автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Определение состава и качества меда методом ВЭЖХ

На правах рукописи

Романов Алексей Валерьевич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА И КАЧЕСТВА МЕДА МЕТОДОМ ВЭЖХ

Специальность 05.11.11.- «Хроматография и хроматографические приборы»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ООЭ4Уе57В

Москва 2009

003476578

Работа выполнена в лаборатории физико-химических основ хроматографии и хромато-масс-спектрометрии Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН

Научный руководитель: доктор химических наук

Ларионов Олег Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Ларин Александр Васильевич Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН

кандидат химических наук Бузин Павел Владимирович

Учреждение Российской академии наук Институт проблем химической физики РАН

Ведущая организация: НПО «Химавтоматика»

Защита состоится 22 сентября 2009 г. В 15-30 на заседании диссертационного совета Д 002.259.04, при Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН, г. Москва, Ленинский проспект, д. 31, кор. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН.

Автореферат размещен на сайте института ИФХЭ РАН http://phyche.ac.ru

Автореферат разослан « 2Р » _2009 г.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим высылать по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 31, кор. 4, ИФХЭ РАН, ученому секретарю диссертационного совета Д 002.259.04 Ученый секретарь .

диссертационного совета, /¿о

кандидат химических наук Коломиец Л.Н.

Общая характеристика работы

Значение меда трудно переоценить ввиду того, что входящие в его состав вещества имеют огромное значение в пищевой промышленности и медицине. Мед является естественным природным продуктом и используется человечеством на протяжении всей его истории. Но пристальное внимание науки к его составу и свойствам появилось относительно недавно.

В настоящее время известно, что основную часть пчелиного меда составляют углеводы (глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и др.). Их общее содержание достигает 80%. Глюкоза и фруктоза составляют 80-90% от суммы всех сахаридов в созревшем меде, сахароза - до 5%. Вода составляет порядка 18%, в зависимости от типа и зрелости меда. Оставшиеся 2-3% составляют микроэлементы и различные полифенольные соединения, обеспечивающие лечебные и антиоксидантные свойства меда.

Состав меда строго регламентируется нормами ГОСТ. Однако эти нормы опираются на устаревшие методы анализа, зачастую не способные дать достоверные результаты. Так, описанный в ГОСТе метод определения углеводного состава меда основан на определении оптической плотности раствора феррицианида калия после того, как он прореагирует с редуцирующими сахарами меда. Метод испытания включает определение Сахаров меда до и после инверсии. Данный метод анализа является косвенным и не позволяет определить количественное содержание каждого из моносахаридов. Также он не позволяет однозначно определить содержание сахарозы, поскольку в меде

может содержаться мальтоза и другие ди- и олигосахариды.. Например, пр искусственном добавлении пищевого сахара в прикорм пчел в меде увелич! вается содержание олигосахаридов, что может нанести вред при употребл( нии такого меда в пищу людьми, страдающими сахарным диабетом. Ста! дартный метод дает общую картину наличия олигосахаридов, но не позвол) ет определить содержание каждого из них.

Аналогичная ситуация наблюдается и при определении остальны компонентов меда. Так, метод определения 5 - гидроксиметилфурфурап (5-ГМФ) основан на его спектрофотометрическом анализе в присутстви барбитуровой кислоты и пара-толуидина (метод Винклера). Этот метод так» является косвенным, сильно зависит от качества используемых реактивов не обладает высокой достоверностью.

Учитывая текущую ситуацию в области методик определения состава качества меда, актуальным является разработка современных, просты: безопасных и высокоэффективных методов пробоподготовки и анализа. На1 большей перспективностью в данном направлении обладают методы высою эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Они позволяют селе] тивно и высокоточно определять содержание всех основных компоненте меда, а также нежелательных веществ, таких как антибиотики. В настоящ« время в России широко используются методы ВЭЖХ для анализа меда. Те не менее, в ГОСТе нет ни одной ВЭЖХ методики для определения состава качества меда.

Существующие в данный момент ВЭЖХ методики нельзя признать достоверными в силу отсутствия государственной аттестации. Такие методики не могут использоваться контролирующими организациями.

Цель работы: Разработка хроматографических методов определения качества меда с целью их включения в систему ГОСТ.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

• Разработка, валидация и аттестация методики определения углеводного состава меда методом ВЭЖХ.

• Разработка, валидация и аттестация методики определения содержания 5-ГМФ в меде методом ВЭЖХ.

• Разработка, валидация и аттестация методики определения остатков антибиотиков в меде методом ВЭЖХ.

Научная новизна:

Впервые была проведена работа по подготовке методики для внесения ее в ГОСТ, включая такие этапы как:

• Пробоподготовка

• Подбор условий хроматографирования

• Выбор колонки и сорбента

• Подбор элюента и его состава

• Выбор режима хроматографирования (скорость потока элюента, температура колонки)

• Сбор и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001

Также был проведен сравнительный анализ содержания 5-ГМФ в ос новных промышленных сортах меда. Обнаружена зависимость начальной уровня содержания 5-ГМФ от сорта меда.

Включение этапа валидации позволяет определить достоверность ме тода анализа, что необходимо для внесения методики в ГОСТ.

Практическая значимость:

Разработанные методики при условии внесения их в ГОСТ могут при меняться в различных производственных лабораториях и лабораториях кон тролирующих организаций.

На защиту выносятся следующие положения:

■ Результаты разработки методики определения углеводного состав меда и ее валидации.

■ Результаты разработки методики определения содержания 5-ГМ< в меде и ее валидации.

■ Результаты разработки методики определения хлорамфеникол (Chloramphenicol, САР) в меде и ее валидации.

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, и 4 тезиса докладов на международных конференциях.

Результаты были представлены в виде докладов на 10-й международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва, 2006) и в виде статей в журнале «Сорбционные и хроматографические процессы». 2007. Т.7. Вып.5.

Структура и объем работы:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы из 260 наименований и содержит 18 таблиц и 46 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель работы и положения, выносимые на защиту.

Первая глава представляет собой литературный обзор современной методологии определения состава и качества пищевых продуктов. Основное внимание уделено рассмотрению общепринятых методов анализа, используемых при определении качества и состава пищевых продуктов, их возможностям и ограничениям. Рассмотрены ключевые источники существующих ограничений, предложены альтернативные варианты.

В этой же главе рассматривается состояние одного из перспективных вариантов анализа, развивающегося сегодня - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с различными вариантами детекти-

рования. Показана его роль, применительно к объекту исследования - пчелиному меду, рассматриваются основные достоинства и недостатки.

Во второй главе описывается оборудование и методика эксперимента. Исходные вещества. Оборудование. Методика эксперимента

Для выполнения данной работы использовали следующее оборудование и реагенты:

1. Анализ проводился на жидкостном хроматографе "Agilent 1100" (Agilent, США), в состав которого входили:

дегазатор, насос, автосамплер, термостат колонок, детекторы: рефрактометрический и спектрофотометрический на диодной матрице Для определения углеводного состава меда использовалась колонка "Supelco" с сорбентом Supelcosil LC-NH2 (Supelco, Чехия) длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 микрон Для определения содержания 5-ГМФ и САР использовалась колонка "Zorbax" с сорбентом Eclipse XDB С-18 (Agilent, США) длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 микрон

Для записи и обработки полученных результатов использовалось программное обеспечение - ChemStation Rev. В.01.03

2. Для приготовления стандартных и рабочих растворов нужной концентрации использовались:

- микропипетки "VWR" объемом 100 и 1000 мкл (VWR, США)

- пипетка "Biohit" объемом 5 мл (Biohit, Франция)

- Колбы мерные наливные объемом 25 мл класса точности 2

- Ультразвуковая ванна "Elma" Elmasonic S 30 Н (Elma, Германия)

- Ацетонитрил для ВЭЖХ "Lecbiopharm" 200 (Россия)

3. Для взвешивания образцов применялись весы аналитические "AnD GR-202" (точность 0,00001 г) (AnD, Япония)

4. Для подготовки воды применялась установка водоподготовки "Millipore Simplicity"

5. Фильтры мембранные диаметром 13 мм и размером пор 0.45 микрон использовались для фильтрации приготовленных растворов.

