия с хитозаном происходит не только сшивка полисахаридных цепей, но также и альдольно-кротоновая конденсация ГА, приводящая к образованию токсичных продуктов нерегулярного строения. Это ограничивает использование системы хитозан - ГА в биомедицинских целях. Актуальным является поиск новых сшивающих реагентов, способных, подобно ГА, эффективно реагировать с хитозаном, но не образующих при этом олигомерных продуктов. В качестве таких соединений могут быть использованы окисленные нуклеотиды, являющиеся по химическому строению производными 3-оксаглутарового альдегида. Наличие заместителей в 2,4-положениях препятствуют кротоновой конденсации. Такие соединения могут быть легко получены периодатным окислением нуклеозидов и нуклеотидов. Выполняя в живых организмах важную роль структурных единиц носителей генетической информации (ДНК и РНК), нуклеотиды и нуклеозиды имеют природное происхождение и содержат несколько функциональных групп, способных связывать различные соединения.

Работа_выполнена в соответствии с основными направлениями

исследований кафедры аналитической, физической и коллоидной химии МГТУ им. А.Н. Косыгина, в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2010 гг.) (проект № 2.1.1/2859), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы» (Госконтракт № 16.740.11.0059), гранта РФФИ 08-04-12065-офи.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось научное обоснование использования диальдегидных производных нуклеотидов и нуклеозидов: уридин-5'-фосфата (о1!МР), аденозин-5-фосфата (оАМР) и уридина (о11гс0 в процессах получения биосовместимых гидрогелей хитозана.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

- установить особенности гелеобразования в растворах хитозана в присутствии диальдегидов оАМР и о11МР по сравнению с ГА и о11гс1;

- установить закономерности и механизм сшивания хитозана окисленными производными нуклеотидов и нуклеозидов;

- на основе установленных закономерностей оптимизировать условия получения полимерных материалов различной физической формы (гидрогелей, пленок, гранул);

- изучить возможность использования предложенных сшивающих реагентов для получения на основе хитозана биосорбентов и носителей для иммобилизации ферментов.

Научная новизна. Установлены особенности гелеобразования в растворах хитозана в присутствии различных диальдегидов:

- показано, что скорость гелеобразования в растворах хитозана в присутствии окисленных производных нуклеотидов значительно выше, чем при использовании нуклеозидов, что обусловлено наличием в их составе фосфатной группировки, при этом строение гетероциклического основания в молекуле диальдегидного производного основания не влияет на кинетику гелеобразования;

- установлено, что меньшая скорость роста вязкости раствора хитозана в присутствии о11гс1 обусловлена существенно более низким по сравнению с ГА содержанием свободных (дегидратированных форм) альдегидных групп, определяющем скорость сшивки хитозана.

- предложен механизм сшивки хитозана диальдегидными производными нуклеотидов, лежащий в основе процесса гелеобразования, включающий ионные взаимодействия фосфатных групп с протонированными аминогруппами хитозана, стерически облегчающие реакцию образования альдиминных связей, с последующим отщеплением фосфатной группы, стабилизирующим альдиминную связь; показано, что хитозан ускоряет рН-зависимый процесс р-элиминирования фосфатной группы.

Установлено, что в результате реализации многоточечных межмолекулярных контактов в процессе испарения растворителя не растворимые в воде хитозановые пленки могут быть получены при соотношении о11гс1/МН2 в 4-8 раз меньшем, чем при получении гидрогелей.

Практическая значимость. Предложены сшивающие реагенты для химической модификации хитозана - диальдегидные производные нуклеотидов, использование которых позволило совместить процесс гелеобразования с функционализацией гидрогеля, что расширяет

4

возможности создания новых материалов на основе хитозана. Показана эффективность использования функционализованных гидрогелей хитозана в качестве носителей для иммобилизации или систем с контролируемым выделением биологически активных белков, а также биосорбентов для удаления ионов меди из водных сред.

Установлено, что увеличение pH раствора хитозана позволяет не только увеличить число депротонированных аминогрупп, но и снизить скорость кислотного гидролиза хитозана.

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатных работах: 8 статьях и тезисах докладов, в том числе, 2 статьях в научных журналах, включенных в перечень ВАК. Получен патент РФ.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации обсуждались и докладывались на: XV и XVII Всероссийских Конференциях «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2008, 2010); 9th International Conference of The European Chitin Society (Venice, Italy, May, 2009); XIX International Round Table «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» (Lyon, France, 2010), Пятой Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры -2010» (Москва, 2010); Десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010).

Личный вклад соискателя заключается в проведении анализа литературных данных по теме диссертации, определении совместно с руководителем задач и путей их решения, выполнении основной части эксперимента по изучению процессов сшивки хитозана и гелеобразования в его растворах, получению сорбентов и носителей для иммобилизации ферментов, в обобщении полученных результатов и подготовке публикаций по работе. Подготовлены образцы для анализа и обсуждены результаты ЯМР-спектроскопии с К.Х.Н. Новиковым В.В. (ИНЭОС им. В.А.Несмеянова РАН) и проф. д.х.н. Михайловым С.Н. (ИМБ им.В.А.Энгельгарда РАН), ИК-спектроскопии с K.X.H. Владимировым Л.В. (ИХФ им. Н.Н.Семенова РАН).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, методической части, выводов, списка цитируемой литературы из 121 ссылки. Работа содержит 10 таблиц и 53 рисунка.

