автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.17, диссертация на тему:Разработка методов и средств автоматизированной оптической диагностики и лазерной стимуляции спермы

На правах рукописи УДК 681.7.069.24:681.784:615.832.9: 621.396.96

Пырикова Светлана Ивановна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И СРЕДСТВ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ ОПТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛАЗЕРНОЙ СТИМУЛЯЦИИ СПЕРМЫ

Специальность 05.11.17. - Приборы, системы и изделия медицинского

назначения.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Московском государственном техническом университете им. Н.Э. Баумана

Научный руководитель: к.т.н., доцент Загидулин Р.Ш.

Официальные оппоненты: д.т.н., профессор Парашин В.Б.

к.т.н., Орбачевский Л.С.

Ведущая организация: ГУН ВНИИИМТ МЗ РФ

Защита состоится "/Г" 2004г.

в 1430 часов на заседании диссертационного совета Д 212.141.14 в Московском государственном техническом университете им. Н.Э. Баумана по адресу: 105005, Москва, 2-я Бауманская ул., д. 5.

Ваш отзыв на автореферат в 1 экз., заверенный печатью, просим выслать по указанному адресу.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке MГТУ им. Н.Э. Баумана. Автореферат разослан

" О-ЛРёЛЯ 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.т.н., профессор

Спиридонов И.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Современный уровень развития медицинской техники позволяет обеспечить такие области медицины и биологии как репродуктология, сперматология, биология разведения новыми высокоэффективными средствами количественной диагностики.

Важнейшим методом оценки функционального состояния половых желез и репродуктивной полноценности человека и животных является исследование спермы (определение показателей подвижности и концентрации сперматозоидов).

Анализ многочисленных литературных данных показал отсутствие единого метода и средств диагностики, позволяющих провести исчерпывающий анализ состояния спермы. Единственным доступным и широко используемым методом исследования является визуальный микроскопический метод, имеющий такие свойства как низкая точность, субъективность оценки, высокая трудоемкость.

Недостатки визуально-оптического метода обусловлены, в первую очередь, малым объемом выборки анализируемых частиц, что приводит к большой статистической погрешности. Существенного повышения точности и достоверности можно достигнуть, используя автоматизированные методы и средства, подобные давно и успешно используемым в гематологии автоматическим анализаторам форменных элементов крови.

Отечественными учеными (Попечителев Е.П., Спиридонов И.Н., Козинец Г.И. и др.) созданы научно-методические основы разработки средств автоматического анализа изображений клеточных структур, чувствительных и точных методов и средств оптического анализа биосубстратов.

Успешные разработки аппаратуры для оптического анализа клеток с 1990г. ведутся фирмой «Видеотест» (Санкт-Петербург), которой, в частности, создан анализатор изображений « Вид еотест-Сперм», позволяющий определять концентрацию сперматозоидов (общую и по классам подвижности); производить автоматический анализ подвижности сперматозоидов в соответствии с рекомендациями ВОЗ; анализировать морфологию сперматозоидов в окрашенных мазках.

В последнем, четвертом издании «Руководства ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью» (1999г), указано, что основным методом анализа концентрации и подвижности сперматозоидов является визуально- микроскопический метод. Отмечается также актуальность разработки и применения автоматических анализаторов.

Цель и задачи диссертации

Цель работы: создание технических средств автоматического количественного анализа концентрации и категорий подвижности объектов на основе современных технологий оптических методов исследования.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Разработка аппаратно-программного комплекса для определения параметров движения сперматозоидов;

2. Разработка технологии экспресс - диагностики концентрации сперматозоидов на основе лазерного нефелометрического метода;

3. Исследование пороговых уровней, стимулирующих и угнетающих доз воздействия лазерного излучения применительно к объекту исследования;

4. Создание и апробация макетов аппаратно-программного комплекса определения параметров траекторий и скоростей движения и лазерного нефелометрического комплекса измерения концентрации;

5. Разработка технологам лазерной обработки биосреды, позволяющая повысить криоустойчивость клеток к повреждающим факторам.

Методы исследования

Поставленные задачи решены с использованием теории траекторной обработки, теории оптических систем, теории рассеяния света, теории взаимодействия лазерного излучения с веществом, методик построения и расчета оптических систем обработки изображений движущихся объектов и приборов нефелометрического анализа, теории криоконсервации и криоповреждений, методики биологического тестирования сперматозоидов на живучесть и терморезистентность.

Научная новизна

1. Разработаны научно-методические основы применения метода траекторной обработки изображений движущихся объектов для анализа подвижности сперматозоидов:

- создана математическая модель подвижной среды, позволяющая определять категории подвижности клеток с показателями достоверности и точности, значительно превышающими таковые для визуально- микроскопического метода;

- разработан алгоритм преобразования исходного изображения анализируемой среды в форму, подвергаемую траекторной обработке;

- разработан алгоритм для траекторной обработки и количественной оценки распределения скоростей и специализированное программное обеспечение.

2. Разработаны научно-методические основы применения нефелометрического метода для определения концентрации сперматозоидов:

- теоретически и экспериментально определены оптимальные условия применения нефелометрического метода для измерения концентрации движущихся частиц специфической формы;

- экспериментально определена зависимость показателей светорассеяния от параметров состояния анализируемого биосубстрата (градуировочная характеристика метода).

3. Определены пороговые, стимулирующие и угнетающие дозы воздействия на сперматозоиды лазерного излучения красного(Я.| =0,63мкм) и инфракрасного (Хг =0,89мкм) диапазона в комплексном анализе, включающем исследование изменений функциональных параметров подвижности;

- для реализации лазерного нефелометрического метода измерения концентрации спермиев установлены пороговые уровни лазерного воздействия;

- обнаружено защитное действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в красном и инфракрасном диапазоне лазерного излучения (А.1 =0,63мкм, Яг =0,89мкм) на сперму, сохраняемую в охлажденном и криоконсервированном виде.

Практическая значимость диссертационной работы заключается в разработке аппаратно-программного комплекса (АПК) и специализированного программного обеспечения для количественного определения параметров движения сперматозоидов, что позволяет автоматизировать микроскопический метод исследования и снизить его трудоёмкость.

Создание лазерного нефелометрического комплекса (ЛНК) позволяет быстро и интактно определять концентрацию сперматозоидов в объеме, что исключает влияние высыхания пробы на показатели подвижности.

Использование методов и средств, предложенных в работе, позволяет проводить неразрушающий экспрессный анализ.

Оба кемплекса АПК и ЛНК могут использоваться в лабораторной биомедицинской диагностике и биотехнологии. 2

Использование НИЛИ в качестве криопротективного фактора позволило достоверно повысить количество репродуктивно полноценных сперматозоидов при криоконсервации. Технология криоконсервации с использованием НИЛИ внедрена и рекомендована к применению в практике биоразведения.

Положения, выносимые на защиту 1. Количественная оценка основных показателей качества сперматозоидов (концентрации и подвижности) с использованием оптических методов обработки изображения и лазерной нефелометрии.

2 Комплексный анализ параметров движения ансамбля объектов сложной формы с использованием методов траекторной обработки скорректированного исходного изображения.

3. Многоцелевой анализ эффективности использования лазерной обработки сперматозоидов, сохраняемых при биологически тестовых температурах.

4. Технология лазерной обработки репродуктивных клеток в процессе криоконсервации.

Апробация работы

Апробация работы проведена на базе лаборатории Клиники Неврозов им. З.Б. Соловьбва г. Москва, НИИ племенного дела, г. Лесные Поляны, консультации №34 "Брак и семья", г. Москва.

Основные положения работы докладывались на VI международной научно-технической конференции "Лазеры в науке, технике, медицине" (Суздаль, 1995), на межреспубликанском заочном научно-техническом семинаре «Применение лазеров в науке и технике» (г. Долгопрудный, 1996), на объединенном научном семинаре факультета «Биомедицинская техника» МГТУ им. Н. Э. Баумана (Москва, апрель 2002; май, декабрь 2003), на научном семинаре кафедры «Лазерные технологии в машиностроении» МГТУ им. Н. Э. Баумана (Москва, февраль 2002; апрель 2003), международной конференции «Телевидение: передача и обработка изображений» (Санкт-Петербург, 2003), международной научно-практической конференции «Измерительные информационные технологии и приборы в охране здоровья» (Санкт-Петербург, 2003), международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек» (Москва, 2003), международной научно-технической конференции «Технологии живых систем» (Москва, 2003), международной научно-практической конференции «Образовательные, научные и инженерные приложения в среде Lab VIEW и технологии National Instruments» (Москва, 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 1 научная статья и 16 тезисов докладов.

Обьём и структура и работы

Диссертация состоит из введения, шести глав, общих выводов, списка литературы и приложения. Основной текст диссертации изложен на 220 страницах. В приложении приводятся дополнительные и вспомогательные материалы. Список литературы включает 229 наименований. Диссертация проиллюстрирована рисунками, таблицами и графиками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована необходимость, актуальность и практическая ценность исследования.

Первая глава посвящена обобщению литературных данных по существующим методам диагностики и хранения семенной жидкости в биологии и медицине. Выделены наиболее информативные параметры качества биосреды и трудности их количественной оценки. Установлено, что наиболее перспективными в данном направлении являются оптические методы исследования. С учётом оптических и динамических особенностей изучаемой биосреды выбрано направление разработки

технологии экспресс - диагностики по параметрам концентрации и подвижности методом обработки визуальных изображений и лазерным нефелометрическим методом.

Анализ литературных данных по криопротективному действию на сперматозоиды физических полей и по стимулирующим эффектам взаимодействия НИЛИ с биосредой показал перспективность исследований защитного действия лазерного излучения с длинами волн 0,63мкм и 0,89мкм, использования данного воздействия для тестирования состояния и качества спермы.

Сформулированы цели и подробно изложены задачи исследования.

Во второй главе описаны материалы и традиционно используемые методы исследования спермы в биологии и медицине.

Третья глава посвящена разработке аппаратно-программного комплекса (АПК) определения траекторий и скоростей движения сперматозоидов для оценки качества спермы человека и животных.

При исследовании эякулята важным показателем фертильности спермиев являются их кинематические характеристики. Вероятность оплодотворения снижается с уменьшением количества подвижных спермиев в эякуляте. Сперматозоиды могут иметь вращательное (манежное), колебательное и прямолинейно-поступательное движение. Анализ механизмов движения клеток, данный в работе (Amelar R.D.,1980) показал, что оплодотворяющей способностью обладают только спермин с прямолинейно-поступательным движением. Количественное соотношение активно-подвижных, слабоподвижных и неподвижных клеток является одним из основных критериев качества в медицинской диагностике спермы.

При разработке комплекса в основу были положены результаты исследований кинематических характеристик клеток оптическими (Соколосски Т., 1977; Габбасов З.А.,1999), микрофотографическими (Macler A., 1979; Panidus D.,1982) и видеомикрофотографическими (Grahman E.F. et al.,1970) методами.

Большинство ранее предложенных (Schoevart D. et.al.,1982; Mortimer D.,1984; Стрелков А.И., Осташко А.П.,2000) методов для количественной оценки параметров движения клеток недоступно для использования в клинико-диагностических лабораториях из-за сложности и высокой стоимости используемого оборудования, недостаточного качества анализа и необходимости применения методов окраски и фиксации подвижных клеток.

Для автоматизированного разделения спермиев по классам подвижности в соответствии с рекомендациями ВОЗ эффективно применение подходов и алгоритмов цифровой обработки радиолокационной информации для обработки массивов данных большой размерности (в том числе изображений), осуществления интегральных преобразований, ассоциативных выборок. Для обеспечения требований быстродействия и эффективности неоднородной системы обработки информации, включающей в себя электронные компоненты и узлы, наиболее пригодны оптоэлектронные процессоры, сочетающие в себе оптику, электронику и цифровую технику, вследствие возможности осуществления связей любой конфигурации, в том числе типа «каждый с каждым» без взаимных помех. К данному классу относятся многоэлементные фоточувствительные приборы с зарядовой связью (ПЗС- фотоприемники).