В качестве подвижной фазы использовалась смесь ацетонитрилУвода в различных объемных соотношениях.

Методика эксперимента

Определение углеводного состава меда

Раствор стандартов готовили по точной навеске. Для обеспечения длительного хранения стандартный раствор смешивали с ацетонитрилом Lecbiopharm в объемном соотношении 1/1. Рабочие растворы стандартов готовили разбавлением стандартного раствора смесью вода-ацетонитрил с объемным соотношением 1/1.

При анализе образцов меда растворы готовили следующим образом: 1г исследуемого меда (точная навеска) растворяли в 50 мл воды для ВЭЖХ.

Раствор перемешивали до полного растворения меда в УЗ - ванне при ком натной температуре в режиме «перемешивание». Затем раствор фильтрова ли через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Фильтрат сме шивали с ацетонитрилом в объемном соотношении 1/1 и анализировали ме тодом ВЭЖХ.

В процессе отработки методики были определены условия анализа: - режим элюирования изократический, состав подвижной фазы ацетонит рил/вода в объемном соотношении 82/18 без смешения из двух отдельны; емкостей. Таким образом была устранена флуктуация базовой линии. Со став подвижной фазы может варьироваться для достижения полного разде ления пиков глюкозы и фруктозы.

Определение содержания 5-ГМФ.

При разработке методики стандартный раствор готовили по точной навеске. Рабочие растворы - путем разбавления стандартного раствора непосредственно перед анализом.

При анализе образцов меда растворы готовили следующим образом: 1г исследуемого меда (точная навеска) растворяли в 50 мл воды для ВЭЖХ. Раствор перемешивали до полного растворения меда в УЗ - ванне при комнатной температуре в режиме «перемешивание». Затем раствор фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Фильтрат анализировали методом ВЭЖХ.

В процессе отработки методики были определены условия анализа:

- рабочая длина волны 5-ГМФ была определена по УФ-спектру и составила 284 нм;

- для повышения эффективности разделения применялся градиентный режим элюирования:

0-7 мин. - вода : ацетонитрил (97 : 3 об.); 7-12 мин. - вода : ацетонитрил (0 : 100 об.); 12-17 мин. - вода : ацетонитрил (97 : 3 об.);

- объемная скорость элюирования составляла 1,0 мл/мин.;

- объем инжекции 20 мкл;

- температура термостата колонки 30°С;

Состав фазы может варьироваться для достижения оптимального разделения.

Определение содержания САР.

Для повышения чувствительности метода и избавления от мешающих анализу компонентов меда было необходимо провести пробоподготовку. Вариант 1. Жидкостная экстракция.

Навеску меда 10 г помещали в полипропиленовую тубу для центрифугирования и растворяли в 10 мл воды для ВЭЖХ в УЗ-ванне в течение 10 минут в режиме «sweep». К полученному раствору приливали 20 мл EtAc. Смесь встряхивали 5 минут на механической мешалке типа Vortex. Затем тубу помещали в центрифугу на 30 мин при 10000 об/мин. Органическую фазу

отбирали медицинским шприцем, переносили в грушевидную колбу и упари вали досуха в роторном испарителе при 50°С. Полученный осадок перерас творяли в 1 мл метанола. Раствор фильтровали через мембранный фильтр диаметром пор 0,45 микрон.

Замечание: Осадок имел интенсивную окраску и запах.

Анализ полученного раствора проводили в изократическом режиме ] режиме градиентного элюирования.

Варианты хроматографирования раствора меда.

Условия хроматографирования экстракта меда Время анализа Время удерживания стандарта

Фаза 30/70 АСЫ/5% уксусная 15 мин 4,24 мин

Фаза 20/80 АС№5% уксусная 15 мин 10,84

Градиент 1: 0-5 мин 30 5,5-10 мин 100% ACN 10,5-15 мин 30% АСЫ 15 мин 4,20

рабочая длина волны - 278 нм. Температура колонки 40°С. Скорость 1 мл/мин

Жидкостная экстракция позволяет извлечь САР из раствора меда и увеличить чувствительность метода. В тоже время наряду с САР из раствор меда экстрагируются вещества полифенольного ряда, что существенно затрудняет идентификацию САР.

В качестве альтернативного варианта пробоподготовки был выбран вариант с твердофазной экстракцией на патронах Isolute. Этот вариант рекомендован производителем оборудования для ВЭЖХ - компанией Agilent.

Вариант 2. Экстракция на патроне Isolute.

Навеску меда 5 г растворяли в 20 мл воды. Раствор загружали в патрон. Выдерживали 5 мин. Затем удаляли воду под вакуумом. После удаления воды через патрон пропускали 50 мл EtAc. Операция проводилась при атмосферном давлении. Органическую фазу собирали и упаривали в грушевидной колбе в роторном испарителе. Полученный осадок перерастворяли в 1 мл смеси вода/метанол в соотношении 9/1. Раствор фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон.

Замечания: Собирать остатки органической фазы необходимо с особой осторожностью. Водная фаза при вакуумировании удаляется не полностью и при резком усилении вакуума выходит вместе с органической фазой. По этой причине было решено отказаться от данного варианта экстракции.

Вариант 3. Комбинация твердофазной и жидкостной экстракции.

Для максимально эффективной экстракции САР и удаления полифе-нольной части было решено совместить предыдущие варианты экстракции.

Навеску меда Зг помещали в полипропиленовую тубу для центрифугирования. Растворяли в 10 мл воды для ВЭЖХ. К раствору добавляли 20 мл этилацетата. Встряхивали на механической мешалке типа Vortex. Тубу помещали в центрифугу на 10 минут при 10000 об/мин. Органическую фазу от-

бирали и упаривали досуха на роторном испарителе при комнатной темпера туре в грушевидной колбе. Полученный осадок перерастворяли в 30 мл воды Данная процедура позволяет освободиться от полифенольной части меда, ко торая в воде практически не растворяется. Раствор переносили в тубу дл) центрифугирования. Грушевидную колбу ополаскивали 5 мл гексана. Смьн добавляли в тубу с водным раствором. Энергично встряхивали тубу и поме щали ее в центрифугу на 10 мин при 10000 об/мин. Органический слой уда ляли. Водную фазу пропускали через картридж для твердофазной экстракцш Varían Bond Elute С18 со скоростью 2 капли в секунду. Жидкость удаляли картридж промывали 1 мл воды, затем еще 2 мл воды. Смыв также удаляли. Картридж просушивали под вакуумом. В чистую пробирку с картриджа де лали смыв 4 мл МеОН. Растворитель упаривали досуха под струей чистого воздуха. Осадок перерастворяли в 1 мл 3% уксусной кислоты. Анализ проводили по следующим схемам:

Градиент 2: 0-10 мин 25% ACN, 10,5-15 мин 100% ACN, 15,5-20 мин 25% ACN, 5 мин промывка после анализа. Время удерживания 4,94.