Содержание работы. Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи. В литературном обзоре проанализированы основные методы получения полимерных материалов на основе хитозана и сшивающих реагентов и механизмы гелеобразования в растворах хитозана. В методическом разделе дана характеристика используемых реагентов, описаны методы исследования, включая фотометрические методы: УФ-, ИК-спектроскопию, ЯМР-спектроскопию,

электронную микроскопию, титриметрический и реологический методы и методы математической обработки результатов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Закономерности получения и свойства гидрогелей на основе растворов хитозана и альдегидных производных нуклеотидов и

нуклеозидов.

С целью создания на основе хитозана нетоксичных и биосовместимых материалов медицинского и биотехнологического назначения, а также новых сорбционно-активных материалов, для получения гидрогелей хитозана предложены новые сшивающие реагенты, окисленные нуклеотиды, являющиеся по химическому строению производными 3-оксаглутарового альдегида (2,2'-оксидиацетальдегида) и проведено исследование эффективности процесса взаимодействия хитозана с диальдегидными производными нуклеотидов по сравнению с ГА и диальдегидным производным нуклеозида. Строение диальдегидов приведено на рис.1.

ГА оигс) оимр оАМР

Рис.1 - Строение ГА и окисленных производных уридина, уридинмонофосфата и аденозинмонофосфата.

В процессе гелеобразования в растворах полимеров в присутствии сшивающих реагентов происходит образование трехмерной сетки пространственно сшитого полимера. В результате происходит увеличение вязкости вплоть до полной потери системой способности к течению. 1. Особенности гелеобразования в растворах хитозана в присутствии окисленных нуклеотидов и нуклеозида Кинетика гелеобразования оценивалась как по времени потери текучести, так и скорости роста вязкости, а свойства полученных гидрогелей хитозана - по значениям предельной вязкости, после которого происходило разрушение геля, и модуля сдвига. Сравнительное исследование времени гелеобразования в растворе хитозана при использовании разных по строению диальдегидов: глутарового альдегида (ГА) и окисленного производного уридина (оигф показало, что о11гс1 взаимодействует с хитозаном значительно медленнее. При добавлении 0,1 моль ГА на 1 моль аминогрупп гель в растворе хитозана с рН 5.6 образуется в течение 3,5 минут, что в 100 раз быстрее, чем при добавлении эквимольного количества о1)гс1. При рН 4.1, когда более 90% аминогрупп хитозана протонированы, и невысоком

соотношении реакционно-способных групп образующийся гель через несколько часов после гелеобразования растворяется.

На основании изучения ЯМР спектров было показано, что в 1Н-ЯМР спектре о11гс! отсутствует сигнал альдегидной группы, который обычно проявляется в области 9 - 10 м. д., это свидетельствует о том, что его водный раствор, в отличие от ГА, не содержит заметных количеств свободного альдегида, и о1)гс1 существует в виде смеси различных гидратированных форм. Это может быть связано с введением в структуру молекулы электроотрицательного атома кислорода. Таким образом, различие в скорости сшивания хитозана о11гс1 и ГА может быть связано с различной концентрацией свободных альдегидных групп.

Наличие фосфатной группировки в составе молекулы нуклеотида создает условия для реализации не только ковалентных, но и ионных взаимодействий. Поэтому можно предположить большую эффективность сшивки нуклеотидами, по сравнению с нуклеозидами. На рис. 2 приведены сравнительные данные времени гелеобразования в растворе хитозана с рН 5.6 в присутствии различных диальдегидов (ДА).

Время, необходимое для гелеобразования в растворе хитозана в присутствии оАМР, сопоставимо с временем гелеобразования раствора полимера, содержащего

эквимольные количества ГА -наиболее эффективного из используемых для сшивки биополимеров сшивающего реагента, при этом оАМР сшивает хитозан значительно быстрее окисленного уридина.

Характер полученных для разных сшивающих реагентов зависимостей сохраняется при увеличении ММ хитозана до 470 кДа. Увеличение ММ привело к снижению количества диальдегида, необходимого для гелеобразования в системе. При соотношении 2,5 моль о1)гс!/моль 1ЧН2 время гелеобразования составило 35 минут, что в 3 раза меньше, чем при использовании более низкомолекулярного хитозана. В более структурированном растворе полимера с высокой ММ для прекращения подвижности макромолекул требуется меньшее количество сшивок.

о

с, «3

о

и §

о, И

0,5 1

ДА/ИНг, моль/моль

Рис.2 - Влияние соотношения ДА/1МН2 на время гелеобразования в растворе хитозана в присутствии о1)гс1, (1), оАМР (2) и ГА (3). ММ хитозана 190 «Да, рН 5.6.

Кинетика изменения модуля сдвига гелей, полученных в разных условиях, исследовалась после завершения гелеобразования (рис. 3). Несмотря на близкие времена гелеобразования прочность гелей на основе хитозана, сшитого эквимольными количествами оАМР и ГА, сильно различаются. Причем образование геля в результате сшивки хитозана как окисленным нуклеотидом, так и окисленным нуклеозидом (хотя и большим его количеством) приводило к повышению прочности геля по сравнению с ГА, и сопровождались выделением свободной воды. Этот факт связан с тем, что глутаровый альдегид, в основном, расходуется на увеличение длины межмолекулярных сшивок в результате кротоновой конденсации, а рост концентрации окисленного уридина приводит к увеличению числа коротких межмолекулярных сшивок. Этот вывод подтверждается результатами изучения кинетики роста вязкости растворов хитозана в присутствии ГА, о1М и оАМР (рис.4).