Таким образом, оптимальным решением задачи количественной оценки подвижности и одновременно автоматизации визуально-микроскопического метода, на наш взгляд, является создание аппаратно - программного комплекса, в котором изображение объекта в виде черно - белого TV - сигнала через объектив микроскопа фиксируется ПЗС камерой и обрабатывается в персональном компьютере. В комплексе реализуется оптический метод исследования - метод обработки изображений по

принципу селекции движущихся целей. При этом используется теория траекторной обработки (ТТО), применяемая в радиолокации.

Разработанная структурная схема комплекса для определения параметров движения представлена на рис1.: __

Микроскоп с камерой снятия изображения

Рис.1. Структурная схема комплекса.

По результатам предварительных экспериментов были выбраны аппаратные средства для реализации АПК. Эксперименты проводились на сперматозоидах человека и животных, изображения которых показаны на рис.2 и рис 3. Как видно из рисунков, концентрация сперматозоидов животных значительно выше (в среднем 3х109 клеток/мл), чем у человека((3-14) х 10' клеток/мл) Кроме того, средняя скорость движения клеток животных выше на 25-35%. Стабильность показателей спермы племенных животных позволяет получить статистически достоверные корреляционные зависимости методом обработки визуальных изображений относительно традиционно используемого визуального метода. Одновременно с этим, ввиду названных отличий биосред, повышаются требования к аппаратным средствам.

Рис.2. Изображение спермы человека. Рис.3. Изображение спермы барана.

По известным данным средней скорости передвижения «цели», т.е. сперматозоида, рассчитывалась наименьшая частота кадров ^ = 1,68 Гц), в соответствии с которой выбиралась ПЗС (прибор с зарядовой связью) - камера со стандартным чёрно-белым видеосигналом и фрейм-граббер, скорость оцифровки которого 15 кадров в секунду, разрешением 640х480 точек.

На основе ТТО разработана математическая модель движения сперматозоидов. Траекторная обработка параметров движения по фиксированной выборке проводилась по схеме (рис.4)

Рис. 4. Структурная схема алгоритма траекторной обработки движения клеток. Параметры траектории определяются по фиксированной выборке.

Имеются моменты измерений:

Этим моментам соответствуют измерения:

где г, - параметр траектории. В данном случае, каждое измерение:

(2)

где

у 1 - отметки клеток на мм моменте измерения.

Траектория движения цели, описываемая полиномом s-ой степени, представляется в виде.

■(*, = ± ±

i = ol

(3)

Так как число измерений положения отметок сперматозоида больше степени полинома, то полиномиальная траектория будет отличаться от истинной, следовательно, необходимо оценить параметры траектории

(4)

и матрицу ошибок

Применительно к решаемой задаче, где траектория описывается квадратичной зависимостью, то есть полиномом второй степени, имеем:

(5)

(6)

Реальную траекторию можно представить в виде суммы из полиномиальной траектории и невязки. То есть:

(7)

Для линейного приближения это можно записать в виде:

О » г(у, ^ + -у ' Ду (8)

4 ' (3 ?

В ходе траекторией обработки (ТО) были определены траектории и параметры движения сперматозоидов: скорости, типы движения, число подвижных клеток.

Метод ТО позволяет разделить траектории клеток на классы, соответствующие рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ).

Для корректного использования теории селекции движущихся целей (СДЦ) методически обеспечивалось выполнение следующих условий: 6

• расстояние между клетками, представляющими цели, намного больше размеров самих клеток

• перемещение за такт фиксации намного меньше размеров целей

• движение объекта происходит между предметным и покровным стеклом (исключая движение по третьей координате)

• селекция клеток проводится по анализу движения головки сперматозоида.

Экспериментально установлено, что для сопровождения перемещения клеток оптимальным является хранение данных по перемещению точки, чего невозможно достичь при «резком» изображении. Завышение фокуса позволило превратить изображение головки клетки в темную отметку (рис 6).

Рис.5. Изображение головки клетки в фокальной плоскости.

Рис.6. Изображение головки клетки вне фокуса.

Распределение интенсивности изображения клетки при завышенном фокусе имеет экстремум и графически носит вид впадины, что позволяет четко определить положение клетки. Пороговая обработка изображений представлена на рис. 7 и рис. 8.

Рис.7. Пороговая обработка изображения Рис.8. Пороговая обработка изображения

в фокальной плоскости вне фокуса .

Для анализа геометрии сперматозоида следует работать в "резком" фокусе, для траекторной обработки - требуется завышение фокуса.

Стадии процесса оценки подвижности сперматозоидов и схема этапов работы АПК подробно описаны в диссертации.

Использование АПК для экспресс-диагностики позволяет повысить точность определения параметров подвижности (соотношения активно-подвижных, слабоподвижных и неподвижных спермиев) и снизить трудоемкость процесса за счет его автоматизации.

Основным количественным показателем разработанного метода является число анализируемых частиц в каждой из категорий сперматозоидов и в целом в пробе (п). Приняв обычное в этих случаях предположение о пуассоновском распределении частиц

в поле зрения системы, получим, что относительная погрешность оценки количества частиц в каждой категории 5о = (п)"0-5

Обычно в одном поле зрения анализируется до 100 частиц (п=100); при этом 5о=0,1. Увеличение числа частиц может быть достигнуто смещением поля зрения; при этом n=625, и 5„=0,04.

Макетный образец аппаратно-программного комплекса определения параметров движения сперматозоидов включает следующие элементы:

♦ * ПЗС камера, выход-стандартный черно-белый видеосигнал;

♦ фрейм - граббер (разрешение кадра 640x480 точек, 256 оттенков серого цвета на одну точку (один байт)); скорость оцифровки 15 кадров в секунду (при снятии последовательности кадров));

♦ персональный компьютер Pentium (не ниже 200).

В четвертой главе приведены результаты экспериментально-теоретического исследования возможности применения лазерного нефелометрического метода для экспресс - контроля концентрации сперматозоидов.

В работах (Сидько Ф.Я.,1969, Sokolosski J.,1977, Rondeau M, Rouleau М.,1981, Лопатин В.Н.,1988, Пшеничникова Т.М.,1990, Сорокин Н.В.,1990, Безрукова А.Г., 1996) показана перспективность применения нефелометрического метода светорассеяния для анализа биологических суспензий, обусловленная возможностью исследовать пробы среды в объеме, без ограничения подвижности и влияния повреждающих факторов, например, разбавителей биосред и средств окраски клеток. Применение метода лазерной нефелометрии в клинической иммунологии и реологии показало высокую эффективность, стабильность, точность и быстродействие.

Определению характеристик сперматозоидов по спектру рассеянного монохроматического излучения на основе эффекта Доплера посвящен ряд работ (Еськов АЛ. и др.,1982; Evenson D.P. et.al.,1982; Jeulin С. et.al.,1982, Foster M. et.al.,1983). Математическое обоснование и преимущества использования лазерного излучения в данном методе подробно описал американский ученый J.Frost (1981).

Наиболее популярной моделью для решения прямой и обратной задач светорассеяния является представление дисперсной биосреды набором однородных сфер, т.к. многие клетки и микроорганизмы по форме представляют собой шары или эллипсоиды. Для сферической формы рассеивателей имеется точное решение, что позволяет оценить адекватность применения того или иного приближения. Универсальной моделью объектов живого микромира - бактерий, спор, дрожжей, растительных и животных клеток, микроводорослей — может служить эллипсоид вращения. Варьируя соотношения осей, можно получить палочко- и дискообразные частицы и аппроксимировать другие формы (цилиндры и сфероиды).

Выбор теории светорассеяния и граничных условий её применимости определялся оптическими свойствами биосреды.

Решение задачи о рассеянии света с учетом формы, микроструктуры, полидисперсности дает теория Ми, позволяющая рассчитать угловое распределение рассеянного частицей света как функцию безразмерного параметра дифракции р=2лг/Х (где г-радиус частицы, длина волны падающего излучения). Расчет граничных условий по параметру дифракции показал необходимость использования 2-го приближения (р»1).

Характеристикой изменения в пространственном распределении света является индикатриса светорассеяния, определяющая интенсивность света как функцию угла рассеяния. Измерение индикатрисы рассеяния включает освещение объекта и 8

регистрацию интенсивности рассеянного веществом света под различными углами, в зависимости от оптических характеристик биосреды.

Результаты теоретических и экспериментальных исследований показали, что нефелометрический метод приемлем для исследования зависимости характеристик светорассеяния от концентрации и подвижности сперматозоидов.

Для математического описания ансамбля используется функция, характеризующая состояние частиц, в каждой точке пространства:

Вероятность нахождения частиц в конфигурации определяется величиной £ (Г|,...,ГП, У],...,У«,0 <1гь..., <}гп Каждая частица находится в элементе объема

(1г, около точки п и имеет скорость в интервале от У, до У,+ ёу,. Функция (¡, нормируется из условия:

К(Г|,...,Гв>Уь...,УпД)<1г,,.. ,<МУь...,<1У.= 1 (10)

Введя обозначение - вектор, определяющий состяние частицы

запишем в виде

1(п(х,Д)с1х,,...,с1хп= 1 (И)

В случае отсутствия подвижных частиц, состояние системы покоящихся характеризуется только положением частиц:

М (12)

В случае независимых рассеивателей

£,=(п"')п-п (х,)... п (х.)... п (х.) (13)

1г(х)ск=Ч (14)

V

где V -объем, в котором находятся частицы,

Функция ^ (х„ I) дает статистическое описание системы. Любая измеряемая характеристика А* рассматриваемого ансамбля (например, интегральная характеристика светового рассеяния, коэффициент пропускания) зависит от и

является средним значением соответствующих характеристик А, реализуемых в возможных состояниях системы:

А"=/ГвА<1х,..(кп (15)

В первом борцовском приближении, без учета многократного рассеяния интегральное рассеяние определяется рассеянием всех частиц объема.

Р,/^!^^^^ (16)

Изменение сигнала светорассеяния биологических объектов связано с вариациями концентрации, размеров, формы, а также морфологией их внутренних компонентов; особое значение имеют параметры зондирующего излучения.

Выбор длины волны зондирующего ихтучения определялся исходя из оптических свойств биосреды, в диапазоне, где биологические среды (бактерии, суспензии, лимфа, сперма) имеют наименьшее поглощение (1-5)% и значительное рассеяние. Известно, что на длине волны 0,9 мкм наблюдается наименьшее поглощение в жидких средах. Экспериментально полученные нами спектральные характеристики спермы показали, что оптимальным диапазоном длин волн для диагностики является 0,87-0,90 мкм (излучение GaAs, Я,= 0,89мкм).

Для измерения использовался нефелометр, разработанный в МГТУ им. Н.Э. Баумана, при участии автора в схемотехнической и конструкторской части. Исследуемая нативная биосреда сохранялась в специальной термокамере при температуре 37° С. Порцию спермы помещали в кювету нефелометра и проводили измерение в 10 сериях по 4 повтора в каждой.

Анализ данных показал, что нефелометрический метод регистрирует линейное уменьшение концентрации сперматозоидов в зависимости от степени разбавления

(нелинейность не более + 2%; среднее квадратическое отклонение (СКО) не более +

0.5.).

Функциональная зависимость светорассеяния не только от концентрации, но и от подвижности при степени разбавления от 1:40 до 1:100 раз, очевидно, объясняется еще и тем, что с утратой жизнеспособности сперматозоид меняет не только свою подвижность, но и другие характеристики, например форму.

Длительность нефелометрического исследования составляет 11с и не влияет на свойства анализируемого субстрата.

Подсчет концентрации клеток также проводили стандартным визуальным методом в камере Горяева, подвижность спермиев определяли по традиционно используемым в биологии и медицине методикам. Параллельно для каждой пробы определяли оптическую плотность на фотоэлектронном колориметре и светорассеяние на нефелометре.

Сравнительные экспериментальные исследования нефелометрического и известного фотоколориметрического метода показали, что предложенный метод измерения концентрации по величине случайной погрешности многократных определений одной и той же пробы на порядок превосходит второй.

Лазерный комплекс экспресс-диагностики концентрации спермы состоит из нефелометра и специализированного программного обеспечения.

Предложенная технология определения концентрации сперматозоидов состоит в следующем:

1. с помощью разработашюго АПК определяется подвижность;

2. с использованием лазерного нефелометрического метода по изменению интегральной характеристики светорассеяния с учетом ранее измеренной подвижности определяют концентрацию

По совокупности измеряемых величин на основе медико-биологических нормативов, приведенных в рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), определяется репродуктивная полноценность клеток.

