автореферат диссертации по технологии, машинам и оборудованию лесозаготовок, лесного хозяйства, деревопереработки и химической переработки биомассы дерева, 05.21.03, диссертация на тему:Сезонные изменения состава и свойств белков и фосфолипидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской

Алаудинова Елена Владимировна

На правах рукописи

РГ6 оя

- 3 ЯНП 7%0

СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА И СВОЙСТВ БЕЛКОВ И ФОСФОЛИПИДОВ МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ ПОЧЕК ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ

05.21.03 - Технология и оборудование химической переработки биомассы дерева, химия древесины

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Красноярск - 2000

1 ' ' . Работа выполнена в Сибирском государственном технологическом университете на кафедре химической технологии древесины, г. Красноярска

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Репях С.М.,

кандидат биологических наук, доцент Миронов П.В.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Тарабанько В.Е.

кандидат технических наук доцент Зингель Т.Г.

Ведущая организация: Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Защита диссертации состоится « 20 » декабря 2000 г. в 10 часов на заседании дис сертационного совета Д 063.83.01. Сибирского государственного технологическог университета по адресу: 660049, г. Красноярск, проспект Мира, 82.

Отзывы (в двух экземплярах с заверенными подписями) просим направлять ученом секретарю диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственно! технологического университета.

Автореферат разослан «_» ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

1 с та Л, д

• ^

Исаева Е.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Хвойные представляют собой основной злеет биоценозов на обширных пространствах Сибири. В условиях, малопригодных я других видов растительности, они способны создавать значительную биомассу, (шиш резервы продуктивности хвойных, а также распространение их на север на льшей части сибирского региона не реализуется полностью из-за лимитирующего йствия неблагоприятных факторов, среди которых низкие температуры относятся основным.

Успешному решению задачи повышения морозостойкости древесных расте-н должны способствовать фундаментальные исследования химической природы акотемпературной устойчивости и природы повреждений низкими температурами меристематических тканей. Известно, что в обеспечении низкотемпературной ус-йчивости растений большую роль играет белковый и липидный обмен, поскольку лки и липиды являются структурными компонентами биологических мембран, 1вреждающихся при замораживании в первую очередь. Исследование сезонных менений состава и свойств белков и липидов меристематических тканей хвойных, щерживающих в зимний период низкие отрицательные температуры (до минус 60 '), может дать ценную информацию о структурно-химических перестройках клеток :ристем.

Среди хвойных пород Сибири лиственница сибирская (Ьапх эймпса Ь.) облает наибольшей морозостойкостью, что свидетельствует о существовании у лист-нницы сформированного и наследственно закрепленного механизма, позволяюще-сохранять жизнеспособность меристематических клеток в условиях суровой си-фской зимы. Таюш образом, меристематические ткани почек лиственницы, при .щелении которых удается получить весьма однородные по содержанию живых еток образцы, являются перспективным объектом для изучения роли белков и ли-[дов при формировании криорезистентного состояния растительных клеток. Белки липиды меристематических тканей почек лиственницы сибирской до настоящего емени практически не изучены. Полученные экспериментальные результаты по-олят глубже понять особенности метаболизма лиственницы, а также будут полез-I для дальнейшего изучения физиолого-биохимических механизмов, выработан-IX хвойными в процессе адаптивной эволюции для защиты от холода.

Таким образом, изучение сезонных изменений состава и свойств белков и ли-;дов меристематических тканей почек лиственницы сибирской и связи этих изме-ний с низкотемпературной устойчивостью тканей в осенне-зимний период акту-ьно и носит фундаментальный характер.

Исследования выполнялись в соответствии с планом научно-следовательских работ Сибирского государственного технологического универ-тета, финансируемых из средств федерального бюджета по единому заказу-наряду 1.10.98.Ф. и Федеральной программой «Интеграция» при финансовой поддержке тсноярского краевого фонда науки. Грант ЗБО172.

Цель и задачи работы. Основной целью работы является изучение сезонных изменений состава и свойств белков и липидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской и разработка представлений о роли белков и липидов в формировании низкотемпературной устойчивости меристематических тканей.

Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие конкретные задачи: .

• изучение сезонной динамики содержания основных компонентов меристематических клеток (водорастворимых веществ цитоплазмы, комплекса клеточных мембран, клеточных стенок);

• изучение сезонной динамики содержания белков в меристематических тканях;

• изучение фракционного состава водорастворимых белков цитоплазмы и белков комплекса клеточных мембран и его изменения при адаптации к низким зимним температурам;

• изучение сезонной динамики содержания нейтральных, фосфо- и гликолипи-дов в меристематических тканях;

• изучение жирнокислотного состава липидов комплекса клеточных мембран и его изменения при адаптации к низким зимним температурам;

• изучение фазовых переходов липидов комплекса клеточных мембран;

• изучение криопротекторных свойств водорастворимых белков цитоплазмы и периферических белков комплекса клеточных мембран меристематических тканей.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование состава и свойств белков и липидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской в периоды подготовки к глубокому покою, глубокого покоя, вынужденного покоя, подготовки к вегетации.

Исследована сезонная динамика содержания белков и липидов комплекса клеточных мембран, выделенного из меристематических тканей почек. Впервые обнаружено, что в зимнее время клеточные мембраны на три четверти сформированы белковыми структурами, что, вероятно, повышает упругость и прочность мембран в условиях фазовых переходов вода - лед и обезвоживания клеток при низких зимних температурах.

Определен фракционный состав и молекулярные массы водорастворимых белков цитоплазмы и белков комплекса клеточных мембран. Обнаружены уникальные антифризные свойства высокомолекулярных фракций водорастворимых белков цитоплазмы и периферических белков комплекса клеточных мембран, полностью исчезающих из белкового спектра к моменту отрастания хвои, заключающиеся в их способности обеспечивать глубокое переохлаждение внутриклеточной воды.

Исследованиями температур фазовых переходов фосфолипидов комплекса клеточных мембран, показана их роль в сохранении жидкого фазового состояния мембран в условиях низких зимних температур.

На основании экспериментальных данных разработаны представления о роли белков и липидов в формировании состояния низкотемпературной устойчивости меристематических тканей почек лиственницы сибирской.

Практическая значимость работы. Данные, полученные в результате иссле-ювания белков и липидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской, обладающих высокой устойчивостью к низким температурам, имеют общетеоретическое значение и вносят определенный вклад в изучение физиологических процессов, протекающих в тканях в связи с адаптацией растений к зимним услови-1м. Полученные результаты показывают важную роль этих исследований для выяв-1ения особенностей механизма формирования состояния низкотемпературной устойчивости и могут быть использованы для оценки морозостойкости древесных растений, возможностей их интродукции, разработки способов повышения устойчивости, а также новых методов криоконсервирования растительных тканей для будущей :елекции растений.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и об-:уждались на Всесоюзной конференции «Проблемы комплексного использования древесного сырья» (Рига, 1984), на региональной экологической конференции «Эко-пого-экономические проблемы Красноярского края» (Красноярск, 1999), на региональной конференции с международным участием «Научные основы и методы комплексного использования растительных ресурсов лесных экосистем Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2000), на международной конференции, посвященной 70-летию СибГТУ «Химико-лесной комплекс - научное и кадровое обеспечение в XXI веке. Проблемы и решения» (Красноярск, 2000).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 14 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической и экспериментальной частей, выводов, библиографии, состоящей из 220 наименований и 2 приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц, 20 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение п аналитический обзор. Во введении обосновывается актуальность изучения физиологических процессов, протекающих в меристематических тканях хвойных, в связи с адаптацией дерева к низким зимним температурам.

Указывается, что в обеспечении низкотемпературной устойчивости растений большую роль играет белковый и липидный обмен. Это связано с тем, что белки и яипиды являются структурными компонентами биологических мембран, повреждающихся при замораживании в первую очередь.

В настоящее время исследователями собран обширный экспериментальный материал, отражающий картину белкового и липидного обмена различных древес-Ешх растений.

Особенностью метаболических изменений в тканях древесных растений в зимний период является накопление белков и фосфолипидов. Однако, доказательства появления новых белков в тканях древесных растений в ответ на понижение температуры немногочисленны. К тому же, по мнению одних авторов, высокая морозостойкость древесных растений коррелирует с содержанием водорастворимых белков, другие связывают это свойство с увеличением содержания неэкстрагируемых и •елочерастворимых белков. Это свидетельствует о разнообразии механизмов фор-

мирования низкотемпературной устойчивости, существующих в природе. Исследо ваний механизмов низкотемпературной устойчивости хвойных древесных растений функционирующих в природных условиях, в литературе не обнаружено.

Анализ литературы показал, что фосфолипидам уделяется существенное вни .мание в связи с изучением низкотемпературной устойчивости у растений. Липидь находятся в метаболически активном состоянии в течение всего года. Измененш фракционного и жирнокислоТного состава липидов, безусловно;, отражается на фи зиологическом состоянии клеток и тканей, так как отдельные компоненты общи? липидов сильно отличаются по своим физическим и химическим свойствам. Осо бенно ощутимо эти изменения могут проявляться на состоянии; мембран. Обращаем на себя внимание низкий уровень содержания этих компонентов (особенно полярных липидов) в исследованных объектах. До современным представлениям мембраны, состоящие из белков и полярных липидов, составляют до 1/3 массы сухого вещества клетки. Очевидно, что имеющиеся в литературе сведения о белках и полярных липидах были получены при изучении неоднородных по составу и анатомическому строению образцов (хвоя, почки, кора, корни, стволовая древесина, побеги, камбиальная зона и т.д.). В определенной мере это связано с тем, что живые клеткь и ткани составляют лишь малую часть дерева, выделение этих тканей в чистом виде, в достаточном для исследований количестве не всегда возможно. Поэтому структурно-химические изменения клеток живых тканей древесных растений при формировании низкотемпературной устойчивости до сих пор мало исследованы.

Весьма важным при изучении белкового и липидного обмена в связи с низкотемпературной устойчивостью древесных растений представляется выбор объекта исследования, в котором содержание живых клеток было бы максимальным. Таким объектом^ как известно, являются меристематические ткани. В качестве основного объекта исследования взяты меристематические ткани вегетативных почек лиственницы сибирской. Белки и липиды меристематических тканей почек лиственницы до настоящего времени практически не изучены. Все это позволяет ставить задачу изучения сезонных изменений химического состава и свойств белков и липидов мери-стематических тканей почек и связи этих изменений с низкотемпературной устойчивостью тканей в осенне-зимний период.

Методики проведения экспериментов. В работе обобщены результаты исследований, проводимых с 1998 по 2000 годы. Модельные деревья лиственницы сибирской для отбора проб растительной ткани подбирали в пригородной зоне г Красноярска в районе совхоза «Удачный» в естественных древостоях, с учетол представительности проб. Отбор проводили с августа по май в первой, второй I третьей декаде каждого месяца. Изучение белков и липидов меристематическю тканей почек проводили с использованием известных и принятых в химии древеси ны и биохимии различных химических и физико-химических методов исследования

Отдельные фракции меристематических клеток: суммарные водорастворимы« вещества и комплекс клеточных мембран (ККМ) получали методом дифференци ального центрифугирования и использовали для дальнейшего выделения белков ) анализа их состава и свойств. Содержание белка в меристематических тканях и экс трактах определяли с помощью красителя амидо-черного 10В. При исследованш белков ККМ их разделяли по положению в мембране на интегральные и перифери

ческие. Разделение белков на фракции осуществляли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (Г1ААГ) с додецнлеульфатом натрия. Исследование крио-протекторных свойств белков проводили методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК). Для исследования льдообразующей активности центров гетерогенной кристаллизации была использована эмульсионная методика изучения переохлаждения воды и водных растворов. Жизнеспособность меристематических тканей после замораживания побегов оценивали по отрастанию хвои.

Суммарные липиды экстрагировали из меристематических тканей почек и ККМ по методу Блайя и Дайера смесью растворителей хлороформ - изопропанол (1:2). Для разделения отдельных групп липидов применяли различные физико-химические методы, преимущественно тонкослойную и элюентную хроматографии. Жирнокислотный состав фосфолипидов (ФЛ) определяли после щелочного гидролиза методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Для идентификации ФЛ использовали методы инфракрасной спектроскопии (ИКС) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). При изучении температурной зависимости изменения теплоемкости в образцах ФЛ использовали метод ДСК.

Результаты опытов и их обсуждение. Установление представительности проб при изучении белков и фосфолипидов меристематических тканей почек.

Для изучения сезонной динамики содержания белков и ФЛ в меристематических тканях почек лиственницы требовалось установить представительность проб, обеспечивающую необходимую достоверность результатов.

На основании полученных экспериментальных данных определен размер выборки. Он показал, чтобы с вероятностью, равной 95% определить содержание белков и ФЛ в меристематических тканях почек лиственниц определенного возраста, произрастающих в одинаковых условиях, необходимо исследовать не менее пяти деревьев. Данное условие соблюдалось на всех последующих этапах работы.