350 -в, кПа 300 -

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 ^ І (мин)

20 40 60

Время, мин

Рис. 3 - Кинетика изменения модуля сдвига сшитых гелей хитозана. оАМР (1,4), оіігсі (2) и ГА (3).

1- оАМР, 0,025 моль/моль, рН 5.6;

2- оіігсі, 1,0 моль/моль рН 5.6,

3- ГА, 0,025 моль/моль, рН 5.6;

4-оАМР, 0,06 моль/моль, рН 4.1.

Рис. 4 - Кинетика изменения вязкости в растворе хитозана в присутствии о11гс! (1), оАМР (2) и ГА (3) при соотношении ДА/Г*Ж2, моль/моль: 0,67 (1); 0,024 (2, 3); рН 5.6.

2. Изучение механизма взаимодействия хитозана с окисленными

нуклеотидами

Строение продуктов взаимодействия хитозана с окисленным уридин -5'-фосфатом было изучено с использованием ИК-спектроскопии. Для того чтобы ослабить спектральный вклад исходных соединений, был использован метод последовательного вычитания спектров реагентов. В результате, кроме

характеристических полос уридинового цикла и полос поглощения фосфорсодержащих функциональных групп, присутствующих в спектре oUMP (1078 и 1708 см4), на разностном спектре, обогащенном спектральной информацией о продуктах реакции, был обнаружен характерный пик 1632 нм, соответствующий поглощению C=N связей. Это свидетельствует о присоединении сшивающих реагентов к аминогруппам хитозана через образование альдиминных связей.

Строение гетероциклического основания нуклеотида практически не оказывает влияния на скорость гелеобразования. Диальдегидные производные AMP и UMP сшивают хитозан с одинаковой скоростью (рис. 5). Времена гелеобразования компонентов, содержащих одинаковое азотистое основание (урацил), но различающихся наличием фосфатной группировки (oUrd и oUMP), отличается на два и более порядка. Эти факты могут быть обусловлены двумя причинами:

а) фиксация структуры гидрогеля происходит не только за счёт ковалентных C=N связей, но и за счёт ионных связей; б) при взаимодействии хитозана с окисленными нуклеотидами может ускоряться процесс отщепления фосфатной группировки, в результате возникает С=С связь, которая образует

сопряжение с альдиминной связью и стабилизирует продукт реакции. Для однозначного ответа на вопрос о механизме взаимодействия хитозана с диальдегидными производными нуклеотидов с использованием методов ЯМР и дифференциальной УФ-спектроскопии было проведено исследование стабильности диальдегидных производных oUMP и оАМР в бодных растворах в присутствии и отсутствие хитозана.

В процессе элиминирования фосфатной группы образуется система сопряженных связей H2C=CR-CH=0 или H2C=COR-CH=N- с максимумом поглощения около 235 нм. Таким образом, за ходом реакции элиминирования можно наблюдать по увеличению оптического поглощения в этой области спектра. Рассчитанные значения констант скорости химической реакции (к) 1-го порядка показывают, что хитозан ускоряет реакцию элиминирования фосфатной группы: к реакции в присутствии хитозана даже при 20°С в 3 раза

9

о

0,2 0,4

0,6 0,8 1 ДА/ЫН2, моль/моль

Рис. 5 - Влияние соотношения ДА/14Н2 на время гелеобразования в растворе хитозана в присутствии оАМР (1, 2) и о1)МР (3, 4) при рН 5.6 (1, 3) и 4.1 (2, 4). ММ хитозана 190 кДа

превышает значения констант скорости реакции отщепления фосфата в окисленных нуклеотидах при 37°С, если она протекает в отсутствие хитозана (таблица 1).

Таблица 1 - Характеристики реакции 0-элиминирования в оІІМР и оАМР в

Диальдегид 1, °С Константа скорости к, ч1 Соотношение да/ын2, моль/моль \пах Хромофор

оІІМР 37 0,09 235 н2с=ссж-сн=0

оиМР 20 0,27 1:10 237 н2с=соя-сн=мр1'

оАМР 37 0,08 235 н2с=ссж-сн=0

оАМР 20 0,26 1:10 236 н2с=сон-сн=\р'

Результаты 31Р ЯМР-спектроскопии показали, что в процессе реакции между оАМР и хитозаном при рН 5.6 значительная часть молекул оАМР претерпевает элиминирование фосфата (возникает сигнал, соответствующий неорганическому фосфату), но также сохраняются и молекулы, содержащие фосфат (присутствует сигнал, соответствующий эфиру фосфорной кислоты (НС>)2Р(0)-СН2-).

Тот факт, что сшивка хитозана с образованием гидрогеля присутствии оАМР является быстрым процессом, а (В-элиминирование фосфата в оАМР значительно более медленным, а также данные, полученные при изучении взаимодействия оАМР с хитозаном методом 31Р ЯМР-спектроскопии позволяют заключить, что первой стадией химического взаимодействия этого сшивающего реагента с хитозаном является образование альдиминных связей (которой предшествовали ионные взаимодействия фосфатных групп с протонированными аминогруппами хитозана), затем следует Р-элиминирование фосфатной группы (рис. 6). Процесс р-элиминирования является рН-зависимым: при значении рН, равном 4.1 оАМР устойчив в течение длительного времени, в то время как при более высоком значении рН (5,6) он претерпевает отщепление фосфатной группы, которая, в свою очередь, может выступать в качестве ионного сшивающего реагента.

