автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.13, диссертация на тему:Разработка методик высокоразрешающей зондовой микроскопии бионаноуглеродных материалов

На правах рукописи

005062353

Морозов Роман Андреевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ БИОНАНОУГЛЕРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Специальность 05.11.13 - Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 7 ¡'ЮН 2013

Москва - 2013

005062353

Диссертационная работа выполнена в Национальном исследовательском университете «МИЭТ» (НИУ МИЭТ), в Научно-образовательном центре «Зондовая микроскопия и нанотехнология»

Научный руководитель доктор технических наук, ведущий

научный сотрудник НОЦ «Зондовая микроскопия и нанотехнология» Иван Иванович Бобринецкий

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор кафедры материалов функциональной электроники НИУ МИЭТ Громов Дмитрий Геннадьевич

кандидат технических наук, директор ООО «Нано Скан Технология» Душкин Игорь Валерьевич

Ведущая организация ФГУП НИИ физических проблем

им. Ф.В. Лукина», г. Москва

Защита состоится « 26 » сентября 2013 года в 14 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д212.134.04 при Национальном исследовательском университете «МИЭТ» по адресу: 124498, Москва, Зеленоград, проезд 4806, д.5, МИЭТ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Национального исследовательского университета «МИЭТ

Автореферат разослан «_ 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета: д.т.н., профессор /^Т?^/^/ А.И. Погалов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Разработка методов повышения эффективности формирования человеческих тканей, при регенерации повреждённых или создании новых органов на данный момент является актуальной задачей тканевой инженерии. Известно, что традиционные методы хирургического протезирования сталкиваются с определенными трудностями, возникающими также в ряде других областей практической медицины. В связи с этим, в качестве заполняющего материала хирургических имплантатов были предложены объемные нанокомпозиты, изготовленные из водных дисперсий альбумина с углеродными нанотрубками под действием теплового и лазерного излучения. Выбор доступного, водорастворимого и фотостойкого глобулярного белка — альбумина, осуществляющего в организме человека и животных транспортную функцию, был обусловлен успешным опытом его применения в составе лазерных биоприпоев.

Для установления структуры нанотрубчатых композитов весьма актуально применение методов микроскопии высокого разрешения на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ), а также метода сканирующего зонда Кельвина.

Влияние электрических и электромагнитных полей на биологические объекты является перспективным направлением исследований в регенеративной медицине, тканевой и генной инженерии, клеточной технологии и в лечении различных заболеваний. Так, воздействие электрических полей на клетки остеобластов приводит к значительному увеличению пролиферации клеток одновременно с возрастанием в них активности щелочной фосфата-зы. В поврежденных тканях всегда присутствуют токи и потенциалы, которые участвуют в восстановлении повреждений, в частности, повреждений нервных и покровных тканей. Приложение внешних электрических полей позволяет ускорять заживление ран за счёт миграции клеток в область повреждения. Тем не менее, основные механизмы влияния электромагнитных и электрических полей на клеточном и молекулярном уровне остаются неизученными досконально.

В связи с этим часть исследований в диссертации посвящена влиянию электрической стимуляции на ускоренное заживление тканей и рост клеток. Основная проблема традиционных методов подведения внешнего электрического поля заключается в том, что отсутствует возможность локализовать поле в области заживления. В общем случае

электрической стимуляции подвергается значительная площадь организма. Решение данной проблемы может быть найдено при использовании имплантируемых электродов, локализующих электрическое поле в необходимом участке организма. Таким образом, используя имплантируемые электроды малого размера, можно добиться стимулирования регенерации поражённых участков при меньших амплитудах напряжённости электрического поля и меньших частотах генерации сигнала. Подобные инвазивные методы требуют использования биодеградируемых материалов, оказывающих минимальное механическое воздействие на окружающие органы и ткани. Одной из перспективных методик в данной области является применение композитных материалов на основе углеродных нанотрубок (УНТ).

На данный момент не существует технологии секвенирования нуклеиновых кислот с необходимой точностью и получением информации о вторичных изменениях таких, как метилирование и многих других известных изменениях отдельных оснований на уровне индивидуальных молекул ДНК и/или РНК. Наконец, ни одна существующая технология не позволяет проводить секвенирование без синтеза, амплификации молекул нуклеиновых кислот и других вспомогательных методов. В связи с этим весьма актуальны исследования, направленные на разработку технологии секвенирования нативной конфигурации ДНК/РНК без добавления дополнительных нуклеотидов, меток, амплификации, или другого любого метода, который вводит количественные ошибки или артефакты. Разработка технологии прямого секвенирования до уровня жизнеспособной научной методики позволит значительно увеличить объем и качество наших знаний о нативном геноме, транскриптоме и эпигеноме, что значительно превысит возможности существующих технологий. В большом числе недавних ис-следованией явно показана связь общего генезиса болезней с характеристиками ДНК и РНК, выходящими далеко за пределы простой последовательности и которые или очень сложно, или вообще нельзя анализировать существующими технологиями: редактирование РНК, модификации отдельных нуклеотидов, окисление ДНК и РНК, регуляторные комплексы ДНК-РНК, комплексы РНК-РНК, комплексы РНК с гистонами, все они участвуют в патогенезе заболеваний и находятся вне досягаемости современных технологий секвенирования.

Методы высокоразрешающей атомно-силовой, туннельной микроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния света, усиленной зондом, позволят значительно продвинуться в сторону секвенирования ДНК молекул.

Цель работы и основные задачи

Целью диссертационной работы является исследование зондовыми методами структуры бионаноуглеродных материалов, возможности использования этих материалов для культивирования клеточных структур, возможностей секвенирования ДНК молекул.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать методику исследования объемного нанотрубчатого композита на основе альбумина и углеродных нанотрубок с помощью атомно-силовой микроскопии высокого разрешения.

