автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.08, диссертация на тему:Системный анализ культивирования Bacillus Thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции с целью интенсификации процесса ферментации

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ

БАКТЕРИЙ И АНАЛИЗ МАТЕМАТИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ

XIIФизиологические особенности энтомопатогенных бактерий и их фагов.

1.1.1. Физиологические особенности энтомопатоген

НЫХ бактерий Вас. thuringiensis

1.1.2. Спорообразование и кристаллообразование.

1.1.3. Фаги Вас. thuringiensis 26 1.2. Анализ работ в области математического моделирования процесса культивирования микроорганизмов.

Выводы .••••••

Глава 2. ФОРМАЛИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ ФАГОВОЙ ИНФЕКЦИИ КАК СЛОЖНОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ (МБС)

2.1. Качественный анализ процесса культивирования микроорганизмов в условиях действия фаговой инфекции •.•••.•••.••••.••••••.••••••••.

2.2. Принципы переработки качественной информации о поведении слогшой МБС с помощью аппарата нечетких множеств

2.3. Особенности задания функций принадлешости при переработке качественной информации о поведении

МБС с помощью аппарата нечетких множеств

Выводы .«•••.•.•••••••••••.

Глава.3. ЭКСПЕРШИТМБНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и методы

3.2; Исследование динамики роста и спорообразования бактерий Вас.thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции методом.математического планирования эксперимента .•••••.••••.•••••

3^3. Предварительный анализ зависимости выхода спор бактерий Вас. thuringiensis от возраста культуры на основе методологии нечетких множеств • •••

3.3.1. Определение функций принадлежности, характеризующих различную активность фага

3.4. Исследование динамики роста споро образующих бактерий Вас.thuringiensis В УСЛОВИЯХ действия фаговой инфекции .».

3.4.Г. Инфекция фагом Tg

3.4.2. Инфекция фагом Tg

Выводы .'.•••.••••••••••••••••••

Глава 4. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЬК БАКТЕРИЙ И ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ВВДЕНИЯ ПРОЦЕССА В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ фаговой инфекции.

4.1. Математическое описание динамики роста спорообра-зуюших бактерий Вас.thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции •.•.•.•.•.•.••.••••«• 99 4."2. Разработка численной схемы решения уравнений математической модели динамики роста спорообразую-ших бактерий Вас.thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции, алгоритмического и программного обеспечения решения задачи на ЭВМ .7.V

4.37 Идентификация параметров математической модели динамики роста спорообразуюишх бактерий Бас. thuringiensis в.условиях действия фаговой инфекции м•••••. • •••.•••.•

4,4; Обсуждение результатов моделирования и выдача рекомендаций по оптимальному ведению процесса культивирования бактерий Бас.thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции •••••••••

Выводы

ВЫВОДЫ .е.

Актуальность проблемы. Основными направлениями экономического и социального развития СССР на I98I-I985 годы и на период до 1990 года предусмотрено обеспечить дальнейший экономический прогресс общества, глубокие качественные сдвиги в материально-технической базе на основе ускорения научно-технического прогресса, интенсификации общественного производства, повышения его эффективности. Особое внимание в последнее время уделяется новой отрасли индустрии - микробиологической промышленности, производящей продукты, которые получают широкое расцространение и ускоряют технический прогресс в пищевой, легкой, химико-фармацевтической промыш-ленностях, сельском хозяйстве, медицине. Одним из наиболее развивающимся направлением микробиологической промышленности является производство бактериальных средств защиты растений.

Решениями ХХУ1 съезда КПСС предусмотрено ускоренное производство микробиологических средств защиты растений. В настоящее время производят и применяют около 30 микробиологических препаратов, патогенных для определенных видов вредных насекомых. Увеличение производства бактериальных средств защиты растений в дальнейшем намечено получать преимущественно за счет повышения эффективности действующих предприятий, внедрения достижений научно-технического прогресса в промышленное производство. В связи с этим актуальной является проблема совершенствования микробиологических процессов на основе исследования их оптимальных режимов, интенсификации работы промышленных аппаратов, внедрения современных методов оптимального управления. Такие задачи могут быть реализованы только на основе глубокого анализа биохимической сущности процессов, создания математических моделей, являющихся на современном этапе основой исследования сложных микробиологических систем, автоматизированного проектирования и управления процессами с применением ЭВМ /I/.

