автореферат диссертации по безопасности жизнедеятельности человека, 05.26.02, диссертация на тему:Последействия воздействия экстремальных факторов на особенности продукции цитокинов у ликвидаторов аварии на чернобыльской АЭС с сердечно-сосудистой патологией

V*. о*

, ц

На правах рукописи

СЫСОЕВ Кирилл Александрович

ПОСЛЕДСТВИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ НА ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ У ЛИКВИДАТОРОВ АВАРИИ НА ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС С СЕРДЕЧЕ ^-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

05.26. 02 - безопасность, защита, спасение и жизнеобеспечение населения в чрезвычайных ситуациях 14. 00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена во Всероссийском центре экстренной и радиационной медицины МЧС России, Санкт- Петербург.

Научные руководители: доктор медицинских, наук профессор Никифоров A.M.

доктор медицинских наук с.н.с. Калинина Н. М.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук с.н.с. Чепрасов В. Ю.

доктор медицинских наук с.н.с. Серебряная Н. Б.

Ведущая организация: 40 -ой государственный НИИ МО РФ

Защита диссертации состоится "14" января 1999 г. в 1330час на заседании диссертационного совета К - 192.01.01 во Всероссийском центре экстренной и радиационной медицины МЧС России (194044, Санкт - Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины МЧС России.

Автореферат разослан "_" декабря 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В.Ю. Рыбников

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Особенности поражения людей физическими, химическими и биологическими воздействиями при аварии на Чернобыльской атомной электростанции (ЧАЭС) и научные основы прогнозирования вероятного ущерба для здоровья лиц, принимавших участие в ликвидации последствий аварии, являются актуальными до настоящего времени. Это во многом связано с тем, что последствия воздействия экстремальных факторов на организм человека проявляются в отдаленный период. Основным аспектом этой проблемы является определение роли указанных экстремальных воздействий в патогенезе наиболее часто встречающихся заболеваний.

Лица, принимавшие участие в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС в 198687 годах ("ликвидаторы"; ЛПА) и подвергшиеся воздействию комплекса факторов радиационной аварии (КФРА), в том числе малых доз ионизирующей радиации, являются на протяжении более 12 лет объектом исследования врачей многих специальностей. Соматическая патология у ЛПА характеризуется разнообразием и включает заболевания сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, дыхательной, эндокринной и центральной нервной систем [Никифоров A.M., 1994]. Одно из ведущих мест по частоте встречаемости у ликвидаторов занимает патология сердечно-сосудистой системы. Во многом формирование соматической патологии определяется нарушениями системы иммунитета у ликвидаторов, обусловленными влиянием КФРА и в том числе малых доз ионизирующего излучения.

У ликвидаторов до настоящего времени наблюдается стойкое снижение популяции зрелых Т-лимфоцитов. Основой гипотезы нарушений в иммунной системе [Ярилин А-А., 1996] является предположение о трехэтапном развитии поражения тимус-зависимого звена иммунитета, включающего начальный этап в виде повышения под влиянием ионизирующего излучения уровня аутоаптител, реагирующих с эпителиальными клетками тимуса, промежуточный этап - подавление этими аутоаятителами секреции тимусных гормонов и конечный этап, характеризующийся нарушением функциональной активности и дефицитом Т-лимфоцитов вследствие недостаточного содержания гормонов тимуса в циркуляции. Таким образом, выявляемые изменения в Т-клеточном звене иммунитета в отдаленные сроки после аварии на ЧАЭС не связаны с прямым воздействием ионизирующей радиации на

иммунокомпетентные клетки [Ярилин A.A., 1997]; причиной этих нарушений является поражение микроокружения тимуса, в котором радиационное воздействие играет пусковую роль, следствием чего является нарушение происходящих в тимусе процессов позитивной и негативной селекции.

Как известно, Т-хелперы (Тх; С04+лимфоциты) делятся на субпопуляции, различающиеся по функциональным и фенотипическим признакам [Mossman T.R. et al., 1994]. Одним из главных различий этих субпопуляций является спектр . продуцируемых ими лимфокинов. Тх1 - регуляторы реакций клеточного иммунитета, проявляющие также свойства эффекторов, продуцируют интерферон-у (ИФН-у), интерлейкин-2 (ИЛ-2), фактор некроза опухоли-a (ФНО-а). Тх-2, осуществляющие регуляцию антителогенеза, продуцируют интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерлейкин-5 (ИЛ-5), . интерлейкин-б (ИЛ-6), интерлейкин-10 (ИЛ-10) [Mossman T.R. et al., 1994]. В отдаленные сроки после действия КФРА и в том числе ионизирующего излучения более выражен дефицит Txl, так как их развитие в большей степени зависит от микроокружения тимоцитов, страдающего в поздние сроки после аварии на ЧАЭС.