• Разработать методику контроля клеток фибробласта, выращенных на пленках из углеродных нанотрубок, в том числе с применением атомно-силовой микроскопии.

• Разработать методики исследования ДНК молекул с высоким разрешением: атомно-силовую, туннельную микроскопии, спектроскопию комбинационного рассеяния света, усиленную зондом.

Научная новизна работы

• Явление «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя бионаноуглеродного композита (или «утопливания» полимерных участков поверхности композита), с помощью которого устанавливается распределение углеродных нанотрубок при атомно-силовой микроскопии.

• Закономерности электростимулированного роста клеточной культуры фибробласта.

• Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий влияние конечного радиуса острия зонда и атмосферы воздуха, позволяющий проводить оценку их геометрических параметров.

Достоверность научных положений, результатов и выводов Полученные экспериментальные результаты и разработанные методики подтверждаются известными теоретическими моделями. Опубликованные результаты согласуются с известными экспериментальными данными зарубежных авторов и дополняют их.

Теоретическая значимость исследования состоит в развитии моделей атомно-силовой и туннельной микроскопии высокого разрешения для бионаноуглеродных композитов в атмосфере воздуха, в том числе для ДНК молекул.

Практическая значимость исследования состоит в том, что разработанные методики могут быть использованы для контроля качества бионаноуглеродных композитов, используемых при регенерации по-

вреждённых или создании новых органов, и в тканевой инженерии для электрической стимуляции роста клеточных структур. Полученные результаты исследований могут быть использованы в курсах «Методы зондовой микроскопии» и «Методы зондовой нанотехнологии».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Атомно-силовая микроскопия бионаноуглеродных композитов в атмосфере воздуха, учитывающая явление «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя композита.

2. Методика контроля взаимодействия локальных электрических полей с клеточными структурами, культивированными на бионаноуглеродных подложках, необходимая и достаточная для проведения оценки корреляций структурных элементов нанокомпозита и геометрической конфигурации формируемых клеточных монослоев.

3. Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий конечный радиус острия зонда и влияние атмосферы воздуха, необходимый и достаточный для проведения оценки их геометрических параметров.

4. Методика сканирования ДНК молекул в атмосфере воздуха с высоким разрешением для обеспечения нуклеотидной характеризации биополимеров на основе различия их электро-оптических свойств.

Личный вклад автора

Концепция диссертации, формирование цели и постановка решенных в ней задач так, как они изложены в диссертации, отражают творческий вклад автора и его точку зрения на рассматриваемую проблему. Основные результаты диссертации, представленные в работе, получены автором лично, либо в соавторстве при его непосредственном участии. Во всех совместных работах автор участвовал в постановке задач, разработке методик исследования, проведении экспериментов, анализе результатов, написании статей, а также представлял результаты исследований на научно-технических конференциях.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech 10». Москва-2010.

International Conference "Advanced carbon nanostructures". St.Petersburg -2011.

12 th international Conference on the Science and Application of nano-tubes 2011. Cambrige, UK.

XIX Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и информатика - 2012» (Москва, Россия, апрель 2012).

Meeting on the Chemistry of Nanotubes and Graphene "ChemOnTubes 2012". Arcachon, France. - 2012.

VIII Russian-Bavarian conference on biomedical engineering. Saint-Petersburg- 2012.

Публикации

Основные результаты исследования, проведенного соискателем, изложены в 15 научных трудах, опубликованных в отечественной и зарубежной литературе, из которых 6 опубликованы в журналах из перечня ВАК. Также соискатель является соавтором двух патентов на изобретение Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка сокращений, списка литературы и приложения. В приложении представлены акты использования результатов исследования. Диссертация изложена на 102 страницах, включая 42 рисунка и 4 таблицы. Список литературы содержит 77 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулирована цель работы и основные задачи, определена научная новизна работы, её теоретическая и практическая ценность. Приводятся основные положения и результаты, выносимые на защиту, перечислены конференции, на которых были апробированы основные результаты работы и её научные положения.

В первой обзорной главе описаны новые возможности и перспективы применения бионаноуглеродных композитов и методы их контроля. Поскольку в состав композитов входят углеродные нанотрубки с диаметрами ~ 1нм, то необходимо использовать микроскопию высокого разрешения, а именно: атомно-силовую и туннельную микроскопию, спектроскопию комбинационного рассеяния света, усиленную зондом. В главе описаны результаты достижений в атомно-силовой и туннельной микроскопии, полученные в научно-образовательном центре «Зон-

довая микроскопия и нанотехнология» (НОЦ ЗМНТ), которые соответствуют зарубежному уровню. Подробно описана новая методика, которая развивается в НОЦ ЗМНТ - спектроскопия комбинационного рассеяния света, усиленная зондом.

Бионаноуглеродные композиты являются новыми и мало изученными «контрастными» материалами по своим физико-механическим свойствам. Углеродные нанотрубки являются весьма твердыми составляющими композита. Биологические компоненты: альбумин, клетки фибробласта, ДНК молекулы являются полимерной составляющей. Высокоразрешающая зондовая микроскопия таких объектов приводит к новым методическим эффектам - артефактам, которые существенно влияют на результаты использования стандартных методик. Последующие главы диссертации посвящены разработке высокоразрешающей микроскопии бионаноуглеродных композитов.

Во второй главе описаны результаты исследования объемного композита на основе бычьего сывороточного альбумина (БСА) и углеродных нанотрубок методами атомно-силовой микроскопии. В разделе 2.1 описана лабораторная технология изготовления композита на основе отверждения исходного раствора лазерным излучением. В разделе 2.2 с использованием теории упругости показано, что наиболее «щадящий» режим сканирования - полуконтактная мода.