Градиент 3: 0-10 мин 2% ACN, 10,5-12 мин 25% ACN, 12-20 мин 25% ACN, 20,5-21 мин 90% ACN, 21-25 мин 90% ACN , 25,5-30 мин 2% ACN, 5 мин промывка после анализа. Время удерживания 17,1.

Градиент 4: 0-10 мин 2% АСЫ, 10,5-18 мин 25% АСЫ, 18-26 мин 25% АСЫ, 26,5-27 мин 90% АСЫ, 27,5-32 мин 90% АСЫ, 32,5-37 мин 2% АС1Ч, 5 мин промывка после анализа. Время удерживания 21,2.

В третьей главе представлены результаты проведенных исследований, а также результаты валидаций разработанных методик.

Углеводный состав меда

На основе разработанной методики были проведены анализы четырех видов меда: подсолнечниковый, липовый, гречишный и цветочный. Хрома-тограммы исследованных медов представлены на рисунках 1.1. - 1.4.

|>«(У 36000

зато

250С0

шй 16000

10СС0

ЯСС

Рис 1.1. Хроматограмма подсолнечникового меда

Рис 1.2. Хроматограмма гречишного меда

Рис 1.3. Хроматограмма липового меда

пМи -шо

амо- 8

1

в В 10 12 14 пш

Рис 1.4. Хроматограмма цветочного меда

Для оценки воспроизводимости результатов были проведены 5 параллельных опытов с растворами одного и того же меда. Были приготовлены 5 одинаковых растворов одного меда. Относительное стандартное отклонение площадей пиков 5 инжекций из разных виал составило для фруктозы и глюкозы 0,27 и 0,50% соответственно. Сахароза и мальтоза в представленном образце отсутствовали.

Для оценки извлекаемое™ углеводов из меда были проведены опыты с добавками по методу «введено/найдено»: к образцам различных медов с известным содержанием углеводов (содержание углеводов определялось по калибровочному графику) добавили по 0,02, 0,04 и 0,06 г (точная навеска) фруктозы и глюкозы на грамм анализируемого меда. Для каждой добавки готовили по 3 навески исследуемого меда.

Результаты опытов с добавками к различным типам меда

Добавка Отклонение Подсолнечник Гречишный Цветочный Липовый

Фруктоза Глюкоза Фруктоза Глюкоза Фруктоза Глюкоза Фруктоза Глюкоза

0,02 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.02 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Srixj Относительное среднеквадр. отклонение 0.37 0.43 0.13 0.29 0.19 0.35 0.11 0.24

0,04 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Sr(х) Относительное среднеквадр. отклонение 0.04 0.01 0.21 0.19 0.15 0.33 0.17 0.35

0,06 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.01 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Srix) Относительное среднеквадр. отклонение 0.07 0.51 0.29 0.27 0.14 0.20 0.07 0.26

Определение 5-гидроксиметилфурфураля

На основе разработанной методики были проведены анализы четырех видов меда: подсолнечникового, липового, гречишного и каштанового. Хро-матограммы исследованных медов представлены на рис. 2.1. - 2.4.

Рис 2.2. Хроматограмма гречишного меда

Для оценки воспроизводимости результатов были проведены 3 параллельных опыта с растворами одного и того же меда. Относительное стандартное отклонение площадей пиков 3-х инжекций из разных виал составило 0,36 %.

Для оценки извлекаемости 5-ГМФ из меда были проведены опыты с добавками по методу «введено/найдено»: к образцам различных медов с известным содержанием ГМФ (определено по калибровочному графику) были добавлены 1/10, 1/4, 1/2, 1 и 3/2 ПДК. Для каждой добавки готовили по 3 навески исследуемого меда, в каждую из которых вносили добавку непосредственно перед анализом, что обусловлено лабильностью 5-ГМФ в водных растворах меда.

Результаты опытов с добавками к различным типам меда

Добавка Отклонение Каштановый Гречишный Подсолнечник Липовый

2,5 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.19 0.28 0.06 0.10

Srix) Относительное среднеквадр. отклонение 9.54 10.61 2.48 4.31

6,25 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.42 0.43 0.07 0.10

Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 6.97 6.97 1.20 1.69

12,5 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.15 0.68 0.18 0.08

Sr( х) Относительное среднеквадр. отклонение 1.19 5.87 1.55 0.67

25,0 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.17 0.87 0.28 0.40

Sr{x) Относительное среднеквадр. отклонение 0.72 3.53 1.24 1.67

37,25 S(x) Среднеквадр. отклонение 1.43 0.86 0.31 0.83

Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 3.92 2.34 0.89 2.23

Определение САР в меде.

На основе разработанной методики был проведен анализ купажного

меда.

Рис 3. Хроматограмма экстракта купажного меда с добавкой САР. Градиент 4.

Для оценки извлекаемости САР из меда были проведены опыты с добавками по методу «введено/найдено»: К образцам меда с известным содержанием САР (определено по калибровочному графику) добавляли раствор САР до достижения концентраций 0,1; 0,5 и 1,0 нг/мл. Для каждой добавки готовили по 3 навески исследуемого меда.

Результаты опытов с добавками САР к купажному меду

Добавка Отклонение Значение

0,1 S(x) Среднеквадр. отклонение 0,18

Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 0,86

0,5 S(x) Среднеквадр. отклонение 0,28

Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 1,32

1,0 S(x) Среднеквадр. отклонение 0,18

Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 0.85

Выводы

1. Изучено состояние современной методологии определения каче ственного и количественного состава меда. Критически рассмот рены достоинства и недостатки существующих методов и пока заны ограниченные возможности последних при решении задач определения качественного и количественного состава меда. В результате сформулирована цель исследования.

2. Разработана отвечающая современным требованиям методика определения углеводного состава меда. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Точность определения составляет 98%. Методика прошла этап валидации.

3. Создана методика определения содержания 5-ГМФ в меде методом ВЭЖХ. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Точность определения составляет 97%. Методика позволяет контролировать стадии хранения и переработки меда. Методика прошла стадию валидации.

4. Разработана схема пробоподготовки образцов меда для последующего определения методом ВЭЖХ, включающая жидкостную и твердофазную экстракции.

5. Предложена методика хроматографического определения содержания САР в меде на уровне 0,1-1,0 нг/мл. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Метод прошел стадию внутрилабораторной стандартизации. Точность определения составляет 95%.

6. Реализация результатов работы, а именно включение методик в ГОСТ, даст возможность применять их в различных производственных лабораториях и лабораториях контролирующих организаций. Это позволит повысить точность и достоверность проводимых анализов меда, а также станет эффективным инструментом при выявлении фальсификатов меда.

Список публикаций

1. Определение 5-гидроксиметилфурфураля в меде методом ВЭЖХ Романов A.B., Ларионов О.Г., Балашова Е.Ю., Коржов П.Б., Дуби чев А.Г.// Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. Вып.5. С.711-718

2. Определение углеводного состава меда методом ВЭЖХ. Романов A.B., Ларионов О.Г., Балашова Е.Ю., Коржов П.Б.// Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. Вып.5. С.719-725

3. Использование хроматографии для изучения адсорбции стабильных наночастиц серебра. Романов А. В., Ларионов О.Г., Ревина A.A. //Международная конференция, посвященная 60-летию ИФХ РАН «Физико-химические основы и высокие технологии в 21 веке». Москва 30 мая - 3 июня 2005.

