автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.17, диссертация на тему:Разработка приборов для определения показателей системы гемостаза и их внедрение в клиническую практику

Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники

На правах рукописи

Кутепов Максим Владимирович

РАЗРАБОТКА ПРИБОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА И ИХ ВНЕДРЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКУЮ

ПРАКТИКУ

Специальность 05.11.17 «Приборы, системы и изделия медицинского назначения»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в ГУН «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат физико-математических наук А.Н. Шибанов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор физико-математических наук, профессор СВ. Селищев кандидат физико-математических наук B.C. Антонов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ЗАО «ВНИИМП-ВИТА» (НИИ медицинского приборостроения) РАМН

Защита диссертации состоится Щ€>НА. в 10-00 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ208.001.01 при ГУН «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» МЗ и СР РФ по адресу: 129301, г. Москва, ул. Касаткина, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУН ВНИИИМТ.

Автореферат разослан

2005 г.

Ученый секретарь регионального диссертационного совета ДМ208.001.01, кандидат технических наук

Козловский

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что гемостаз - остановка кровотечения, основанная на естественных физиологических процессах свертывания крови и сужения поврежденных кровеносных сосудов, является защитной реакцией, предохраняющей организм от кровопотери.

В связи с увеличением числа заболеваний, связанных с системой гемостаза, проблема диагностики свертывающей системы крови является актуальной. Большое количество людей имеют факторы риска, обусловленные генетическими дефектами (наследственные нарушения) отдельных звеньев гемостаза. В обычных условиях дисбаланс компонентов свертывающей системы может не проявиться, но в условиях оперативного вмешательства или бесконтрольно назначенной терапии риск тяжелых осложнений у таких пациентов многократно возрастает. Выявление факторов риска у разных групп пациентов и принятие соответствующих профилактических мероприятий позволяет избежать тяжелых осложнений.

По этим причинам значимость анализа показателей системы гемостаза признана высокой во всем мире. Различные исследования свертывающей системы крови выполняются практически в любой клинико-диагностической лаборатории (КДЛ).

Статистика Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) на основе обработки результатов исследований проведенных лабораториями показывает, что сегодня подавляющее большинство российских КДЛ выполняют исследования системы гемостаза с помощью унифицированных коагулологических методик: определяется протромбиновое время (ПВ), активированное частично тромбопластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ), концентрация фибриногена. Часто для проведения анализа свертывающей системы крови в нашей стране лаборатории пользуются следующими методиками: время свертывания по Сухареву, Ли - Уайту, а определение концентрации фибриногена проводят по весовому методу Рутберга. Спектр исследований не выходит за рамки 3-х тестов, а сами исследования

до сих пор проводятся с использованием секундомеров и водяных бань (термостатов). В связи с этим многие исследователи отмечают недостаточную точность определения параметров системы гемостаза.

Таким образом, разработка современных приборов для экономичного и диагностически надежного определения параметров системы гемостаза в условиях КДЛ различного уровня, а также решение задачи повышения точности, увеличения производительности и снижения стоимости выполнения коагулологических анализов являются востребованными и необходимыми для клинико-диагностических исследований.

Цель. Разработка современных приборов для экономичного и надежного определения параметров системы гемостаза в условиях КДЛ различного уровня и их внедрение в клиническую практику.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

1.Проведение анализа современного состояния методов исследования системы гемостаза и применяемых технических решений в используемых приборах в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ).

2. Определение требований к анализаторам свертывающей системы крови, методическому обеспечению, расходным материалам для оптимального обеспечения современных потребностей ЛПУ.

3.На основе проведенного анализа разработать:

- математическую модель определения параметров системы гемостаза при проведении калибровки для создания более совершенного прибора для исследования свертывающей системы крови в КДЛ;

- унифицированные модули для построения анализаторов свертывающей системы крови с целью применения в условиях КДЛ различного уровня и подготовить приборы к серийному производству.

4. Разработать технические решения, в том числе конструкцию одноразовых кювет, обеспечивающие качественные исследования системы гемостаза с применением отечественных реагентов.

Научная новизна. Разработаны коагулометры, не имеющие аналогов, с комбинированным оптико-механическим принципом регистрации фибринового сгустка и уменьшенным объемом биопробы 35-50 мкл, позволяющие проводить анализ цельной крови или плазмы в различных разбавлениях и расширить спектр проводимых исследований свертывающей системы (заявка на изобретение по сущ. № 200331723, №2004129084).

Научно обоснованы технология нанесения силиконового покрытия на стальные шарики и введение шероховатости внутренней поверхности в одноразовых кюветах для проведения коагулологиче-ских исследований, что обеспечивает повышенную точность и надежность регистрации образования фибринового сгустка.

Построена математическая модель определения параметров системы гемостаза при проведении калибровок, позволившая оценить возможные погрешности при пересчете результатов измерений, и разработать, включая экспериментальную оптимизацию, улучшенный алгоритм проведения калибровок.

Практическая иенность. Разработаны унифицированные модули и на их основе построены два программируемых прибора для исследования показателей системы гемостаза различного назначения: АПГ4-01-«МИНИЛАБ-704», ТУ 9443-003-598798152004 - 4-х канальный высокопроизводительный анализатор показателей гемостаза со встроенным принтером для КДЛ средних и крупных больниц и АПГ2-01-М-«МИНИЛАБ-701-М», ТУ 9443-01511254896-2004 - 2-х канальный анализатор показателей гемостаза для поликлиник, мелких больниц и экспресс-лабораторий, позволяющие проводить анализ с уменьшенными объемом пробы и расходом реагентов в 2-3 раза. Анализаторы позволяют снизить количество методических ошибок при подготовке и измерении биопроб, упростить выполнение рутинных операций и повысить

производительность труда в КДЛ при выполнении коагулологических исследований и существенно снизить их стоимость. Коагулометры серийно выпускаются на производственной базе ООО «Эйлитон» (г. Москва).

Освоена технология применения шариков из стали марки ШХ15, покрытых силиконом в кюветах для проведения коагулоло-гических исследований, позволившая значительно упростить конст-• рукцию кювет и снизить их стоимость более чем в 4 раза. Разработан диспенсер для дозирования шариков в кювету перед проведением коагулологического исследования (свидетельство на полезную модель №200331723), в настоящий момент серийно выпускающиеся на производственной базе ООО «Эйлитон» (г. Москва).

Разработаны одноразовые кюветы (с шероховатыми участками поверхностей) для проведения коагулологических измерений с повышенной воспроизводимостью (свидетельство на полезную модель №2004129084). Кюветы в настоящий момент серийно выпускающиеся на производственной базе ООО «Эйлитон» (г. Москва).

Внедрение. Разработанные анализаторы внедрены в серийное производство ООО «Эйлитон» (г. Москва). Произведено 35 коа-гулометров, которые поступили в КДЛ лечебно-профилактических и научных учреждений страны.

Основные научные положения, выносимые на защиту.

1. Математическая модель определения параметров системы гемостаза при проведении калибровок, позволившая оценить возможные погрешности при пересчете результатов измерений, и разработать, включая экспериментальную оптимизацию, алгоритм проведения калибровок.

2.Результаты исследований и разработка одноразовых кювет, обеспечивающих уменьшенные объемы пробы и реактивов, повышенную точность и надежность определения параметров системы гемостаза и обладающих низкой стоимостью.

3.Результаты оптимизации конструкции и алгоритма работы анализатора для исследования системы гемостаза, разработка

диспенсера для дозирования шариков перед проведением коагулологического исследования.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались и обсуждались на следующих научных конференциях:

1.8-ая Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и инфор-матика-2001», МИЭТ, Москва, 18-19 апреля 2001г.;

2.11-я Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и инфор-матика-2004», Москва, МИЭТ, 21-23 апреля 2004г.;

З.П Всероссийская научная конференция «Клиническая ге-мостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва, 2-4 февраля 2005г.

Публикации. По теме опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах, включает введение, аналитический обзор, решение задачи по разработке измерительной ячейки и кюветы с уменьшенным объемом пробы, решение задачи по разработке программных средств анализаторов свертывающей системы крови, решение задачи по разработке и подготовке к серийному производству анализаторов показателей гемостаза и результаты медицинских испытаний разработанных изделий, выводы, заключение и практические рекомендации. Литературный указатель включает 164 источника информации. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 47 рисунками.

Диссертация содержит следующие главы:

1. Обзор современных методов и технических средств для исследования системы гемостаза.

2. Разработка измерительной ячейки и кюветы с оптимизированной геометрией.

3. Алгоритмы работы и программное обеспечение анализаторов показателей системы гемостаза.

4. Разработка, испытания и подготовка к серийному производству серии анализаторов.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и основные задачи работы, представлены научные положения, выносимые на защиту.

Первая глава диссертации содержит обзор методов и средств исследования системы гемостаза. Рассмотрены физические основы функционирования анализаторов свертывающей системы крови, дана их классификация. На основе проведенного анализа существующих приборов сформулированы требования к современным анализаторам и обоснована актуальность разработки и внедрения в лабораторную практику нового прибора для исследования показателей системы гемостаза. На основании обзора данных литературы сделан ряд выводов:

1 .Сравнительный анализ публикаций по методам и приборам для исследования системы гемостаза показал, что комбинированные приборы с возможностью определения момента свертывания как оптическим, так и механическим методом, наиболее полно отвечают современным требованиям и являются наиболее перспективными для использования в рутинной клинической практике.

2.В отечественном здравоохранении внедрение анализаторов с улучшенными потребительскими характеристиками вместо применяемых повсеместно устаревших ручных методов, сдерживается высокой стоимостью импортных коагулометров и расходных предметов к ним (кювет и шариков), а также высокой стоимостью наборов реагентов. Измерения проводятся с использованием водяных бань и секундомеров, в результате отмечается низкая точность проводимых коагулологических исследований.

3.Современный прибор должен обеспечивать экономное расходование реагентов и биологического материала (плазмы и крови), при обеспечении высокой точности и воспроизводимости получаемых результатов. Общепринятым в коагулологии является объём пробы 100 мкл. На момент начала работы в России не существовало коагулометра, на котором можно было качественно и быстро выполнять коагулологические исследования с уменьшенным объемом пробы (менее 100 мкл).

4. Конструкция, материалы и размеры расходных предметов (кювет и шариков) для коагулометрического исследования должны обеспечивать их низкую стоимость для обеспечения экономичности проведения исследований.

5. Для обеспечения потребностей лабораторий разного уровня - от поликлиник и экспресс-лабораторий до крупных больниц целесообразно применение серии приборов одинакового технологического уровня с возможностью определения как базовых [ПВ (% по Квику), АЧТВ, ТВ, определение концентрации фибриногена по Клауссу], так и расширенных (определение активности факторов VIII, IX, антитромбина Ш, системы протеина С и пр.) коагулологи-ческих параметров в исследуемых пробах, с одинаковыми расходными материалами и однотипным управлением прибором, но с разной производительностью. Наиболее целесообразно использование 2-х канального прибора в лабораториях с небольшим количеством анализов и 4-х канальных приборов для лабораторий со средней загрузкой с возможностью автоматизации ввода, вывода и сохранения данных.