Материал углеродных нанотрубок является весьма прочным и жестким. Напротив, материал, например, альбумина является мягким и податливым. Такие материалы, подобные полимерам, в АСМ обычно исследуют в полуконтактной моде, поскольку в контактной моде поверхность полимера в точке сканирования может претерпеть необратимые изменения. Действительно, в модели неограниченной плоской подложки, на поверхность которой в перпендикулярном к ней направлении действует сосредоточенная сила F , величину деформации можно оценить по формуле из [1]:

Alx(l + M)(3-4»)F

Здесь Д/ - углубление зонда в поверхность полимера, F- сила давления острия зонда на поверхность пленки, Е - модуль Юнга, ц - коэффициент Пуассона, R - радиус острия зонда. Из формулы (1) при одном и том же усилии прижатия зонда кантилевера к поверхности подложки следует, что чем меньше модуль Юнга и радиус зонда (выше

латеральное разрешение микроскопа), тем значительней деформация подложки, вызываемая острием зонда. Например, для полиэтилена высокого давления £=0,2 ГПа, ц =0,35 и радиусе острия Л = 10 им, и углублении Д/ = 0,1 нм (разрешение микроскопа по высоте), усилие должно составлять менее 1,4- 10"п Н. Такие усилия прижатия канти-левера практически трудно реализовать, они реально выше, и значит, деформации полимерных участков поверхности подложки более значительны. В связи с этим при сканировании композита из полимера и углеродных нанотрубок при высокой податливости полимера возможен эффект «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя композита (или «утопливания» полимерных участков поверхности композита), что должно приводить к искажению реального изображения поверхности. Пользуясь формулой (1) можно написать неравенство:

М < с/, (2)

означающее, что обратимая деформация поверхности подложки в пределах закона Гука не должна превышать диаметр углеродных нанотрубок с/. В случае полимерного композита с углеродными нанотрубками такое условие трудно выполнить в силу малого диаметра углеродных нанотрубок, порядка 1 нм. На рисунке 1 представлена модель выдавливания углеродных нанотрубок на поверхность композита.

альная поверхность до сканирования; б) изображения поверхности в результате сканирования. 1 - углеродная нанотрубка; 2 - полимерная матрица; 3 - зонд; 4 - молекулярные цепочки полимера

В модели выдавливания учтено, что полимер «смачивает» поверхность углеродных нанотрубок. Такая ситуация имеет место для композита альбумин-углеродные нанотрубки.

В разделе 2.3 приведены результаты атомно-силовой микроскопии композитов на основе альбумина и углеродных нанотрубок для различных относительных концентраций альбумина и углеродных нанотрубок. Во всех экспериментах по топографированию композитов наблюдается эффект вытеснения углеродных нанотрубок на поверхность.

На рисунке 2 представлены топография поверхности образца композита и поперечное сечение топографии по некоторой линии. Справа от графика рисунок 26 указываются расстояния в нанометрах между маркерами: сверху расстояние по X, снизу расстояние по У.

Из рисунка 26 можно видеть, что на изображении наблюдаются поры различной глубины, обусловленные в основном за счет выступающих наноуглеродных образований. Дополнительно использован метод зонда Кельвина, который учитывает тот факт, что в полимерном композите находятся проводящие углеродные нанотрубки. Особенностью этого метода является то, что под относительно ровной поверхностью композита можно «разглядеть» проводящие включения.

В третьей главе описана атомно-силовая микроскопия клеток фиб-робласта, выращенных на пленках из углеродных нанотрубок и альбумина с помощью электрической стимуляции. Был разработан, создан и запатентован электронный планшет для электростимулированного выращивания клеток фибробласта. Разработана методика создания композитных подложек на основе альбумина и углеродных нанотрубок. Эта методика запатентована как способ изготовления нанотрубчатого носителя. На рис. 3 представлено схематическое изображение макета для электрической стимуляции роста клеток на покровном стекле с одно-стенными углеродными нанотрубками (ОСНТ).

Были исследованы и найдены закономерности для электрической стимуляции роста клеток. Проведены оптическая и атомно-силовая микроскопия композитных подложек и выращенных клеток. Предложена модель, объясняющая электрическую стимуляцию клеток.

Plane, (jm 6)

Рисунок 2. - а) Топография поверхности образца нанокомпозита №ЗА (концентрация нанотрубок МУНТ 4 г/л, мощность излучения 9 Вт, время облучения 7 мин, температура 49°С), б) поперечное сечение топографии по некоторой линии

Генератор -► _П_ПЛ_ Плата

х I

Подводящие электроды

ОУНТ+БСА покрытие

Покровное стекло Контактные площадки Питательная среда Игла MEM

Рисунок 3 - Схематическое изображение макета для электрической стимуляции роста клеток на покровном стекле с ОСНТ. Электроды помещаются в среду для подведения контакта к золотым электродам и подключаются к генератору напряжения

На рисунке 4 изображена атомно-силовая топография поверхности пленки ОУНТ/БСА на покровном стекле.

О 5 10 15 20 25 30 35 (jm

Рисунок 4 - АСМ изображение пленки ОСНТ/БСА на поверхности покровного стекла после осаждения из раствора и отжига при температуре 100 "С. Толщина пленки ~ 100 нм

Можно видеть, что пленка получилась достаточно равномерной. Сопротивление пленочных структур составляло в работе от 100 кОм до ЮМОм. На рисунке 5 представлены результаты электростимулирован-ного роста клеток ФЭЧ.

Рисунок 5 - Фотографии клеток ФЭЧ, зафиксированных на третий день после посева на покровных стеклах, модифицированных ОСНТ/БСА пленкой. Напряжение электрической стимуляции 100 мВ.

Увеличение х400

Найдена закономерность электостимулированного роста клеток. Показано, что в малых полях короткие электрические импульсы приводили к увеличению коэффициента пролиферации (КП) на 20 % клеточной линии ФЭЧ-Т (лаборатория культур тканей ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского»), рис.6.

