автореферат диссертации по транспортному, горному и строительному машиностроению, 05.05.06, диссертация на тему:Обоснование, выбор параметров и разработка систем фильтрации рабочих жидкостей для гидрофицированных горных машин

На правах рукописи

ГАБДРАХМАНОВА ЛЕЙЛА АСХАТОВНА

РОЛЬ АДАПТАЦИОННЫХ СИСТЕМ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково - 2006

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Казанского государственного университета им. В.И.Ульянова-Ленина.

Защита диссертации состоится «24» ноября 2006 г. в 10® часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, г.Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИТИБП РАСХН

Автореферат разослан «20» октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Ильинская Ольга Николаевна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Воробьева Галина Ивановна

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Рауис Госманович Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, г. Москва

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современная биотехнология включает целый ряд разнообразных, быстро развивающихся, социально ориентированных направлений исследований. При этом успехи биотехнологии во многом связаны с использованием ферментов и ферментативных систем, позволяющих оптимизировать традиционные производства путем замены химических подходов энзиматическими либо за счет повышения эффективности уже существующих ферментативных процессов. Актуальной проблемой биотехнологии является поиск простых и экономически выгодных подходов направленного влияния на уровень синтеза целевых белков. Выяснение роли адаптационных систем бактерий в регуляции синтеза ферментов может открыть перспективное направление в микробной биотехнологии, заключающееся в использовании новых аспектов теории стресса для оптимизации ферментативных производств. Однако в настоящее время молекулярные механизмы, контролирующие адаптационный потенциал микробной клетки, изучены недостаточно.

Бактерии обладают множеством регуляторных систем, позволяющих им быстро адаптироваться в неблагоприятных условиях и контролирующих широкий спектр процессов, протекающих в клетке, включая образование жгутиков [Aizawa et al., 2000], синтез внутри- и внеклеточных ферментов [Kunst, Rapoport, 1995; Volker, Hecker, 2005], формирование состояния компетентности [Hamoen et al., 2003], переход к спорообразованию [Sonenshein, 2000], вступление в стационарную фазу роста [Головлев, 1999], образование некультивируемых форм [Романова с соавт., 2002]. В основе формирования перечисленных адаптационных реакций лежит регуляция экспрессии соответствующих генов на различных уровнях, в частности, на уровне инициации транскрипции [Lloyd et al., 2001; Mooney et al., 2005]. Широко распространена у бактерий позитивная регуляция экспрессии генов с участием сенсорно-рсгуляторных систем: фосфатный регулон или DegS-DegU система представляют собой примеры глобального контроля за процессами в клетке в стрессовых условиях [Wanner, 1993; Pragai et al., 2004; Eguchi, Utsumi, 2005]. У части клеток в условиях стресса включается механизм, генерирующий множественные адаптивные мутации (SOS-ответ) [Janion, 2001; Foster, 2005].

Секретируемые гидролазы бактерий в последние годы вызывают все больший интерес как модельные объекты при исследовании отдельных регуляторных процессов и как перспективные для промышленного использования ферменты. Так как усиленный синтез гидролитических ферментов является одним из способов

3

адаптации бактерий к агрессивным условиям окружающей среды, установление молекулярных механизмов регуляции синтеза гидролаз может внести существенный вклад в выявление путей формирования ответа бактериальной клетки на стресс, а также позволит направленно влиять на уровень продукции этих ферментов.

Бактерии Serratia marcescens являются единственными представителями семейства Enterobacteriaceae, секретирующими в среду уникальные по свойствам гидролитические ферменты, включая хитиназы (КФ 3.2.1.14), и представляют собой адекватную систему для изучения механизмов регуляции синтеза хитинолитических ферментов. Циклизующие гуанилспецифичные рибонуклеазы (КФ 3.1.27) и глутамилэндопептидазы (3.4.21.19), продуцируемые различными видами бацилл, являются интересными моделями для исследования эволюционного развития ферментативной системы спорообразующих бактерий. Кроме того, хитиназы, РНКазы и глутамилэндопептидазы широко используются в биотехнологии, в молекулярной биологии, находят применение в медицине. Изучены физико-химические и каталитические свойства ферментов, установлены первичные структуры белков, клонированы и секвенированы соответствующие гены. Однако крайне мало работ посвящено изучению регуляции биосинтеза гидролаз, а накопленные данные, полученные традиционными физиолого-биохимическими методами исследования, часто противоречивы и недостаточно информативны. Все это определяет актуальность данной работы, посвященной исследованию конкретных молекулярных механизмов регуляции биосинтеза секретируемых гидролаз грамотрицательных и грамположительных бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды.

Целью данной работы явилось установление механизмов регуляции биосинтеза ферментов гидролитического типа действия у Serratia marcescens и различных видов бацилл в условиях стресса.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие экспериментальные задачи:

1. Выяснение закономерностей биосинтеза хитиназ S.marcescens, РНКаз B.intermedius, B.pumilus, B.amyloliquefaciens и глутамилэндопептидазы B.intermedius в процессе роста бактерий.

2. Характеристика качественного и количественного состава хитинолитического комплекса штамма S.marcescens Bu-211 АТСС 9986. Характеристика мутантного штамма S.marcescens с повышенной хитиназной активностью.

3. Исследование влияния индуктора ЗОБ-функций клетки митомицина С (МС) и субстрата фермента - хитина на биосинтез белков с хитиназной активностью у Б.тагсехсепз.

4. Аначиз нуклеотидных последовательностей промоторов генов РНКаз В. иПегтесИш, В.ритИиз, В.ату1оИдие/аЫеп5 и глутамилэндопептидазы ВлМегтесИм с целью обнаружения возможных консервативных участков для связывания с регуляторными белками.

5. Получение рекомбинантных штаммов Е.соИ, несущих плазмиды со структурными генами РНКаз В.Шегте<Ииз, В.ритИих и В.атуШ'щие/аЫеги под собственными и гетерологичными регуляторными областями, а также рекомбинантных штаммов В.хиЫШэ, несущих полный ген глутамилэндопептидазы В.Шегтеейш, для изучения экспрессии генов данных ферментов.

6. Выяснение механизмов регуляции биосинтеза РНКаз В.шегтейиа, В.ритНиз и B.amyloliquefaciens в условиях недостатка и избытка неорганического фосфата и под воздействием специфического ингибитора транскрипции актиномицина Д (АД).

7. Исследование механизмов регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы В.ШегтесИш в условиях солевого и температурного стрессов.

Научная новизна работы. К началу настоящей работы данные по биосинтезу хитиназ З.тагсеясет и гуанилспецифичных РНКаз бацилл были ограничены изучением влияния факторов внешней среды, а для глутамилэндопептидазы В.ШегтесИш публикации по исследованию биосинтеза фермента отсутствовали. В данной работе впервые исследования регуляторных механизмов биосинтеза перечисленных ферментов проведены на качественно новом уровне и систематизированы, установлены конкретные молекулярные механизмы регуляции биосинтеза хитиназ $.тагсе$сепя, а также РНКаз и глутамилэндопептидазы бацилл в условиях стресса.

Впервые изучен качественный и количественный состав хитинолитического комплекса штамма З.тагсезсею Ви-211 АТСС 9986 и мутантного штамма З.тагсехсет Д5 с конститутивным синтезом хитиназ. Получены приоритетные данные о том, что в условиях индукции системы ЗОБ-ответа происходит координированная индукция белков, обладающих хитиназной активностью.

Впервые на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов, физиологических экспериментов и исследования экспрессии соответствующих

5

генов в рекомбинантных штаммах Е.соЫ и В.ьиЫШа показана регуляция синтеза РНКаз и глутамилэндопептидазы бацилл посредством сенсорно-регуляторных систем на уровне транскрипции. Установлено, что секретируемые РНКазы бацилл по типу регуляции биосинтеза можно разделить на две принципиально различные группы: синтез РНКаз В.ШегтеШш и В.ритИиа индуцируется посредством активации двухкомпонентной системы РЬоР/РЬоК; синтез РНКазы В.ату1оИдие/ааеп5 не подвержен регуляторным воздействиям со стороны данной системы. Показано, что АД стимулирует синтез РНКаз, регулируемых по типу активации генов фосфатного регулона, и не оказывает видимого эффекта на синтез РНКазы В.ату1оНдие/ааепз. Биосинтез глутамилэндопептидазы ВлМегтесНиз также подвержен регуляции со стороны сенсорно-регуляторной системы. В данном случае системой, контролирующей регуляцию процесса биосинтеза, является система транедукции сигнала а внешним индуктором служат условия

солевого стресса.