Изучение сезонной динамики содержания основных компонентов меристематических клеток.

В рамках поставленной в данной работе задачи необходимо было выяснить, как изменяется содержание общего белка в меристематической ткани почек, содержание и свойства водорастворимых белков цитоплазмы (ВРБЦ), содержание и свойства белков, входящих в состав многочисленных мембранных структур меристематических клеток, с момента формирования почек до распускания хвои в следующем году. Вместе с тем, интересно оценить изменение состояния самих клеток, в частности, изменение массовой доли основных компонентов клеток - клеточных стенок, ККМ, водорастворимых веществ. На рисунке 1 приведена сезонная динамика содержания этих фракций. Содержание водорастворимых веществ возрастало с момента окончания формирования почек (август) и достигало максимальных значений к середине октября (около 50%). Этот момент соответствовал началу роста содержания ККМ, который завершался во второй половине ноября. Доля ККМ оставалась стабильно высокой до февраля (около 32%). Затем доля ККМ в клетке постепенно снижалась. Перед распусканием хвои она становилась ниже зимнего уровня на 30%. Содержание водорастворимых веществ оставалось стабильным до марта. После небольшого увеличения в апреле (55,25%) содержание быстро снижалось и к моменту распускания хвои составляло около 39% от абсолютно сухой массы (а.с.м.) ткани.

й 40

н

0

£ 30

аГ

К

1 20

о.

<и

п

д 10 0

VIII IX X XI ХП I П Ш IV V

Месяы

♦ водорастворимые вещества цитоплазмы ■ комплекс клеточных мембран

* клеточная стенка

Рисунок 1 - Сезонная динамика содержания растворимых и нерастворимых компонентов клеток меристематических тканей почек

Исследование состава й свойств белков.

На рисунке 2 приведена сезонная динамика содержания общего белка тканей, ВРБЦ и белка ККМ. Рост содержания общего белка начинался во второй половине августа. Интенсивное накопление водорастворимых белков отмечалось несколько позже, в сентябре, в октябре его содержание достигало максимальных значений (около 15%). Содержание общего белка продолжало увеличиваться до ноября. Обращает на себя внимание очень высокое содержание общего, белка в меристематических тканях почек в зимнее время - около 43%. В середине февраля наблюдался спад содержания общего белка и ВРБЦ, достигавший минимума в середине марта. В апреле их содержание возрастало до максимальных значений. Весенний максимум общего белка и ВРБЦ наблюдался в течение нескольких дней. Перед распусканием хвои содержание ВРБЦ быстро падало до 4,52%, а общего белка снижалось до 22,17%.

Наибольшее количество белка в меристематических тканях почек локализовано в клеточных мембранах. В период покоя, одновременно с увеличением массовой доли ККМ в ткани, наблюдался рост содержания мембранных белков. Это свидетельствует о том, что наряду с изменением среды, окружающей мембрану, происходят изменения и самих клеточных мембран.

В связи с изложенным представлялось важным изучение особешюстей сезонной динамики содержания интегральных и периферических компонентов белковой части ККМ.

• общий белок мес5П1 ■ водорастворимый белок

* белок ККМ

Рисунок 2 - Сезонная динамика содержания белков меристематических

тканей почек

На рисунке 3 приведены результаты изучения динамики содержания интегральных (ИБ) и периферических (ГШ) белков ККМ меристематических тканей почек относительно абсолютно сухой массы ткани и абсолютно сухой массы ККМ. Рост содержания общего мембранного белка начинался уже в августе и заканчивался к концу ноября. В этот период наибольший прирост имели ИБ, и в меньшей степени в это же время увеличивалось содержание ПБ. Содержание ПБ начинало возрастать с момента окончания формирования почек (август) и достигало наибольшего значения к середине октября (около 8% от абсолютно сухой массы ткани). С этого момента начинался быстрый синтез ИБ. В начале ноября их содержание достигало максимальных значений (около 17% от абсолютно сухой массы ткани). Уменьшение содержания ИБ начиналось еще в зимних условиях - с начала февраля. До середины марта наблюдалось их почти двукратное снижение. Снижение содержания ПБ наблюдалось на две недели позже, темпы снижения почти в 2 раза ниже, чем у ИБ.

Иная картина динамики ПБ наблюдалась при отнесении их содержания не к сухой массе ткани, а к сухой массе ККМ. В этом случае относительное содержание ПБ в общей массе мембран в конце осени снижалось с 31,16% до 23,36%. Кроме того, весенний максимум содержания общего мембранного белка обеспечивался только за счет доли ПБ в белковой части ККМ, так как доля ИБ в этот период продолжала снижаться. Сопоставление данных графиков позволяет сделать вывод о том, что увеличение массовой доли ККМ в клетках в период покоя объясняется не только синтезом ИБ в уже существующих мембранах (синтез ИБ обеспечивает около 60% прироста ККМ), но и синтезом новых мембранных структур. Поскольку содержание ПБ в этот период времени было относительно стабильно (в расчете на абсолютно

X

о.

и «

в

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

—ш— —■

\

ш 1,

1 _4

я

Л' • V к

ё

VIII IX X XI XII I II 1П IV V

Месяц

периферический белок ■ интегральный белок

60

2 50

К 40 и

ев ■

. ё 30 г?

§ 20 I

& 1° «

. в

0

МП IX X XI XII I II Ш IV V

Месяц

• периферический белок ■ интегральный белок

Рисунок 3 - Сезонная динамика содержания интегральных и периферических белков ККМ меристематических тканей почек

сухую массу ткани), то находит объяснение и соответствующее данному периоду снижение доли ПБ в общей массе ККМ.

Обнаруженные особенности сезонной динамики содержания белков в меристематических тканях почек лиственницы ранее в литературе не описаны.

-- а—

У Г

1\

/ V -V

•

Для фракционирования белков и определения молекулярных масс полученных белковых фракций был использован метод электрофореза в ПААГ.

Предполагалось, что накопление белков осенью и снижение их содержания весной связано с перестройками белкового комплекса протопластов растительных клеток. Обнаруженные изменения в составе ВРЕЦ и белков ККМ могли свидетельствовать о существенных перестройках в осенне-зимний период, направленных на формирование у клеток меристематических тканей устойчивого состояния к действию низких зимних температур. Изменение состава белков в весенний период, очевидно, связано с потерей устойчивости и подготовкой к периоду вегетации.

Анализ результатов электрофоретического исследования ВРБЦ и белков ККМ показал, что формирование морозоустойчивого состояния дерева сопровождалось качественными и количественными изменениями состава белков. В зимнее время в белковом спектре обнаружено до 23 фракций с различной молекулярной массой. На фоне увеличения количественного содержания ВРБЦ происходило значительное расширение их электрофоретического спектра (с 8 до 15 фракций). В электрофоре-тическом спектре ИБ появлялась одна, а в электрофоретическом спектре ПБ - три дополнительные фракции. Для ВРБЦ, ПБ и ИБ наблюдалась общая тенденция увеличения доли высокомолекулярных фракций (молекулярная масса выше 100 кД) в осенне-зимний период и снижения весной. При этом у ВРЦБ и ПБ в зимний период обнаружено появление двух одинаковых по молекулярной массе фракций (около 170 кД и 150 кД). Доля этих фракций составляла до 40% в массе ВРБЦ и ПБ. Во второй половине апреля эти фракции полностью исчезали, что по времени совпадало с утратой клетками низкотемпературной устойчивости. В связи с этим можно предположить, что криозащитным действием обладают белки высокомолекулярных фракций. С целью проверки криорезистентных свойств высокомолекулярных фракций ВРБЦ, методом препаративной жидкостной хроматографии (сефадекс G-150) были получены препараты высокомолекулярных (от 170 до 80 кД) и низкомолекулярных (от 30 до 10 кД) фракций белков.

Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) были определены температуры плавления (tIDI) п гомогенного зародышеобразования (tn) в водных растворах белков высоко- и шгзкомолекулярных фракций. На рисунках 4 и 5 приведены концентрационные зависимости температур t,a и tr3. Видно, что высокомолекулярные фракции ВРБЦ значительно сильнее снижают tr3, чем низкомолекулярные фракции ВРБЦ. Последние, в свою очередь, значительно сильнее снижают tn по сравнению с рядом модельных растворов - известных криопротекторов.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что высокомолекулярные фракции ВРБЦ обладают выраженным антинуклеационным действием, способствующим глубокому переохлаждению тканей.

Для более полного понимания особенностей переохлаждения меристематических тканей представлялось важным изучить влияние нерастворимых компонентов клеток и, в частности, их органелл на кристаллизацию воды. Для этого из зимующих меристематических тканей почек и активно растущей хвои были выделены хлоропласта и изучено их влияние на температуру кристаллизации переохлажденной воды. Для оценки влияния ПБ на льдообразующую активность поверхностей хлоро-пластов последние обрабатывали трис-глициновым буфером (рН 8,3). Слабо связан-

С, %

1 - водорастворимый белок меристематических тканей почек; 2 - полиэтиленгликоль (20 ООО); 3 сумма водорастворимых веществ меристематических тканей почек; 4 - глюкоза; 5 - глицерин

Рисунок 4 - Зависимость температур плавления льда в водных растворах

от концентрации

25 С, % 30

и

О

с

-55

1- высокомолекулярные фракции водорастворимого белка меристематических тканей почек; 2 -низкомолекулярные фракции водорастворимого белка меристематических тканей почек; 3 - глицерин; 4 - сумма водорастворимых веществ меристематических тканей почек; 5 - полиэтиленгликоль (20 ООО); 6 - глюкоза

Рисунок 5 - Зависимость температур гомогенного зародышеобразования льда в

водных растворах от концентрации |

>

ные с поверхностью ПБ переходили в раствор и отделялись центрифугированием. Для достижения переохлаждения использовали эмульсии типа «вода в масле».

Эксперимент показал, что хлоропласты зимующих меристематических тканей (фактически не влияли на температуру кристаллизации переохлажденной чистой воды, в которой они были суспендированы. Температура кристаллизации воды, в которой были суспендированы хлоропласты с удаленными ПБ, была на 5° выше, чем для чистой воды. Температура кристаллизации воды, в которой были суспендированы хлоропласты активно растущей хвои, была также несколько выше, чем для чистой воды. Это, вероятно, свидетельствует о том, что сами хлоропласты или участки их поверхности способны служить центром гетерогенного зародышеобразования.

Полученные результаты позволяют предположить, что клеточные органеллы зимующих меристематических тканей почек не оказывают существенного влияния

на замерзание переохлажденной воды и, следовательно, не могут играть роль центров кристаллизации при внутриклеточном льдообразовании.

Среди вероятных причин различий в лъдообразующей активности суспендированных в воде хлоропластов меристематических тканей, активно растущей хвои и хлоропластов меристематических тканей с удаленными ПБ, могут быть различия в свойствах их поверхностей. Известно, что поверхность эффективных льдообразую-щих агентов имеет микронеоднородную структуру, состоящую из гидрофильной матрицы, на которой находится значительное количество гидрофобных участков. Такая мозличность поверхности является одной из особенностей, обуславливающих их льдообразующую активность. В связи с этим можно сделать вывод, что поверхность хлоропластов меристематических тканей почек является более однородной по сравнению с поверхностью хлоропластов активно растущей хвои. Однородность поверхности в отношении гидрофильных свойств обеспечивается адсорбированными на ней ПБ. Полученные данные дают основание считать, что возможность глубокого переохлаждения внутриклеточной воды в меристематических тканях почек обусловлена не только антинуклеационным действием ВРБЦ и, в частности их высокомолекулярных фракций, но и отсутствием лъдообразующей активности поверхности клеточных мембран и органелл, обеспечиваемой ПБ.

Исследование состава и свойств липидов

Формирование состояния низкотемпературной устойчивости меристематических тканей лиственницы сопровождалось увеличением доли белков в ККМ и, соответственно, снижением доли липидов. До настоящего времени химический состав липидов ККМ меристематических тканей почек лиственницы не исследовался. С другой стороны, известно, что именно липидная часть обеспечивает жидкое фазовое состояние биологических мембран, необходимое для их нормального функционирования. В связи,с изложенным, возникла необходимость исследования липидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской.

В таблице 1 приведены результаты исследования группового состава липидов меристематических тканей почек.

Таблица 1 - Групповой состав липидов меристематических тканей почек, % от а.с.м. ткани

Наименование липидов Время отбора проб, месяц

VIII IX X XI XII I II III IV V

Суммарные липиды 13,53 9,56 11,62 12,66 12,30 11,78 11,70 13,20 15,88 12,48

Нейтральные липиды 3,49 2,87 3,73 4,20 3,82 3,58 3,60 3,69 9,57 3,01

Гликолипиды 4,52 1,72 1,34 1,02 1,03 0,93 0,82 2,33 2,55 4,51

Фосфолипиды 5,52 4,97 6,55 7,44 7,45 7,27 7,28 7,18 3,76 4,96

Как свидетельствуют результаты исследований, содержание суммарных ли-пидов в ходе развития почек непостоянно и зависит от фенологического состояния дерева. Четко прослеживающийся весенний максимум (15,88%) приходился на период, предшествующий распусканию хвои. Минимум содержания суммарных липи-дов наблюдался в сентябре (9,56%) и совпадал по времени с таковым для нейтральных липидов (НЛ).

