автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.17, диссертация на тему:Аппаратно-методический комплекс исследования клеток неоднородным переменным электрическим полем

На правах рукописи

ГЕНЕРАЛОВ ВЛАДИМИР МИХАЙЛОВИЧ

АППАРАТНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК НЕОДНОРОДНЫМ ПЕРЕМЕННЫМ ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ПОЛЕМ

Специальность 05.11.17 - Приборы, системы и изделия медицинского назначения

2 8 ФЕВ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Новосибирск - 2013

005050123

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Научный САФАТОВ Александр Сергеевич

консультант: доктор технических наук

Официальные ВЕЛИК Дмитрий Васильевич, доктор технических оппоненты: наук, доцент, Новосибирский Государственный

Технический Университет, заведующий кафедрой "Систем сбора и обработки данных";

СЕДАЛИЩЕВ Виктор Николаевич, доктор технических наук, профессор, Алтайский Государственный Технический Университет им. И.И. Ползунова, профессор кафедры "Информационные технологии";

НОВИКОВ Алексей Алексеевич, доктор технических наук, Омский Государственный Технический Университет, профессор кафедры "Материаловедение и технология конструкционных материалов.

Ведущая Национальный исследовательский Томский поли-

организация технический университет

Защита состоится «26» марта 2013 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.173.08 при Новосибирском государственном техническом университете по адресу: 630092, Новосибирск, пр. Карла Маркса, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Новосибирского Государственного Технического Университета

Автореферат разослан «7 »

Ученый секретарь диссертационного совета /¿. к.т.н., доцент

2013 г.

Полубинский Владимир Львович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В медицинской практике всестороннее исследование клеток является актуальным для диагностики многих заболеваний человека. В настоящее время широко используются приборы, принцип работы которых состоит в воздействии постоянного электрического поля на клетки крови. В указанном поле на отдельную клетку действует сила пропорционально величине ее заряда, а также напряженности внешнего электрического поля. Эта сила является основой метода электрофореза, на базе которого созданы технологии: разделения белков по массе, фильтрации, сепарации, изучения свойств отдельных клеточных структур (например, мембраны), а также клетки в целом. Электрофорез широко применяется в клинической практике и часто используется в медицинских исследованиях. Однако исследовать быстрые процессы, происходящие внутри или вокруг клетки, с помощью электрофореза не удается, в силу самой сути метода - использования постоянного электрического поля.

Теория диэлектрофореза, созданная в середине прошлого века, накопленные экспериментальные данные за последние пятьдесят лет убедительно свидетельствуют о новых уникальных возможностях исследования клеток с помощью неоднородного переменного электрического поля (НПЭП). Многочисленные компоненты клетки и она, как единое целое, во внешнем электрическом поле поляризуются. Количественное описание поляризации достигается введением феноменологического коэффициента пропорциональности объемной поляризуемости - а. В НПЭП наблюдаются следующие основные эффекты:

- разнонаправленное поступательное движение клеток относительно электродов в зависимости от частоты внешнего электрического поля;

- ориентация клеток относительно силовых линий электрического поля;

- образование кооперативных цепочек между клетками;

- деформация клеток;

- вращение клеток вокруг собственной оси;

- кооперативное вращение клеток друг относительно друга.

Перечисленные эффекты открывают широкие возможности в

разработке новых приборов, методов в области медицины, вирусологии, микробиологии, биотехнологии и др.

Цель работы: создание аппаратно-методического комплекса исследования характеристик клеток неоднородным переменным электрическим полем.

Для достижения поставленной цели формулировались следующие основные задачи исследования:

- создание электрооптической системы исследования клетки (ЭОСИК);

- разработка метода измерения вязкоупругих характеристик клетки неоднородным переменным электрическим полем для нужд медицины;

- разработка метода измерения коэффициента объемной поляризуемости клеток неоднородным переменным электрическим полем;

- разработка метода измерения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью неоднородного переменного электрического поля;

- разработка подхода специфической экспресс индикации вирусов электрооптической системой исследования клеток.

Объекты исследования: электрооптическая система исследования клеток, клетки, вирусы, микрочастицы.

Научная новизна работы заключается в следующем:

- разработан аппаратно-методический комплекс исследования свойств клеток, бактерий, вирусов, вирус-клеточного взаимодействия, измерения коэффициента поляризуемости, обобщенной вязкости и обобщенной жесткости клетки. Свидетельство на полезную модель № 71439. "Система для измерения вязкоупругих и электрических характеристик клеток биологических объектов". Положительное решение от 22.11.2007 г.;

- разработан способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его параметров. Патент РФ № 2357251 зарегистрирован 27 мая 2009 г.;

- разработан методический подход специфической экспресс индикации вирусов гриппа с помощью электрооптической системы исследования клеток. Заявка на патент. Уведомление о регистрации заявки № 2011133270 от 08.08 2011 г.;

- предложено уравнение для расчета величины электрической емкости клетки в НПЭП;

- установлено изменение знака поляризуемости эритроцитов человека в области частот (60+100) Гц, как результат пробоя мембраны клетки неоднородным переменным электрическим полем;

- латексные микрочастицы производства Dow Chemical (Индианаполис, США) Ф = 5,7-10"6 м. предложены в качестве референс образец поляризуемости;

- разработан способ концентрирования клеток в суспензии. Патент на изобретение РФ 1712856, опубл. 10.05.1997. Бюл. № 13.;

- разработан способ определения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью неоднородного переменного электрического поля. Способ определения концентрации вирусов в жидком биологическом материале и устройство для его осуществления. Патент 2225446 зарегистрирован в ГРИРФ 10 марта 2004 г. Заявка на изобретение 2001132198, опубл. 2003.07.10.;

- разработано устройство для селективной деструкции биологических объектов. Свидетельство на полезную модель № 29932 зарегистрировано в ГРИРФ 18.11.2002, опубл. 10.03.2003 г. Бюл. № 16.

Использование электрооптической системы исследования клетки в медицине позволило:

- на основе анализа поляризуемости и вязкоупругих характеристик эритроцитов осуществлять неинвазивную диагностику фиброза печени. Способ дифференциальной диагностики заболеваний печени. Патент РФ № 2296327. Заявка № 2004126112 от 30.08.2004; опубл. 27.03.2007. Бюл. № 9.;

- выявить повышенные показатели вязкости, жесткости эритроцитов у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

На защиту выносится:

- электрооптическая система исследования клеток для изучения вирус-клеточного взаимодействия, измерения коэффициента объемной поляризуемости, обобщенной вязкости и обобщенной жесткости клетки;

- метод измерения обобщенной вязкости и обобщенной жесткости эритроцита, как единого целого;

метод измерения коэффициента объемной поляризуемости биологических частиц и клеток крови;

- методический подход специфической экспресс индикации вирусов электрооптической системой исследования клеток;

- метод измерения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью неоднородного переменного электрического поля.

Достоверность научных положений, выводов и рекомендаций подтверждается:

- законами и положениями физики, вирусологии, медицины, справедливость которых общепризнанна;

- публикациями в рецензируемых изданиях и представлением полученных результатов на Российских и международных конференциях;

- положительными результатами апробации и внедрения ЭОСИК в условиях медицинского учреждения;

- строгостью используемого математического аппарата;

- экспериментальными результатами и теоретическими оценками, которые совпадают между собой.

Практическая значимость работы:

Создана электрооптическая система исследования клеток для не-инвазивной диагностики фиброза печени и алкогольного поражения сердца.

Внедрение аппаратно-методического комплекса исследования клеток неоднородным переменным электрическим полем в практику позволит:

- осуществлять измерения обобщенной вязкости и обобщенной жесткости эритроцитов человека с визуальной наглядностью, с высокой производительностью, минимальными временными и материальными затратами;

- осуществлять неинвазивную диагностики заболеваний печени и сердца;

- обеспечить возможность проведения массового скрининга населения страны с целью выявления заболевай печени и сердца на ранних стадиях;

- исследовать механизмы взаимодействия вирусов с клетками животных;

- изучать влияния, биологических, физических и химических воздействий на клетки;

- исследовать причины и механизмы клеточного разрушения.

Связь работы с научными программами, планами, темами.

Диссертационная работа выполнялась в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор в

рамках научно-исследовательских работ организации 1986+2012 гг.:

- разработка электрооптических систем детекции клеток микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров. Госконтракт № 02.434.11.3011. инв. номер 02.2.00700318;

- разработка электрооптической системы детекции клеток. Госконтракт № 02.512.11.2132. инв. номер 0220.0 803326;

- разработка аппаратно-программного комплекса и алгоритма проведения неспецифической и специфической индикации возбуди-

телей особо опасных инфекционных болезней в объектах окружающей среды на основе биосенсорных технологий. Контракт № 72-Д/1. инв. номер 02201162444;

- разработка электрооптических систем детекции микроорганизмов. Тема 05-2-06. инв. номер 02.2.00 950283;

- разработка персональных пробоотборных устройств нового поколения для обнаружения и идентификации вирусов и других микроорганизмов. Тема 027-5-06. инв. номер 02.2.00 950286.