4. Использование хроматографии для изучения адсорбции стабильных наночастиц серебра. Романов A.B., Ларионов О.Г., Ревина A.A. //Сборник тезисов. Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии». Самара. 3-8 июля. 2005. С.122.

5. Исследование температурной кинетики образования 5-гидроксиметилфурфураля в меде методом ВЭЖХ. Романов A.B.,

Ларионов О.Г., Коржов П.Б., Гришковский Б.А.// X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии». 2006 г.

6. Определение малых концентраций левомицетина

(Chloramphenicolum) методом ВЭЖХ с применением масс-спектрометрического детектора Романов A.B., Ларионов О.Г., Гришковский Б.А.// X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии». 2006 г.

1. Введение

Содержание работы

2. Обзор литературы

2.1. Углеводный состав меда

2.2. 5-ГМФ в меде

2.3. Антибиотики в меде

2.4. Флавоноиды в продуктах пчеловодства

3. Экспериментальная часть

3.1. Определение углеводного состава меда

3.2. Определение 5-ГМФ в меде

3.3. Определение антибиотиков в меде 45 3.3.1. Определение хлорамфеникола (САР) в меде

4. Обсуждение результатов

4.1. Углеводный состав меда

4.2. 5-ГМФ в меде

4.3. Определение хлорамфеникола (САР) в меде

5. Выводы

Значение меда трудно переоценить ввиду того, что входящие в его состав вещества имеют огромное значение в пищевой промышленности и медицине. Мед является естественным природным продуктом и используется человечеством на протяжении всей его истории. Однако, пристальное внимание науки к его составу и свойствам появилось относительно недавно.

В настоящее время известно, что основную часть пчелиного меда составляют углеводы (глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и др.). Их общее содержание достигает 80%. Глюкоза и фруктоза составляют 80-90% от суммы всех сахаридов в созревшем меде, сахароза - до 5%. Вода составляет порядка 18%, в зависимости от типа и зрелости меда. Оставшиеся 2-3% составляют микроэлементы и различные полифенольные соединения, обеспечивающие лечебные и антиоксидантные свойства меда.

Состав меда строго регламентируется нормами ГОСТ [1]. Однако эти нормы опираются на устаревшие методы анализа, зачастую не способные дать достоверные результаты. Так, описанный в ГОСТ 19792-2001 метод определения углеводного состава меда основан на определении оптической плотности раствора феррицианида калия после того, как он прореагирует с редуцирующими сахарами меда. Метод испытания включает определение Сахаров меда до и после инверсии. Данный метод анализа является косвенным и не позволяет определить количественное содержание каждого из моносахаридов. Также он не позволяет однозначно определить содержание сахарозы, поскольку в меде может содержаться мальтоза и другие ди- и олигосахариды. Например, при искусственном добавлении пищевого сахара в прикорм пчел в меде увеличивается содержание олигосахаридов, что может нанести вред при употреблении такого меда в пищу людям, страдающим сахарным диабетом. Стандартный метод дает общую картину наличия олигосахаридов, но не позволяет определить содержание каждого из них.

Аналогичная ситуация наблюдается и при определении остальных компонентов меда. Так, метод определения 5-ГМФ основан на его спектрофотометрическом анализе в присутствии барбитуровой кислоты и пара-толуидина (метод Винклера) [1]. Этот метод также является косвенным, сильно зависит от качества используемых реактивов и не обладает высокой достоверностью.

Учитывая текущую ситуацию в области методик определения состава и качества меда, актуальным является разработка современных, простых, безопасных и высокоэффективных методов пробоподготовки и анализа. Наибольшей перспективностью в данном направлении обладают методы ВЭЖХ. Они позволяют селективно и высокоточно определять содержание всех основных компонентов меда, а также нежелательных веществ, таких как антибиотики. Тем не менее, в настоящее время ни один ГОСТ не содержит ни одной ВЭЖХ методики для определения состава и качества меда.

Существующие в данный момент ВЭЖХ методики нельзя признать достоверными в силу отсутствия государственной аттестации. Такие методики не могут использоваться контролирующими организациями.

Цель работы: Разработка хроматографических методов определения качества меда с целью их включения в систему ГОСТ.

Для достижения поставленной цели следовало решить задачи разработки, валидации и аттестации методик:

• определения углеводного состава меда методом ВЭЖХ.

• определения содержания 5-ГМФ в меде методом ВЭЖХ.

• определения остатков антибиотиков в меде методом ВЭЖХ.

Научная новизна:

Впервые была проведена работа по подготовке методики для внесения ее в ГОСТ, включая такие этапы как:

• Пробоподготовка

• Подбор условий хроматографирования

• Выбор колонки и сорбента

• Подбор элюента и его состава

• Выбор режима хроматографирования (скорость потока элюента, температура колонки)

• Сбор и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-22001

Также был проведен сравнительный анализ содержания 5-ГМФ в основных промышленных сортах меда. Обнаружена зависимость начального уровня содержания 5-ГМФ от сорта меда.

Включение этапа валидации позволяет определить достоверность метода анализа, что необходимо для внесения методики в ГОСТ.

Практическая значимость:

Разработанные методики при условии внесения их в ГОСТ могут применяться в различных производственных лабораториях и лабораториях контролирующих организаций.

5. Выводы

1. Изучено состояние современной методологии определения качественного и количественного состава меда. Критически рассмотрены достоинства и недостатки существующих методов и показаны ограниченные возможности последних при решении задач определения качественного и количественного состава меда.

2. Разработана отвечающая современным требованиям методика определения углеводного состава меда. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Точность определения составляет 98%. Методика прошла этап валидации и подготовлена к подаче заявки о внесении ее в ГОСТ.

3. Создана методика определения содержания 5-ГМФ в меде методом ВЭЖХ. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Точность определения составляет 97%. Методика позволяет контролировать стадии хранения и переработки меда. Методика прошла этап валидации и подготовлена к подаче заявки о внесении ее в ГОСТ.

4. Разработана схема пробоподготовки образцов меда для последующего определения методом ВЭЖХ, включающая жидкостную и твердофазную экстракции.

5. Предложена методика хроматографического определения содержания хлорамфеникола в меде на уровне 0,1-1,0 нг/мл. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Метод прошел стадию внутрилабора-торной стандартизации. Точность определения составляет 95%.