Наибольшее практическое значение из применяемых в настоящее время микробиологических средств зашиты растений имеют бактериальные инсектицидные препараты, получаемые на основе культур Вас, thuringiensis.

Бактериальные инсектицидные препараты состоят из спор культуры Вас. thuringiensis и белковых кристаллов (параспоральных включений), остатков питательной среды и нейтрального наполнителя (каолина).

Общепринято, что белковый кристалл - эндотоксин - оказывает паралитическое действие на организм насекомых, споры же способны црорастать в организм насекомых, приводить к массовому размножению бактерий и вызывать септицемию.

В настоящее время выявлено более 60 видов насекомых-вредителей садовых, огородных и парковых культур, в борьбе с которыми инсектицидные препараты эффективны /2/,

Ванным преимуществом бактериальных препаратов перед ядохимикатами является то, что они не оказывают отрицательного действия на растения, безвредны для человека, теплокровных животных, птиц и полезных насекомых.

Учитывая большую потребность в инсектицидных препаратах, в нашей стране построены и функционируют несколько биохимических заводов по выпуску указанных препаратов.

Производство инсектицидных препаратов включает следующие стадии технологического процесса: приготовление посевного материала, выращивание культуры Вас, thuringiensis в ферментере, концентрирование культуральной жидкости, стандартизация, фасовка и упаковка готового продукта. Схема производства инсектицидных препаратов показана на рис. I.

Процессы сепарации и сушки широко используются в других отраслях промышленности, например, пищевой, химической и т.д. и вопросы их технологии и управления достаточно хорошо разработаны, В то ке время процесс культивирования Вас. thuringiensis , на основе которого вырабатываются инсектицидные препараты, является специфичным, сложным и до настоящего времени мало изученным. Необходимо отметить, что именно в процессе ферментации формируются споры и белковые кристаллы, а последующие технологические стадии предназначены лишь для выделения образовавшейся биомассы.

В промышленности реализуется периодический процесс ферментации. Наиболее распространенными компонентами питательных сред являются: кукурузный экстракт, кормовые дрожки, как источник азотистых веществ, и техническая глюкоза, кукурузная мука, как источник углеводов.

Питательную среду готовят доведением рН,концентрации аминно-го азота и углеводов до регламентного уровня. Осуществляется автоматическая стабилизация температуры и давления в аппарате, расхода воздуха на аэрацию. В процессе выращивания из ферментера периодически отбирают пробы для микробиологического и биохимического анализов.

Отбор проб производят закрытым способом в стерильные бутыли, которые присоединяют к пробоотборникам с соблюдением правил асептики.

К 12-15 часам роста в поле зрения микроскопа должно быть 100-200 вегетативных клеток культуры Вас. thuringiensis • При нормальном развитии культуры к 26-30 часам заканчивается процесс спорообразования и кристаллообразования. Выращивание культуры в ферментере происходит за 35-40 часов.

Однако, производство энтомоцидных препаратов затруднено изза частых заражений фагом при промышленном культивировании штаммов-продуцентов. В этом случае культура не доходит до стадии кристаллообразования и соответственно операция считается неэффективной, Явление фаголизиса резко снижает экономическую рентальность производства микробных инсектицидов. В условиях производства из-за фаголизиса около 25% ферментаций заканчивается полным лизисом культуры. Даже эта средняя величина брака, полученная на основании анализа 6000 ферментаций, показывает актуальность проблемы фаголизиса при промышленном цроизводстве инсектицидных препаратов.

Фаголизис при промышленном культивировании может быть вызван рядом факторов, В данной работе рассматривается случай экзогенного внесения фага.

Широкое использование штаммов спорообразуюших кристаллонос-ных микроорганизмов Вас, thuringiensis при производстве средств зашиты растений при промышленном культивировании этих штаммов, осложненное фаголизисом, а также несовершенство систем управления ведения процесса, определили выбор объекта исследования.