Практическая значимость работы. Выявленные в работе закономерности важны для общего понимания механизмов формирования ответа бактериальных клеток на стресс. Хитиназы, секретируемые 5.тагсезсеп$, РНКазы и специфические протсиназы, секретируемые бациллами, могут найти применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, а также в аналитических технологиях и промышленности. В ходе исследования охарактеризован новый штамм 5.шагсе«сеп5, синтезирующий внеклеточные хитиназы в отсутствие индукторов. Разработана биотсхнологическая схема для получения препарата хитиназы 8.тагсе$сеп$ в промышленных условиях, отраженная в акте об испытании на ГУП Опытный завод АН РБ. Оптимизированы и заявлены к патентованию питательные среды, обеспечивающие высокую продукцию всех исследованных ферментов. Исследована экспрессия генов РНКаз и И и, Акр-специфической протештзы бацилл в рекомбинантных штаммах Е.соИ и В.зиЬМЫ, соответственно. Полученные рекомбинантные штаммы предложены как продуценты соответствующих ферментов. В каждом отдельном случае подобраны условия накопления гетерологичных ферментов в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов, что используется при получении белков в препаративных количествах для структурно-функциональных исследований в соответствии с актом о внедрении в Институте молекулярной генетики РАН.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Все исследованные гидролазы являются ферментами второй фазы роста, и максимум их активности приходится на стационарную фазу роста культуры. Факторы среды, регулирующие биосинтез ферментов, индивидуальны для каждой группы гидролаз.

2. В присутствии индукторов штамм S.marcescens Bu-211 АТСС 9986 секретирует в среду четыре белка с хитиназной активностью с молекулярными массами 58, 52, 38 и 21 кДа. Мутантный штамм S.marcescens Д5 синтезирует хитиназы конститутивно и не нуждается в индукторах для продукции больших количеств ферментов.

3. В условиях активации системы SOS-ответа происходит координированная индукция биосинтеза всех четырех хитиназ S.marcescens.

4. Близкородственные гуанилспецифичные циклизующие РНКазы бацилл имеют принципиальные различия в регуляции их биосинтеза: экспрессия генов РНКаз B.intermedius и B.pumilus контролируется двухкомпонентной системой трансдукции сигнала PhoP/PhoR, тогда как регуляция экспрессии гена РНКазы B.amyloliquefaciens происходит по иному механизму.

5. Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius осуществляется посредством сенсорно-регуляторной системы типа DegS/DegU системы B.subtilis в условиях солевого стресса. Регуляция биосинтеза фермента не зависит от активации св-фактора, а также от функционирования специфических механизмов, индуцирующихся при холодовом и тепловом шоке.

Связь работы с базовыми научными программами. Исследования по теме диссертационной работы проводились в соответствии с программой НИР КГУ (№ гос.регистрации 01.2.00 104982; «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования автора как исполнителя данной тематики поддержаны грантами фонда «Университеты России - фундаментальные исследования» (№ 015.07.01.32), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 01-04-48037, 04-04-49385, 05-04-48182), фонда НАТО (HTECHLG. 97337213), фонда Санкт-Петербургского университета (№ Е00-6.0-15), фонда Российско-Американской Программы «Фундаментальные исследования и высшее образование» (№ REC-007), фонда НИОКР и Академии Наук РТ (№№ 0402/99, 04-02/2000, 03-3.10-11, 03-3.10-295), фонда Else-Kroner, Fresenius Medical Care (2003-2004 гг.), Государственными контрактами № 02.434.11.3020

7

«Конструирование противоопухолевых препаратов селективного действия на основе микробных рибонуклеаз (2005-2006 гг.) и №02.451.11.7019 «Центр коллективного пользования КГУ», Государственной программой «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП 2.1.1.1005.

Место выполнения работы. Экспериментальные данные получены автором за время работы на кафедре микробиологии Казанского государственного университета в период с 1991 по 2005 гг. Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала, базируются на результатах собственных исследований автора.

Исследования были начаты в НИЛ биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии КГУ под руководством к.б.н. Л.В.Знаменской и д.б.н., проф. И.БЛещинской. Изучение экспрессии гетерологичных генов РНКаз бацилл в рекомбинантных штаммах E.coli частично проводили в лаборатории проф.

A. Ди Донато (кафедра биохимии Университета г. Неаполь, Италия). Работа по исследованию хитинолитического комплекса S.marcescens выполнена в лаборатории к.б.н. Д.ВЛОсуповой при участии к.б.н. Порфирьевой, к.б.н, Е.В.Петуховой и Р.Б.Соколовой (НИЛ ББФ, КГУ). Исследования экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в клетках B.subtilis частично былй выполнены в лаборатории д.х.н. С.В.Кострова (Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва). Работа по изучению биосинтеза глутамилэндопептидазы

B.intermedius проходила в сотрудничестве с к.х.н. Н.П.Балабан, к.б.н, А.М.Мардановой и д.б.н. М.Р.Шариповой (НИЛ ББФ, КГУ).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность проф. Р.Хартли и доктору Е.Б.Чернокальской (Национальные Институты Здоровья, США), проф. М.Дебарбюльс (Институт Пастера,' Франция), проф. С.В.Кострову (ИМГ РАН, г.Москва), проф. Й.Йомантасу (ГНИИ Генетика, г.Москва) за любезно предоставленные для работы штаммы и плазмиды, а также сердечно благодарит всех коллег, в сотрудничестве с которыми выполнена работа.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на III, IV, V Международных симпозиумах по РНКазам (Капри, 1993; Гронинген, 1996; Уоррентон, 1999), VI конференции «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1994), Международных симпозиумах по биотехнологии (Брайтон, 1994; Мельбурн, 1995), Международной конференции «Молекулярная биология на рубеже XXI века» (Москва, 1995), VIII Европейском конгрессе по биотехнологии (Будапешт, 1997), VII Всемирной конференции по промышленному

8

использованию ферментов (Барселона, 1997), Международной конференции «Экологические эффекты микробиологических воздействий» (Вильнюс, 1997), V, VI и VIII Международных конференциях «Новые перспективы в исследованиях хитина и хигозана» (Щелково, 1999, 2001; Казань, 2006), V Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002), Ш съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), I Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), Всероссийской конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), XI, XII и ХШ Всероссийских конференциях «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 1998, 2001, 2005), Всероссийской конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 70 печатных работ, из них 30 статей в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 316 страницах и содержит 15 таблиц и 45 рисунков. Работа оформлена по стандартному плану и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы (629 наименований), приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Бактериальные штаммы и плазмиды. При исследовании хитиназ S.marcescens использовали пигменгообразующий прототрофный штамм S.marcescens Bu-211 АТСС 99S6, полученный из коллекции бактериальных культур Армянской АН; мутантный штамм Д5, полученный на кафедре микробиологии КГУ методом индуцированного мутагенеза из исходного штамма S.marcescens Bu-211 АТСС 9986 с последующим отбором колоний, обладающих повышенной хитиназной активностью. Фунгистатическую активность хитиназ изучали, используя штаммы микромицетов из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии КГУ: Alternaria sp., Bipolaris sorokiniana, Rhizoctonia solani, Fusarium graminearum.