Таким образом, разработан комплекс для экспресс-диагностики спермы на основе метода лазерной нефелометрии и метода обработки оптических изображений, позволяющий определять качество спермы по параметрам подвижности и концентрации

Достоинства разработанного комплекса: высокая точность, объективность, скорость выполнения анализа, удобство использования, сохранение результатов анализа в графическом и табличном виде.

Решение задачи нефелометрической диагностики биосреды требует определения пороговых доз воздействия НИЛ И. В экспериментальных исследованиях установлено, что за пределами пороговых доз воздействия существуют диапазоны стимулирующих и угнетающих доз.

Исходя из теории биотехнических систем (БТС), объект исследования, технологию и аппаратуру для анализа спермы следует рассматривать как единую биотехническую систему лабораторного анализа (БТС ЛА), для разработки которой целесообразно учитывать основные принципы синтеза БТС. Согласно принципам построения БТС при анализе объекта как элемента биотехнической системы необходимо учитывать, что параметры взаимодействующих с объектом физических полей не должны превышать физиологический диапазон адаптации объекта и вызывать его изменения.

Исходя из этого, в пятой главе исследовалось воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) с длинами волн 0,63 мкм и 0,89 мкм на биосреду с целью

определения доз невозмущающего, биостимулирующего и угнетающего действия НИЛИ на спермин.

В биологии принято оценивать степень действия фармакологических препаратов и различных физических полей на биорепродуктивную полноценность сперматозоидов по изменению абсолютного показателя живучести (АПЖ) опытных групп относительно контрольных. АПЖ лредставляет сумму подвижности клеток за определенные промежутки времени:

АПЖ= О, П,+ П2 + г3 П3 +.....+ ГТ„)ЛЬ где

П| Пм - последовательные оценки подвижности сперматозоидов, выраженные в баллах или процентах.

.. Ь. .отпезки времени в часах, вычисляемые по формуле:

4 — ~ 1

- интервал времени, за который определяется подвижность

клеток.

7'„ - время от начала опыта до п-го измерения. _ суммарное время тестового исследования от его начала до полной потери жизнеспособности клеток.

Дозой порогового воздействия считается доза, при которой изменение АПЖ не превышает 2%, стимулирующего - (АПЖобд - АГОК^нприц) > 2%, угнетающего -(АПЖ^^-АПЖ^) > 2%.

В исследованиях после лазерной обработки биосреда подвергалась традиционным для биологических исследований шоковым испытаниям на биорепродуктивную полноценность. При этом исследовали живучесть сперматозоидов баранов при различных температурах хранения (38°С, 45°С,18°С) и охлаждении до 0°С. Каждый эксперимент проведен в 7-12 сериях по 3 повтора в серии (Р< 0,01; Р<0,05). Биосреда подвергалась обработке лазерным излучением с параметрами, приведенными в таблицах 1 и 2. Время экспозиции варьировалось от 10 до 300 с шагом 5с

Таблица 1

Параметры излучения GaAs лазера с длиной волны 0,89 мкм

Таблица 2

Параметры излучения лазера с длиной волны 0,63 мкм

Эффект воздействия НИЛИ на живучесть и подвижность сперматозоидов оценивался по превышению абсолютного показателя живучести облучённых спермиев над контролем. Из проведенных исследований установлены уровни порогового воздействия (УПВ). Показано, что на них влияет мощность, длина волны и параметры модуляции излучения.

В процессе исследования выявлено, что за пределами УПВ существует стимулирующее воздействие лазерного излучения, выраженное в увеличении абсолютного показателя живучести при определенных сочетаниях параметров лазерного излучения.

Зависимость индуцированных изменений анализируемых показателей от дозы имеет немонотонный характер. Одинаковые дозы при разных частотных и временных характеристиках вызывают различные эффекты.

При этом наиболее эффективной является лазерная обработка сперматозоидов с длительностью экспозиции 30с, 60с, 90с, 120с. Эти данные согласуются с классификацией ритмов, характерных для динамики жизнедеятельности субклеточных структур, отдельных клеток, простых и сложных одно- и многоклеточных организмов, а также популяций или экосистем (Моисеева Н.И., Сысуев В.М., 1981). В исследованиях по влиянию лазерного излучения (0,63 мкм) на морфофункциональные свойства сперматозоидов человека максимальное стимулирующее действие установлено при времени экспозиции 30 с и 60 с.

Эксперименты показали, что однократная обработка сперматозоидов НИЛИ с длинами волн 0,63 мкм и 0,89 мкм повышает живучесть клеток, сохраняемых при температуре 38°С, соответственно на 10-20 % и на 40-100% в зависимости от параметров излучения.

В изучении выживаемости клеток при повышенной температуре (45°С) установлено стимулирующее действие лазерного излучения с длиной волны 0,89 мкм и дозе облучения 19 мДж/см2 (50 с), составляющее 40%. Максимальное стимулирующее действие излучения с длиной волны 0,63 мкм составило 94% при дозе облучения 31 мДж/см2 (50с).

Выраженный стимулирующий эффект проявлялся при времени облучения 30-60с. По мере увеличения поглощенной энергии стимулирующий эффект переходит в ингибирующий.

При температуре хранения 18°С установлено повышение живучести опытных групп эякулятов над контрольными на 12-25%.

Исследование на устойчивость сперматозоидов к "холодовому шоку" (резкое охлаждение до 0°С) показало преобладающее стимулирующее действие излучения Gate лазера (70 - 100% по отношению к контролю), в то время как излучение He-Ne лазера защитило клетки на 30-40%

Таким образом, в результате данной части работы экспериментально определены дозы порогового воздействия, используемые в диагностике, и дозы стимулирующего характера лазерного излучения.

Установленное стимулирующее действия лазерного излучения (см. табл.4) позволило сформулировать следующую задачу исследования как создание технологии лазерно-криогенной консервации (глава 6). Для достижения максимального криозащитного эффекта были оптимизированы дозовые диапазоны стимулирующего воздействия лазерного излучения.

Таблица 3

Эффективность воздействия лазерного излучения на живучесть спермиев вне организма.

Количество серии экспериментов N=12

Доза облучения, мДж/см2 Длительность экспозиции, с АПЖОЕЛ-АПЖм>|птоль% № режима работы лазера

1. X-0,89 мкм

t термостатирования клеток =» 38"С

45,80+0,10 120 98,30+1.10* IV

24,00+0,10 60 95,20+0,50» IV

34,00+0,10 90 93,00+0,90* IV

7,60+0,05 40 75,40+1,60** III

69,00+0,10 90 50,40+1,20* V

Продолжение таблицы 3

"Тепловой шок", 1 термостатироваии* клеток = 45"С

19,00+0,10 50 40,30+1,40»* IV

2,40+0,05 60 37,20+0,80» V

5,70+0,05 60 31,70+1,00» II

г термостатирования клеток = 18°С

34,00+0,10 90 20,1010,70» IV

5,70+0,05 60 20.50+1,20» п

5,70+0,05 30 19.00+1,50* ш

92,00+0,10 120 18,40+2,50** III

] 7,20+0,05 90 17,90+1,80* III

69,00+0,10 60 16,30+3,00** V

11,60+0,10 60 16,40+0,05* III

"Холодовой шок", 1 термостатирования клеток = 0°С

69,00+0,10 90 99,00+3,40 V

8,60+0,05 90 84,90+1,50 п

46,00+0,10 60 70,50+0,70 V

2. Я = 0,63 мкм

1 термостатирования клеток = 38°С

8,60+0,05 30 24,00+1,00» III

17,00+0,10 40 16,70+1,70»* II

12,00+0,10 30 10,20+0,90»» I

"Тепловой шок", 1 термостатирования клеток - = 45°С

31.00±0,10 50 94,60+1,70*» П1

38,00+0,10 60 80,40+0.80» III

26,00+0,10 60 53,20+1ДО* П

17,00+0,10 40 50,00+2,50** II

1 термостатирования клеток - 18°С

74,4+0,10 120 34.20+0,90* 111

7,4+0,05 180 26,00+1,10* II

51,6+0,10 120 24,30±>,30* И

13,0+0,10 90 22,20+1,80* II

"Холодовой шок", 1 термостатирования клеток = 0иС

38,00+0,10 120 43,40+1,20* V

37,00+0,10 60 43,30+1,80* II

19,00+0,10 30 36,30+1,40* V

•Р<0,01;«Р<0,05

Из анализа работ по исследованию механизмов криоконсервации (Крамар Т.И. 1982, Дрокин К.Е.,1998, Смаглий Н.Ю.,1985) установлено, что повреждающее действие на сперматозоиды при криоконсервации происходит вследствие разрушения мембраны клетки.

Экспериментально исследовалось воздействие НИЛИ на живучесть сперматозоидов, подвергнутых глубокому замораживанию до температуры -196°С согласно стандартной биологической методике криоконсервации по разбавлению, замораживанию и хранению спермы (ГОСТ 6909-72, ГОСТ 10652-73). Эффект оценивался по изменению АПЖ.

Результаты экспериментов показали, что максимальным защитным действием обладает излучение с ^0,89 мкм. Предполагаем, что это связано с наибольшим проникновением излучения полупроводникового лазера в клетку и воздействием на восстановительные и стимулирующие свойства клетки на «организационном» субклеточном уровне и ДНК

Таблица 4

Эффективность использования лазерного излучения в качестве криопротекторз репродуктивных клеток.

Доза облучения, мДж/см3 Врем« экспозиции, с АПЖоьл-АПЖК01Ггкшъ% № режима работы лазера

1 криохранения клеток = -196 °С

1. Х=0,89 ыкм

5,70+0,05 30 97,00+1,10* 111

17,20+0,10 90 70,00+1,50» Ш

34,50+0,10 90 68,20+2,60» IV

92,00+0,10 120 65,30+1,30* V

11,70+0,10 60 59,10+1,30* Ш

2. Х=0, 63 ыкм

51,60+0,10 120 54,20+3,40** 1

56,00+0,10 90 24,80+1,80* III

*Р <0.01; **Р <0.05

Таким образом, впервые экспериментально установлены дозы стимулирующего действия излучения GaAs лазера на криосохраняемые сперматозоиды с максимальным двукратным эффектом (по отношению к контролю) при дозе облучения 5,7мДж /см2.

На основе экспериментальных данных оптимизированы параметры лазерной обработки биосреды для технологического процесса глубокого замораживания.

В проведённых исследованиях определено оптимальное соотношение параметров обработки НИЛИ биосреды для получения максимального стимулирующего действия на клетки, сохраняемые при различных температурах. Показано высокое криозащитное действие НИЛИ на спермоклетки, позволяющее повысить живучесть оттаянных сперматозоидов в 2 раза по сравнению с традиционно используемой технологией криоконсервации и в 1,5 раза по сравнению с применением магнитного поля (Ковалев М.Г., 1988), электрического поля (Марющенко А.В.,1985; Курзин Н.Н., 1999) и ультразвука (Степанов А.С., 1991).

Технология лазерно-криогенной консервации заключается в следующем:

1. Предварительный контроль качества спермы по показателям подвижности и концентрации с применением методик экспресс-диагностики спермы, описанных выше;

2. Однократное лазерное воздействие с установленными оптимальными параметрами воздействия на биосреду перед эквилибрацией;

3. Глубокое замораживание согласно стандартной методике криоконсервации спермы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ♦ В результате обобщения научно-технической информации и анализа состояния проблемы показана актуальность и возможность разработки автоматизированных средств анализа качества спермы человека и животных.

Разработан алгоритм траекторной обработки и специализированное программное обеспечение для реализации метода обработки изображений применительно к объекту исследования.

Теоретически обосновано использование метода светорассеяния на ансамбле частиц (лазерного нефелометрического метода) для диагностики подвижности и концентрации исследуемых объектов в пробе малого объема.

♦ Экспериментально определена взаимосвязь изменения характеристик светорассеяния с параметрами состояния объекта исследования (концентрацией и подвижностью). Разработана технология определения концентрации клеток нефелометрическим методом, позволяющая повысить точность на 30%.