Цитокины - медиаторы межклеточного взаимодействия - высокоактивные биологические вещества пептидной природы, основными клетками-продуцентами которых являются моноциты/макрофаги и Т-лимфоциты [Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998]. Обладая широким спектром биологических активностей, цитокины способны оказывать влияние на собственную продукцию (аутокринная регуляция), продукцию других цитокинов я на клетки-мишени иммунной системы. Так, ИЛ-lß индуцирует синтез других цитокинов - ИЛ-6 [Dmarelto С.А., 1996], колониестимулирующих факторов (КСФ) и хемокинов (в частности ИЛ-8) [Oppenheim J.J. and Gery I., 1993], является фактором переключения с Txl ответа на Тх2 ответ, усиливает продукцию цитокинов моноцитами [Manetti R. et al., 1994 ], блокирует апоптоз нейтрофилов [Colotta F. et al., 1992].

ФНО-а является антагонистом ИЛ-4 [Hart Р.Н. et al., 1989], может индуцировать некроз и апоптоз клеток [Grooten J. et al., 1993], стимулирует дифференцировку клеток моноцитарного ряда [Peetre С. et al., 1986], сиитез и продукцию ИЛ-lß, ИЛ-б, ИЛ-8 [Beyaert R. and Fiers W., 1998] . В малых дозах ФНО-а обладает митогенным эффектом, в больших дозах вызывает цитотоксический эффект в отношении лимфоцитов [Higuchi M. et al., 1990].

ИЛ-б является дифференцировочным фактором для В-лимфоцитов [Muraguchi A. et al., 1988]. Развитие цитотоксических лимфоцитов и их предшественников опосредуется ИЛ-б [Luger Т.А. et al. 1989]. ИЛ-б усиливает ответ на антиген В-лимфоцитов, CD4+-, С08+-лимфоцитов и NK-клеток (Van Snick J., 1990]. В действии ИЛ-б на пролиферацию Т-лимфоцитов наблюдается синергизм с ИЛ-1 [Houssiau F. et al. 1988]. Продукция ИЛ-б усиливается ИЛ-ф и ФНО-а [Richards C.D., 1998]. ИЛ-4 оказывает ингибирующее действие на продукцию ИЛ-6 [Donnely R.P. et al., 1993].

ИЛ-8 ингибирует продукцию ИЛ-4 и IgE, пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов [Kimata Н. et al., 1995]. Ш7-8 стимулирует выход функциональных гемопоэтических предшественников из костного мозга в периферический кровоток [LaterveerL. et al., 1996].

Цитокины оказывают влияние на клетки-мишени не только иммунной системы, но и других органов и систем. В связи с этим в литературе обсуждается роль цитокинов в формировании сердечно-сосудистой патологии. G.N.Dalekos и соавт. [1997] отмечена положительная корреляция между уровнем ИЛ-1(5 и уровнем артериального давления у больных эссенциальной пшертензией. C.A.Dinarello [1994] установлено, что влияние Ш1-1|} на уровень артериального давления проявляется через стимулирующее воздействие на продукцию гормонов и медиаторов гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы. По данным G.K.Hansson и соавт. [1989] активированные Т-лимфоциты в атеросклеротических бляшках продуцируют ИЛ-4. S.K.Clinton и соавт. [1992] установлено, что цитокины стимулируют пролиферацию васкулярных мкоцитов. Также показано, что ИЛ-ip и ФНО-а оказывают супрессирующее влияние на сократительную способность миокарда [Hosenpud J.D. et al., 1989; Finkel M.S. et al., 1992]. Механизмом этого воздействия является индукция провоспалительными цигокинами активных форм кислорода, в свою очередь подавляющих сократительную способность миокарда [ChandrasekarB. et al., 1997].

В литературе представлены единичные данные о нарушениях в цитокиновом звене иммунитета при экстремальном воздействии КФРА, в том числе малых доз ионизирующего излучения. Изменения продукции цитокинов у ликвидаторов в отдаленный период также описаны недостатоточно полно, кроме того отсутствуют данные о роли этих изменений в формировании соматической патологии.

В связи с вышеизложенным была поставлена цель исследования :

выявить особенности продукции цитокинов у лиц, подвергшихся экстремальным воздействиям при ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, и определить вклад нарушений в цитокиновом звене иммунитета в формировании патологии сердечнососудистой системы. ■ .

В связи с поставленной целью были сформулированы задачи исследования:

1. Изучить особенности продукции цитокинов (ИЛ-1 р, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а) мононуклеарами периферической крови ЛПА на ЧАЭС с заболеваниями

. сердечно-сосудистой системы.