6. Реализация результатов работы, а именно включение методик в ГОСТ, даст возможность применять их в различных производственных лабораториях и лабораториях контролирующих организаций. Это позволит повысить точность и достоверность прово

1. ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия

2. Crane, Е.// A book of honey. Oxford University Press, Oxford, New York, Toronto, Melbourne 1975

3. Goodall, I.; Dennis, M.J.; Parker, I.; Sharman, M. "Contribution of high-performance liquid chromatographic analysis of carbohydrates to authenticity testing of honey" Journal of Chromatography A, Volume 706, Issues 1-2, 7 July 1995, Pages 353-359

4. Cotte, J. F.; Casabianca, H.; Chardon, S.; Lheritier, J.; Grenier-Loustalot, M.F., "Application of carbohydrate analysis to verify honey authenticity" Journal of Chromatography A, Volume 1021, Issues 1-2, 22 December 2003, Pages 145-155

5. Bender, M.M. "Mass spectrometric studies of carbon 13 variations in corn and other grasses."/ Radicarbon 10 (1968) 468

6. Bender, M.M. Phytochemistry 10 (1971) 1239

7. Casabianca, H.; Perruchietti, C.; Jame, P.; Grenier, C.; Cotte, J.F.; Ber-trand, M.C.; Kustner, D. Ann. Fals. Exp. Chim. 51 (2000) 179

8. White, J.W.; Winters, K. J. AOAC. 72 (1989) 907

9. White, J.W.; J. AOAC. 75 (1992) 543

10. White, J.W.; Winters, K. J.; Martin, P.; Rossman, J. AOAC. 81 (1998) 610

11. Official Methods of Analysis, 5th Revision, AOAC International, Gai-thersburg, MD, 16th ed., 1999, Method 995.17

12. Pourtallier, J. Bull. Apic. (1964) 197

13. Pourtallier, J. Bull. Apic. 2 (1967) 209

14. Siddiqui, I.R.; Furgala, B. J. Apic. Res. 6 (1967) 139

15. Siddiqui, I.R.; Furgala, B. J. Apic. Res. 7 (1968) 51

16. Maclnnes, A.G.; Ball, D.H.; Cooper, F.P.; Bishop, J., "Separation of carbohydrate derivatives by gas-liquid partition chromatography" Journal of Chromatography A, Volume 1, 1958, Pages 556-557

17. Mateo, R.; Bosch, F.; Pastor, A.; Jimenez, M., "Capillary column gas chromatographic identification of sugars in honey as trimethylsilyl derivatives" Journal of Chromatography A, Volume 410, 1987, Pages 319-328

18. Swallow, K.W.; Low, N.H. "Analysis and quantitation of the carbohydrates in honey using high-performance liquid chromatography"/ J. Agric. Food Chem., 38 (1990) 1828

19. Rocklin, R.D.; Pohl, C.A. "Determination of Carbohydrates by Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection"/ Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, Volume 6, Issue 9 July 1983 , pages 1577 1590

20. Swallow, K.W.; Low, N.H.; Petrus, D.R. J. AOAC. 74(2) (1991) 341

21. Swallow, K.W.; Low, N.H. J. AOAC. 77(3) (1994) 695

22. Low, N.H.; Wudrich, G.G. "Detection of inexpensive sweetener addition to grapefruit juice by HPLC-PAD'V J. Agric. Food. Chem., 41 (1993) 902

23. Binder. H., "Separation of monosaccharides by high-performance liquid chromatography: comparison of ultraviolet and refractive index detection" Journal of Chromatography A, Volume 189, Issue 3, 7 March 1980, Pages 414-420

24. Brons, E.; Olieman, J., J. Chromatogr. 159 (1983) 79

25. Porsh, В., "High-performance liquid chromatography of sugar mixtures containing xylose and arabinose on primary amino-bonded phases" Journal of Chromatography A, Volume 253, 1982, Pages 49-54

26. Voragen, A.G.J.; Scholl, H.A.; Devries, J.A.; Pilnik, W., "High-performance liquid chromatographic analysis of uronic acids and oligoga-lacturonic acids"/ Journal of Chromatography A, Volume 244, Issue 2, 30 July 1982, Pages 327-336

27. Nebinger, P.; Koel, M.; Franz, A.; Werries, E., "High-performance liquid chromatographic analysis of even- and odd-numbered hyaluronate oligosaccharides"/ Journal of Chromatography A, Volume 265, 1983, Pages 1925

28. Liu, Y.; Shu, C.; Lamb J.D., J. Capillar. Electrophor. 4(3) (1997) 97-103

29. Callul, M.; Loppez, E.; Marce, R.M.; Olucha, J.C.; Borrul, F., Journal of Chromatography. Volume 500 (1992) Pages 453

30. Swallow, K.W.; Low, N.H., "Analysis and quantitation of the carbohydrates in honey using high-performance liquid chromatography'VJ. Agric. Food Chem. 38 (1990) 1828

31. Tomlinson, A.J.; Landers, J.P.; Lewis, L.A.S.; Naylor, S.; "Buffer conditions affecting the separation of Maillard reaction products by capillary electrophoresis"/ Journal of Chromatography A, Volume 652, Issue 1, 15 October 1993, Pages 171-177

32. Porreta, S., "Chromatographic analysis of Maillard reaction products"/ Journal of Chromatography A, Volume 624, Issues 1-2, 30 October 1992, Pages 211-219

33. White, J. W., J. AO AC 62 (1979) 509

34. Kim, H.-J.; Richardson, M., "Determination of 5-hydroxymethylfurfural by ion-exclusion chromatography with UV detection"/ Journal of Chromatography A, Volume 593, Issues 1-2, 28 February 1992, Pages 153-156

35. White, J.W.; Siciliano, J., J. AOAC 63 (1980) 7

36. Шкендеров С., Иванов Ц. Пчелиные продукты/ пер. с болг. София: Земиздат, 1985, 266 е.; Кривцов Н.И., Лебедев В. И. Продукты пчеловодства. 2-е изд. Ml: Нива России, 1995. 254 с

37. EU Council// Council Directive 2001/110/ЕС of 20 December 2001 relating to honey. Official Journal of the European Communities L10, 47-52 (2002)

38. Salinas, F.; Mansilla, A.E.; Nevado, J.J.B., Fresenius J. Anal. Chem. 3401991)250

39. Anam, O.O.; Dart, R.K., Anal. Proc. 32 (1995 515

40. Cason, J.; Harris, E.R.,. "Utilization of Gas Phase Chromatography for Identification of Volatile Products from Alkaline Degradation of Herquei-none "/ Journal of Organic Chemical 24 (1959) 676

41. Stephens, R.L.; Teszler, A.P., "Quantitative Estimation of Low Boiling Carbonyls by a Modified alpha-Ketoglutaric Acid-2,4-Dinitrophenylhydrazone Exchange Procedure "/ Analytical Chemistry, 32 (1960) 1047

42. Anklan, E., Food Chem. 63 (1998) 549

43. Kim, H.-J.; Richardson, M., "Determination of 5-hydroxymethylfurfural by ion-exclusion chromatography with UV detection"/ Journal of Chromatography A, Volume 593, Issues 1-2, 28 February 1992, Pages 153-156

44. Bogdanov, S.; Martin, P.; Lullmann, C., Apidologie Extra issue (1997) 23

45. Vinas, P.; Campillo, N.; Herrnandez, M.; Candela, M.E., Food Chem. 441992) 67

46. Maria J. Nozal, Jose L. Bernal, Laura Toribio, Juan J. Jimenez, Maria T. Martin, "High-performance liquid chromatographic determination of methyl anthranilate, hydroxymethylfurfural and related compounds in honey"/

47. Journal of Chromatography A, Volume 917, Issues 1-2, 11 May 2001, Pages 95-103

48. Winkler, C.; Grafe, A.; UBA-Bericht 29733911 (2000)

49. Jorgensen, S.E.; Halling-S0rensen, B. "Drugs in the environment"/ Che-mosphere, Volume 40, Issue 7, April 2000, Pages 691-699

50. Stuer-Lauridsen, F.; Birkved, M.; Hansen, L.P.; Holten Lutzhoft H.-C.; Halling-S0rensen, B. "Environmental risk assessment of human pharmaceuticals in Denmark after normal therapeutic use"/ Chemosphere, Volume 40, Issue 7, April 2000, Pages 783-793

51. Wollenberger, L.; Hailing-S0rensen, В.; Kusk, K.O. "Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics to Daphnia magna"/ Chemosphere, Volume 40, Issue 7, April 2000, Pages 723-730

