автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.17, диссертация на тему:Разработка и внедрение в клиническую практику специализированного фотометра с набором реагентов для количественного анализа общего белка в моче

Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники

На правах рукописи

Ким Юрий Вячеславович

РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКУЮ ПРАКТИКУ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО ФОТОМЕТРА С НАБОРОМ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ОБЩЕГО БЕЛКА В МОЧЕ

Специальность 05.11.17 «Приборы, системы и изделия медицинского назначения»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в ГУН «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат физико-математических наук А.Н. Шибанов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор технических наук Н.Е. Беняев

доктор физико-математических наук, профессор С.В. Селищев ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ЗАО «ВНИИМП-ВИТА» (НИИ медицинского приборостроения) РАМН

Защита диссертации состоится 20 апреля в 10-00 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ208.001.01 при ГУН «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» МЗ и СР РФ по адресу: 129301, г. Москва, ул. Касаткина, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУН ВНИИИМТ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь регионального диссертационног

кандидат технических наук

совета ДМ208.001.01,

Э.Б. Козловский

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что протеинурия - секреция белков с мочой - наблюдается при многих болезнях почек и моче-выделительной системы в целом. Задача определения концентрации общего белка в моче (ОБМ) является важным клиническим исследованием, позволяющим получить существенную информацию о состоянии почек пациента и предупредить развитие почечных патологий на ранних этапах заболевания.

В связи с увеличением числа заболеваний, связанных с системой мочевыделения, проблема диагностики протеинурии является актуальной. По этой причине значимость данного анализа признана высокой во всем мире, и различные методы определения ОБМ внедряются в широкую клиническую практику. Данный вид анализов выполняется практически в любой клинико-диагностической лаборатории (КДЛ), а суммарное число анализов является одним из наиболее высоких.

Статистика Центра внешнего контроля качества клинических лабораторных исследований утверждает, что сегодня подавляющее большинство российских КДЛ выполняет анализы ОБМ с помощью унифицированных методов с применением сульфосалици-ловой кислоты (ССК-метод) или азотной кислоты (метод Брандбер-га-Робертса-Стольникова). Часто для анализов в нашей стране используются технически устаревшие фотометры типа КФК с проточной кюветой, изначально не предназначенные для применения в лабораторной медицине. В связи с этим многие исследователи отмечают низкую точность определения ОБМ. Данные опросов КДЛ и отчетов Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) по результатам циклов внешней оценки качества определения концентрации ОБМ, проводимых среди отечественных КДЛ, указывают на критическое состояние данной проблемы.

Следовательно, решение задачи повышения точности определения, увеличения производительности выполнения и снижения стоимости анализов является востребованным и необходимым в КДЛ.

Цель. Создание оборудования и набора реагентов, разработка методических указаний для количественного определения концентрации общего белка в моче и их внедрение в клиническую практику.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

1. Провести анализ существующих методов определения концентрации ОБМ, теоретически и экспериментально обосновать выбор наиболее эффективного метода, удовлетворяющего современным требованиям рутинной лабораторной практики.

2. Теоретически обосновать решение разработки оборудования и набора реагентов для количественного определения концентрации ОБМ.

3. Создать набор реагентов для количественного определения концентрации ОБМ и исследовать его характеристики.

4. Разработать специализированный биохимический фотометр для количественного определения концентрации ОБМ с применением исследованного набора реагентов и подготовить их к серийному производству.

5. Разработать методику выполнения анализа ОБМ с помощью созданного набора реагентов и специализированного фотометра и внедрить их в клиническую практику.

Научная новизна. Построена математическая модель определения концентрации белка в биопробе фотометрическим методом с помощью двухволновой методики анализа, позволяющая численно выбрать оптимальные параметры источников излучения и оценить возможные погрешности при измерении.

Численным моделированием дано обоснование того, что светодиоды пригодны для использования в качестве источников излучения в измерительной ячейке разработанного фотометра, а необходимые фотометрические параметры измерения достигаются без применения светофильтров для сужения спектра зондирующего излучения светодиодов.

Исследована модификация пирогаллолового реагента, позволившая улучшить его аналитические характеристики в сравнении с существующими аналогами.

Практическая ценность. Дано решение одной из важных социальных проблем, позволяющее улучшить качество диагностики протеинурии (снизить количество методических ошибок при подготовке и измерении биопроб, повысить точность и правильность результатов анализов), упростить выполнение рутинных операций и повысить производительность труда в КДЛ при выполнении данного вида анализов и существенно снизить его стоимость.

Освоена технология применения светодиодов в качестве источников излучения в фотометрах без использования светофильтров, позволившая значительно упростить конструкцию измерительной ячейки и снизить ее стоимость.

Разработана конструкция измерительной ячейки фотометра для проведения измерений в круглых пробирках, позволившая в два раза сократить время выполнения анализа в сравнении с классическими фотометрами и спектрофотометрами с проточной кюветой.

Создан набор реагентов для количественного определения ОБМ «Юни-Тест-БМ», ТУ 9398-001-59879815-2004, на него получено регистрационное удостоверение № ФС 032а2004/1190-04 от 07.12.2004 г. и в настоящий момент он серийно выпускается на производственной базе ООО «Эйлитон» (г. Москва).

Создан специализированный биохимический фотометр ФБС-01-1-«Микролаб-600», ТУ 9443-005-59879815-2004, предназначенный для выполнения анализа ОБМ с применением набора реагентов «Юни-Тест-БМ», на него получено регистрационное удостоверение № ФС 022а2004/1115-05 от 15.02.2005 г. и он серийно выпускается на производственной базе ООО «Эйлитон».

Разработана методика определения концентрации ОБМ с применением фотометра ФБС-01-1-«Микролаб-600» и набора реагентов «Юни-Тест-БМ».

Внедрение. Разработанный фотометр внедрен в серийное производство ООО «Эйлитон». Произведено более 170 фотометров, которые поступили в КДЛ медицинских и научных учреждений страны.

Разработанный набор реагентов внедрен в серийное производство 0 0 0 «Эйлитон». Произведено более 1040 наборов реагентов, которые поступили в КДЛ медицинских и научных учреждений страны.

Фотометры с наборами реагентов и методика определения ОБМ внедрены в широкую клиническую практику.

Основные научные положения, выносимые на защиту.

1. Математическая модель определения концентрации белка в биопробе фотометрическим методом с помощью двухволновой методики анализа, позволяющая численно выбрать оптимальные параметры светодиодов, используемых в качестве источников излучения, и оценить возможные погрешности при фотометрировании.

2. Разработка фотометра, обладающего существенно низкой стоимостью в сравнении с существующими прототипами благодаря использованию в нем светодиодов с параметрами, выбранными с учетом результатов математического моделирования и экспериментальных данных; а также обладающего значительной производительностью за счет оптимизации конструкции и алгоритма работы для анализа с помощью созданного и исследованного набора реагентов.

3. Результаты исследований и технология производства набора реагентов, с улучшенными потребительскими характеристиками в сравнении с импортными аналогами, и обладающего более низкой стоимостью.

4. Результаты испытаний и внедрения разработанного оборудования для выполнения количественных анализов концентрации ОБМ в лабораторную практику отечественного здравоохранения.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались и обсуждались на следующих научных конференциях:

1. 11-я Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и инфор-матика-2004», Москва, МИЭТ, 2004 г.;

2. Научно-практический симпозиум по проблеме «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина», Москва, ММА им. И.М. Сеченова, 2004 г.

Публикации. По теме опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах, включает введение, аналитический обзор, исследование характеристик созданного набора реагентов, решение задач по разработке и подготовке к серийному производству специализированного фотометра для анализа концентрации ОБМ, результаты технических и медицинских испытаний разработанных изделий, выводы и заключение. Литературный указатель включает 217 источников информации. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 57 рисунками.

Работа содержит следующие главы:

1. Методы и средства анализа концентрации белка в моче.

2. Исследование характеристик набора реагентов, разработка методики определения концентрации общего белка в моче с его применением и сравнительный анализ с наборами реагентов сторонних производителей.

3. Разработка и подготовка к серийному производству специализированного фотометра для анализа концентрации общего белка в моче.

4. Испытания, применение и внедрение фотометра с набором реагентов в лечебные учреждения.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и основные задачи работы, представлены научные положения, выносимые на защиту.

Первая глава диссертации содержит аналитический обзор методов и средств анализа концентрации белка в моче, дана их классификация. Согласно сформулированным требованиям к современному методу анализа ОБМ наиболее оптимальным является метод, основанный на взаимодействии комплекса молекул красителя пиро-галлолового красного (ПГК) и молибдата натрия с молекулами белка. Представлены теоретические основы метода, основанного на применении красителя ПГК, (ПГК-метод) и обоснована актуальность создания и внедрения в лабораторную практику нового реагента. Рассмотрены физические основы функционирования биохимических анализаторов, на основе проведенного анализа существующих анализаторов и сформулированных требований обоснована актуальность разработки и внедрения в лабораторную практику нового анализатора ОБМ. На основании обзора литературных данных сделан ряд выводов:

1. Анализ ОБМ является одним из важных лабораторных тестов, так как данный лабораторный показатель играет решающую роль в диагностике почечных заболеваний.

2. Сравнительный анализ методов показал, что наиболее оптимальным и, значит, перспективным для использования в рутинной клинической практике является ПГК-метод.

3. В отечественном здравоохранении внедрение методов с улучшенными потребительскими характеристиками вместо применяемых повсеместно устаревших методов, таких как низкоточный ССК-метод, сдерживается высокой стоимостью импортных биохимических анализаторов и наборов реагентов.

4. Измерения проводятся либо на импортном оборудовании, либо с помощью отечественных фотометров и спектрофотометров с проточной кюветой, не предназначенных для выполнения

этого вида анализов. На момент начала работы не существовало специализированного анализатора, на котором можно было бы выполнять анализы ОБМ качественно и быстро.