Однако данный транспортный механизм проявляет эффект инги-бирования роста клеток при больших токах (рис. 6). При этом можно отметить, что ингибирование начинается при разности потенциалов прикладываемых к электропроводящему ОУНТ/БСА покрытию на стекле -100 мВ.

Проводилось изучение биологической совместимости углеродных нанотрубок в культуре клеток Vero путем исследования формирования каркасного материала на основе углеродных нанотрубок и культивирования клеток на полученных каркасных структурах.

КП 1,6 1,1 1,2 1 0,8 0.6 0,4 0.2 ■ О

1 10 100 1000 10000 100000 1, пЛ

Рисунок 6 - Закономерность роста клеток ФЭЧ, культивируемых 72 часа на ОСНТ/БСА модифицированных покровных стеклах в зависимости от протекающего через проводящую пленку импульсов тока в течение последних 48 часов

В общем случае токсичность самих нанотрубок рассматривается, как способность нанотрубок проникать сквозь липидно-пептидную мембрану и разрушать целостность клеток. Полученные результаты демонстрируют низкую токсическую активность нанотрубок, представленных в виде каркасных структур, на которых происходит рост клеточных структур. Данный результат коррелирует с результатами последних работ по сравнению токсического эффекта нанотрубок в виде организованного на носителе каркаса из нанотрубок. Трубки находятся в растворе в виде коллоида, когда они обладают более ярко выраженным токсическим эффектом [2].

В главе четыре описаны результаты исследования ДНК - молекул зондовыми методами высокого разрешения. В разделе 4.1 предложена аналитическая модель для описания сканирования биологических нано-частиц в атмосфере воздуха, которая учитывает наличие адсорбата на исследуемых образцах. Считалось, что пленка адсорбата является квазижидкой [3]. На рис.6 представлена геометрическая схема сканирования зондом радиуса Я , покрытого пленкой адсорбата толщиной АК, наночастицы радиусом г, покрытой пленкой адсорбата толщиной Дг . Толщина адсорбата на подложке равна АП , <1 - величина зазора между зондом и поверхностью подложки, ширина поперечного изображения наночастицы. Вначале рассматривается случай, когда

Д77 < 1г . (4)

Наночастица может быть сферической или протяженной. Толщина адсорбата на разных концах молекул может быть разной из-за наличия гидрофобных или гидрофильных окончаний. Известно, что существует проблема закрепления наночастиц на подложках, поскольку зонд может свободно их сметать за пределы области сканирования. В связи с этим предпочтительно для сканирования наноразмерных образцов использовать полуконтактную моду сканирования. Наночастицы нужно размещать на нагретой подложке до температуры ~ 100 °С, когда пленка адсорбата воды станет минимальной. Такой прием позволяет в большей мере использовать ван-дер-ваальсовые силы для сцепления с подложкой. При этом важно, чтобы нанотрубки или биомолекулы были протяженными, чтобы увеличить суммарную силу притяжения. При этом покрывающая пленка дополнительно способствует прижатию наночастицы к поверхности подложки.

Из геометрических соображений можно найти 1- ширину поперечного изображения наночастицы. Это уравнение окружности со смещенным центром и в общем виде описывает зависимость t = с/) , которая представлена на рисунке 8.

12+{с + с1-с1тахУ=С2. С = Яе +ге. с!тах=ге+г-АП (5)

Рисунок 7 - Геометрическая схема сканирования

Рисунок 8 - Общий вид поперечного изображения наночастицы радиуса г

Из формул (5) и рисунка (8) можно видеть, что наличие пленки ад-сорбата приводит в любом случае к увеличению межцентрового расстояния между зондом и наночастицей и к увеличению латерального изображения наночастицы равного 2/тах. Латеральное изображение обычно значительно превышает максимальную высоту изображения наночастицы:

В этом случае, см. рис. 7, наночастица находится под слоем адсор-бата и её просто можно не обнаружить. Для уменьшения влияния ад-сорбата на результаты измерений, учитывая, что пленка является квазижидкой, необходимо вытеснять адсорбат из контакта между поверхностью зонда и поверхностью наночастицы. Время выдавливания адсорбата можно оценить из [3] по адаптированной формуле для нашей задачи, считая, как и прежде, что между сближающимися электродами имеет место вязкое течение Куэтта:

(6)

Далее рассматривается случай, когда ДЯ > 2г + Дг .

(7)

I,

Зу^-Я2

(8)

в

АЯ + Дг - 8)2 '

где г/ - динамическая вязкость адсорбата, 5 - толщина адсорбата, остающаяся при контакте острия зонда с поверхностью наночастицы, - сила, с которой действует острие кантилевера, площадь поверхности острия. Время 1В -определяет частоту колебаний кантилевера в полуконтактной моде. В этом случае разрешение на воздухе может зависеть от степени прижатия (прогиба) балки кантилевера и в каждом конкретном случае необходимо проведение небольшой исследовательской работы для получения удовлетворительного решения. На рис. 9 представлен пример таких исследований.

-а»!

Рисунок 9 - Топография молекул ДНК на подложке и их характерные профили

Можно видеть, что высота единичных ДНК составляет 2,1 нм, двойных ДНК в два раза больше. Отношение максимальной ширины изображения молекулы к её максимальной высоте составляет 2/тах / ¿/тах » 90, что согласно формуле (6) свидетельствует о достаточно сильном «боковом» налипании адсорбата между подложкой и молекулами ДНК, (см. рис.7) и слабом выталкивании адсорбата острием кантилевера.