52. Baguer, A.J.; Jensen, J.; Krogh, P.H. "Effects of the antibiotics oxytetracy-cline and tylosin on soil fauna"/ Chemosphere, Volume 40, Issue 7, April 2000, Pages 751-757

53. Neu, H.C. "The Crisis in Antibiotic Resistance "/Science 21 August 1992 257: 1064-1073

54. European Commission, Regulation of the European parliament and of the Council on additives for use in animal nutrition, 2002/0073 (COD)

55. Official J. С 203 E (2002) 10

56. Norwara, A.; Burhenne, J.; Spiteller, M. "Binding of Fluoroquinolone Car-boxylic Acid Derivatives to Clay Minerals"/ J. Agric. Food Chem. 45 (1997) 1459

57. Tolls, J. Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 3397

58. Baguer, A.J.; Jensen, J.; Krogh, P.H. "Effects of the antibiotics oxytetracy-cline and tylosin on soil fauna"/ Chemosphere, Volume 40, Issue 7, April 2000, Pages 751-757

59. Ланчини, Д., Паренти, Д. Антибиотики, пер. с англ., М., 1985

60. Навашин, С.М. Современные проблемы антибактериальной химиотерапии. Тер. архив, т. 60, № 8

61. Spivak, M.S.; Reuter, G.S. "Resistance to American foulbrood disease by honey bee colonies Apis mellifera bred for hygienic behavior"/ Apidologie 32(2001)555

62. Alippi, A.M.; Albo, G.N.; Leniz D.; Rivera, I.; Zan M.L.; Roca, E.M. J. Apic. 38 (1999) 149

63. Kochnsky, J.; Knox, D.; Shimanuki, H. "Comparative stability of oxytetra-cycline and tylosin in sugar syrup"/ Apidologie 30 (1999) 321

64. EMEA/MRL/829/02, Final, European Agency for the Evaluation of Veterinary Medicine, Brussels, 2002 (Tylosin)

65. Dreassi, E.; Corti, P.; Bezzini, F.; Furlanetto, S. Analyst 125 (2000) 1077

66. Edder, P.; Coppex, L.; Cominoli, A.; Corvi, C. Food Addit. Conyam. 19 (2002) 232

67. Prats, C.; Francesch, R.; Arboix, M.; Perez, B. J. Chromatogr. В 766 (2001) 57

68. Juhel-Gaudain, M.; Anger, В.; Laurentie, M. J. AOAC Int. 82 (1999) 1046

69. Moran, J.W.; Turner, J.M.; Coleman, M.R. J. AOAC Int. 80 (1997) 1183

70. Stobba-Wiley, C.M.; Chang, J.P.; Elsbury, D.T.; Moran, J.W.; Turner, J.M.; Readnour, R.S. J. AOAC 83 (2000) 837

71. Tod, M.; Biarez, O.; Nicolas, P.; Petjean, O. J. Chromatogr. 575 (1992) 171

72. Shaikh, В.; Moats, W.A. "Liquid chromatographic analysis of antibacterial drug residues in food products of animal origin"/ Journal of Chromatography A, Volume 643, Issues 1-2, 23 July 1993, Pages 369-378

73. Delepine, В.; Hurtaud-Pessel, D.; Sanders, P. J. AOAC Int. 79 (1996) 397

74. Hwang, Y. H.; Lim, J. H.; Park, В. K.; Yun, H. I. "Simultaneous determination of various macrolides by liquid chromatography/mass spectrometry."/ Journal of Veterinary Science 3 (2002) 103

75. Li, Y. X.; Neufeld, K.; Chastain, J.; Curtis, A.; Velagaleti, P. J. Pharm. Biomed. Anal. 16 (1998) 961

76. Wang, J. "Determination of Five Macrolide Antibiotic Residues in Honey by LC-ESI-MS and LC-ESI-MS/MS'V J.Agric. Food Chem. 52 (2004) 171

77. Nouws, J.F.; ven Egmond, H.; Loeffen, G.; Schouten, J.; Keukens, H.; Smulders, I.; Stegeman, H. Vet. Q. 21 (1999) 21

78. Korsrud, G.O.; Salisbury, C.D.; Fesser, A.C.; MacNeil, J.D. Analyst 119 (1994) 2737

79. Charm, S.E.; Chi, R. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71 (1988) 304

80. Okerman, L.; De Wasch, K.; Van Hoof, J. Analyst 123 (1998) 2361

81. Horie, M. in Oka, H.; Nakazawa, H.; Hayrideand, K.-E. and MacNeil, J.D. (Editors), J. AOAC Int 1995 165

82. Cullor, J.S. Vet.Med. 87 (1992) 1235

83. Van Eenennaam, A.I.; Cullor, J.S.; Perani, L.; Gardner, I.A.; Smith, W.L.; Dellinger, J.; Guterbock, W.M.; Jensen, L. J. Dairy Sci. 76 (1993) 3041

84. Roybal, J.E. in: Turnipseed, S.B.; Long A.R. (Eds.). Sci. Tech. Sys., 1998, 227

85. Code of Federal Regulations, National Archives and Records Administration, Washington, DC, 1997, 21 CFR 530.41

86. Commission Decision of 13 March 2003, Off. Eur. Commun. L71 (2003)

87. Council Regulation (EEC) No. 2377/90 of 26th June 1990, Off. J. Eur. Commun. L 224 (1990) 1

88. Commission Decision of 19 Sept. 2001, Off. J. Eur. Commun. L 251 (2001) 11

89. Commission Decision of 30 Jan. 2002, Off. J. Eur. Commun. L 30 (2002) 50

90. Wal, J.-M.; Peleran, J.-C.; Bories, G. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63 (1980) 1044

91. Schenck, F.J. unpublished data

92. Nagata, T. in Oka, H.; Nakazawa, H.; Hayrideand K.-E.; MacNeil, J.D. (Editors), J. AOAC Int. (1995) 207

93. Bayo, J.; Moreno, M.A.; Prieta, J.; Diaz, S.; Suarez, G.; Dominguez, L. J. AOAC Int. 77 (1994) 854

94. Keeukens, H.J.; Aerts, M.M.L.; Traag, W.A.; Nouws, J.F.M.; deRuig, W.G.; Beek, W.M.J.; Den Hartog, J.M.P. J. AOAC Int. 75 (1992) 245

95. Yoshida, K.; Kondo, F. "Procedure for Liquid Chromatographic Determination of Thiamphenicol in Bovine Serum and Milk"/ Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, Volume 17, Issue 12 July 1994 , pages 2625 2632

96. Rodziewicz, L.; Zawadzka, I. Apiacta 42 (2007) 25

97. Bogusz M.J., Hassan H., Al-Enazi E. J. Chromatogr. B. 807 (2004), 343

98. Huang J.F., Zhang H.J., Feng Y.Q. J. Agric. Food Chem. 54 (2006), 9279

99. Turnipseed S., Burnas C., Storey J. Laboratory Information Bulletin 4281 (2002), 1

100. Verzegnassi L., Royer D., Mottier P. Food Addit. Contam. 20 (2003), 335120121.122123,124125126127128129130131132133134

101. Blanchflower, WJ.; Cannavan, A.; McCracken, R.J.; Hewitt, S.A.; Kennedy, D.G. in: Haagsma, N.; Ruiter, A.; Czedik-Eysenberg, P.B. (Eds.), Feder. of Eur. Chem. Soc., (1993), 196