В диссертационную работу вошли также результаты научных исследований, выполненных в рамках сотрудничества с международным научно техническим центром (МНТЦ) и другими зарубежными организациями:

- МНТЦ № 1802 - Экспресс метод идентификации клеток, инфицированных вирусом;

- МНТЦ № 3275 - Разнообразие жизнеспособных микроорганизмов в атмосферном аэрозоле юга Западной Сибири;

- МНТЦ № 2490 - Разработка микробиологических средств защиты растений;

- Национальная Северотихоокеанская лаборатория США. Контракт № 325717-А-Р1 - Улучшенный автоматизированный счетный сортер для биологической клеточной суспензии;

- Национальное агентство космической аэронавтики США -Сепарация и идентификации биологических частиц;

- Европейский научный офис Армии США. Контракт 68171-96-С-9021 - Развитие метода экспресс индикации вирус-клеточного взаимодействия неоднородным переменным электрическим полем.

Внедрение результатов и рекомендации по их использованию. Разработанные в диссертационной работе аппаратно-методический комплекс исследования клеток используется в:

- Федеральном Бюджетном Учреждении Науки «Государственном Научном Центре Вирусологии и Биотехнологии «Вектор», пос. Кольцово, Новосибирской области для исследования вирус-клеточного взаимодействия;

- Федеральном Бюджетном Учреждении Науки Научно -Исследовательском Институте Терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук для исследования вязкоупругих свойств эритроцитов, неинвазивной диагностики, лечения заболеваний печени и сердца;

- Сибирском Научно-Исследовательском Институте Метрологии для разработки подходов создания референс образца и эталона поляризуемости;

- Государственном Бюджетном Образовательном Учреждении высшего профессионального образования, Российском Национальном Исследовательском Медицинском Университете имени Н.И. Пирогова для исследования клеток при различных патологиях и под воздействием наночастиц.

Результаты работы могут использоваться учреждениями -занимающиеся диагностикой заболевания человека, индикацией вирусов, производством вакцин, клеточными технологиями и др.

Основные результаты диссертационной работы докладывались на международных и отечественных конференциях:

Первой школе-семинаре, (пос. Кольцово, 1990); Научной конференции химической и биологической защиты. (США, Абердин, 1995); Втором химическом и биологическом медицинском симпозиуме. (Швейцария, Шпиц, 1996); НАСА/РКА. Техническом консультативном исследовательском совете. (Королев, Московская область, 1996); IX Рабочей группе «Аэрозоли Сибири». (Томск, 2002); Международной конференции вновь возникающих инфекционных заболеваний. (США, Атланта, 2002); Международной конференции "Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний". (Новосибирск, 2004); XI Российском национальном конгрессе кардиологов. (Томск, 2004); Второй международной конференции "Наука - Бизнес - Образование". (Пущино, 2005); Российской конференции "Гастроэнтерологическая неделя". (Москва, 2005); 10-ой Российской конференции "Гепатология сегодня" (Москва. 2005); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 г. в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП. (Москва, 2007); Конгрессе кардиологов стран СНГ. (Москва, 2008); Пятнадцатой российской гастроэнтерологической неделе. (Москва, 2009); II Московской региональной научно-практической конференции. (Москва, 2009); 4-ой школе метрологии и стандартизации в нанотехнологии и наноиндустрии. (Новосибирск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы: монография, 38 статей в научных журналах, из них 32 статьи в изданиях из списка ВАК, 4 патента на изобретение РФ, 2 свидетельства на полезные модели РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах. В ее состав входит 64 рисунка и 31 таблица. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 350 источников.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение содержит обоснование актуальности диссертационной работы, общую характеристику работы, формулировку цели и основных задач. Во введении излагаются научная новизна, практическая значимость работы, а также положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлен обзор литературы по изучению клеток, биочастиц с помощью постоянного, переменного и НПЭП. Проанализированы литературные данные о множестве вариантов реакции клетки в широком частотном диапазоне НПЭП и причинах их вызывающие.

В разделе 1.2. приводится теория диэлектрофореза клетки. Внешнее электрическое поле Е°Р , приложенное к клетке, вызывает поляризацию ее положительных и отрицательных электрических зарядов.

Коэффициент объемной поляризуемости1 ак-л клетки в форме шара по одному выделенному направлению (например, оси х) с диэлектрической проницаемостью клетки с1<л и среды scp находится из уравнения,

акл=4-я-гкл-£ср---е- (1)

SKH ■ £ср

ЕКЛ ~ Еср

где --г-= K(f) - фактор Клаузиуса-Мосотти.

Бкл + ^ "ЕСр

В НПЭП на клетку действует усредненный по времени вектор силы, который приводит ее в поступательное движение

— £ ~Е

{FJ = {2-K ■еср -Eg - г* ■[———У-VE2cp) (2)

1 Далее по тексту поляризуемость.

где V Е2ср - градиент квадрата напряженности электрического поля среды.

Фактор Кф может принимать как положительные значения, если

£кл>£ср> так и отрицательные, если

£кл<еср, рисунок 1.

Рисунок 1. Типичные частотные зависимости реальной части Яе(К) фактора Кф клетки

Значения реальной части фактора Кф меньше нуля соответствуют отрицательному диэлек-трофорезу (-ДЭФ), клетки выталкиваются в области с наименьшим ЧЕ2ср. Значения реальной части

фактора Кф больше нуля соответствуют положительному диэлек-трофорезу (+ДЭФ), клетки стремятся в область с максимальным

V Е* . Частотные области отрицательного и положительного ди-

ср

электрофореза разделяет равновесная частота /р, на которой клетки неподвижны.

В разделах 1.3.,1.4. рассмотрено строение клетки, биологических тканей, их электрические свойства.

В разделе 1.5. сформулирована актуальность настоящего исследования. В области медицины разработка неинвазивных методов диагностики, которые не травмируют пациентов или методов, приносящие пациентам минимальные неудобства является актуальной задачей. Актуальными являются методы, которые позволяют предоставлять в распоряжение врачей объективные данные. Среди них следует выделить исследования вязкоупругих характеристик (ВУХ) эритроцитов (обобщенных вязкости и жесткости). Жесткие и вязкие эритроциты могут стать причиной нарушения микроциркуляции крови в органах и тканях и кислородного обмена в организме. В ито-

^геа!

ге возникают условия для таких грозных заболеваний как инфаркт миокарда, ишемия, некроз, инсульт, тромбоз и др. ЭОСИК открывает новые возможности в инструментальной диагностики заболеваний человека на основе исследовании поляризуемости, ВУХ клеток.

В области вирусологии, микробиологии экспресс индикация патогенных биологических агентов (ПБА) является актуальной задачей, как в диагностике заболеваний человека, так и в защите населения от возможных последствий экологических и техногенных катастроф. В настоящее время, нет единого метода, который бы удовлетворял, условиям высокой чувствительности, специфичности, скорости, низкой стоимости, абсолютной достоверности в получении результатов индикации ПБА. По-прежнему существует необходимость в поиске и разработке новых более совершенных методов индикации ПБА.

Множество инфекционных и неинфекционных заболеваний человека связано со сбоем в работе клеток, поэтому анализ процессов, происходящих в них, является также неотъемлемой и актуальной частью исследования. Необходимо выяснить какое потенциальное влияние на свойства клетки, как единого целого, могут оказывать точечные или структурные изменения мембраны, цитоплазмы; где допустимые границы этих изменений и др.

В области биотехнологии, разработка методов концентрирования, разделение клеток, бактерий, вирусов является актуальной задачей. Концентрирование позволяет улучшить условия, точность, воспроизводимость, повторяемость исследования клеток и вирусов, поэтому оно широко используются.

До настоящего момента, создание приборов на основе диэлек-трофореза и их внедрения в широкую практику, сдерживалось сложностью автоматизации измерений и как следствие высокой трудоемкостью. Кроме того, требует внимания задача выявления и анализа источников ошибок инструментального измерения. Стремительный прогресс в области цифровой записи изображения, микроскопии и развития компьютерной техники в значительной части способен решить перечисленные проблемы создания аппаратно-методического комплекса исследования клеток неоднородным переменным электрическим полем.

Во второй главе приводятся материалы и методы исследования.

В разделе 2.1-2.3. представлен перечень основных материалов, средств измерений и вспомогательных устройств. Базовым изотони-

ческим раствором с низкой ионной силой в работе выбран 0,3 М сахарозы с добавкой 5 мМ ЫаС1. В исследованиях также использовалась кровь многочисленных пациентов. Клиническое обследование пациентов, забор их крови выполнены с одобрения комитета биомедицинской этики Федерального бюджетного учреждения науки научно-исследовательского института терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (протокол № 4 заседания Этического комитета Государственного учреждения научно-исследовательского института терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук от 14 сентября 2002 г.).

В разделе 2.4. описан метод измерения равновесной частоты клетки в неоднородном переменном электрическом поле. Суть метода состоит в поиске частоты НПЭП, на которой клетки неподвижны.