6.Из общих выводов, изложенных в главе, следует заключение о необходимости разработки приборов с более высокими техническими характеристиками по сравнению с отечественными и импортными аналогами для экономичного и надежного определения параметров системы гемостаза в условиях КДЛ средних и крупных больниц. По своим потребительским характеристикам они должны превосходить все существующие аналоги, имея при этом более низкую стоимость на отечественном рынке медицинской лабораторной техники, что позволит им быть

доступными любой КДЛ. Их внедрение позволит создать предпосылки для расширения спектра выполняемых коагулологических анализов в отечественных КДЛ.

7.Ряд параметров приборов не может быть определен из анализа литературных данных, так для построения приборов необходимо:

- определить необходимость перемешивания реакционной смеси в ходе реакции свертывания (выпускаются приборы с перемешиванием реакционной смеси и без перемешивания - в ряде полуавтоматических и автоматических анализаторов);

- выбрать источник оптического излучения для регистрации изменения светопропускания исследуемой пробы при коагуляции;

- определить допустимый объем исследуемой биопробы для проведения точных коагулологических измерений;

- оценить влияние загрязнений и определить допустимые размеры шероховатости поверхностей кюветы при проведении измерений;

- определить требования к материалу и размерам используемой мешалки (шарика).

Вторая глава посвящена решению задачи разработки и оптимизации измерительной ячейки и микрокюветы для анализатора свертывающей системы крови.

В рамках работ по разработке ячейки и микрокюветы 1) осуществлен выбор источника излучения, используемого для регистрации изменения светопропускания биопробы при коагуляции; 2) установлена необходимость перемешивания реакционной смеси; 3) подтверждено влияние повторного использования кювет при проведении коагулологических исследований даже при последующей обработке в ультразвуковой ванне; 4) показана возможность использования в качестве расходных предметов (мешалок) шариков из стали марки ШХ15 с силиконовым покрытием; 5) проведено исследование влияния шероховатости стенок кюветы на результаты коагулологических исследований и определены оптимальные величины параметров

шероховатости поверхностей кюветы при проведении измерений; 6) определен минимальный объем пробы для выполнения точных коагулологических исследований; 7) изготовлены и опробованы опытные образцы измерительной ячейки и микрокювет; 8) разработан диспенсер для дозирования шариков в кювету перед проведением коагулологического исследования.

Анализатор должен выполнять измерения в оптических кюветах (как правило, для коагулологических исследований кюветы изготавливаются из оптически прозрачного полистирола). Одним из существенных факторов, ухудшающих точность фотометрирования, является фоновая «засветка», характеризующаяся дневным и искусственными модулированными потоками света с частотой 50-100 Гц. Влияние данного фактора в классической оптической схеме снижают за счет установки «обрезающих» светофильтров на оптической оси непосредственно перед фотоприемником.

При разработке анализатора свертывающей системы крови в качестве источника оптического излучения для регистрации изменения светопропускания исследуемой биопробы при коагуляции целесообразно использовать светодиоды ИК диапазона с длиной волны излучения 860-870нм. Применение ИК светодиодов обладает рядом преимуществ:

- отсутствует влияние фоновой «засветки» фотоприемника (достаточно применение диафрагмы или коллимирующего канала);

- простота конструкции измерительной ячейки (отсутствие дорогостоящих светофильтров);

- нет жесткого ограничения на прозрачность кювет (возможно применение кювет из дешевых материалов: полипропилена и полиэтилена)

- снижение стоимости устройства и кювет.

В ряде полуавтоматических и автоматических коагулометров отсутствует перемешивание реакционной смеси (пробы и реагента) в ходе реакции свертывания. В связи с этим, исследована необходимость перемешивания реакционной смеси. Эффективность перемешивания исследована на примере теста фибриноген по Клауссу с применением взвеси каолина (0,25 мг/мл) и образцов

плазмы с концентрацией фибриногена 3-6 г/л, что позволяет наиболее четко отследить динамику перемешивания пробы и реагента при коагуляции.

Исследования, проведенные на опытном образце измерительной ячейки АПГ4-01, показали, что при уменьшенном объеме реакционной смеси (за счет уменьшенных размеров кюветы и шарика) удается обеспечить качественное размешивание пробы и реагента за время Т = 2,0 ± 0,3 с (дня АГТТ2-01 -«МИНИЛАБ-701» - 4,0 ± 0,5 с). Таким образом, при использовании оптического метода регистрации, минимальным регистрируемым временем свертывания для АПГ4-01 является величина 3-4 с (для современных оптических коа-гулометров это время составляет 6-7 с), что наиболее важно для проб с содержанием фибриногена > 4,5 г/л (время свертывания составляет 5-7 с).

Изучено изменение светопропускания (оптической плотности) при использовании перемешивания и при его отсутствии. Эксперимент показал, что при перемешивании реакционной смеси амплитуда изменения оптической плотности при коагуляции и скорость ее изменения существенно больше, чем без перемешивания. По-видимому, в отсутствии перемешивания, неоднородность реакционной смеси в измерительной кювете обуславливает менее резкое изменение светопропускания за счет не синхронного прохождения реакции по всему объему кюветы, что способствует изменению скорости протекания реакции.

Полученные данные, позволяют утверждать, что перемешивание позволяет повысить точность, правильность регистрации момента коагуляции, повысить чувствительность метода оптической регистрации фибринового сгустка, особенно это касается исследования сильно разведенных (при построении калибровок) или патологических плазм.

Из-за недостаточного финансирования в ряде отечественных КДЛ используют одноразовые кюветы к коагулометрам повторно. Показано, что при повторном использовании расходных предметов (кювет и шариков) ухудшается точность проводимого исследования

- СУ > 6%, в то время как при применении одноразовых кювет коэффициент вариации снижается в 2-4 раза (таблица 1).

Таблица 1.

Результаты измерений ПВ при повторном использовании кювет с

Кюветы многоразовые одноразовые

% по КВИ^ 100 50 25 100 50 25

Среднее значение, с 16 5 30 5 62,9 16.3 30,2 63,3

СТ, % <6,3 <8.4 <7,5 <1,7 <2.8 <33

При разработке конструкции новой кюветы преследовалась следующие задачи: 1) повышение качества коагулологического исследования, 3) снижение стоимости расходных предметов, 2) увеличение производительности труда и повышение уровня безопасности проведения коагулологических анализов в КДЛ.

В кюветах для анализатора АПГ2-01-«МИНИЛАБ-701» было предложено отказаться от использования стопорного элемента (перегородка-фиксатор), т.к. в оптико-механических приборах (АПГ2-01) в случае работы с разведенной плазмой или при исследовании проб с малым содержанием фибриногена имеется возможность использования оптического метода регистрации, в

Перегородка-

/ фиксатор

Рис. 1 Модифицированная кювета

отличие от механического коагулометра «ЭМКО-02», в котором ранее использовались кюветы со стопорным элементом (рис. 1, кювета слева).

Для удешевления кюветы было предложено использовать шарики не из стали марки 95X18, а из стали ШХ15 с инертным покрытием (рис. 1, кювета справа).

Использование покрытия необходимо для устранения возможных артефактов, связанных с влиянием поверхности шарика из стали (контакт с пробой) на процесс коагуляции, при проведении измерений, а также для обеспечения возможности хранения обезжиренных шариков без специальных предосторожностей (предотвращение коррозии).

В качестве такого покрытия опробованы покрытия на основе различных силоксановых жидкостей [Пента-107 (толщиной 3-5 мкм), ПМС-10 (толщиной 0,8-1,2 мкм)].

Экспериментально установлено, что шарики из стали ШХ15 и силиконы типа Пента-107 и ПМС-10 не оказывают существенного влияния на процесс коагуляции (СУпв < 4%, Впв < 1%; СУдчтв < 1,7%, Вдчтв < 1,3%), т.е. их применение в одноразовой кювете возможно (таблица 2).

Таблица 2.

Результаты измерений ПВ, АЧТВ при применении силиконов Пента-

107 и ПМС-10 в качестве ин ертного по] шытия ш 1ариков из стали ШХ15

Шарик (силикон) 95X18 (нет) 111X15 (нет) ШХ15 (Пента-107) ШХ15 (ПМС-10)

Тест ПВ

Время свертывания <Х>, с 15,3 15.2 15.1 15.2

Коэффициент вариации СУ, % 1,12 1,63 1,57 132

Правильность В. % 0.65 0,68 0,76 0,62

Тест АЧТВ

Время свертывания <Х>, с 34,0 33,9 34,3 33,8

Коэффициент вариации СУ, % 3,24 3,64 4,02 3,43

Правильность В, % 0,87 1,22 1,05 0,92

Получены данные, позволившие утверждать, что переход на кюветы нового образца не ухудшает воспроизводимость, а вместе с тем и качество проводимого анализа (таблица 2). Разработана технология силиконирования шариков. Благодаря более простой технологии силиконирования предпочтение было отдано силикону ПМС-10. Силиконирование осуществляется путем дозированного введения раствора ПМС-10 в емкость с шариками с последующим перемешиванием.

При повторном использовании кювет присутствие царапин на их боковой поверхности увеличивает рассеяние излучения на границе раздела воздух-кювета или кювета-биопроба в зависимости от расположения дефектов (внутренняя или внешняя поверхность), что отрицательно сказывается при измерении оптической плотности исследуемой пробы - снижается интенсивность принимаемого сигнала фотоприемником, а, следовательно, и чувствительность анализатора и точность проводимого исследования. Опытным путем установлено, что шероховатость боковой поверхности кюветы должна быть не более

Таблица 3.

Результаты измерений ПВ, АЧТВ при исследовании влияния _шероховатости поверхности кюветы

Шероховатость (Я, / ЯД чкм | 0.2/0,8 | 0,8/3.2 | 3,2/12.5 | 12.5/50 | 50/200

ПВ

Плазма нормальная

Среднее время свертывания <Х>, с 16 0 16.0 15,9 16,1 15,8

Коэффициент вариации (СУ), % 1,38 1,45 1,13 2.87 4.72

Правильность (В), % 0 0 0,63 0,63 1,25

Плазма патологическая

Срелнее время свертывания <Х>, с 24.0 24,1 23,7 23,9 23,6

Коэффициент вариации (СУ), % 3,14 2,97 1,76 3,52 6,53

АЧТВ

Плазма нормальная

Среднее время свертывания <Х>, с 31,1 31,5 30,8 32.0 29.8

Коэффициент вариации (СУ), % 1,87 1,83 1,65 3,63 6,86

Правильность (В), % 0,82 1,01 1,28 2.56 4,49

Определены оптимальные величины параметров шероховатости поверхностей кюветы при проведении измерений. Результаты измерений в тестах ПВ и АЧТВ представлены в таблице 3. Исследование показывает приемлемую точность определения ПВ и АЧТВ (СУщз < 4,72%, СУАЧТВ < 6,86%). Анализ полученных результатов показывает, что оптимальным выбором (СУпв<1,13%, Впв < 0,63%; СУАЧТВ < 1,65%, ВАЧтв < 1,28%)является использование кювет с шероховатостью внутренней поверхности дна с параметрами -

Опытным путем установлены размеры шероховатости внутренней поверхности дна одноразовой кюветы

мкм для проведения точных измерений (таблица 4). Полученные данные показывают, что применение кювет с шероховатостью на дне позволяет повысить точность исследования, как при серийных измерениях, так и при проведении калибровки (СУ < 2%).