Значительная часть липидов меристематической ткани почек представлена полярными липидами. На их долю в разные периоды года приходилось от 39,74% до 75,88% от суммы липидов ткани. В состав полярных липидов входили глико- и фосфолипиды. Сезонная динамика их содержания имела противоположный характер. Максимум, содержания ФЛ (около 7,5%) совпадал по времени с минимумом содержания гликолипидов (около 1%) и отмечался в декабре. Динамика содержания полярных липидов связана, в первую очередь, с качественной перестройкой мембранных структур клетки.

Анализ данных таблицы 2 показал, что в зимнее время доля НЛ в ККМ была почти в 2 раза выше, чем весной и составляла около 5 % от суммы липидов ККМ.

Содержание гликолипидов (ГЛ) в ККМ изменялось в течение года от 2,37% в ноябре до 21,72% в августе. Характер динамики их содержания противоположен таковому для НЛ и ФЛ. Повышенное содержание ГЛ наблюдалось весной и составляло более 40 % от суммы липидов ККМ. Осенью содержание ГЛ в ККМ резко снижалось и в период покоя оставалось низким - менее 10 % от суммы липидов ККМ.

Компонентом, преобладающим в мембранных липидах на протяжении исследуемого периода развития почек, являлись ФЛ. Содержание ФЛ, рассчитанное к абсолютно сухой массе ткани, показывает, что в зимний период их доля увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с сентябрем. Одновременно содержание ФЛ в расчете на абсолютно сухую массу ККМ снижалось. Это подтверждает сделанное ранее предположение о синтезе мембранных структур в осенне-зимний период, на что также

Таблица 2 - Групповой состав липидов мембранного комплекса

Наименование липидов Время отбора проб, месяц

VIII IX X XI XII I И III IV V

Суммарные липиды 9.56 51,39 6.58 32,54 7.87 32,02 . 8.46 26,04 8.44 25,65 8.09 24,84 8.02 29,05 9.22 36,72 6.04 24,16 9.03 40,48

Нейтральные липиды 0.27 1,44 0,32 1,58 0.45 1,81 0.49 1,51 0.44 1,34 0.43 1,32 Мб 1,67 0.41 1,65 0,19 0,76 0.19 0,85

Гликолипиды 4.0*4 21,72 1.42 7,02 1.10 4,49 0.74 2,37 0.83 2,52 0.79 2,43 0.73 2,64 1.93 7,69 2.25 9,00 4.18 18,74

Фосфолипиды 5.25 28,23 4.84 23,94 6.32 25,72 7.20 22,16 7.17 21,79 6.87 21,09 6,83 24,74 6.88 27,38 3.60 14,40 4.66 20,89

указывает определение массовой доли ККМ в меристематической ткани. Весной (апрель) содержания ФЛ снижалось. Следующий затем рост содержания ФЛ в ККМ перед распусканием хвои связан с увеличением размеров клеток. Даже для сохранения в этот период прежнего количества ФЛ, требуется ускорение их биосинтеза.

Таким образом, установлено, что липидный матрикс ККМ на протяжении исследуемого периода развития почек в значительной мере представлен ФЛ, а в зимнее время их содержание возрастает до 85% от массы липидов ККМ.

Как видно из таблицы 3, групповой состав ФЛ мембранного комплекса меристемы почек представлен фосфатидилхолинами (ФХ), фосфатидилэтаноламинами (ФЭ), фосфатидилсеринами (ФС), фосфатидилглицеролами (ФГ) и фосфатидпыми кислотами (ФК). И-ацил фосфатидилэтаноламины (Ы-ацил ФЭ), ранее обнаруженные в камбиальной зоне, в исследуемом объекте найдены лишь в следовых количествах. Все группы ФЛ характеризуются индивидуальной динамикой содержания, свидетельствующей о том, что в течение исследуемого периода в ККМ меристемы почек протекают процессы биосинтеза и катаболизма ФЛ.

В осенне-зимний период усиливался биосинтез ФХ, ФЭ и ФС, содержание ФХ, основного количественного компонента ФЛ, в липидном матриксе возрастало почти в 2 раза, ФЭ - в 1,2 раза, а ФС - в 6 раз. Содержание ФГ и ФК зимой минимально, а ФИ практически полностью отсутствовали.

Таким образом, формирование криозащищенного состояния ККМ сопровождается во-первых - увеличением суммы ФХ, ФС и ФЭ в липидном матриксе с 42%

Таблица 3 - Групповой состав фосфолипидов меристематических тканей почек

Время отбора Группы фосфолипидов

проб, месяц ФХ ФЭ ФС ФИ ФГ ФК

Август 2А0 12,91 125 10,51 0.13 0,69 0.12 0,62 0.21 1Д1 0.44 2,39

Сентябрь 2,68 13,26 1.40 6,92 0.37 1,83 - 0.10 0,52 0.29 1,41

Октябрь 3.67 14,96 1.59 6,48 0.48 1,96 - 0.21 0,86 0.37 1,53

Ноябрь 4,28 13,17 1.82 5,62 0.67 2,07 - 0.22 0,66 0.21 0,64

Декабрь 4.32 13,12 1.79 5,45 0,73 2,23 - 0.20 0,60 0.13 0,39

Январь 4,14 12,72 1.74 5,33 0.65 1,98 - 0.18 0,56 0.16 0,50

Февраль 4.15 15,02 " 1.72 6,24 • 0^4 2,34 - 0.14 0,50 0.18 0,64

Март 3.58 14,25 1,83 7,26 0.29 1,14 0.36 1,46 0.39 1,57 0.43 1,70

Апрель 1.57 6,27 1.03 4,15 0,11 0,45 0,29 -1,17 0.31 1,22 0.29 1,14

Май 1.78 7,97 1.34 5,98 0.11 0,50 0.48 2,17 0.79 3,55 0.16 0,72

до 80%, во-вторых - сокращением количества групп ФЛ за счет исключения ФИ, в-третьих - низким и относительно стабильным содержанием ФК.

Согласно двум известным путям биосинтеза, ФЛ можно разделить на две группы. В первую группу входят ФХ и ФЭ, образующиеся в результате присоединения к БП-1.2-диацилглицеролу СБР-холина или СОР-этаноламина. Во вторую - ФИ, ФГ и ФС, биосинтез которых идет через СОР-диацилглицеролы и ФК. Анализ динамики содержания отдельных групп ФЛ позволяет предположить, что их биосинтез в период адаптации к низким зимним температурам протекает по первому пути. Вероятно, второй биосинтетический путь в это время заблокирован, в этом случае ФС могут образовываться по вспомогательной реакции обмена из ФЭ.

Жидкое фазовое состояние, необходимое для нормального функционирования мембран, во многом зависит от состава жирных кислот (ЖК) липидов. Снижение температуры может вызвать физическое изменение состояния гидрофобного мембранного матрикса, поэтому живые клетки очень чутко реагируют на изменение температуры окружающей среды, изменяя жирнокислотный состав мембранных липидов. До сих пор такие изменения в тканях хвойных мало исследованы. Поэтому изучение вещественного состава ЖК мембранных липидов живых тканей морозостойких хвойных древесных растений в различные периоды годового цикла представляет несомненный интерес.

Результаты определения состава ЖК фосфолипидов в различные периоды годового цикла приведены в таблице 4. В структуре ФЛ обнаружено 14 ЖК. Динамика

Таблица 4 - Состав жирных кислот фосфолипидов, % к сумме кислот

Жирная кислота Врем отбора проб, месяц

VIII К X XI XII I П Ш IV V

Лауриновая 0/4 1,12 1,27 1,26 1,13 0,67 0,65 0,92 0,30 2,26

Мирисгиновая 0,20 0,28 0,17 0,88 0,74 0,32 0,28 1,03 0,18 1,21

Пальмитиновая 21,30 17,83 12,29' 10,17 10,96 11,59 12,96 22,54 27,38 29,89

Пальмитолеиновая 4,45 8,37 10,64' 10,90 10,15 10,94 10,21 5,62 5,56 2,01

Стеариновая 8,69 4,72 4,08 4,81 . 4,40 4,22 5,08 5,18 4,50 1,60

Олеиновая 12,78 10,14 9,23 8,03 8,07 9,46 9,13 14,23 11,45 2,81

Линолевая 21,82 20,35 20,95 20,33 21,83 20,31 20,24 19,57 15,88 29,74

Линоленовая 14,63 19,63 20,86 20,78 19,92 18,54 20,83 13,83 7,85 5,31

Эйкозановая 3,94 ЗД1 3,75 4,45 3,99 4,39 4,53 5,98 8,34 14,90

Эйкозеновая 2,90 3,34 3,11 3,17 3,12 3,31 4,07 1,08 2,67 2,44

Эйкозадиеновая 2,37 2,05 2,13 2,52 2,41 2,56 1,17 0,34 1,59 2,08

Эйкозатриеновая 2,51 4,72 6,49 6,73 6,23 6,05 5,95 5,50 4,23 1,18

Арахидоновая 0,83 0,63 1,24 1,91 1,69 2,49 1,58 1,01 5,56 2,25

Эруковая 2,94 3,61 3,79 4,06 5,36 5,15 3,32 3,17 4,51 2,32

ИДС 1,26 1,46 1,60 1,62 1,60 1,58 1,56 1,26 1,18 1,02

сирнокислотного состава также носит сезонный характер. В начале мая в период одготовки к активному росту хвои, в ФЛ резко повышалась концентрация пальми-шювой кислоты, что приводило к снижению индекса двойных связей (ИДС) до ,02 .Осенью уровень ненасыщенности ЖК повышался за счет увеличения содержа-шя линоленовой С ]8:з и эйкозатриеновой С 2п:з кислот, а также снижения содержа-1ия насыщенных кислот. В период покоя значение ИДС в ФЛ оставалось на высо-;ом уровне (около 1,60), так как содержание ненасыщенных ЖК достигало 80% от :уммы кислот. Это подтверждает важную роль ФЛ при формировании устойчивого юстояния мембран растительных клеток к низким зимним температурам. Поддер-кантпо в жидком фазовом состоянии липидного матрикса ККМ в зимнее время спо-;обствовало большое количество ненасыщенных ЖК в структуре ФЛ.

Содержание швкомолекулярных ЖК (лауриновой Спо и миристиновой Сн.о) ! ФЛ невысоко и в течение года изменялось от 0,48% до 3,47% от суммы кислот. В щнамике их содержания наблюдалось два максимума: перед распусканием хвои 3,48%) и в ноябре (2,14%). Поскольку длина углеродной цепи жирной кислоты шияет на температуру ее плавления, то низкомолекулярные ЖК, как и высоконена-;ыщенные, могут способствовать поддержанию жидкой консистенции липидов, умещая точку перехода в твердое состояние в низкотемпературную область.

Методом ДСК изучена температурная зависимость изменения теплоемкости в образцах ФЛ. На кривой теплопоглощения ФЛ, выделенных из ККМ активно растущей хвои, имеется два тепловых эффекта в области отрицательных температур: эколо минус 12°С и минус 7°С. На кривой теплопоглощения ФЛ, выделенных из ККМ зимующих меристематических тканей почек, имеется три тепловых эффекта в области отрицательных температур: около минус 23°С, минус 12°С и минус 7 °С. Смещение температуры фазовых переходов до минус 23°С обеспечивает сохранение жидкого фазового состояния'мембран, необходимого для обезвоживания меристематических клеток до относительно безопасного уровня содержания воды.

Особенности механизма повреждения меристематических клеток при замораживании

Увеличение доли ККМ в меристематических тканях в зимний период происходило за счет преимущественного образования фосфолипидсодержащих мембранных структур. Одновременно наблюдалось снижение содержания суммарных липидов в ККМ до минимума (около 25% от абсолютно сухой массы ККМ).

Известно, что липидное окружение белков играет важную роль в их ферментативной активности: активность многих мембранных ферментов снижается, если из |мембраны извлечь липиды и, наоборот, восстанавливается при добавлении мембранных липидов. По-видимому, низкий уровень содержания суммарных липидов в ККМ в зимний период может способствовать снижению активности мембранных ферментов. С другой стороны, молото предположить, что снижение доли липидов в ККМ уменьшает риск повреждения мембранных структур липолитическими ферментами в случае их активации.