2. Изучить продукцию вышеперечисленных цитокинов у пациентов с патологией сердечно-сосудистой системы, не имевших экстремальных воздействий КФРА в анамнезе.

3. Провести сопоставление между уровнем продукции медиаторов иммунитета и количеством клеток-мишеней и клеток-продуцентов цитокинов в периферической крови.

4. Для доказательства особенностей формирования патологии сердечно-сосудистой системы в группе ЛПА на ЧАЭС сравнить данные, полученные у ликвидаторов с данными пациентов без экстремальных воздействий КФРА в анамнезе.

Научная новизна.

1. Впервые охарактеризованы особенности продукции цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а) клетками периферической крови лиц, подвергшихся экстремальному воздействию КФРА, в том числе малых доз ионизирующего излучения.

2. Определены различия в продукции цитокинов клетками периферической крови ликвидаторов, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями и пациентов с аналогичной патологией, не подвергавшихся экстремальным воздействиям КФРА.

3. Научно обоснованы механизмы участия цитокинов в формировании патологии сердечно-сосудистой системы у пациентов, в том числе у ликвидаторов.

Практическая значимость результатов работы

Выявленные нарушения продукции ИЛ-1Р, ИЛ-б, ИЛ-8, ФНО-а у ЛПА позволят на доклинической стадии ИБС выделить группы повышенного риска возникновения заболевания для диспансерного наблюдения. Включение исследований цитокинов (ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а) в лабораторный мониторинг ЛПА, больных сердечно-

сосудистыми заболеваниями, позволит оценивать эффективность патогенетической терапии. Результаты комплексного изучения цитокинов позволяют расширить представления о патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Положения, выносимые на защиту

1. Воздействие экстремальных факторов на участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС является причиной изменений в цитокиновом звене иммунитета.

2. Особенности иммунных механизмов формирования заболеваний сердечнососудистой системы ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС характеризуются достоверным повышением спонтанной продукции ФНО-а in vitro, повышением ФНО-а и ИЛ-4 в циркулирующей крови при отсутствии повышения ИЛ-8.

3. Изменения в цитокиновом звене иммунитета у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, играющие патогенетическую роль в формировании заболеваний сердечнососудистой системы, возникают на доклинической стадии и участвуют в формировании клинической симптоматики.

Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на II совместном съезде ICS (International Cytokine Society) и ISICR (International Society Interferon and Cytokine Research), Иерусалим (1998), на 1-ой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт- Петербурга (1998), на второй международной научной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'98" (1998), на международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург (1998).

Публикации, По теме диссертации опубликовано б научных работ.

Объем и структура диссертации. Настоящая работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания

материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения

t

полученных результатов, выводов и списка литературы. В диссертации приведены 19 таблиц и 8 рисунков. Список использованной литературы содержит 157 названий.

Материалы и методы исследования

. Были обследованы 85 ликвидаторов последствий авария на Чернобыльской АЭС, профессиональная деятельность которых в 1986 году была связана с непосредственным участием в мероприятиях по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС (строители, дорожные рабочие, техники, вертолетчики и т.п.)- Из них отобраны для диссертационного исследования 33 пациента, в историях болезни которых основным диагнозом была патология сердечно-сосудистой системы (ССС). Эти пациенты составили I группу. В нее вошли мужчины в возрасте от 36 до 57 лет, страдающие заболеваниями сердечно-сосудистой системы: ишемическая болезнь сердца (ИБС), гипертонической болезнь I-II стадии (ГБ).

Суммарная доза радиационного облучения (согласно официальным документам) составила от 5 до 42 бэр.

В качестве группы сравнения были обследованы 18 пациентов-мужчин с такой же патологией, не имевших экстремальных воздействий КФРА в анамнезе (II группа).

Данные о структуре заболеваний ССС у обследованных пациентов I и II групп представлены на рис. 1.

I группа

ИБС, ГБ п=16(48.5%) ИБС п=7 (21.2%) ГБ п=10(30.3%)

ИБС ГБ

ИБС, ГБ

II группа

п=9 (50.0%) п=6 (33.3%) iï-3 (16.7%)

ГБ 33%

Л

ИБС 50%

ИБС, ГБ 17%

Рис.1. Структура заболеваний ССС в I и II группе

Контрольную группу (п=15) составили условно здоровые люди аналогичного возраста (доноры; III группа).

В качестве материала исследования использовали периферическую кровь.