В разделе 2.5. приводятся характеристики гармонического сигнала и радиоимпульса, которые заложены в работу ЭОСИК.

Третья глава посвящена разработке аппратно-методического комплекса.

В разделе 3.1. рассматривается метод измерения поляризуемости клетки в НПЭП. В основу метода положено уравнение

^ КЛ ' ^^ср

Щакл =-1-;— (3)

где: е0 - диэлектрическая постоянная; 7]ср, - вязкость изотонического раствора в котором находится клетка; гкч, Укл - радиус и вектор скорости поступательного движения клетки в электрическом поле, определяются экспериментально.

В разделе 3.2. представлена электрооптическая система исследования клеток (ЭОСИК), рисунок 2.

С помощью ЭОСИК производились измерения и расчет следующих основных и вспомогательных характеристик, г^ - радиус клетки; - скорость поступательного движения клетки относительно электродов; хт -амплитуда деформации клетки; % - поляризуемость клетки; сш - обобщенная жесткость клетки; Цкд - обобщенная вязкость клетки; /р] - равновесная частота клетки; СК7 - электрической емкость клетки.

Рисунок 2. Функциональная схема электрооптической системы исследования клеток

В разделе 2.4. приводятся характеристики гармонического сигнала и радиоимпульса, которые использовались в работе для исследования клеток.

В разделе 3.2.2. описана разработка конструкции измерительной ячейки для работы с патогенными биологическими агентами, рисунок 3.

Рисунок 3. Конструкция измерительной ячейки. 1 - стеклянная пластина, 2 -электроды, 3 - измерительная камера (щель) между электродами

(10 х54'10 6) м., 4 - покровное стекло

В разделе 3.2.3. описан расчет характеристик электрического поля в измерительной камере. Используется метеод суперпозиции для определения потенциал (рХ:У электрического поля в каждой точке измерительной камеры путем суммирования всех расчетных

потенциалов от каждого заряда q^ элементарного участка поверхности электродов. Определяются значения напряженности электрического поля по координатам х, у, и величина ЧЕ2 в каждой точке измерительной камеры.

В разделе 3.2.4. представлены сведения о программном обеспечении ЭОСИК. В компьютере ЭОСИК устанавливается оригинальный программный пакет, который осуществляет управление работой генератора; распознавание образа клеток; расчет силовых характеристик НПЭП; измерение амплитуды деформации; расчет поляризуемости, вязкости, жесткости для каждой отдельно наблюдаемой клетки.

В разделе 3.2.5 приведен математический анализ контроля точности измерения поляризуемости клеток ЭОСИК. Относительная

погрешность измерения величины поляризуемости 8 (акг) находится из уравнения

8т]с

3(акл)<

где погрешности измерения:

8г„

сН>„

д(УЕ2ср)

ЧЕ

ср

дт?,

ср

/ср

- вязкости суспензии клеток;

дп.

' кл

- радиуса клетки;

^е2ср)

- скорости ее поступательного движения;

МЕ,

ср

градиента квадрата напряженности электрического поля в

месте нахождения клетки.

Относительная погрешность измерения поляризуемости клетки

ЭОСИК не превышает 8 {и¡а ) < 19,5%.

В разделе 3.2.6. сопоставлены величины поляризуемости латекс-ных микрочастиц и эритроцитов, полученных теоретически (1) и экспериментально с помощью ЭОСИК (3). Величины совпали с ожидаемой погрешностью 8 (акп) < 19,5%.

В разделе 3.2.7. дана теоретическая оценка времени релаксации

Тр клетки в вязкой среде 0,3 М сахарозы. Она характеризует, за какое время клетка поляризуется и способна достигать скорости равновесия в изотоническом раствор 0,3 М сахарозы. Теоретические

оценки показали 7р~1,8'10"Пс. Это позволяет считать процесс поляризации клетки, в рамках представленной работы, практически "мгновенным".

Четвертая глава посвящена результатам, полученным в работе и их обсуждению.

В разделе 4.1. показаны результаты исследования взаимодействия клетки с НПЭП.

В разделе 4.1.1. представлен анализ эквивалентной электрической схема клетки и ее характеристик в широком диапазоне частот. Обоснована эквивалентная электрическая схема клетки в виде, изображенном на рисунке 4.

Рисунок 4. Эквивалентная элек-

Клетка.

—г г^.м

г Кср

т ¿Г -1 (-1

трическая схема клетки. См, Сц и

ССр — емкость мембраны, ци-р1, Си | ~~р- у топлазмы и среды (клеточной сус-

пензии); Ям, Яц, Кср, - сопротивление мембраны, цитоплазмы, среды

Электрические сопротивления, емкости СМцС„ мембраны, цитоплазмы клетки, а тающее окружающей среды являются частотно зави-

симыми Хм,ц,ср~ -шС

м.ц.ср

что позволяет рассматривать эквивалент-

Клетка

Клетка

ные схемы клетки в области низких и высоких частот. В низкочастотном диапазоне частот (10-И О3) Гц эквивалентная схема представлена на рисунке 5.

Рисунок 5. Эквивалентная схема клетки в низкочастотном диа-

з

пазоне частот (10+10 ) Гц

В области высоких частот эквивалентная схема преобразуется к виду, представленному на рисунке 6.

С,

Си

с,

ср

Рисунок 6. Эквивалентная схема

клетки в высокочастотном диапазо-

7 8

не частот (10 +10 ) Гц

Анализ отношения сопротивлений клетки и среды в диапазоне

2 8

(10 +10 ) Гц показал, что на равновесной частоте сор1 выполняется ус-

ловие равенство сопротивлений Я^ = Яср, Ст - Сср.. Коэффициент отношений комплексного сопротивления среды 1ср и клетки на равновесной частоте сор1 равен единице. Указанное равенство позволяет находить характеристики клетки Ккл, Скл через измерения Яср, а

емкость клетки, среды из уравнения Ст> ср = 11Яср. Сопротивление среды находится с помощью измерительного прибора, кондуктометра.

В частотной области (-ДЭФ) выполняется неравенство '¿кл > '¿ср В результате переменный ток от внешнего генератора замыкается, в основном, по наружной поверхности и прилегающему объему клеточной суспензии (среды). В этом частотном диапазоне осуществляется селективное исследование свойств мембраны.

В частотной области (+ДЭФ) выполняется неравенство 7КЛ < 2ср. Переменный ток от внешнего генератора фокусируется в клеточной цитоплазме. Внутриклеточные органеллы находятся под действием внешнего генератора. В этом частотном диапазоне осуществляется селективное исследование свойств цитоплазмы, рисунок 7.

о) Град/с)

Рисунок 7. Типичная амплитудно-частотная зависимость 2)<л,-+ 2ср - ■ от частоты переменного электрического поля,£Ур - равновесная частота

В разделе 4.1.2. проведены теоретическое и экспериментальное исследования влияния сквозных пор мембраны на амплитудно-частотную зависимость поляризуемости эритроцитов человека. В экспериментах использовались эритроциты человека, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, штамм Y-55, клетки ВНК21, а также ла-тексные частицы как контроль. Последние не имеют мембраны, поэтому и образование пор на их поверхности невозможно. Измерения проводились в диапазоне частот/= (RIO6) Гц. В частотном диапазоне (60+100) Гц выявлен положительный диэлектрофорез клеток (эритроцитов и дрожжей), а не ожидаемый отрицательный, который приводится в литературе, рисунок 1. Появление сквозных пор на мембране приводить к резкому увеличению объема клеток, который после выключения электрического поля к исходному состоянию не возвращаются, рисунок 8.

а) Ъ)

Рисунок 8. Динамик резкого увеличения объема клетки ВНК21. а) - клетка в отсутствии НПЭП. Е= 0 В/м, / = 0; Ь) - клетка, но уже с увеличенным объемом в НПЭП. £=105 В/м, I = 5 с,/ = 100 кГц

В разделе 4.2. рассмотрено применение электрооптической системы исследования клеток в вирусологии.

В разделе 4.2.1. дана оценка силовым характеристикам электрического поля, необходимым для манипуляции вирусами, обосновываются причины поляризации вирусов в НПЭП, приводится фотография кооперативных цепочек вируса ядерного поли-эдроза в НПЭП.

В разделе 4.2.3. описана индикации вируса краснухи (Р-1965) с помощью ЭОСИК. Индикация построена на измерении равновесной частоты интактных и инфицированных вирусом клеток. Значения

равновесной частоты для суспензии вируса краснухи + клетки ВНК 21 представлены в таблице 1.

Таблица 1. Значения равновесной частоты для суспензии клетки

Наименование суспензии Вирус краснухи + клетки внк 21 Клетки внк 21 [Контроль!