Ранее установлено, что при определенных условиях замораживания меристе-магические ткани зимующих почек лиственницы могут сохранить жизнеспособность при замораживании до минус 196 ПС. На рисунке 6 приведены кривые зависимости равновесного (со льдом) влагосодержапия меристематических тканей почек,

их растворимых и нерастворимых компонентов от температуры ц.иы.1М ■.чцы и иЛ|иии^ Сохранение жизнеспособности было возможно в том случае, когда ККМ в результате обезвоживания клеток дегидратировался до остаточного содержания воды, равного содержанию незамерзающей воды. В этих условиях клеточные мембраны теряли воду, локализованную в их капиллярно-пористой системе. Былс также обнаружено, что низкотемпературная кристаллизация даже небольших количеств воды, локализованной в капиллярно-пористой системе ККМ (0,01 - 0,02 г/г ткани) приводила к повреждениям клеток зимующих тканей. Почки теряли способность к набуханию и прорастанию. В то же время, при условии медленного замораживания (3-5 °С /ч) до температуры минус 20 °С и выдерживания при этой температуре в течение нескольких часов, впоследствии побеги с почками сохраняли жизнеспособности при замораживании вплоть до температуры жидкого азота (минус 196 °С). В этих условиях низкотемпературная внутриклеточная кристаллизация имела место только в' растворимой жидкой фазе цитоплазмы и повреждений клеток не наблюдалось. Можно предположить, что в частично дегидратированных клетках именно кристаллизация воды в капиллярной системе клеточных мембран индуцирует активацию мембраносвязанных липолитических ферментов и, как следствие, распад ФЛ.

г/г а.с.м. ткани

1 - целые выделенные мери-стематические ткани;

2 - водорастворимые вещества цитоплазмы;

3 - низкомолекулярные водорастворимые вещества цитоплазмы;

4 - водорастворимые белки цитоплазмы;

5 - комплекс клеточных мембран.

Рисунок 6 - Зависимость равновесного содержания воды со льдом при отрицательных температурах

'" С целью выяснения механизма повреждения клеток в случае кристаллизации воды, локализованной в капиллярно-пористой системе мембран меристематических тканей почек, изучали влияние замораживания при контролируемом остаточном содержании воды в клетках. Зимующие побеги медленно охлаждали со скоростью 3,5 °С/ч до минус 15 °С и минус 20 °С и выдерживали при этих температурах в течение суток. При минус 15 °С остаточное содержание воды в тканях составляло около 0,5 г/г ткани. Количество водЫ, локализованной в порах ККМ, - около 0,02 г/г ткани. При минус 20 °С остаточное содержание воды составляло около 0,45 г/г ткани при общем содержании незамерзающей воды в тканях 0,35 г/г ткани. При содержании незамерзающей воды в мембранах 0,25 г/г ткани вода, локализованная в капилляр-

по-пористой системе мембранного комплекса, практически отсутствовала. Побеги с почками на начальной стадии набухания медленно охлаждали до минус 20 °С и выдерживали в течение суток при этой температуре. Те и другие побеги при охлаждении до минус 20 °С сохраняли жизнеспособность. Далее зимующие побеги замораживали от минус 15 °С и от минус 20 °С со скоростью 15 °С/ч, а побеги на начальной стадии набухания - от минус 20 °С со скоростями 3,5 °С/ч и 15 °С/ч до минус 60 С, оттаивали со скоростью 5 °С/ч и выдерживали при плюс 5 °С в течение суток. Затем извлекали суммарные ФЛ и изучали их групповой и жирнокислотный состав. Результаты изучения деградации ФЛ приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Деградация фосфолипидов комплекса клеточных мембран почек

Зимующие почки . Почки на начальной стадии набухания"

Фос-фоли охлаждение охлаждение охлаждение охлаждение

контроль от -20 °С 15 °С/ч от-15 °С 15 °С/ч контроль от-20°С 15 °С/ч от-20 °С 3,5 °С/ч

пиды Р, ФЛ, Р, ФЛ, Р, ФЛ, Р, ФЛ, Р, ФЛ, Р, ФЛ,

мг/г % мг/г % мг/г % мг/г % мг/г % мг/г %

а.с.м. от £ а.с.м. от £ а.с.м. от 2 а.с.м. от £ а.с.м. от£ а.с.м. от£

1 2 3 4 5 6 7 8 : 9 10 11 12 13

ФХ 1,72 60,3 1,72 60,3 0,36 24,8 1,48 52,1 0,48 27,7 1,24 , 45,5

ФЭ 0,72 25,3 0,72 25,3 .0,23 15,6 0,76 26,5 0,27 15,3 0,62 • 22,6

ФС 0,25 9,4 0,25 9,4 0,09 6,2 0,11 4,2 0,06 3,7 0,09 3,4

ФГ 0,07 2,7 0,07 2,7 0,06 4,3 0,16 5,7 0,11 6,2 0,11 4,3

ФИ - - - - - - 0,13 5,3 0,08 5,6 0,13 5,6

ФК . 0,08 2,3 0,08 2,3 0,81 49,0 0,20 6,2 0,81 41,5 0,57 18,6

РЕ 2,84 2,84 1,55 2,84 1,81 2,76

фосфатидилэтаноламин; ФС - фосфати-- фосфатидилинозит; ФК - фосфатидная

Примечание: ФХ - фосфатидилхолин; ФЭ -дилсерин; ФГ - фосфатидилглицерин; ФИ -кислота; Р - липидный фосфор.

* - содержание воды 1,4 г/г а.с.м. ткани; ** - содержание воды 1,8 г/г а.с.м. ткани.

Из приведенных результатов следует, что сохранение гаи распад ФЛ в зимующих почках в устойчивом состоянии зависят от начальных условий. Замораживание побегов от минус 20 °С, при условии предварительного медленного замораживания до этой температуры, практически не вызывает повреждений мембран даже при относительно быстром (15 С/ч) охлаждении до минус 60 °С. При охлаждении от исходной температуры минус 15 °С (т. е. при наличии в капиллярно-пористой структуре мембран объемной фазы воды, способной к кристаллизации) наблюдался распад ФЛ. В тканях почек на начальной стадии набухания распад ФЛ (по сравнению с контролем) наблюдался при любых условиях, как при быстром, так и при медленном охлаждении до минус 60 °С даже от исходной температуры минус 20 °С.

Изменения липидного матрикса мембран при выходе из состояния покоя приводят к снижению устойчивости меристематических тканей к действию низких температур. В обоих случаях деградация ФЛ сопровождалась также изменением их

жирнокислотного состава. В таблице 7 приведены результаты изучения изменения состава жирных кислот ФЛ при замораживании побегов.

Таблица 7 - Изменение состава жирных кислот фосфолипидов при замораживании побегов, % от суммы кислот

Зимующие почки Почки на начальной стадии набухания

Жирная кислота Контроль Охлаждение от -20,°С -15°С/ч Охлаждение от-15°С " 15°С/ч Контроль Охлаждение от -20°С 3,5°С/ч

Лауриновая ' 0,67 '0,69 1,59 0,92 3,39

Мкрисгиновая 0,32 0,30 ; ' 1,95 1,03 4,57

Пальмитновая 11,59 11,66 22,01 22,54 25,54 .

Пальмитолеиновая , 9,94 9,95 5,90 5,62 3,86

Стеариновая 4,22 4,30 10,71 5,18 10,18

Олеиновая 10,46 10,31 2,92 14,23 5,77

Линолевая 20,31 20,31 12,81 19,57 12,32

Линоленовая 18,54 18,55 5,72 13,83 7,42

Эйкозановая 4,39 4,39 14,83 5,98 15,98

Эйкозеновая 3,31 3,36 9,79 1,08 4,85

Эйкозадиеновая 2,56 2,49 2,25 0,34 0,27

Эйкозатриеновая 6,05 6,10 0,00 5,50 0,19

Арахидоновая 2,49 2,51 3,61 1,01 2,04

Эруковая 5,15 5,08 5,91 3,17 6,59

. Распад ФЛ в почках содержащих в капиллярно-пористой структуре мембран влагу, сопровождался существенным изменением их жирнокислотного состава. Наименее устойчивыми оказались ФЛ, имеющие в своей структуре остатки линоле-вой, линоленовой и эйкозатриеновой кислот.

Полученные результаты подтверждают предположение о том, что распад ФЛ и, повреждение мембран в зимующих побегах индуцированы фазовым переходом врды, локализованной в капиллярно-пористой системе клеточных мембран. На начальной стадии набухания почек распад ФЛ наблюдался даже в условиях относительно медленного замораживания вследствие повышенного содержания воды в тканях. При замораживании зимующих почек, не содержащих в капиллярно-пористой системе мембран объемной фазы воды, способной к кристаллизации, их жизнеспособность полностью сохранялась. Деградации ФЛ и изменения их жирно- , кислотного состава не происходило. Однако, при наличии даже небольшого количества влаги в капиллярно-пористой системе мембран, зимующие ткани утрачивают способность выносить понижение температуры до минус 60°С.

Параллельно проводилось электрофоретическое исследование белков ККМ, которое показало, что увеличение числа фракций белков или изменение их молекулярных масс при замораживании побегов не наблюдалось.

Вероятно, кристаллизация воды, локализованной в капиллярно-пористой системе мембран, в первую очередь индуцирует активацию мембраносвязанных липо-литических ферментов и, как следствие, деградацию ФЛ и существенное изменение состава их ЖК.

На основании экспериментальных исследований разработана теоретическая модель механизма биохимической адаптации меристематических тканей почек лиственницы сибирской, объясняющая сохранение их жизнеспособности в условиях низких зимних температур. Эта модель отражает ключевую роль белков и фосфоли-пидов в формировании низкотемпературной устойчивости тканей. Основные особенности механизма заключаются в следующем:

- В осенний период в клетках появляются специфические высокомолекулярные фракции ВРБЦ, обеспечивающие возможность глубокого переохлаждения цитоплазмы при отрицательных температурах. В свою очередь, глубокое переохлаждение способствует обезвоживанию клеток до относительно безопасного уровня содержания воды;

- В это же время в комплексе клеточных мембран появляются высокомолекулярные фракции ПБ, обладающие способностью снижать льдообразующую активность внутриклеточных центров гетерогенной кристаллизации и, тем самым, также способствующие глубокому переохлаждению цитоплазмы;

- Увеличение содержания ИБ и ПБ в мембранах до 75% может обеспечивать высокую механическую прочность при многократном обезвоживании и ре-гидратации;

- Высокая проницаемость клеточных мембран для воды при отрицательных температурах обусловлена повышением содержания мембранных белков (как ИБ, так и ПБ), а также изменением состава и свойств мембранных липидов;

- Липидный матрикс комплекса клеточных мембран в зимний период на 85% состоит из ФЛ, в структуре которых преобладают ненасыщенные жирные кислоты (около 80%), что приводит к смещению фазовых переходов ФЛ в низкотемпературную область (около минус 23°С).

Выводы

1. Впервые проведены систематические исследования сезонной динамики содержания и некоторых свойств белков и липидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской в периоды подготовки к глубокому покою, глубокого покоя, вынужденного покоя, подготовки к вегетации.

2. Установлено, что формирование состояния низкотемпературной устойчивости у лиственницы сопровождается интенсивным синтезом белков в меристематических тканях почек, содержание белков в ноябре по сравнению с августом возрастает почти в три раза и составляет около 43%. .

3. Обнаружены уникальные антифризные свойства водорастворимых белков цитоплазмы и периферических белков комплекса клеточных мембран, заключающиеся в их способности обеспечивать глубокое переохлаждение внутриклеточной воды.

4. Исследован фракционный состав белков и его изменения в различные периоды года. Установлено, что повышенной антинуклеационной активностью обладают высокомолекулярные фракции водорастворимых белков цитоплазмы и периферических белков комплекса клеточных мембран, синтезирующиеся в осенне-зимний период и исчезающие при потере низкотемпературной устойчивости весной.

5. Впервые установлено, что во время адаптации к низким температурам происходит замещение части липидного матрикса комплекса клеточных мембран белками, в период наибольшей криорезистентности клеточные мембраны на три четверти сформированы белковыми структурами.

6. Исследован групповой состав липидов меристематических тканей почек и его изменения в различные периоды года. Максимальное содержание липидов наблюдается перед распусканием хвои (15,88% - апрель), минимальное - с завершением ростовых процессов (9,56% - сентябрь).

7. Установлено, что значительная часть липидов представлена полярными липи-дами (в зависимости от сезона от 39,74% до 75,88%) и локализована в клеточных мембранах. Основную долю липидов комплекса клеточных мембран составляют фосфолипиды, в структуре которых в осенне-зимний период накапливаются высоконенасыщенные жирные кислоты, что приводит к сохранению жидкого фазового состояния мембран в условиях низких температур.

8. Предложена гипотетическая схема биосинтеза фосфолипидов в меристематических тканях почек лиственницы при формировании состояния низкотемпературной устойчивости клеток.

9. Установлен биохимический механизм повреждения меристематических клеток в условиях летального замораживания. Возникающие при этом повреждения индуцированы фазовым переходом воды, локализованной в капиллярно-пористой системе комплекса клеточных мембран и, в первую очередь, связаны с активацией мембраносвязанных липолитических ферментов, приводящей к деградации фосфолипидов.