Уровень продукции цитокинов в условиях in vivo и in vitro определяли методом твердофазного иммуноферметного анализа - ИФА (ИЛ-Iß, ИЛ-8, ИЛ-4, .ФНО-а, эритропоэтин), a также с использованием биологического метода (ИЛ-2, ИЛ-6). Определение цитокинов методом ИФА ("сэндвич-метод") осуществляли с использованием отечественных тест-си;стем, производимых фирмами "Протеиновый контур" и "Цитокин". Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра для микропланшет при длине волны 492 или 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лункам без' определяемого цитокина в растворе. Количественную оценку результатов проводили методом построения калибровочной кривой вручную или с использованием коммерческих компьютерных программ, отражающих зависимость оптической плотности от концентрации для стандартного антигена и позволяющих в сравнении с ним определить концентрацию цитокина в исследуемых образцах. Чувствительность метода при изучении вышеперечисленных цитокинов составила 20-40 пг/мл.

Содержание ИЛ-2 в исследуемых образцах определяли с помощью стандартного теста поддержания пролиферации ИЛ-2 зависимой перевиваемой клеточной линии CTLL-2, содержание ИЛ-6 - с использованием стандартного теста поддержания пролиферации ИЛ-6-зависимой гибридомы В-9. Уровень "пролиферации клеток в исследуемых и контрольных образцах оценивали по интенсивности включения 3Н-тимидина с помощью бета-счетчика (Rackbeta) и жидкостного сцинциллятора. Уровень биологической активности ИЛ-2 или ИЛ-6 в образцах рассчитывали, сравнивая полученные значения с контрольньми образцами, и выражали в ед/мл.

Выделение мононуклеаров периферической крови (МНПК) осуществляли по методике, предложенной A.Boyum [1968], определение субпопуляций лимфоцитов проводили в лимфоцитотоксическом тесте согласно методики NiH USA с использованием моноклональных антител НПЦ "МедБиоСпектр".

Для статистической обработки данных применяли критерий Вилкоксона-Манна-УитнИ, используя - статистическую программу Stadia и MicroSoft Excel-97 для компьютерной обработки данных. Для проведения корреляционного анализа была использована программа STATISTICA for Windows, Release 5.0. (StatSoft, Inc.).

Основные результаты исследования и их обсуждение

Изучение особенностей продукции провоспапитепъных цитокинов ИЛ-1 р и ФНО-а

С целью выявления особенностей продукции ИЛ-ip и ФНО-а эти цитокины были изучены у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС с заболеваниями сердечнососудистой системы (ЛПА; 1 группа) в сравнении с пациентами с аналогичной патологией, не имевшими экстремальных воздействий КФРА в анамнезе, - группа сравнения (ГС; II группа) и донорами - (III группа). Определяли спонтанную и индуцированную продукцию ИЛ-ip и ФНО-а МНПК (in vitro), a также содержание данных цитокинов в сыворотке периферической крови (in vivo). Особенности продукции ИЛ-1 (3 у пациентов сравниваемых групп представлены на рисунке 2.

Спонтанная продукция ИЛ-1 бета (пг/мл) Юао*"

Индуцированная продукция ИЛ-1 бета (пг/мл)

Доноры

4000 3600 3000 2500 2000 1600 1000 600 О

Доноры

р<0.05 *(1-Ш группа), **(1-П группа), ♦**( II- III группа).

Рис.2. Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-1р в сравниваемых группах

Как видно на рисунке 2, у ликвидаторов и пациентов II группы отмечено достоверное повышение спонтанной продукции ИЛ-1Р МНПК в сравнении с донорами, причем спонтанная продукция в ГС была достоверно наибольшей среди сравниваемых групп. Повышенная спонтанная продукция в группе ЛПА и во II группе в сравнении с донорами свидетельствует о наличии эндогенной - активации мононуклеаров периферической крови.

При исследовании индуцированной продукции ИЛ-1р МНПК в группах ЛПА, ГС и здоровых лиц было отмечено, снижение индекса стимуляции (отношение индуцированной продукции к спонтанной; ИС) у пациентов сравниваемых групп: в I группе ИС равнялся 3.7, во II группе - 3.0, в III группе - 5.9, что говорит о снижении функциональных резервов клеток отвечать продукцией ИЛ-1Р на -антигенную

стимуляцию у лиц с заболеваниями ССС. Ввиду того, что клетками-продуцентами ИЛ-ip являются CD4+-, CDS'1-, CD16+-, С020+-лимфоциты, вышеперечисленные субпопуляции клеток были изучены в сравниваемых группах.

В группе ЛПА отмечается достоверное (р<0.05) снижение относительного и абсолютного количества CD4+- и CD 16+-лимфоцитов по сравнению с III группой, CD8+- и С020+-лимфоцитов по сравнению со II и III группами. При пересчете спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-ip на клетку-продуцент тенденции в нарушениях спонтанной продукции ИЛ-,ф сохранились в сравниваемых группах, индуцированная продукция во II группе и в группе доноров практически была одинакова.