Из общих выводов, изложенных в главе, следует заключение о необходимости разработки оборудования для анализа ОБМ ПГК-методом, которое должно включать в себя набор реагентов и специализированный фотометр. Они не должны уступать по своим потребительским характеристикам импортным аналогам, и иметь при этом более низкую стоимость на российском рынке медицинской лабораторной техники, что позволит им быть доступным любой КДЛ. Их внедрение позволит создать предпосылки для широкого применения ПГК-метода в практике отечественных КДЛ.

Вторая глава посвящена исследованиям характеристик набора реагентов «Юни-Тест-БМ» с целью дальнейшей разработки специализированного фотометра для анализа содержания ОБМ с его применением. Представлены методические аспекты определения концентрации ОБМ с применением данного набора. В завершении главы представлены результаты сравнительных исследований характеристик созданного набора реагентов и наборов реагентов других производителей, позволяющие заключить, что рассматриваемый набор не уступает по качеству импортным аналогам, а по каким-то характеристикам некоторые из них превосходит.

В состав набора реагентов «Юни-Тест-БМ» входят пирогал-лоловый реагент и калибровочный раствор белка с концентрацией 1 г/л. Далее по тексту речь пойдет об исследовании пирогаллолового реагента.

Компонентами пирогаллолового реагента являются: 1) краситель ПГК, 2) молибдат натрия, 3) янтарная кислота, 4) стабилизатор, 5) буферный раствор.

На рис.1 представлен его спектр поглощения.

Исследованы время инкубации и время стабильности оптических плотностей (ОП) проб с момента завершения инкубации при температуре +18... + 25 °С, которые составили 15 и 30 мин, соответственно.

и

б

3

1 /

г /1

Л ил

\ \

\8

А

Исследовано влияние рН образцов мочи, величина кислотности которых может варьироваться в диапазоне 4,5-9 рН, на рН пробы. Химическая реакция между реагентом и белком должна проходить в кислой среде при 2,43,2 рН. Доказано, что буферная сила исследуемого реагента достаточна для проведения реакции взаимодействия комплекса краси-тель-молибдат натрия с белком.

Экспериментальным путем определены технические (аналитические) характеристики набора реагентов (чувствительность, линейная область определения концентрации, коэффициент вариации и допустимый разброс результатов при анализах одних и тех же концентраций). Проведены исследования области линейности для проб с соотношением образец/реагент 1:50. Зарегистрированы спектры поглощения проб для водного альбумина с концентрациями в диапазоне 0,005-3,5 г/л. Доказано, что область линейности с относительным отклонением 5% от ее линейного тренда достигает своего предела при концентрации белка 2,5 г/л в образце (рис.2).

ДгъмЛ ВО(*М м

Рис. 1. Спектр поглощения исследуемого реагента (А) и спектр поглощения реагента при добавлении белка (В).

В диапазоне длин волн 300-700 нм наблюдаются следующие характерные пики

1 - пик с максимумом поглощения при длине волны 480 нм характеризует концентрацию молекул красителя, способных к взаимодействию с белковыми молекулами;

2 - пик с максимумом поглощения при длине волны 375 нм соответствует соединению, возникающему при окислении красителя, и характеризует концентрацию молекул красителя, не способных к взаимодействию с молекулами белка,

3 - пик с максимумом поглощения при длине волны 600 нм соответствует соединению, возникающему при взаимодействии красителя с белком, и его амплитуда прямо пропорциональна концентрации белка, участвующего в данном взаимодействии, С - О.

5 1.5

05

1 I 1

1 х 1 1 1 -* 1

3 V ч к

ас И Ч2

О 0,1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0,7 0.8 0,9 1 Оптическая плотность рабочей пробы с вычетом оптической плотности холостой пробы, 6

Рис.2. Калибровочная зависимость для одноволновой методики измерения (при длине волны 600 нм).

С помощью измеренных значений построен квадратичный тренд (2 - тонкая сплошная), описываемый уравнением квадратичной аппроксимации С = 0,394 •Д/)2 + 2,409 *Д£>, где С -концентрация белка, Д£> - оптическая плотность пробы с вычетом оптической плотности холостой пробы. Для него определен 5%-й «доверительный» интервал (границы отклонения (3 -пунктирная)). Линейный тренд (1 - жирная сплошная) для полученных точек также находился в указанном интервале и описывался уравнением С = 2,66*ДО. Из уравнения линейной аппроксимации получен фактор пересчета из значений ДО в соответствующее значение концентрации С, равный 2,66 г/(л*Б).

Получены данные, позволившие утверждать, что разработанная технология производства обеспечивает непосредственно после синтеза воспроизводимость от серии к серии основных характеристик реагента (фактора и ОП при длине волны 600 нм) с разбросом, не более 3%.

Исследовано изменение характеристик реагента в течение длительного срока хранения при разных температурах. Показано, что реагент работоспособен в течение 12 мес при температуре хранения +2... + 8 °С.

Разработана методика количественного анализа ОБМ. Сложность анализа заключается в том, что диапазон концентраций является чрезвычайно широким: от сотых единиц до единиц г/л, - и по этой причине определять низкие значения (в области 0,02 г/л) и высокие значения (в области 2,5 г/л) при одном и том же соотношении образец/реагент с заявленным коэффициентом вариации 5% не представляется возможным. Предложены два варианта проведения анализа, отличающиеся соотношениями образец/реагент:

• Анализ с соотношением 1:50 предназначен для определения концентраций в диапазоне 0,07-2,5 г/л;

• Анализ с соотношением 1:10 предназначен для определения концентраций в диапазоне 0,02-0,4 г/л.

Таким образом, по результатам исследований реагент обладает следующими техническими характеристиками:

- Линейная область определения концентрации белка - до 2,5 г/л (при соотношении образец/реагент 1:50); отклонение от «линейности» - не более 5%.

-Чувствительность определения - не более 0,01 г/л (при соотношении образец/реагент 1:10).

- Коэффициент вариации результатов измерений - не более 5%.

Проведены сравнительные исследования с характеристиками существующих аналогов, таких как реагент из набора «Total protein UC FS» (DiaSys, Германия), реагент из набора «Fluitest USP» (Biocon Diagnostik, Германия) и реагент из набора «Белок-ПГК-НОВО» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Изучена сопоставимость результатов анализов, полученных с применением созданного реагента и реагентов компаний DiaSys на фотометре КФК-3 (рис.3) и Biocon Diagnostik на спектрофотометре СФ-2000 (Ким Ю.В., Шибанов А.Н. // Клин. лаб. диагн. - 2004. - № 10.-С.З-7).

В каждом случае исследовались 35 образцов мочи; измерения проводились при длине волны 600 нм (одноволновая методика измерения). В обоих случаях корреляция результатов имела коэффициент г — 0,98. Результаты представлены в табл.1 и 2. Из них сле-

дует, что исследуемый реагент обладает лучшими характеристиками, чем данные импортные аналоги.

С целью сравнения устойчивости аналитических характеристик и химического состава созданного реагента и реагентов-аналогов в течение длительного времени проведена оценка скоростей их изменения. Исследовались образцы рассматриваемого реагента, реагентов компаний ЗАО «Вектор-Бест» и DiaSys, помещенные в термостат при температурах в диапазоне +40...+50 °С в течение месяца. Полученные результаты позволили сделать выводы о том, что первый реагент обладает характеристиками, не уступающими указанным аналогам.

Таблица 1.

Результаты анализа характеристик разработанного реагента _и реагента компании Biocon Diagnostic_

Критерий при соотношении образец/реагент 50 1500 мкл Разработанный реагент Реагент компании Biocon Diagnostik (Германия)

ТИП зависимости калибровочной кривой линейная линейная

Фактор пересчета для монохроматического метола измерения при 600 нм, г/(л*Б) 1,8 2,05

Фактический предел линейной области определения, г/л 2 15

Фактическая чувствительность реагента, г/л 0,04 0,05

Стабильность продукта реакции с момента завершения инкубации пробы, мин 30 30

Коицмтрадо бема (исслсдусымЛ реагент), г/я

Рис.3. Диаграмма сопоставления значений концентраций ОБМ, определенных с применением исследуемого реагента и реагента DiaSys

Таблица 2.

Результаты анализа характеристик разработанного реагента _и реагентов компаний DiaSys и ЗАО «Вектор-Бест»_

Критерий при соотношении образен/реагент20:1000 мкл Разработанный реагент Реагент ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) Реагент компании (Германия)

Тип зависимости калибровочной кривой линейная линейная линейная

Фактор пересчета для монохроматического метода измерения при 600 нм, г/(л*Б) 2,9 2,6 4,7

Фактический предел линейной области определения, г/л 3 3 3

Фактическая чувствительность реагента, г/л 0,05 0,05 0,08

Стабильность продукта реакции с момента завершения инкубации пробы, мин 30 60 30

Предложены пути дальнейшего улучшения потребительских характеристик представленного набора реагентов.

Третья глава посвящена теоретическому обоснованию и техническому решению задачи разработки и подготовки к серийному производству специализированного биохимического фотометра для выполнения количественных анализов концентрации ОБМ с применением исследованного во второй главе набора реагентов, в том числе представлено решение задачи разработки и оптимизации измерительной части фотометра, описан процесс выбора и конструирования основных узлов прибора при соответствующих ограничениях к ним, основанных на первичных требованиях, изложенных в первой главе. Представлена блок-схема работы фотометра. Описаны алгоритм его функционирования и пользовательский интерфейс.

Основными требованиями к анализатору являлись высокая точность и воспроизводимость результатов измерений, эргономич-ность и максимально сниженная стоимость фотометра.