10.На основании экпериментальных исследований разработана теоретическая модель механизма биохимической адаптации меристематических тканей почек лиственницы сибирской, отражающая ключевую роль белков и фосфолипидов в формировании низкотемпературной устойчивости тканей и объясняющая сохранение их жизнеспособности в условиях низких зимних темпераТУР-

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Миронов Ц.В., Алаудинова Е.В., Шимова Ю.С., Репях С.М. Характеристика белков меристематических тканей почек лиственницы сибирской. 1. Состав и сезонная динамика водорастворимых белков // Вестник СибГТУ. - 1999. - № 2. -С.55-63.

2. Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Шимова Ю.С., Репях С.М. Характеристика белков меристематических тканей почек лиственницы сибирской. 2. Состав и се-

зонная динамика белков мембранного комплекса // Вестник СибГТУ. - 1999. -№2. - С.64-74.

3. Алаудинова Е.В., Шимова Ю.С., Миронов П.В. Белки и липиды живых тканей Ьапх эЛшса // Труды региональной конференции с международным участием «Научные основы и методы комплексного использования растительных ресурсов лесных экосистем Сибири и Дальнего Востока». - Красноярск, 2000. - С.20-22.

4. Алаудинова Е.В., Миронов П.В., Репях С.М. Жирнокислотный состав фосфоли-пидов меристематических тканей почек Ьапх БЛшса // Труды Международной конференции посвященной 70-летию СибГТУ «Химико-лесной комплекс - научное и кадровое обеспечение в XXI веке. Проблемы и решения». - Красноярск, 2000.-С. 249-252.

5. Алаудинова Е.В., Шимова Ю.С., Миронов П.В. Эколого-физиологические особенности состояния живых тканей Ьапх БЛтса // Тезисы докладов региональной экологической конференции «Эколого-экономические проблемы Красноярского края». - Красноярск: СибГТУ, 2000. - С.96-98.

6. Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Шимова Ю.С., Кишко Е.В., Семенкова О.С. Белки живых тканей некоторых хвойных Сибири // Тезисы докладов конференции «Молодежь и наука: третье тысячелетие». - Красноярск, 2000. - С.4-5.

7. Вол Е.В., Левин Э.Д. Выделение и идентификация фосфатидилхолинов из камбиальной зоны лиственницы сибирской // Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Проблемы физиологии и биохимии древесных растений». - Красноярск, 1982.-Часть 1.-С.13.

8. Левин Э.Д., Рублевская Л.П., Вол Е.В. Глицериды и фосфолипиды камбиальной зоны лиственницы сибирской // Химия древесины. - 1983. - № 4. - С.97-100.

9. Вол Е.В., Левин Э.Д. Методика выделения фосфолипидов из камбиальной зоны лиственницы сибирской и определение их группового состава // Химия древесины. - 1984. - № 1. -С.99-101.

10.Вол Е.В., Левин Э.Д. Характеристика фосфолипидов луба, камбия и камбиального сока лиственницы сибирской // Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Проблемы комплексного использования древесного сырья». -Рига, 1984. - С.19.

11.Алаудинова Е.В., Миронов П.В., Репях С.М. Липиды меристемы почек Ьапх яИнпса // Вестник СибГТУ. - 2000. - №1. - С.94-98.

12.Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Репях С.М. Повреждение мембран меристематических тканей Ьапх эЛтса при внутриклеточном льдообразовании // Труды Международной научно-практической конференции посвященной 70-летшо СибГТУ «Химико-лесной комплекс - научное и кадровое обеспечение в XXI веке. Проблемы и решения». - Красноярск, 2000. - С. 246-249.

13.Алаудинова Е.В., Миронов П.В., Репях С.М. Жирные кислоты мембранных ли-пидов живых тканей почек лиственницы сибирской // Химия растительного сырья. - 2000. - №2. - С.41-45.

Подписано в печать 8.11.2000. Сдано в производство 9.11.2000. Формат 60x84 1/16. Бумага типографская. Печать офсетная. Усл.печ.л. 1,5. Уч.-изд.л. 1,5. Изд. №179. Тираж 100 экз. Заказ №1338. Лицензия ЛР №020346 20.01.97.

Редакционно-издательский отдел СибГТУ. 660049, Красноярск, пр.Мира, 82, тип.СибГТУ

Введение.

1. Аналитический обзор.

1.1 Белки древесных растений.

1.2' Липиды древесных растений.

Выводы по главе 1. г.

2. Методы проведения экспериментов.

2.1 Методика отбора проб и подготовки образцов.

2.2 Методика оценки представительности проб.

2.3 Определение содержания белка в растворах и гомогенатах.

2.4 Экстракция интегральных и периферических белков.

2.5 Гель-хроматография белков.

2.6 Электрофоретическое исследование белков.

2.7 Методика выделения липидов из растительной ткани.

2.8 Адсорбционная колоночная хроматография липидов.

2.9 Аналитическая микротонкослойная хроматография фосфолипидов.|.:.

2.10 Определение содержания фосфолипидов.

2.11 Определение жирнокислотного состава фосфолипидов.

2.12 Препаративная тонкослойная хроматография фосфолипидов.

2.13 Спектральный анализ фосфолипидов.

2.14 Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

2.15 Методика изучения переохлаждения воды и водных растворов.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1 Установление представительности проб при изучении белков и фосфолипидов меристематических тканей почек.

3.2 Исследование состава и свойств белков меристематических тканей почек.

3.3 Исследование состава и свойств липидов меристематических тканей почек.

3.4 Особенности механиз|ма повреждения меристематических клеток при замораживании.:.

Выводы.

Хвойные древесные растения представляют собой основной элемент биоценоза на обширных пространствах Сибири. В условиях, малопригодных для других видов растительности, их меристемы, аккумулируя органические вещества, способны создавать значительную биомассу. Однако в условиях Сибири меристематические ткани большую часть года остаются неактивными [1]. К концу августа заканчивается дифференциация последних ксилемных производных, ростовые процессы завершаются [2]. Это обуславливает изменения обмена веществ. Приоритетным направлением метаболизма меристем в этот период становится сохранение жизнеспособности и создание потенциала физиологической активности для интенсивной вегетации в следующем году. I I

Среди неблагоприятных факторов, влияющих на жизнеспособность ме-ристематических тканей в зимнее время и, таким образом, ограничивающих продуктивность древостоев, а также распространение древесных растений на север, низкие температуры относятся к основным. Это определяет актуальность изучения физиологических процессов, протекающих в меристематиче-ских тканях, в связи с адаптацией дерева к зимним условиям.

Представления о действии на клетки растений отрицательных температур, вызываемых ими губительных изменениях, а также о свойствах клеток, определяющих их морозостойкость, значительно расширились [3-6]. Для последних десятилетий при выяснении вышеперечисленных вопросов характерно применение модельных опытов, каллусных культур, кроме того, большое внимание уделялось изучению процессов, происходящих в тканях сельскохозяйственных культур при понижении температуры окружающей среды. Однако механизмы, функционирующие в естественных условиях и участвующие в процессах адаптации древесных растений к низким температурам, до сих пор изучены недостаточно. Становится все более очевидным, что исследования морозостойкости растений вообще, и в частности, лесных древесных растений, имеют большое значение для сельского хозяйства, лесного хозяйства и производства продуктов питания. Наконец, уже давно осознаётся важнейшая роль лесов в экологии биосферы Земли.

Успешному решению задачи повышения морозостойкости древесных растений должны способствовать фундаментальные исследования химической природы низкотемпературной устойчивости и природы повреждений низкими температурами их меристематических тканей. Известно, что в обеспечении низкотемпературной устойчивости растений большую роль играет белковый и липидный обмен. Это связано с тем, что белки и липиды являются структурными компонентами биологических мембран, повреждающихся при замораживании в первую очередь [7-9]. О направлении белкового и липидного обменов в определенной мере можно судить по содержанию белков и липидов в ткани и по их изменению в ходе годового цикла. Авторы публикаций отмечают корреляционную связь повышения содержания белков и ненасыщенности жирных кислот липидов в органах и тканях древесных растений с повышением морозостойкости [10-14]. Однако имеющиеся в литературе сведения по ли-пидному и белковому обмену хвойных были получены при изучении неоднородных по составу и анатомическому строению образцов (хвоя, почки, кора, корни, побеги и т.д.), что затрудняет возможность объективной оценки структурно-химических изменений, происходящих в живых клетках. Вместе с тем, изучение сезонной динамики; химического состава и свойств белков и липидов живых тканей морозостойких растений, выдерживающих в зимний период низкие отрицательные температуры (до минус 60 °С) является важным, поскольку дает ключ к пониманию механизма формирования состояния низкотемпературной устойчивости клеток.

Среди хвойных пород, образующих естественные древостой Сибири, лиственница сибирская (Ьапх БЙэтса Ь.) обладает наибольшей морозостойкостью [15, 16]. Это свидетельствует о существовании у лиственницы сформированного и наследственно закрепленного механизма, позволяющего сохранить жизнеспособность меристематических клеток в условиях суровой сибирской зимы. В связи с этим она выбрана в качестве объекта исследования.

Меристематические ткани почек, при выделении которых удается получить весьма однородные по содержанию живых клеток образцы, являются перспективным объектом для изучения роли белков и липидов при формировании криорезистентного состояния растительных клеток. Белки и липиды ме-ристематических тканей почек лиственницы сибирской до настоящего времени практически не изучены. Исследование химического состава белков и липидов меристематических тканей почек, изменений, происходящих в них в процессе адаптации к низким температурам, криопротекторных свойств белков, их роли в снижении льдообразующей активности поверхности мембран, а также характера повреждений, возникающих в меристематических тканях почек при замораживании, позволят разработать представления о формировании устойчивого состояния живых тканей лиственницы сибирской в условиях низкотемпературного стресса.

Таким образом, основной целью данной работы является изучение сезонных изменений состава и свойств белков и липидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской (Ьапх эШшса Ь.) и связи этих изменений с низкотемпературной устойчивостью тканей в осенне-зимний период. Полученные экспериментальные данные позволят глубже понять особенности метаболизма лиственницы, исследование которой на протяжении ряда лет проводятся в Сибирском государственном технологическом университете и Институте леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, а также могут быть использованы для оценки морозостойкости древесных растений, возможностей их интродукции, разработки способов повышения устойчивости и новых методов криоконсер-вирования растительных тканей для будущей селекции растений.

Выводы

1. Впервые проведены систематические исследования сезонной динамики содержания и некоторых свойств белков и липидов меристематических тканей почек лиственницы сибирской в периоды подготовки к глубокому покою, глубокого покоя, вынужденного покоя, подготовки к вегетации.

2. Установлено, что формирование состояния низкотемпературной устойчивости у лиственницы сопровождается интенсивным синтезом белков в меристематических тканях почек, содержание белков в ноябре по сравнению с августом возрастает почти в три раза и составляет около 43%.

3. Обнаружены уникальные антифризные свойства водорастворимых белков цитоплазмы и периферических белков комплекса клеточных мембран, заключающиеся в их способности обеспечивать глубокое переохлаждение внутриклеточной воды.

4. Исследован фракционный состав белков и его изменения в различные периоды года. Установлено, что повышенной антинуклеационной активностью обладают высокомолекулярные фракции водорастворимых белков цитоплазмы и периферических белков комплекса клеточных мембран, синтезирующиеся в осенне-зимний период и исчезающие при потере низкотемпературной устойчивости весной.

5. Впервые установлено, что во время адаптации к низким температурам происходит замещение части липидного матрикса комплекса клеточных мембран белками, в период наибольшей криорезистентности клеточные мембраны на три четверти сформированы белковыми структурами.

6. Исследован групповой состав липидов меристематических тканей почек и его изменения в различные периоды года. Максимальное содержание липидов наблюдается перед распусканием хвои (15,88% - апрель), минимальное - с завершением ростовых процессов (9,56% - сентябрь).

7. Установлено, что значительная часть липидов представлена полярными ли-пидами (в зависимости от сезона от 39,74% до 75,88%) и локализована в клеточных мембранах. Основную долю липидов комплекса клеточных мембран составляют фосфолипиды, в структуре которых в осенне-зимний период накапливаются высоконенасыщенные жирные кислоты, что приводит к сохранению жидкого фазоврш-есгстоянйя мембран в условиях низких температур.

8. Предложена гипотетическая схема биосинтеза фосфолипидов в меристематических тканях почек лиственницы при формировании состояния низкотемпературной устойчивости клеток.

115

9. Установлен биохимический механизм повреждения меристематических клеток в условиях летального замораживания. Возникающие при этом повреждения индуцированы фазовым переходом воды, локализованной в капиллярно-пористой системе комплекса клеточных мембран и, в первую очередь, связаны с активацией мембраносвязанных липолитических ферментов, приводящей к деградации фосфолипидов.

10.На основании экпериментальных исследований разработана теоретическая модель механизма биохимической адаптации меристематических тканей почек лиственницы сибирской, отражающая ключевую роль белков и фосфолипидов в формировании низкотемпературной устойчивости тканей и объясняющая сохранение их жизнеспособности в условиях низких зимних температур.

1. Судачкова Н.Е. Метаболизм хвойных и формирование древесины. Новосибирск: Наука, 1977. - 230с.