Процесс культивирования штаммов Вас, thuringiensis с учетом фаголизиса отличается сложностью и многостадийностью, большим разнообразием параметров, определяющих протекание процесса на каждом этапе биохимических преобразований веществ,

В общем случае система биохимических процессов в аппарате-ферментере представляет сложную микробиологическую систему (МБС), обладающую всеми признаками сложных физико-химических систем (уХС), Исследование такой системы требует соответствующего математического аппарата. Основой современного подхода к исследованию таких систем является системный анализ, в соответствии с которым задачи исследования и совершенствования био-технологических преобразований решаются в тесной взаимосвязи друг с другом, объединены общей стратегией и подчинены единой цели - созданию высокоэффективного микробиологического производства•

Диссертационная работа посвяшена исследованию оптимальной организации и интенсификации процесса культивирования энтомопатоген-ных бактерий Вас, thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции, В связи с тем, что широкие возможности для решения указанных проблем открывают методы математического моделирования /3/, поставленные в работе задачи решаются с использованием обшей стратегии системного подхода, путем построения математической модели, описывающей динамику культивирования бактерий Вас, thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции /4/,

Цель работы, В соответствии с изложенным' выше в настоящей работе поставлены следующие задачи:

- исследовать процесс культивирования бактерий Вас. thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции с целью выявления особенностей этого процесса и определения интенсивности влияния основных факторов на процесс методом математического планирования эксперимента ;

- исследовать поведение процесса культивирования бактерий Вас. thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции математическим аппаратом нечетких множеств с целью построения алгоритма поведения биологической системы как с учетом влияния фаговой инфекции, так и без нее;

- исследовать динамику роста спорообразующих бактерий Вас.thuringiensis при различных воздействиях фаговой инфекции;

- создать математическую модель процесса культивирования бактерий Вас. thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции, учитывающую основные физиологические закономерности процесса, в том числе возрастные особенности клетки, гибель от продуктов метаболизма, исчерпывания компонентов питания, взаимодействие бактериофага с клеткой;

- разработать численную схему решения уравнений математической модели динамики роста споро образующих бактерий Вас, thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции;

- провести идентификацию параметров математической модели динамики спорообразуюших бактерий Вас, thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции;

- исследовать с помощью математической модели процесс культивирования энтомопатогенных бактерий Вас, thuringiensis при различных воздействиях фаговой инфекции;

- выдать научно-практические рекомендации по оптимальному ведению процесса с учетом фаговой инфекции.

Научная новизна работы. Впервые осуществлен системный подход к анализу процесса культивирования микроорганизмов с учетом фаговой инфекции.

Разработан метод переработки качественной информации о поведении микробиологической системы с помощью аппарата нечетких множеств, позволяющий формализовать лингвинистическую информацию о системе и получить предварительные данные об ее особенностях.

На основе.факторного анализа определены характер и интенсивность влияния основных факторов, влияющих на процесс роста и спорообразования бактерий в условиях действия различных типов фагов.

Проведен комплекс экспериментальных работ по исследованию динамики роста бактерий Вас. thuringiensis при различных воздействиях фаговой инфекции.

Предложена математическая модель процесса культивирования Вас. thuringiensis 0 Учетом возрастного распределения клеток, исчерпывания компонентов питания, метаболизма бактерий и фаголизиса •

Разработан алгоритм численного решения уравнений математической модели на ЭВМ,

Проведена идентификация параметров математической модели процесса культивирования бактерий Вас. thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции.

На основе проведенных исследований и анализа результатов моделирования предложены научно-практические рекомендации по оптимальному ведению процесса культивирования бактерий Вас. thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции.

Практическая ценность работы. С помощью созданной модели исследован процесс культивирования бактерий Вас.thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции. В результате .йодтверждено ,что фагочувствительность бактерий является функцией времени. Разработанная математическая модель, описывающая процесс, позволяет определить критическое время для эффективной инфекции фагами и множественность фаговой инфекции, при которой культура "полностью "лизиру-ется.