Анализатор должен выполнять измерения в оптических пробирках. Использование пробирок обусловило реализацию двухвол-

новой методики регистрации ОП биопробы при длинах волн 600 и 650 нм.

В большинстве существующих фотометров в качестве источников излучения используются специализированные лампы накаливания. Они обладают высоким энергопотреблением и требуют применения дорогостоящих интерференционных светофильтров. По этой причине в качестве источников излучения предложено использовать светодиоды (СД) с фиксированными длинами волны излучения и с углом расхождения луча порядка 10-20°. Применение источников с широким спектром зондирующего излучения, таких как СД, и круглых пробирок подразумевает ряд проблем, связанных с ограничениями закона Бугера-Ламберта-Бера (Б-Л-Б), на котором основан фотометрический метод анализа. К таким ограничениям относятся требования монохроматичности источника излучения и равномерности оптического пути для каждого светового пучка в зондирующем луче.

Построена математическая модель процедуры измерения концентрации белка в пробе на двух длинах волн

(рис.4), основанная на обобщен-

Концецтрация С

Рис.4. Калибровочные зависимости, построенные экспериментально (1 - жирная) на макетной измерительной ячейке и с помощью численного моделирования (2 - тонкая) (при расчете использовались параметры тех же СД, которые участвовали в эксперименте). Треугольниками обозначены экспериментальные точки.

Насыщение для экспериментально полученной калибровочной зависимости наблюдается при концентрации, равной 2,0 г/л. Относительное отклонение величин разности ОП для концентрации 2,0 г/л не превысило 5%, что свидетельствует об удовлетворительной достоверности построенной математической модели, описывающей процедуру измерения концентрации белка, реальным условиям измерения.

ном законе Б-Л-Б, позволившая теоретически обосновать следующие положения:

1. СД пригодны для использования в качестве источников излучения в ячейках фотометров.

2. Необходимые фотометрические параметры измерения достигаются без применения корректирующих светофильтров в ячейках разрабатываемого фотометра.

3. Отсутствует необходимость ввода квадратичной поправки для выполнения закона Б-Л-Б в алгоритме расчета концентрации.

4. Выбраны оптимальные технические параметры СД для использования в ячейке фотометра.

5. Разработана процедура настройки СД на этапе юстировки фотометра при серийном производстве.

На основе технических требований к фотометру и результатов численного моделирования разработана измерительная ячейка, выбраны базовые комплектующие фотометра. В рамках работ по разработке ячейки 1) разработана ее оптическая схема (рис.5); 2) разработана модуляционная методика регистрации сигналов (рис.6); 3) выполнена оценка динамического диапазона измерений и обоснован выбор разрядности применяемого аналого-цифрового преобразователя (АЦП); 4) разработана процедура настройки источников излучения на этапе юстировки фотометра;

Рис.5. Эскиз оптической схемы измерительной ячейки.

В начале цикла измерения включается основной СД 1. Световой поток проходит через делительное стекло 3. Диафрагма 4 формирует узкий зондирующий пучок и пропускает его через пробирку с пробой 5 Пробирка с пробой, являясь цилиндрической линзой, фокусирует прошедший свет через диафрагму 6 на рабочую часть ФПУ 7, которое регистрирует полученный сигнал. Затем СД 1 выключается и включается вспомогательный СД 2, часть светового потока которого отражается от стекла 3 и проходит тот же оптический путь до ФПУ 7, что и световой поток от СД 1. ФПУ регистрирует полученный сигнал от СД 2.

5) описаны расчетные формулы, используемые для вычисления результирующих величин (ОП и концентрации) в фотометре; 6) выбраны базовые комплектующие элементов и определены критические размеры ячейки; 7) изготовлены и опробованы опытные образцы ячейки.

Одним из существенных факторов, ухудшающих точность фотомет-рирования, является фоновая «засветка», характеризующаяся дневным и искусственными модулированными потоками света с частотой 50100 Гц. Влияние данного фактора в классической оптической схеме снижают за счет установки «обрезающих» фильтров на оптической оси непосредственно перед фотоприемником (ФПУ). В связи с

поставленной задачей максимального снижения стоимости конструкции ячейки данный вопрос решен разработкой следующей модуляционной методики измерения сигналов (рис.6). Пачки импульсов при измерении «темнового» и рабочего сигналов подаются с частотой 1 КГц и компенсируют влияние помех.

Экспериментально изучены спектры излучения СД разных производителей; определены разбросы их параметров. Выбранные СД и ФПУ опробованы на стендах и в макетах ячейки.

Рис. 6. Временная диаграмма выходных сигналов, зарегистрированных на ФПУ при последовательном включении СД с 600 и 650 нм, и фазы выполнения алгоритма:

• Фазы 1 и 3. СД выключены. Регистрация «темнового» сигнала Уё.

• Фаза 2. Включение СД с 600 нм и регистрация сигнала измерительного канала У1. СД выключается. Величина сигнала (VI- Уё) помешается в накопитель ^600.

• фаза 4. Включение СД с 650 нм и регистрация сигнала измерительного канала У2. СД выключается. Величина равная {У2- Уё) помещается в накопитель ^650.

Фазы 1-4 выполняются в N измерительных циклах. Накопленные величины усредняются по N и затем участвуют в расчете ОП (формула (1)) при длинах волн 600 и 650 нм.

Теоретически показано, что 12-разрядного АЦП достаточно для того, чтобы допустимая погрешность не превышала 10% при измерении концентрации в требуемых диапазонах при соответствующих соотношениях образец/реагент в исследуемых пробах (медицинские требования - погрешность не более 20%).

Расчет значений ОП О1 (Б) при включении СД с длиной волны излучения 600 нм производится по формуле:

где Уь 1 - выходное напряжение на ФПУ при включении СД с длиной волны излучения 600 нм при измерении пробирки с холостой пробой; - выходное напряжение на ФПУ при включении СД с длиной волны излучения 600 нм при измерении пробирки с опытной пробой.

Аналогично рассчитывается значение ОП при включении СД с длиной волны излучения 650 нм.

Расчет значений концентрации С (г/л) производится по формуле:

где - ОП пробы, вычисленная по измеренным сигналам при включении СД с длиной волны излучения 600 нм по формуле (1); Иг - ОП пробы, вычисленная по измеренным сигналам при включении СД с длиной волны излучения 650 нм по формуле (1);

- фактор пересчета, рассчитанный при измерении калибровочной пробы, в зависимости от варианта анализа:

(1)

C = (DrD2)*F.

(2)

С

cal

F.= — ' D

cal 1

- D

call

(3)

где Ciai - установленная концентрация белка в калибровочной пробе; Да/| - ОП калибровочной пробы, вычисленная при включении

светодиода с длиной волны излучения 600 нм по формуле (1); А»п - ОП пробы, вычисленная при включении светодиода с длиной волны излучения 650 нм по формуле (1).

Разработана блок-схема фотометра (рис. 7).

Рис.7. Блок схема фотометра.

Фотометр функционирует под управлением центрального процессора по алгоритму, занесенному в ПЗУ. Ввод данных осуществляется с помощью 4-х кнопочной клавиатуры. Вывод данных осуществляется посредством отображения сообщений и измеренных (расчетных) значений наЖКИ.

Фотометр функционирует от первичного источника питания: комплекта из четырех элементов питания типа АА или от сети переменного тока с напряжением 220 ± 22 В и частотой 50 Гц (от блока питания типа БПН-6,0-0,5). Вторичный источник питания, входящий в состав блока питания фотометра, обеспечивает стабилизированными напряжениями -5 В и +3,3 В микропроцессорный блок, тем самым обеспечивая сохранение работоспособности и воспроизводимости метрологических характеристик фотометра.

Зарегистрированный сигнал (напряжение) с ФПУ с ОУ на одном кристалле поступает в электронный блок в АЦП, который передает его на обработку в микропроцессорный блок. В зависимости от выполняемого алгоритма микропроцессор заносит обработанные данные либо в ОЗУ, либо дает команду на индикацию соответствующих сообщений на индикаторе. Согласно занесенному в ПЗУ алгоритму во время рабочих процедур происходит постоянный опрос тех или иных кнопок клавиатуры. В зависимости от результата данного опроса система переходит в соответствующее состояние согласно алгоритму работы.

Руководствуясь техническими требованиями к фотометру, выбраны корпус, индикатор, микроконтроллер, разработана лицевая панель (рис.8) с пленочной клавиатурой, разработана и оптимизиро-

вана конструкция измерительной ячейки. При конструировании ячейки решен ряд инженерных задач таких как 1) обеспечение устойчивой фиксации пробирки внутри ячейки при помощи плоской пружины и фасонного отверстия; 2) оптимизация размещения и крепления датчика пробирки; 3) выбор материала для изготовления ячейки; 4) оптимизация процесса сборки ячейки из простых составных деталей; 5) разработка и крепление к ячейке кросс-платы для размещения оптико-электронных элементов; 6) разработка конструкции крепления ячейки к корпусу.

Разработан алгоритм функционирования фотометра и его пользовательской интерфейс (программное обеспечение), в которых реализованы общие потребительские требования, а также:

1. Обеспечение проведения поверочных измерений с помощью комплекта контрольных светофильтров КСП-01 ТУ 4486003-27480117-98 с выводом результатов измерений на индикатор согласно разработанной методики поверки, т.к. фотометр является средством измерения (рег. удостов. № ФС 022а2004/1115-05 от 15.02.2005 г.).

2. Обеспечение возможности контроля рабочих сигналов и изменения базовых параметров фотометра. Указанные процед>ры необходимы при производстве и сервисном обслуживании фотометров.

3. Реализация процедуры контроля элементов питания в случае его работы в режиме автономного питания, что позволяет заблаговременно предупреждать пользователя о необходимости замены израсходованных элементов питания.