Данные, полученные при изучении ИЛ-ip в сыворотке периферической крови лиц всех групп, свидетельствуют о том, что активация МНПК не приводит к значительному увеличению циркулирующег . ИЛ-lp в сыворотке крови. Отсутствие выявляемых количеств ИЛ-ip в сыворотке периферической крови во всех группах можно объяснить наличием растворимых форм рецептора ИЛ-1р и/или наличием антител к ИЛ-1 р. Другим возможным объяснением этого может быть продукция МНПК рецепторного антагониста ИЛ-1 (РАИЛ), который, конкурируя с ИЛ-ip за связывание с рецептором ИЛ-11 типа, ингибирует аутокринную регуляцию МНПК продуцируемым ими ИЛ-iptArendH., 1993].

Была изучена спонтанная и индуцированная продукция ФНО-а МНПК периферической крови и содержание цитокина в сыворотке крови пациентов сравниваемых групп. Данные исследования спонтанной продукции и значения индекса стимуляции в сравниваемых группах представлены на рисунке 3.

Спонтанная продукция ФНО-альфа (пг/мл)

Индекс стимуляции ФНО-альфа

ГС Доноры

р<0.05 *(1-Ш группа) +*(Н1 группа).

Рис.3. Спонтанная продукция МНПК и индекс стимуляции ФНО-а в сравниваемых группах

Как видно из рисунка 3, спонтанная продукция ФНО-а была максимальной в группе ЛПА, несколько ниже во II группе. Показатели в I и II группах достоверно превышали показатели в группе доноров. Обращает на себя внимание достоверно

сниженная индуцированная продукция ■ ФНО-а в группе ЛПА по сравнению с III группой. Снижение возможности клеток продуцировать ФНО-а в ответ на антигенный стимул наиболее ярко выявляется при изучении индекса стимуляции (ИС). ИС ФНО-а у здоровых лиц составил 6.4, в ГС - 3.2, в группе ЛПА - 1.8 (рисунок 3).

Таким образом, нарушение продукции ФНО-а в ответ на антигенную стимуляцию было наиболее выражено в группе ЛПА. Выявленные особенности могут быть связаны с длительной гиперпродукцией ФНО-а клетками периферической крови, последующим нарушением аутокринной регуляции цитокина и рефрактерностъю клеток-продуцентов к антигенному стимулу.

Учитывая, что клетками-продуцентами ФНО-а являются CD4+-, CD8+-лимфоциты и NK-клетки, представляется интересным сравнить уровень спонтаниой и индуцированной продукции в пересчете на клетку-продуцент, так как изучение продукции цитокина in vitro проводили в супернатантах при культивировании цельной крови.

При пересчете на клетку-продуцент практически нивелируются различия между II и III группами в спонтанной продукции ФНО-а и по-прежнему максимально высокая спонтанная продукция ФНО-а выявляется в I группе. При изучении ответа каждой клетки-продуцента на индуктор отмечаются те же закономерности, что и при исследовании цельной крови.

Особенностью обследованной группы ЛПА явилось достоверное повышение уровня ФНО-а в периферической крови по сравнению со И и III группами (рисунок 4 ).

Содержание ФНО-альфа в сыворотке (пг/мл)

ЛПА ГС Доноры

Рис.4. Содержание ФНО-а в сыворотке крови в сравниваемых группах

Циркулирование ФНО-а в перифедической крови может быть следствием как нарушения связывания цитокина со своим рецептором, так д формированием тримеров ФНО-а, плохо выводящихся из циркуляции [Тгасеу В., 1994]. Наличие в циркуляции

тримеров цитокииа может приводить к постоянной активации не только клеток иммунной системы, но и кардиомиоцитов, инициировать в них оксидативный стресс и апоптоз. Таким образом, при оценке продукции ФНО-а, играющего важную роль в формировании сердечно-сосудистой патологии, выявлены различные изменения в I и II группах: при повышенной спонтанной продукции в обеих группах у ЛПА отмечается более высокий уровень цитокина в периферической крови.

Гиперпродукция ИЛ-1(3, высокая спонтанная продукция и повышенный уровень ФНО-а в периферической крови в группе ЛПА предполагают механизмы компенсации активирующего и повреждающего действия этих цитокинов. В этой связи проводили определение уровня эритропоэтина (ЕРО) в сыворотке крови, который по данным литературы подавляет продукцию ИЛ-ф и ФНО-а [МузН\узка .1. е1 а1, 1998]. ЕРО представляет собой кислый гликопротеин, продуцируемый клетками почечной паренхимы. Продукция ЕРО связана с уровнем свободных форм кислорода в крови, в норме уровень ЕРО в сыворотке крови незначителен и не превышает 20 тШ/т1. Определение ЕРО у ликвидаторов выявило достоверное увеличение этого показателя. Средний уровень в группе ЛПА составил 62±10 шШ/т1, что более чем в 3 раза превысило уровень, встречающийся у здоровых людей.