Таблица 4.

Результаты измерений ПВ (% по Квику) при применении _модифицированных кювет__

% по КВИКУ 100 50 25

Кювета стандарт шерх. стандарт шерх. стандарт шерх

<Х>,с 14,8 14.6 23.0 22,9 42.5 41,9

СУ. % < 1,42 <1,08 <2,14 <0.61 <6.17 <1,84

Примечание:

шерх. - кювета с шероховатостью на внутренней поверхности дна 3,5; 6,3 мкм

На основе результатов экспериментов разработана кювета нового образца для анализатора АПГ2-01-«МИНИЛАБ-701» с шероховатыми участками внутренней поверхности дна 6,3 мкм и с шариком из стали марки ШХ15, покрытым силиконом ПМС-10. Разработка одноразовых расходных предметов (свидетельство на полезную модель №2004129084, 2004г) позволилаповыситьточность проводимого исследования;

- снизить стоимость расходных предметов (отсутствие перегородки-фиксатора и применение шариков из стали марки ШХ15, покрытых силиконом ПМС-10, позволяет снизить стоимость кювет более чем в 4 раза);

- обеспечить надежность результатов измерений (отсутствие ошибок, связанных с недостаточно хорошо отмытыми кюветами, что может активировать процесс коагуляции и вызывать получение неверных результатов, вызывать досрочную остановку шарика за счет неровной или неправильно зафиксированной перегородки, механических частиц внутри кюветы и пр.);

- повысить уровень безопасности проведения анализов (снимается необходимость в мытье кювет).

Не всегда удается получить достаточно большое количество плазмы (крови) пациента, что приводит к ограничению количества выполняемых исследований в лаборатории и, соответственно, снижает эффективность диагностики нарушений системы гемостаза. При разработке кюветы для анализаторов АПГ4-01 поставлена

задача по определению минимального объема пробы при выполнении коагулологического исследования. В таблицах 5-8 представлены результаты измерений в тестах ПВ, определение . фибриногена по Клауссу, АЧТВ и ТВ с уменьшенными объемами пробы и реагента

Исследование показало возможность уменьшения объема плазмы с общепринятых в коагулологии 100 мкл (АПГ2-01-«МИНИЛАБ-701») до 25-30 мкл (АПГ4-01). Наименьшим объемом пробы для АПГ4-01 без значительного ущерба для точности и воспроизводимости и достаточной чувствительности для тестов ПВ (% по Квику), АЧТВ следует считать объём - 35 мкл (СУпв < 3,5%, СУдта < 3,5%, В < 1,9%), для ТВ - 25 мкл (СУ < 1,8%), а для теста фибриноген по Клауссу - 70 мкл (СУ < 2,2%).

Таблица 5.

Результаты измерений ПВ с уменьшенным объемом пробы_

% по КВИКУ 100 50 25

Объем пробы, мкл 50 35 30 50 35 30 50 35 30

.<Х >, с 16,0 16,3 15,5 28.9 29,7 27,5 70,9 68,9 65,7

В,% 0 1.9 3,1

СУ, % 1,1 3,0 3,5 12 3,5 2,3 2,1 3,5 5,4

Результаты измерений при определении конце Клауссу с уменьшенным объемом п Таблица 6. нтраци и фибриногена по робы

Концентрация фибриногена, г/л 5,0 2,5 1,675 1,25

Объем плазмы, мкл 100 70 100 70 100 70 100 70

<Х>, с 8,3 8.4 15,8 15,6 22,3 21,5 30,3 29,8

СУ, % 0,9 1,1 0,5 1,2 0,2 2,2 0,2 1,9

Результаты изм ¡рений АЧТВ с у Таблица 7. меньшенным объемом пробы

Объем пробы, мкл 50 35 25

<Х > с 32.0 32,1 32,6

В,% 1,6 1,9 3,5

СУ, % 0,8 1,8 3,6

Результаты измерений Т Таблица 8. 5 с уменьшенным объемом пробы

Объем пробы, мкл 50 35 30 25

<Х>,с 15.8 15,7 16,0 15,9

СУ, % 1,0 2,1 1,8 1,8

Экспериментально показана нецелесообразность

дальнейшего уменьшения объемов биопробы (плазмы или крови) и реагента.

В качестве оптимального объема для работы на анализаторе АПГ4-01 с высокой точностью рекомендуется использовать объем биопробы 50 мкл.

В завершении главы представлены результаты сравнительных исследований АПГ4-01-«МИНИЛАБ-704» (объем пробы 50мкл) и АПГ2-01-«МИНИЛАБ-701» (объем пробы 100мкл), позволяющие заключить, что уменьшение объема не ухудшает качество проводимых исследований.

На рис. 2 и 3 представлены корреляционные зависимости измерений времени свертывания на АПГ4-01 и АПГ2-01 в тестах ПВ, АЧТВ. Как видно из графиков, результаты измерений практически совпадают при

сравнении работы ДВУХ коагулометров проведенных с применением опытного образца

АПГ4-01-«Минилаб-704» и анализатора АПГ2-01-(отмечена высокая «Минилаб-701»

корреляционная

зависимость между рядами выборок, г = 0,99).

Таким образом, проведенные исследования показывают, что конструкция измерительной ячейки АПГ4-01 дает возможность получения точных и достоверных результатов с уменьшенным объемом пробы.

Уменьшение расхода реагентов (в 2-4 раза по сравнению с обычно используемым в коагулологии объемом) на одно исследование снижает стоимость анализов и тем самым

Рис. 2 Корреляционная зависимость измерений ПВ,

способствует более широкому внедрению современных коагулологических исследований в практику КДЛ всех уровней.

На основе потребительских требований к

анализатору и

результатов исследований для анализатора АПГ4-01 разработана микрокювета и опытный образец измерительной ячейки для

проведения коагулологических

измерений с

образца АПГ4-01-«Минилаб-704» и анализатора объемом пробы 25-АПГ2-01-«Минилаб-701» 50 МКЛ ПОЛНЫЙ

объем кюветы

составляет 200мкл.

Для организации движения шарика выбрана система привода шарика вращающимся магнитным полем, аналогичная анализатору АПГ2-01-«МИНИЛАБ-701». Опытным путем установлено, что для осуществления качественного перемешивания реакционной смеси и регистрации кругового движения шарика оптическим способом в микрокювете оптимальным является применение шарика 0 2,5мм.

При конструировании измерительной ячейки анализатора АПГ4-01 оптимально выбрано расположение датчиков движения шарика. Датчики закрыты защитным стеклом, что обеспечивает при необходимости очистку и дезинфекцию измерительного отверстия, в которое помещается кювета.

Шарик в кюветы нового образца должен опускаться непосредственно перед проведением анализа. Для решения этой задачи разработан специальный диспенсер - дозатор для поштучной

у- 2801 ♦ 10725- х г * 0 99623

Время свертывания в

АЛГ4-01

Рис. 3 Корреляционная зависимость измерений АЧТВ, проведенных с применением опытного

выдачи шариков, представленный на рис. 4 (свидетельство на полезную модель №200331723, 2003г). Шарик выдается диспенсером в канал дозирования (5) по нажатию кнопки (2). Ёмкость диспенсера составляет 400-1000 шт и зависит от диаметра используемых шариков.

Особенность устройства состоит в том, что центры шариков, включая шарик фиксатора (6) и отверстие (4) в пластинчатом толкателе (3), расположены в узлах решетки плотнейшей упаковки шариков в плоскости, располагаемой в пазу подготовки шариков к дозированию (1). Причем дно паза расположено под углом 60° к толкателю. Пластинчатый толкатель имеет толщину Б <0,7*с1 (где (I -

диаметр применяемых шариков), чтобы геометрия расположения шариков не нарушалась при движении толкателя.

Работа с диспенсером шариков проста - не сложнее, чем с обычной пипеткой. И, что немало важно имеет невысокую стоимость.

Рис.4 Диспенсер для шариков

дозатор для шариков

Третья глава посвящена анализу алгоритма выполнения коагулологического исследования и разработке программного обеспечения анализаторов показателей системы гемостаза.

В рамках работ по разработке программного обеспечения: 1) разработаны алгоритмы управления и программирования анализатора, 2) решена важная задача обеспечения удобства работы с прибором: минимизировано количество клавиш управления, структурирована выводимая на индикатор и встроенный термопринтер информация, 3) разработаны удобные способы

отображения результатов измерений и служебной (вспомогательной) информации; 4) разработан улучшенный алгоритм проведения калибровок при проведении измерений.

Проведен структурный анализ выполнения коагулологического исследования, позволивший разработать универсальный алгоритм работы на анализаторе.

Построена математическая модель процедуры построения калибровки при определении параметров системы гемостаза, позволившая оценить возможные погрешности при пересчете результатов измерений и осуществить оптимальный выбор метода интерполяции (рис. 5), где х, - измеренное время свертывания биопробы при известной активности или концентрации допустимая ошибка при измерении времени свертывания биопробы, - допустимая ошибка пересчитанного результата по калибровочному графику.

Рис. 5 Математическая модель процедуры построения калибровки при определении параметpoв системы гемостаза

Численное моделирование дало обоснование того, что метод взвешенных наименьших квадратов (МВНК) наиболее пригоден для использования при проведении калибровок.

Разработан улучшенный алгоритм проведения калибровок на основе МВНК, позволяющий повысить точность при определении параметров системы гемостаза: определение протромбинового времени по Квику, концентрации фибриногена по Клауссу, активности фактора VIII, IX и антитромбина III и пр.

Результаты численного моделирования позволяют ввести простой критерий качества калибровочного графика по разбросу (в %) измеренного времени свертывания, вызванного случайными ошибками при проведении измерений:

(1)

где парные измерения времени свертывания одной и

той же исследуемой пробы.