Разработанная математическая модель процесса культивирования бактерий Вас.thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции дает возможность решить проблему определения оптимальных условий ведения процесса.

Модель может быть использована для управления процессом ферментации при культивировании микроорганизмов в условиях действия заражения фагом.

Разработанный алгоритм решения уравнений математической модели процесса культивирования бактерий Вас.thuringiensis в условиях действия фаговой инфекции может быть использован при моделировании процессов культивирования микроорганизмов с учетом фаголизиса.

Для фага Tg8l получена фагоустойчивая культура.

Внедрение алгоритмов и программ разработанной математической модели культивирования микроорганизмов в условиях действия фаговой инфекции позволит получить экономический эффект 120 тыс.руб. в год.

Диссертационная работа состоит из введения,четырех глав, выводов и приложения.

ВЫВОДЫ

1. Предложена стратегия системного анализа процесса культивирования микроорганизмов с учетом фаголизиса, как сложной микробиологической системы, включающей 6 уровней иерархии явлений от внутриклеточного уровня до уровня аппарата в целом.

2. Разработан метод переработки качественной информации о поведении МБС с помощью аппарата нечетких множеств, позволяющий формализовать лингвинистическую информацию о системе и получить предварительные данные о ее особенностях1.'

Поставлена я решена задача определения характера интенсивности влияния основных факторов, влияющих на процесс спорообразования бактерий в условиях действия различных типов фагов методом математического планирования эксперимента.1

4. Разработана математическая модель роста популяции, учитывающая возрастное распределение клеток, исчерпывание компонентов питания, метаболизм бактерий и фаголизис:.'

5. Разработана численная схема решения уравнений математической модели процесса культивирования спорообразуюших бактерий в условиях действия фаговой инфекции.'

6. Предложен алгоритм последовательного решения уравнений математической модели на ЭВМ.

7. С целью идентификации параметров математической модели, выполнен комплекс экспериментальных работ по исследованию динамики роста спорообразуюших бактерий Вас.thuringiensis при различных воздействиях фаговой инфекции,1

8. В результате проведенного моделирования .подтверждено,что культура Вас. thuringiensis к разным фагам имеет различную чувствительность.

9. Установлено, что первичными воротами фаговой инфекции явля

- 122 ются ранние этапы технологической цепочки.

10. Определено наиболее критическое время для эрективной инфекции двумя типами фагов.

11. Определены множественности фаговой инфекции бактерий Вас. thuringiensis, при которых наблюдается рост и лизис культуры.

12. Впервые для фага Tg 81 получена фагоустойчивая культура.

13. На основании проведенного системного анализа процесса культивирования бактерий Вас. thuz-ingiensis в условиях действия фаговой инфекции выданы научно-практические рекомендации по оптимальному ведению процесса.

14. Ожидаемый годовой экономический эффект от внедрения алгоритмов и программ разработанной математической модели-120 тыс. руб. в год.

1. Edlund Т., Siden I., Boman Н. Evidence for two immune inhibitors from Bacillus thuringiensis interfering with the humoral defenPe system of Saturniid pupae,-Infect.Immunol,,1976,v.14, p.934.

2. Vankova J. The heatstable exotoxin of Bacillus thuringiensis. -Folia Microbiol.,1978,v.23,p.162.

3. Звенигородский В.И., Смирнова Е.И. Выделение и свойства вирулентных И умеренных фагов Bacillus thuringiensis,

4. Научн.докл.высш.школы. Биол.науки, 1976, Ml. с.17

5. JO.(/Стефанов С.Б. ,Раутенштейн Я.И., Хачатрян JI.C. Строение некоторых бактериофагов культур группы Вас. cereus-thuringiensis,-- Микробиология, 1968, т.35, с. 1064

6. Singer S., Rogoff М. Inhibition of growth of Bacillus thuringiensis by amino acids in defined media.-J.Inverfcebr.Pathol., 1968,v.12,p.98.