♦ Рассчитан, создан и прошел экспериментальную апробацию макетный образец лазерного автоматизированного комплекса экспресс-диагностики, особенностью которого является наличие двух автоматизированных систем, снабженных специализированным программным обеспечением.

♦ Экспериментально определены пороговые дозы, дозы стимулирующего и угнетающего действия НИЛИ с длинами волн А.д=0,63мкм, А,2=0,89мкм применительно к объекту исследования.

♦ Для обеспечения максимальной выживаемости репродуктивных клеток экспериментально определены параметры лазерной обработки при различных режимах их хранения (нормотермия при 38°С, гипертермия при 45°С, гипотоническое хранение при 18°С).

♦ Показана возможность и перспективность использования лазерного излучения с Х|=0,63мкм и Ä.j=0,89 мкм в качестве дополнительного криопротективного фактора. Установлено, что максимальным криозащитным действием обладает лазерное излучение с Хг=0,89мкм при Woo,, = 5,7мДж/см2, ТЭЮ1;=30 с.

♦ Разработана технология обработки излучением He-Ne и GaAs лазеров ( А.]=0,63мкм, Ä,j=0,89 мкм), позволяющая повысить криоустойчивость клеток к повреждающим факторам в 1,5 и 2 раза соответстветвенно отношению к контролю.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григорьянц А.Г., Пырикова С.И., Загидуллин Р.Ш. Определение концентрации нативных спермиев лазерным нефелометрическим методом // Медико-технические технологии на страже здоровья: Тез. докл.5-й Междун конф., Шарм эль шейх, 4-11 октября 2003 г.- М., 2003.-С. 95-96.

2. Загидулин Р.Ш., Пырикова С.И., Иванов Ю.В. Измерение концентрации сперматозоидов лазерным нефелометрическим методом // Радиоэлектроника в медицинской диагностике: Тез.докл. 2-й Междун. конф. - г. Москва, 1997. - С.123-124.

3. Загидуллин Р.Ш., Пырикова С.И., Нефелометр - на базе PC // Научные и инженерные приложения в образовательной среде LABVIEW: Труды междун. конф.-Москва, 2003.-С 288-290.

4. Пырикова С.И., Гаткин Е.Я., Брыдун А.В.Биостимуляция семенной жидкости человека энергией лазерного луча // Квантовая медицина: Тез. докл. I конф. - Москва, 2000.-С 114.

5. Пырикова С.И. Иванов Ю.В., Беркингейм М.Л. Воздействие лазерного излучения с длиной волны 0,63 мкм на семенную жидкость человека// Применение лазеров в науке и технике: материалы межреспубликанского заочного научно-технического семинара

-Иркутск, 1996.- Вып. 8.-С. 13-16.

6. Воздействие лазерного излучения на семенную жидкость человека/ С.И. Пырикова, Ю.В. Иванов, М.Л. Беркингейм и др. // Клиническая лабораторная диагностика-1998.-№5.-С.15-17.

7. Пырикова С.И., Жуковская Н.В., Ерохин А.С. Воздействие низкоинтенсивного лазерного ихтучения на криоустойчиость семенной жидкости // Радиоэлектроника в медицинской диагностике: Тез. докл.2-й Междун. конф.-Москва, 1997.-C100-102.

8. Пырикова С.И., Загидуллин Р.Ш. Программно- аппаратный комплекс оценки подвижности биологических клеток методом обработки изображений: Тез. докл.2-й Междун. конф.-СПб, 2003 -С. 95-97.

9. Пырикова С.И. Низкоинтенсивное лазерное излучение в оптической диагностике биологических жидких сред // Лазеры в науке и технике -2003: Тез. докл.ХНУ Междун. конф.-Сочи,2003.-С. 121-123.

10.Пырикова С.И. Исследование протективного действия лазерного излучения на функциональные свойства репродуктивных клеток, сохраняемых в охлажденном и глубокозамороженном состоянии // Лазеры в науке и технике -2003: Тез. докл.ХНУ Междун. конф.-Сочи, 2003.-С.123-125.

11. Пырикова С.И. Автоматизация стандартного лабораторного исследования эякулята человека // Измерительные информационные технологии в охране здоровья -2003: Тез. докл. XIV Междун. конф.-СПб, 2003.- С.78-80.

12.3агидуллин Р.Ш., Пырикова С.И. Нефелометр - на базе PC // Научные и инженерные приложения в образовательной среде IABVГEW. Труды междун. конф.-Москва, 2003.-С 95-97.

13.Пырикова С.И. Автоматизация и стандартизация контроля качества жидких биологических сред методом оптической диагностики // Пища, экология, человек: Материалы 5-ой МНТК.- Москва, 2003.-С75-77.

14.Пырикова С.И. Григорьянц А.Г. Низкоинтенсивное лазерное излучение -инструмент зондирования и стимуляции биологически подвижных объектов сложной формы // Технологии живых систем. Материалы МНТК.- Москва, 2003.-С.131-133.

Сдано в печать 26.04.04 Формат 60x90/16 Объем 1 печл Тираж100экз.3ак.№8

Отпечатано в ООО "Эдэль-М" 105005, г.Москва, ул Бауманская д.43/1

Р- 8290

Введение.

Глава 1. Актуальность проблемы. Цели и задачи исследования.

1.1 .Актуальность работы.

1.2. Аналитический обзор литературы.

1.3. Методы оценки качества спермы человека и животных.

1.3.1. Определение концентрации спермы.

1.3.2.Оценка подвижности и типы движения спермиев.

1.4. Генетические ресурсы — составляющая часть биосферы.

1.5. Цели и задачи исследований.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Характеристика спермы человека.

2.2. Характеристика спермы животных.

2.2.1.Оценка качества спермы животных.^.

2.2.1.1.Определение концентрации сперматозоидов.

2.2.1.2. Определение процента живых.

2.2.1.3. Испытания методами шоковых воздействий.

2.3. Выводы.

Глава 3. Аппаратно-программный комплекс определения параметров траекгорий и скоростей движения сперматозоидов.

3.1.Предпосылки решения задачи экспресс - диагностики спермы оптическими методами.

3.2 Оптико-электронные системы формирования и обработки изображения.

3.2.1. Оптико-электронные системы формирования и обработки изображений.

3.2.2. Оптическая диагностика рассеивающих сред.

3.3. Постановка задачи.

3.3.1. Ошибки при анализе эякулята.

3.3.1.1.Статистические ошибки подсчета при анализе эякулята.

3.3.1.2.Ошибки подсчета при оценке концентрации сперматозоидов.

3.3.1.3.Ошибки подсчета при оценке подвижности и морфологии сперматозоидов.

3.3.1.4. Значение контроля качества.

3.3.1.5.Ругинный ко i гтро ль и корреляция результатов между образцами.

3.3.2.Схема основных этапов работы аппаратно-программного комплекса.

3.3.3.Математическое решение к выбору аппаратного средства.

3.3.4. Обзор имеющихся аппаратных средств.

3.3.4.1.Фрейм-граббер ы.

3.3.4.2.ТУ-тюнер ы.

3.3.4.3. Преобразователи VGA-TV.

3.3.3.4. MPEG - плейеры.

3.4. Алгоритм траекторией обработки.

3.4.1 Фильтрация.

3.4.2.Точность оценок траектории.

3.4.3. Операция экстраполяции.

3.4.4.Экстраполяция ковариационной матрицы.

3.4.5. Селекция.

3.4.6.0бнаружение.

3.4.7.3авязка.

3.4.8. Формирование списка траекторий.

3.5. Реализация аппаратно - программного комплекса.

3.5.¡.Оптимизация параметров настройки (увеличения микроскопа и фокусировки изображения).

3.5.1.1. Увеличение микроскопа.

3.5.1.2. Фокусировка изображения.

3.5.3. Алгоритмы траекторией обработки.

3.5.3.1. Алгоритм пороговой обработки.

3.5.3.2. Алгоритм логического сглаживания.

3.5.3.3. Обработка траекторий.

3.5.4. Тестирование.

3.5.5. Оценка биосреды.

3.5.6. Работа с программой.

3.5.7. Руководство пользователя.

3.5.8.Вывод ы.

Глава 4. Определение концентрации биосреды лазерным нефелометрическим методом.

4.1. Диагностическое значение концентрации сперматозоидов.

4.2. Физические методы анализа биологических дисперсных сред.

4.2.1. Сперма - биологическая дисперсная среда.

4.2.2. Физические методы анализа биодиснерсий.

4.2.3. Применение методов светорассеяниям биологии и медицине.

4.3. Теоретические основы рассеяния света.

4.3.1. Подход к методу исследования на ансамбле частиц.

4.3.2. Краткое описание рассеяния волн в дисперсной среде.

4.3.3. Статистическое описание состояния дисперсной среды.

4.3.4. Интегральное представление характеристик светорассеяния.

4.3.5. Интегральное рассеяние света большими частицами.

4.3.6. Определение угла регистрации рассеянного излучения.

4.4. Требования к параметрам зондирующего излучения.

4.5. Экспериментальное исследование зависимости интегральной характеристики светорассеяния на биосреде.

4.5.1. Общая характеристика прибора.

4.5.2. Анализ погрешностей измерения оптических характеристик рассеяния.

4.5.3.Экспериментальное исследование зависимости характеристик светорассеяния от параметров биосреды.

4.5.4 Исследование зависимости характеристик светорассеяния от подвижности сперматозоидов.

4.6. Выводы.

Глава 5. Взаимодействие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) с биообъектами.

5.1. Взаимодействие НИЛИ с биообъектами.

5.1.1. Стимулирующее и биологическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения.

5.1.2. Биофизический аспект взаимодействия НИЛИ с биообъектами

5.1.3. Модельный анализ основных биологических процессов при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения.

5.1.4. Информационный аспект структурного отклика биожидкостей на внешние воздействия.

5.2. Исследование воздействия лазерного излучения на сперму человека.

5.2.1. Исследование воздействия лазерного излучения с длиной волны 0,63 мкм на сперму человека.

5.2.2. Исследование воздействия лазерного излучения с длинами волн 0,63 мкм и 0,89 мкм на сперматозоиды племенных животных.

Глава 6. Исследование воздействия НИЛИ на свойства криосохраняемых репродуктивных клеток.

6.1. Роль и место криобиологии в репродукции человека и животного. бЛЛ.Криконсервация генетических ресурсов.

6.1.2. Биологическая мембрана.

6.1.3. Структурно- биохимические изменения спермиев при криоконсервации.

6.1.4. Альтернативные методы повышения эффективности криоконсервации спермиев.

6.1.4.1. Использование постоянного магнитного ноля ъ криоконсервации спермы.

6.1.4.2. Использование низкоинтенсишюго лазерного излучения (НИЛИ) в криоконсервации спермы.

6.2. Исследование возможности криоконсервации спермы барана с использованием НИЛИ с длинами волн 0,63и 0,89 мкм.

6.2.1.Материалы и методы.

6.2.2. Замораживание спермы.

6.2.3. Оттаивание спермы.

6.2.4. Анализ воздействия НИЛИ на подвижность сперматозоидов.

6.3. Результаты экспериментов.

Согласно современным представлениям жизнь на Земле возникла около 3,5 миллиарда лет тому назад. Основой возникновения жизни было появление молекулы ДНК - уникального биосубстрата, определяемого двумя свойствами: способностью к воспризводству и синтезу белков и определенной последовательностью аминокислот.

Индивидуальные качества каждого живого существа определяются генетическим набором, содержащимся в ДНК. ДНК человека состоит из более, чем трех миллиардов последовательно соединенных частиц, объединенных в 100 ООО геномов. Каждый геном ответственен за какое-либо свойство организма человека. Сто тысяч геномов распределены вдоль 23 пар хромосом.

ДНК-человека - самая мощная молекула из существующих в природе нашей планеты. Именно ДНК обеспечила человеку доминирующее положение в современном живом мире на Земле. Всего 10 ООО лет тому назад на Земле было около 10 млн. человеческих особей. Около 4000 лет назад их число стало быстро увеличиваться. К началу нашей эры их было уже четыре миллиарда человек.

В текущем столетии человек стал преобладающим видом не только по численности, но и по распространенности на планете: он проник на самые высокие точки Земли, морское дно и в космос. Ответственность современного человека за будущее развитие жизни на планете возрастает с каждым днем.