При этом дополнительно необходимо контролировать монотонность калибровочного графика. Тем самым, устанавливая разброс для парных измерений (измерений в дубле), при проведении калибровки анализатор автоматически осуществляет контроль качества и не позволяет лабораториям пользоваться «плохим» графиком. В связи с эти в программ}' анализатора введено сообщение-подсказка («Калибровка недействительна»),

указывающее на некачественный график и требующее от лаборанта устранения ошибок или проведения новой калибровки.

Разработан алгоритм функционирования коагулометра и его пользовательский интерфейс (программное обеспечение), в которых реализованы общие потребительские требования:

1. Обеспечение возможности контроля рабочих сигналов и изменения базовых параметров коагулометра. Указанные процедуры необходимы при производстве и сервисном обслуживании анализаторов.

2. В коагулометре реализованы три режима работы:

2.1. пользовательский режим является основным рабочим режимом для определения параметров системы гемостаза;

2.3. режим калибровки, предназначенный для установки ключевых параметров коагулологических методик (вид биопробы, метод регистрации, время предварительного прогрева, различных калибровочных значений и коэффициентов);

2.2. сервисный режим предназначен для настройки и контроля ключевых параметров функционирования коагулометра (настройка параметров измерения, температуры, контроль рабочих сигналов).

Разработано эргономичное (с интуитивно понятным интерфейсом, не требующем обучения лаборанта) программное обеспечение, включая алгоритм проведения калибровки на основе МВНК и прикладную программу для связи с персональным компьютером, для анализатора АПГ4-01.

Предложены пути дальнейшего улучшения потребительских характеристик программного обеспечения: доработка прикладного программного обеспечения, обеспечивающего связь с персональным компьютером посредством ЯБ232, организацию базы данных пациентов коагулологического обследования, ведение внутрилабораторного контроля качестве согласно нормативам ФСВОК.

Четвертая глава посвящена теоретическому обоснованию и техническому решению задачи построения и подготовки к серийному производству анализаторов показателей гемостаза, описан процесс выбора и конструирования основных узлов прибора, в том числе представлены результаты технических и медицинских испытаний коагулометров, приведены результаты сравнительных исследований применимости разработанных анализаторов, выявившие его значительные преимущества над повсеместно используемым оборудованием.

Основными требованиями к анализатору являлись высокая точность и воспроизводимость результатов измерений, эргономичность и максимально сниженная стоимость коагулометра.

В рамках работ по конструированию анализатора АПГ4-01: 1) разработана его блок-схема (рис.6); 2) разработаны унифицированные измерительные модули, позволяющие на их основе создавать устройства с разным количеством каналов измерения; 3) разработан алгоритм управления унифицированными модулями прибора; 4) выполнен выбор базовых комплектующих элементов прибора; 5) изготовлены и опробованы опытные образцы анализаторов.

В главе представлены блок-схемы работы основных узлов (модулей) анализатора, описан алгоритм их функционирования. На основе потребительских требований к анализатору, результатов

Рис. 6 Блок схема анализатора АПГ4-01

Анализатор функционирует под управлением центрального процессора модуля управления и индикации по алгоритму, занесенному в ПЗУ. Ввод данных осуществляется с помощью кнопочной клавиатуры. Вывод данных осуществляется посредством отображения измеренных (расчетных) значений, сообщений на 4-х строчный жидкокристаллический дисплей (ЖКИ), на встроенный термопринтер или на внешнее устройство при помощи RS232 интерфейса.

исследований разработки измерительной ячейки и микрокюветы выбраны корпус, индикатор, микроконтроллеры, разработана лицевая панель с пленочной клавиатурой.

При конструировании прибора решен ряд инженерных задач, таких как 1) оптимизация процесса сборки измерительного модуля из простых составных деталей; 2) разработка и крепление к ячейке платы для размещения оптико-электронных элементов; 3) оптимизация конструкции крепления ячейки к корпусу.

Разработана блок-схема измерительного модуля (рис.7)

Рис. 7 Блок схема измерительного модуля АПГ4-01 Измерительный модуль функционирует под управлением микроконтроллера по алгоритму, занесенному в ПЗУ. Согласно занесенному в ПЗУ алгоритму во время соответствующих рабочих процедур происходит постоянный опрос тех или иных фогоприемников и датчиков модуля. В зависимости от результата данного опроса система переходит в соответствующее состояние согласно алгоритму работы.

В начале цикла измерения включается узел вращения обеспечивающий стабильное круг овое движение шарика по дну кюветы при помощи вращающегося магнитного поля.

Оптичсским режим регистрации Световой поток Излучателя 1 (X = 860-870нм) проходит через диафрагму (1), которая формирует узкий зондирующий пучок и пропускает его через кювету с исследуемой пробой. Прошедший через пробу и диафрагму (2) свет фокусируется на рабочую часть Фотоприемника 1, далее сигнал поступает на Ф11Ч, а затем на АЦП (12 разр.) микроконтроллера, который регистрирует полученный сигнал светопропускания. Изменение светопропускания на запрограммированную величину свидетельствует о коагуляции пробы.

Механический режим регистрации При попадании шарика в луч света излучателей 2 и 3 (X = 940-960нм), часть светового потока отражается от его поверхности и проходит через диафрагмы (1) и (2) и далее на Фотоприемники 2 и 3 соответственно. Полученный сигнал от фотоприемников регистрируется микроконтроллером. Изменение частоты сигнала свидетельствует о замедлении или остановке вращения шарика, т.е. коагуляции исследуемого образца.

Внешний вид анализатора представлен на рис. 8. Для удобства рабош четыре кнопки управления, имеющие непосредственное огношение к программированию (меню) размещены непосредственно под индикатором.

Система управления анализатором позволяет пользователю выполнять следующие действия: 1) включат ь/выкл ючать анализатор, 2)

включать/выключать мешалку реактивов и независимый таймер, 3) выбирагь необходимый вариант анализа в пользовательском режиме, 4) осуществлять просмотр результатов в

общепринятых единицах измерения (%, ПО, MHO, г/Л, с), 5) осуществлять 2-ячейки термостатирования без таймера;

3-ячейки термостатирования с таймером; ВЫВОД результатов на 4-измерительные ячейки; встроенный термопринтер 5 - гнезда для прогрева реактивов (одно из них ИЛИ компьютер С ПОМОЩЬЮ с магнитной мешалкой); интерфейса RS232, 6) 6-передняя панель анализатора; переключаться в режим калибровки и производить установку параметров тестов.

С целью оценки конкурентоспособности разработанного анализа гора и расходных предметов по отношению к распространенному в КДЛ оборудованию проведена сравнительная оценка при использовании коагулометров: АПГ2-01-«Минилаб-701», АПГ4-01-«МИ11ИЛАБ-704», АПГ2-01-М-«МИНИЛАБ-701-М» («А/О Юнимед», Россия) и Coagulometr CL4 («Belink Elektronik», Германия).

12 3 4 5

7

Рис. 8 Внешний вид анализатора АПГ4-01 1-встроенный термопринтер,

На рис. 9

представлена корреляционная зависимость измерений в тесте ПВ при сравнении работы двух

коагулометров АПГ4-01 и CL4 фирмы Behnk Elektronik (один из лучших импортных образцов), отмечена высокая

корреляционная Рис.9 Корреляционная зависимость измерений ПВ,

проведенных с применением разработанного зависимость между анализатора АПГ4-01-«Минилаб-704» и

рядами выборок (r = анализатора CL4 (Behnk Elektronik, Германия)

0,98).

Известно, что общую стоимость проводимого коагулологического исследования можно представить в виде суммы: затраты на реактивы (величина различна в зависимости от вида исследования) плюс затраты на расходные предметы (одноразовые кюветы и шарики).

При использовании анализаторов показателей гемостаза АПГ4-01-«МИНИЛАБ-704» и АПГ2-01-М-«МИНИЛАБ-701-М» общая стоимость затрат на одно дублетное измерение сокращается в среднем в 2-3 раза (затраты на реактивы уменьшаются в 2 раза, затраты на кюветы в 3-5 раз) (таблица 9). Что позволяет лабораториям без увеличения затрат расширить свои диагностические возможности.

у - -0 7648 ♦ 1 0S26 * * r«0 96347

30 I ---

14 ' ■ ■ ■ ■

14 16 19 20 22 24 28 21

Время емртымния с

АПГ4-01

Таблица 9.

Характеристик Анализатор (фирма производитель) Trombotimer 2 / Trombotimer 4 (Behnk Elektronik, Германия) CL4/ CL8 (Behnk Elektronik, Германия) АПГ2-01-«Минилаб-701»/ АПГ4-01-«Минилаб-704» (Юнимел. Россия)

Количество канатов 2/4 4/8 2/4

Метод регистрации образования сгустка оптический механический оптико-механический

Вил биопробы плазма плазма, коовь плазма, кровь

Объем пробы, мкл 100 100 50

Автозапуск измерения есть +/- есть

Стоимость кюветы, руб 5,47 5.25 1,15

Стоимость прибора, евро 3700/6100 10900/25000 1700/3800

Примечание

+/- - автозапуск измерения только при наличии контактной пипетки, соединяемой с анализатором при помощи кабеля.

Проведенный анализ показал эффективность и экономическую целесообразность использования разработанной серии анализаторов.

С точки зрения эксплуатационных качеств анализатор АПГ4-01 обеспечивает высокую точность определения параметров системы гемостаза, более удобен в эксплуатации, чем существующие анализаторы и в 2-4 раза снижает стоимость проводимого исследования. Разработанный коагулометр, как показал сравнительный анализ, превосходит все имеющиеся аналоги, включая импортные, в своем классе и при этом имеет низкую стоимость.

Проведены технические испытания опытных образцов коагулометров. Результаты испытаний показали, что их опытные образцы обладают техническими характеристиками, отвечающими требованиям ТУ.

Медицинские испытания анализаторов проведены в КДЛ ведущих медицинских и научных учреждениях России. Опытные образцы анализатора признаны выдержавшими медицинские испытания на всех клинических базах. На основании положительных результатов они признаны соответствующими требованиям медицинской и лабораторной практики и

рекомендованы в установленном в государстве порядке к промышленному производству для использования в медицинских учреждениях.

Анализатор показателей гемостаза двухканальный АПГ2-01-«Минилаб-701» имеет регистрационное удостоверение № 29/07050902/4932-03 от 25.06.03г МЗ РФ, регистрационное удостоверение РК-МТ-5 №01880 от 26.06.04г МЗ республики Казахстан.

Анализатор показателей гемостаза четырехканальный АПГ4-01-«Минилаб-704» имеет регистрационное удостоверение № ФС 022а2005/1481-05. от 25.03.05г МЗ РФ.

Выводы:

1. Построена математическая модель процедуры построения калибровки при определении параметров системы гемостаза, позволившая разработать улучшенный алгоритм математической обработки результатов измерений (построение калибровок по МВНК), что позволяет повысить точность исследования свертывающей системы крови в следующих методиках: активность факторов протромбинового комплекса (протромбиновое время по Квику), активность факторов VIII и IX, активность антитромбина, определение концентрации фибриногена по Клауссу.