2. Антонова Г.Ф. Рост клеток хвойных. Новосибирск: Наука, 1999. - 232с.

3. Актуальные проблемы криобиологии / Под общ. ред. Н.С. Пушкаря и A.M. Белоуса. Киев: Наук, думка, 1981. - 608с.

4. Трунова Т.Н. Физиологические и биохимические основы адаптации растений к морозу// Сельскохозяйственная биология. 1984. -№ 6. - С.3-10.

5. Трунова Т.И. Физиолого-биохимические основы адаптации и морозостойкости растений // Второй съезд ВОФР: Тез. докл. М., 1990. С.91.

6. Алексеев В.Г. Устойчивость растений в условиях Севера: эколого-биохимические аспекты. Новосибирск: Наука, 1994. - 152с.

7. Самыгин Г.А. Причины вымерзания растений. М.: Наука, 1974, - 180с.

8. Палта Дж.П., Ли П.Х. Свойства клеточных мембран в связи с повреждением при замерзании // Холодостойкость растений / Пер. с англ. Под ред. Г.А. Самыгина. М.: Колос, 1983. - С.79-96.

9. Wang Chien Yi. Physiological and Biochemical Responses of Plants to Chilling Stress // Hort. Sei. 1982. - № 2, - РЛ73-187.

10. Ю.Новицкая Ю.Е., Чикина П.Ф. Азотный обмен у сосны на Севере. Л.: Наука, 1980. - 166с.

11. Чикина П.Ф. Динамика различных форм азота в органах и тканях сосны // Физиолого-биохимические основы роста и адаптации сосны на Севере. -Л.: Наука, 1985.-С.57-63.

12. Физиология сосны обыкновенной / Н.Е. Судачкова, Г.И. Гире, Г.С. Про-кушкин и др. Новосибирск: Наука, 1990. - 248с.

13. Sakai A., Larcher W. Frost survival of plants Springer-Verlag. BerlinHeidelberg, 1987. -304p.

14. Хлебникова H.A., Гире Г.И., Коловский P.A. Физиологическая характеристика хвойных растений Сибири в зимний период // Труды ИлиД СО АН СССР. Красноярск, 1963. - Т.60. - С.5-16.

15. Дылис Н.В. Лиственница. М.: Лесн. пром-сть, 1981. - 96с.

16. Туманов И.И. Физиология закаливания и морозостойкости растений. М.: Наука, 1979.-352с.

17. Голдовский A.M. Анабиоз и его практическое значение. Л.: Наука, 1986. -169с.

18. Kukal Olga, Hauking BarbaraJ., Rihard A. Cryoinjury in conifer seedings // Cryo -Lett. 1991. -№ 1. -P.9-17.

19. Вайзер К.Дж. Семинар по морозостойкости растений: итоги и общие заме-чеания // Холодостойкость растений / Пер. с англ. Под ред. Г.А. Самыгина. -М.: Колос, 1983. -С.300-303.

20. Максимов H.A. Избранные труды по засухоустойчивости и зимостойкости растений. М.: Изд-во АН СССР, 1952. - Т.2. - 296с.

21. Levitt J. The hardiness of plants. New York: Acad. Press, 1956. - 278p.

22. Karlsson Jens O.M., Craialho Ernest G., Toner Mehmet. Intraceluular ice formation: Causes and consequences // Cryo-lett. -1993. Vol.14. - № 6. - P.323-334.

23. Красавцев O.A. Калориметрия растений при температурах ниже нуля. М.: Наука, 1972.-117с.

24. Сергеева К.А. Физиологические и биохимические основы зимостойкости древесных растений. М.: Наука, 1971. - 174с.

25. George M.F., Becwar M.R., Burke M.J. Freezing Avoidance by Deep Undercooling of Tissue Water in Winter-Hardy Plants // Cryobiology. 1982. -Vol.19.-P.628-639.

26. Левитт Дж. Повреждения и выживание после замораживания и связь с другими повреждающими воздействиями // Холодостойкость растений / Пер. с англ. Под ред. Г.А. Самыгина. М.: Колос, 1983. - С. 10-22.

27. Миронов П.В. Льдообразование в зимующих тканях лиственницы сибирской: Автореф. дис.канд. биол. наук. Иркутск, 1986. - 19с.

28. Красавцев О.А. Скорость оттока воды из клеток морозостойких растений при отрицательных температурах // Физиол. раст. 1970. - Т.17. - Вып.З. -С.508-513.

29. Drossopoulus J.P., Niavis S.A. Seasonal changes of the metabolites in the leaves, bark and xylem tissues of olive tree (Olea europaea L.). 1. Nitrogenous compounds // Ann. Bot. 1988. - Vol.62. - № 3. - P.313-320.

30. Полякова Р.Б., Преснухина Л.П. Сезонные изменения ультраструктуры клеток хвои сосны обыкновенной // Сезонные структурно-метаболические ритмы и адаптация древесных растений / Под ред. Э.Н. Адлера и др. Уфа: Башк. фил. АН СССР, 1977. - С.87-96.

31. Физиолого-биохимические основы роста и адаптации сосны на Севере / Ю.Е. Новицкая, П.Ф. Чикина, Г.И. Сафронова и др. Л.: Наука, 1985. -156с.

32. Новицкая Ю.Е. Физиологическая роль эндоплазматического ретикулума и гиалоплазмы клеток мезофила хвойных растений // Электронная микроскопия в ботанических исследованиях. Петрозаводск: Изд-во КФАН СССР,1974. С.78-82.

33. Родионов B.C., Фуксман И.Л., Новицкая Ю.Е. Расщепление фосфолипидов и изменение ультраструктуры клеток зимней хвои сосны после ее промораживания // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1985. - № 6, - С.934-939.

34. Красавцев O.A., Туткевич Г.И. Ультраструктура клеток коровой паренхимы древесных растений в связи с морозостойкостью // Физиол. раст. 1971. -Т.18. - Вып.З. - С.601-608.

35. Pihakaski К. Seasonal changes in the chloroplast ultrastructure of Diapensia lap-ponica // Nord. J. Bot. 1988. - Vol.8. - № 4. - P.361-366.

36. Лебеденко Л.А. Материалы к 3 Всесоюзному симпоз. по применению электронной микроскопии в ботан. исследованиях. Петрозаводск: Изд-во КФАН СССР, 1974. - С.69-71.

37. Степонкус П.Л., Вист С.К. Изменения плазмалеммы в результате закаливания и замораживания // Холодостойкость растений / Пер. с англ. Под ред. Г.А. Самыгина. -М.: Колос, 1983. С.64-78.

38. Heber U., Volger H., Overbeck V. and Santarius K.A. Membrane damage and protection during freezing // Proteins Low Temperatures. Washington: DC. -1979.-P.159-189.

39. Красавцев O.A. Свойства плазмалеммы морозоустойчивых растительных клеток//Успехи соврем, биол. 1988. -Т.106. - № 1. - С.143-157.

40. Климов C.B. Биоэнергетическая концепция устойчивости растений к низким температурам // Успехи.современной биологии. 1997. -Т.117.-№2. - С.133-154.

41. Прянишников Д.Н. Избранные сочинения. М.: Изд-во АН СССР, 1951. -Т.1. - С.196-261.

42. Osborne T.B. The Vegetable Proteins/ 2nd ed. London: Longmans, 1924.

43. Благовещенский A.B. Биохимия обмена азотсодержащих веществ у растений. М.: Изд-во АН СССР, 1958. - 346с.

44. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия; Учебник / Под ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова. М. : Медицина, 1990. - 528с.

45. Крамер П.Д., Козловский Т.Т. Физиология древесных растений. М.: Лесн. пром-сть, 1983. -462с.

46. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Т.1. / Пер. с англ. М.: Мир, 1985.-367с.

47. Конарев В.Г. Проблема пищевой и кормовой ценности растительных белков // Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука, 1975. - С.5-20.

48. Гудвин Т. Мерсер Э. Введение в биохимию растений / Пер. с англ. Под ред. В.А. Кретовича. М.: Мир, 1986. - 393с.

49. Браун Г.Н. Механизм белкового синтеза в связи с морозостойкостью растений // Холодостойкость растений / Пер. с англ. Под ред. Г.А. Самыгина. -М : Колос, 1983. С.124-131.

50. SiminovitchD., Chater A.P.J. In: Physiology of forest trees. Symp. Harvard Forest. New York: Ronald Press Co., 1958. - 219p.

51. Parker J. Changes in sugars and nitrogenous compounds of tree barks from summer to winter. Naturwiss., 1958. -Bd 45. -№ 6. -P.139.

52. David H. Evolution de la teneur en azotes solubles des aiquilles et des rameaux du Pin maritime. С. R. Acad Sei., 1966. - Vol. 262. - P.1852-1855.

53. Полищук Л.К. Исследования грецкого ореха Украины как представителя группы недостаточно стойких растений в связи с проблемой морозостойкости: Автореф. дис.докт. биол. наук. Харьков, 1961. - 37с.

54. Матейкане И. Динамика общего и белкового азота в органах сосны обыкновенной в течение года // Биология. Научные труды высших учебн. заведений Лит. ССР. Изд-во ВУЗ, Вильнюс. -1971.-T.il- С.89-100.

55. Сергеев Л.И., Сергеева К.А., Мельников В.К. Морфофизиологическая периодичность и зимостойкость древесных растений. Уфа: Изд-во Башк. фил. АН СССР, 1961.- 150с.

56. Филиппова Ю.Е. Морфофизиологическая периодичность и зимостойкость древесных растений. Кзыл Орда: Автореф. дис.канд. биол. наук. Уфа, 1963.- 17с. Г

57. Мельников В.К., Станкевич K.B. Азотный обмен различных по зимостойкости сортов яблони//Тр. Центр, генет. лабор., 1970. -Т.П. -С.11-27.I

58. Wetzel S., Demmers С., Greenwood J.S. Seasonally fluctuating bark proteins are a potentional form of nitrogen storage in three temperate hardwoods // Planta. -1989.-Vol.178.-P.275-281.

59. Шуляковская T.A., Ильинова M.K., Кищенко И.Т. Динамика содержания азотистых веществ и липидов в хвое некоторых представителей рода Picea A. Dietr., интродуцированных в Карелию // Раст. ресурсы. 2000. - Вып.1. -С.33-42.

60. Андреева Т.Ф. Фотосинтез и азотный обмен листьев. М.: Наука, 1969. -162с.

61. Жибоедов П.М. Адаптация растений к условиям Крайнего Севера и разработка методов диагностики на зимостойкость // Исследования по физиологии растений в Заполярье. Апатиты, 1975. - С.51-68.

62. Удовенко Г.В. Характер защитно-приспособительных реакций и причины разной устойчивости растений к экстремальным воздействиям // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. 1973. - Т.49. - Вып.З. - С.258-268.

63. Ротегу М.К., Siminovitch D., Wightman F. Seasonal biochemical changes in the living bark and needles of red pine (Pinus resinosa) in the relation to adaptation to freezing // Canad. J. Bot. 1970. - Vol.48. - № 5. - P.953-967.

64. Мириманян В.А. К вопросу разработки методов диагностирования морозоустойчивости субтропических растений // Докл. ВАСХНИЛ, 1958. Вып.З. - С.17-19.

65. Проценко Д.Ф. Морозостойкость плодовых культур СССР. Киев: Наук, думка, 1958.-391с. 1

66. Heber U. Ursachen der Frostresistenz bei Winter-weizen. 2 Mitt. Die Bedeutung von Aminosäuren bei Peptiden für die Frostresistenz. Planta, 1958. - Bd 52. -S.431-446.

67. Васильева И.М., Лебедева Л.А., Рафикова Ф.М. Некоторые связи между водным, углеводным и азотным обменами озимой пшеницы в связи с вопросом морозоустойчивости // Физиол. раст. 1964. - Т.П. - Вып.5. -С.897-905.

68. Туманов И.И., Трунова Т.И. Значение для озимой пшеницы накопления Сахаров и охлаждения во время первой фазы закаливания ее к морозам // ДАН СССР, 1967. -Т.175. Вып.5. - С.1186-1189.

69. Heber U. Proteins capable of protecting chloroplast membranes against freezing // The Frozen cell: A Ciba Foundation Symposium. London: Churchill, 1970. -P.175-186.

70. Purification and characterization of a cryoprotective protein (cryoprotectin) from the leaves of cold-acclimated cabbage / F. Sieg, W. Schroder, J.M. Schmit, P.K. Hincha // Plant Physil. 1996. - Vol. 111. - № 1. - P.215-221.

71. Миронов П.В., Лоскутов C.P. Роль белков-криопротекторов в переохлаждении внутриклеточной воды в тканях лиственницы сибирской // Лесн. журнал 1998. - Вып.6. - С.24-29.

72. Brown G.N., Bixby J.A. Soluble and insoluble protein patterns during induction of freezing tolerance in black locust seedling // Physiol. Plant. 1975. - Vol.34. -№2. -P.187-191.