В исследованиях биосинтеза протеиназы B.intermedius использовали устойчивый к стрептомицину штамм B.intermedius 3-19 (В-3833, ВКПМ). Экспрессию гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в клетках B.subtilis

9

исследовали с использованием плазмид Д58.21 и pV, сконструированных на основе вектора рСВ22 и отличающихся по размеру фрагмента хромосомной ДНК B.intermedius [Rebrikov et al., 1999]. В среды для рекомбинантных штаммов B.subtilis добавляли эритромицин и хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл, т.к. плазмиды pV и Д58.21 несут гены устойчивости к соответствующим антибиотикам. Плазмиды любезно предоставлены проф. С.В.Костровым (ИМГ РАН). В качестве реципиента плазмидной ДНК использовали штамм B.subtilis AJ73, из хромосомы которого делегированы гены внеклеточных протеиназ, предоставленный проф. Й.Йомантасом (ГНИИ Генетика), В исследованиях экспрессии гена глутамидэндопептидазы в условиях солевого стресса в качестве реципиента плазмидной ДНК использовали мутантный штамм B.subtilis QB4883 с делецисй гена degU, предоставленный проф. М.Дебарбюлье (Институт Пастера, Франция).

В работе по исследованию регуляции биосинтеза РНКаз использовали штаммы B.intermedius 7Р (В-3073, ВКМ), B.pumilus КММ62 (коллекция ТИБОХ РАН), B.amyloliquefaciens Н2 (предоставлен доктором Р.Хартли, США). Реципиентом рекомбинантных плазмид служил штамм E.coli SURE (Stratagene). Для исследования экспрессии генов РНКаз бацилл в клетках E.coli использованы три типа плазмид: гены всех РНКаз под собственными промоторами (pML5, pMLöl, рМТ415); гены РНКаз B.amyloliquefaciens и B.intermedius под искусственным tac-промотором (рМТ416 и pML163); ген РНКазы B.intermedius под промоторами двух других РНКаз (pML67, pML53). Плазмиды рМТ415 и рМТ416 любезно предоставлены Р.Хартли [Hartley, 1988]. Плазмиды pML5, pML163, pML61, pML67, pML53 сконструированы методом полимеразной цепной реакции [Jones, Howard, 1990]. В среду для культивирования штаммов E.coli вносили ампициллин, 50 мкг/мл.

Питательные среды и условия культивирования. Культивирование штаммов S.marcescens проводили, используя модифицированную среду Бантинг [Юсупова с соавт., 1972] либо солевую среду с коллоидным хитином в качестве единственного источника азота и углерода [Чигалейчик, Пириева, 1976]. Микромицеты выращивали на глюкозо-картофельной среде [Литвинов, 1969]. Питательная среда для продукции РНКаз штаммами B.intermedius и B.pumilus описана Знаменской с соавт. [1994]. Для культивирования B.amyloliquefaciens и рекомбинантных штаммов E.coli нами были подобраны оптимальные для синтеза РНКаз питательные среды.

EcoRI BamHI Hindlll

Ndel

-T^—J 11 П И 1114-HfeJ-PMT415

ParJdsp Barnaso Ptac Barstar EcoRI BamHI EcoRI Xbal Hindlll

—Цы "ЬЬянишипУ-

Ptac PhoAsp BarnaseBarstar P Barstar

EcoRI BamHI Hindlll

^Цш -Ъи||11ИТТТТШ1>1-

Pandsp Binase Ptac Barstar

pMT416

pML5

EcoRI BamHI EcoRI Xbal Minctm

-Ца '' 4ilH 111111111 ITffiJ-pML163

Ptac PhoAsp Binase Barstar P Barstar

■ , EcoRI BamHI Hindlll

^ Egsssa -i"" Y hIIIIIIHIMIH I—

RNase Bp RNase Bp ptac Barstar Pandsp EcoRI BamHI Hindlll

—" 'babi 111111 H 11J-

RNase Bp Binase Ptac Barstar P and sp

EcoRI BamHI Hindlll

И!И!!м8358ЭТ 111 !4ТТПТПТ>1-

P3anSSsep Binase Ptac Barstar

pML61 pML67

pML53

P — промотор, sp - сигнальная последовательность

При исследовании биосинтеза глутамилэндопептидазы для культивирования клеток B.intermedius и B.subtilis в качестве исходной использовали солевую среду, описанную ранее [Шакиров с соавт., 2000]. Культивирование штаммов S.marcescens и бацилл проводили при 30°С, штаммов E.coli при 37°С. При температурном стрессе культуру B.intermedius в экспоненциальной стадии роста переносили на водяную баню, где создавались экспериментальные температурные условия, инкубировали в течение 30 мин и вновь помещали на вибростенд при 30°С [Lowering, Streips, 1995].

Выделение плазмид и трансформацию клеток B.subtilis и E.coli плазмидной ДНК проводили стандартными методами [Sambrook et al., 1989].

Определение содержания Ф„ в среде проводили модифицированным методом Куттнера и Коэна [Знаменская с соавт., 1984].

Прирост биомассы определяли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм. Продуктивность культуры в отношении синтеза фермента определяли как отношение величины ферментативной активности к величине биомассы.

Удельную скорость роста ц, удельную скорость накопления ферментов в культуральной жидкости е, время генерации g рассчитывали по Перту [Pirt, 1975].

Внеклеточные белки концентрировали, осаждая из культуральной жидкости с сульфатом аммония при 90%-ном насыщении (сульфат-аммонийная фракция). Белок определяли по методу Лоури [Lowry et al., 1951 ].

Получение бесклеточных экстрактов. Клетки отмывали 0,14 М раствором NaCl до удаления следов внеклеточных гидролаз и разрушали ультразвуком. В бесклеточном экстракте определяли активность ферментов. Величину активности рассчитывали на единицу биомассы или мг белка.

Хитиназную активность определяли по количеству образующихся при гидролизе хитина редуцирующих Сахаров с динитросалициловым реагентом (ДНС метод) [Чигалейчик, Пириева, 1976]. Эндохитиназную активность определяли вискозиметрически по действию на гликольхитин в микровискозиметре Оствальда. Активность хитобназы определяли, используя в качестве субстрата п-нитрофенил-М-ацетил-Р-В-глюкозаминид [Стояченко с соавт., 1991]. Коллоидный хитин готовили по методу, описанному Чигалейчиком с соавт. [1976]. Гликольхитин получали по методике Ямады и Имото [Yamada, Imoto, 1981].

Электрофоретнческое разделение белков проводили с применением вертикального электрофореза в 12,5%-ном ПААГ в присутствии 1% Ds-Na [Laemmli, 1970]. Денситограммы электрофореграмм получали на микрофотометре ИФО-450. Определение хитиназной активности белковых фракций в геле после электрофореза в денатурирующих условиях проводили согласно методике Труделя и Асселина [Trudel, Assclin, 1989].

Частичную очистку хитиназ проводили путем адсорбции на коллоидном хитине [Roberts, Cabib, 1982].

Изоэлектрическое фокусирование в гранулированном геле [Ригетти, 1986] проводили на приборе Multiphor 2117 фирмы LKB.

Фунгистатическую активность хитиназ исследовали методом бумажных дисков [Литвинов, 1969].

Активность РНКазы определяли модифицированным методом Анфинсена [Anfinsen et al., 1954].

Активность глутамнлэндопептидазы определяли, используя в качестве субстрата паранитроанилид карбобензокси-Ь-глутаминовой кислоты [Leshchinskaya et al., 1997].

Статистическую обработку результатов проводили, используя общепринятые методы статистической обработки [Гроссман, Тернер, 1983]. Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении о<10%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р<0,05 за достоверный уровень значимости. Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью комплекса программ «ВЮРТ» [Краснов, Знаменская, 1992].

При анализе нуклеотидных последовательностей генов использовали интерактивную программу BLAST [Altschul et al., 1997]. Поиск потенциальных -10 и -35 областей связывания с ад фактором транскрипции в промоторе гена глутамнлэндопептидазы B.intermedius идентифицировали, используя сервер Softberry В PROM [Helmann, 1995].

Результаты исследований 1. Хитннолитический комплекс S.marcescens и особенности его биосинтеза

Поскольку известно, что многие гидролазы являются ферментами ответа на стресс, мы планировали выяснить, индуцируются ли ферменты хитинолитического комплекса S.marcescens (внеклеточные хитиназы и хмтобиаза) при активации SOS-функций клетки. В качестве индуктора SOS-ответа использовали митомицин С (MC). Исследовали также влияние хитина на биосинтез хитиназ S.marcescens, так как хитиназы являются индуцируемыми ферментами и синтезируются лишь при наличии в среде хитина или высокомолекулярных продуктов его расщепления [Monreal, Reese, 1969].