4. Автоматическое выключение через заданный промежуток времени помимо штатной процедуры выключения с помощью специальной кнопки. Требование обусловлено необходимостью экономии расхода электроэнергии и увеличения срока эксплуатации элементов питания, а также для предотвращения их случайного расхода в случае, когда фотометр не выключен штатным образом.

5. В фотометре реализованы три режима работы:

5.1. пользовательский режим является основным рабочим режимом, предназначенным для проведения анализа концентрации ОБМ по одному из двух вариантов:

5.1.1. анализ ОБМ в диапазоне концентраций 0,07-2,0 г/л с погрешностью не более 10%;

5.1.2. анализ ОБМ в диапазоне концентраций 0,02-0,4 г/л с погрешностью не более 10%;

5.2. режим поверки предназначен для проведения государственной поверки метрологических параметров фотометра с помощью соответствующего комплекта КСП-01;

5.3. сервисный режим предназначен для настройки и контроля ключевых параметров функционирования фотометра (настройка параметров измерения, звукового сопровождения, запись различных калибровочных коэффициентов, контроль рабочих сигналов).

Система управления фотометром (рис.8) позволяет пользователю выполнять следующие действия: 1) включать/выключать фотометр, 2) выбирать необходимый вариант анализа в пользовательском режиме, 3) переключаться в режим поверки, 4) переключаться в сервисный режим, 5) производить настройку параметров в сервисном режиме.

Четвертая глава содержит результаты технических и медицинских испытаний реагента и фотометра. Приведены результаты сравнительных исследований применимости разработанного обору-

Рис.8. Эскиз лицевой панели с указанием расположения кнопок.

«Скрытые» кнопки СК1 и СК2 визуально скрыты от обычного пользователя (лаборанта) и служат для настройки параметров в сервисном режиме, с их помощью сервисный инженер может переключиться в сервисный режим работы фотометра

дования для выполнения анализов ОБМ в реальных лабораторных условиях, выявившие его значительные преимущества над повсеместно используемыми методами и оборудованием.

Согласно ГОСТ 15013 разработаны комплекты документации к набору реагентов для количественного определения общего белка «Юни-Тест-БМ» (рис.9) и к фотометру биохимическому специализированному ФБС-01-1-«Микролаб-600» (рис.10).

Проведены технические испытания опытных образцов набора реагентов и фотометра. Результаты испытаний показали, что их опытные образцы обладают техническими характеристиками, отвечающими требованиям технических условий.

Медицинские испытания набора реагентов и фотометра проведены в КДЛ четырех ведущих медицинских и научных учреждений: Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ и СР РФ (РКНПК МЗ и СР РФ), Российская медицинская академия последипломного образования МЗ и СР РФ (РМАПО МЗ и СР РФ), Российский научный центр хирургии Российской академии медицинских наук (РНЦХ РАМН), НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ и СР РФ. Опытные образцы набора реагентов и фотометра признаны выдержавшими медицинские испытания на всех вышеуказанных клинических базах. На основании положительных результатов испытаний они рекомендованы к промышленному производству и

Рис.9. Внешний вид набора реагентов «Юни-Тест-БМ».

Рис.10. Внешний вид фотометра ФБС-01-1-«Микролаб-600».

разрешены для применения в медицинской практике (per. удостов. № ФС 032а2004/1190-04 и № ФС 022а2004/1115-05, соответственно).

С целью оценки конкурентоспособности разработанного фотометра с набором реагентов по отношению к распространенным в КДЛ методам и оборудованию проведены сравнительные исследования ОБМ с применением ССК-метода на фотометрах Chem-5 Plus и КФК на базе двух высококвалифицированных медицинских учреждений.

Проанализированы 147 образцов мочи. Обобщенные результаты представлены на рис.11 и в табл.3.

ССК-методом обнаружено наличие белка только в 30 (20%) образцах мочи из 147. Общая характеристика концентраций описывалась диапазоном 0-5,5 г/л (в среднем 0,09 г/л). Для разработанного фотометра с набором реагентов измеренные концентрации описывались диапазоном 0-6,6 г/л (в среднем 0,37 г/л).

Проанализированные образцы разделены на три группы:

• группу №1 составили образцы, в которых обнаруженный ОБМ не превышал 0,1 г/л (нормальные значения);

• группа №2 - образцы с концентрациями в диапазоне 0,10,3 г/л (умеренная протеинурия);

о I з з < s s i

Кояшитрэии* fl«twa фаэработаииыА фотометр с набором реагентов) rfn

Рис.11. Диаграмма сходимости результатов ССК-метода и ПГК-метода (разработанное оборудование).

• группа №3 - образцы с концентрациями, превышающими 0,3 г/л (высокая протеинурия).

Результат обработки данных по группам представлен в

табл.3.

Данные, полученные в группе №1, подтверждают ранее известный факт, что ССК-метод малочувствителен и поэтому вообще не выявляет концентрации ОБМ в пределах нормы. Данные для групп №2 и №3 позволяют сделать вывод, что ССК-метод зачастую не способен определять достаточно высокие концентрации ОБМ, а в образцах, в которых обнаруживается наличие белка, результат значительно занижен (на 30-150%).

Таблица 3.

Сравнительные данные для ССК-и ПГК-методов, полученные при исследовании контрольной выборки одних и тех же образцов мочи._

№ группы Кол-во образцов в группе Кол-во образцов, в которых ССК выявил наличие белка Диапазон выявленных концентраций ОБМ ПГК-методом, г/л Средняя концентрация в группе, выявленная ПГК-методом, г/л Диапазон выявленных концентраций ОБМ ССК-методом, г/л Средняя концентрация в группе, выявленная ССК-методом, г/л

1 63 5 (8%) 0-0,1 0,05 0-0,19 0,01

2 46 7(15%) 0,11-0,29 0,18 0-0,128 0,08

3 38 18(47%) 0,32-6,6 1,15 0-5,5 0,87

С помощью разработанного фотометра с набором реагентов выявлено присутствие ОБМ свыше общепризнанной нормы (0,1 г/л) у 57% пациентов, в то время как ССК-методом обнаружен ОБМ, превышающей норму, только у 10%. По результатам исследования (и на основе данных литературного обзора) сделаны следующие выводы:

1. Данный фотометр с набором реагентов позволяет корректно и более полно выявлять пациентов не только с протеинурией, но и с микропротеинурией в сравнении с унифицированным ССК-методом.

2. ССК-метод не выявлял низкие концентрации ОБМ, практически все обнаруженные концентрации ОБМ оказались занижен-

ными, а в ряде случаев при анализе образцов мочи с высоким содержанием белка ССК-метод приводил к ложноотрицательным результатам. Подобная ситуация в лечебной практике, в свою очередь, может привести к ошибочной диагностической картине состояния здоровья пациентов, к постановке некорректных диагнозов и, как следствие, к неверному лечебному процессу. Таким образом, ССК-метод является неадекватным методом для диагностики протеину-рии!

С точки зрения эксплуатационных качеств фотометр ФБС-01-1-«Микролаб-600», как показал сравнительный анализ, более удобен в эксплуатации, чем существующие фотометры, и существенно (в 2 раза) ускоряет процесс анализа. Проанализировано время, затрачиваемое на проведение анализа 100 образцов мочи ССК-методом на фотометре с применением кюветы и ПГК-методом на разработанном фотометре в реальных условиях (2 ч и 50 мин соответственно).

Сравнительный анализ стоимостей выполнения одного анализа ОБМ показал, что затраты 0,6 руб/анализ для разработанного фотометра с набором реагентов сравнимы с затратами 0,2 руб/анализ для ССК-метода и вполне приемлемы для малых КДЛ, в то время как для импортных наборов реагентов и анализаторов затраты превышают 5 руб/анализ.

Выводы:

1. Дано решение проблемы диагностики протеинурии, позволяющее улучшить качество, упростить рутинные процедуры и повысить производительность труда в КДЛ при выполнении данного вида анализов с существенным снижением их стоимости в сравнении с унифицированными в КДЛ методами.

2. Создан и исследован набор реагентов для количественного определения концентрации ОБМ с улучшенными аналитическими характеристиками в сравнении с импортными аналогами, такими как наборы «Total protein UC FS» (DiaSys, Германия) и «Fluitest USP» (Biocon Diagnostik, Германия).

3. Построена математическая модель, описывающая процедуру измерения проб, приготовленных с помощью исследованного набора реагентов, и расчета концентрации ОБМ, позволившая разработать требуемую конструкцию фотометра.

4. Выбрана численным моделированием оптимальная разрядность АЦП, рассчитаны точность и область линейности определения концентрации ОБМ, выбраны параметры источников излучения и оптимизирована процедура настройки фотометров.

5. Разработана конструкция измерительной ячейки фотометра, эффективно выбраны и разработаны такие узлы и элементы фотометра, как микроконтроллер, корпус, индикатор, клавиатура, схема питания, которые позволили сконструировать фотометр, удовлетворяющий требованиям КДЛ к анализу ОБМ.

6. Разработаны программные средства фотометра, позволившие упростить выполнение анализов ОБМ, сделать его интуитивно-понятным для пользователя.