2. Разработаны коагулометры, не имеющие аналогов в России, с комбинированным оптико-механическим принципом регистрации фибринового сгустка и уменьшенным объемом биопробы 35-50 мкл, позволяющие проводить анализ цельной крови или плазмы в различных разбавлениях и расширить спектр проводимых исследований. Приборы позволяют улучшить качество, упростить рутинные процедуры и повысить производительность труда в КДЛ при выполнении коагулологических исследований с существенным снижением их стоимости.

3. Разработаны микрокюветы, позволяющие проводить исследования с объемом пробы 25-50 мкл, что в 2-4 раза меньше общепринятых в коагулологии объемов.

4. Разработаны одноразовые кюветы с шероховатостью на внутренней поверхности дна (11а ~ 3,5и ~ 6,3 скм) применением шарика из стали марки ШХ15, покрытым силиконом ПМС-10 (толщиной 0,8-1,2 мкм), что позволило повысить точность регистрации образования сгустка и снизить стоимость кювет в 4 раза. Разработан диспенсер для дозирования шариков в кювету перед проведением коагулологического исследования.

5. Разработаны программные средства коагулометра, позволившие упростить выполнение анализов свертывающей системы крови, сделать его интуитивно-понятным для пользователя.

6. Разработана серия унифицированных программируемых оптико-механических анализаторов для лабораторий разного уровня: АПГ2-01-М-«МИНИЛАБ-701-М» - двухканальный коагулометр для лабораторий уровня поликлиник и участковых больниц, АПГ4-01-«МИНИЛАБ-704» - четырехканальный коагулометр со встроенным принтером для лабораторий со средней загрузкой, уровня центральных и районных больниц).

7. Освоено серийное производство на производственной базе ООО «Эйлитон», г. Москва (выпущено 10 анализаторов АПГ4-01-«МИНИЛАБ-704», 25 анализаторов АПГ2-01-«МИНИЛАБ-701-М» и 35 диспенсеров для шариков). Анализатор показателей гемостаза двухканальный АПГ2-01-«Минилаб-701» имеет регистрационное удостоверение № 29/07050902/4932-03 от 25.06.03г МЗ РФ, регистрационное удостоверение РК-МТ-5 №01880 от 26.06.04г МЗ республики Казахстан. Анализатор показателей гемостаза четырехканальный АПГ4-01-«Минилаб-704» имеет регистрационное удостоверение № ФС 022а2005/1481-05 от 25.03.05г МЗ РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Кутепов М.В., Термостатированный измерительный блок анализатора показателей гемостаза, // Тезисы докладов научно-технической конференции «Микроэлектроника и информатика -2001». - М.: МИЭТ.-2001.- С. 128.

2.Безруков А.В., Кутепов М.В., Шибанов А.Н., Устройство для поштучной выдачи тестовых шариков, // Заявка на изобретение по сущ. №200331723, и17 А 61 Л/00,2003г.

3. Кутепов М.В., Программируемый четырехканальный коагулометр полуавтомат, // Тезисы докладов научно-технической конференции «Микроэлектроника и информатика - 2004». -М.:МИЭТ.-2004.-С. 138.

4.Безруков А.В., Кутепов М.В., Шибанов А.Н., Минимизация объема пробы при проведении коагулологического исследования, // Тромбоз, гемостаз и реология, №3,2004г, С. 75-78.

5.Безруков А.В., Кутепов М.В., Шибанов А.Н., Кювета для определения времени свертывания, // Заявка на изобретение по сущ. №2004129084, 7А 61 В 5Д45,2004г.

6.Гулидова О.В., Кутепов М.В., Определение показателей гемостаза на программируемом оптико-механическом коагулометре «МИНИЛАБ-704», // Руководство пользователя и методические рекомендации, 2005г, с.50.

Подп. к печати 20 04.2005 г. Формат издания 60x84 1/8. Бумага офс. № 1. Усл. печ. л. 2. Уч -изд л 1,67 Тираж 100 экз. Зак. 1154 Типография НПО «Экран» ЛИЦЕНЗИЯ: Серия ПД № 00966

os: 09 - PS

i !

'9 Ш 2005

13 С О

Список и обозначения аббревиатур .л:.;.;.:.:.:.:::.л;.^.и.:.

Введение:;.;.-...

Глава Г: Методы и средства 'исследования- системы •гемостаза'«'.:;.л

1. Общие представления о механизмах свертывающей системы крови.:;;.

2. Методы исследования системы гемостаза.л;.;.:^.'.-.:.

3. Физические основы функционирования современных анализаторов свертывающей системы крови.

4; Влияние типа анализатора.на результаты измерений. 5; Приборы для исследования параметров системы гемостаза и их. классификация.

6. Обоснование актуальности разработки приборов для исследования свертывающей системы крови.-.:

Свертывание крови является защитной реакцией, предохраняющей организм от кровопотери [38]. Возникающие при различных состояниях организма, нарушения свертываемости . крови могут сопровождаться кровоточивостью (геморрагические состояния , при , тромбоцитопении,, тромбоцитопатии, наследственных нарушениях плазменного , гемостаза, первичном и вторичном гиперфибринолизе, ревматизме, приобретенных коагулопатиях, ДВС-синдроме, микротромбоваскулитах и др.), а также быть причиной внутрисосудистого . тромбообразования (тромбозы, . . при атеросклерозе,. инфаркте .миокарда, гипертонии, нарушении мозгового кровообращения, сахарном диабете, злокачественных. новообразованиях, патологиях беременности и пр.) [5,8,23,26,41,52,54].

Определение параметров свертывающей . системы крови . занимает существенное -место в клинической лабораторной диагностике [34]. Исследование 28 параметров системы гемостаза включено в утвержденный Минздравом "Рекомендуемый перечень лабораторных исследований для клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений" [57,63].

Лабораторные исследования - самые массовые исследования в здравоохранении. От 30 до 45% случаев заболеваний не могут быть правильно диагностированы без данных' объективного обследования, среди которых результаты клинических лабораторных исследований составляют от 60 до 80%. Ежегодно только в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) системы Министерства здравоохранения клинические лаборатории выполняют свыше 2,546 миллиарда лабораторных исследований. Если прибавить к этому ведомственные, академические, частные и др. клинико-диагностические лаборатории (КДЛ), то эту цифру необходимо увеличить по крайней мере в 1,5 раза. Номенклатура лабораторных исследований составляет более 1,5 тыс. наименований [52,57,63].

За последнее десятилетие техника для диагностики нарушений системы гемостаза совершила качественный переход от. ручного способа (при помощи водяной бани и секундомера) к автоматическому способу измерения времени свертывания крови (при помощи коагулометра, автоматически регистрирующего время образования сгустка фибрина в тестируемой смеси) [32]. ' ^ . . .' Г!";;

Различные виды коагулометров эксплуатировались в КДЛ за эти годы.Это оборудование развивалось от простых одноканальных приборов, не производящих никаких расчетов до современных многопараметровых многоканальных автоматических анализаторов, способных определять более 10-ти коагулологических показателей с производительностью до 120-150 проб крови в час. Использование автоматических анализаторов позволяет не только существенно улучшить регистрацию, хранение, первичную обработку данных коагулограммы, применять компьютерные методы анализа,, предоставляющие, врачу дополнительную диагностическую информацию, но и заметно облегчить труд лаборанта, устранить элементы субъективности при выполнении коагулологических тестов и повысить точность проводимых исследований.

Анализаторы свертывания крови являются важнейшим средством изучения системы гемостаза в КДЛ. Значительное расширение за последние годы ассортимента коагулометров все еще не. позволяет кардинально решать вопросы всестороннего исследования^ системы, гемостаза [2,3,36]. В то .время как. исследование гемостаза остается острейшей проблемой ^современной медицины [8,16]. . . •■ : .л . , v.\: —л,. .

Актуальность работы:

В течение последних лет наблюдается интенсивное развитие методов и технологий клинической лабораторной диагностики. Это обусловлено общими тенденциями в здравоохранении и технологическими факторами:

1: Совершенствованием методов клинической лабораторной диагностики и повышением качества лабораторных исследований на базе внедрения новой лабораторной техники и технологий.

2. Заменой трудоемких ручных методов на автоматизированные, выполняемые на биохимических, гематологических, иммунологических, коагулологических, бактериологических и других типах анализаторов, всесторонней информатизацией и интеграцией на основе развития компьютерных технологий. • i 3. Переходом медицинских диагностических технологий на объективные количественные методы исследований, внедрением протоколов лечения и стандартов диагностики. Разработкой комплекса мер по управлению качеством лабораторных исследований.

4. Интеграцией лабораторной диагностики с другими медицинскими дисциплинами.

5. Повышением уровня подготовки врачей клинических специальностей в области клинической лабораторной диагностики. .

Особая значимость контроля свертывающей системы крови в последнее время связана с активным применением в клинической практике современных высокоэффективных антикоагулянтов прямого и непрямого действия, антиагрегантов и тромболитиков. Узкий терапевтический коридор и избирательная индивидуальная чувствительность к препаратам разных групп требует точного индивидуального подбора дозировки и продолжительности лечения, а главное целесообразности и эффективности проводимой терапии [28,29].

Большое количество людей имеют факторы риска, обусловленные генетическими дефектами отдельных звеньев гемостаза, применением некоторых фармакологических препаратов, в том числе антибиотиков и оральных, контрацептивов, наличием сопутствующих заболеваний [25]. В обычных условиях дисбаланс компонентов свертывающей системы может не проявиться, но в условиях оперативного вмешательства или бесконтрольно назначенной терапии риск тяжелых осложнений у таких пациентов многократно возрастает. Выявление факторов риска у разных групп пациентов и принятие соответствующих профилактических мероприятий позволяет избежать тяжелых осложнений [74]. Современные методы лабораторной диагностики состояния,.системы гемостаза позволяют получить большой объем информации. Однако, нередко из-за. недостаточного . финансирования, выделяемого на лабораторную диагностику, гемостаза, российские лаборатории не могут обеспечить :высркое качество исследований. Лаборатории пользуются устаревшими методиками (время рекальцификации, р-нафтоловый тест, аутокоагуляционный тест, определение концентрации фибриногена по методу Рутберга и др.) и: нередко самостоятельно приготовленными не аттестованными реагентами и контрольными материалами [1,52]. Спектр .исследований не выходит за рамки 3-х тестов, а сами исследования до сих пор проводятся ручными методами ,с использованием.водяных бань и секундомеров. ,.,

На сегодняшний день актуальной задачей является стандартизация методов диагностики [35], разработка, программ контроля .за эффективностью антикоагулянтной, тромболитической, фибринолитической. терапии [29]. В связи с большим количеством факторов, влияющих на свертывание крови, требуется разработка алгоритмов диагностики углубленного исследования и контроля лечения нарушений гемостаза.'