При выращивании бактерий на среде Бантинг без добавления хитина и MC на 24-48-й час роста хитиназная активность практически не обнаруживалась. На среде Бантинг с MC хитинолитическая активность резко возрастала. Хитин при добавлении его в солевую среду в качестве единственного источника углерода и азота индуцировал синтез хитиназ и хитобиазы. Внесение 0,05 мкг/мл MC в среду с хитином приводило к увеличению общей хитиназной активности S.marcescens Bu 211 АТСС 9986 в два раза. Наблюдалось увеличение как суммарной хитиназной активности, измеренной ДНС-мегодом, так и эндохитиназной активности, следовательно, происходила одновременная индукция экзо- и эндохитиназ. В

13

бесклеточных экстрактах (БЭ) во всех вариантах опыта хитиназная активность ни одним из использованных методов не обнаруживалась, то есть хитиназы, по-видимому, не накапливаются в периплазме клеток. Исследование активности хитобиазы показало, что удельная активность фермента внутри клетки многократно превышала внеклеточную активность. На среде с хитином внутриклеточная хитобиазная активность в 20-30 раз превышала активность, достигнутую на среде без хитина. МС не индуцировал синтез хитобиазы (табл. 1).

Ранее на кафедре микробиологии КГУ методом индуцированного мутагенеза с последующим отбором по признаку наибольшей хитиназной активности на основе штамма 5.тагсе$сет Ви 211 АТСС 9986 был получен штамм З.тагсехсет Д5. Активность мутантного штамма З.тагсевсет оказалась существенно выше активности исходного штамма, причем, в отличие от исходного, мутантный штамм активно синтезировал хитиназу в отсутствие индукторов - хитина и МС. Исходный и мутантный штаммы хорошо растут и синтезируют хитиназы на солевой среде с хитином в качестве единственного источника азота и углерода. При развитии на этой среде мутантный штамм отличался короткой лаг-фазой роста, ранним появлением и высоким уровнем эндохитиназной активности в культуралыюй жидкости (КЖ) по сравнению с исходным штаммом. Эта разница между штаммами исчезала при добавлении в среду с хитином МС.

Таблица 1

Индукция синтеза ферментов хитинолитического комплекса Б.тагсевсет

под влиянием МС и хитина.

Варианты опыта Хитиназная активность, ед/мг белка Хитобиазная активность, ед/мг белка

Общая хитиназная активность (ДНС-метод) Эндохитиназная активность КЖ БЭ

КЖ БЭ КЖ

Среда Бантинг (без хитина) Контроль Контроль + МС 1,5±0,03 24,9±0,5 1,6±0,02 2,0±0,03 13,4±0,25 216,0+5,0 8±0,1 92+2,0 109+3,2 62+3,0

Солевая среда с хитином Контроль Контроль + МС 11,0±0,2 19,7±0,35 2,6±0,03 2,0+0,02 100,0+3,0 183,0±4,0 60±1,5 741+20 3009+48 2639±50

При этом резко повышался уровень эндохитиназной активности в культуральной жидкости исходного штамма. Хитиназная активность мутантного штамма в присутствии МС увеличивалась незначительно (рис.1). Таким образом, мутантный штамм Б.тагсехсет Д5, обладающий повышенной активностью хитиназы, синтезирует значительные количества эндохитиназы в процессе роста на полусинтетической среде в отсутствие индукторов (хитина и МС). Исследовали динамику роста природного и мутантного штаммов Б.тагсезсегк и биосинтеза ими хитиназ с целью подбора условий, оптимальных для биосинтеза хитинолитических ферментов. В условиях индукции хитиназ у исходного штамма либо при использовании мутантного штамма с конститутивным синтезом хитиназ на срсде Бантинг у З.тагсеьсет хитиназная активность обнаруживалась в культуральной жидкости в конце экспоненциальной фазы роста (4-6-й час) и достигала максимального значения в стационарной фазе на 18-24-й часы культивирования. В процессе дальнейшего культивирования как активность фермента, так и продуктивность культуры в отношении синтеза хитиназ у обоих штаммов существенно не изменялись (рис. 2). В связи с обнаруженными различиями в регуляции биосинтеза хитиназ исходного и мутантного штаммов

Время, час

Рис.1. Активность эндохитиназы в процессе роста мутантного (1, 3) и исходного (2,4) штаммов на среде с хитином без МС (1,2) и в присутствии МС (3,4).

Б.тагсасем представлялось необходимым установить состав внеклеточных белков с хитиназной активностью у этих штаммов. Изучение состава внеклеточных хитиназ методом электрофореза в 12,5%-ном ПААГ с гликольхитином в денатурирующих условиях с последующей ренатурацией и обнаружением хитиназной активности в геле показало, что при росте исходного штамма в отсутствие индукторов на 12-й час культивирования (переход к стационарной фазе роста) в культуральной жидкости обнаруживается один белок, обладающий хитиназной активностью, с молекулярной массой 38 кДа. В присутствии МС у исходного штамма индуцировался синтез четырех белков с хитиназной активностью с молекулярными массами 58,52, 38 и 21 кДа, обозначенных как А, В, С и С, (рис. 3). Профиль внеклеточных белков мутантного штамма на среде Бантинг в отсутствие МС аналогичен профилю белков исходного штамма на срсде с МС (рис. 3). Обнаруженная нами индукция биосинтеза хитиназ З.тагсеьсепь в присутствии МС указывает на то, что гены, кодирующие хитиназы, подвержены регуляции со стороны БОБ-системы клетки.

Время, час Время, час

Рис.2. Рост мутантного (а) и исходного (б) штаммов З.тагсезсеп5 и продукция ими хитиназ при культивировании на среде Бантинг. Мутантный штамм культивировали без внесения индукторов в среду. Среда для культивирования исходного штамма содержала МС. ОБ - 0059о, опт.ед., А - активность хитиназы, ед/мл. 1. Рост; 2. Активность хитиназы; 3. Продуктивность культуры в отношении синтеза хитиназы.

кДа 116.0

ЛТС.С 9986 ЛТС'С 9986 Д5

(cpiuia Ьантинг) (cpejft Ьантннг + MQ (среда Вантннг)

кДа

67.0

43.0

29.5

I' Ii I. " ~

■ш*

* ^Эг*

«SS* щшШт*"^

58 52

3S

20.1

21

6 12 18 24 48 6 12 18 24 48 6 12 18 24 48 Час

Рис. 3. Изменение состава внеклеточных белков в процессе роста & тагсеясею. Электрофорез в 12,5% -ном ПААГ с гликольхити-ном в денатурирующих условиях. Окраска кумасси бриллиантовым синим Ы250. Слева — белки-маркеры. Сверху указаны штаммы бактерий и питательные среды.

Мы провели анализ известных к настоящему времени нуклеотидных последовательностей промоторных участков генов хитиназ S.marcescens с целью обнаружения последовательностей, характерных для связывания с регуляторными белками SOS-системы. Известно, что все гены E.coli и многие гены S.marcescens, регулируемые по типу SOS-ответа, содержат в структуре своих промоторов высоко консервативную область из 20 пар нуклеотидов, так называемый SOS-бокс: ТА CTG N,o CAG ТА [Lewis, Mount, 1992]. Последовательность SOS-бокса обладает двойной симметрией и содержит участок, богатый AT основаниями. Мы обнаружили участки, проявляющие высокую гомологию (60%) с консенсусной последовательностью SOS-бокса, в промоторах генов chi А штаммов S.marcescens

BJL200 [Brurberg et al., 1995] и S.marcescens QMB1466 [Jones et al., 1986; Harpster, Dunsmuir, 1989]: TG CTG N, CAG TT (рис.4). В структуре промоторов других исследованных генов хитиназ последовательностей, схожих с SOS-боксом E.coli, не обнаружено.