7. Разработан и подготовлен к серийному производству фотометр ФБС-01-1-«Микролаб-600» с набором реагентов для количественного определения белка в моче «Юни-Тест-БМ». Фотометр (per. удостов. № ФС 022а2004/1115-05) и набор реагентов (рег. удо-стов. № ФС 032а2004/1190-04) внедрены в производство (выпущено более 170 фотометров и более 1040 наборов реагентов) и внедрены в широкую клиническою практику.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ким Ю.В., Потехин О.Е., Токар М.И., Шибанов А.Н. Что мы измеряем в моче сульфосалициловым методом? // Лаб. мед. -2003.-№6.-С.94-98;

2. Ким Ю.В., Свистов А.Е., Шибанов А.Н. Способ количественного определения белка в биологических жидкостях // Заявка на изобр. по сущ. № 2004109212/15 (010164). - G01N33/493. - 2004;

3. Ким Ю.В. Портативный фотометрический анализатор на сверхярких светодиодах для анализа концентрации веществ в биологических жидкостях // Тезисы докладов научно-технической конфе-

ренции «Микроэлектроника и информатика-2004». - М.: МИЭТ. -2004.-С.136;

4. Ким Ю.В., Шибанов А.Н. 170 лет с сульфосалициловым методом (обзор литературы) // Клин. лаб. диагн. - 2004. - № 8. -С.10-15;

5. Ким Ю.В., Шибанов А.Н. Сравнительный анализ методик определения белка в моче: набор «Юни-Тест-БМ» и унифицированный метод с сульфосалициловой кислотой // Тезисы докладов научно-практического симпозиума «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина» в рамках «Национальные дни лабораторной медицины России-2004». - Клин. лаб. диагн.-2004.-№ 9.-С.84-85;

6. Ким Ю.В., Шибанов А.Н. Пирогаллоловый метод определения белка в моче (обзор литературы) // Клин. лаб. диагн. -2004.-№10.-С.3-7.

Подп. к печати 01.03.2005 г. Формат издания 60x84 1/8.

Бумага офс. № 1. Усл. печ. л. 1,7. Уч.-изд. л. 1 _Тираж 100 экз. Зак.3999029/5._

Типография НПО «Экран». ЛИЦЕНЗИЯ: Серия ПД № 00966

о^од-об:/-/

л í '

2 2 'V? 2*j

i.

Î С

Перечень обозначений и сокращений.

Введение.

Глава I. Методы и средства анализа концентрации белка в моче.

1.1. Биологический объект исследования - белок в моче.

1.2. Методы определения белка в моче.

1.3. Основы метода взаимодействия комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия с белком.

1.4. Обоснование актуальности создания нового отечественного набора реагентов.

1.5. Физические основы функционирования биохимических фотометров.

1.6. Обоснование актуальности разработки анализатора концентрации общего белка в моче.

Заболевания почек - одни из самых распространенных недугов современного человека [1]. Ухудшающаяся экологическая обстановка в крупных городах, где проживает большая часть населения развитых стран, неправильное питание, вода низкого качества, нездоровый образ жизни и каждодневные стрессовые нагрузки - все это способствует быстрому росту числа людей, подверженных болезням мочевыделительной системы. К ним относятся сахарный диабет [2, 3], различные нефротические синдромы [1], которые в значительной степени влияют на состояние всего организма в целом [3-5].

По официальным данным отдела медицинской статистики и информатики МЗ и CP РФ на 01.01.2003 г. насчитывалось по обращаемости 2182408 больных 1 и 2 типом сахарного диабета. Фактическое же количество больных только сахарным диабетом в России в 3-4 раза выше, исходя из данных эпидемиологических обследований, проводимых в различных регионах страны.

Более 70% людей, имеющих болезни почек, не догадываются об этом. Зачастую, врачи способны поставить диагноз и назначить необходимое лечение тогда, когда заболевание приобретает тяжелую форму [2].

Существует несколько причин, из-за которых выявление патологии почек на ранних стадиях существенно усложнено, а зачастую невозможно.

Во-первых, многие популярные аналитические методы, как, например, метод с применением сульфосалициловой кислоты для преципитации белка в моче (ССК-метод), используемые сегодня в отечественной медицине, не позволяют выявлять малое содержание биологических веществ, являющихся надежными показателями работоспособности почек, например, таких как белок в моче. Эти методы также не позволяют корректно отслеживать изменение содержания этих биологических веществ в организме пациента.

Во-вторых, в подавляющем большинстве клинико-диагностических лабораторий (КДЛ), занимающихся исследованием мочи - основного результата деятельности почек, не используется современное высокопроизводительное и точное аналитическое оборудование [6].

В-третьих, крайне тяжелое экономическое положение отечественного здравоохранения не позволяет кардинально изменить сложившуюся ситуацию теми аналитическими средствами (оборудованием и методами), которыми обладает в настоящий момент.

Поиском решения проблемы диагностики почечных патологий активно занимаются исследователи во многих развитых странах, таких как Япония, США, Великобритания, Франция, Германия, Швеция, Южная Корея. Сегодня разработано и внедряется в зарубежную медицинскую практику большое количество новых, более современных методов диагностики про-теинурии - основного показателя нарушения работы почек, и мочевыдели-тельной системы в целом.

Для российского здравоохранения актуальным становится вопрос выбора приемлемого метода анализа белка в моче, а также выбора оборудования, удовлетворяющего условиям реализации этого метода.

Данная работа посвящена решению задач создания доступного по цене оборудования и набора реагентов, разработки методических указаний, с помощью которых любая КДЛ могла бы наиболее эффективно на сегодняшний день выполнять необходимое количество анализов содержания общего белка в моче (ОБМ).

Структура работы следующая:

В главе 1 представлен исторический обзор методов определения белка в моче, дана их классификация. Согласно сформулированным требованиям к современному методу анализа ОБМ наиболее оптимальным является метод, основанный на взаимодействии комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия с молекулами белка (ПГК-метод). В главе представлены основы этого метода и на основе анализа существующих реагентов с красителем пирогаллоловым красным (ПГК-реагентов) обоснована актуальность создания и внедрения в лабораторную практику нового набора реагентов. Далее рассмотрены физические основы функционирования биохимических анализаторов, на основе проведенного сравнения существующих фотометров и сформулированных требований обоснована актуальность разработки и внедрения в клиническую лабораторную практику специализированного фотометра для количественного анализа ОБМ. На основании общих выводов поставлена задача на разработку специализированного фотометра с набором реагентов для выполнения анализов ОБМ.

В главе 2 изложены результаты исследований характеристик созданного набора реагентов с целью дальнейшей разработки специализированного фотометра для анализа содержания ОБМ с его применением. Представлены методические аспекты определения концентрации ОБМ с применением исследованного набора реагентов. В завершении главы представлены результаты сравнительных исследований его характеристик и характеристик наборов реагентов других производителей, позволяющие заключить, что рассматриваемый набор реагентов не уступает по качеству импортным аналогам.

В главе 3 изложено решение задачи разработки и подготовки к серийному производству специализированного биохимического фотометра для выполнения количественных анализов концентрации ОБМ с применением исследованного набора реагентов, в том числе представлено решение задачи разработки и оптимизации измерительной части (оптической ячейки) фотометра, описан процесс выбора и конструирования основных узлов прибора при соответствующих ограничениях к ним, основанных на требованиях, изложенных в главе 1. Представлена блок-схема работы фотометра. Описаны его программные средства.

В главе 4 представлены результаты технических и медицинских испытаний фотометра и набора реагентов, проведенных соответствующими государственными испытательными учреждениями РФ. Приведены результаты сравнительных исследований применимости разработанной системы для выполнения анализа ОБМ в клинической практике, выявившие его значительные преимущества над повсеместно используемыми методами и оборудованием для выполнения данного вида анализа.

В заключении сделан вывод, о том, что поставленные задачи в данной работе выполнены, что подтверждают положительные заключения, полученные при испытаниях в сторонних организациях (соответствующие документы представлены в Приложениях к данной работе).

Данная работа защищает следующие положения:

1. Математическая модель определения концентрации белка в биопробе фотометрическим методом с помощью двухволновой методики анализа, позволяющая численно выбрать оптимальные параметры светодиодов, используемых в качестве источников излучения, и оценить возможные погрешности при фотометрировании.

2. Разработка фотометра, обладающего существенно низкой стоимостью в сравнении с существующими прототипами благодаря использованию в нем светодиодов с параметрами, выбранными с учетом результатов математического моделирования и экспериментальных данных; а также обладающего значительной производительностью за счет оптимизации конструкции и алгоритма работы для анализа с помощью созданного и исследованного набора реагентов.

3. Результаты исследований и технология производства набора реагентов, с улучшенными потребительскими характеристиками в сравнении с импортными аналогами, и обладающего более низкой стоимостью.

4. Результаты испытаний и внедрения разработанного оборудования для выполнения количественных анализов концентрации ОБМ в лабораторную практику отечественного здравоохранения.

4.3. Общие выводы

Решена задача по подготовке и проведению технических и медицинских испытаний набора реагентов, описанного в главе 2, и фотометра, описанного в главе 3. На основании положительных результатов испытаний они рекомендованы к промышленному производству и разрешены для применения в медицинской практике (per. удостов. № ФС 032а2004/1190-04 и № ФС 022а2004/1115-05, соответственно).

Показано, что разработанная аналитическая система: специализированный фотометр с набором реагентов - обладает явными преимуществами перед распространенными сегодня в КДЛ средствами анализов ОБМ, такими как ССК-метод и методы «сухой химии».

Учитывая результаты данной главы и результаты сравнительных исследований разработанного набора реагентов с аналогами других производителей, представленные в разд. 2.6.2 главы 2, можно утверждать, что разработанный фотометр с набором реагентов является наиболее эффективным (и по стоимости, и по потребительским параметрам) среди средств для выполнения анализов ОБМ, предлагаемых на российском рынке медицинской лабораторной техники.

Заключение

Цель работы заключалась в разработке и подготовке к серийному производству фотометра с набором реагентов и создании методики количественного определения концентрации ОБМ.

Перечень выполненных задач следующий:

1. Дано решение проблемы диагностики протеинурии, позволяющее улучшить качество, упростить рутинные процедуры и повысить производительность труда в КДЛ при выполнении данного вида анализов с существенным снижением их стоимости в сравнении с унифицированными в КДЛ методами.

2. Создан и исследован набор реагентов для количественного определения концентрации ОБМ с улучшенными аналитическими характеристиками в сравнении с импортными аналогами, такими как наборы «Total protein UC FS» (DiaSys, Германия) и «Fluitest USP» (Biocon Diagnostik, Германия).