Таким образом, в основе процесса гелеобразования, лежит механизм сшивки хитозана, включающий ионные взаимодействия фосфатных групп с протонированными аминогруппами хитозана, стерически облегчающие реакцию образования альдиминных связей, с последующим отщеплением фосфатной группы, стабилизирующим альдиминную связь (рис. 6).

Рис. 6 - Строение продуктов взаимодействия хитозана с оАМР.

3. Разработка полимерных материалов на основе функционализованных гидрогелей хитозана и исследование их

свойств

Получение нерастворимых в воде полимерных материалов на основе хитозана путем взаимодействия с бифункциональными реагентами осуществляется без его перевода в форму полиоснования, что, с одной стороны, исключает использование денатурирующих белки растворов щелочей, а с другой - представляет интерес с точки зрения сохранения высокой влагоудерживающей способности сшитого хитозана, содержащего прстонированные аминогруппы. Ковалентное присоединение белка в этом случае происходит в одну технологическую стадию, т.к. и белок и хитозан содержат аминогруппы.

При получении пленок в процессе испарения растворителя из тонкого слоя полимерного раствора концентрация хитозана увеличивается, и для потери подвижности макромолекул достаточно меньшего числа сшивок. В зависимости от рН раствора хитозана и его молекулярной массы равновесная степень набухания пленок, полученных сшиванием хитозана в растворе, содержащем в 2-20 раз меньшее количество диальдегида, вследствие реализации многоточечных межмолекулярных взаимодействий снижается до 4-8 раз. На рис. 7 показано, что равновесная степень набухания хитозановой

пленки, полученной при соотношении оигё/ЫНг 0,06 моль/моль (рН 5.6), в 5 раз меньшем, чем необходимо для завершения гелеобразования в 2%-ном

Установлена возможность иммобилизации протеолитического фермента трипсина в структуре пленок из хитозана, полученных из совместных растворов

полисахарида и белка в присутствии о1)МР и оигс! Пленки были получены на твердых подложках, а также на поверхности целлюлозной ткани. Показано, что за счет использования разных

сшивающих реагентов можно регулировать скорость

выделения фермента.

При иммобилизации трипсина другим способом: инкубируя пленки, сшитые диальдегидами, в водном растворе фермента, были достигнуты высокие значения эффективности иммобилизации трипсина (78-81%) (Таблица 2). Реализация электростатических взаимодействий приводит к тому, что из пленки, полученной с использованием о1)МР, в процессе обработки в течение 1 часа буферным раствором с рН 3 в раствор десорбируется в 3 раза меньшее количество фермента, чем из пленок, сшитых ГА или о1)г<± Таблица 2 - Активность трипсина, иммобилизованного на хитозановых пленках, сшитых диальдегидами._

Сшивающий реагент Соотношение да/ын2, моль/моль Активность пленки, Е/г Выход по активности, % Количество десорбированного трипсина, %

оиМР 0,01 2,16 78,9 25,4

о11гс1 0,08 2,32 84,7 75,0

ГА 0,01 2,22 81,2 74,7

растворе хитозана, составляет 900%.

Время, мин

Рис. 7 - Кинетика набухания пленки из хитозана, сшитого оигсШН2 0,06 моль/моль, рН 5.6.

Природное происхояодение нуклеотидов и нуклеозидов, наряду с возможностью получения гидрогелевых биокатализаторов с заданными свойствами (активностью, стабильностью, скоростью выделения из материала во внешний раствор), как показано с использованием двух методов иммобилизации ферментов, позволяет рекомендовать предложенные сшивающие реагенты для получения новых материалов медицинского и

биотехнологического назначения с контролируемым выделением лекарственных соединений.

Для изучения влияния строения сшивающего реагента на сорбционные свойства хитозана был получен гранулированный сорбент, представляющий собой зерна набухшего в воде гидрогеля хитозана, сшитого оАМР (ХТЗ-АМР). Гелеобразование проводили в 4%-ном растворе хитозана в 4%-ной уксусной кислоте при соотношении оАМР/ЫИг 0,3 моль/моль и рН 4.1. Через 30 минут после завершения гелеобразования полученный гель продавливали через калиброванные сита и промывали раствором. Характеристика полученного сорбента приведена в Таблице 3.

Таблица 3 - Характеристика сорбентов на основе хитозана, сшитого AMP и ГА.

Сорбент Соотношение fla/nh2b реакционной смеси, моль/моль Степень сшивки да/nhz, моль/моль Содержание амр, моль/г Сорбционно -активные группы Равновесная адсорбция*, мг/г

хтз-амр 0,3 0,18 1,1 -nh2, -nh-, о но-р-о— но 76,7

хтз-га 0,2 - - -nh2, 55,2

* Аравн. при концентрации раствора СиЄ04 Со= 7,8 ммоль/л

Изучение процесса сорбции ионов Си2+ сорбентом ХТЗ-АМР из растворов СиБ04 показало увеличение равновесной сорбционной емкости с ростом концентрации до 133 мг Си2+/г сорбента или 2 ммоль/г при С<р23 ммоль/л.