Существенного улучшения требует приборный парк для диагностики нарушений гемостаза (около 1500 приборов приходится на 14 тысяч российских КДЛ) [30,36]. Особого внимания заслуживает направление для экспресс-диагностики нарушений гемостаза [33].

Для российских КДЛ требуются анализаторы показателей гемостаза, предназначенные как для использования в лабораториях участковых больниц, поликлиник, других медицинских учреждениях при проведении профилактических осмотров, оценке эффективности лечебных мероприятий и диагностике целого ряда заболеваний, выявлении нарушений свертывающей системы крови на ранней стадии, так и для лабораторий уровня центральных, районных и областных больниц, посредством определения . в процессе измерений как базовых коагулологических параметров в пробах плазмы и цельной крови, так и расширенных.

Цель, работы:

• Разработка современных приборов для, экономичного и надежного, определения параметров системы гемостаза в условиях КДЛ различного,уррвня и их внедрение в юганическую практику. • . , , . . ,

Для осуществления этой цели были поставлены следующие задачи:/ , . 1. Проведение анализа современного состояния методов исследования системы гемостаза и применяемых технических решений в используемых приборах лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) России. -2. .Определение, .требований к:.анализаторам свертывающей сцстемы крови, методическому обеспечению,. расходным материалам для оптимального. обеспечения современных потребностей ЛПУ. РФ, п . ; . ■ : . . i .

3. На основе проведенного анализа разработать математическую модель определения параметров системы гемостаза при проведении калибровки для создания более совершенного прибора для исследования свертывающей системы крови в КДЛ. ' • \ • , :

• ' '4. Разработать унифицированные Модули для построения анализаторов ''свертывйощей сйстёмы крови' с целью' применения: в условиях КДД.различного уровня rt ПОДГОТОВИТЬ приборы к серийному производству •;. 7.~

V ' '5; Рйработать' техничёскйе ; решения, - в том-мчиоле ••, конструкцию одноразовых кювет,- обеспечивающие качественные"исследования ? системы гемостаза с применением отечественных реагентов; 1 • .■;■.-.'. ■

Научная новизна: . .

Разработаны : коагулометры, не . имеющие. . аналоговв России, .с комбинированным оптико-механическим принципом регистрации фибринового сгустка и уменьшенным объемом .биопробы 35г50 мкл, позволяющие проводить анализ цельной крови .или плазмы в различных разбавлениях и расширить спектр проводимых исследований свертывающей системы. . .

Научно обоснованы технология нанесения силиконового покрытия на стальные шарики и введение шероховатости внутренней поверхности в одноразовых кюветах. для проведения коаг^лологических исследований, что обеспечивает повышенную точность и „ надежность. регистрации образования фибринового сгустка. . ;

Построена математическая модель определения, параметров,, системы гемостаза при проведении калибровок, позволившая оценить, возможные погрешности, при пересчете результатов измерений,. и разработать включая экспериментальную оптимизацию, улучшенный алгоритм,. проведения, калибровок. . . . .,.- . • .,:•.,. . •

Практическая значимость:

Разработаны унифицированные модули и на их основе построены, два программируемых прибора для исследования показателей системы гемостаза различного назначения: АПГ4-01-«МИНИЛАБ-704», ТУ 9443-003-598798152004 - 4-х канальный высокопроизводительный анализатор показателей гемостаза со встроенным принтером для КДЛ средних и крупных больниц и АПГ2-01 -М-«МИНИЛАБ-701 -М», ТУ 9443-015-11254896-2004 - 2-х;канальный анализатор показателей гемостаза для поликлиник,, мелких больниц и экспресс-лабораторий, позволяющие проводить анализ с уменьшенными объемом пробы и расходом реагентов в 2-З раза. Анализаторы позволяют снизить количество методических ошибок при" подготовке и измерении биопроб," . упростить выполнение рутинных операций и повысить , производительность пруда в КДЛ при выполнении коагулологических исследований и 'Существенно - снизить' их стоимость». Коагулометры серийно выпускаются.на'^производственной базе ООО «Эйлитон» (г. Москва). . ■ . . ' I ;v . Освоена технология ' применения шариков . из • стали''' марки ШХ15, покрытых силиконом в кюветах для проведения коагулологических исследований, позволившая значительно упростить конструкцию кювет и снизить их стоимость более чем в 4 раза.

Разработаны одноразовые кюветы (с шероховатыми участками поверхностей) для проведения коагулологических измерений с повышенной воспроизводимостью (свидетельство на полезную, модель №2004129084), Кюветы в настоящий момент, серийно выпускающиеся на производственной базе ООО «Эйлитон» (г.Москва). .;; .

Внедрение. Разработанные анализаторы внедрены ■ в - серцйное производство ООО «Эйлитон» (г. Москва). Произведено 35 коагулометров, которые посту пили, в КДЛ лечебногпрофилактических и научных учреждений, страны. ■ ■ . ".' / ■" ■ 1

Положения, выносимые на защиту:

1. Математическая модель определения параметров системы гемостаза при проведении калибровок, позволившая оценить возможные погрешности при пересчете результатов измерений, и разработать, • включая экспериментальную оптимизацию, алгоритм проведения калибровок.

2. Разработка коагулометров/ обладающих существенно низкой стоимостью и более высокими техническими характеристиками в сравнении с существующими' 'прототипами ' благодаря использованию" в . v них унифицированных модулей, дешевых одноразовых кювет и применения улучшенного алгоритма проведения калибровок с учетом результатов математического моделирования 'и экспериментальных данных, а. также обладающих значительной производительностью за счет оптимизации конструкции и ■ алгоритма работы ' анализатора для исследования системы гемостаза. '

3. Результаты исследований и разработка .одноразовых расходных материалов, обеспечивающих уменьшенные объемы пробы и реактивов, повышенную точность и надежность определения параметров системы гемостаза и обладающих низкой стоимрстью.

4. Результаты испытаний разработанного оборудования для .выполнения коагулологических исследований в КДЛ.

Основные положения работы докладывались и обсуждались на следующих научных конференциях:

1. 8-ая.Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и информатика-2001», МИЭТ, Москва, 18-19 апреля 2001г.;

2. На научно-практической конференции лаборантов Московской области, МОНИИКИ, Москва, 12-13 февраля 2002г. .

3. 11-я Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и информатика-200.4», Москва, МИЭТ, 21-23 апреля 2004г.;

4. II Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н Бакулева РАМН, Москва, 2-4 февраля 2005г.

Объем и структура работы:

Диссертация изложена на 172 страницах, включает" введение; аналитический обзор, решение задачи по разработке измерительной ячейки и кюветы с уменьшенным объемом пробы, решение задачи по разработке программных средств анализаторов свертывающей системы крови, решение задачи по разработке и подготовке к серийному производству анализаторов показателей гемостаза и результаты медицинских испытаний разработанных' изделий, выводы, заключение и практические рекомендации. Литературный указатель включает 164 источника информации. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 47 рисунками

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тип анализаторов показателей гемостаза четырехканальных АПГ4-01 утвержден с техническими и метрологическими характеристиками, приведенными в настоящем описании типа, метрологически обеспечен при выпуске из производства и в эксплуатации согласно поверочной схеме.

ИЗГОТОВИТЕЛЬ:

ООО «ЭЙЛИТОН», 129301, г. Москва, ул. Касаткина, д. ЗА. Телефон (095) 935-8650, факс (095) 564-8641.

Директор ООО «ЭЙЛИТОН»

А.Н. Шибанов

Протокол медицинских испытаний анализатора показателей гемостаза чешрехканального АПГ4-01 «Мнтишб 704».

Протокол медицинских испытаний анализатора показателей гемостаза четырехканального АПГ4-01 «Минилаб 704»,

Обьекг испытаний.

Для испытаний предоставлен комплект анализатора АПГ 4-01 в составе самого прибора, кювет для исследования, шариков металлических и дозатора шариков. Прибор предназначен для определения протромбинового времени (ПВ), АЧТВ, тромбинового времени, фибриногена, факторов свертывания крови и пр. Прибор разработан фирмой ООО «Эйлитон» гМосква. В комплекте с прибором представляется: Проект инструкции

Комплект расходных материалов (измерительные юовегты, шарики .дозатор для шариков)

Копия выписки решения Комиссии по лабораторному оборудованию Комитета по новой технике Мз РФ о проведении медиспыганий Программа медиспытвний Цель испытаний.

1 .Проверка воспроизводимости определений (на основании расчета коэффициента вариации) при определении ПВ, АЧ'Ш,фибриногена с использованием аттестованной нитратной плазмы с известными исследуемыми значениями для данного типа измерения.

2. Проведение сравнительных исследований ПВ.АЧТВ «фибриногена на данном приборе и приборе подобного типа измерения «CL-8» производства Benk Electronics (Германия) использованием контрольной плазмы . Время и место испытаний.

1 Медицинские испытания прибора были проведены а лаборатории экспресс-диагностики НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ в период с с 15 ноября по 29 ноября 2004 года. Методика проведения испытаний.

1.При испытаниях проведены следующие исследования:

1 Проведано по 20 параллельных определений ПВ, АЧТВ в плазме пациентов с использованием прибора АПП4-01 и прибора «CL-8» с последующим расчетом коэффициента корреляции ^

2.Проведено по 20 параллельных определений ПВ, АЧТВ, в контрольной плазме на 1 и 2 измерительном кашле прибора АПГ4-01 с последующим расчетом коэффициента вариации и оценки воспроизводимости

3.Проведены исследования чувствительности прибора к разведению возможности использования прибора для определения фибриногена.

4.Оценены эксплуатационные качества прибора

Представление результатов испытаний.

1. Авдеева Н.А., Долгов В.В., Щетникович К.А., Методы исследования гемостаза: Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики. -М. , 1996.

2. Амосова Е.Н., Грицюк А.И., Грицюк И.А., - Практическая гемостазиология, Киев: Здоровье, 1994, 256с.

3. Андреев А.Е., Косырев А.Б., Отечественные приборы для исследования гемостаза, Медицинская картотека, №9, 2000, с. 16-18.

4. Анкудинова О.В., Илясов Л.В., Устройство для определения времени свертывания, патент РФ № 2 187 797 С2, GO IN 27/02, 2000.

5. Баирова B.C., Ветлицкая Н.А., Леванович В.В. Нарушения в системе гемостаза в послеоперационном периоде у детей. Вестник хирургии, 1989,т.144,№8,с.83-87.

6. Баркаган З.С, Балуда В.П., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования гемостаза,. —Томск, 1980, 314 с.

7. Баркаган З.С, Геморрагические заболевания и синдромы, - М.: Медицина, 1988, 528с.