3. Построена математическая модель, описывающая процедуру измерения проб, приготовленных с помощью исследованного набора реагентов, и расчета концентрации ОБМ, позволившая разработать требуемую конструкцию фотометра.

4. Выбрана численным моделированием оптимальная разрядность АЦП, рассчитаны точность и область линейности определения концентрации ОБМ, выбраны оптимальные параметры источников излучения и оптимизирована процедура настройки фотометров.

5. Разработана конструкция измерительной ячейки фотометра, эффективно выбраны и разработаны такие узлы и элементы фотометра, как микроконтроллер, корпус, индикатор, клавиатура, схема питания, которые позволили сконструировать фотометр, удовлетворяющий требованиям КДЛ к анализу ОБМ.

6. Разработаны программные средства фотометра, позволившие упростить выполнение анализов ОБМ, сделать его интуитивно-понятным для пользователя.

7. Разработан и подготовлен к серийному производству фотометр ФБС-01-1-«Микролаб-600» с набором реагентов для количественного определения белка в моче «Юни-Тест-БМ». Фотометр (per. удостов. № ФС 022а2004/1115-05) и набор реагентов (per. удостов. № ФС 032а2004/1190-04) внедрены в производство (выпущено более 170 фотометров и более 1100 наборов реагентов) и внедрены в широкую клиническую практику.

Широкое применение разработанного фотометра с набором реагентов в практике отечественных КДЛ позволит решить следующие задачи здравоохранения страны:

1. Улучшение качества диагностики протеинурии в медицинских учреждениях за счет повышения точности определения концентрации ОБМ с помощью данного фотометра с набором реагентов и стандартизация методики проведения анализов ОБМ (методический эффект).

2. Увеличение производительности КДЛ за счет повышения скорости и качества проведения анализов ОБМ с помощью данного оборудования (технический эффект).

3. Снижение финансовых затрат на выполнение анализов ОБМ за счет невысокой стоимости фотометра с набором реагентов, что позволит создать более благоприятную экономическую ситуацию для отечественной медицины (экономический эффект).

4. Рост доверия специалистов (врачей, лаборантов) к результатам анализов ОБМ с помощью данного оборудования как следствие выполнения п. 1 (социальный эффект).

Оценка потребности здравоохранения РФ в фотометрах ФБС-01-1-«Микролаб-600» для количественного определения концентрации ОБМ составляет не менее 5 тыс. штук.

В заключение автор выражает глубокую благодарность и признательность к.ф.-м.н. Шибанову А.Н. за научное руководство и поддержку в работе, а также за помощь в организации исследовательской работы и разработки представленного оборудования с набором реагентов. Также автор выражает искреннюю благодарность к.ф.-м.н. Свистову А.Е. за помощь, оказанную при разработке математических моделей, описанных в работе, и помощь при подготовке диссертации в целом, а также сотрудников компаний ЗАО «А/О Юнимед» и ООО «Эйлитон» за содействие.

Автор благодарит д.т.н. Беняева Н.Е. и д.ф.-м.н., профессора Сели-щева С.В. за согласие оппонировать данную работу на защите.

1. Юрьева Э.А., Длин В.В. Диагностический справочник нефролога // М.: Изд-во «Оверлей». 2002. - 96 е.;

2. Шестакова М.В. И РМЖ. 1998. - Т. 6. — № 12.-С.14-18;

3. Gerstein Н.С. et al. // JAMA. 2001. - Vol. 286. - P.421-426;

4. AnavekarN. et al. //N. Engl. J. Med. 2004. - Vol. 351. - P. 1285-1295;

5. Go A. et al.// N.Engl. J. Med. -2004. -Vol. 351.- P.1296-1303;

6. Щетникович K.A. II Лаб. 2002. - №2. - C.20-21;

7. Наточин Ю.В. Физиология почки // Л. 1972. - С.83-115;

8. Арутюнян В.М., Багдасарян А.С. Нефротический синдром // Ер.: Изд-во «Айастан». 1997. - 287 е.;

9. Чиж А.С., Петров С.А., Ящиковская Г.А. и др. Нефрология в терапевтической практике. 3-е изд-е, доп. // Под ред. А.С. Чижа. Минск: Изд-во «Высшая школа». - 1998. - 557 е.;

10. Clinical guide to laboratory tests. 3rd ed. // Edited by Tietz N.W. USA: W.B. Saunders Company. - 1995. - P.520;

11. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник // Под ред. А.И. Карпищенко. — СПб: Изд-во «Интермедика». 2002. -С.155-177. -408 е.;

12. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка лабораторных исследований. 2-е изд., стереотипное // М.: Изд-во «Медицина». 2002. -С.69-79, 121, 129-131, 199-205,208.-544 е.;

13. Серов В.В., Пальцев М.А., Мухин Н.А. и др. // Тер. архив. 1992. - № 6. -С.5-10;

14. Ратнер М.Я. Болезни почек. Справочник терапевта // Под ред. Ф.И. Комарова. Минск: Изд-во «Беларусь». - 1983. - С. 160-184;

15. Dilena В. A., Penberthy L.A., Fraser C.G. I I Clin. Chem. 1983. - Vol. 29. -P.553-557;

16. Карягина И.Ю., Слепышева B.B., Козлов A.B. И Кл. лаб. диагн. 1996. -№ 6. - С.27-28;

17. Sapan С. V., LundbladR.L., Price N.C. II Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. -Vol. 29.-P.99-108;

18. Шмелева В.Г. Химия белков и ферментов. Текст лекций // СПб: СпбТИ. 1992.-С.4-37;

19. Kjeldahl J. И Z. anal. Chem. 1883. - Vol. 22. - P.366;

20. Kjeldahl J. II Compt.-rend. trav. Lab. Carlsberg. 1883. - Vol. 2. - P. 1;

21. Kjeldahl J. I/ Compt.-rend. trav. Lab. Carlsberg. 1888. - Vol. 2. - P. 197;

22. Hiller A., Plazin J., Van Slyke D.D. II J. Biol. Chem. 1948. - Vol. 176. -P.1401-1420;

23. Vickery H.B. II Yale J. Biol, and Med. 1946. - Vol. 18.-P.473;

24. Friedrich A. II Mikrochemie. 1933. - Vol. 13. - P.91;

25. Bradstreet R.B. II Chem. Rev. 1940. Vol. 27. - P.331;

26. BrandE., Kassell ВSaidel L.J. II J. Clin. Invest. 1944. - Vol. 23. - P.437;

27. Brand E. // Ann. New York Acad. Sc. 1946. - Vol. 47. - P. 187;

28. Brand E., Edsall J. Т. II Stanford University. 1947. - Vol. 16. - P.223;

29. WuH. II J. Biol. Chem. 1921. - Vol. 51.-P.33-39;

30. Kingsbury F.B., Clark C.P., Williams G., Post A.L. И J. Lab. and Clin. Med. -1926.-Vol. 11.-P.981-989;

31. Robinson H. W., Hogden C.G. // J. Biol. Chem. 1941. - Vol. 140. - P.853;

32. Beckman W. W. et al. // J. Biol. Chem. 1943. - Vol. 148. - P.247-248;

33. Hiller A., GreifR.L., Beckman W.W. И J. Biol. Chem. 1949. - Vol. 176. -P.1421-1429;

34. Lowry O.H. et al. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193.-P.265-275;

35. Амелин В.Г., Иванов В.М., Золотое Ю.А. Химические тест-методы анализа // М.: Изд-во «Едиториал УРСС». 2002. - С.268-282;

36. Ким Ю.В., Шибанов А.Н. II Клин. лаб. диагн. 2004. - № 8. - С.10-15;

37. Алътшулер Б.Ю., Раков С.С., Ткачев Г.А. II Вопр. мед. химии. 2001. -№ 4. - С.426-438;

38. Nakamura J., Yakata М. II Clin. Chem. 1982. - Vol. 28 (11). - P.2294-2296;

39. Nishi H.H., ElinRJ.II Clin. Chem. 1985.-Vol. 31.-P.1377-1380;

40. Chambers R.E., Bullock D.G., Whicher J.T\ II Ann. Clin. Biochem. 1991. -Vol. 28 (Pt. 5).-P.467-473;

41. Миронов O.JI. Химический состав почечных камней и фракционный состав белков сыворотки крови и мочи. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.х.н. // Донецк: ИФОХУ им.Л.М. Литвиненко АН Украинской ССР. 1991. - 10 е.;

42. Ким Ю.В., Потехин О.Е., Токар М.И., Шибанов А.Н. II Лаб. мед. 2003. -№ 6. - С.94-98;

43. Folirt О., Denis W. И J. Biol. Chem. 1914. - Vol. 18. - Р.273-276;

44. Albanese А.А., Irby V., Saur В. II J. Biol. Chem. 1946. - Vol. 166. - P.231-237;

45. Shiba K.S. et al. // Clin. Chem. 1985. - Vol. 31.- P. 1215-1218;

46. GerbautL., Macart M. II Clin. Chem. 1986. - Vol. 32. - P.353-355;

47. Chaturvedi S., Jain N., Bhatia A. II Indian J. Pathol. Microbiol. 2001. -Vol. 44 (4). -P.399-401;

48. Базарный В.В., Мазеин Д.А. II Вестник Обл. клин, больницы №1 г. Екатеринбург. 2002. - № 4. - С.45-47;

49. Пупкова В.И. и др. // Новости «Вектор-Бест». 2003. - № 4 (30). - С.7-Ю;