В разделе 4.2 описаны результаты сканирования ДНК молекул в туннельном режиме. Для получения максимально возможного разрешения использован максимально возможный набор известных процедур. Были предприняты меры по защите микроскопов от сейсмических и акустических колебаний. Для защиты от электромагнитных помех использовано автономное электропитание и дополнительное экранирование, аппаратно-программными методами и экспериментальным путем были определены области параметров сканирования с высоким разрешением. Опытным путем определены приемлемые подложки из пиро-литического графита для сканирования в атмосфере воздуха и получения наибольшего разрешения. Показано, что наши результаты сканирования не уступают известным зарубежным результатам. На рисунке 10 представлены топографии бактериальной ДНК с максимальным разрешением, полученным в феврале 2013 года. Однако наши исследования и исследования других авторов [4] показывают, что на поверхности молекул ДНК имеется связанная вода, которая «забивает» отдельные нуклеотиды и не позволяет их различить. Для решения этой проблемы и дальнейшего повышения разрешения СТМ - метода, по-видимому, необходимо проводить сканирование образцов с ДНК при повышенных температурах, что и будет проделано в ближайшем будущем.

а) б)

Рисунок 10 - СТМ изображение двойной спирали бактериальной ДНК. Область сканирования 25x25 нм: а - режим высоты, б - режим токового контраста

В разделе 4.3 описаны результаты по спектроскопии комбинационного рассеяния света, усиленной зондом. Был использован отечественный спектрометр Centaur HR. Проводилось совершенствование техно-

логии работы прибора и его программного обеспечения специально для задач ДНК секвенирования. Поскольку кандидатская диссертация является квалификационной работой, то нами было продемонстрировано владение методиками комбинационного рассеяния света на отечественном экспериментальном оборудовании. В разделе представлены спектры нуклеотидов бактериальных ДНК, которые удалось расшифровать, рисунок 11.

Рисунок 11 - Спектры комбинационного рассеяния бактериальных ДНК с характерными пиками нуклеотидов

На рис. 12 проведено сравнение спектров с зарубежными результатами.

На рисунке 13 показан эффект усиления интенсивности спектров при подведении зонда кантилевера к ДНК - молекуле. В экспериментах использовался кантилевер У1Т_Р с наклоненным вперед зондом, с золотым покрытием высотой 2,5 нм.

-1-1—

120О "CO 1000

Woverajirfcsn (1Лт]

Рисунок 12 - Спектры в различных точках двойной ДНК спирали. Пики спектров соответствуют приведенным в статье Barhoumi et al (2008) «Surface enhanced Raman spectroscopy of DNA bases» J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (16), pp 5523-5529

1 !.!.!!„ 1

Wever.umberj [1/cnl]

Рисунок 13 - Сравнение спектров, полученных в одной и той же точке с подведенным зондом (верхний) и без подведенного зонда (нижний). При подведенном зонде наблюдается усиление

Основные результаты и выводы по диссертации

1. Атомно-силовая микроскопия в полуконтактной моде бионано-углеродных нанокомпозитов должна учитывать эффект «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя композита (или «утоп-ливания» полимерных участков поверхности композита).

2. Методика контроля роста клеток в электрических полях на пленках из углеродных нанотрубок и бычьего сывороточного альбумина на основе электрических измерений, АСМ, химических методов и оптической микроскопии необходимая и достаточная для установления закономерностей роста клеточных культур.

3. Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий конечный радиус острия зонда и влияние атмосферы воздуха, необходимый и достаточный для анализа их латеральных изображений и оценки их диаметров.

4. Методика сканирующей туннельной микроскопии ДНК молекул в атмосфере воздуха на подложках из пиролитического графита позволяет получать информацию о структуре цепочек ДНК.

5. С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света идентифицирован ряд нуклеотидов в бактериальных ДНК молекулах и получено усиление сигнала с помощью подведенного зонда.

В ходе проведенных исследований были разработаны, изготовлены и запатентованы подложки с электропроводящим покрытием на основе одностенных углеродных нанотрубок и бычьего сывороточного альбумина, и устройство для электрической стимуляции клеток, которые могут быть использованы при культивировании клеток.

Цитируемая литература

1.Ландау Л.Д.и Лифшиц Е.М.. Теория упругости. М.: Наука 1965.

С.44.

2. М. A. Hussain, М. A. Kabir and А. К. Sood On the cytotoxicity of carbon nanotubes. Current Science.2009. V.96. No.5. P. 664-673.

3. Неволин B.K. Зондовые нанотехнологии в электронике. М.: Техносфера. 2006. С. 159.

4. Намиот В.А., Анашкина А.А., Филатов И.В., Туманян В.Г., Еси-пова Н.Г. Секвенирование ДНК на основе анализа специфических даль-нодействующих взаимодействий макромолекул. Биофизика. 2012. Т.57. В.6. С.925-932.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Бобринецкий И.И., Морозов P.A.. Подгаецкий В.М., Симунин М.М., Яминский И.В. Исследование объемного нанотрубчатого композита на основе альбумина методами микроскопии высокого разрешения. Биофизика. 2011. Т.56. В.2. С.212-218.

2. Bobrinetskiy I.I., Seleznev A.S., Morozov R.A.. Lopatina O.A., Pod-cheryaeva R.Y., Suetina I.A. Investigation of the Effect of Local Electrical Stimulation on cells Cultured on Conductive Signale-Walled Carbon Nano-tube/Albumin films. J. of Biomaterials and Nanobiotechnology. 2012. V.3. N.3. P.377-384.

3. Бобринецкий И.И., Морозов P.A.. Селезнев A.C., Подчерняева Р.Я., Михайлова Г.Р., Лопатина O.A., Суетина И.А. Гальванотаксис клеток фибропластов при культивировании на пленках из углеродных на-нотрубок. Биомедицинская радиоэлектроника. 2012. №З.С.41-49.

4. Бобринецкий И.И., Морозов P.A.. Селезнев A.C., Подчерняева Р.Я., Лопатина O.A. Перспективы использования углеродных нанотру-бок в качестве каркасного материала в инженерии биологических тканей. Клеточная транплантология и тканевая инженерия. 2011. Т.6. №1. С.85-90.