7. Nickerson K., Grant S., Bulla L.Physiology of sporeforming bacteria with insects. Ill Radiorespirometric survey of carbohydrate metabolism in the 12 serotypes of Bacillus thuringiensis.-Appl.Microbiol.,1974,v. 28,p.129.

8. Nickerson K.,Bulla L. Physiology of sporeforming bacteria associated with insects; minimal nutritional requirements for growth, sporulation and parasporal crystal formation of Bacillus thuringiensis. -Appl. Microbiol.,1974,v.28,p.124.

9. Mandelstam I«Regulation of bacterial sporeformation.-Symp.Soc. Gen. Microbiology,1969,v.19, p.377»

10. Bulla L,, Kramer P., Bechtel D., Davidson L. Entomocidal pro-teinaceous crystal of Bacillus thuringiensis.-Microbiology, 1976,p.534.

11. Kingan S#, Ensing J. Chemical composition of the cell wall of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis.-J.Bacterid.,1968, v.95,p.724.

12. Bulla L., Kramer K., Davidson L. Characterization of the entomocidal parasporal crystal of Bacillus thuringiensis.-J.Bac-teriol,,1977,v.130,p.373.

13. Somerville H.,James C. Association of the crystalline inclusion of Bacillus thuringiensis with exosporium.-J. Bacterid., 1970,v.102,p.580.

14. Young I., Pits-James P. Chemical and morphological studies of bacterial spore formation. II Spore and parasporal protein formation in Bacillus cereus var.alesti.-J.Biochem.Cytol.,1939,v.6,p.483.

15. Di Gioccio R., Strauss N. Patterns of transcription in Bacillus subtilis during sporulation.-J.Mol.Biol.,1973,v.77,p.325.

16. Sumida-Yasumoto C., Doi R. Transcription from the complementary deoxyribonucleic acid strand of Bacillus subtilis during various stages of sporulation.-J.Bacterid.,1974,v.117,p.775.

17. Klier A., Lecadet M»M.,Rapoport G. Transcription in vitro of sporulation-specific mRNA^s by RNA polymerase from Bacillus thuringiensis.-Spores VII,1978,p.205.

18. Klier A., Lecadet M.-M., Rapoport G. Transcription in vitro of sporulation-specific mRNA's by RNA polymerase from Bacillus thuringiensis.-Microbiology-76,1976,p.205.

19. Glatron M., Rapaport G. Biosynthesis of the parasporal inclusion of Вас. thuringiensis: half-life of its corresponding mRNA.-Biochemie,1972,v.54,n Ю, p.1291.

20. Ribier J., Lecadet M.-M. Etude ultrastructurale et cinetiquede la sporulation de Bacillus thuringiensis var. Berliner 1715» Remarquer sur la formation de I'inclusion parasporale.-Ann. Microbiol., 1973,v.124A,, p.311.

21. Bechtel D., Bulla L. Electron microscope study of sporulation and parasporal crystal formation in Bacillus thuringiensis. -J. Bacteriol., 1976,v.127,p.1427.

22. Lecadet M.^M., Dedonder R. Biogenesis of the crystalline inclusion of Bacillus thuringiensis during sporulation.-Eur.J. Biochem.,1971,v. 23,p.282.

23. Somerville H. Insect toxin in spores and protein crystals of Bacillus thuringiensis.-Trends Biochem. Sci.,1978,v.3,p.108.

24. Somervill H., James С,, Rutfell R.,Norris J. The parasporal inclusion of Bacillus finitimus.-Spore Research.,1971,p.193.

25. Nishiitsuju-Uwo J., Wakisaka Y., Ede M. Sporeless mutantsof Bacillus thuringiensis.-J.Invert.Pathol.,1975,v.25,p.355.

26. Звенигородский В.И., Смирнова Е.И. Выделение и свойства вирулентных и умеренных фагов Вас.thuringiensis.- Научн.докл.высш.школы. Биол.науки, 1976, $11, с.17.

27. Адаме М. Бактериофаги. М.: Изд-во ИД, 1961, - 527 с.

28. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968. - 89 с.