Время экспозиции 10 60 120 10 60 120

Равновесная частота /р [МГц] 0,25 0,30 0,35 0,55 0,50 0,50

±4%

В экспериментах также использовались эритроциты человека. Значения равновесной частоты для суспензии вирус краснухи + эритроциты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Значения равновесной частоты для эритроцитов чело-

Наименование суспензии Эритроциты + вирус краснухи Эритроциты [Контроль]

Величина разведения исходной вирусной суспензии [раз] 2 4 8 16 32 64 128 Вирус отсутствует

Равновесная частота /р [МГц] 10 3,5 1,5 0,8 0,8 1,0 0,5 0,5

±4%

Эксперименты показали. Равновесная частота эритроцитов человека в присутствии вируса, относительно контрольных (без вируса) изменяется в 20 раз. Аналогичные изменения равновесной частоты для клеток ВНК 21 незначительные. Равновесная частота эритроцитов животных являются более перспективными клетками для индикации чем клетки ВНК 21.

В разделе 4.2.3. описана индикация вируса гриппа

А/А ¡сИ У2/68 (НЗЫ2) с помощью ЭОСИК. В экспериментах использовались эритроциты цыпленка, а также клетки МОСК. С помощью ЭОСИК находилась их равновесная частота, таблицы 3. Анализ данных, представленных в таблице 3, показал - равновесная частота эритроцитов /р1 увеличивается с повышением концентрации вируса

гриппа в клеточной суспензии. Клетки МЭСК для индикации вируса с помощью ЭОСИК непригодны, так как изменения их равновесная частота незначительны.

Таблица 3. Значения равновесной частоты для эритроцитов цыпленка + вирус гриппа__

Наименование Вирус гриппа + эритроциты Эритроциты [Контроль]

Величина разведения исходной вирусной суспензии [раз] 2 4 8 16 32 64 -

Равновесная частота /р [МГц] 1,2 - 0,7 - 0,7 0,6 0,6

Примечание. Относительная погрешность измерения частоты не более

±4%

В отдельном эксперименте проведены исследования морфологии мембраны эритроцитов обезьяны до и после адсорбции на них вирусов гриппа, рисунок 9.

Рисунок 9. Эритроциты обезьяны в атомносиловом микроскопе, а) -контрольные, Ь) - после адсорбции вируса гриппа. (Фото Зайцева Б.Н.)

В разделе 4.2.4. рассмотрен методологический подход специфической экспресс индикации вирусов, с помощью ЭОСИК, на примере вируса гриппа A/Common gull/Chany/P/2006 (H5N1), полученного из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ Вектор. Исследования велись с учетом следующих экспериментально установленных в работе результатов: вирус гриппа способен сдвигать равновесную частоту эритроцитов в

более высокочастотную область относительно контрольных; изменения равновесной частоты эритроцитов после взаимодействия с вирусом гриппа происходит в течение короткого промежутка времени (меньше минуты); специфическая сыворотка (+) к чувствительному вирусу изменяет его свойства таким образом, что происходит его инактивация, в результате чего модификации свойств клетки не происходит; нормальная сыворотка (-) нечувствительна к вирусу свойства его не изменяет и вирус остается способным модифицировать характеристики клетки. Для индикации использовалась специализированная ячейка, в составе которой имелись шесть измерительных камер с квадрупольной структурой поля в каждой. Результаты индикации вируса гриппа A/Common gull/Chctny/P/2006 (H5N1) в исследуемой пробе по поведению эритроцитов лошади в измерительной камере методом диэлектрофореза приведены в таблице 4. Характерная реакции эритроцитов для отрицательного и положительного диэлектрофореза представлены на рисунках 10+13.

Таблица 4. Результаты индикации вируса A/Common gull/Chany/ Р/2006 (H5N1) ___

Наименование Напряжение на электродах 5 В частота 50 кГц Напряжение на электродах 5 В частота 2000 кГц Вывод

Пробирка 1. Интактные эритроциты лошади Отрицательный диэлек-трофорез Положительный диэлек-трофорез Эритроциты пригодны для использования

Пробирка 2. Эритроциты лошади + вирус в разведении 1:128. Контроль ге-магглютинации Отрицательный диэлек-трофорез Отрицательный диэлек-трофорез В указанной пробирке присутствует вирус, который агглютинирует клетки

Пробирка 3. Эритроциты лошади + вирус в разведении 1:128 + специфическая сыворотка с титром 1:2560 к вирусу a/common gull/ chcmy/p/2006 (h5n1) в разведении 1:640 Отрицательный диэлек-трофорез Положительный диэлек-трофорез В указанной пробирке содержится искомый штамм вируса а/соттоп gull/chany/p/2006 (h5n1)

Пробирка 4. Эритроциты лошади + вирус в разведении 1:128 + нормальная сыворотка Отрицательный диэлек-трофорез Отрицательный диэлек-трофорез В указанной пробирке отсутствует влияние белков нормальной сыворотки на клетки

Таким образом, ЭОСИК позволяет осуществлять индикацию вирус-клеточного взаимодействия на основе регистрации изменения свойств клетки.

Рисунок 10. Эритроциты (А) лошади в измерительной камере и=0 В. Темные области - элек-

Рисунок 11. Агрегат эритроцитов (А) лошади в центре измерительной камеры. Частота 50 кГц, £/= 5 В

троды

Рисунок 12. Распад агрегата Рисунок 13. Эритроциты (А)

эритроцитов (А) в центральной лошади на электродах изме-

части измерительной камеры, рительной камеры. Частота

Ц= 0 В 2000 кГц, и= 5 В

В разделе 4.2.5. описан метод измерения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью ЭОСИК. В основу метода определения концентрации инфицированных клеток и вирусов в клеточной суспензии положена идея принципиальной разницы в реакции ин-тактных и инфицированных клеток на двух фиксированных частотах НПЭП. Для реализации метода необходимо выполнить три условий. Первое - концентрация клеток в суспензии известна. Второе - направление вектора поступательного движения для интактных и инфицированных клеток диаметрально противоположно на экспери-

ментально подобранных, двух частотах. Например, интактные клетки на первой частоте испытывают положительный диэлектрофорез, тогда как клетки в присутствии вируса демонстрируют отрицательный диэлектрофорез. Третье - в клеточной суспензии путем разведения концентрация клеток с^ и вируса св подбирается из условия

ст ~ 2св. Это обеспечивает нехватку вируса примерно для 50 % клеток от общего количества. В интерпретации результатов количество клеток, движущихся в НПЭП в различных направлениях относительно электродов в измерительной камере, связывается с концентрацией вируса в клеточной суспензии, Таблица 5. На основе полученной из эксперимента величины разведения исходной вирусной суспензии 1 : 5120 и известного количества эритроцитов 2'10 шт/мл в пробирке, давалась оценка количеству вирусов гриппа A/Aichi/2/68 (H3N1) в пробе по формуле

Св ~ 2Т06 • 5120 • 0,54 ~ 5,1'109 шт/мл

9 5 w

Данная оценка согласуется с величиной 10 ' шт/мл полученной, с помощью биологического метода - эмбриональных инфекционных доз ЭИД50.

Таблица 5. Количество клеток с положительным и отрицательным диэлектрофорезом в суспензии _

Вирус-клеточная пара Количество клеток с положительным диэлектрофорезом А Количество клеток с отрицательным диэлектрофорезом В Фон В/(А+В) Общее количество клеток (А+В)-(А+В)*фон =D Отношение клеток с адсорбированными вирусами к общему количеству (В/О)

Эритроциты цыпленка + вирус гриппа а/лш/2/68 (нзы1) 46 52 - 85 0,54

Контрольные эритроциты цыпленка 45 7 0,13 - -

Эритроциты человека + вирус краснухи р-1965 11 15 - 23 0,65

Контрольные эритроциты человека 66 9 0,12 - -

В разделе 4.2.6. показана инактивация вирусов краснухи и гриппа в растворах с низкой ионной силой (в дистиллированной воде, 0.3 М растворе сахарозы). Исходя из полученных результатов, в работе была сформирована общая генеральная стратегия исследования вирус-клеточного взаимодействия, состоящая из двух основных этапов. Первый этап. Вирусы следует вносить в клеточную суспензию, приготовленную на хорошо зарекомендовавших себя средах, и которые не оказывают на них какого-либо негативного влияния. Второй этап. После экспозиции вирус-клеточной суспензии клетки из нее переводятся в ИР с низкой ионной силой для дальнейшего исследования с помощью ЭОСИК.

В разделе 4.2.7. продемонстрирована возможность манипуляция вирусами методом диэлектрофореза. Представлены фотографии осаждения вируса оспавакцины на острие зонда атомносилового микроскопа ACM SOLVER P47BIO (NT-MDT, Россия) методом диэлектрофореза.

В разделе 4.3. исследовано применение ЭОСИК в микробиологии.

В разделе 4.3.1. рассмотрено применение ЭОСИК для экспериментальной оценки влияния антибиотиков (бензилпенициллина) на величину равновесной частоты пенициллин-чувствительного штамма Bacillus subtilis {Pen ) В-167. Бензилпенициллин {Benzylpenicillin), оказывает бактерицидное действие за счёт ингибирования синтеза клеточной стенки микроорганизмов. Эта его способность использовалась для получения клеток Bacillus subtilis с нарушенной или отсутствующей клеточной стенкой и ис-

следования частотном (50+5000) пряжением

их

поведения в диапазоне кГц и на-на электродах

и=10 В, НПЭП, рисунок 14.