50. Shriever Я, Gambino S.P. II Am. J. Clin. Pathol. 1965. - Vol. 44. - P.667-672;

51. Ebina S., Nagai Y. II Clin. Chem. 1979. - Vol. 25. - P.247-251;

52. Muir A., Hensley W.J. II Clin. Chim. Acta. 1978. - Vol. 90 (3). - P.231-239;

53. Yosselson-Superstine S., Sinai Y. I I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1986. -Vol. 24 (1). -P.103-106;

54. BeibyJ.P., O'Leary B.A. II Clin. Chem. 1990. - Vol. 36. - P.565-567;

55. Kaplan I. V., Levinson S.S. II Clin. Chem. 1999. - Vol. 45. - P.417-419;

56. ShepardM.D., Penberthy L.A. II Clin. Chem. 1987. - Vol. 33. -P.792-795;

57. SaiferA., GersenftidN. И Clin. Chem. 1964.-Vol. 2.-P.321-334;

58. McElderry L.A. et al. // Clin. Chem. 1982. - Vol. 28. - P.356-360;

59. Shepard M.D., Whiting M.J. II Ann. Clin. Biochem. 1992. - Vol. 29 (4). -P.411-417;

60. Iwata J., Nishikase О. И Clin. Chem. 1979. - Vol. 25 (7). - P. 1317-1319;

61. Fontaine M. et al. // Ann. Biol. Clin. (Paris). 1987. - Vol. 45 (5). - P.519-526;

62. Van Straalen J.P. et al. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1995. -Vol.33 (5).-P.315-322;

63. MacartM. et al. // Ann. Biol. Clin. (Paris). 1994. - Vol. 52 (5). - P.355-360;

64. Eppel G.A. et al. // Clin. Biochem. 2000. - Vol. 33. - P.487-494;

65. Flachaire E. et al. // Clin. Chem. 1983. - Vol. 29. - P.343-345;

66. GuobingX. et al. // J. Clin. Lab. Anal. 2001. - Vol. 15 (4).-P.161-164;

67. Rising M.M., Johnson C.A. II J. Biol. Chem. 1928. - Vol. 80. - P.709-722;

68. Wiedemann G. И J. Prakt. Chem. 1847. - Vol. 42. - P.225;

69. Wiedemann G. И Ann. Chem. 1848. - Vol. 68. - P.323;

70. Wiedemann G. И J. Prakt. Chem. 1848. - Vol. 43. - P.271;

71. Ritthausen H. II J. Prakt. Chem. 1873. - Vol. 7. - P.361;

72. SchiffH. II Ber. Chem. Ges. 1896. - Vol. 29. - P.298;

73. SchiffH. И Ann. Chem. 1898. - Vol. 299. - P.236;

74. SchiffH. II Ann. Chem. 1901. - Vol. 319. - P.287;

75. SchiffH И Ann. Chem. 1907. - Vol. 352. - P.73;

76. LeyH., Werner F.ll Ber. Chem. Ges. 1905. -Vol. 38.-P.2199;

77. Ley H., Werner F. II Ber. Chem. Ges. 1907. - Vol. 40. - P.705;

78. Ley H., Werner F. II Ber. Chem. Ges. 1913. - Vol. 46. - P.4042;

79. Tschugaeff L. И Ber. Chem. Ges. 1905. - Vol. 38. - P.2899;

80. Tschugaeff L. //Ber. Chem. Ges. 1906. - Vol. 39. - P.3190;

81. Tschugaeff L. II Ber. Chem. Ges. 1907. - Vol. 40. - P. 1973;

82. Fischer E. Untersuchungen uber Amino-sauren, Polypeptide und Proteine // German. 1906;

83. Riegler E. IIZ. anal. Chem. 1914. - Vol. 53. - P.242;

84. Hiller A. II Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. 1926. - Vol. 24. - P.385;

85. Price J. W. II Proc. Am. Soc. Biol. Chem. 1941. - Vol. 140.-P.54;

86. Lehmann J. //Nord. Med. 1945. - Vol. 25. - P.604;

87. Gornall A.G., Bardawill C.J., David M.M. II J. Biol. Chem. 1949. - Vol. 177.-P.751-766;

88. Goren M.P., LiJ.T. // Clin. Chem. 1986. - Vol. 32. - P.386-388;

89. Goshev I, Nedkov P. II Anal. Biochem. 1979. - Vol. 95. - P.340-343;

90. Doumas В. T. et al. // Clin. Chem. -1981.- Vol. 27. P. 1642-1650;

91. Barnes D.B. II Clin. Chem. 1985. - Vol. 31.- P.2018-2019;

92. Serra S., Morgante L. 11 Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1980. - Vol. 56 (2). -P.160-165;

93. Orsonneau J.L. et al. // Clin. Chem. 1983. - Vol. 35. - P.2233-2236;

94. Watanabe N. et al. // Clin. Chem. 1986. - Vol. 32. - P.1551-1554;

95. Borovansky J., Melezinek I., Budesninska A. II Anal. Biochem. 1986. - Vol. 159. -P.249-252;

96. Lim C. W. et al. // Pathology. 1990. - Vol. 22. - P.89-92;

97. Folin O., LooneyJ.M. //J. Biol. Chem. 1922. - Vol. 41. -P.421;

98. LooneyJ.M. //J. Biol. Chem. 1926.-Vol. 59.-P.519;

99. Folin O., Ciocalteu V. И J. Biol. Chem. 1927. - Vol. 73. - P.627-650;

100. Chou S.-C., Goldstein A. II Biochem. J. 1960. - Vol. 75. - P.109-115;

101. Peterson G.L. И Anal. Biochem. 1977. - Vol. 83. -P.346-356; m.WuA.E., Wu J.C., HerpA. II Biochem. J. - 1978. - Vol. 175.-P.47-51; 104. Berg D. H. И Anal. Biochem. - 1971. - Vol. 42. - P.505-508;

102. Herd J.К. 11 Anal. Biochem. -1971. Vol. 44. - P.404-410;

103. Lo C., Stelson H. II Anal. Biochem. 1972. - Vol. 45. - P.331-336;

104. Geiger P. J., Bessman S.P. // Anal. Biochem. 1972. - Vol. 49. - P.467-473;

105. Ross E., Shatz G. II Anal. Biochem. 1973. - Vol. 54. - P.304-306;

106. Едрева E., Чолакова H. II Физиол. раст. 1975. - № 22. - C.204-207;

107. Peterson G.L. II Anal. Biochem. 1979. - Vol. 100. - P.201-220;

108. Smith J.L. II Proc. Okla. Acad. Sci. 1982. - Vol. 62. - P.80-83;

109. Peterson G.L. II Methods Enzymol. 1983. - Vol. 91. - P.95-119;113 .DulleyJ.R., Grieve P.A. II Anal. Biochem. 1975. -Vol. 64. - P.l 36-140; WA.Bensadoun A., Weinstein D. II Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 70. - P.241-245;

110. Hartree E.F. II Anal. Biochem. 1972. - Vol. 48. - P.422-427;

111. Lieu P.L., Rebel G. II Anal. Biochem. 1991. - Vol. 192. - P.215-218;

112. Ml. Dunn M.J., Harris E.L., Angal S. Protein determination of total protein concentration. Protein Purification Methods // Oxford: IRL Press. 1992;

113. PriceN.C. Proteins, Labfax // Oxford: Academic Press. 1996;

114. Ким Ю.В., Шибанов A.H. II Клин. лаб. диагн. 2004. - №10. - С.3-7;

115. Гаспаров B.C., Дегтярь В.Г. И Биохимия. 1994. - № 59 (6). - С.763-777;

116. Fazekas de St. Groth S., Webster R.G., Datyner A. II Biochim. Biophys. Acta. 1963. - Vol. 71. -P.377-391;

117. Bradford MM. II Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P.248-254;

118. Pesce M.A., Strande C.S. II Clin. Chem. 1973. - Vol. 19 (11). - P.1265-1273;

119. Pinnell A.E, Northam B.E. И Clin Chem. 1978. - Vol. 24 (1). - P.80-86;

120. Westgard J.O., Poquette M.A. // Clin. Chem. 1972. - Vol. 18 (7). - P.647-653;

121. Schosinsky K.H. et al. // Clin Chem. 1987. - Vol. 33 (2 Pt 1). - P.223-226; Ul.Fujita Y., Mori I., Kitano S. II Bunseki Kagaku. - 1983. - Vol. 32. - P.379386;

122. Ш.Шишкин C.C. II Вопр. мед. химии. 1982. -№ 28 (5). - С. 134-141;

123. Gustafsson J.E. II Clin. Chem. 1978. - Vol. 24 (2). - P.369-373;

124. Speicher C.E. et al. // Am. J. Clin. Pathol. 1978. - Vol. 69 (3). - P.347-350;131 .HeickH.M. et al.//Clin Biochem. 1980.-Vol. 13 (2).-P.81-83;

125. Joern W.A., SchmoelL. И Clin. Chem. 1981. - Vol. 27.-P. 1305;

126. LaskyF.D. et al. // Clin. Biochem. 1985. - Vol. 18 (5). - P.290-296;

127. Koupparis M.A. et al. // Clin. Chim. Acta. 1985. - Vol. 149 (2-3). - P.225-235;

128. Lynch R.M., Sellers T.S., Gosset K.A. II Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. -1996. Vol. 34 (7). - P.569-571;13e.Sedmak J.J., Grossberg S.E. II Anal. Biochem. 1977. - Vol. 79. - P.544-552;