Мутантный штамм был использован в дальнейшем при получении, очистке и характеристике хитиназ. Проведена очистка хитиназ культуральной жидкости S.marcescens Д5 путем осаждения белков сульфатом аммония при 90%-ном насыщении с последующей адсорбцией на хитине [Roberts, Cabib, 1982]. Анализ изменения удельной хитиназной активности в процессе адсорбции на хитине показал, что степень очистки возрастала в 12,3 раза при измерении ДНС-методом и в 18,5 раз - вискозиметрическим методом. Результаты электрофореза частично очищенных хитиназ показали, что в препарате содержалось два белка с хитиназной активностью, с молекулярными массами 58 и 52 кДа (хитиназы А и В). Хитиназы с молекулярными массами 38 и 21 кДа, присутствовавшие в сульфат-аммонийной фракции, не связывались с хитином и оставались в супернатанте.

E.coli recA TA CTG TATgagcATA CAG TA [i]

E.coli umuDC TA CTG TATATAaAaA CAG TA [i]

E.coli lexА TA CTG TATATActcA CAG CA [l]

E.coli sulA TA CTG- TAcATccATA CAG TA [i]

E.coli uvrA TA CTG TATATtcATt CAG gt [i]

E.coli uvrB aA CTG TtTtTtTATc CAG TA [l]

S.marcescens recA TA CTG TATgaccATA CAG TA [2]

S.marcescens nucA cA CTG TAaATATATA CAG TA [23

Консенсусная

последовательность

SOS-бокса E.coli TA CTG TATATATATA CAG TA [1]

S.marcescens BJL200

chiA тд CTG aATAaAacc CAG Tt

S.marcescens QMB1466

ChiA Tg CTG aATAaAacc CAG Tt

Рис.4. Сравнение нуклеотидных последовательностей, обнаруженных

промоторах генов хитиназ A S.marcescens, с нуклеотидными последовательностями промоторов генов E.coli и S.marcescens, регулируемых по типу SOS-ответа, и консервативной последовательностью SOS-бокса. Ссылки: [1] Lewis, Mount, 1992; [2] Ball et al., 1990.

18

Таким образом, хроматографией на хитине хитиназы Л и В отделены от хитиназ С и С, и очищены от сопутствующих белков. Методом изоэлектрофокусирования хитиназы А и В получены в очищенном состоянии. Хитиназа А имеет две изоформы с pi 4,9-5,2 и pi 6,2 и по механизму действия является экзохитиназой. Хитиназа В является эндохитиназой и имеет pi около 5,0.

2. Регуляция биосинтеза внеклеточных рпбонуклеаз различных видов бацилл

Целью данной части работы явилось выяснение механизмов регуляции биосинтеза секретируемых РНКаз B.amyloliquefaciens (барназы), B.intermedius (биназы), B.pumilus (РНКазы Bp) и выявление возможных различий в механизмах регуляции синтеза данных ферментов.

В начальной части исследования был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полных генов исследованных РНКаз, имевший своей задачей определение различий в структуре генов, кодирующих ферменты, а также поиск потенциальных областей связывания с регуляторными белками. Полные гены барназы, биназы и РНКазы Bp клонированы и представлены в Международном Банке Генов [Hartley, 1988; Shulga et al., 1992; Znamenskaya et al., 1995]. Анализ показал, что в структурном гене РНКазы Bp имеется 10 замен нуклеотидов по сравнению с геном биназы, но ни одна из них не приводит к заменам аминокислот в структуре белка. Таким образом, первичные структуры биназы и РНКазы Bp полностью идентичны, а идентичность нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих данные ферменты, составляет 98%. Структурный ген РНКазы Bp (также как и биназы) идентичен таковому барназы на 72% [Hartley, 1988]. Промоторы генов биназы и РНКазы Bp отличаются по 5 нуклеотидам, в промоторной области гена РНКазы Bp имеется одна делеция. В лидерной последовательности РНКазы Bp в сравнении с геном биназы имеются замены четырех аминокислот, три из иих не меняют полярности пептида, а одна замена (Glu —> Lys) вносит положительный заряд. Нуклеотидная последовательность полного гена, а также аминокислотная последовательность сигнального пептида и зрелого белка РНКазы Bp в сравнении с геном биназы представлена на рис. 5. Будучи очень схожи между собой, промоторные области и лидерные последовательности генов биназы и РНКазы Bp абсолютно отличаются от таковых гена барназы (рис.6).

а т а

1ТТАТТТАТТТ САТСАСААвА АТАТСАвСАС ААААвССТСА ТТТТАССААА

-35 -10

А[**-* .... (3

ЗЮАТССТСТТТ СТТТАСАТТТ ССТТСАТАТТ ССССТССАТ ААТАТвАССТ

ББ

101АСАСААССАТ СААСАССАСА ССАТСССАТТ ТССТТААТА0_САС5А1еААЭ -50 -40

151 АТС ААА ААА АТС АЭТ тсв етт ТТТ АСТ АТС ТТТ йСТ СТС АТС

А1а А1а 11е Ьеи РЬе Бег РЬе Не -30 Рго С1п С1п А1а Туг

192ССТ ест АТТ СТС ТТТ ТСТ йвТ ТТТ АТТ ссв САв САА всс ТАТ

Рго -20 С1Г) 61 и

А1а Й1и ТЬг ТЬг Ьеи 1Ьг Рго ТЬг А1а ТЬг Аэп Ьуе ТЬг А1а

234гсс вАА АСА АСА СТТ АСА ссс АСС йСС АСА ААТ ААА АСА ССТ

ТЬг -10 1

Бег Не С1п Ьеи ТЬг Бег Аэр Шз ТЫ Ьеи А1а \7а1 11с

276ТСТ АТТ САА СТО АСА ТСА САТ йТТ САТ АСС СТТ ССС СТС АТТ

Аэп ТЬг РЬе Авр Й1у Уа1 10 А1а Аэр Туг Ьеи 11е Агд Туг ЬуБ

318ААТ АСЙ ТТТ йАТ рот СТА вСА вАТ ТАТ ТТА АТТ ССС ТАС ААА

20 30

Агд Ьеи Рго Аэр АЕП Туг Не ТЫ ЬуБ Бег С1п А1а Бег А1а

360 ССА СТС т ССТ САТ ААС ТАС АТС АСА ААА ТСА САА ССА АСТ ССТ

Ьеи Й1и Тгр Уа1 А1а Бег Ьуз С1у 40 Авп Ьеи А1а в1и Уа1 А1а

402СТТ йСА тес йТв 6СА ТСС А ААС вбА ААТ СТА ССА САС етт ССС

Рго С1у Ьуз Бег 50 Х1е С1у Ыу А5Р РЬе Бег Авп Агд С1и

444ССА свс ААА АСС АТС сет СвА САТ етт НС ТСТ ААС ССС вАв

60 т 70

01у Агд Ьеи Рго Бег А1а Бег й1у Агд ТЫ Тгр Агд С1и А1а

486СС-А сет СТТ ССТ ТСА ТСА АСС свс свс А АСА ТЙС ССТ САА С ССА

Абр Не Аэп Туг Бег 80 С1у РЬе Агд Азп А1а Авр Агд Ьеи

528САТ АТС ААС ТАС втс ТСА ССС ТТС ссс ААТ ССТ САС ССС СТС

90 Т А 100

Туг бег Бег Аэр Тгр Ьеи 11е Туг Ьуэ ТЬг ТЬг Аэр Шэ

570СТЗ ТАТ ТСА АйТ 6АС тсс СТС АТТ ТАТ ААА АСА АСА САС САТ

Туг А1а ТЬг РЬе ТЬГ Агд 11е Агд ---

612 Т АТ ССС АСА ТТС АСА ССТ АТТ СйА ТАА

А 1

Рис.5. Нуклеотидиая последовательность гена РНКазы Вр в сравнении с геном биназы. Примерный сайт связывания рибосом и области -35 и -10 подчеркнуты. Отличающиеся нуклеотиды промогорной области и аминокислоты сигнального пептида гена биназы приведены сверху, отличающиеся нуклеотиды в структурной части гена - снизу.