29. Беспалова.И.А., Москаленко JI.H., Раутенштейн Я.М.Тихоненко

30. А.С. Электронно-микроскопическое изучение внутриклеточного развития фага, специфического для Bacillus thuringiensis var.gall.- Микробиология, 1976, т. 45, с. 884.

31. Colasito D., Rogoff M. Characterization of lytic bacteriophages of Bacillus thuringiensis.- J.Gen.Virol.,1969,v.5, p.275.

32. Colasito D., Rogoff M. Characterization of temperate bacteriophages of Bacillus thuringiensis.-J.Gen.Virol.,1969,v.5, P.275.

33. Звенигородский В.И., Смирнова Е.И. Выделение и свойства вирулентных и умеренных фагов Bacillus thuringiensis.

34. Научн.докл.выс.школы. Биол.науки, 1976, № II, с.17.

35. Азизян А.Г., Капитонова О.Н., Майсурян А.Н. Физиологические особенности развития фага g8 Bacillus thuringiensis var.gal— leriae и его мутанта по морфологии негативных колоний.-Генетика, 1976, т.12, № II, с.121

36. Раутенштейн Я.И. Лизогения и ее биологическое значение. Успехи микробиологии, 1971, в. 7, с. 223

37. Блохина Т.П., Сахарова З.В., Раутенштейн Я.И. Особенности роста лизогенной культуры Bacillus thuringiensis var.galleriae.-- В кн.: Тезисы Ж Всесоюзн.микробиол.общества, Рига, 1980, т.1, с.19.

38. Кочкина З.М., Блохина Т.П., Раутенштейн Л.И. 0 полилизогении культур Bacillus thuringiensis var.galleriae. -Микробиология, 1977, т.46, с. 730.

39. Раутенштейн Я.И., Москаленко Л.Н., Беспалова И.А., Тихоненко А.С. Ультраструктура бактериофага, специфичного для Bacillus thuringiensis var.galleriae. . Микробиология, 1976, т.45, с. 690.

40. Volterra V, Lecons sur la theorie mathematique de la lutte pour la vie, Paris, Gauthier-Villars,1931.-214 p.

41. Hinshelwood C.N. The chemical kinetics of the Bacterial Cell, Oxford, Clarendon Press, 1946.-284 p.

42. Dean A,C.R. Hinshelwood C.N. Growth. Function and Regulation in Bacterial Cells, Oxford, Clarendon Press,1966.-493p.

43. Dean A.C.R. Influence of Environment on the Control of Enzyme Syntesis.-J.of Applied chemistry and biotechnology,1972, v.22, N 2,p.245.

44. Кафаров В .В., Перов В.1., Мешалкин В.П. Принципы математического моделирования химико-технологических систем.- М.: Химия,1974. 343 с.

45. Mukhopadhyay S.N. Ghose Т.К. Oxygen Participation in Fermentation. -Process Biochemistry, 1976,v.5,p.19-27.

46. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий. М.: Мир, 1965.' - 467 с.

47. IV Арзуманов ЕеН. Интенсификация процесса биосинтеза белковых кристаллов в производстве энтобактерша. Автореф.дис. . канд.техн.наук. Л.!, 1979. - 23 с.

48. Яненко H.Hv, Ровденственский Б,Л.: Системы квазилинейных уравнений и их приложения к газовой динамике".' М.: Наука1, 1968.- 592 с.

49. Нигматулин Р.И. Основы механики гетерогенных сред, М.: Наука, 1978; - 336 с.

50. Азизбекян P.P.-, Нетыкса EiMv Особенности развития фагов в спорообразующих и аспорогенных шташах Бас. thuringiensis- Генетика-, 1978, т.- 14, № 4, с. 666.

51. Звенигородский ВЖ1, Смирнова Е.И. Выделение и свойства умеренных фагов Вас:, thuringiensis . Научн.докл.высш.школы, Биол.наука, 1976, № II, с. 17.

52. Звенигородский В.ИС-, Серегина Т.А., Сшрнова Е.И. Особенности взаимодействия некоторых умеренных фагов с культурой Вас.: thuringiensis • Научн.докл.высш.школы. Биол.наука, 1977, $ 5, с ; 19.