Рисунок 14. Бактерии в НПЭП

Наблюдения показали, что равновесная частота клеток, обработанных бензилпе-нициллином, уменьшалась. Значения равновесной частоты приведены в таблице 6.

Таблица 6. Зависимость значения равновесной частоты fp\ в неоднородном переменном электрическом поле для Bacillus subtilis В-167

Время экспозиции 2 часа 5 часов

Равновесная частота Bacillus subtilis В-167 + бензилпенициллин (эксперимент) [кГц1 100 100-=-200

Равновесная частота Bacillus subtilis В-167 (контроль - без бензилпенициллина) ГкГц] 1000 750

Примечание. Относительная погрешность измерения частоты не более

±4%

Таким образом, ЭОСИК позволяет исследовать эффективность действия антибиотиков через анализ величины равновесной частоты бактерий.

В разделе 4.3.2. проведена экспериментальная оценка влияния хлорид золота (ЛмС/"4) на величину поляризуемости бактерий Pseudomonas species. Численные оценки эквивалентной электрической схемы клетки показали, что трансмембранная наночастица золота шарообразной формы с радиусом гю,=10"Х м способна трансформировать электрическое сопротивление мембраны RM ~ 109 Ом к величине

rau ~ 0,73 Ом. Такая модификация мембраны способна оказывать существенное влияние на величину поляризуемости и равновесной частоты. Клетки, выращенные в питательной среде с добавлением хлорида золота, в НПЭП теряют способность к поступательному движению во всем частотном диапазоне. Отсутствие поступательного движения

клеток в НПЭП объясняется равенством S^Scp, малыми величинами

поляризуемости аkj, (1) и силы (F3Jl), действующей на нее (2). Вывод: ЭОСИК позволяет исследовать модификацию клеточной стенки бактерий химическими ингредиентами внешней среды.

В разделе 4.4. рассмотрено применение электрооптической системы исследования клеток в области медицины.

В разделе 3.4.1 представлен метод исследования вязкоупругих характеристик (ВУХ) с помощью ЭОСИК.

Обобщенная жесткость сК7 клетки находилась из выражения

т?2

ОТ £ Е с _ кл о

кл 2г х кл т

где; хт - амплитуда деформации клетки в НПЭП, определяется экспериментально.

Обобщенная вязкость клетки находилась из выражения

Пкя=~

скл • 11

6-тг-гкл-1п\хт\ '

где хт - амплитуда деформации клетки, ^ - длительность радиоимпульса. Частота заполнения радиоимпульса находилась в области в области положительного диэлектрофореза.

Для исследования ВУХ эритроцитов на электроды измерительной ячейки подавались радиоимпульсы длительностью 0,5 е., напряжение ит=5+0,2 В и частотой заполнения 1 МГц.

В разделе 4.4.2. изложены результаты системных исследований ЭОСИК в диагностике патологии сердца. Исследования пациентов с алкогольным и неалкогольным поражением сердца (АПС и НАПС) показали наличие корреляции между тяжестью заболевания и уменьшением амплитуды деформации их эритроцитов в НПЭП, рисунок 15.

Рисунок. 15. Деформация эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле, а) - отсутствие деформации эритроцитов для пациентов с патологией сердца; Ь) - характерная деформация эритроцитов для здоровых пациентов

В группе с АПС (27 чел.) обобщенная жесткость эритроцитов составляла ст = (1,0-10"4±8,3-10"5) Н/м, обобщенная вязкость Пкл = . (2,4-10"2±1,9-10"3) Па-с, средняя амплитуда деформации 10~6±0,5-10"6) м, поляризуемость аа =1,4-10~14±4,7-10"15м3 на

частоте /= 106 Гц.

Полученные результаты позволили сделать следующие основные выводы:

- при алкогольном поражении сердца наблюдаются увеличение величин обобщенных показателей жесткости, вязкости эритроцитов;

- показатели жесткости, вязкости эритроцитов могут использоваться как дополнительные характеристики в целях диагностики алкогольного поражения сердца.

В разделе 4.4.3. описано применение ЭОСИК в диагностике патологии печени. Обследовались три группы пациентов (мужчины) в возрасте от 35 до 60 лет. Группа сравнения (БО) состояла из 33-х условно здоровых мужчин, у которых клиническими и инструментальными методами патологии печени и не выявлено. Первая группа включала пациентов с первой или второй стадиями фиброза (легкий - невыраженный фиброз - Б1, Б2). Во вторую группу входили пациенты с третьей или четвертой стадиями фиброза (выраженный фиброз - БЗ, Б4).

Измерения обобщенной жесткости и обобщенной вязкости эритроцитов от пациентов со стадией фиброза БЗ, ¥4 печени достоверно отличались от группы сравнения Р0 и группы И, VI. Амплитуда их деформации и скорость поступательного движения относительно электродов на частотах 0,5 и 1 МГц были ниже. Практически все эритроциты необратимо переходили в форму сфероцитов. На частоте 0,5 МГц наблюдалось массовая деструкция клеток. Отмечалась также повышенная способность эритроцитов к образованию агрегатов после перевода эритроцитов в раствор 0,3 М сахарозы. Для этой группы обобщенная жесткость эритроцитов составляла Сю1=4,3• 10"5±4,9-10"6 Н/м, обобщенная вязкость ^7=-1,3-10"2±1,4-10"3 Па с, амплитуда деформации хш=7,2-10"7±0,5-10"6 м, поляризуемость аюг=9,0-10"15±3,1-10Л5 м3 на частоте/=106Гц.

В разделе 4.5. представлено применение ЭОСИК в биотехнологии.

В разделе 4.5.1. рассмотрено концентрирование клеток по величине поляризуемости в неоднородном переменном электрическом поле проточной камеры. Скорость поступательного

движения укл каждой отдельной клетки в НПЭП находится из уравнения (3)

1 || , - -Яе \акл\-е0 -VЕср

V = —- .

У КЛ у

6 ■ к ■ Пер ■ гкл

Из уравнения следует, что скорость поступательного движения клетки укл прямо пропорциональна величине поляризуемости

Ле^кл!- Данное выражение положено в основу метода концентрирования и разделения клеток по величине поляризуемости. На рисунке 16 представлены экспериментальные результаты концентрирование клеток в измерительной камере с двумя электродами.

а) Ь).

Рисунок. 16. Концентрирование клеток в измерительной камере с двумя электродами, а) - эритроциты между электродами измерительной камеры до процесса концентрирования; Ь) - концентрация эритроцитов между электродами измерительной камеры

Применялась также разделительная камера с множеством парных электродов, рисунок 17.

Рисунок 17. Конструкция разделительной ячейки

К каждой паре электродов прикладывается переменное напряжение в частотной области отрицательного диэлектрофореза. Система уравнений поступательного движения клетки в плоскости электродов записывается следующим образом

1

с1х _ 2 Ж

I

йу 2£° 'акл Ж

6-К-Г}

кл кл

■т]Р)у

'(М кл -Мер)

где Vj.~l.5vJl-

2у-Н Н

\2

) - скорость вязкого течения

потока клеточной суспензии; у0 - скорость потока жидкости в разделительной ячейке на расстоянии Я/2 от стенки.

Типичные траектории клетки в частотной области отрицательного диэлектрофореза, полученные численным интегрированием уравнений представлены на рисунке 18.

О 0,2 0,3 [мм]

Рисунок 18. Траектории латексных частиц разными коэффициентами поляризуемости: • - акл > о - а,.,, > х - акл. Стрелкой указано направление потока суспензии

На рисунке 19 приведена фотография результата процесса разделения эритроцитов при подаче различных напряжений на электроды разделительной ячейки. Численные исследования поведения клеток в разделительной камере и определение оптимальных параметров ее конструкции позволили сделать следующий вывод - выбор конструктивных характеристик ячейки (геометрические размеры), режимы работы (скорость потока микрочастиц, напряжение на электродах) целесообразно рассматривать в сочетании с безразмерным параметром подобия. Параметр подобия равен отношению электрической силы, действующей на клетку, к силе трения в вязкой среде.

^ ■ ■ - - ^-чг-з

- V V л§

¡М« чь. ^

и к 1

Рисунок 19. Эритроциты человека на второй паре электродов разделительной камеры, установленной вертикально. Напряжение на второй паре электроде ¿7=10 В, на остальных £/= 0 В. Стрелкой УТ указано направление потока суспензии

выводы

1. Создана электрооптическая системы исследования клетки неоднородным переменным электрическим полем в целях диагностики инфекционных и не инфекционных заболеваний человека. Тестирование системы в условиях медицинского учреждения показало высокую ее эффективность неинвазивного контроля заболеваний печени и сердца. Электрооптическая система исследования клетки позволяет

измерять следующие ее характеристики: радиус - (2+10) мкм; скорость поступательного движения относительно электродов

Ум - (0,5+25) мкм/с; амплитуду деформации хт - (0,5+5) мкм; коэффициент объемной поляризуемости ат - (10"14+10"16) м3; обобщенную жесткость с0- (10"3+10"6) Н/м; обобщенную вязкость Лкл - (0,1+0,001) Па-с; равновесную частоту -/р - (50+10000) кГц; электрическую емкость Ол -10"<12т15) Ф. Относительная погрешность

измерения поляризуемости клетки не превышает - 5(акц) < 19,5%.