1CAATÄAGAAG AAAAATCCCG GTTGGTTCAG CCGGGGTTTA TTTTTCGCTA

51 GATAAAAAGT ACTATTTTTA AATTCTTTCT ATTCCTTTCT TTCGTTGCTG

SD

101ATACAATGAA AAGGAATCAG CTTCACATGA TGAAAATGGG AGGTATTGCT

-30

Met Lys Lys Arg Leu Ser Trp lie Ser Val Cys Leu Leu Val

151TTG AAA AAA CGA TTA TCG TGG ATX TCC GTT TGT ITA CTG GTG -20

Leu Val Ser Ala Ala Gly Met Leu Phe Ser Thr Ala Ala Lys

193CTT GTC ТСС GCG GCG GGG A.TG CTG TTT TCA АСА GCT GCC AAA -10

Thr Glu Thr Ser Ser His Lys Ala His Thr Glu

235ACG GAA АСА TCT TCT CAC AAG GCA CAC ACA GAA

Рис.6. Промоторная область и лидерная последовательность гена РНКазы • B.amyloliquefaciens Н2.

Дальнейший анализ нуклеотидной последовательности генов биназы и РНКазы Bp показал, что в их составе в -35 области имеется последовательность, сходная с pho боксом E.coli (на рис. 5 эта область отмечена квадратными скобками и звездочками; звездочки указывают на идентичные с последовательностью pho бокса нуклеотиды).

Гомология этого участка с консенсусной последовательностью pho-бокса составляет 50%. Промоторная область барназы гомологичного pho-боксу участка не содержит. Известно, что pho-бакс является специфическим сайтом активации транскрипции генов E.coli, продукты которых участвуют в ассимиляции неорганического фосфора из различных источников внешней среды [Van Bogelen et al., 1996]. Промоторы всех генов фосфатного регулона имеют в своем составе по обе стороны от -35 области консервативную последовательность из 18 пар оснований, так называемый pho бокс; CTGTCATA(A/T)A(T/A)CTGTCA(C/T). Такая последовательность необходима для активации транскрипции этих генов, а фосфорилированная форма белка PhoB является активатором транскрипции.

Различия, обнаруженные в структуре генов биназы, РНКазы Bp и барназы, позволяют предположить, что закономерности биосинтеза данных ферментов также могут быть различны. Провели сравнительное исследование синтеза РНКаз в процессе роста B.intermedius, B.pumilus и B.amyloliquefaciens. Биосинтез биназы и РНКазы Bp к настоящему времени охарактеризован [Знаменская с соавт., 1982, 1994], однако пути регуляции биосинтеза барназы до сих пор не изучались. Мы исследовали синтез барназы природным продуцентом B.amyloliquefaciens Н2 в сравнении с синтезом биназы и РНКазы Bp. Вначале мы подобрали оптимальную питательную среду для биосинтеза барназы. В трехфакторных экспериментах с

21

последующим обсчетом результатов в программе «ШОРТ» исследовали соотношения концентраций трех компонентов питательной среды, в наибольшей степени влияющих на увеличение РНКазной активности: пептона, глюкозы и неорганического фосфата (Ф„). Принятые уровни факторов и усредненные по трем повторностям значения биомассы, активности РНКазы и продуктивности культуры в отношении синтеза фермента указаны в табл. 2. На рис.7 приведен график линий уровня, где выделяется оптимальная по рассматриваемым факторам зона. Активность барназы при культивировании штамма В.ату1о1к{ие/ас1ет на подобранной среде удалось повысить более чем в 5 раз в сравнении с активностью фермента при культивировании штамма на исходной среде (от 7000 до 36000 опт.ед./мл'час). В отличие от сред, подобранных для биосинтеза биназы и РНКазы Вр [Знаменская с соавт., 1994], оптимальный для биосинтеза барназы состав питательной среды включает (%): глюкоза — 6,5; пептон - 3,75; №гНР04 - 0,04.

На рис.8 приведена динамика роста культур В. ¡ШегтеЛшя, В.ритНиз и В.ату!оИдие/ас1епз на оптимальных питательных средах и накопления РНКаз в культуральной жидкости этих штаммов. Ферменты появляются в культуральной жидкости всех исследованных штаммов в стадии замедления роста культуры, активность достигает максимума к началу стационарной фазы.

Таблица 2

Результаты трехфакторного эксперимента для штамма В.ату1оИдие/аЫет 112

Пептон Глюкоза Биомасса, опт.ед. РНКаза, опт.ед./мл час Продуктивность

х, % % Х3 мг/мл

+ 4 + 1 + 0,1 8,4 32 700 3 900

- 2 + 1 + од 4,0 25 500 6 400

+ 4 - 0 + 0,1 5,8 10 300 1 800

2 - 0 + од 2,8 4 600 1 600

+ 4 + 1 - 0 5,2 22 900 4 400

- 2 + _ 1 - 0 3,2 7 000** 2 200

+ 4 - 0 - 0 2 1 300 650

2 - 0 - 0 0,2 215 1 400

+ 4 0 0,5 0 0,05 8,8 33 400 3 800

- 2 0 0,5 0 0,05 7,6 26 300 3 500

0 3 + 1 0 0,05 8,0 28 400 3 600

0 3 - 0 0 0,05 4,0 7 700 1 900

0 3 0 0,5 + 0,1 8,2 36 200 4 400

0 3 0 0,5 - 0 5,0 23 200 4 600

* Фосфор вносили в виде ЫагНРО^ концентрации указаны в пересчете на Р.

**Вариант среды соответствует составу среды для ВлМегтесНия.

Пептон,%

Рис.7. Линии уровня активности барназы в трехфакторном эксперименте для штамма В.ату1оИдие/ас1епз Н2. За 1 принята максимальная активность РНКазы в эксперименте. Ф„ фиксирован на уровне 0,075 мг/мл.

Во всех случаях удельная скорость синтеза РНКазы возрастает и достигает максимума в период, когда удельная скорость роста культуры падает, то есть синтез РНКазы активируется в то время, когда рост культуры замедляется.

Обнаружение в структуре промоторов генов биназы и РНКазы Вр последовательности нуклеотидов, необходимой для связывания с регуляторными белками фосфатного регулона, указывает на то, что биосинтез этих РНКаз подвержен репрессии Фн. Отсутствие такой последовательности в промоторе гена барназы предполагает иной механизм регуляции биосинтеза фермента. Чтобы подтвердить это предположение, исследовали влияние Фн на синтез биназы, барназы и РНКазы Вр. Внесение в среду от 20 до 800 мг/л Ф„ приводило к увеличению биомассы всех трех штаммов. Одновременно увеличение концентрации Ф„ в среде вызывало резкое снижение продукции РНКаз штаммами ВАмегте/Низ и В.ритНия (рис. 9).

А

Б

OD

А

12

16

3

10

6

г

о

4

8

О

2

О 4 8 12 16 20 24 28,32 Время.ч.

О 4 8 12 16 20 24 28 32 Время.ч.

Рис.8. Рост бациллярных штаммов (А) и синтез ими РНКаз (Б).

OD - OD59o, А - активность РНКазы, опт.ед/мл"час.

1 - B.amyloliquefaciens 112; 2 - B.intermedius 7Р; 3 - B.pumilus КММ62

Продуктивность B.amyloliquefaciens в отношении синтеза барназы не менялась при увеличении концентрации ф„ до 100 мг/л, тогда как продуктивность штаммов B.intermedius и B.pumilus снижалась до 4% и 18%, соответственно. Затем продуктивность B.amyloliquefaciens в отношении синтеза РНКазы снижалась, но даже при концентрации Ф„ 1000 мг/л она составила 28% от максимальной. Итак, синтез биназы и РНКазы Bp оказался подвержен репрессии Ф„, синтез барназы не зависит от присутствия Фм в среде культивирования.

С целью выяснить, какие именно регуляторные элементы задействованы в системе, контролирующей биосинтез РНКаз в присутствии Ф„, изучали экспрессию генов бациллярных РНКаз рекомбинантными штаммами E.coli, несущими соответствующие гены на мультикопийных плазмидах. Штамм E.coli SURE был трансформирован плазмидами, в которых гены биназы, РНКазы Bp и барназы находятся под своими промоторами и лидерными последовательностями (pML5, pMLöl, рМТ415); гены биназы и барназы находятся под синтетической регуляторной областью - tec-промотор и лидерная последовательность гена phoA E.coli (pML163, рМТ416); плазмидами со структурным геном биназы под регуляторными областями РНКазы Bp и барназы (pML67, pML53).