На основании значений равновесной адсорбции, полученных при разных концентрациях раствора СиБОд, была построена изотерма сорбции в координатах Аравн = f (Сравн) (рис. 8а). Линеаризация полученных данных в координатах Ленгмюра и показала, что изотерма описывается уравнением Ленгмюра с низким коэффициентом корреляции и хорошо аппроксимируется уравнением Фрейндлиха (рис. 86).

Кинетика сорбции была исследована в условиях, исключающих гидролиз и осаждение продуктов гидролиза сульфата меди (низкие концентрации растворов Си304, рН 5.6), поэтому тот факт, что процесс хемосорбции ионов Си2+ функционализованным гидрогелем хитозана описывается только эмпирическим уравнением Фрейндлиха, свидетельствуют о сложном характере процесса, реализующегося на разных типах функциональных групп.

500 1000

С равн, мг/л

1500

2,5 п 2

|і.5

ш

0,5 -I 0

О

у = 0,4288х + 0,8241 Р2 = 0,9932

12 3 4 ^С равн (С, мг/л)

Рис. 8 -кривая -

Изотерма адсорбции ионов Си2+ сорбентом ХТЗ-АМР1 (экспериментальная а, линеаризация в координатах уравнения Фрейндлиха - б)

Сравнительное изучение кинетики сорбции ионов меди из растворов Си2+ с концентрацией 0,5 г/л сорбентом ХТЗ-АМР и полученным в аналогичных условиях сорбентом ХТЗ-ГА показало, что равновесная сорбционная емкость ХТЗ-ГА в 1,4 раза ниже, чем сорбционная емкость ХТЗ-АМР (Таблица 3).

Таким образом, использование окисленных нуклеотидов дает возможность совмещения процесса сшивки при получении гелевых форм сорбентов с функционализацией хитозана. Это открывает возможности создания на основе исследуемых гелеобразующих композиций новых сорбентов и энтеросорбентов.

Выводы

1. С целью создания на основе хитозана гидрогелей медико-биологического назначения предложены новые сшивающие реагенты -диальдегидные производные структурных единиц нуклеиновых кислот нуклеотиды оиМР и оАМР. Использование этих соединений позволяет наряду со сшиванием вводить в гель функциональные группы. Установлено строение продуктов взаимодействия хитозана с оЫМР и оАМР.

2. Установлено, что причиной низкой скорости гелеобразования в растворах хитозана в присутствии диальдегидного производного уридина по сравнению с ГА является отсутствие в составе его равновесных форм свободных альдегидных групп. В растворе ГА присутствует до 30% гидратированных форм альдегида.

3. Установлены закономерности гелеобразования в растворах хитозана в присутствии о1)МР и оАМР. Показано, диальдегидные производные

14

нуклеотидов представляют собой сшивающие реагенты ковалентно-ионного типа. Предложен механизм сшивания хитозана окисленными нуклеотидами.

4. Установлено, что для потери подвижности макромолекул при получении не растворимых в воде пленок путем испарения растворителя из тонкого слоя гелеобразующего раствора достаточно меньшего числа сшивок, чем при получении гидрогелей, поэтому содержание сшивающих реагентов может быть существенно снижено.

5. Показана возможность использования полимерных композиций на основе растворов хитозана, содержащих предложенные сшивающие реагенты, для иммобилизации белков; обнаружен эффект стабилизации трипсина в хитозановых пленках, сшитых оАМР.

6. Получены гранулированные сорбенты на основе хитозана, сшитого оАМР. Обнаружено отклонение экспериментальной зависимости равновесной сорбции от концентрации ионов Си2+ от уравнения Ленгмюра, связанное с наличием разного типа функциональных групп.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Азарова А.И., Перминов П.А., Кильдеева Н.Р., Михайлов С.Н., Владимиров Л.В. Гелеобразование композиций для модификации волокнистых материалов // Химические волокна. - 2011. - №2. - С. 7-11.

2. Перминов П.А., Донецкая А.И., Симаненкова Л.М., Ефременко Е.Н., Кильдеева Н.Р. Получение волокнистых форм иммобилизованной органофосфатгидролазы с использованием хитозана и его производных // Изв. вузов. Технология текстильной промышленности. - 2011. - № 7. - С. 9599.

3. Михайлов С.Н., Кильдеева Н.Р., Перминов П.А., Никоноров В.В., Захарова А.Н., Донецкая А.И.. Новые сшивающие агенты для получения биосовместимых материалов на основе хитозана // Патент РФ № 2408618, приоритет от 21.07.2008, опубликовано 10.01.2011, Бюлл. № 1.

4. Никоноров В.В., Перминов П.А., Захарова А.Н., Донецкая А.И., Кильдеева Н.Р., Михайлов С.Н. Гелеобразование в растворах хитозана в присутствии сшивающих реагентов // Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей. - Москва-Йошкар-Ола-Уфа-Казань, - 2008. - Т.15. -С.139-142.

5. Zakharova A.N., Novikov V.V., Donetskaya A.I., Perminov P.A., Kildeeva N.R., S.N.Mikhailov. Dialdehyde derivatives of nucleosides and nucleotides: novel Effective crossiinking reagents. //Proceedings of the 9th International Conférence of the European Chitin Society, Venice, Italy 23-26 May 2009, P.283-288.