73. Roberts Dane R., Teivonen Peter, Mc Innis Stephanie M. Discrete proteins associated with overwintering of interior spruce and Douglasfir seedlings // Can. J. Bot. -1991. Vol.69. - № 3. - P.437-441.

74. Craker L.E., Gusta L.V., Weiser C.J. Soluble proteins and cold hardiness of two woody species // Canad. J. Plant Sci. 1969. - Vol.49. - № 2. - P.279-286.

75. Галимова И.В. Содержание белков в годичном цикле различных по зимостойкости древесных растений // Тезисы докладов научной конференции, посвященной 50-летию Октября. Уфа, 1967. - С. 15-17.

76. Судачкова Н.Е., Семенова Г.П. К характеристике белков вегетативных органов кедра сибирского // Материалы конференции по физиологии и биохимии растений, посвященной 50-летию образования СССР. Красноярск, 1972. - С.53-57.

77. Благовещенский A.B., Александрова Е.Г. Биохимические основы филогении высших растений. ML: Наука, 1974. - 102с.

78. Сулейманов И.Г. Структурно-физические свойства протоплазмы и ее компонентов в связи с проблемой морозоустойчивости культурных растений. -Казань: Изд-во Казанского ун-та, 1964. 200с.

79. Kung Seong-Mo, Titus J.S. Specific proteins may determine maximum cold resistance in apple shoots // J. Hort. Sei. 1971. - Vol.62. - № 3. - P.281-285.

80. Крищенко В.П. Методы оценки качества растительной продукции. М.: Колос, 1983. - 192с.

81. Репях С.М., Левин Э.Д. Состав белков хвои ели // Химия древесины. 1976. - № 4. - С.114-116.

82. Репях С.М., Рахмилевич В.А., Левин Э.Д. Состав белков хвои сосны разного возраста // Химия древесины. 1976. - № 4. - С.111-113.

83. Судачкова Н.Е., Семенова Г.П. Растворимые белки прикамбиальной зоны Pinus silvestris L. // Лесоведение. -1971. № 6. - С.39-44.

84. Галимова И.В. О белковом метаболизме в период покоя у различных по зимостойкости древесных растений // Симпозиум по физиологии глубокого покоя древесных растений. Уфа: Изд-во Башк. фил. АН СССР, 1969.1. С.55-59.

85. Суздальцева В.А. Фракционный состав белков у различных по зимостойкости сортов яблонь // Тр. Центр, генет. лабор. 1972. - Т.12. - С.183-189.

86. Галимова И.В. Годичная динамика белков в хвое сосны обыкновенной // Проблемы физиологии и биохимии древесных растений: Тез. докл. Всесоюз. конф. Красноярск: Ин-т леса и древесины, 1974. - С.18-19.

87. Репях С.М., Хлызова Т.П., Тихомирова Г.В. О протеине хвои лиственницы сибирской //Лиственница. Межвуз. сб. Красноярск: СТИ, 1977. - Т.13. -С.161-166.

88. Каргапольцев А.П., Репях С.М., Юшипицина Г.Г. Динамика фракционного и аминокислотного состава белков хвои лиственницы сибирской в зависимости от возраста // Химия древесины. 1985. - № 5. - С.93-95.

89. Каргапольцев А.П. Состав белков древесной зелени хвойных пород лесов Сибири: Автореф. дис.канд. техн. наук. Красноярск, 1987. - 17с.

90. Кудашова Ф.Н., Позднякова A.C. Характеристика азотного обмена в связи с дифференциацией элементов ксилемы у сеянцев сосны и лиственницы // Физиолого-биохимические механизмы роста хвойных. Новосибирск: Наука, 1978. - С.22-31.

91. Кудашова В.Н. Сезонная динамика свободных аминокислот в хвое и корнях сеянцев некоторых хвойных // Биохимическая характеристика хвойных пород Сибири в связи с ростом и морфогенезом. Новосибирск: Наука, 1974. - С.111-127.

92. Прокушкин С.Г., Полякова Г.Г. Влияние температуры почвы на фракционный состав белков корней сосны обыкновенной в течение вегетации //

93. Физиология роста и питания хвойных. Красноярск: ИЛиД СО АН СССР, 1986.-С.15-23.

94. Прокушкин С.Г. Минеральное питание сосны: (на холодных почвах). -Новосибирск: Наука, 1982. 190с.

95. Судачкова Н.Е., Семенова Г.П. Белки вегетативных органов сибирских видов хвойных как потенциальный кормовой ресурс // Раст. ресурсы. -1995. Т.31. - Вып.4. - С.20-25.

96. Биохимические индикаторы стрессового состояния древесных растений / Н.Е. Судачкова, И.В. Шеин, Л.И. Романова и др. Новосибирск: Наука, 1997.- 176с.

97. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. - 322с.

98. Химия липидов / Р.П. Евстигнеева, Е.Н. Звонкова, Г.А. Серебренникова и др. М.: Химия, 1983. - 296с.

99. Коссович Н.Л. Масло в коре растений / Рукопись НИС ЛТА, 1943. -С.28-32.

100. Лир X., Польстер Г., Фидлер Г. Физиология древесных растений. М.: Высш. шк., 1974-423с.

101. Царегородцева С.О. Годичная динамика основных липидов почек тополя / Биолог, науки. 1975. - № 12. - С.89-92.

102. Jeremias К/ Physiology der speicherung in Picea abies und Sequoia gigantea //Mitt. Ver. Forstl. Standartskunde Forstpfl. Lucht. 1969,- № 19. -P.58-66.

103. Мосин В.И. Изучение некоторых особенностей метаболизма семян сосны обыкновенной в процессе их снегования // Тр. ин-та / Ин-т экологии растений и животных АН СССР. Свердловск: АН УФ СССР, 1968. -Вып.62. - С.185-189.

104. Као С. Biochemical changes in seeds of Taiwan red pine and Chinese fir during germination / Forest Sci. 1973. - Vol.19. - № 4. - P ,297-302.

105. Nyman B. Light, seed coat and gibberelic acid in relation to the amylase activity in germinating Scots pine seeds (Pinus silvestris L.) // Physiol. Plantarum. 1971.-Vol.25.-№ 1.-P.112-117.

106. Новицкая Ю.Е. Сезонная и возрастная динамика основных фракций ли-пидов хвои сосны обыкновенной // Физиолого-биохимические исследования сосны на Севере. Петрозаводск: Ин-т леса. Карел, фил. АН СССР, 1978. - С.39-52.

107. Фуксман И.Л., Понькина H.A. Качественный состав жирных и смоляных кислот древесины сосны обыкновенной // Липидный обмен древесных растений в условиях Севера. Петрозаводск: Ин-т леса. Карел, фил. АН СССР, 1983. - С.119-131.

108. Рязанова Т.В., Чупрова H.A., Исаева Е.В. Химия древесины. Красноярск: КГТА, 1996. - 358с.

109. Рубчевская Л.П. Глицериды камбиальной зоны лиственницы сибирской: Автореф. дис. канд. хим. наук. Рига, 1983. - 24с.

110. Левин Э.Д., Рубчевская Л.П. Состав триглицеридов камбиальной зоны лиственницы сибирской // Химия древесины. 1985. - № 1. - С. 104-109.

111. Репях С.М., Чупрова H.A., Барабаш Н.Д. Экстрактивные вещества древесной зелени // Химия древесины. 1983. - № 4. - С.62-64.

112. Полежаева Н.С. Сезонные изменения содержания липидов и их состава в однолетних побегах сосны обыкновенной // Химия древесины. 1987. - № 1. - С.94-98.

113. Шарков В.И., Цветкова Е.С. Изменение химического состава древесины в процессе ее роста // Тр. ин-та / ВНИИГС. Л., 1950. - Т.З. - С.69-84.

114. Ситнянская Н.П., Мартын Г.И. Запасные липиды клеток меристемы почек в период выхода древесных растений из покоя // Цитология и генетика. 1991. - Т.25. - № 2. - С.3-6.

115. Кагава Ясуо. Биомембраны / Пер. с яп. A.A. Селищевой; Предисл. и общ. ред. В.Е. Кагана. М.: Высш. шк., 1985. - 303с.

116. Лебедев С.И. Физиология растений. М.: Колос, 1982. - 463с.

117. Саламатова Т.С. Физиология растмительной клетки. Л.: Изд-во Ле-нингр. ун-та, 1983. - 232с. j

118. Mazliak P. Glyco- and phospholipids of biomembranes in higher plants // Lipids and lipid polymers in higher plants. Berlin: Ed. M. Tevini, 1977. -P.48-74.

119. Липиды плодов Dispyros kaki / A.A. Колесник, В.Н. Голубев, Л.И. Кос-тинская, М.А. Халилов // Химия природных соединений. 1987. - № 4. -С.501-505.

120. Липиды листьев хлопчатника 175-Ф / С.Г. Юнусова, С.Д. Гусакова, Х.Т. Мирзаазимова, А.И. Глушенкова, С.А. Усманов, Ю. Икрамов // Химия природных соединений. 1989. - № 2. - С.285-286.

121. Мухамедова Х.С., Акрамов С.Т. Фосфолипиды семян Phaseolus Vulgaris // Химия природных соединений. 1982. - № 6. - С.688-691.

122. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.: Высш. шк., 1980. - 445с.

123. Тыхеева Э.Б. Липиды пшеницы: Автореф. дис. канд. хим. наук. М., 1971.-25с.

124. Нечаев А. П. Липиды зерновых культур и их изменения при хранении и переработке зерна: Автореф. дис. д-ра. техн. наук. М., 1971. - 44с.

125. Газизов Ф.С., Исамухамедов А.Ш., Акрамов С.Г. Фосфолипиды из промышленного шрота хлопчатника // Химия природных соединений. 1983. -№ 6. - С.698-700.

126. Исамухамедов А.Ш., Акрамов С.Т. Фосфолипиды семян граната // Химия природных соединений. 1982. - № 3. - С.396-397.

127. Корнена Е.П., Пономарева H.A. Характеристика жирных кислот и не-омыляемых веществ фосфолипидов растительных масел // Изв. ВУЗов. Пищевая технология. 1984.-№ 2. - С. 19-20.

128. Асланов С.М. химический состав плодов облепихи, выращиваемой на Апшероне // Растительн. ресурсы. 1982. - Т. 18. - № 1. - С.74-75.

129. Щербакова В.Г., Лобанов В.Г., Соловьева Т.Е. Состав гликолипидов семян подсолнечника // Изв. ВУЗов. Пищевая технология. 1984. - № 3. -С.22-25.128j

130. Щербаков В.Г. Химия и биохимия переработки масличных семян. М.: Пищевая промышленность, 1977. - 168с.

131. Дусеева Ф.А. Исследование фосфорноорганических соединений у различных по зимостойкости древесных растений: Автореф. дис.канд. биол. наук.-Уфа. 1975.-27с.

132. Фуксман И.Л. Изучение состава и содержания липидов в древесине сосны в условиях Севера: Автореф. дис.канд. хим. наук. Рига, 1983. - 26с.

133. Зингель Т.Г., Репях С.М. Фосфолипиды коры побегов древесной зелени сосны обыкновенной и пихты сибирской // Изучение и пути использования древесной коры: Тез. докл. конф. Красноярск, 1985. - С.70-71.

134. Кулакова О.Ю. Арахидоновая кислота почек и однолетних побегов лиственницы сибирской // Использование и восстановление ресурсов Ангаро-Енисейского региона (Сибирский лес): Тез. докл. Всесоюз. конф. Красно-ярск-Лесосибирск, 1991. - С.193.

135. Рубчевская Л.П., Игнатова Е.В., Репях С.М. Фосфолипиды камбиальной зоны Larix sibirica // Химия природных соединений. 1998. - № 4. - С. 549550.

136. Фуксман И.Л., Понькина H.A. Качественный состав липидов древесины сосны обыкновенной // Химия древесины. 1984. - № 5. - С.85-88.

137. Полежаева Н.С. Сезонные изменения содержания липидов и их жирно-кислотного состав в однолетних побегах сосны обыкновенной // Химия древесины. 1987. - № 1. - С.94-98.

138. Игнатова Е.В. Полярные липиды древесной зелени лиственницы сибирской: Автореф. дис.канд. хим. наук. Красноярск, 1992, - 24с.

139. Исаева Е.Е. Групповой состав фосфолипидов почек тополя бальзамического // Исследования в области химии древесины: Тез. докл. 6 -межрес-публ. школы-семинара. Рига, 1991. - С.63.

140. Исаева Е.В. Арахидоновая кислота Populus balsamifera как предшественник простагландинов: Автореф. дис.канд. хим. наук: 05.21.03. Красноярск, 1991.-24с.

141. Родионов B.C., Ильинова М.К., Шуляковская Т.А. Динамика содержания нейтральных липидов, глико- и фосфолипидов в однолетней хвое сосны в течение года // Липидный обмен древесных растений в условиях Севера. -Петрозаводск, 1983. С.69-77.

142. Лебедева О.И., Тихомирова Г.В. Методика определения состава липидов древесной зелени // Изучение химического состава древесной зелени. Методические основы. Рига: Зинатне. - 1983. - С.62-66.