Рис.9. Влияние неорганического фосфата на рост (А) бациллярных штаммов и продукцию ими РНКаз (Б). За 100% приняты значения биомассы и продуктивности при культивировании бактерий на среде, не содержащей Ф„. 1 - В.ату1оИдие/ас1еп5, 2 — В.ритНих, 3 — ВАшегтесНих

Сначала в многофакторных экспериментах мы подобрали питательные среды, обеспечивающие максимальный синтез РНКаз. Среды, подобранные для штаммов Е.соИ с плазмидами, несущими полный ген биназы и структурный ген биназы под регуляторной областью гена РКазы Вр, не содержат смей фосфора, в отличие от сред, подобранных для штаммов, несущих плазмиды с полным геном барназы, с геном биназы под регуляторной областью гена барназы и со структурными генами РНКаз под синтетической регуляторной областью. Для нормальной жизнедеятельности всем рекомбинантным штаммам необходимы в достаточно

высоких концентрациях пептон (4-5%) и дрожжевой экстракт (3,5%). При культивировании на оптимизированных средах уровень активности РНКаз одинаков как в бациллярных штаммах, так и в рекомбинантных штаммах Е.соИ, когда гены РНКаз экспрессировалнсь с собственных промоторов. РНКазная активность рекомбинантных штаммов, несущих плазмиды с генами биназы и барназы под ¿ас-промотором, в несколько раз превышала таковую у бацилл. Динамика синтеза бациллярных РНКаз рекомбинантиыми штаммами аналогична таковой для исходных штаммов-продуцентов.

Следующей задачей было исследование влияния Фя на синтез биназы, РНКазы Вр и барназы полученными рекомбинантиыми штаммами. Как показали эксперименты, Фн подавляет экспрессию генов биназы и РНКазы Вр, когда они находятся под собственными промоторами (рис.Юа). Экспрессия гена барназы под собственной регуляторной областью, а также генов РНКаз под гас-промотором и ркоА лидерной последовательностью не подавлялась Фн. Далее мы изучили экспрессию структурного гена биназы под регуляторными областями двух других РНКаз. Это штаммы, несущие плазмиды рМЬ53 со структурным геном биназы под промотором и лидерной последовательностью барназы и рМЦ>7 со структурным геном биназы под регуляторной областью РНКазы Вр (рис.10 6). В присутствии фосфата наблюдалась репрессия • синтеза биназы, когда ген экспрессировался с собственного промотора и с промотора РНКазы Вр. Экспрессия гена биназы с промотора барназы не зависела от присутствия Ф„ в среде культивирования.

Различия в регуляции синтеза биназы, РНКазы Вр и барназы Ф„ позволяют предположить, что эффект других экзогенных факторов на синтез данных ферментов также будет различным. Ранее было показано, что биосинтез биназы и РНКазы Вр стимулируется малыми дозами актиномицина Д (АД) - специфического ингибитора транскрипции [Знаменская с соавт., 1994]. Исследования регуляции биосинтеза -бациллярных РНКаз методом ингибиторного анализа показали, что АД в концентрациях 0,1-0,3 мкг/мл оказывал индуцирующее воздействие на синтез биназы и РНКазы Вр (продукция биназы и РНКазы Вр повышалась в 10 и 9 раз, соответственно), но не влиял на уровень синтеза барназы.

О 0,71 1,42 2,13 2,84

0рМЬ5 ШрМЬ67 □ рМЬбЗ

Рис.10. Влияние Ф„ на биосинтез бациллярных РНКаз рекомбинантными штаммами Е.соИ. П - продуктивность культуры в отношении синтеза РНКазы.

А. Гены биназы (рМЬ5), барназы (рМТ415) и РНКазы Вр (рМЬ61) находятся под собственными регуляторными областями.

Б. Ген биназы находится под собственной регуляторной областью (рМЬ5) и под регуляторными областями РНКазы Вр (рМЬ67) и барназы (рМЬ53).

3. Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидазы В.Шегтейшя

С целью установить регуляторные системы, контролирующие биосинтез глутамилэндопептидазы В.Шегте&из, исследовали биосинтез фермента в оптимальных условиях и в условиях стресса.

На первом этапе работы было исследовано влияние ряда экзогенных факторов на синтез глутамилэндопептидазы и подобрана питательная среда, обеспечивающая максимальный уровень продукции протеиназы. Установлено, что для эффективной продукции глутамилэндопептидазы необходимо вводить в среду пептон и Ф, в концентрациях 20 г/л и 0,2 г/л, соответственно. Подобно синтезу других протсиназ, синтез глутамилэндопептидазы ВЛмегтесИм подавляется лсгкометаболизируемыми

27

источниками углерода. Сочетание в среде органического (пептон) и неорганического (К11)С1) источников азота благоприятно для развития культуры и образования протеиназы. Показан стимулирующий эффект ионов Са2+ и М§2+ на продукцию фермента. Индукции синтеза глутамилэндопептидазы сложными органическими субстратами - казеином, желатином и гемоглобином в концентрациях 0,5-2,0% -обнаружено не было. Используя подобранную питательную среду, мы исследовали динамику роста культуры и накопления глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости В-ШегтесИиз. Глутамилэндопептидаза появляется в культуральной жидкости в стадии замедления роста культуры, активность глутамилэндопептидазы достигает максимума в стационарной фазе. Удельная скорость накопления протеиназы в культуральной жидкости нарастает в период, когда удельная скорость роста снижается (рис. 11).

Для более подробного анализа биосинтеза глутамилэндопептидазы ВлтеппесНиз экспрессия гена, кодирующего фермент, была изучена в рекомбинантных штаммах ВлиЬгШз. Полный ген глутамилэндопептидазы был клонирован в клетках В.эиЬНШ А]73 [ЯеЬпкоу е1 а1., 1999] с использованием мультикопийных плазмид рУ и Д58.21, различающихся величиной вставки хромосомной ДНК В.ШегтесИив. В многофакторных экспериментах были подобраны питательные среды, обеспечивающие высокую продукцию глутамилэндопептидазы В.ШегтесНиз рекомбинантными штаммами В.зиЫНи. Закономерности биосинтеза глутамилэндопептидазы рекомбинантными штаммами В.зиЫШз аналогичны таковым для исходного штамма В. ШегтеЛшь, однако, в отличие от исходного штамма, биосинтез фермента клетками ВлиЫШз активируется в присутствии сложных органических субстратов.

Ген глутамилэндопептидазы В.т1егтееИи5 клонирован и секвенирован, номер регистрации в Международном Банке Генов У15136 (ДеЬпкоу е1 а1., 1999]. Мы провели анализ промоторной области гена глутамилэндопептидазы с целью обнаружения возможных консервативных участков для связывания регуляторных белков (рис.12). Предполагаемые -10 и -35 области, узнаваемые с/1 -фактором, подчеркнуты. В промоторе гена глутамилэндопептидазы обнаружена последовательность нуклеотидов, на 78% идентичная консенсусной последовательности, характерной для Е>е§и-зависимых промоторов: АСАТ Г^ю ТТСАС. Кроме того, промотор гена глутамилэндопептидазы содержит еще несколько последовательностей нуклеотидов с меньшим процентом гомологии с предполагаемой консервативной последовательностью для связывания Ое§и-белка.

28

На рис.13 приведена последовательность нуклеотидов, обнаруженная в промоторе гена глутамилэндопептидазы В.ШегпгесНих, предположительно участвующая во взаимодействии с регулятором ответа в сравнении с соответствующими

участками промоторов различных генов АтЬй'/и [ОагЫв е! а1., 1998], для которых показана регуляция посредством двухкомпонентной системы транедукции сигнала DegS-DegU.

Экспрессия генов, кодирующих ряд гидролитических ферментов, продуцируемых клетками В.зиЬШк в стационарной фазе роста, связана с активацией альтернативного ^-фактора [НаЫепи'а!^, 1995]. В промоторе гена глутамилэндопептидазы мы обнаружили вероятный сайт для связывания белка SigL: ТввСТС N7 ТГОСАААТ (рис.12). Степень гомологии с консенсусной последовательностью составила 85%.

Время, час

Рис.11. Динамика роста штамма ВЛШегтеШих 3-19 и биосинтеза им глутамилэндопептидазы. 1 - СЮ590, опт.ед.; 2 - А, активность глутамилэндопептидазы, ед/мл; 3 - удельная скорость роста ц, час'1; 4 - удельная скорость накопления фермента е, час"1.