2. Разработан метод измерения обобщенной вязкосда„ и обобщенной жесткости эритроцитов. В основе метода лежит измерение амплитуды деформации эритроцита в неоднородном переменном электрическом поле, созданного в измерительной камере электрооптической системы исследования клеток. Получены дополнительные диагностические признаки (обобщенной вязкости и обобщенной жесткости эритроцитов), использование которых позволяет осуществлять неинвазивную диагностику заболеваний печени и сердца человека.

3. Разработан метод измерения коэффициента объемной поляризуемости клетки в неоднородном переменном электрическом поле. Характеризация клетки по признаку поляризуемости отражает присущую ей биологическую уникальность через распределение электрических зарядов по всему клеточному объему.

4. Разработан метод измерения концентрации вирусов в клеточной суспензии в неоднородном переменном электрическом поле.

5. Разработан подход специфической экспресс индикации вируса гриппа с помощью электрооптической системы исследования клеток. Разница между амплитудно-частотными зависимостями поляризуемости интактной и инфицированной вирусом клетки является основой специфической экспресс индикации вирусов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Бакулина Л.Ф., Фефелов О.В., Чепурнов A.A. Измерение электрической емкости мембраны клеток// Биотехнология. 2001. № 4. С. 64-69.

2. Бакиров Т.С., Генералов В.М. Пробоотборник "Ловушка" для частиц биогенного происхождения в космосе // Оптика атмосферы и океана. 2000. Т. 13, № 6-7. С. 598-602.

3. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Дурыманов А.Г., Порываев

B.Д., Топорков B.C. Эквивалентная электрическая схема клетки // Биотехнология. 2000. № 2. С. 53-59.

4. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Пугачев В.А., Репин В.Е., Куслий A.A., Смолина М.П., Чепурнов A.A. Исследование амплитудно-частотной поляризации биочастиц в ответ на внешние воздействия // Доклады академии наук. 2001. Т. 377, Вып. 3. С. 399-401.

5. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Топорков B.C. Измерение вязкоупругих характеристик клетки с помощью неоднородного переменного электрического поля // Биотехнология. 1998. № 5. С. 88-96.

6. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Топорков B.C. Измерение поляризации отдельной клетки в неоднородном переменном электрическом поле // Биотехнология. 1998. № 2. С. 73-82.

7. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Фефелов О.В. Решение задачи взаимодействия электрических полей с частицами биогенного происхождения // Оптика атмосферы и океана. 2001. Т. 14, № 6-7.

C. 616-619.

8. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Чепурнов A.A., Тюнников Г.И., Порываев В.Д. Анализ механизма деполяризации клеток на начальных стадиях вирус-клеточного взаимодействия // Доклады академии наук. 1998. Т. 363, № 2. С. 258-259.

9. Бакиров Т.С., Чепурнов A.A., Тюнников Г.И., Генералов В.М. Исследование изменений электрических характеристик эритроцитов гуся при адсорбции вируса краснухи // Биотехнология. 1997. № 4. С. 47-54.

10. Генералов В.М., Бакиров Т.С., Дурыманов А.Г., Медведев A.A., Порываев В.Д., Топорков B.C., Тюнников Г.И., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Шишкина Л.Н., Фефелов О.В. Исследование

вирус-клеточного взаимодействия методом диэлектрофореза // Доклады академии наук. 2002. Т. 383, № 2. С. 256-259. П.Генералов В.М., Бакиров Т.С., Дурыманов А.Г., Пак A.B., Сухенко Е.П., Кручинина М.В., Курилович С.А., Андреева И.С., Печуркина Н.И. Теоретическое и экспериментальное исследование влияния пор мембраны на амплитудно-частотную зависимость поляризуемости клетки // Биофизика. 2008. Т. 53, Вып. 5. С. 810816.

12. Генералов В.М., Бакиров Т.С., Пак A.B., Звольский И.Л., Зайцев Б.Н., Дурыманов А.Г., Кручинина М.В., Курилович С.А., Сергеев А.Н. Автоматизированная установка измерения вязкоупругих характеристик эритроцитов // Наукоемкие технологии. 2008. Т. 9, № 12. С. 28-33.

13. Генералов В.М., Кручинина М.В., Курилович С.А., Громов

A.A. Диэлектрофорез - этапы развития // Технология живых систем. 2012. Т. 9, № 2. С. 3-12.

14. Зайцев Б.Н., Дурыманов А.Г., Бакулина Л.Ф., Генералов В.М. Исследование взаимодействия эритроцитов и вирусных частиц методом атомно-силовой микроскопии // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2003. № 7. С. 34-38.

15. Кручинина М.В., Громов A.A., Рабко A.B., Курилович С.А., Генералов В.М., Бакиров Т.С., Шакиров М.М. Патогенетические варианты реологических нарушений у больных, перенесших инсульт // Сибирский медицинский журнал. Томск. 2010. Т. 25, № 2. С. 177-179.

16. Кручинина М.В., Курилович С.А., Громов A.A., Генералов

B.М., Бакиров Т.С., Рихтер В.А., Семенов Д.В., Морозов C.B. Алкогольное поражение печени. Взаимосвязь электрических, вязкоупругих характеристик эритроцитов и структуры их мембран // Вестник НГУ. 2008. Т. 6, № 2. С. 96-103.

17. Кручинина М.В., Курилович С.А., Громов A.A., Рабко A.B., Бакиров Т.С., Генералов В.М., Пак A.B. Отличия электрических и вязкоупругих свойств эритроцитов при аритмиях алкогольного и неалкогольного генеза // Омский научный вестник. 2005. Т. 1, № 13. С.169-173.

18. Кручинина М.В., Курилович С.А., Паруликова М.В., Бакиров Т.С., Генералов В.М., Пак A.B., Звольский И.Л. Электрические и вязкоупругие свойства эритроцитов у пациентов с диффузной

патологией печени // Доклады академии наук. 2005. Т. 401, № 5. С. 701-704.

19. Кручинина М.В., Курилович С.А., Паруликова М.В., Бакиров Т.С., Дурыманов А.Г., Пак A.B., Мальченко Д.А., Генералов В.М. Изменение электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов пациентов с алкогольным поражением сердца // Вестник НГУ. 2005. Т. 3, №. 1. С. 12-20.

20. Кручинина М.В., Курилович С.А., Паруликова М.В., Громов

A.A., Бакиров Т.С., Генералов В.М., Пак A.B. Вязкоупругие и электрические характеристики эритроцитов при различной степени фиброза печени // Вестник НГУ. Серия Биология. Клиническая медицина. 2005. Т. 3, №. 4. С. 43-52.

21. Кручинина М.В., Курилович С.А., Светлова И.О., Громов A.A., Генералов В.М., Бакиров Т.С. Диэлектрофорез эритроцитов: новые возможности в диагностике непрямых гипербилирубинемий // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2009. № 3. С. 29-35.

22. Кручинина М.В., Курилович С.А., Громов A.A., Генералов

B.М. Особенности параметров эритроцитов у пациентов с неалкогольным стеатогепатитом // Вестник НГУ. 2011. Т.9. № 3. С.68-76.

23. Курилович С.А., Кручинина М.В., Генералов В.М., Бакиров Т.С., Рихтер В.А., Семенов Д.В. Электрические параметры и структура мембран эритроцитов при диффузных заболеваниях печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, коло-проктологии. 2009. T. XIX, № 2. С. 30-36.

24. Курилович С.А., Кручинина М.В., Громов A.A., Генералов В.М., Бакиров Т.С., Рихтер В.А., Семенов Д.В. Обоснование применения эссенциальных фосфолипидов при хронических заболеваниях печени: динамика электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2010. № 11. С. 46-52.

25. Курилович С.А., Кручинина М.В., Громов A.A., Немцова Е.Г., Генералов В.М., Бакиров Т.С., Шакиров М.М., Рихтер В.А., Семенов Д.В. Опыт применения новых технологий для изучения комплекса параметров эритроцитов при диффузных заболеваниях печени // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2011. Т. 31. №. 6, С. 21-30.

26. Мальченко Д.А., Генералов В.М., Дурыманов А.Г., Бакиров Т.С., Фефелов О.В., Ситников А.Н. Измерение электрической ем-

кости клеточной мембраны методом диэлектрофореза // Оптика атмосферы и океана. 2003. Т. 16, № 05-06. С. 515-518.

27. Медведев A.A. Бакиров Т.С. Генералов В.М., Топорков B.C. Разделение интактных клеток по величине поляризации // Биотехнология. 2000. № 1. С. 89-94.