6. Донецкая А.И., Симаненкова Л.M., Перминов П.А., Кильдеева H.P., Михайлов С.Н. Влияние рН уксуснокислотных растворов хитозана на их стабильность и кинетику гелеобразования // Матер. Десятой

15

международной научной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» - Нижний Новгород, 2010. - С. 98-101.

7. Zakharova A.N., Novikov V.V., Donetskaya A.I., Perminov P.A., Kildeeva N.R., Mikhailov S.N. Dialdehyde derivatives of nucleosides and nucleotides: novel effective crosslinking reagents // Proceedings of the XIX International Round Table «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» - Lyon, France, 2010.-P. 568-569.

8. Донецкая А.И., Симаненкова il.M., Перминов П.А., Новиков А.В., Кильдеева H.Р., Михайлов С.М. Влияние степени протонирования аминогрупп на свойства растворов хитозана и кинетику гелеобразования в присутствии диапьдегидов // Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей. Москва-Йошкар-Ола-Уфа-Казань, 2010,- Т. 17. ч.2. - С. 58-61.

9. Перминов П.А., Симаненкова Л.М., Донецкая А.И., Кильдеева Н.Р., Михайлов С.Н.. Синтез наночастиц серебра на поверхности хитозановых пленок Тезисы устных и стендовых докладов. Пятой Всероссийской каргинской конференции «Полимеры - 2010» - Москва, 2010. - С. 48.

Подписано в печать 16.04.12 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл.печ.л. 1,00 Заказ 140 Тираж 80 ФГБОУ ВПО «МГТУ имени А.Н. Косыгина», 119071, Москва, ул. Малая Калужская, 1

61 12-2/473

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина»

На правах рукописи

Азарова Анна Игоревна

ГЕЛЕОБРАЗУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Специальность 05.17.06 - Технология и переработка полимеров и композитов

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Кильдеева Н.Р. Щ^/ ^

Москва-2012

Содержание

стр.

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................4

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................9

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Закономерности получения и свойства полимерных материалов на основе гидрогелей ковалентно-сшитого хитозана.......................................................................................10

1.1. Изучение взаимодействия хитозана с альдегидами и дженипином в гелеобразующих растворах....................................................................13

1.2. Свойства гидрогелей хитозана, полученных ковалентной сшивкой с использованием альдегидов и дженипина........................................25

1.3. Использование бифункциональных реагентов для получения на основе хитозана полимерных материалов различной физической формы........................................................................................................32

1.4. Медико-биологические, сорбционные и каталитические свойства полимерных материалов на основе хитозана, модифицированного сшивающими реагентами.......................................................................45

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Закономерности получения и свойства гидрогелей на основе растворов хитозана и альдегидных производных нуклеотидов и нуклеозидов..............................................................................................54

2.1. Влияние рН на вязкостные свойства и стабильность растворов хитозана....................................................................................................57

2.2. Установление особенностей гелеобразования в растворах хитозана в присутствии окисленных нуклеотидов и нуклеозидов по сравнению с глутаровым альдегидом.......................................................................67

2.3. Изучение механизма взаимодействия хитозана с окисленными нуклеотидами..........................................................................................83

2.3.1. Исследование стабильности диальдегидных производных оИМР и

оАМР в водных растворах.....................................................................86

2.3.2 Исследование процесса взаимодействия диальдегидных производных oUMP и оАМР с хитозаном..............................................................94

2.3.3 Изучение стабильности гидрогелей хитозана, сшитого диальдегидными производными Urd и AMP......................................105

2.4. Разработка полимерных материалов на основе функционализованных гидрогелей хитозана и исследование их свойств....................................................................................................112

2.4.1 Изучение иммобилизации ферментов на гидрогелевых пленках на основе хитозана, сшитого диальдегидами..........................................113

2.4.2. Изучение сорбционных свойств хитозана, модифицированного сшивкой оАМР.......................................................................................121

3. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ..................................................132

3.1. Объекты исследования.......................................................132

3.2. Реактивы..........................................................................132

3.3. Методы исследования.........................................................133

ВЫВОДЫ........................................................................146

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................147

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Разработка биологически активных полимерных систем с заданными свойствами имеет большое значение для создания новых материалов, предназначенных для применения в медицине, биотехнологии, экологии и других областях. Одним из наиболее перспективных полимеров для создания таких материалов является биосовместимый и биодеградируемый аминополисахарид хитозан. В отличие от других доступных полисахаридов элементарное звено хитозана содержит аминогруппу, которая обладает большей реакционной способностью по сравнению с гидроксильными группами, поэтому хитозан может быть легко модифицирован с целью придания различных свойств.