5. Бобринецкий И.И., Морозов P.A.. Селезнев A.C. Нанотрубчатый носитель для электрической стимуляции роста клеток и способ его изготовления. Патент РФ. №2465312. от 01.04.2011г.

6. Бобринецкий И.И.. Морозов P.A.. Селезнев A.C. Устройство для электрической стимуляции клеток. Заявка на патент. №2012122386 от 31 мая 2012 г (решение о выдаче патента от 2013.02.14).

7. Bobrinetskiy I.I., Seleznev A.S., Morozov R.A.. Romashkin A.V., Lopatina O.A., Podcheryaeva R.Y., Suetina I.A. Carbon Nanotube Coatings for Local Electrical Simulation and Visualization of Living Celles in Vitro. Proceedings of the VIII Russian-Bavarian Conference on Biomedical Engineering. Zelenograd. May 2012. P.215.

8. Бобринецкий И.И., Морозов P.A., Селезнев A.C., Подчерняева Р.Я., Лопатина O.A. Исследования пролиферативной активности и жизнеспособности клеток фибробласта и глиобластомы на различных типах углеродных нанотрубок // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012 г. - Т. 153. - № 2. - С. 227-232.

9. Бобринецкий И.И., Морозов P.A., Трошин В.В., Чаплыгин Е.Ю. Атомно-силовая микроскопия биологических наночастиц на воздухе. Известия вузов. Электроника. 2013. №2. С.36-41.

10. Морозов P.A., Костюков Д.А. Исследование ДНК комбинированными методами высокоразрешающей микроскопии: ACM, SERS. XIX Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и информатика - 2012». Москва, 2012. С.16.

11. Морозов P.A., Селезнёв A.C. Исследование пролиферативной активности и жизнеспособности клеток на различных типах углеродных нанотрубок. Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech 10». Сборник тезисов докладов участников Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. Москва -2010.

12. Bobrinetskiyl.I., KireevD.M., Seleznev A.S., Morozov R.A.The creation of biocompatible transparent CNT-electrodesWInternational Conference "Advanced carbon nanostructures". Book of abstract. St.Petersburg.-2011.-P. 115.

13. Seleznev A.S., Bobrinetskiy I.I., Morozov R.A.. Podchernyaeva R.Y., Suetina I.A., LopatinaO.A., A.S. SeleznevA.S. Electrical Stimulation of HEF Cells Through Carbon Nanotube SubstratesWInternational Meeting on the Chemistry of Nanotubes and Graphene "ChemOnTubes 2012". Book of abstracts. Arcachon, France. - 2012,- P. 134.

14. Подчерняева Р.Я., Суетина И.А., Михайлова Г.Р., Лопатина O.A., Бобринецкий И.И., Морозов P.A., Селезнев A.C. Культивирование перевиваемых клеточных линий на подложках из углеродных нанотру-бок и влияние электростимуляции на пролиферацию клеток // Вопросы вирусологии. - 2012. №5 - Стр.46-48.

15. Morozov R.A.. SeleznevA.S. Biocompatibility And Toxicological Research Of Surfaces Modificated With Different Carbon Nanotubes. 12 th international Conference on the Science and Application of nanotubes 2011. Cambrige, UK. Book of abstracts. P.373.

Автореферат

Морозов Роман Андреевич

Разработка высокоразрешающей зондовой микроскопии бионаноуглеродных композитов

Формат 60x84 1/16. Уч.-изд.л 1,3. Тираж 100 экз. Заказ 36.

Отпечатано в типографии ИПК МИЭТ.

124498, Москва, Зеленоград, проезд 4806, д. 5, МИЭТ.

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего

профессионального образования

«Национальный исследовательский университет «МИЭТ»

На правах рукописи

04201361769

Морозов Роман Андреевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ БИОНАНОУГЛЕРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Специальность 05.11.13 - приборы и методы контроля природной среды, веществ,

материалов и изделий

Научный руководитель: доктор технических наук, ведущий научный сотрудник Бобринецкий И.И.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение.................................................................................... 4

Глава 1. Новые возможности и перспективы применения бионаноуглеродных материалов и методы их контроля..................... 12

1.1. Бионаноуглеродные композиты - новые объекты для исследования...... 12

1.2. Атомно-силовая микроскопия высокого разрешения........................ 15

1.3. Сканирующая туннельная микроскопия высокого разрешения............ 17

1.4. Спектроскопия комбинационного рассеяния света, усиленная зондом... 20 Глава 2. Исследование объемного композита на основе альбумина и углеродных нанотрубок методами микроскопии высокого разрешения

115]......................................................................................................................................................................................26

2.1. Бионанокомпозит на основе альбумина и углеродных нанотрубок............26

2.2. Особенности атомно-силовой микроскопии бионанокомпозитов..................32

2.3. Результаты атомно-силовой микроскопии бионанокомпозитов....................36

2.4. Метод зонда Кельвина в сканирующей зондовой микроскопии

бионаноуглеродных композитов............................................................................................................41

Выводы по главе 2................................................................................................................................................43

Глава 3. Атомно-силовая микроскопия клеток фибробластов, выращенных на пленках из углеродных нанотрубок и альбумина [3133]........................................................................................................................................................................................44

3.1. Электростимулированное выращивание клеток фибробласта..........................45

3.2. Результаты исследования электростимулированного роста клеток фибробласта........................................................................................................................50

3.3. Использование углеродных нанотрубок в качестве каркасного

материала в инженерии биологических тканей......................................................................59

Выводы по главе 3................................................................................................................................................68

Глава 4. Атомно-силовая, туннельная микроскопия и спектроскопия

комбинационного рассеяния света ДНК молекул, усиленная зондом ... 69

4.1. Атомно-силовая микроскопия клеток ДНК в атмосфере воздуха [68]..........70

4.2. Сканирующая туннельная микроскопия клеток ДНК в атмосфере воздуха..............................................................................................................................................................................78

4.3. Спектроскопия комбинационного рассеяния света ДНК молекул,

усиленная зондом..................................................................................................................................................82

Выводы по главе 4................................................................................................................................................88

Заключение..................................................................................................................................................................90

Список использованных сокращений..........................................................................................92

Список литературы..........................................................................................................................................93

Благодарности.............................................................................................................100

Приложения............................................................................................................................................................101

ВВЕДЕНИЕ Актуальность диссертационной работы

Разработка методов повышения эффективности формирования человеческих тканей, при регенерации повреждённых или создании новых органов, на данный момент, является актуальной задачей тканевой инженерии.