Философия наших древних предшественников, считавших своей основной задачей сохранение человеческого рода, практически не изменилась на протяжении многих веков существования человечества.

В современной биологической науке понятия "адаптация" и " оптимизация" вида практически отождествлены с возможностями воспроизводства здорового потомства.

В настоящее время бесплодие в браке - проблема, занимающая особое место в медицине. Бесплодие в браке практически всегда социальное, психическое, и очень часто физическое. При частоте бесплодия 15% и выше возникает проблема социально-демографическая. Немаловажное значение имеют данные о том, что у нерожавших женщин частота опухолей репродуктивной системы значительно выше, чем у женщин, имеющих детей.

В настоящее время в медицине наиболее остро встает вопрос лечения и диагностики заболеваний, связанных с репродуктивной функцией человека.

Приведем небольшую статистику: состояние беременных женщин с каждым годом резко ухудшается, выросла заболеваемость беременных по сравнению с 1993 годом: анемией - на 14,5 %, болезнями мочеполовой системы - на 13,9 %, системы кровообращения - на 11,9 %, число поздних токсикозов увеличилось па 9,4%. Доля нормальных родов составила в 1998 году - 31,5 % (в 1994-37,9 % , в 1990 году 52 %). Заболеваемость злокачественными новообразованиями репродуктивной системы составила 280 на 100 ООО человек населения. Заболевания мочеполовой системы у мужчин увеличилась на 16,6% (1993г.-10,3%).

О развитии тревожной тенденции мужского бесплодия заговорили во всем мире, особенно в России, Германии, Франции и Норвегии: все больше и больше мужчин в промышленно развитых странах не могут стать отцами. Постоянно увеличивается количество супружеских пар, которые ненамеренно остаются бездетными. В 50-е годы в европейских государствах таких семей было около 8%, а в начале 90-х уже свыше 20%. В настоящее время ответственность за бесплодие распределяется уже поровну между супругами в 40% "виноваты" мужчины, в 40% - женщины, в 15% "виноваты" оба, и в 5% случаев причина бездетности остается неизвестной.

Основная причина угрожающе растущей неспособности сперматозоидов мужчин к оплодотворению - загрязнение окружающей среды ядовитыми соединениями промышленного производства, тяжелыми металлами, радионуклидами и другими вредоносными веществами.

Проводя массовые исследования качества и концентрации сперматозоидов в сперме мужчин, немецкие ученые установили, что в среднем насчитывается всего 25 млн. в 1мл эякулята. Для сравнения: в начале нашего века в 1 мл семенной жидкосл! у мужчин было в среднем около 100 млн/мл, 25-30 лет назад этот показатель снизился до 60 млн/мл, а сегодня нормой считается уже 40 млн.

На первый взгляд 40 миллионов - громаднейшее количество, но на долгом пути к яйцеклетке сперматозоиду приходится преодолевать " полосу препятствий": кислоты, энзимы, гормоны. Даже при высокой концентрации сперматозоидов в эякуляте до маточной трубы, где происходит оплодотворение, доходит обычно лишь несколько сотен, а то и десятков живых сперматозоидов, то есть чем меньше полноценных сперматозоидов в эякуляте, тем меньше шансов на зачатие.

Ситуация осложняется существенным ухудшением качества сперматозоидов. По данным немецких ученых в настоящее время в среднем только четвертая часть из них в состоянии оплодотворить яйцеклетку. При изучении причин было обращено внимание на то, что качество сперматозоидов мужчин, проживающих в промышленных районах значительно хуже, чем качество сперматозоидов у мужчин, живущих в более экологически чистых районах.

Например, в Рейно-Рурском районе среднее количество сперматозоидов в эякуляте мужчин к 2000 году снизилось до 14 млн. в 1 мл по сравнению с 24 млн. в 1981 году. В относительно же "чистых" землях Германии соответствующие показатели оказались равными 36 и 44 млн.

Существенные различия в качестве репродуктивных клеток мужчин, проживающих на территориях с неодинаковой экологической ситуацией отмечались также в Дании, Швеции, Австралии и США. По мнению большинства ученых эти очевидные различия настолько велики, что они однозначно указывают на загрязнение окружающей среды как основную причину растущего бесплодия среди мужчин.

От начала формирования мужской половой клетки до полного созревания сперматозоида проходит до 3-х месяцев - время, в течение которого на репродуктивную систему мужчин могут оказывать влияние различные вредоносные факторы.

В лабораторных условиях экспериментальным путем было доказано, что сперматозоиды становятся неподвижными при добавлении в 1 мл эякулята всего 10"2 мг полихлорбифинила, вещества широко применяемого в качестве пластификатора при производстве клеев, лаков и пластмасс.

Не меньший вред может принести контакт с тяжелыми металлами: свинцом, кадмием, ртутью. При попадании в организм они повреждают тончайшие оболочки семенных канальцев и нарушают процесс образования сперматозоидов.

На способность мужчин к зачатию неблагоприятно влияют многие лекарственные препараты: болеутоляющие, гормональные, психотропные средства. Уже давно установлено отрицательное воздействие на мужские половые клетки веществ, сознательно употребляемых людьми: никотин, алкоголь, опиум.

Радикальных методов лечения мужского бесплодия вызванного снижением качества спермы, нет. В качестве мягкой терапии немецкие врачи советуют для восстановления способности к зачатию сменить место жительства на более экологически чистый район.

В последнее время все более широкое применение находит создание "банков семени": мужчина многократно сдает сперму, которая замораживается и хранится при температуре -196 °С. После того как ее набирается достаточное количество "концентрат" вводится женщине в благоприятный физиологический период для зачатия. Для многих мужчин это единственный способ спасения от бездетного брака.

Прогресс в понимании генетической основы мужского бесплодия в совокупности с успехами вспомогательных репродуктивных технологий вернули надежду мужчинам, ранее считавшихся бесплодными. Успех применения ультразвука, лазерного излучения, электрического и магнитного поля в лечении репродуктивных нарушений привел к возрождению интереса к оценке функциональных характеристик сперматозоидов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

В результате обобщения научно-технической информации и анализа состояния проблемы показана актуальность и возможность разработки автоматизированных средств анализа качества спермы человека и животных.

Разработан алгоритм траекторией обработки и специализированное программное обеспечение для реализации метода обработки изображений применительно к объекту исследования.

Теоретически обосновано использование метода светорассеяния на ансамбле частиц (лазерного нефелометрического метода) для диагностики подвижности и концентрации исследуемых объектов в пробе малого объема.

Экспериментально определена взаимосвязь изменения характеристик светорассеяния с параметрами состояния объекта исследования (концентрацией и подвижностью). Разработана технология определения концентрации клеток нсфелометрическим методом, позволяющая повысить точность на 30%.

Рассчитан, создан и прошел эксперимегггальную апробацию макетный образец лазерного автоматизированного комплекса экспресс-диагностики, особенностью которого является наличие двух автоматизированных систем, снабженных специализированным программным обеспечением.

Экспериментально определены пороговые дозы, дозы стимулирующего и угнетающего действия НИЛИ с длинами волн А,.1=0,63мкм, А,2=0,89мкм применительно к объекту исследования.

Для обеспечения максимальной выживаемости репродуктивных клеток экспериментально определены параметры лазерной обработки при различных режимах их хранения (нормотермия при 38°С, гипертермия при 45°С, гипотоническое хранение при 18°С).

Показана возможность и перспективность использования лазерного излучения с А.1=0,63мкм и 0,89 мкм в качестве дополнительного криопротективного фактора. Установлено, что максимальным криозащитным действием обладает лазерное излучение с А.2:=0,89мкм при >/Уобл = 5,7мДж/см2, Т эксп= 30 с. ♦ Разработана технология обработки излучением Не-Ые и ваАБ лазеров (А,|=0,63мкм, А.2=0,89 мкм), позволяющая повысить криоустойчивость клеток к повреждающим факторам в 1,5 и 2 раза соответственно по отношению к контролю.

1. Авдеева С. М., Куров A.B. Алгоритмы трехмерной машинной графики: М.: МГТУ им. Н.Э.Баумана, 1996.-140 с.

2. О значении двойного лучепреломления и ориентации молекул в мембранах в оценке качества семени быка. Б. Н. Аветисян, А. О. Манасян, Ш. С. Саасян, А. К. Дадиванян //Арм. биол. журн.-1985.-Т. XXXVIII, №3.- С. 272—273.

3. Аджимолаев Т.А., Крылов O.A. Влияние излучения гелий-неонового лазера на нервные и эндокринные функции // Материалы к 7 Всесоюзному съезду физиотерапевтов и курортологов.-Л.,1977.- С. 241242.

4. Алешина Т.Е. Индуцированные низкоинтенсивным лазерным излучением (Л,= 890 нм) морфофизиологические и биохимические изменения в процессе развития Drosophila Melanogaster: Автореферат дис. . канд. биол. наук. Обнинск, 2001.- 23 с.

5. Апресян Л.А. Кравцов Ю.А. Теория переноса излучения.-М.:Наука , 1983.—216 с.

6. Аскарьян Г.А., Увеличение прохождения лазерного и другого излучения через мутные физические и биологические среды // Квантовая электроника .-1982.-Т.9, №7. -С.1378-1384.

7. Баркрофт Дж. О скорости некоторых физиологических процессов. М.: Биомедгиз,1987.- 276 с.

8. Богданович У .Я. Использование лазера для лечения повреждений и заболеваний органов опоры и движения // Сов. Медицина .-1980.-№3.-С.61-66.

9. Бондарчук И.А. Гипотеза о механизме индукции адаптивного ответа при облучении клеток млекопитающих в малых дозах // Радиационная биология.-2002.- Т.42, № 1.- С. 36-43.

10. Борисов В. М. Многофакторная регрессионная модель оплодотворяющейспособности спермы быков-производителей // Сб. науч. тр. Гродненского с.-х. ин-та.-1974.- Вып. 20.-С. 3—7.

11. П.Браун Г., Уолкен Дж. Жидкие кристаллы и биологические структуры. -М.: Мир, 1982.-198 с.

12. Бурнашева С.А., Габаева Н.С., Данилова JI.B. Современные проблемы сперматогенеза.-М.: Наука.-1982.-259 с.

13. З.Буров В. А., Корякина JL В. Экспресс-метод определения выживаемости семени быков // Животноводство 1985.- № 7,- С. 43—44.

14. Ван Дюйн К. Зависимость между качеством семени и его оплодотворяющей способностью // Сельское хозяйство за рубежом. -1972.- № 5.- С. 23—27.

15. Веденов A.A. Физика растворов.-М.:Наука, 1984.-107 с.

16. Вепринцев Б.Н., Ротт H.H. Проблема сохранения генофонда особо ценных и исчезающих животных.— М.,1985.—С.973-976.

17. Вепринцев Б. Н. Ротт Н. Н. О возможности восстановления исчезающих видов животных из их консервированных геномов. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР- 1978.- 15 с.

18. Вепринцев Б. Н. Ротт Н. Н. Проблема сохранения генофонда: Информационный материал.- Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР- 1984.47 с.

19. Вернадский В.И. Химическое строение биосферы земли и её окружения.-М.: Наука, 2001.-376с.

20. Винник Е. М., Шуб Г. М. Определение содержания дифтерийного интитоксина в сыворотке крови методом лазерной нефелометрии // Сб. науч. тр. Ленингр. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (Л.:).- 1990.- Вып. 2.- С. 168-173.

21. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И. Биофизика. -М.: Медицина, 1983.-271с.

22. Волькенштейн М.В. Биофизика: Учебное руководство.- М.: Наука, 1988.- 592 с.

23. Вольф Е.Б. Лазерные эффекты в растворах биополимеров: Автореф. дис. . канд. техн. наук.- Екатеринбург, 1995.- 14с.

24. Ворник Б.М. Мужское бесплодие: проблемы классификации и диагностики //Пробл. репрод.-1996.-№ 2.-С.38-40.

25. Воробьева O.A., Скрипкина O.A., Корсак B.C. Методы оценки морфологии сперматозоидов и их прогностическое значение в программе ЭКО // Пробл. репрод.-1995.-№ 3.-С.71-75.