. Исследование особенностей продукции хемокииа ИЛ-8

ИЛ-8 известен как классический хемоаттрактант, участвующий в привлечении клеток иммунной системы к месту поступления антигена. В последнее время появились литературные данные, подтверждающие участие ИЛ-8 в формировании атеросклеротических бляшек при патологии ССС, а также характеризующие цитокин как митоген и хемоаттрактант для гладкомышечных клеток сосудистой стенки. В связи с вышеизложенным была изучена продукция ИЛ-8 in vivo и in vitro в обследуемых группах. Спонтанная продукция у пациентов обеих групп была достоверно повышена по сравнению с донорами, причем максимально высокой она была в группе пациентов без экстремальных воздействий в анамнезе. Изучение индуцированной продукции показало, что в I и II группах отмечается снижение продукции ИЛ-8 в ответ на антиген, что выражается в снижении ИС: в группе доноров ИС равняется 17.9, в группе ЛПА -3.7, в группе сравнения -1.1. Данные изучения представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Продукция ИЛ-8 in vivo и in vitro (M±m)

Группы ИЛ-8 (пг/мл)

Продукция МНПК. в сыворотке крови

спонтанная индуцированная

I (ЛПА) п=33 1430±3092*,'** ' 5300±561'* ■ 39±19

II (ГС) п= 18 3210+S813*** 35301487^*** 141+541***

Ш (Доноры) я=15 302±80 5420+626 0

- p<0.05, p<0.01, J-p<0.001; *(1- II группа); **(.I- III группа); ***( II- III группа).

Ответ на антиген у пациентов II группы практически отсутствовал (у 22% лиц ГС спонтанная продукция ИЛ-8 превышала индуцированную, то есть в ответ на стимуляцию клетки демонстрировали рефрактерность).

Так как исследование ИЛ-8 in vitro проводилось с использованием цельной крови, представлялось целесообразным определить, являются ли изменения продукции ИЛ-8 in vitro связанными с функциональными особенностями изучаемых клеток или с их количественными изменениями по сравнению с донорами. Известно, что источником ИЛ-8 в периферической крови являются моноциты и Т-лимфоциты. В связи с тем, что изменений количества моноцитов во всех сравниваемых группах не было выявлено, этот источник продукции ИЛ-8 не учитывали, то есть основными клетками-продуцентами ИЛ-8 были Т-лимфоциты.

Исследования клеточного иммунитета, проведенные ранее, выявили достоверное снижение CD4+- и С08+-лимфоцитов у ликвидаторов по сравнению с донорами и достоверное повышение Т-лимфоцитов в ГС по сравнению с III группой. При пересчете продукции ИЛ-8 на клетку-продуцент, выявилась та же закономерность, что и при исследований цельной крови in vitro.

Изучение продукции ИЛ-б in vivo u in vitro ИЛ-6 играет важную роль в формировании патологии ССС (способствует снижению сократительной способности миокарда как через индукцию синтеза оксида азота (NO), так и NO-кезависимыми путями) [Kelly В. и Smith К., 1997]. Известно, что уровень ИЛ-б коррелирует с выраженностью симптомов сердечной недостаточности. Кроме этого, ИЛ-6 играет непосредственную роль в переходе активированных В-лимфоцитов в Ig-продуцирующие клетки. Таким образом, B-лимфоциты (CD20+) являются основными клетками-мишенями для ИЛ-6. Роль ИЛ-6 в воспалении не ясна: ряд исследователей считают его провоспалктельным [Luger T. et al, 1989], другие -противовоспалительным цитокином [Schindler R. et al., 1990]. В связи с этим

представлялось необходимым изучить особенности продукции этого цитокина в группе ЛПА и сопоставить с числом клеток-мишеней. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Продукция ИЛ-6 in vitro и in vivo и количество В-лимфоцитов в сравниваемых

группах (М±т)