28. Онищенко Г.Г., Нетесов C.B., Агафонов А.П., Сафатов A.C., Генералов В.М., Буряк Г.А., Сергеев А.Н., Дроздов И.Г. Высокопатогенный птичий грипп: угроза новой пандемии и возможности ей противостоять // Вестн. РАМН. 2006. № 12. С. 36-42.

29. Сергеев А.Н., Сафатов A.C., Генералов В.М., Агафонов А.П., Перова О.В., Буряк Г.А., Нетесов C.B., Дроздов И.Г. Высокопатогенный грипп птиц за рубежом и в России: Стратегия борьбы и профилактики // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов. 2006. Вып. 1, № 91. С. 5-10.

30. Ситников А.Н., Бакиров Т.С., Генералов В.М., Мальченко Д.А., Фефелов О.В. Измерение вязкоупругих характеристик частиц методом диэлектрофореза // Оптика атмосферы и океана. 2003. Т. 16, № 5-6. С. 512-515.

31. Фефелов О.В., Бакиров Т.С., Генералов В.М., Сафатов A.C. Двухчастотный метод измерения коэффициента поляризуемости клеток // Оптика атмосферы и океана.2002. Т. 15. № 05-06. С.537-540.

32. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Фефелов О.В. Пробоотбор биологических частиц с помощью высокочастотных электрических и магнитных полей // Оптика атмосферы и океана. 2002 . Т. 15. № 05-06. С. 515-517.

Монография

Генералов В.М., Кручинина М.В., Дурыманов А.Г., Медведев A.A., Сафатов A.C., Сергеев А.Н., Буряк Г.А., Курилович С.А., Громов A.A. Диэлектрофорез в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний. Новосибирск: Изд-во "ЦЭРИС", 2011. 172 с.

Патенты, полезные модели

1. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Ведерников Б.Ф., Сергеев А.Н. Система для измерения вязкоупругих и электрических характеристик клеток биологических объектов. Свидетельство на полезную модель № 71439. Опубликован 10.03.2008. Бюл. № 24.

2. Бакиров Т.С., Бакулина Л.Ф., Генералов В.М., Жуков В.А., Звольский И.Л., Фефелов О.В., Чепурнов A.A., Шишкина Л.Н.

Устройство для селективной деструкции биологических объектов. Свидетельство на полезную модель №29932; опубл. 10.06.2003. Бюл. № 16.

3. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Порываев В.Д., Топорков B.C., Тюнников Г.И., Чепурнов A.A. Способ определения концентрации вирусов в жидком биологическом материале и устройство для его осуществления. Патент на изобретение РФ №2225446, опубл. 10.03.2004. Бюл. №7.

4. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Чермашенцев В.М. Способ концентрирования биочастиц в суспензии. Патент на изобретение РФ 1712856, опубл. 10.05.1997. Бюл. № 13.

5. Генералов В.М., Бакиров Т.С., Пак A.B., Звольский И.Л., Курилович С.А., Кручинина М.В. Способ дифференциальной диагностики заболеваний печени. Патент на изобретение РФ № 2296327, опубл. 27.03.2007. Бюл. № 9.

6. Сухенко Е.П., Бакиров Т.С., Соловьев A.A., Генералов В.М., Васильев Ю.В., Пак A.B. Способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его вариант. Патент на изобретение РФ №2357251, опубл. 20.07.2007. Бюл. № 20.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 2.25 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 571. Подписано в печать 28.01.2013 г.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР»

Аппаратно-методический комплекс исследования клеток неоднородным переменным электрическим полем

Специальность 05.11.17 - Приборы, системы и изделия медицинского назначения

Диссертация

на соискание ученой степени доктора технических наук

На правах рукописи

Генералов Владимир Михайлович

Научный консультант д.т.н. Сафатов А.С.

Новосибирск -2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ....................................5

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................7

ГЛАВА 1. ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ КЛЕТОК ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ПОЛЕМ (Литературный обзор)...........................................................................18

1.1. Диэлектрофорез-этапы развития...........................................................18

1.2. Теория диэлектрофореза.......................................................................39

1.3. Строение клетки.....................................................................................49

1.3.1. Электрические характеристики мембраны и цитоплазмы клетки. 58

] .4. Диэлектрические свойства биологических тканей.............................64

1.5. Выводы по главе 1.................................................................................67

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................70

2.1. Перечень основных материалов, средств измерений и вспомогательных устройств.................................................................................70

2.2.Базовый изотонический раствор...........................................................74

2.3. Цельная кровь человека........................................................................75

2.4. Метод измерения равновесной частоты клетки в неоднородном переменном электрическом поле.........................................................................76

2.5. Электрические сигналы зондирования клеток...................................78

ГЛАВА 3.РАЗРАБОТКА АППРАТНО-МЕТОДИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА.......................................................................................................81

3.1. Разработка метода измерения коэффициента объемной поляризуемости клетки в неоднородном переменном электрическом поле ..81

3.2. Разработка электрооптической системы исследования клеток........82

3.2.2. Конструирование ячейки для измерений коэффициента поляризуемости клеток.........................................................................................84

3.2.3. Расчет характеристик электрического поля в измерительной камере.....................................................................................................................88

3.2.4. Общие сведения о программном обеспечении электрооптической

системы исследования клеток..............................................................................92

3.2.5. Контроль точности измерения коэффициента поляризуемости электрооптической системой исследования клеток........................................100

3.2.6. Сопоставление экспериментальной и расчетной величины поляризуемости латексных микрочастиц и эритроцитов...............................105

3.2.7. Оценка времени релаксации клетки в вязкой среде......................108

3.2.8. Выводы по главе 3............................................................................111

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................112

4.1. ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТКИ С НЕОДНОРОДНЫМ ПЕРЕМЕННЫМ ЭЛЕКТРИЧЕКИМ ПОЛЕМ.............112

4.1.1. Анализ эквивалентной электрической схемы клетки................... 112

4.1.2. Теоретическое и экспериментальное исследование влияния сквозных пор мембраны на амплитудно-частотную зависимость поляризуемости эритроцитов человека............................................................131

4.2. ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК В ВИРУСОЛОГИИ..........................................146

4.2.1. Поляризуемость вирусной частицы................................................146

4.2.2. Индикация вируса краснухи............................................................150

4.2.3. Индикация вируса гриппа................................................................152

4.2.4. Разработка методического подхода применения электрооптической системы индикации клеток для специфической экспресс индикации вируса гриппа...................................................................................156

4.2.5. Разработка метода измерения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью электрооптической системы исследования клеток ..165

4.2.6. Инактивации вирусов в растворах с низкой ионной силой..........172

4.2.7. Манипуляция вирусами методом диэлектрофореза......................174

4.3. ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК В МИКРОБИОЛОГИИ....................................176

4.3.1. Оценка влияния бензилпенициллина на величину равновесной частоты бактерий Bacillus siibtilis......................................................................176

4.3.2. Оценка влияния хлорида золота (.АиСГ4) на величину поляризуемости бактерий Pseudomonas species...............................................180

4.4. ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК В МЕДИЦИНЕ.................................................182

4.4.1. Разработка метода исследования электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов...............................................................................182

4.4.2. Электрооптическая система исследования клеток в диагностике заболевания сердца.............................................................................................188

4.4.3. Электрооптическая система исследования клеток в диагностике патологии печени................................................................................................195

4.5. ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК В БИОТЕХНОЛОГИИ.....................................203

4.5.1. Концентрирование клеток по величине поляризуемости в неоднородном переменном электрическом поле проточной камеры............206

4.6. Выводы по главе 4...............................................................................213

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................220

ВЫВОДЫ.....................................................................................................225

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................................227

ПРИЛОЖЕНР1Е А. Акты внедрения.........................................................262

1. Акт внедрения электрооптической системы исследования клеток в медицине..............................................................................................................262

2. Акт о внедрении раствора 0,3 М сахарозы в практику измерений.... 262

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Титульный лист методики измерения

поляризуемости биологических частиц и клеток крови, утвержденной в Сибирском научно-исследовательском институте метрологии.....................265

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Патенты, полезные модели......................................267

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

л

акл - коэффициент объемной поляризуемости клетки [м ]; скп - обобщенная жесткость клетки [Н/м]; 7]Ю1 - обобщенная вязкость клетки [Па-с]; Ст - емкость клетки [Ф]; ткл - масса клетки [кг]; гкл - радиус клетки [м]; хт - амплитуда деформации клетки [м]; 2

УЕСр - градиент квадрата напряженности электрического поля среды, век-

2 3

торная величина [В /м ];

2

(VЕср)х - градиент напряженности электрического поля среды по оси х, ска-

о 3

лярная величина [В7м ]; % - восприимчивость [б/р];

со- круговая частота внешнего электрического поля [рад/с]; а- удельная проводимость [См/м];

- относительная диэлектрическая проницаемость среды [б/р];

-12

£0 - диэлектрическая постоянная 8,8510 [Ф/м];

Тр - время релаксации [с];

Лср ~ вязкость среды [Па-с];

Е- напряженность электрического поля [В/м];

р - удельное сопротивление [Ом-м];

АЧХ - амплитудно-частотная характеристика;

ВАЖ - вирусаллантоисная жидкость;

ВУХ - вязкоупругие характеристики;

ДЭФ - диэлектрофорез; ИР - изотонический раствор;

НПЭП - неоднородное переменное электрическое поле; ПБА - патогенные биологические агенты; РГА - реакция гемагглютинации;

СИ - международная система единиц, физических величин; УЗИ - ультразвуковые исследования;

ФБУН ГИД ВБ «Вектор» - Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный Научный Центр Вирусологии и Биотехнологии «Вектор»; ФБУН НИИ Терапии СО РАМН - Федеральное бюджетное учреждение науки научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук;

ФГУН ЦИТиС - Федеральное государственное учреждение науки центр информационных технологий и систем органов исполнительной власти; ФГУП СНИИМ - Федеральное государственное унитарное предприятие Сибирский научно-исследовательский институт метрологии; ФСБ - фосфатно-солевой буфер;

ЭОСИК - электрооптическая система исследования клеток.