26. Гайвороновский Г. С. Совершенствование объективных методов оценки качества спермы сельскохозяйственных животных: Автореф.дис.канд. биол. наук. Харьков, 1966.- С. 27.

27. Гапочка A.A. Воздействие электромагнитного излучения на водные растворы и биологические системы: Автореф. дис. канд. техн. наук. М., 1997.-21с.

28. Гаткин Е.Я., Гельман И.Б., Брыдун А.Б. Влияние излучения гелий-неонового лазера на морфофункционапьные свойства сперматозоидов // Прикладные проблемы лазерной медицины: Тез. докл. V научно-техн. конф. - М.Д993.-С.113-120.

29. Гольдштейн М. Н. Биологические мембраны. — М.: Атомиздат, 1978.230 с.

30. Грин К. Д., Грищенко В. И. Низкие температуры в медицине и в биологии //Наука и человечество. — М., 1985. — С. 59 71.

31. Грищенко В. И. Криобиология и проблемы бесплодия. Киев, 1990. - С. 24 - 40.

32. Гулевский А.К., Бондаренко В.А., Белоус A.M. Барьерные свойства биомембран при низких температурах. — Киев: Наукова думка, 1988.208 с.

33. Девятков Н.Д., Зубкова С.М., Макеева Н.С. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения // Успехи современной биологии.-1987.-Т.103, вып.1.-С.31-43.

34. Деревинский Б., Фоломеев В. Связь качества спермы с активностьюаминотрансфераз // Свиноводство. 1975.- № 7.- С. 24—25.

35. Деряженцев В.И., Ерохин A.C. Наставление по применению ГЖУК -ТРИС -буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов -производителей.- Лесные поляны.: ВНИИплем, 1992.-11 с.

36. Еськов А. П., Соколов П. В. О возможности анализа распределения по скоростям сперматозоидов быка: Токсиколого-гигиеническая и экспериментально-клиническая оценка // Сб. ст. Всесоюз. науч. медико-техн. о-ва.- М., 1987.- С. 39-43.

37. Захаров С.Д., Минц Р.И., Скопинов С.А. Действие электромагнитного излучения на биологические объекты и лазерная медицина. Владивосток: ДВО АН СССР, 1989.-С.41-52.

38. Зуев В.Е., И.Э.Наац Обратные Задачи оптики атмосферы.- Л.: Гидрометеоиздат, 1990. 281 с.44.3уев В.Г., Банах В.А., Покасов В.В. Оптика турбулентной атмосферы. -Л.: Гидрометеоиздат, 1988.- 231с.

39. Иванов А.П., Данилюк В.Г. Об эффектах затенения света в мутных средах с плотной упаковкой // Журн. прикл. спектр.- 1975.- Т. 22, №.2.-С.302-306.

40. Иванов А.П., Лойко В.А., Дик В.П. Распространение света в плотноупакованных дисперсных средах. Минск: Наука и техника, 1988.-276с.

41. Изотова В.Ф., Максимова И.Л., Романов C.B. Анализ ошибок лазерного поляризационного нефелометра // Опт. и спектр.- 1996.- Т.80, в.6 -С.1001-1007.

42. Илларионов В.Е. Основы лазерной терапии. -М.: Респект, 1992.-С.28-50.

43. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. М.: Мир, 1981.-Т. 1.-Однократные явления и теория переноса -360с.

44. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. М.: Мир, 1981.-Т.2.- Многократное рассеяние, турбулентность, шероховатые поверхности и дистанционное зондирование — 290с.

45. Калабеков Б.А. Микропроцессоры и их применение в системах передачи и обработки сигналов -М.: Радио и связь, 1988.- 170с.

46. Камардин Н., Воробьев Н. Методы морфометрического анализа для улучшения процесса пробоподготовки // Сб. ст. Всесоюз. науч. медико-техн. о-ва.- С-Пб, 1994.- С. 39-43.

47. Карлов В.А. Применение низкоинтенсивных лазеров и излучения миллиметрового диапазона в эксперименте и клинике.- Саратов, 1994.-123с.

48. Карлов В.А. Миллиметровые волны нетепловой интенсивности.- М.: Наука, 1991.-200с.

49. Кару Т.Й., Календо Г.С., Лобко В.В. Зависимость биологического действия низкоинтенсивного света на клетки от параметров излучения — когерентности, дозы и длины волны // Изв. АН СССР. Сер. физич.-1983.- Т.47, № 10 С. 2017- 2022.

50. Кару Т.И. Фотобиология регуляции метаболизма низкоинтенсивным видимым светом. Троицк, 1985.- 57 с.

51. Кару Т.И. О молекулярном механизме терапевтического действия излучения низкоинтенсивного лазерного света // ДАН СССР — 1986.-Т.291, №5.- С. 1245-1249.

52. Кац Е.И., Лебедев В.В. Динамика жидких кристаллов. -М.: Наука,1988.-144с.

53. Козина О.Н., Максимова И.Л., Романов C.B. Исследования полидисперсности системы биочастиц нефелометрическим методом //Диагностические применения лазеров и волоконной оптики. Саратов.: -СГУ, 1989.-С. 46-50.

54. Королевич А.Н., Хайруллина А.Я., Шубочкин Л.П. Матрица рассеяния монослоя оптически "мягких" частиц при их плотной упаковке // Опт. и спектр.- 1990.- Т.68, в.2.- С.403-409.

55. Королевич А.Н., Хайрулина А.Я., Шубочкин Л.П. Влияние агрегации больших биологических частиц на элементы матрицы светорассеяния

56. Опт. и спектр.-1994.- Т.77,в.2.- С. 278 282.

57. Крамар М. И., Дахно Ф. В., Обозня Э. И. Влияние гипотермии на спермии человека // Сб. науч. тр. АН УССР.- Харьков: 1990. - С. 83-86.

58. Крук H.A. Использование биологически активных веществ при замораживании спермы хряков // Ветеринария. —1996. №10. —С.28-30.

59. Крыжановский Л.Н. Медицинское электричество в XVIII веке //Электричество.-1992.-№2.-С.56-58.

60. Кузмичев В.Е., Чернова Г.В., Каплан М.А. Изучение зависимости биостимулирующего эффекта НЛИ от стадии развития облученных особей Apis mellifera // Физич. мед.- 1994. -Т.5, № 1-2.- С. 19-20.

61. Кузмичев В.Е., Каплан М.А. Чернова Г.В. Биологические эффекты низкоэнергетического лазерного излучения и нелинейное возбуждение биомолекул // Физич. мед.- 1996. Т.5, № 1-2.- С. 65-69.

62. Кузмичев В.Е., Чернова Г.В., Каплан М.А. Концепция неспецифическогомеханизма действия низкоэнергетического лазерного излучения // Вестник академии лазерных наук (JIAH), 1996.- № 6 С. 65-69.

63. Курзин H.H., Горбань A.B., Демьяненко H.A. Устройство для электромагнитного воздействия на биологические объекты

64. Энергосберегающие технологии и процессы в АПК: Тез.докл. науч. конф. по итогам 1998. Краснодар, 1999.-С.54.

65. Курзин H.H., Фонтанецкий A.C. Электрофизические методы повышения воспроизводства животных // Энергосберегающие технологии и процессы в АПК: Тез. докл. науч. конф. по итогам 1998г.-Краснодар, 1999.-С.59.

66. Курило Л.Ф. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью.- 4-е изд., перераб.- М.: медПресс, 2001.- 143 с.

67. Лапрун И.Б. Действие излучения гелий-неонового лазера на перекисное окисление липидов. Автореферат дис. канд. биол. наук.- М., 1981.-18с.

68. Лощилов В.И. Биотехнические системы и информационные взаимодействия // Актуальные проблемы создания биотехнических систем: Сб. научных трудов.- М., 1996. № 1.- С.6-13.

69. Максимова И. Л., Тучин В.В., Шубочкин Л.П. Поляризационные характеристики роговой оболочки глаза // Опт. и спектр.-1986.-Т.60, вып.4.-С.801-806.

70. Максимова И.Л., Шубочкин Л.П. Матрицы рассеяния света на плотноупакованной системе твердых сфер // Опт. и спектр.- 1991.- Т.70, вып.6.- С. 1276-1281.

71. Максимова И.Л., Татаринцев С.Н., Шубочкин Л.П. Эффекты многократного рассеяния в биообъектах при лазерной диагностике // Опт. и спектр.- 1992. -Т.72, вып.5.- С.1171-1177.

72. Малов А.Н., Костюк М.Г. Модельный анализ основных фотобиологических процессов в низкоинтенсивной лазерной терапии //Лазермаркет.-1995.-№ 1 .-С.З 7-3 9.

73. Малое А.Н. Малов С.Н. Структурные характеристики когерентного светового поля , распространяющегося в клеточной структуре

74. Применение лазеров в науке и технике: Сб.статей 8-го межреспубликанского семинара. -Новосибирск, 1992.-С.95-98.

75. Медведев П.М. Роль криопротекторов как стабилизаторов воды в биосредах//Успехи современной биологии.-1973.-Т.75, вып.1.-С.46-60.

76. Меньшиков В.В. Качество клинических лабораторных исследований.-М.:Наука, 2002.- 303с.

77. Михайличенко В.В., Пупкова Л.С. Лазерорефлексотерапия у субфертильных мужчин // Применение лазеров в урологии: Тез. докл. НУ научн.-практ. конф. Чимкент, 1986. - С. 32-36.

78. Морозов А.Н. теория броуновского движения. Метод многомерных функций распределения. М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1993.- 83с.

79. Накагаки М. Физическая химия мембран: — М. : Мир, 1991.- 255с.

80. Наук В. А. Структурно-биохимические изменения спермиев при криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных

81. Автореферат дис . докт.биол.наук.-Харьков.- 1987.- С. 1-28.

82. Науменьков А., Романькова А Н. Влияние степени разбавления спермы разных концентраций на показатели ее живучести // тр. ВНИИК,1984.- С. 124—127.

83. Неустроев Г. В., Метелкин А. Н., Чикин Н. А. Использовние лазерной нефелометрии в дигностике заболевний внутренних органов

84. Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики внутренних болезней: Сб. статей -М.,1992.- С. 77-82.

85. Николов И. Влияние лазерного излучения на сперму быков в криоконсервации // Животноводческие науки.- 1986.- Т.23, № 11.- с.3-7.

86. Оптико-электронные методы изучения аэрозолей / Беляев С. П . ,

87. Никифорова Н. К., Смирнов В.В. и др. М.: Энергоатомиздат, 19 81.- 87 с.

88. Оптическая обработка информации: Пер. с англ./ Под ред. Д. Кейсесента. -М.: Мир, 1980. -350 с.

89. Папулис А. Теория оптических систем и преобразований в оптике: Пер. с англ./ Под ред. В. И. Алексеева М.: Мир, 1971.- 496 с.

90. Попечителев Е. П. Физические и физико-химические методы исследования биожидкостей: Уч. Пособие. ЛЭТИ.- Л . , 1988.- 230с.

91. Попечителев Е. П., Чигирев Б. И. Двухлучевые фотометрические системы для клинико-физиологических исследований: Учеб. пособие ЛЭТИ.- Л . : ЛГУ, 1991.- 222с.

92. Предтеченский В. Е., Боровская В. М., Марголина Л. Т. Лабораторные методы исследования.- М.: Медгиз, 1950.- 780 с.

93. Приезжев А. В . , Тучин В. В . , Шубочкин Л. П. Лазерная диагностика в биологии и медицине.- М.: Наука, 19 89 .-240с.

94. Прикладная оптика: Учебное пособие/ Под ред. А. С. Дубовика М.: Недра, 1982.-612 с.

95. Пшеничникова Т.М., Малкина Л.А., Чаханина К.Л. Измерение уровня сывороточных иммуноглобулинов нефелометрическим методом

96. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1990.-№ 7.- С. 113-114.

97. Пшеничникова Т.М., Чаханина K.JI., Малкина JI.A. Получение стандарта для нефелометрического метода определения иммуноглобулинов человека // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии и прикладной иммунологии: Сб.статей.- Томск, 1990.- С. 105- 107.