Известно, что традиционные методы хирургического протезирования сталкиваются с определенными трудностями, возникающими также в ряде других областей практической медицины. В связи с этим, в качестве заполняющего материала хирургических имплантатов были предложены объемные нанокомпозиты, изготовленные из водных дисперсий альбумина с углеродными нанотрубками под действием теплового и лазерного излучения. Выбор доступного, водорастворимого и фотостойкого глобулярного белка - альбумина, осуществляющего в организме человека и животных транспортную функцию, был обусловлен успешным опытом его применения в составе лазерных «биоприпоев».

Для установления структуры нанотрубчатых композитов возможно результативное применение методов микроскопии высокого разрешения на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ), а также метод сканирующего зонда Кельвина.

Влияние электрических и электромагнитных полей на биологические объекты является перспективным направлением исследований в регенеративной медицине, тканевой и генной инженерии, клеточной технологии и в лечении различных заболеваний. Так, воздействие электрических полей на клетки остеобластов приводит к значительному увеличению пролиферации клеток одновременно с возрастанием в них активности щелочной фосфатазы. В поврежденных тканях, всегда присутствуют токи и потенциалы, которые участвуют в восстановлении повреждений, в частности, повреждений нервных и покровных тканей. Приложение внешних электрических полей позволяет ускорять заживление ран за счёт миграции клеток в область повреждения. Однако, основные механизмы влияния электромагнитных и электрических полей на клеточном и молекулярном уровне остаются пока неизученными досконально.

В связи с этим часть исследований в диссертации посвящена влиянию электрической стимуляции на ускоренное заживление тканей и рост клеток. Основная проблема традиционных методов подведения внешнего электрического поля заключается в том, что отсутствует возможность локализовать поле в области заживления. В общем случае электрической стимуляции подвергается значительная площадь организма. Решение данной проблемы может быть найдено при использовании имплантируемых электродов, локализующих электрическое поле в необходимом участке организма. Таким образом, используя имплантируемые электроды малого размера можно добиться стимулирования регенерации поражённых участков при меньших амплитудах напряжённости электрического поля и меньших частотах генерации сигнала. Подобные инвазивные методы требуют использования биодеградируемых материалов, оказывающих минимальное механическое воздействие на окружающие органы и ткани. Одной из перспективных методик в данной области является использование композитных материалов на основе углеродных нанотрубок (УНТ).

На данный момент не существует технологии секвенирования нуклеиновых кислот с необходимой точность и получением и информации о вторичных изменениях, таких как метилирование и многих других известных изменениях отдельных оснований на уровне индивидуальных молекул ДНК и/или РНК. Наконец, ни одна существующая технология не позволяет проводить секвенирование без синтеза, амплификации молекул нуклеиновых кислот и других вспомогательных методов. В связи с этим весьма актуальны исследования, направленные на разработку технологии секвенирования нативной конфигурации ДНК/РНК без добавления дополнительных нуклеотидов, меток, амплификации, или другого любого метода, который вводит количественные ошибки или артефакты. Разработка технологии прямого секвенирования до уровня жизнеспособной научной методики позволит значительно увеличить объем и качество наших знаний о нативном геноме, транскриптоме и эпигеноме, что значительно превысит возможности существующих технологий. В большом числе недавних исследованиий явно показана связь общего генезиса болезней с характеристиками ДНК и РНК, выходящими далеко за пределы простой последовательности и которые или очень сложно, или вообще нельзя анализировать существующими технологиями: редактирование РНК, модификации отдельных нуклеотидов, окисление ДНК и РНК, регуляторные комплексы ДНК-РНК, комплексы РНК-РНК, комплексы РНК с гистонами, все они участвуют в

5

патогенезе заболеваний и находятся вне досягаемости современных технологий секвенирования.

Методы высокоразрешающей атомно-силовой, туннельной микроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния света, усиленной зондом, позволят продвинуться в сторону секвенирования ДНК молекул.

Цель работы и основные задачи

Целью диссертационной работы является исследование зондовыми методами структуры бионаноуглеродных материалов, возможности использования этих материалов для культивирования клеточных структур,

возможностей секвенирования ДНК молекул. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать методику исследования объемного нанотрубчатого композита на основе альбумина и углеродных нанотрубок методами атомно-силовой микроскопии высокого разрешения.

• Разработать методику контроля клеток фибробласта, выращенных на пленках из углеродных нанотрубок, в том числе с применением атомно-силовой микроскопии.

• Разработать методики атомно-силовой, туннельной микроскопии, спектроскопии комбинационного исследования, усиленной зондом ДНК молекул с высоким разрешением.

Научная новизна работы

• Явление «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя бионаноуглеродного композита (или «утопливания» полимерных участков поверхности композита), с помощью которого устанавливается распределение углеродных нанотрубок при атомно-силовой микроскопии.

• Закономерности электростимулированного роста клеточной культуры фибробласта.

• Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий влияние конечного радиуса острия зонда и атмосферы воздуха, позволяющий проводить оценку их геометрических параметров.

Достоверность научных положений, результатов и выводов

Полученные экспериментальные результаты и разработанные методики подтверждаются известными теоретическими моделями. Опубликованные результаты согласуются с известными экспериментальными данными зарубежных авторов и дополняют их.