ВВЕДЕНИЕ

В медицинской практике всестороннее исследование клеток является актуальным для изучения патогенеза многих заболеваний человека. В настоящее время широко используются приборы, принцип работы которых состоит в воздействии постоянного электрического поля на клетки крови и тканей человека. В указанном поле на отдельную клетку действует сила пропорционально величине ее заряда, а также напряженности внешнего электрического поля. Электрические заряды являются неотъемлемой частью всех без исключения клеточных структур: ядра, цитоплазмы, митохондрий, клеточных включений, белков и множества ее молекул и т.д. Эта сила является основой классического метода электрофореза, на базе которого созданы уникальные технологии: разделения белков по массе, фильтрации, сепарации, изучения свойств отдельных клеточных структур (например, мембраны), а также клетки в целом. Электрофорез широко применяется в клинической практике и часто используется в медицинских исследованиях. Однако исследовать быстрые процессы, происходящие внутри или вокруг клетки, с помощью электрофореза не удается, в силу самой сути метода - использования постоянного электрического поля.

В середине прошлого века была создана теория диэлектрофореза, описывающая поведение клеток под воздействием неоднородного переменного электрического поля (НПЭП). Накопленные экспериментальные данные за последние пятьдесят лет убедительно свидетельствуют о новых уникальных возможностях исследования клеток с помощью НПЭП в широком диапазоне частот. Молекулы, белки, многочисленные компоненты клетки и она сама, как единое целое, во внешнем электрическом поле поляризуются. Поляризация характеризует процесс перераспределения электрических зарядов по всему объему клетки, ее физико-химическую, структурную уникальность. Количественное описание поляризации достигается введением феноменоло-

гического коэффициента пропорциональности объемной поляризуемости1 -а, который связывает между свойства клетки и вызывающее его воздействие - электрическое поле. В НПЭП наблюдаются следующие основные эффекты:

- разнонаправленное поступательное движение клеток относительно электродов в зависимости от частоты внешнего электрического поля;

- ориентация клеток относительно силовых линий электрического поля;

- образование кооперативных цепочек между клетками;

- деформация клеток;

- вращение клеток вокруг собственной оси;

- кооперативное вращение клеток друг относительно друга;

- деструкция клеток.

Перечисленные эффекты открывают широкие возможности в разработке новых методов и технологий в области медицины.

До настоящего момента разработка прикладных методов диэлектрофо-реза сдерживалась сложностью автоматизации измерения поляризуемости клеток и, как следствие, высокой трудоемкостью. Вместе с тем, стремительный прогресс в области цифровой микроскопии, развитие компьютерной техники, цифровой записи изображения, предоставляет исследователям новые возможности, которые значительно уменьшают трудоемкость исследований и способствуют практическому внедрению диэлектрофореза в фундаментальную науку и практику.

Цель работы: - создание аппаратно-методического комплекса исследования характеристик клеток неоднородным переменным электрическим полем.

1 Далее по тексту будет использоваться термин поляризуемость.

Задачи работы:

- создание электрооптической системы исследования клетки (ЭОСИК);

- разработка метода измерения вязкоупругих характеристик клетки неоднородным переменным электрическим полем для нужд медицины;

- разработка метода измерения коэффициента объемной поляризуемости клеток неоднородным переменным электрическим полем;

- разработка метода измерения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью неоднородного переменного электрического поля;

- разработка подхода специфической экспресс индикации вирусов электрооптической системой исследования клеток.

Объекты исследования: - электрооптическая система исследования клеток, клетки, вирусы, микрочастицы.

Методы исследования. В диссертационной работе использованы методы лабораторных и практических исследований, математического и численного анализа, статистической обработки данных.

Клиническое обследование пациентов, забор их крови выполнены с одобрения комитета биомедицинской этики Федерального бюджетного учреждения науки научно-исследовательского института терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук; (протокол № 4 заседания Этического комитета Государственного учреждения научно-исследовательского института терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук; от 14 сентября 2002 г.). Все обследуемые заполняли анкеты информированного согласия об участии в исследованиях.

На защиту выносится:

- электрооптическая система исследования клеток для изучения вирус-клеточного взаимодействия, измерения коэффициента объемной поляризуемости, обобщенной вязкости и обобщенной жесткости клетки;

- метод измерения обобщенной вязкости и обобщенной жесткости эритроцита, как единого целого;

метод измерения коэффициента объемной поляризуемости биологических частиц и клеток крови;

- методический подход специфической экспресс индикации вирусов электрооптической системой исследования клеток;

- метод измерения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью неоднородного переменного электрического ПОЛЯ.

Достоверность научных положений, выводов и рекомендаций подтверждается:

- общепризнанными законами и положениями физики, вирусологии, медицины;

- публикациями в рецензируемых изданиях и обсуждением полученных результатов на Российских и международных конференциях;

- положительными результатами апробации и внедрения электрооптической системы исследования клеток в условиях медицинского учреждения;

- строгостью используемого математического аппарата;

- экспериментальными результатами и их теоретическими оценками, которые совпадают между собой.

Научная новизна работы заключается в следующем:

- раз работай аппаратно-методический комплекс исследования свойств клеток, бактерий, вирусов, вирус-клеточного взаимодействия, измерения коэффициента поляризуемости, обобщенной вязкости и обобщенной жестко-

сти клетки. Свидетельство на полезную модель № 71439. "Система для измерения вязкоупругих и электрических характеристик клеток биологических объектов". Положительное решение от 22.11.2007 г.;

- разработан способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его параметров. Патент РФ № 2357251 зарегистрирован 27 мая 2009 г.;

- разработан методический подход специфической экспресс индикации вирусов гриппа с помощью электрооптической системы исследования клеток. Заявка на патент. Уведомление о регистрации заявки № 2011133270 от 08.08 2011 г.;

- предложено уравнение для расчета величины электрической емкости клетки в НПЭП;

- установлено изменение знака поляризуемости эритроцитов человека в области частот (60-И 00) Гц, как результат пробоя мембраны клетки неоднородным переменным электрическим полем;

- латексные микрочастицы производства Dow Chemical (Индианаполис, США) Ф = 5,7-10"6 м предложены в качестве референс образец поляризуемости;

- разработан способ концентрирования клеток в суспензии. Патент на изобретение РФ 1712856, опубл. 10.05.1997. Бюл. № 13.;

- разработан способ определения концентрации вирусов в клеточной суспензии с помощью неоднородного переменного электрического ПОЛЯ. Способ определения концентрации вирусов в жидком биологическом материале и устройство для его осуществления. Патент 2225446 зарегистрирован в ГРИРФ 10 марта 2004 г. Заявка на изобретение 2001132198, опубл. 2003.07.10.;

- разработано устройство для селективной деструкции биологических объектов. Свидетельство на полезную модель № 29932 зарегистрировано в ГРИРФ 18.11.2002, опубл. 10.03.2003 г. Бюл. № 16.

Использование электрооптической системы исследования клетки в медицине позволило:

- на основе анализа поляризуемости и вязкоупругих характеристик эритроцитов осуществлять неинвазивную диагностику фиброза печени. Способ дифференциальной диагностики заболеваний печени. Патент РФ № 2296327. Заявка № 2004126112 от 30.08.2004; опубл. 27.03.2007. Бюл. № 9.;

- выявить повышенные показатели вязкости, жесткости эритроцитов у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Личный вклад автора. Вклад автора в представленные результаты заключается в личном участии в постановке задач, во всех теоретических и экспериментальных исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов, подготовке материалов к публикации в отечественных и зарубежных изданиях, разработке методик и их регистрация в государственных органах. Часть исследований выполнена в соавторстве с сотрудниками ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Бакировым Т.С., Дурымановым А.Г., Сафатовым A.C., Ведерниковым Б.Ф., Шишкиной JT.H., Булычевым JI.E., Сергеевым А.Н., Бакулиной Л.