102. Korfmacher, W.A.; Getek, T.A.; Hansen, E.B.; Cerniglia, C.E.; Abou-Khalil, S.; Yunis, A.A. J. Chromatogr. Sci. 28 (1990) 236 Blanchflower, W.J.; Cannavan, A.; McCracken, R.J.; Hewitt, S.A.; Kennedy, D.G.; Euroresidue I (1993) 196

103. Pfenning, A.P.; Madson, M.R.; Roybal, J.E.; Turnipseed, S.; Gonzales, S.A.; Hurbutand, J.A.; Salmon, G.D. J. AOAC Int. (1997) Kijak, P.J. J. AOAC Int. 77 (1994) 34

104. Clark, S.B.; Barrell, R.A.; Nandrea, J.M.; Geisler, C.A.; Hurlbut, J.A. US FDA Lab. Inf. Bull. 7 (1991) 3529

105. Choma, I.; Grenda, D.; Malinowska, I.; Suprynowics, Z. J. Chromatogr. В 734 (1999) 8

106. Petz, M.; Solly, R.; Lymbum, M.; Clear, M.H. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70 (1987) 691

107. Ко, H.C.; Lin, H.Y.; Chen, L.H.; Chin. J. Agric. Chem. Soc. 32 (1994) 497 Noa, M.; Alfonso, H.A.; Ginorio, C. Rev. Salud Anim. 11 (1989) 212 Noa, M.; Cabrera, M.C. Rev. Salud Anim. 14 (1992) 181 Keskin, G. Pen.-Vet.-Mikroniyol.-Der. 24 (1993) 107

108. Dugger, B.M., Ann. New York Acad. Sci. 51 (1948) 177

109. Химия антибиотиков, 3 изд., т.1, М., 1961. 180

110. Навашин С.М., Фомина И.П., Рациональная антибиотикотерапия, 4 изд., М., 1982, 183

111. Чернух, А. М., Кивман, Г. Я., Антибиотики группы тетрациклинов, М., 1962; Химия антибиотиков, 3 изд., т.1, М., 1961. 180

112. Spivak, M.S.; Reuter, G.S. "Resistance to American foulbrood disease by honey bee colonies Apis mellifera bred for hygienic behavior"/ Apidologie 32 (2001) 555

113. Mitscher L.A. (Ed.), The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics, 1st Ed., NY, 1978

114. Ishidate, M.; Sakaguchi, T. Chem. Pharm. Bull. 6 (1958) 1

115. Lee, J.Y.; Evrett, W. J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 5221

116. Radecka, C.; Wilson, W.L. "Direct densitometric determination of tetracycline in pharmaceutical preparations"/ Journal of Chromatography A, Volume 57, 1971, Pages 297-302

117. Bossuyt, R.; Renterghem, R.V.; Waes, G. "Identification of antibiotic residues in milk by thin-layer chromatography"/ Journal of Chromatography A, Volume 124, Issue 1, 1 September 1976, Pages 37-42

118. Ragazzi, E.; Veronese, G. "Simple method for the quantitative analysis of tetracyclines by direct fluorimetry after thin-layer chromatography on cellulose plates"/ Journal of Chromatography A, Volume 132, Issue 1, 1 February 1977, Pages 105-114

119. Szabo, A.; Nagy, M.K.; Tomorkeny, E. "Thin-layer chromatographic assay of tetracyclines"/ Journal of Chromatography A, Volume 151, Issue 2, 11 April 1978, Pages 256-258

120. Ока, Н.; Suzuki, М. "Improvement of chemical analysis of antibiotics : VII. Comparison of analytical methods for determination of impurities in tetracycline pharmaceutical preparations"/ Journal of Chromatography A, Volume 314, 1984, Pages 303-311

121. Nelis, H.J.C.F.; DeLeenheer, A.P. "Retention mechanisms of tetracyclines on a C8 reversed-phase material"/ Journal of Chromatography A, Volume 195, Issue 1, 4 July 1980, Pages 35-42

122. Knox, J.H.; Jurand, J. "Mechanism of reversed-phase separation of tetracyclines by high-performance liquid chromatography"/ Journal of Chromatography, Volume 186, 30 December 1979, Pages 763-782

123. Howell, H.R.; Rhodig, L.L.; Sigler, A.D. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67 (1984) 572

124. Chen, C.-L.; Gu, X. J. AOAC Int. 78 (1995) 1369

125. Tj0rnelund, J.; Hansen, S.H. "Use of metal complexation in non-aqueous capillary electrophoresis systems for the separation and improved detection of tetracyclines"/ Journal of Chromatography A, Volume 779, Issues 1-2, 29 August 1997, Pages 235-243

126. Huang, T.S.; Du, W.X.; Marshall, M.R.; Wei, C.I.; "Determination of Oxy-tetracycline in Raw and Cooked Channel Catfish by Capillary Electrophoresis"/ J. Agric. Food Chem. 45 (1997) 2602

127. Oka, H.; Uno, K.; Harada, K.-I.; Suzuki, M. "Improvement of chemical analysis of antibiotics: III. Simple method for the analysis of tetracyclines on reversed-phase thin-layer plates"/ Journal of Chromatography A, Volume 284, 1984, Pages 227-234

128. Sharma, J.P.; Bevill, R.F. "Improved high-performance liquid chromatographic procedure for the determination of tetracyclines in plasma, urine and tissues."/ Journal of Chromatography A, Volume 166, Issue 1, 1 December 1978, Pages 213-220

129. Eksborg, S. "Reversed-phase ion-pair chromatography of tetracyclines on a LiChrosorb NH2 column"/ Journal of Chromatography A, Volume 208, Issue 1, 3 April 1981, Pages 78-82

130. Eksborg, S.; Ekqvist, В.; "Reversed-phase ion-pair liquid chromatography of tetracyclines"/ Journal of Chromatography A, Volume 209, Issue 2, 15 May 1981, Pages 161-173

131. Hermansson, J. J. Chromatogr. 232 (1982) 385

132. Dihuidi, K.; Kucharski, M.J.; Roets, E.; Hoogmartens, J.; Vanderhaeghe, H. "Quantitative analysis of doxycycline and related substances by high-performance liquid chromatography"/ Journal of Chromatography A, Volume 325, 1985, Pages 413-424

133. Wolfs, K.; Roets, E.; Hoogmartens, J.; Vanderhaeghe, H. "Separation of tetracycline related substance by high-performance liquid chromatography on poly(styrene—divinylbenzene)"/ Journal of Chromatography A, Volume 358, 1986, Pages 444-447

134. Sheridan, M.E.; Clarke, G.S. J. Chromatogr. 434 (1988) 253

135. Eivindvik, K.; Rasmussen, K.E. J. Liq. Chromatogr. 12 (1989) 3061

136. Fletouris, D.J.; Psomas, J.E.; Botsoglou, N.A. "Trace analysis of oxytetra-cycline and tetracycline in milk by high-performance liquid chromatography"/ J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 1913

137. Naidong, W.; Verresen, K.; Roets, E.; Hoogmartens, J. "Determination of metacycline and related substances by column liquid chromatography on poly(styrene-divinylbenzene)"/ Journal of Chromatography A, Volume 586, Issue 1, 8 November 1991, Pages 61-66

138. Barnes, W.N.; Ray, A.; Bates, I.J. "Reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the assay of oxytetracycline"/ Journal of Chromatography A, Volume 347, 1985, Pages 173-178