Теоретическая значимость исследования состоит в развитии моделей атомно-силовой и туннельной микроскопии высокого разрешения для бионаноуглеродных композитов, в том числе для ДНК молекул.

Практическая значимость исследования состоит в том, что разработанные методики могут быть использованы для контроля качества бионаноуглеродных композитов, используемых при регенерации повреждённых или создании новых органов, и в тканевой инженерии для электрической стимуляции роста клеточных структур. Полученные результаты исследований могут быть использованы в курсах «Методы зондовой микроскопии» и «Методы зондовой нанотехнологии».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Атомно-силовая микроскопия бионаноуглеродных композитов в атмосфере воздуха, учитывающая явление «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя композита.

2. Методика контроля взаимодействия локальных электрических полей с клеточными структурами, культивированными на бионаноуглеродных подложках, необходимая и достаточная для проведения оценки корреляций структурных элементов нанокомпозита и геометрической конфигурации формируемых клеточных монослоев.

3. Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий конечный радиус острия зонда и влияние атмосферы воздуха, необходимый и достаточный для проведения оценки их геометрических параметров.

4. Методика сканирования ДНК молекул в атмосфере воздуха с высоким разрешением для обеспечения нуклеотидной характеризации биополимеров на основе различия их электро-оптических свойств.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech 10». Москва -

2010.

International Conference "Advanced carbon nanostructures". St.Petersburg- 2011.

12 th international Conference on the Science and Application of nanotubes 2011. Cambrige, UK.

XIX Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и информатика - 2012» (Москва, Россия, апрель 2012).

Meeting on the Chemistry of Nanotubes and Graphene "ChemOnTubes 2012". Arcachon, France. - 2012.

VIII Russian-Bavarian conference on biomedical engineering. 2012. Saint-Petersburg.

Публикации

Основные результаты исследования, проведенного соискателем, изложены в 15 научных трудах, опубликованных в отечественной и зарубежной литературе, из которых 6 опубликованы в журналах из перечня ВАК. Также соискатель является соавтором двух патентов на изобретение Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка сокращений, списка литературы и приложения.

Во введении рассмотрена актуальность проведения исследований. Сформулированы цели и задачи, решаемые в диссертационной работе.

В первой обзорной главе описаны новые возможности и перспективы

применения бионаноуглеродных материалов и методы их контроля.

8

Рассматривается бионаноуглеродный композит на основе углеродных нанотрубок и бычьего сывороточного альбумина. Поскольку в состав композитов входят углеродные нанотрубки с диаметрами ~ Ihm, то необходимо для структурного анализа использовать микроскопию высокого разрешения, а именно: атомно-силовую и туннельную микроскопию, спектроскопию комбинационного рассеяния света, усиленную зондом. В главе описаны результаты достижений в атомно-силовой и туннельной микроскопии, полученные в научно-образовательном центре «Зондовая микроскопия и нанотехнология» (НОЦ ЗМНТ), которые соответствуют зарубежному уровню. Подробно описана новая методика, которая развивается в НОЦ ЗМНТ - спектроскопия комбинационного рассеяния света, усиленная зондом.

Бионаноуглеродные композиты являются новыми и мало изученными «контрастными» материалами по своим физико-механическим свойствам. Углеродные нанотрубки являются весьма твердыми составляющими композита. Биологические компоненты: альбумин, клетки фибробласта, ДНК-молекулы являются полимерной составляющей композита. Высокоразрешающая зондовая микроскопия таких объектов приводит к новым методическим эффектам -артефактам, которые существенно влияют на результаты использования стандартных методик. Последующие главы диссертации посвящены разработке высокоразрешающей микроскопии бионаноуглеродных композитов.

Во второй главе описаны результаты исследования объемного композита на основе альбумина и углеродных нанотрубок методами атомно-силовой микроскопии. В разделе 2.1 описана лабораторная технология изготовления композита на основе отверждения исходного раствора лазерным излучением. В разделе 2.2 с использованием теории упругости в модели зонд - полубесконечная подложка с плоской поверхностью показано, что наиболее «щадящий» режим сканирования является полуконтактная мода. Тем не менее, возникают специфические артефакты - эффект «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя композита (или «утопливания» полимерных участков поверхности композита). В разделе 2.3 приведены результаты атомно-силовой микроскопии композитов на основе альбумина и углеродных нанотрубок для различных относительных концентраций альбумина и углеродных нанотрубок. Во всех экспериментах по топографированию композитов наблюдается эффект вытеснения углеродных нанотрубок на поверхность. Дополнительно использован метод зонда Кельвина, который учитывает тот факт, что в полимерном композите

9

находятся проводящие углеродные нанотрубки. Особенностью этого метод является то, что под относительно ровной поверхностью композита можно «разглядеть» проводящие включения.

В третьей главе описана атомно-силовая микроскопия клеток фибробласта, выращенных электрической стимуляции на пленках из углеродных нанотрубок и альбумина. Был разработан, создан и запатентован электронный планшет для электростимулированного выращивания клеток фибробласта. Разработана методика создания композитных подложек на основе альбумина и углеродных нанотрубок. Эта методика запатентована как способ изготовления нанотрубчатого носителя. Были исследованы и найдены закономерности для электрической стимуляции роста клеток. Проведены оптическая и атомно-силовая микроскопия композитных подложек и выращенных клеток. Предложена модель, объясняющая электрическую стимуляцию клеток.

В главе четыре описаны результаты исследования ДНК молекул зондовыми методами высокого разрешения. В разделе 4.1 предложена аналитическая модель для описания сканирования биологических наночастиц в атмосфере воздуха, которая учитывает наличие адсорбата на исследуемых образцах. Рассмотрен эффект выдавливания адсорбата из межэлектродн