Группы ИЛ-6 ед/мл CD20+-■ лимфоциты мм3

Продукция МНПК в сыворотке крови

спонтанная индуцированная

I (ЛПА) п=33 906±135* 1410±99 4.0±0.6*,** 322±29V*

II (ГС) п=18 1018±331*** 11 ';8±б5б 9 7±1 2** *** 426±29

Ш (Доноры) п=15 140+35 1 1022±120 1.0±0.5 418±58

р<0.05 *(1-Ш группа),**( I-II группа), ***(И-Ш группа),

Как видно из таблицы 2, спонтанная продукция ИЛ-б была резко повышена в группе ЛПА. Индуцированная продукция цитокина в ответ на антиген у ликвидаторов в абсолютных числах не отличалась от таковой в группе доноров, хотя ответ клеток на индуктор был резко снижен. Коэффициент соотношения индуцированной продукции к спонтанной в группе доноров составил 7.3, в группе ЛПА - 1.6, в ГС - 1.1. Наличие ИЛ-6 в сыворотке крови пациентов с сердечно-сосудистой патологией (что крайне редко встречается в норме) говорит о непосредственном влиянии циркулирующего цитокина на клетки-мишени. Максимальный уровень ИЛ-б в циркуляции был выявлен в ГС (по сравнению с I и III группами, р<0.05). Пересчет уровня ИЛ-б, циркулирующего в периферической крови, на число клеток-мишеней в мм3 подтвердил выявленные закономерности. Достоверное снижение С020+-лимфоцитов (клеток-мишеней для ИЛ-6) в группе ЛПА по сравнению с донорами, с нашей точки зрения, свидетельствует о длительном процессе гиперпродукции ИЛ-б у ликвидаторов, приведшему, вследствие длительной активации С020+-клеток к снижению числа B-лимфоцитов и смещению баланса В-лимфоциты - плазматические клетки в периферической крови.

Особенности продукции ИЛ-2 и ИЛ-4 в сравниваемых группах Была изучена продукция ИЛ-2 МНПК в сравниваемых группах в связи с тем, что в работах, посвященных изучению параметров клеточного иммунитета в первые годы после аварии на ЧАЭС, исследователи отмечали у ликвидаторов снижение числа Т-лимфоцитов (в основном за счет С08+-лимфоцитов) [Ярилин А., 1996], а при изучении Т-клеточного ростового фактора - ИЛ-2 отмечали снижение его продукции. Выявлено достоверное снижение индуцироваиной продукции ИЛ-2 в группе ЛПА через 12 лет после аварии и в ГС по сравнению с контрольной группой. Так как основными

клетками-продуцентами ИЛ-2 являются Т-лимфоциты, представлялось необходимым сопоставить индуцированную продукцию ИЛ-21 с числом Т-лимфоцитов. Данные изучения представлены в таблице 3.

^ Таблица 3.

Индуцированная продукция ИЛ-2 МНПК н число клеток-продуцентов в

сравниваемых группах (М±т)

Группы Индуцированная продукция ИЛ-2 (ед/мл) Т-лимфоциты (мм3)

I (ЛПА) п=33 10.3±1.5* 1046

И (ГС)п=18 9.411.3** 1282 •

III (Доноры) п=15 1б.7±1.8 1120

р<0.01 *( I- III группа), **( И- III группа)

Изучение продукции ИЛ-2 в супернатантах клеток периферической крови в пересчете на клетку-продуцент вьмвило снижение функциональной способности Т-лимфоцитов в группах ЛПА и ГС продуцировать Т-клеточный ростовой фактор ИЛ-2. Ввиду того, что различие между общим числом Т-лимфоцитов во всех сравниваемых группах было незначительным, объяснением полученных результатов является, по нашему мнению, не наличие Т-клеточного дефицита, а переключение с Txl- на Тх2-ответ, наблюдаемое у пациентов с заболеваниями ССС. В этой связи была изучена продукция ИЛ-4 in vitro и in vivo в сравниваемых группах. Так как клетками-мишенями для ИЛ-4 являются В-яимфоциты (CD2Ó+), представлялось необходимым сопоставить показатели продукции ИЛ-4 и число В-лимфоцитов в сравниваемых группах. Результаты изучения представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Показатели продукции ИЛ-4 in vitro и in vivo и число В-лимфоцитов в сравниваемых группах (М±т)

ИЛ-4 (пг/мл)

Продукция МНПК в сыворотке CD20+

Группы спонтанная индуцированная крови мм3

I (ЛПА) п=33 63±13 63±10** 54±31* 322±29

II (ГС) п=18 59+7 101±9 40±20 426±29

1П (Доноры) п=15 - - 25±15 418±58

р<0.05 *(I-III группа), **(I-II группа)

Как видно из таблицы 4, изучение ИЛ-4 не выявило различий в спонтанной продукции цитокина между группой ЛПА и ГС. Изучение индуцированной продукции ИЛ-4 в ответ на антиген выявило ее достоверное изменение у ликвидаторов по сравнению с ГС. В группе ЛПА отсутствовало увеличение продукции ИЛ-4 в ответ на антиген, в то время как в группе сравнения увеличение продукции ИЛ-4 после

антигенного воздействия было достоверным. Исследование продукции цитокина in vivo выявило максимальный уровень циркулирующего ИЛ-4 в группе ЛПА по сравнению со II и III группами. Учитывая, что клетками-мишенями для ИЛ-4 являются В-лимфоциты, которые с помощью ИЛ-4 начинают дифференцироваться в плазматические клетки, представлялось необходимым определить как отличается в сравниваемых группах количество циркулирующего ИЛ-4 в пересчете на одну клетку-мишень (В-лимфоцит).