143. Зингель Т.Г. Фосфолипйдные концентраты древесной зелени хвойных растений: Автореф. дис.канд. техн. наук. Красноярск, 1990. - 24с.

144. Донская Л.И., Музалевская О.В. Состав нейтральных липидов и фосфолипидов семян Pinus sibirica Du Tour // Раст. ресурсы. 1994. - Т.30. -Вып.З. - С.64-66.

145. Исследование двойного электрического слоя монослоев стеариновой кислоты и ее производных на границе раздела фаз вода-воздух /B.C. Гевод, О.С. Ксенжек, И.Л. Решетняк и др. // Биологические мембраны. 1991.1. Т.8. № 4. - С.423-429.

146. Hajime Н. Reconjtitution of ion channels into planal phospholipid bilayers // Ferroelectrics. 1988. - Vol.86. - № 1. - P.l 15-120.

147. Dohler G., Datz G. Effect of light on lipid and fatty acid composition of cya-nobacteria, Anacystis nidulans (Synechococcus) // Z. Pflanzenphysiol. 1980. -Vol.100.-P.427-435.

148. Quinn D.M. Acetylcholinesterase: enzyme structure, reaction dynamics and virtual transition states // Chem. Rew. 1987. - Vol.87. - № 5. - P.955-979.

149. Дятловицкая Э.В. Исследование липидов клеточных мембран опухолевых и гомологичных нормальных тканей: Автореф. дис.д-ра. хим. наук. -М, 1973.-44с.

150. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. М., Наука, 1981. - 339с.

151. Родионов B.C. Изменения в мембранных липидах растений при пониженных температурах // Липидный обмен древесных растений в условиях Севера. Петрозаводск, 1983. - С.97-105.

152. Kuiper P.J.С., Siegenthaler Р.А., Eichenberger W. Lipid metabolism of higher plants as a factor in environmental adaptation // Structure, function and metabolism of plant lipids. New York. - 1984. - P.525-530.

153. Изменения жирнокислотного состава липидов хвои сосны обыкновенной в течение годичного цикла / И.Л. Фуксман, М.К. Ильинова, Л.А. Саукконен, А.А. Степанов // Химия древесины. 1986. - № 3. - С. 101-108.

154. Сопин А.И., Трунова Т.И. Динамика содержания фосфолипидов и жирных кислот в этиолированных проростках озимой пшеницы при закаливании к морозу // Физиология растений. 1991. - Т.33. - № 1. - С.142-149.

155. Hardiness dependent accumulation of phospholipids in leaves of wheat culti-vars /1. Horvath, Z. Vigh, A. Belea, T. Farkas // Physiol. Plant. 1980. - Vol.49. -№ 2.-P.l 17-120.

156. Lipid changes in cold hardened leaves of Nothofagus dombeyi / A. Miren, F. Guno, C. Raul, R. Magdalena, R. Darcy // Phytochemistry. 1990. - Vol.29. - № 8. -P.2467-2471.

157. Новицкая Г.В., Зверкова O.A., Соколова И.А. Липидный состав листьев и узлов кущения озимой ржи при закаливании к морозу // Физиология растений. 1986. - № 5. - С.997-999.

158. Wilson М., Crawford R.M. The acclimatization of plants to chilling temperatures in relation to the fatty acid composition of leaf polar lipids // Cryobiology. -1974.-№5.-P.805-820.

159. Yoshida S., Sakai A. Phospholipid changes associated with the cold hardiness of cortical cells from poplar stem // Plant Cell Physiology. 1973. - Vol.32.1. P.353-359.

160. Norby H.E., Yelenovsky G. Relationship of baf fatty acids to cold hardening of citues seedlings // Plant Physiology. 1982. - № 1. - P. 132-135.

161. Ketchie D.O., Bervaes J.C.A.M., Kuiper P. J.C. Lipid composition of pine needle chloroplasts and apple bark tissue as affected by growth temperature and daylength changes. 1. Phospholipids // Physiol. Plant.- 1987. Vol.71. - № 4. -P.419-424.

162. Бергельсон Л.Д. Мембраны, молекулы, клетки. М.: Наука, 1982. - 182с.

163. Сулаберидзе К.В., Тушишвили Л.Ш., Пасешниченко В.А. Содержание и состав стеринов с листьях цитрусовых растений и их связь с морозоустойчивостью // Физиология растений. 1989. - Т.36. - Вып.6. - С. 1192-1198.

164. Sikorska Е., Farkas Т. Sterols and frost hardening of winter rape // Physiol. Plant. 1982. - Vol.56. - № 3. - P.349-354.

165. Оканенко А.А. Влияние низких температур на содержание некоторых фракций липидов в однолетних побегах различных по морозоустойчиво-стисортов яблони // Физиология и биохимия культурных растений. 1974. -Т.6.-№5.-С.553-554.

166. Сергеева К.А., Дусеева Ф.А. Сезонный ритм фосфорноорганических соединений у сосны обыкновенной // Проблемы физиологии и биохимии древесных растений. Вып.1. Метаболизм и его регуляция. Красноярск, 1974.- С.104-110.

167. Габукова В.В. Сезонные и суточные изменения фосфорных соединений в хвое сосны обыкновенной // Физиолого-биохимические исследования сосны на Севере. Петрозаводск, 1978. - С.73-96.

168. Лишко В.К., Шевченко М.И. Мембраны и жизнь клетки. Киев: Наук, думка, 1987. - 104с. |

169. Heber U. Freezing injury in relation to loss of enzyme activities and protection against freezing // Cryobiology. 1968. - Vol.5. - № 3. - P.188-201.

170. Рубчевская Л.П., Девятловская А.Н., Репях С.М. Некоторые аспекты метаболизма фосфолипидов в древесной зелени лиственницы сибирской / Эколого-физиологические аспекты ксилогенеза хвойных. Материалы Меж-дунар.конф. Красноярск, 1996. -С.136-139.

171. Sutinen Marja-Liisa. Physiological changes in the needles of Pinus nigra and Pinus resinosa with seasonal changes in freezing stress resistance // Acta Univ Ouluen. A. 1992. - № 240. - P.l-39.

172. Sutinen M.L.K., Palta J.P. Changes in fatty acid composition and plasma membrane ATP-ase activity in pine needles // Amer. Soc. Argon Annu. Meet. -Madison, 1991,-P.135.

173. Фуксман И.Л., Комшилов Н.Ф. Сезонная динамика липидов смол древесины сосны // Химия древесины. 1980. - № 6. - С.90-101.

174. Фуксман И.Л., Саукконен А.А., Степанов А.А. Динамика жирнокислот-ного состава липидов почек сосны обыкновенной в связи с ее ростом // Химия древесины. 1987. - № 6. - С.89-93.

175. Левин Э.Д., Рубчевская Л.П., Вол Е.В. Глицериды и фосфолипиды камбиальной зоны лиственницы сибирской // Химия древесины. 1983. - № 4.- С.97-100.

176. Нюппиева К.А., Маркова Л .В. Адаптивные изменения в липидах листьев огурца, картофеля и овсянццы луговой при холодовом закаливании растений 11 Физиология и биохимия культурных растений. 1988. - Т.20. - № 1. -С.68-73.

177. Новицкая Г.В., Сальникова Е.Б., Суворова Т.А. Изменения ненасыщенности жирных кислот липидов растений озимой и яровой пшеницы в процессе закаливания // Физиология и биохимия культурных растений. 1990.- Т.22. № 3. - С.257-264.

178. De Yoe D.R., Browng Н. Glycerolipid and fatty acid changes in eastern white chloroplast lamellae during the onset of winter // Plant Physiol. 1979. - Vol.64.- P.924-929. ;

179. Lyons J.M. Chilling injury in plants // Annual Rev. Plant Physiol. 1973. -Vol.24.-P.445-466.

180. Singh J., De La Roche.I.A., Siminovitch D. Differential Scanning Calorimeter Analyses of Membrane Lipids Isolated from Hardened and Unhardened Black Locust Bark and from Winter Rye Seedlings // Cryobiology. 1977. - Vol.14. -P.620-624.

181. Биологические мембраны. Методы / Пер.с англ. Под ред. Дж.Б. Финдлея, У.Г. Эванда. М.: Мир, 1990. - 424с.

182. Родионов B.C. Современные методы выделения органелл и мембранных систем из клеток растений. Петрозаводск: Карельский научный центр АН СССР, 1990. - 170с.

183. Сравнительное изучение белков хлоропластов методом электрофореза в полиакриламидном геле / A.JI. Курсанов, В.И. Сафонов, С.С. Чаянова, М.В. Сафонова // Функциональная биохимия клеточных структур М. : Наука, 1970.-С.143-152.

184. Бернстейн А. Справочник статистических решений. М.: Статистика, 1968.- 162с.

185. Пижурин А.А., Розенблит M.C. Исследование процессов деревообработки. М.: Лесн. пром-сть, 1984. - 232с.

186. Бузун Г.А., Джемухадзе К.М., Милешко Л.Ф. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного // Физиология растений. 1982. - Вып.1. -С. 198-204.

187. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии: Учеб. Пособие для студентов биологических специальностей университетов. М.: Высш. шк., 1980.-272с.

188. Ornstein L. Disc electrophoresis. 1. Background and theory // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964.-Vol. 121.-P.321-349.

189. Davis B.J. Disc electrophoresis. 2. Method application to human proteins // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964. - Vol. 121. - P.404-428.

190. Практикум по физико-химическим методам в биологии. М.: Московский университет, 1976. - 300с.

191. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification//Can. J. Biochem. Physiology. 1959. - Vol.37. - P.911-917.

192. Mckillican M.E., Larose J.A.G. Residual lipids of hexane extracted repeseed meal // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1970. - Vol.47. - № 7. - P.256-258.

193. Amenta J. S. A rapid chemical method for quantification of lipid separation by thin-layer chromatography // J. Lipid Res. 1961. - № 5. - P.270-272.

194. Новицкая Г.В. Методическое руководство по тонкослойной хроматографии. М.: Наука, 1972. - 112с.

195. Исамухамедов А.Ш., Газизов Ф.Ю. Использование реагента Васьковско-го-Светашева для комплексного обнаружения фосфолипидов и при их препаративном разделении методом ТСХ // Химия природных соединений. -1988.-№ 1.-С.40-42.

196. Препаративная биохимия липидов / Л.Д. Бергельсон, Э.В. Дятловицкая, Ю.Л. Молотковский, С.Г. Батраков, Л.И. Барсуков, Н.В. Проказова. М.: Наука, 1982.-256с.

197. Флеров М.А., Зубер В.Л. Применение инфракрасной спектроскопии для изучения фосфолипидов головного мозга // Вопросы мед. химии. 1971. -Т.17. -№ 2. -С.211-216.

198. Кальве А., Пратт Э. Микрокалориметрия. Пер. с англ. М.: ИЛ, 1963. -477с.

199. Миронов П.В., Левин Э.Д. Переохлаждение и обезвоживание хвойных зачатков в зимующих почках лиственницы сибирской // Физиология растений. 1985. - Вып.4. - С.695-700.

200. Калориметрические методы измерения теплот адсорбции газов и паров и теплоемкости адсорбционных систем // Экспериментальные методы в адсорбции и молекулярной хроматографии. М.: Изд. МГУ, 1973. - С. 133135.

201. Rasmussen D.N., Makkenzie А.Р. Effect of soluté on ice-solution interfacial free energy: Calculation from measured homogeneous temperatures nucleation // Water Structure at the Water Polymer Interface. N.Y.: Plénum Press, 1972. -P.126-145.

202. Пасичный A.B., Пономарева И.Д., Цепков Г.В. Анализ процесса льдообразования в тканях разных по морозоустойчивости древесных растений // Физиология и биохимия культурных растений. 1980. - Т. 12. - № 5. -С.548-552. !

203. Товбин М.В., Будерская Г.Г. О механизме кристаллизующего действия твердых веществ на переохлажденные водные аэрозоли. //Физика аэродисперсных систем. 1969. - Вып.1. - С.75-78.136

204. Ситнянская Н.П., Мартын Г.И. Онтогенез липидных тел конуса нарастания древесных растений // Докл. АН УССР. Сер.Б. геол., хим. и биол. науки. 1986.-№8.-С.79-81.

205. Вол Е.В., Левин Э.Д. Методика выделения фосфолипидов из камбиальной зоны лиственницы сибирской и определение их группового состава // Химия древесины. 1984. -№ 1. - С.99-101.

206. Lennars W.S. Lipid Metabolism // Ann. Rev. Biochem. 1970. - Vol.39. -P.359-388.

207. Иошида С. Распад фосфолипидов при замерзании растительных клеток // Холодостойкость растений /Пер. с англ. Под ред. Г. А. Самыгина. М.: Колос, 1983- С.97-111.

208. Фуксман И. Л., Степанов A.A. Расщепление фосфолипидов летней хвои сосны обыкновенной при промораживании //Химия древесины. — 1986. — №3. С.100-103.138