8. Баркаган З.С, Момот А.П., Диагностика й- контролиру<ёмая терапия • нарушений гемостаза, М: 2001, с. 10-50. . -

9. Безруков А.В., Кутепов М.В., Шибанов А.Н., Минимизация объема пробы при проведении коагулологического исследования, Тромбоз, гемостаз и реология, №3, 2004г, с. 75-78.

10. Безруков А.В., Кутепов М.В., Шибанов.А.Н., Устройство для поштучной выдачи тестовых шариков, патент RU №200331723, 7А61 J7/00, 2003.

11. Безруков А.В., Ким Ю.В., Кутепов М.В., Свистов А.Е., Технические условия на анализатора показателей гемостаза АГТГ4-01-«Минилаб-704» ТУ №9443-003-59879815-2004. _ , .

12. Белозерская ГГ., Рогачева Н.А., Шелепова Т.М., и соавт. Способ определения фибриногена и продуктов его деградации в крови. Авт. свид. на изобретение № 1709194,1989г.

13. Берковский А.Л., Козлов А.А., Качалова Н.Д., Простакова Т.М., Пособие для врачей лаборантов по методам исследования гемостаза, М., 2004, с. 5-28.

14. Бойченко СВ., Русяев В.Ф., Термогемостон, патент СССР № 1457897, А61В 5/05, 1987.

15. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высш. шк., 1989.

16. Владимиров Ю.А., Свечение, сопровождающее биохимические реакции, Соросовский Образовательный Журнал. 1999, JSfo 6, с.25-32.

17. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Хемилюминесценция клеток животных, Итоги науки и техники. Биофизика. 1989, т. 24. 21,Власов В.В., Эффективность диагностических исследований, М.: Медицина, 1988, 256с.

18. Волчек Ю.З., Медведев В.В., Клиническая лабораторная диагностика: Справочник для врачей, СПб., 1995.

19. Воробьев А.И., Васильев А., Городецкий В.М,, Синдром острого диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови' в^ клинической практике, Клиническая лабораторная диагностика, Т997, №5, с.12-14.

20. Гаташ СВ., Лемешко В.А., Румянцев М.Н., Устройство для исследования процесса агрегации тромбоцитов, патент РФ № 2061952, G01N 33/48, 1989г.

21. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Петрищева Н.Н., Папаян Л.П. СПб.: 1999. -117 с.

22. Голдман Л., Количественные аспекты клинического, мышления, Внутренние болезни, книга 1, пер. с англ., под ред. Браунвальда Е., Иссельбахера К.Д, Петерсдорфа Р.Г. и др., М.:.Медицина,1993, с.36-50.

23. Гулидова О.В,, Протромбиновый тест - плазма или капиллярная кровь, I- ая Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазиология и реология", тезисы докладов, 2003 г.

24. Добровольский А.Б., Косырев А.Б., Современные методы лабораторного контроля антикоагулянтной терапии, Лабораторные новости Дальнего Востока, №1,1999г., С23-26.

25. Добровольский Н.А., Кострйцо П.Р., Лабинская Т.А., Макаров В.В., Парфенов А.С., Пешков А.В., Анализатор крови коагулологический, Медицинская техника, М.: Медицина, №1,2000, с.42-44. •

26. Добровольский НА., Лабинская Т.А., Макров В.А., Парфенов А.С., Пешков А.В., Коагулометр шариковый, патент РФ № 2133955, G01N 11/10, 1999.

27. Долгов В.В,, Малахов В.Н, Мошкин А.В., Прищепа и др.. Обеспечение качества в лабораторной медицине. Учебное пособие. - М.: 1997.

28. Долгов В.В., Щетниконич К.А., Методы исследования гемостаза: Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики. - М. 1996.

29. Доронина Т.И., Курочкина А.И., Титова М.И, и др.. Компьютерная консультативно-диагностическая система "Коагулограмма", Клин. лаб. диаг., 1994,№2,с. 55-57.

30. Иванова В.М. и др., Математическая статистика, - М.: Высшая школа, 1981.

31. Исследование системы крови в клинической практике, Под ред. Козинца Г.И., Макарова В.А, - М., 1997.

32. Кадашева О.Г., Меньшиков В.В., Качество лабораторных исследовании и современные подходы к его оценке, Клин. лаб. диагн., №6, 2000.

33. Карельская Е.Ю., Цыпкин Ю.И., Щуковский В.В., Электрокоагулография - базовый метод исследования состояния системы гемостаза, Саратов,' 1997,33 с.

34. Качалова Н.Д., Козлов А.А., Простакова Т.М., Наиболее распространенные технические ошибки и рекомендации как их избежать при проведении коагулологического тестирования. Тромбоз гемостаз и реология, №3(3), 2000, с. 22-25 • 163 .

35. Коблов Л.Ф., Методы и приборы для клинических лабораторных исследований, - М.: Медицина, 1979, с 51-57.

37. Корп1унов А.Г., Алгоритм электрокоагулографической диагностики состояния системы гемостаза: Автореф. дисс,.канд..мед.^наук., Саратов, 1996,22 с.

38. Коршунов А.Г., Коршунов Г.В., Пучиньян. Д.М., Электрокоагулография как метод экспресс-диагностики функционального состояния системы гемостаза в травматологии и ортопедии, Лабораторная медицина, №2, 1999,0.66-73

39. Косырев А.Б., Влияние типа коагулометра на результат. Лабораторная медицина, №1, 1998г., с.21.

40. Кутепов М.В., Программируемый четырехканальный _ коагулометр полуавтомат, тезисы докладов научно-технической конференции "Микроэлектроника и информатика - 2004",- М.:МИЭТ, 2004, с. 138.

41. Кутепов М.В., Термостатированный измерительный блок анализатора показателей гемостаза, тезисы докладов научно-технической конференции "Микроэлектроника и информатик1а - 2001", - М.: МИЭТ, 2001г,с.128;

42. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник под ред. Меньшикова В.В., М.,1987, с. 37-42.

43. Лауга В.И., Мухин В.А., Способ и устройство определения свертываемости в пробах плазмы крови, патент RU2172483; GO IN 21/59, 2001.

44. Лычев В.Г., Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, Н. Новгород: Издательство НГМА, 1998, 191с.

45. Прищепа М.И., Особенности национального обеспечения единства измерений а КДЛ, Лабораторная медицина №6, 2003, с.23-26.

46. Результаты исследования рабочей группы Проблемной комиссии РАМН "Патология гемостаза". Гематология и трансфузиология, 1991, № 4, с.ЗЗ-35.

47. Рекомендуемый перечень лабораторных исследований для клинико- диагностических лаборатории лечебно-профилактических учреждений, Клин. лаб. диагн., № 3-4, 1992, с.65-74.

48. Рогачева Н.А., Макаров В.А., Шелепова Т.М. и соавт., Определение содержания фибриногена, фибрин-мономерных комплексов, продуктов деградации фибрин-фибриногена и плазминогена в капиллярной крови, Гематология и трансфузиология, 1990, № 6, с.33-34.

49. Томас Плум, Устройство для определения времени коагуляции крови, патентСССР№2051383, GO IN 33/48, 1988.

50. Управление качеством клинических лабораторных исследований. Нормативные документы^ под ред. Меньшикова В.В., М.: Лабпресс, 2000, 152. УО.Урбах В.Ю., Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях, - М.: Медицина, 1975.

51. Шебалин О.Д., Физические основы механики и акустики, М.: Высшая школа, 1981, с 23-45.

52. Шифрин Л.И., Гемокоагулограф, патент СССР № 1076086, GO IN 33/48, 1982.

53. Шифрин Л.И., Оптический гемокоагулограф, патент СССР № 1195975, А61В 5/14, 1984.

54. Якунин Г.А., Структурно-функциональные особенности гемостаза при некоторых физиологических и патологических состояниях, автореф. дисс. докт. биол. наук, М., 1975, с.21-23.

55. А11еп G.A., Wolberg A.S., Oliver J.A., Hoffman М., Roberts H.R., Monroe D.M., Impact of procoagulant concentration on rate, peak and total thrombin generation in a model system, J. Thromb. Haemost, 2004, p.2, p.402-413.

56. Arvind N. Jina, Coagulation or lysis assays using an electroactive species, patent US 6.066.504, GOl N 33/86, 2000

57. Arvind N. Jina, Method and device for measuring blood coagulation or lysis by viscosity.changes, US patent 6.338.821, GOIN 33/86, 2002

58. Aurell L., Friberger P., Claeson G., Chromogenic substrates for kallikreins and related enzymes, BirkhauserVerlag, 1982, p.83-90.

59. Bergstrom K. Determination of trypsin in duodenal fluid using a new chromogenic substrate and a reaction rate instrument, LbCB Application Note, 1976, p.211-216.

60. Bergstrom L., Lundh G., Determination of trypsin in duodenal fluid as a test of pancreatic function. A methodological note, Scand J. Gastroent, 1970, №5, p.533-536.

61. Blanco M., Colesse, G., Woodhams, B. & Gourmelin, Y., Stability of coagulation factors in frozen plasma, Haemostasis, №30, 2000, p.37-38. (влияние тромбопластинов и стабилизаторов при определении ПВ)

62. Butler, et al.. Measurement of blood coagulation time using infrared electromagnetic energy, patent US № 5.167.145, BOIN 21/17, 1992.

63. Cambas J.P., Bierme ,R., Martinon J.C. & Dousset В., Evaluation des performances d'un automate en coagulation: Electra 700. Nouvelle Revue Francaise D'hematologie, №25, 1985, p.313-320.

64. Campbell J.H., Fennessy P.A., Mendelsohn F.A., et al., Angiotensin- converting enzyme inhibitors and athero-sclerosis: relevance of animal models to human disease, Clin. Exper. Pharmacol. Physiol., 1996, №23, p.30-32.

65. Carr, Magnetic stirring system, patent US № 5.586.823, BOIF 13/08, 1996.

66. Carroll E. et al. Method and apparatus for measuring prothrombin time and the like, patent US 3 905 769, G 01 11/42, 1975.

67. Carville D.G., Guyer K.E., Coagulation Testing: Part 1, Current Methods and Challenges, Part 2: The quest to optimize near-patient analyzers, IVD Tech, 4(4): 1998, p.59-66.

68. Chakravarti D. N., Muller-Eberhard H. J. Biochemical characterization of the human complement protein C, J. Biol. Chem., 1988, №263, p.1306-1312.

69. Chan S-Y., Strickland D.K., Sator de Serrano V., et al, Purification and properties of a plasminogen activator from cultured rat prostate adenocarcinoma cells. Biochemistry, 1983, №22, p.444-449.

70. Chang-Liem G.S., Lustermans F.A., van Wersch J.W., Comaprison of the approaches of Latex and ELISA D-Dimer determination for the diagnosis of deepvien thrombosis. Haemostssis, 1991; №21 p. 106-110.