Было подсчитано, что на каждый В-лимфоцит в группе доноров оказывает активное влияние 0.5x10"4 пг ИЛ-4; во II группе - 0.9х10"4пги в группе ЛПА 1.6x10'4 пг цитокина. Полученные данные подтверждают переключение с Txl- на Тх2-ответ как в группе ЛПА, так и в ГС. Учитывая роль ИЛ-4 в формировании патологии ССС (стимуляция продукции 12-липооксигеназы - фермента, способствующего миграции и пролиферации васкулярных миоцитов, учАстие в формировании атеросклеротических бляшёк путем индукции экспрессии молекул адгезии VCAM), можно предположить, что более высокий уровень циркулирующего ИЛ-4 в группе ЛПА отражает скорость формирования процесса. Практическое отсутствие в группе ЛПА продукции ИЛ-4 в ответ на антиген отражает принцип обратной связи вследствие достаточно высокого уровня циркулирующего ИЛ-4 в сыворотке крови ликвидаторов.

ВЫВОДЫ

1. Нарушение в продукции цитокинов у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, как и у пациентов с аналогичной патологией без экстремальных воздействий комплекса факторов радиационной аварии, доказывает участие иммунных механизмов в патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы

2. Особенностью иммунных механизмов формирования заболеваний сердечнососудистой системы участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС является гиперпродукция ФНО-а in vitro, повышение ИЛ-4 и ФНО-а в периферической крови при отсутствии повышения ИЛ-8.

3. Для ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, как и для пациентов с аналогичной патологией без экстремальных воздействий комплекса факторов радиационной аварии, характерно переключение с Txl-ответа на Тх2-ответ, сопровождающееся снижением продукции ИЛ-2 и повышением ИЛ-4.

4. Переключение на Тх2-ответ сопровождается, высокой продукцией ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8 как в группе ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, так и у пациентов с аналогичной патологией без экстремальных воздействий комплекса факторов радиационной . аварии.

Практические рекомендации

В связи с выявленными нарушениями в продукции цитокинов как у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС с заболеваниями сердечнососудистой системы, так и у пациентов с аналогичной патологией без экстремальных воздействий комплекса факторов радиационной аварии, рекомендуется:

1. При диспансерном наблюдении • ликвидаторов последствий аварии. на ' Чернобыльской АЭС включать в лабораторный мониторинг определение ФНО-а.

2. При проведении патогенетической терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы с целью оценки ее эффективности учитывать динамику изменения уровней ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а.

3. Появление в циркулирующей крови уровня ФНО-а, превышающего 200 пг/мл, учитывать в качестве неблагоприятного критерия возникновения инфаркта миокарда.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Особенности клеточного и цитокинового звеньев иммунитета у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС// Медико-психологические последствия аварии на ЧАЭС и пути их преодоления: Материалы Всероссийской конференции,.С.-Петербург, 1996. -С.38 (в соавторстве с А.М. Никифоровым, Н.М. Калининой и др.).

2. Особенности клеточного и цитокинового звеньев иммунитета у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС// Радиоактивные отходы. Хранение, транспортировка, переработка. Влияние на человека и окружающую среду: Материалы Международной конференции, С.-Петербург, 1996. - С.27 (в соавторстве с А.М. Никифоровым, Н.М. Калининой и др.).

3. Особенности синтеза и продукции цитс шнов мононуклеарами периферической крови под воздействием ионизирующего излучения// Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Материалы ХШ Российской научной конференции, Челябинск, 1997. -С.153-154 (в соавторстве с Н.М. Калининой и др.).

4. Особенности клеточного и цитокинового звеньев иммунитета у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС// Медико-психологические последствия аварии на ЧАЭС и пути их преодоления: Материалы Всероссийской конференции, С.-Петербург, 1996. - С.43 (в соавторстве с А.М. Никифоровым, Н.М. Калининой и др.).

5. Взаимосвязь продукции цитокинов и состояния плотности костной ткани у ликвидаторов последствий аварии (ЛПА) на ЧАЭС// СПИД, рак и родственные проблемы: Материалы Международной конференции, С.-Петербург, 1998. - С.52 (в соавторстве с Н.М. Калининой и др.).

6. Cytokines production Chernobyl cleanup workers exposed low doses ionizing radiation// Eur. Cytokine Netw. - 1998. - Vol.9. - N.3. - P.436 (в соавторстве с Н.М. Калининой ).