98. Пырикова С.И. Автоматизация стандартного лабораторного исследования эякулята человека // Измерительные информационные технологии в охране здоровья —2003: Тез. докл. XIV Междун. конф.-СПб, 2003.1. С 78-80.

99. Пырикова С.И., Григорьянц А.Г. Низкоинтенсивное лазерное излучение — инструмент зондирования и стимуляции биологически подвижных объектов сложной формы // Технологии живых систем. Материалы МНТК.- Москва, 2003.- С.131 -133.

100. Пырикова С.И., Загидуллин Р.Ш. Программно- аппаратный комплекс оценки подвижности биологических клеток методом обработки изображений. Тез. докл.2-й Междун. конф.-СПб, 2003.-С. 95-97.

101. Раковская Я. П. Модельное сопоставление качественных показателей спермы // Тр. Харьков, с.-х. ин-та, 1980.- Т. 269.- С. 92—93.

102. Резников В.А., Зусь Б.И. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения различного спектрального диапазона на семенные железы

103. Гигиенические и медико-биологические аспекты здорового населения.-Сб. науч.тр.-Л.,1989. с.104-107.

104. Рожков 0. В ., Щетинкин В. С. Лазерные приборы обработки информации. Когерентные процессоры : Учеб. пособие.-М:МВТУ, 1988.- 50с.

105. Роджерс Д. Алгоритмические основы машинной графики.-М.: Мир, 1989.-123с.

106. Ронин В.С . , СтаробинецГ. М. Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований: Учеб. пособие.- 4-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1989.- 320 с.

107. Ротт Н. Н., Вепринцев Б. Н. Экспериментальные и теоретические предпосылки для решения проблемы сохранения генофонда животныхметодом консервации // Успехи соврем, биол., 1981.- Т.91, вып. 3.- С. 451—466.

108. Рысаков В., Стонь М. Рассеяние света взвесью монодисперсных прозрачных сфер // Оптика и спектроскопия , 1995.- Т. 79, № 5.- С.852-857.

109. Рысаков В., Стонь М. Рассеяние света взвесью частиц // Оптика и спектроскопия.- 1997.-Т. 82,№ 2.- С.305-309

110. Руководство по гематологии: В 2 т. T.l/Под ред. А. И. Воробьева.- 2-е изд., перераб. и доп.-М.: Медицина, 1985.-448с.

111. Русяев В . Ф. Фотодинамический способ исследования гемокоагуляции // Медицинская техника.- 1989.- №4. С.8-12.

112. Рязанский М. П. Определение концентрации спермиев // Ветеринария, 1966.-№8.- С. 97—99.

113. Сафонова Л. ПСпиридонов И.Н. Метод количественной оценки патологий форменных элементов крови// Новые информационные технологии в медицине и экологии. Тез. докл. Меж-дун. научн.-технич. конф. 26 мая 4 июня 1998 г. - Ялта-Гурзуф, 1998 г. - С. 292-294.

114. Свенсон К., Уэбстер П. Клетка. М.: Мир, 1980. - 303с.

115. Соколовская И. И. Проблема оплодотворения сельскохозяйственных животных. —М.: Советская наука, 1957. — С. 314.

116. Соколовская И. И., Милованов В. К. Иммунология воспроизведения животных. — М.: Колос, 1981. — 264 с.

117. Соколовская И.И„ Ойвайдис Р., Авилов А. О значении акросомы в оценке семени самцов //Животноводство.- 1981. № 9.- С. 45—46.

118. Сорокин Н.В., Журавлев Н.И. Оптимизация условий иммунохимического нефелометрического анализа IgG, IgA, IgM // Лабораторное дело.- 1990.-№ 1.-С. 35-38.

119. Справочник по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. -М.: Россельхозиздат. 1983.- 272 с.

120. Степанов А. Т., Степанов А. А. Качество спермы и оплодотворяемость

121. Ветеринария.- 1983,- № 8.- С. 48—49.

122. Сунгуров А.Ю. Разделение и анализ клеток физическими методами // Итоги науки и техники. Сер.Цитология. -1985.- Т.4.-С.145.

123. Успенский А. Определение оплодотворяющей способности глу-бокоохлажденной спермы быков по активности дегидротеназ // Молоч. и мяс. скотоводство.-1967.- № 12.- С. 30—31.

124. Фаронов В.В. Delphi 4 учебный курс. -М.: Нолидж, 1998.- 97с.

125. Фарина А., Студер Ф. Цифровая обработка радиолокационной информации.- М.: Радио и связь, 1993.-319 с.

126. Федорич В.Н. Определение иммунохимическим нефелометрическим анализом содержания IgG, IgA, IgM в биологических жидкостях: методические рекомендации.- Киев, 1992.- 10 с.

127. Хадсон Б., Пепперив Р. Дж. Проблема бесплодия.- М.: Медицина, 1983.-156с.

128. Хлебцов Н.Г. О рассеянии света гауссовыми сферами и эллипсоидами // Оптика и спектроскопия.- 1999.- Т.87,№ 6.- С. 996-1000.

129. Шишикина JI.H., Смотряева М.А. Связь повреждения мембраны и ДНК с процессом перекисного окисления липидов при слабых воздействиях

130. Биофизика.- 2000.- Т.45, вып. 5.- С. 844-852.

131. Шубочкин Л.П. Светорассеивающие свойства биологических структур применительно к лазерной диагностике в офтальмологии: Автореферат дис. . канд. техн. наук.- Саратов, 1997.-16с.

132. Эндебера О.П. Оценка биологической эффективности ИК-низхкоинтенсивного импульсного лазерного излучения на уровне характеристик приспособленности у Drosophila melagaster: Автореф.дис. . канд. техн. наук. Калуга, 1996.- 14с.

133. Эпштейн Б. С. Искусственное осеменение животных в зоопарках и питомниках. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1984.- с. 32.

134. Яблонский В. А. Видовые особенности обмена веществ в сперме быка, барана и хряка: Автореф.дис. . канд.биол. наук. Львов, 1970.- 34с.

135. Яблонский В. А. О взаимосвязи физиологических и биохимических показателей качества спермы // Уч. пособие Кабардино-Балкар. ун-та,-1972.- Т. 2, вып. 38.- С. 119—120.

136. Яковлева С.В. Воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения на лиотропную среду: Автореф.дис. . канд.техн. наук. Екатеринбург, 1995.-34с.

137. Ярославская А.Н. Спектроскопическое исследование биотканей и супензий клеток применительно к задачам лазерной диагностики: Автореф. дис. . канд. техн. наук.- 2000.- 15с.

138. Amelar R. D. Dubin L., Schoenfeld С. Sperm motiv Fertil. Steril. 1980.-V. 34,№3.- P. 197—215.

139. Anderson R. A. Relationship between semen characteristics and fertility in electroejaculated mice//J. Repr.- 1983- V. 68.- P. 1-7.

140. Bane A. A study of the techniqe of haemocytometric determinatio.- of sperm motility and sperm concentration in bull sperm // Corneli Vet.- 1953.-V. 42.- P. 518.

141. Bangham A. D., Hancoch J. L. A new metod for counling live and dead bull spermatozoa//Nature.-1955.- V. 176.- P. 656.

142. Bartoov В., Blanco A. On the functional significance of LDG-H // J Hopkins Med. I., 1980.- V.41, № 2.- P. 117—192.

143. Benhaim A. D. Hydrophobic interaction and structural changes in the solvent // Biopolimers — 1975. № 7.- P. 1337 - 1355.

144. Blasco L. Clinical tests of sperm fertilizims ability//Fertil Steril.-1984.- V.41, №2.-P. 177—192.

145. Blochius E. M. Types of movement of bull spermatozoa and semen quality

146. Proc. 7th Int. Congr. on Anirn. Repr. & Artif. Ins (Munich), 1972.- V. 2.- P. 1289.

147. Blom E. The ultrastructure of some characteristic sperm defects and a proposal for a new classification of the bull spermatozoa // Nord Vet. Med.-1973.- V. 25.- P. 383.

148. Boell E. J., Burkus J. K. Oxygen consumption and motility of mouse sperm as affected by oxidizable substrates and oxygen tension. // Carlsberg Res. Comm., 1984.-V. 49, № 2.- P. 1117-1154.

149. Brilliard J. P., Mcdaniel G. R. The reliability and efficiency of various methods for estimating spermatozoa concentration // Poultry Sci.- 1985.- V. 64, № 1.- P. 155—158.

150. Broks B. E. Observation in the content of ATP and ADP in bull spermatozoa uzing the firefly luciferase system // J. Repr. Pert.- 1970.- V. 23, № 3. -P. 525—528.

151. Calamera J. C., Brugo S., Vilar 0. Relation between motility and ATP in human spermatozoa// Andrologia.-1982.- V. 14, № 3.- P. 239— 241.

152. Chandler J. E., Ruiz C. F., Adkinson R. W. Relationship between final temperature, thaw rate and quality of bovine semen J. Dairy sci.- 1984.- V. 67, №8-P. 1806—1821.

153. Cheng San-Pao Using DAPl-fluorescence as a radio vital stain test for the viability of the unfixed mouse sperm.— Proc. 5-th World conf. Anim. Prod. Tokyo, 1983.- V. 2.- P. 173—174.

154. Clarke R. H., Hewetson R. W., Thompson B. J. Comparison of the fertility of bovine semen collected by artifical vagina and electroejacu-lation from bulls with low libido // Austral. Vet. J.- 1973.- V. 49.- P. 240.

155. Corteed G. M. Effects du plasma seminal sur la survie et la fertilite des spermatozoides conserves in vitro // Repr. nutr. develop.- 1980.- V. 20, № 4.-P. 1111—1123.

156. Costentino M. J., Emilson L., Cokcett A. Prostaglandins in semen and their relationship to male fertility: a study of 145 man // Fértil. Steril.-1984.- V. 41, № 1.-2.-P. 8.

157. Coulter W. H. Height speed automatic blood cell' bunter and cell analyzer //Proc. Nat.Elec. Conf., 1956.- V. 12.-P. 1034.

158. Courtot A. M., Jouannet P. Zona-free hamster avum penetration by human spermatozoa: influence of various sperm factors // Reprod. Nutr. Develop.1985,- V. 25, № 3.- P. 521-529.

159. Cristanelli M., Squrires R., Amann R. Fertility of stallion semen processed frozen and thawed by a new procedure // The riogenology.- 1984.- V. 22, № 1.- P. 39.

160. David G., Serres C., Jouannet P. Kinematics of human spermatozoa // Gamete Res.- 1981.- V. 4, № 1.- P. 83—95.

161. Dixit M. K., Agarwal S. Seasonal variations in sperm levels of thiroid hormones and their relation with seminal quality and libido in buffalo bulls

162. The riogenology.-1984.- V. 22, № 5.-P. 497—502.

163. Eggenberger E., Zeborin K. Graphische Darstellungen multivariater daten von Spermabefunden//Zuchtygienne.- 1983.- V. 18, № 1.- S. 27—36.

164. Elliot F. I. Sherman J. K. A photographic method of measuring percentage of progressively motile sperm cell using Dark-Field Microscopy // VIII Int. symp. Zootechn.-Milan, 1973.-P. 160—169.

165. Ericsson R., Buthala D. A fluorescence staining method for studing sperm membranes // Biol. Repr.- 1970.- V. 3, № 1.- P. 8-14.

166. Bobichou H., Bajolle F., Andet J. Detection d'activities enzymatiques du spermatozoide human en microscopic electronique a balayage // Biol. Cell.-1982.- V. 44, № l.-P. 25.

167. Bousquet D., Brackett B., Dressel M. Efforts to correlate laboratory with field observations on bull sperm fertility // The riogenology.-1983.- V. 20, № 5.- P. 601—613.

168. Foster H., Hang G., Larson L. Testicular measurements as predictors of semen output and semen quality // Proc. 3rd Techn. Conf. Art. Ins. Repr. N. A. A. B., 1970.-P. 38—43.

169. Foulkes G. A., Macdonald B. G. The relationship between ATP content andmotility of bovine spermatozoa // The riogenology.-1979.- V.4.- P. 313—319.

170. Fowler A. K., Hellman A, An electronic method for counting and sizing rabbit sperm // Fertil. Steril.-1965.- V. 16, № 6.- P. 778—784.