В последние десятилетия все возрастающий интерес вызывают полимерные гидрогели, на основе которых разрабатываются материалы различной физической формы и назначения (биосорбенты, матрицы для выращивания клеток, носители для иммобилизации ферментов, системы с контролируемым выделением лекарственных соединений, раневые покрытия). Ковалентное сшивание хитозана бифункциональными реагентами приводит к формированию непрерывной сетки геля, обладающей прочностью и в то же время обеспечивающей свободную диффузию воды. Наиболее эффективным сшивающим реагентом является глутаровый альдегид (ГА). В процессе его взаимодействия с хитозаном происходит не только сшивка полисахаридных цепей, но также и альдольно-кротоновая конденсация ГА, приводящая к образованию токсичных продуктов нерегулярного строения. Это ограничивает использование системы хитозан -ГА в биомедицинских целях. Актуальным является поиск новых сшивающих реагентов, способных, подобно ГА, эффективно реагировать с хитозаном, но не образующих при этом олигомерных продуктов. В качестве таких соединений могут быть использованы окисленные нуклеотиды, являющиеся по химическому строению производными 3-оксаглутарового альдегида. Введение электроотрицательного атома кислорода в 3-положение ГА, а

также наличие заместителей в 2,4-положениях препятствуют кротоновой конденсации, и образованию нерегулярных продуктов. Такие соединения могут быть легко получены периодатным окислением нуклеозидов и нуклеотидов. Выполняя в живых организмах важную роль структурных единиц носителей генетической информации (ДНК и РНК), нуклеотиды и нуклеозиды имеют природное происхождение и содержат несколько функциональных групп, способных связывать различные соединения.

Работа выполнена в соответствии с основными направлениями исследований кафедры аналитической, физической и коллоидной химии МГТУ им. А.Н. Косыгина, в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2010 гг.) (проект № 2.1.1/2859), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы» (Госконтракт № 16.740.11.0059), гранта РФФИ 08-04-12065-офи.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось научное обоснование использования диальдегидных производных нуклеотидов и нуклеозидов: уридин-5'-фосфата (оЦМР), аденозин-5'-фосфата (оАМР) и уридина (оЦгс1) в процессах получения биосовместимых гидрогелей хитозана.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

- установить особенности гелеобразования в растворах хитозана в присутствии диальдегидов оАМР и оЦМР по сравнению с ГА и оЦгё;

- установить закономерности и механизм сшивания хитозана окисленными производными нуклеотидов и нуклеозидов;

- на основе установленных закономерностей оптимизировать условия получения полимерных материалов различной физической формы (гидрогелей, пленок, гранул);

- изучить возможность использования предложенных сшивающих реагентов для получения на основе хитозана биосорбентов и носителей для иммобилизации ферментов.

Научная новизна. Установлены особенности гелеобразования в растворах хитозана в присутствии различных диальдегидов:

- показано, что скорость гелеобразования в растворах хитозана в присутствии окисленных производных нуклеотидов значительно выше, чем при использовании нуклеозидов, что обусловлено наличием в их составе фосфатной группировки, при этом строение гетероциклического основания в молекуле диальдегидного производного основания не влияет на кинетику гелеобразования;

-установлено, что меньшая скорость роста вязкости раствора хитозана в присутствии оГЫ обусловлена существенно более низким по сравнению с ГА содержанием свободных (дегидратированных форм) альдегидных групп, определяющем скорость сшивки хитозана.

-предложен механизм сшивки хитозана диальдегидными производными нуклеотидов, лежащий в основе процесса гелеобразования, включающий ионные взаимодействия фосфатных групп с протонированными аминогруппами хитозана, стерически облегчающие реакцию образования альдиминных связей, с последующим отщеплением фосфатной группы, стабилизирующим альдиминную связь; показано, что хитозан ускоряет рН-зависимый процесс [3-элиминирования фосфатной группы.

Установлено, что в результате реализации многоточечных межмолекулярных контактов в процессе испарения растворителя не растворимые в воде хитозановые пленки могут быть получены при соотношении оигёМН2 в 4-8 раз меньшем, чем при получении гидрогелей.

Практическая значимость. Предложены сшивающие реагенты для химического сшивания хитозана - диальдегидные производные нуклеотидов, использование которых позволило совместить процесс гелеобразования с функционализацией гидрогеля, что расширяет возможности создания новых материалов на основе хитозана. Показана эффективность использования функционализованных гидрогелей хитозана в качестве носителей для иммобилизации или систем с контролируемым выделением биологически

активных белков, а также биосорбентов для удаления ионов меди из водных сред.

Установлено, что увеличение pH раствора хитозана позволяет не только увеличить число депротонированных аминогрупп, но и снизить скорость кислотного гидролиза хитозана.

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатных работах: 8 статьях и тезисах докладов, в том числе, 2 статьях в научных журналах, включенных в перечень ВАК. Получен патент РФ.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации обсуждались и докладывались на: XV и XVII Всероссийских Конференциях «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2008, 2010); 9th International Conference of The European Chitin Society (Venice, Italy, May, 2009); XIX International Round Table «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» (Lyon, France, 2010), Пятой Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры - 2010» (Москва, 2010); Десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010).

Личный вклад соискателя заключается в проведении анализа литературных данных по теме диссертации, определении совместно с руководителем задач и путей их решения, выполнении основной части эксперимента по изучению процессов сшивки хитозана и гелеобразования в его растворах, получению сорбентов и носителей для иммобилизации ферментов, в обобщении полученных результатов и подготовке публикаций по работе. Подготовлены образцы для анализа и обсуждены результаты ЯМР-спектроскопии с к.х.н. Новиковым В.В. (ИНЭОС им. В.А.Несмеянова РАН) и проф. д.х.н. Михайловым С.Н. (ИМБ им.В.А.Энгельгарда РАН), ИК-спектроскопии с к.х.н. Владимировым Л.В. (ИХФ им. Н.Н.Семенова РАН).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, методической части, выводов, списка

цитируемой литературы из 121 ссылки. Работа содержит 10 таблиц и 53 рисунка.