129. Vatassery G.T. et al. // Clin. Biochem. 1980. - Vol. 13 (2). - P.78-80;

130. Van Wilgenburg M.G. et al. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1981. -Vol. 19. — P.301-304;

131. Keay G., DoxeyD.L. II Vet Res. Commun. 1984. - Vol. 8 (1). -P.25-32;

132. Tal M, Silberstein A., Nusser E. II J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 260. -P.9976-9980;

133. De Moreno M.R., Smith J.F., Smith R. V. II J. Pharm. Sci. 1986. - Vol. 75. -P.907-911;

134. Fountoulakis M., Juranville J.F., Manneberg M. II J. Biochem. Biophys. Methods. 1992. - Vol. 24. - P.265-274;

135. Congdon R.W., Muth G.W., Splittgerber A.G. II Anal. Biochem. 1993. -Vol. 213. - P.407-413;

136. Chial H.J., Splittgerber A.G. II Anal. Biochem. 1993. - Vol. 213. - P.362-369;

137. Atherton B.A. et al. // Anal. Biochem. 1996. - Vol. 233. - P.160-168;14e.LottJ.A. et al. // Clin. Chem. 1983. - Vol. 29. - P.1946-1950;

138. Ramakers J.M. II Clin. Chem. 1984. - Vol. 20 (8). - P. 1433-1434;

139. Lever M., Walmsley T.A. II Clin. Chim. Acta. 1978. - Vol. 83 (3). - P.279-285;

140. ReedS.M., Northcote D.H. II Anal. Biochem. 1981. - Vol. 116. - P.53-64;

141. Walsh R.L., Need A.G., Coles M.E. II Clin. Chim. Acta. 1983. -Vol. 130 (l).-P.l 1-23;

142. Marshall Т., Williams KM. II J. Biochem. Biophys. Methods. 1986. -Vol. 13 (3). - P. 145-50;

143. Wilsott D.K, Lott J.A. II Clin. Chem. 1987. - Vol. 33. - P.2100-2106;153 .Friedenauer S., Berlet H.H. II Anal. Biochem. 1989. - Vol. 178. - P.263-268;

144. Jung K, Nickel E. II Clin Chem. 1989.-Vol. 35 (2).-P.336-337;

145. Stoschek СМ. II Anal. Biochem. 1990. - Vol. 184. - P.l 11-116;

146. Zor Т., Selinger Z. II Anal. Biochem. 1996. - Vol. 236. - P.302-308;

147. Pugia M.J. Reduction of background interferences in the molybdate-dye protein assay // United States Patent No. 5399498. 1995;

148. Иванов B.M., Ким Ю.В., Мамедова A.M. и др. Способ количественного определения белка в биологических жидкостях // Заявка на изобр. по сущ. № 2004109212/15 (010164). G01N33/493. - 2004;

149. Pugia М. et al. // Clin. Chim. Acta. 2002. - Vol. 326 (1-2). - P. 177-183;

150. Harrison N.A. И Br. J. Urol. 1989. - Vol. 63 (2). - P.202-208;

151. Gilbert R.E., Akdeniz A., Jerums G. II Aust. N. Z. J. Med. 1992. -Vol. 22 (4). - P.334-337;

152. Newman D.J. et al. // Clin. Nephrol. 1995. - Vol. 43 (2). - P. 104-109;

153. Ralston S.H. et al. // Ann. Rheum. Dis. 1988. - Vol. 47 (9). - P. 759-763;

154. BangstadHJ. II Diabetes Care. 1991. - Vol. 14(11).- P. 1094-1097;

155. Jury D.R. et al. //Ann. Clin. Biochem. 1992. - Vol. 29 (Pt. 1). -P.96-100;

156. Spooren P.F., Lekkerkerker J.F., Vermes I. II Diabetes Res. Clin. Pract. -1992.-Vol. 18 (2). -P.83-87;

157. Schaufelberger H. et al. // Schweiz. Med. Wochenschr. 1992. -Vol. 122 (16).-P.576-581;

158. URiSCAN Urine Strip. Urinalysis dip and read strips for visual or instrumental use // YEONGDONG Diagnostics, Korea. 2001;

159. Meyer N.L. et al. // Am. J. Obstet. Gynecol. 1994. - Vol. 170 (1 Pt 1). -P.137-141;

160. Brown M.A., Buddie M.L. И Aust. N. Z. J. Obstet. Gynaecol. 1995. -Vol. 35 (4). - P.366-369;

161. Minetti E.E. et al. // Nephrol. Dial. Transplant. 1997. - Vol. 12 (1). - P.78-80;

162. Solanas Prats J.V. et al. // Aten. Primaria. 1998. - Vol. 22 (10). - P.631-635;

163. Ml. Marshall S.M., Shearing P.A., Alberti KG. II Clin. Chem. 1992. -Vol. 38 (4). -P.588-591;

164. Gossain V.V. et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. 1996. - Vol. 120 (11). -P.1015-1018;

165. Beer J.H. et al. // BMJ. 1996. - Vol. 313 (7048). - P.25;

166. Wilson P. et al. // BMJ. 1996. - Vol. 313 (7063). - P. 1009-1010;

167. Heidelberger M., Kendall F.E. И J. Exp. Med. 1929. - Vol. 50. - P.809;

168. Goettsch E., Kendall F.E. II J. Biol. Chem. 1935. - Vol. 109. - P.221;

169. Goettsch E., Reeves E.B. II J. Biol. Chem. 1936. - Vol. 15. - P.173;

170. Goettsch E., Lyttle J.D. II J. Biol. Chem. 1940. - Vol. 19. - P.9;

171. Kabat E.A., Mayer M.M. Experimental. Immunochemistry // Springfield. -1948;

172. Kunkel G.H., Ward S.M. II J. Biol. Chem. 1950. - Vol. 182. - P.597-604;

173. Whicher J.T., Price C.P., Spencer К. И Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. — 1983. — Vol. 18 (3). -P.213-260;

174. Watts G., RoweD. II Clin. Chem. 1986. - Vol. 32 (8). -P.1544-1548;l%9.Paloheimo L. et al. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1987. - Vol. 25 (12). -P.889-892;

175. Le Bricon Т. И Ann. Biol. Clin. (Paris). 2002. - Vol. 60 (5). - P.525-540;19 l.ZagerR.A.II Invest. Urol. 1980. -Vol. 17 (6). - P.526-528;

176. Tillyer C.R. et al. // J. Clin. Pathol. 1991. - Vol. 44. - P.466-471;m.Priem F. et al. // Clin. Chem. 1999. - Vol. 45. - P.567-568;

177. Twyman S.J. et al. // Clin. Chim. Acta. 2000. - Vol. 297 (1-2). - P.155-161;

178. Cambiaso C.L. et al. // Clin. Chem. 1988. - Vol. 34 (2). - P.416-418;

179. Phillipou G. et al. // Clin. Chem. 1989. - Vol. 35 (3). - P.456-458;

180. Инструкция по применению набора реагентов для колориметрического определения белка в моче и спинно-мозговой жидкости с пирогаллоло-вым красным «Белок-ПГК-Ново» // Новосибирск: ЗАО «Вектор-Бест». -2003.- 1 е.;

181. Total Protein UC FS. Diagnostic reagent for quantative in vitro determination of total protein in urine or cerebrospinal fluid on photometric systems. Instruction // DiaSys Diagnostic Systems GmbH, Germany. 2003.

182. Иванов B.M., Мамедова A.M. II Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. -2002. Т. 23. - № 3. - С. 167-171;

183. Клиническая лабораторная аналитика. Том 1. Основы клинического лабораторного анализа // Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Агат-Мед. -2002. - 860 с.

184. Бугер П. Оптический трактат о градации света // пер. с франц. -М.: Гостехиздат. 1950;

185. Овчинников М.М., Подгорный Т.Н. II Клин. лаб. диагн. 2004. - № 3. -С. 16-21;

186. Руководство по эксплуатации Спектрофотометры СФ-2000, СФ-2000-01, СФ-2000-02 // СПб: АОЗТ «ОКБ Спектр». -2001.-34 е.;

187. Пакет программного обеспечения СФ-2000 (программа общего назначения). Руководство по эксплуатации // СПб: АОЗТ «ОКБ Спектр». -2001.-23 е.;

188. Инструкция пользователя к дозатору механическому поршневому Biohit Proline // СПб: ООО «Биохит». -2004;

189. Руководство по эксплуатации одноканальной пипетки переменного объема KOJIOP // СПб: ЗАО «Термо Электрон». 2004. - 1 е.;

190. Fluitest Ultra-Sensitive Proteins (Pirogallol-red Method). Instruction // Biocon Diagnostik GmbH, Germany. 2003;

191. Берг А., Дин П. Светодиоды // Пер. с англ. под ред. А.Э. Юновича. -М.: Изд-во «Мир». 1979. - С.27-51;

192. Коган JI.M. Полупроводниковые светоизлучающие диоды // М.: Изд-во «Энергоатомиздат». 1983. - С.98-135;

193. Data Sheet. ОРТЮ1. Monolithic Photodiode And Single-Supply Transim-pedance Amplifier // Burr-Brown Corp., USA. 1994. -P.l 1.

194. Franke G., Salvati M., Sommer R. G. Composition and device for urinary protein assay and method of using the same / United States Patent # 5326707. -1994;

195. Smith C.E. et al. Simple spectrophotometric technique for quantifying amelogenin against BSA based on pyrogallol red // The 32nd Annual Meeting and Exhibition of the AADR. San Antonio, Texas, USA. - 12-15.03.2003;

196. Le Bricon et al. // Clin Chem. 1998. - Vol. 44. - P.l 191-1197;

197. Технические условия на набор реагентов для определения белка в моче «Юни-Тест-БМ» 9398-001-59879815-2004 // 2005. 22 е.;

198. Инструкция по применению набора реагентов для определения белка в моче «Юни-Тест-БМ» // М.: ООО «Эйлитон». 2005. - 5 е.;

199. Технические условия на фотометры биохимические специализированные ФБС-01 9443-005-59879815-2004 // 2005. 25 е.;

200. Руководство по эксплуатации фотометров биохимических специализированных ФБС-01 -1-«Микролаб-600» ЭФБС 944300.300 РЭ //

201. М.: ООО «Эйлитон». 2005. - 21 с.