171. Frost J., Cummins H. Z. Motility assay of human sperm by photon correlation spectroscopy//Science.- 1981.-V. 212.-P. 1520—1522.

172. Gabbasov Z.A., Gavrilov I.Yu., Popov E.G. The use of optical density fluctuations for determination of platelet concentration in stirred suspension. Platelets 1992.-№3.- P. 281.

173. Glover F. A., Phipps L. W. Preliminary study of an electronic method of counting and sizing bull spermatozoa//J. Repr. Fert.- 1962.- V. 4.- P. 189-194.

174. Grehem E. F., Shmehl K. L. Some physical and chemical methods of evaluating semen // Proc. 3rd Techn. conf. Art. ins. Repr. N. A. A. B., 1970.-P. 44—49.

175. Guerin J. F., Cziba J. C., Menezo I. Metabolisme energetique du spermatozoide humain // Bull. Assoc. Anat.- 1980.- V. 64, № 87.- P. 547- 560.

176. Halang W., Bohnensack R. A quick test for the simultaneous determination of intactness and concentration of spermatozoa // Acta biol. et med. Germ.- 1982.-V. 41, № 10.-P. 899—905.

177. Macler A. Simultaneous differentiation between motile, non motile, live and dead spermatozoa by combining the supravital staining and the MEP method

178. Int. J. Androl., 1979.-V. 2, № 1.- P. 32—42.

179. Makler A. Use a microcomputer in combination with the MEP method for human sperm motility determinaton // J. Urol.-1980.- V. 124.- P. 132.

180. Makler A., Jacobi P. Factors, affecting sperm motility. Washing and resuspension of human spermatozoa in various artitical media // Fertil. Steril.-1981.-V. 35, № 4.- P. 442—446.

181. Makler A., Fischer M., Lissak A. A new method for rapid determination of sperm concentration in bull and ram semen // The riogenology.-1984.-V. 21, № 4.- P. 543—554.

182. Makler A., Fischer M., Murillo O.Factors, affecting sperm motility. IX.

183. Survival of spermatozoa in various biological media and under different gaseous compositions // Fértil. Steril.- 1984.- V. 41, № 3.- P. 428—432.

184. Martin R. H., Tailor P. J. Effect of sperm concentration in the zona-free hamster ova penetration assay // Pert. Steril.- 1983.- V. 39, № 3—4.- P. 379 -381.

185. Martin P. A., Dzuik P. J. Assessment of relative fertility of males (cockeres and boars) by competative mating // J. Repr. Pert.- 1977.- V. 49, № 2.- P. 323—329.

186. Menger H., Neubert L. Die Veränderlichkeit der Spermaqualitat im Jahresverlauf sowie inte Bedentung furdie Beurteilung der Beschmungstauglichkeit von Schafbocken // Monatsh. Vetrinar-med.- 1985.-V. 40, № 11.- S. 477—480.

187. Menveld R., Van Zil J. A statistical comparison of three methods for the counting of human spermatozoa // Andrologia.- 1984.- V. 16, № 6.- P. 554558.

188. Mercado-Richardo E., Dominiguez-Aquilar R. Intrinic fluorescence on intact and washed and metabolically active human spermatozoa // Arch. Invest. Med.- 1982.-V. 13, № 14.- P. 225—229.

189. Mettler L., Baukloch V., Seki M. Human in vitro fertilization and sperm immunological animal experiments // Follicular Maturation and Ovula Proc.: 4th Rainer de Graaf Symp.- Nijmegen, 1982.- P. 323—337.

190. Mohr L. R., Trounson A., Freeman L. Deep freezing and transfer of human embryos // J. of in vitro fertilization and Embryo transfer. 1985. - № 1 - P. 1 -10.

191. Mortimer D., Courtot A., Giovangrandi I. et al. Human sperm motility after migration into and incubation in syntetic media // Gamete Res.- 1984.- V. 9,-№2.-P. 131-144.

192. Nehruig H., Blottner S. Versuche zur Trennung der Sper-miengenotypen aufgrund von Motilitatsdifferenzen // Arch. exp. Veter. med.- 1983.- V. 37, № 5.-S. 729-739.

193. Niwa K., Chang M. C. Optimal sperm concentration and minimal number of spermatozoa for fertilization in vitro of rat eggs // J. Repr. Fert.- 1974.- V. 40.1. P. 471—474.

194. Overstreet W., Katz D. E., Hanson F. W., Fonseca J. R. A simple inexpensive method for objective assessment of human sperm movement characteristics

195. Fértil. Steril.- 1979.- V. 31.- P. 162 -172.

196. Pace M. M., Graham E. F. The release of glutamic oxaloacetic transaminase from bovine spermatozoa as a test method of assessing semen quality and fertility // Biol. Repr.- 1970.- V. 3, № 2.- P. 140 -146.

197. Panidis D., Tarlatsis B., Papaloucas A. Objective evaluation of spermatozoa motility in fertile males with the multiple exposure protography (MEP) method // Acta Endocrinol.- 1982.- V. 101, № 248.- P. 19 -20.

198. Parkinson T. Seasonal variation in semen quality of bulls and correlations with metabolic and endocrine parameters // Vet. Ree.- 1985.- V. 117, № 12.- P. 302307.

199. Perreault S. D., Rogers B. Capacitation pattern of human spermatozoa // Fértil. Steril.- 1982.- V. 38, № 1-2.- P. 258 -260.

200. Pedersen H., Lebech P. E. Ulrtastructural changes in the human spermatozoa after freezing for artificial insemination // Fertile and sterile. 1971. - № 2 - P. 125- 133.

201. Petersen R. N., Freund M. ATP synthesis and oxydative metabolism in human spermatozoa//Biol, repr., 1970.- V. 3, № 1.- P. 47 -54.

202. Pusch H. H. Messung der Spermatozoenmotilitat mittels Laser-Doppler Spectroskopie im andrologishen Routinenlabor // Andrologia.- 1985.- V. 17, №. 3.- S. 217-223.

203. Rogers B. G., Perreault S. D., Bentwood B. J., Mccar-Ville C., Hall R. W., Soderdahe D. W. Variability in the human — hamster assay for fertility evaluation // Fértil. Steril.- 1983.- V. 39, № 1-2.- P. 204 -211.

204. Rondeau M., Rouleau M. Effects of dilution rates, animal species and instruments, on the spectrophotometric determination of sperm counts // Revuecañad, de biologie.-1981.- V. 40, № 2.- P. 173 -180.

205. Roussel G. D., Stallcup 0. T. Parallelism between semen characteristic and glutamic oxaloacetic, glutamic pyruvic acetic transaminase activities // J. Dairy Sci.- 1965.- V. 48, № 12.- P. 1684 -1687.

206. Saacke R. G., Amann R. R., Marshall C. E. Acrosomal cup abnormalities of sperm from subfertile bulls // J. Anim. sci.-1968.- V. 27, № 5.- P.1391 -1400.

207. Saacke R. G. Morphology of the sperm and its relationship to fertility: Proc. 3rd Techn. conf. on Art. Ins. Repr, N. A. A. B., 1970.- P. 17-30.

208. SaacKe R. G., Vinson W., O'conner M. The relationship of semen quality and fertility: A heterospermic study.-Proc. 8th Techn. conf. on Art. Ins. Repr, N. A. A. B, 1980.-P. 71 -81.

209. Sato H., Landthaler M., Haina D. The effect of laser light on sperm motility and velocity in vitro // Andrologia, 1984.-V. 16,№1.-P. 23 -25.

210. Schoevart D., Serres C., David C. Analyse automatique des trajectores des spermatozoides humains // Biot. Cell.- 1982.- V. 44, №1.- P.296.

211. Senger P. L., Saacke R. G. Serum induced head-to-head agglutination of bovine spermatozoa // Repr. Fert.- 1976.- V. 47, №10.- P. 215—219.

212. Schoysman R., Khan L., Vanroosendaal E. A la recherhe du pouvoir fecondant du sperm // Rev. Med. Bruxelles.-1985.- V. 6, № 9.- p. 633 637.

213. Sjager S., Kulken J., Kremer J. Comparison of two supravital stains in examination of human semen and in tests for cytotoxic antibodies to human spermatozoa // Fértil. Steril.- 1984.- V. 41, № 2. P. 294 -297.

214. Sokolosski J., Blasco L., Storey B. Turbodimetric analisis of sperm motility // Fértil. Steril.-1977.- V. 28.- P. 1337 -1340.

215. Soules M., Moore D., Spandonl L. The relationship between the postcoital test and the semen penetration assay // Fértil. Ster.- 1982.- V. 38.- № 3.- P. 584 -387.

216. Stanger J. D., Quinn P. Fertilization of cumulus free, zona intact mouse ova in vitro at hight and low sperm concentrations // Gamete Res.- 1982.- V. 5, № 1.-P. 61 -70.

217. Stewart D. L. The predication of the fertility of bull semen from laboratory tests:-Proc. 7th Int. congr. Anim. Repr. and Artif. Insem.-Munich, 1972.- V. II.-P. 1279-1283.

218. Stumpf P. G., Frances G., Lloid T. Effects of temperature on the in vitro penetration of hunam sperm into bovine cervical mucus // J. Repr. Med.-1984.- V. 29, № 1 l.-P. 833 -836.

219. Suarez S. S., Katz D. F., Meizel S. Changes in motility that accompany the acrosom reaction in hyperactivated hamster spermatozoa // Gamete Res.-1984.- V. 10, № 3.- P. 253 -265.

220. Sueldo C., Mars R., Berger T. Correlation of transferrin concentration and sperm fertilizing ability //Amer. J. Obstet. Gynecol.- 1984.- V. 150, № 5.- P. 528 -531.

221. Sundquist C., Lucola A., Valtonen M. Relationship between serum testosterone concentrations and fertility in male mink. // J. Repr. Fert.- 1984.- V. 70, № 2.-P. 409 -412.

222. Talbot P., Chacon R. A new procedure for rapidly scoring acrosome reactions of human sperm // Gamete Res.-1980.- V.3, № 3.- P. 211 -216.

223. Topfer -Petersen , Tsunoda I., Chagn M. C. Penetrationn of mouse eggs in vitro: optimal sperm concentration and minimal number of spermatozoa // J. Fert.- 1975.- V. 44, № p. 139 -142.

224. Wall R., Jerard D., Foote R. H. Separation of rabbit and bull spermatozoa on bovine serum albumin gradients // Bioi. Repr.-1980.- V. 22, № 1.- P. 94.

225. Wells M. S., Awa 0. A., Fangy S. S. Effect of season acrosome status in the bull // J. Dairy Sci.-1972.-V.55, № 8.- P.l 174-1176.

226. Wenig H., Rudolph K., Menger H. I'ntersuchungen und Ergebnisse zur Spermienkorizentrationbestimmung in Sehd bock- und Bullenejakulaten mittels Spekol //Vetcc.-Medizin.- 1983.- V. 38, № 6.- S. 220 -222.

227. Wilson M. C., Harvei J. D. Twin-bear laser velocitimeter for the investigation of spermatozoon motility // Biophys.J.- 1983.-V. 41, № 1.- P. 13 -21.

228. Williams W. L., Robertson R. T., Ixjcalow W. R. Decapicitation factor andcapacitation // Advances in Biosci.- 1969.- V. 4.- P. 6.

229. Wishart G. Maitenance of ATP of fertilizing ability ot fov sperm // J. Repr. Fert.- 1982.- V. 66.- № 2.- P. 457 462.

230. Wolf D. E. Sperm concentration dependency in fertilization and zonae sperm binding properties ot mouse eggs inscmintion in vitro // J. Exp. Zool.- 1976.-V. 196.-№ l.-P. 27 -37.

231. Wolf D. P., Boldt J., Bird W. Acrosome status evaluation in human ejaculated semen with inonodonal antibf dies // Biol. Repr.- 1985.- V. 32.- № 5.- P. 1157 -1162.

232. Wong W. T., Dhaliwal G. K. Observation on semen quality of dogs in tropics // Vet. Res.- 1985.- V. 116.- № 12.- P. 313 314.

233. Wolley D. M. A test of functional significance of the quantit of mitochondria in the spermatozoa in mice // Gen. Res.-1970.- V. 16.- P. 225 228.