71. Chantarangkul V., Tripodi A. & Mannucci P.M., Evaluation of a fully automated centrifugal analyzer for performance of hemostasis tests. Clinical Chemistry, №33, 1987, p.1888-1890.

72. Chitolie A., Mackie I.J., Grant D., Hamilton J.L. & Machin S.J., Inaccuracy of the derive fibrinogen measurement, Blood Coagulation and Fibrinolysis, №5, 1994, p.955-957.

73. Chitolie, A., Mackie, I.J. & Machin, S.J., The type of thromboplastin reagent has important effects on the PT-derived fibrinogen potency. Laboratory Hematology, №4, 1998, p. 149-155.

74. Claeson G., Friberger P., Knos M., et al.. Methods for determination of prekallikrein in plasma, glandular kallikrein and urokinase, Haemostasis, 1978, №7, p.76-78.

75. Clauss A., Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, №17, 1957, p.237-246.

76. Coagulometr, Heinrich Amelung GmbH, DE 2 937 195, GOIN 33/86, 1981.

77. Gebrain, Method and apparatus for mixing liquid solutions using a rotating magnet to generate a stirring vortex action, patent US 6 382 827, BOIF 13/08, 2002.

78. Geiger M.T., Method and apparatus for determining coagulation times, patent US 4 034 601, GOIN 11/10, 1977.

79. Harding D. R., Hardman M. J., Keogh S. J., The complement component С Is catalysed hydrolysis of peptide-4-nitroanilide substrates., Biochem Biophys Acta, 1987, №913, p.39.44.

80. Hartert, Apparatus and method for measuring changes in conditions in coagulating liquids, patent US 4 202 204, GOIN 11/10, 1980.

81. Hayashi Т., Niiya K., SakuragawaN. Down-regulation of urokinase secretion from a human lymphoma cell line RC-K8 by dexamethasone without inducing plasminogen activator inhibitors, Tromb Res., 1992, №65, p.311-321.

82. Heebels A.E., Janssen M.C., Metz ML, Verbruggen H. et al. Reliability of five rapid D-dimer assays compared to ELISA in the exclusion of deep venous thrombosis, Thromb. Haemost., 1997, 77, p.262-266.

83. Heins v., Reiauer H., Automation in coagulation testing, AIFCC, 1996, vol. 8, №3,p.l 17-122.

84. Hemker H.C., Giesen L.A, Ramjee M., Wagenvoord R., Beguin S., The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma, Thromb. Haemost., 2000, №83, p.589-591.

85. Hemmes P.R., Ultrasonic coagulation monitor and method, patent US № 4.558.589, GOIN 33/48, 1985.

86. Hirsh J, Anand SS, Halperin JL, Fuster V,, Guide to Anticoagulant Therapy: Heparin. A Statement for Healthcare Professionals From the American Heart Association, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2001, №21, p.29-33.

87. Kane J. et al. Coagulation timing apparatus, and method, US 3 658 480, GOIN 33/16, 1972 .. 113. Katayama et. al., An analyzing method of blood reaction, Sysmex Corporation, Dade Behring, patent EP № 1 316 802 A2, GO IN 33/86, 2003.

88. Kishimoto et al.; Method and system for measuring blood coagulation time, patent US 4.252.536, GOIN 33/86, 1981.

89. Kitchen S., Jennings I. & Preston F.E., Comparison of fibrinogen determinations using a Clauss assay and two prothrombin time derived methods. Thrombosis and Haemostasis, p73, 1995, p.1245-1246.

90. Kloth B. et al.. Blood coagulation time measuring device, patent US J№ 4.964.728, COIN 21/59, 1990.

91. ICraus M. et al., Method and diagnostic agent for hemostasis diagnosis, Dade Behring Mamburg GmBh, US patent 6.482.253 B l , GOIN 33/86, 2002.

92. Kraus M., Schelp C , Wiegand A., Method and diagnostic agent for hemostasis diagnosis, US patent № 6.187.594 B l , GO IN 33/86, 2001.

93. Krone K., Process and an apparatus for testing the coagulation properties of liquids, patent US № 4.388.824, GOIN 33/48, 1983.

94. Langdell R.D., Wagner R.H., Brinhous K.M., Effect of anti-hemophilic factor on one-stage clotting tests: a presumptive test for hemophilia and a simple one-stage anti-hemophilic factor assay procedure, J. Lab. Clin. Med., 1953, 41,p.637-647.

95. Lee R., White P., Actual study of the coagulation time of blood, AJMS, №145, 1913, p. 495-503.

96. Lin T-Y., McRae B.J., Powers J.C. Mapping the substrate binding site of human Clr.and С Is with peptide thioesters, J. Biol. Chem., 1981, №255, p. 12362-12366.

97. Lipscomb, Methods for coagulation monitoring, patent US № 4.720.787, GOIN 33/86, 1988

98. Lorincz et al.. Solid state apparatus employing hall effect sensors for detecting the coagulation of blood, patent US № 6.136.271, GOIN 33/49, 2000.

99. Macfarlane R.G., An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier. //Nature, №202, 1964, p. 498-499.

100. Macfarlane R.G., The theory of blood coagulation. In: Human Blood Coagulation, // Haemostasis and Thrombosis fed, by R. Biggs, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1972, p. 1-31.

101. Medical Devices Agency Evaluation Report: Fibrinogen Assay reagents and Methods. MDA 2000/01 ISBN 184182 139X. Her Majesty's Stationery Office, Norwich.

102. Medical laboratory automation, Blood coagulation analyzer, patent EP № 0 932 041 A2, GO IN 33/49, 1999.

103. Mintz D. et al. System for timing the coagulation of blood, patent US 3 836 333, COIN 11/10, 1974.

104. Mintz M.D., Method and system for analyzing a liquid, patent US № 3.695.842, COIN 11/16, 1972.

105. Mintz M.D., Microprocessor-controlled apparatus and method for detecting the coagulation of blood, patent US 5.154.082, COIN 11/10, 1992.

106. Morawitz P,, Die Chemie der Blutgerinnung. // Ergebnisse der Physiologic, №4, 1905, p. 307-422.

107. Natelson E.A. & Dooley D.F., Rapid determination of fibrinogen by thrombokinetics. American Journal of Clinical Pathology, p61, 1974, p.828-833.

108. Nilsson Т., Wiman В., Kinetics of the reaction between human Cl-esterase inhibitor and Clr or Cls, Eur. J. Biochem., 1983, №129, p.663-667.

109. Osting J.D. & Hoffinann J.L., Evaluation of an automated photometric fibrinogen assay. Blood Coagulation and Fibrinolysis, p8, 1997, p.321-326.

110. Poggio М., Van den Besselaar A.M., Van der Velde E.A. et al., The effects of some instruments for PT testing on the ISI of two rabbit brain thromboplastin reagents, Thromb. Haemostas., 1989, №62, v3, p. 868-874.

111. Poller L., Keown M., Shepherd S.A. et.al., The effect of freeze' drying and freeze drying additives on the prothrombin time and the international sensitivity index. J. Clin. Pathol., 1999, 52, p. 744-748.

112. Porter R.R., Reid K.M., Sim R.B. et al, The structure and enzymatic activities of the Clr and Cls subcomponents of CI, the first component of human serum complement, Biochem J., 1977, №163, p.219-227.

113. Pozsgay M., Szabo G., Tozser J. et al. Active center studies on bovine pancreatic chymotrypsin with tripeptidyl-p-nitroanilide substrate. Acta Biochim Biophys Hung, 1986, №21, p.335-348.

114. Proctor R.R., Rapaport S.L, The partial thromboplastin time with kaolin. A simple screening test for first stage plasma clotting factor deficiencies. Am J. Clin. Pathol., 1961, №36, p.212-219.

115. Quick A.J., On the constitution of prothrombin. // American Journal of Physiology, №140, 1943, p. 212-220.

116. Quick A.J., The prothrombin in hemophilia and in obstructive jaundice. // Journal of Biological Chemistry, №109, 1972.

117. Quick A.J., The prothrombin time in hemophilia and jaundice, J. Biol. Chem., 1935, №109, p.73-74.

118. Rosenberg, Apparatus determinmg blood clotting time, patent US № 4.197,734, COIN 33/16, 1980.

119. Rossi E., Mondonico P., Lombardi A. & Preda L., Method for determination of functional (clottable) fibrinogen by the new family of ACL coagulometers. Thrombosis Research, 52, 1998, p.453-468.

120. Saito et al. Method of measuring blood clotting time, patent US № 4.217.107, GOIN 33/16, 1980.

121. Schildknecht K., Method and apparatus for measuring blood coagulation time, US 4 659 550, COIN 21/03, 1987

122. Schmidt A., Zur Blutlehre, // Vogel, Leipzig, 1892, p. 270-300.

123. Schneider et al.. Conductivity measuring circuit utilizing conductivity cell as input resistance of an operational amplifier, patent US № 3.430.130, GOIR 11/44,1969.

124. Scordato R.E., Test circuit for use in coagulation instrument, US 4 454 752, GOIN 33/48, 1984. .

125. See W. A., Plasminogen activators: regulators of tumor cell adherence to sites of lower urinary tract surgical trauma, J. Urol., 1993, №150, p.1024-1029.

126. Seitz J. et al. Clot-timing system and method, US 3 635 678, GOIN 11/16, 1972.

127. Sigelmann R.A., Ultrasonic coagulation timer, US Parent 4.014.650, GOl N 33/16,1977

128. Stener et al.. Hematocrit measurement by electrical conductivity, patent US 30 007, GOIN 27/42, 1979.

129. Stiene et al. Device for measuring blood coagulation and method thereof, US patent 2004/0072357, GOl N 33/86, 2004.

130. Teodorczuk et al.. Electrochemical test strip with an integrated micro-needle and associated methods, US patent 2003/0150745, C25 С 3/02, 2003

131. Ur et al.. Blood coagulation detection method and apparatus, patent US № 3.699.437, G01R27/02, 1972.

132. Van den Besselaar A.M., Evatt B.L., Brogan D.R. et al. Proficiency testing and standardization of prothrombin time: effects of thromboplastins, instrumentation and plasma. Am. J. Clin. Path., 1984, №82, vol.6, p.688-699.

133. Verfahren und vorrichtung zum messen der koaagulationszeit von flussigkeiten, Heinrich Amelung GmBh, patent DE № 3 523 906 Al , GOIN 11/10,1986.

134. Vermylen J, Hoylaerts M., The multiple faces of the partial thromboplastin time APTT, J. Thromb. Haemost., Vol. 2, Issue 12, 2004, p.2252-2253.

135. Wells P.S., Brill-Edwards P., Stevens P. et al., A novel and rapid whole- blood assay for D-dimer in patients with clinically suspected deep vein thrombosis. Circulation, 1995, №91, p.2184-2187.

136. Witt I., Test systems with synthetic peptide substrates in haemostaseology, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem, 1991, №29, p.355-374.