139. Chappell, G.S.; Houglum, J.E. J. AOAC Int 69 (1986) 28

140. Khan, N.H.; Roets, E.; Hoogmartens, J.; Vanderhaeghe, H.; "Quantitative analysis of oxytetracycline and related substances by high-performance liquid chromatography"/ Journal of Chromatography A, Volume 405, 1987, Pages 229-245

141. Cheng, Y.-R.; Phillips, D.J.; Neue, U.; "Simple and rugged SPE method for the determination of tetracycline antibiotics in serum by HPLC using a volatile mobile phase"/ Chromatographia 44 (1997) 187

142. Oka, H.; Ito, Y.; Ikai, Y.; Kagami, Т.; Harada, K.-I. "Mass spectrometric analysis of tetracycline antibiotics in foods"/ Journal of Chromatography A, Volume 812, Issues 1-2, 3 July 1998, Pages 309-319

143. Oka, H.; Patterson, J. in: Oka, H.; Nakazawa, H.; Harada, K.-I.; MacNeil, J.D. (Eds.),J. AOAC, 1995, 333

144. Kijak, P.J.; Leadbetter, M.G.; Thomas, M.H.; Thompson, E.A. "Confirmation of oxytetracycline, tetracycline and chlortetracycline residues in milk by particle beam liquid chromatography/mass spectrometry"/ Biological Mass Spectrometry 20 (1991) 789

145. Ackerman, B.H.; Bailie, G.R.; Zaske, D.E. Drug Monit. 75 (1984) 177

146. Whelton, A. J. Clin. Pharmacol. 25 (1985) 67

147. McLaughlin, L.G.; Henion, J.D.; Kijak, P.J. Biol. Mass Spec. 23 (1994) 417

148. Tawa, R.; Matsunaga, H.; Fujimoto T. "High-performance liquid chromatographic analysis of aminoglycoside antibiotics"/ Journal of Chromatography A, Volume 812, Issues 1-2, 3 July 1998, Pages 141-150

149. Rouan, M.C. "Antibiotic monitoring in body fluids" Journal of Chromatography: Biomedical Applications, Volume 340, 10 May 1985, Pages 361400

150. Elrod Jr., L.; White, L.B.; Wong, C.F. "Determination of fortimicin a sulfate by high-performance liquid chromatography after derivatization with 2,4-dinitrofluorobenzene"/ Journal of Chromatography A, Volume 208, Issue 2, 17 April 1981, Pages 357-363

151. Simons Jr., S.S.; Johnson, D.F. "Reaction of o-phthalaldehyde and thiols with primary amines: Fluorescence properties of l-alkyl(and aryl)thio-2alkylisoindoles'V Analytical Biochemistry, Volume 90, Issue 2, 15 October 1978, Pages 705-725

152. Chevreul, A., J. Chim. Med., Pharm et Toxicol. 6 (1830) 157-159

153. Perkin, A.G., J. Chem. Soc. 69(206) (1896) 799-803

154. Harborne, J.B., Chem. Biochem. Plant Pigm. 2nd edn., Vol.1' (1976) 736

155. Harbone, J.Bi, Comparative biochemistry of the flavonoids, L.N.Y., 1967

156. Запрометов M.H., Основы биохимии фенольных соединений, M.: 1967

157. Chevreul, A., J. Chim. Med., Pharm et Toxicol. 6 (1830) 157-159

158. Perkin, A.G., J. Chem. Soc. 69(206) (1896) 799-803

159. Henning, W., Z. Lebensm.-Unters.-Forsch. 173 (1981) 180

160. Kaderm, F.; Rovel, В.; Girardin, M.; Metche, M., Food Chem. 55 (1996)35

161. Friedrich, H.; Wiedemeyer, H., Planta medica, 30 (1976) 223-231 Nash, Т., Nature 170 (1952) 976

162. Payares, p.; Diaz, D.; Olivero, J.; Vivas, R.; Gomez, I., "Prediction of the gas chromatographic relative retention times of flavonoids from molecular structure"/ Journal of Chromatography A, Volume 771, Issues 1-2, 30 May 1997, Pages 213-219

163. Schmidt, T.J.; Merfort, I.; Matthiesen, U., "Resolution of complex mixtures of flavonoid aglycones by analysis of gas chromatographic-mass spectrometric data"/ Journal of Chromatography A, Volume 634, Issue 2, 26 March 1993, Pages 350-355

164. Schieber, A.; Keller, P.; Carle, R., "Determination of phenolic acids and flavonoids of apple and pear by high-performance liquid chromatography" Journal of Chromatography A, Volume 910, Issue 2, 2 March 2001, Pages 265-273

165. Chen, H.; Zuo, Y.; Deng, Y., "Separation and determination of flavonoids and other phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid chromatography"/ Journal of Chromatography A, Volume 913, Issues 1-2, 13 April 2001, Pages 387-395

166. Cristea, D.; Bareu, I.; Vilrem, G., Dyes and Pigments 57 ( 2003) 267-272

167. Raffaelli, A.; Moneti, G.; Mercati, V.; Toja, E., "Mass spectrometric characterization of flavonoids in extracts from Passiflora incarnate"/ Journal of Chromatography A, Volume 777, Issue 1, 8 August 1997, Pages 223-231

168. Jungbluth, G.; Ternes, W., Fresenius J. Anal. Chem. 367 (2000) 661-666

169. Crozier, A.; Jensen, E.; Lean, M.E.J.; McDonald M.S., "Quantitative analysis of flavonoids by reversed-phase high-performance liquid chromatography"/ Journal of Chromatography A, Volume 761, Issues 1-2, 14 February 1997, Pages 315-321

170. Cristea, D.; Bareu, I.; Vilrem, G., Dyes and Pigments 57 ( 2003) 267-272

171. Houghton. P.J.; Woldemariam, T.Z.; Davey, W.; Basar, A.; Lau, C., Phyto-chem. Anal. 6 (1995) 207

172. Orsolic, N.; Kosalec, I.; Basic, I., Biol. Pharm. Bull. 28(4) (2005) 694-700

173. Markham, K.R.; Mitchell, K.A.; Wilkins, A.L.; Daldy, J.A.; Lu, Y., Phyto-chem. 42(1) (1996) 205-211

174. Konig, В., Bee World 66 (1985) 136

175. Bonvehi, J.S.; Coll, F.V.; Jorda, R.R., J. Am. Oil Chem. Soc. 71 (1994) 529

176. Tomas-Barberan, F.A.; Garcia-Viguera, C.; Vit-Olivier, P.; Ferreres, F.; Tomas-Lorente, F., Phytochem. 34 (1993) 191

177. ГОСТ P ИСО 5725-2-2001 Точность (правильность и прецизионность методов и результатов измерения)

178. Энгельгард X. / Жидкостная хроматография при высоких давлениях. «Мир». Москва. 1979. 245 с.

179. Roman-Leshkov, Y., Chheda, J., Dumesic, J.// Science 30 June 2006: Vol. 312. no. 5782, pp. 1933 1937 10.1126/science. 1126

180. Определение 5-гидроксиметилфурфураля в меде методом ВЭЖХ. Романов А.В., Ларионов О.Г., Балашова Е.Ю., Коржов П.Б., Дубичев А .Г.// Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. Вып.5. С.711-718

181. Определение углеводного состава меда методом ВЭЖХ. Романов А.В., Ларионов О.Г., Балашова Е.Ю., Коржов П.Б.// Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. Вып.5. С.719-725