Содержание работы. Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи. В литературном обзоре проанализированы основные методы получения полимерных материалов на основе хитозана и сшивающих реагентов и механизмы гелеобразования в растворах хитозана. В методическом разделе дана характеристика используемых реагентов, описаны методы исследования, включая фотометрические методы: УФ-, ИК-спектроскопию, ЯМР-спектроскопию, электронную микроскопию, титриметрический и реологический методы и методы математической обработки результатов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГА - глутаровый альдегид ДА - диальдегид

оАМР - окисленный аденозин монофосфат

оИгё - окисленный уридин

оЦМР - окисленный уридин монофосфат

ОФГ - органофосфатгидролаза

ТФУ - трифторуксусная кислота

УК - уксусная кислота

СД - степень дезацетилирования

ММ - молекулярная масса

РСОЕ - равновесная обменная сорбционная емкость

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Закономерности получения и свойства полимерных материалов на основе гидрогелей ковалентно-сшитого хитозана.

В настоящее время гидрогели на основе биосовместимых полимеров находят широкое применение в различных областях: медицине, фармацевтике, тканевой инженерии, хроматографии, защите окружающей среды и т.д. [1-5]. Это побуждает ученых и технологов, уделять все большее внимание развитию методов получения гидрогелей из биологически активных и биодеградируемых полимеров. Гидрогели, представляют собой трехмерные полимерные сетки, которые поглощают и удерживают от 10-20% до десятков тысяч % воды или биологических жидкостей по отношению к их сухому весу. Гидрогели могут быть химически стабильными или они могут разрушаться со временем вплоть до полного растворения полимера. Для получения стабильных гидрогелей в раствор полимера вводят сшивающие реагенты. Гидрофильные группы в составе таких систем гидратируются в водной среде, а межмолекулярные сшивки предотвращают растворение полимера.

Водорастворимые полимеры, содержащие гидроксильные группы (например, поливиниловый спирт, декстран или другие водорастворимые полисахариды) могут быть сшиты с использованием глутарового альдегида (ГА) или других диальдегидов, однако для того, чтобы произошла такого рода сшивка, должны соблюдаться жесткие условия: низкий рН, высокая температура, присутствие метанола [6]. Полимеры, содержащие аминогруппы, также могут быть сшиты теми же реагентами, но в значительно более мягких условиях [7], что расширяет возможности использования материалов на их основе, например, для иммобилизации белков или получения ряда материалов медицинского назначения.

Хитин и хитозан являются природными полисахаридами, хитин получают из органических возобновляемых ресурсов - панцирей ракообразных, скелетов насекомых и некоторых грибов. Хитозан

и

представляет собой дезацетилированное производное хитина, построенное преимущественно из глюкозаминных остатков (схема 1). Степень превращения хитина в хитозан характеризуется степенью дезацетилирования (СД), которая составляет 70 - 98%. Хитин и хитозан могут рассматриваться по химическому строению как аналоги целлюлозы, в которых гидроксильная группа у С-2 заменена ацетамидными и аминогруппами соответственно. Важно отметить, что хитин и хитозан могут различаться по составу в зависимости от происхождения и процесса производства.

Коммерческий хитин и хитозан получают при относительно низких затратах из панцирей моллюсков (в основном, крабов, креветок, омаров и криля), из отходов переработки морепродуктов. Для получения хитозана, хитин подвергается №дезацетилированию обработкой 40-45% раствором КаОН, с последующей очисткой. Таким образом, производство и применение хитозана является экономически привлекательным средством использования отходов оболочек ракообразных.

Хитозан содержит в макромолекулярной цепи реакционноспособные аминогруппы, которые не только определяют возможность его модификации, но в протонированной форме придают полимеру растворимость в воде. Кроме того, аминогруппы хитозана делают его катионным полиэлектролитом (рКа ~ 6,2 - 6,5), одним из немногих в природе. Благодаря этому хитозан растворим в водной кислой среде при рН <6,5 и при растворении приобретает положительный заряд благодаря 1ЧН3+ " группам (схема 2), и способен взаимодействовать с отрицательно заряженными соединениями. Хитозан обладает уникальными биологическими свойствами, которые включают биосовместимость, способность к биологическому разложению до безвредных продуктов, нетоксичность, физиологическую инертность

сродство к белкам, кровоостанавливающие, фунгистатические, противоопухолевые свойства, хитин и хитозан имеют широкий спектр применения. По прогнозам, происходит рост использования стандартизированных хитиновых материалов, и они становятся доступными. Важно то, что материалы биоразлагаемых полимеров хитина / хитозана экологически чистые, безопасные для людей и окружающей среды.

В течение последнего десятилетия были разработаны материалы на основе хитина и хитозана для таких областей, как очистка сточных вод (удаление ионов тяжелых металлов, красителей, флокуляция/коагуляция белков, мембранные процессы очистки), пищевой промышленности (антихолестериновые биодобавки, консерванты, упаковочный материал, добавки в корма для животных), сельское хозяйство (покрытия семян и удобрений, контролируемое высвобождение агрохимических соединений), целлюлозно-бумажная промышленность, производство косметических средств [8-13]. Но благодаря уникальным биологическим свойствам наиболее перспективным является использование материалов на основе хитозана в области медицины и биотехнологии [14-22]. В медицине они могут быть использованы как бакте