В различных стрессовых условиях у Е®М/и происходит также неспецифическая индукция синтеза так называемых общих стрессовых белков, индукция синтеза которых полностью зависит от еще одного альтернативного а-фактора - с3 [Ре1егео1ш ег а1., 2001]. В структуре промотора гена глутамилэндопептидазы В.Шегтейшз не удалось обнаружить последовательность иуклеотидов, сходную с последовательностью, характерной для SigB-зaвиcимыx генов.

30 60

сасстсссас сттсатства астасссатв атсатватсс сассссстас ассаатссст

90 120

ссатттасас сстттбттса сссаасасаа стстсссаса ассаабсааа ассастасас

150 180

саасстсасс тстаттттсс стйтсстсас сстсттса|ас ат^атетата тт)ттсас|саа

210 240

атссассттс сазсссаааа ассасттстт сасатссасс ссссттаттс тсвтсасааа

270 300

(5авсааааас тататстсса всатттсттс ааасааоасс сссссатсст сатсаастта

330 360

сттсассаас стааататст ттассютсс свссасссаа аасттатссс ассасасста

390 420

сассстассс ттатссасст статсаааас сасааасатт сстссаасва аасасстсаа

450 480

аатЕ1Ша саасссЕ£^>а?щ|сасаат а<зататстаа аасатсютс сасстбаааа

510 540

аттассааса сссссаатта «зссаттттт тстахттсат асасасасат саатасаатс

570 600

аассттссаа асатасаааа сасстааттт ааааатсааа таттттотаа аааатаасаа

-35 630 -10 бэ

таттстстса тттастссаа татсааасаа тсстатбатт ттюататас сасатаааяс

абсааг

Рис.12. Нуклеотидная последовательность промотора гена глутамилэндопептидазы ВлМегтесИщ. Предполагаемая область Шайна-Дельгарно и -10 и -35 области, узнаваемые с^-фактором, подчеркнуты. Последовательность нуклеотидов, на 78% идентичная канонической последовательности, характерной для DegU-зaвиcимыx промоторов, взята в рамку. Последовательности, обладающие меньшей гомологией с предполагаемой консервативной последовательностью для связывания DegU-белка, выделены жирным шрифтом. Вероятный сайт для связывания с альтернативным сигма-фактором о1" выделен цветом.

Наличие в промоторе гена глутамилэндопептидазы В. ЬиегтесНиз последовательности нуклеотидов, характерной для связывания с регуляторным белком Ое§и, предполагает индукцию биосинтеза глутамилэндопептидазы в условиях солевого стресса. Мы исследовали влияние высоких концентраций солей на уровень биосинтеза глутамилэндопептидазы В. ¡ЫегтесИт при периодическом культивировании. В присутствии высоких концентраций солей рост культуры существенно снижался, а уровень продукции протеиназы резко возрастал. При внесении в среду 1 М ЫаС1 наблюдалось повышение продуктивности культуры в отношении синтеза протеиназы на 40%. Увеличение концентрации соли в среде до 2,5 М вело к увеличению продукции фермента в 4 раза (рис.14). Подобный стимулирующий эффект был обнаружен также при замене >1аС1 на КС1 или сукцинат натрия. Исследовали также биосинтез глутамилэндопептидазы при внесен™ стрессового фактора к экспоненциально растущим клеткам. Активный синтез глутамилэндопептидазы ВЛмегтесИш происходит в стадии замедления роста культуры (рис.11), поэтому №С1 вносили в среду культивирования на 14-й и 16-й часы культивирования. В данном случае моделирование условий солевого стресса могло повлиять непосредственно на регуляторные механизмы, задействованные в процессе биосинтеза протеиназы. ЫаС1 вносили в среду до конечной концентрации 1,5 М (рис.15). Через два часа после внесения соли уровень продукции глутамилэндопептидазы в обоих случаях увеличивался примерно вдвое в сравнении с контролем. Наибольшее увеличение продуктивности наблюдалось при внесении соли в период, когда удельная скорость биосинтеза протеиназы В.ШегтесНих максимальна (16-й час).

Изучена экспрессия гена глутамилэндопептидазы ВЛгиегтесНиз в мутантном штамме В.хиЪМЬ ОВ4883 с делецией гена degU[Dartois й а1., 1998]. Собственную глутамилэндопептидазу штамм С?В4883 образует в крайне малых

количествах. В.виЪЧШ С2В4883 был протрансформирован плазмидой Д58.21, несущей полный ген глутамилэндопептидазы B.inlermedius, и в полученном рекомбинантном штамме была исследована экспрессия гена глутамилэндопептидазы в присутствии высоких концентраций соли. Штамм В.эиЫШз АЛЪ с функциональным degS-degU опероном был протрансформирован плазмидой Д58.21 и служил контролем.

\vapA -41 АААА АТАТ ТСТААТСАТАТ ТТСАС ТСТ

хасВ -128 СААА АСАА АСАСАТАОАТТТТ ТТТАС ттс

хасХУ +245 АТСА АСАА СССОАСТТТТС ТТСАС СЛА

аргЕ -188 АССТ АААА ААССАТСАСАТ ТТСАС САТ

<къи (214) ОЛСД АСАА ЛЛЛСЛЛАТСЛ ТТССС СГТ

-286 АТСй АСАв СТСССАОСТС ТГСАС АТТ

-173 АТГА АСАА ТСПТСГСААТ ТТСАС САС

фЪ (168) ТСАА АААА САСТАСАААСА ТТСАС ССС

ууЛ (347) АААА АСАА АТССАОСССАТ ТТСАА ААА

сотО -94 ТОСС АСАА ЛСААТТСОТТТ ТТСАС САТ

сотС -100 С(ХЗС АСАА ТСАААААААОА ТТСГС саз

сотЕА (284) АААТ АААА АТСАТСТСОТТ ТТСАС ААА

тесА -85 АААТ АСАА АТАСАААССАА ТГСАС АСТ

консенсусная

последовательность; АСАА и„ ТГСАС

gse В.Мегте&ш-. -487 ТТОА АСАТ САТСТСТАТТ ТГСАС (ЗАЛ

Рис.13. Сравнение нуклеотидной последовательности, обнаруженной в промоторной области гена глутамилэндопептидазы В.ШегтесИш е), с нуклеотидными последовательностями промоторов генов В.зиЫИа, регулируемых DegS-DegU системой, и консенсусной последовательностью, необходимой для связывания с регулятором ответа Эеди, предложенной Дартуа с соавт. в результате компьютерного анализа. Цифры указывают положение соответствующих нуклеотидов относительно сайта инициации транскрипции; цифры, приведенные в скобках, соответствуют положению соответствующих нуклеотидов относительно сайта инициации трансляции. Данные для В.яиЫШв цитируются согласно Цаг^э й а!. [1998].

0.05 03 1 2 2.5

NaCl М

Б

450 400 J 350 § 300 £ 250 | 200 $ 150

а юо

с 50 0

0,05 0,5 1 1,5 2 2,5

NaCl. М

Рис.14. Влияние NaCl на рост культуры (А) и продукцию глутамилэндопептидазы (Б) B.intermedius. Среда, содержащая 0,05 М NaCl [Gabdrakhmanova et al., 1999], служила контрольной средой.

Уровень экспрессии гена глутамилэндопептидазы у штамма B.subtilis QB4883 А58.21 в присутствии как низких, так и высоких концентраций соли был близок к нулю. У штамма B.subtilis AJ73 Д58.21 был отмечен достаточно высокий уровень продукции фермента во всех исследованных вариантах, то есть для полноценной экспрессии гена глутамилэндопептидазы необходима функционально активная форма белка DegU.

Изучали влияние высоких (42°С, 48°С, 54°С) и низких (20"С, 15°С, 10°С) температур на уровень синтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius. Клетки подвергали кратковременному температурному воздействию в период замедления роста культуры, когда удельная скорость синтеза глутамилэндопептидазы увеличивается и достигает максимума (12-16-й часы роста). Значения температуры

подбирали согласно данным литературы, так как в конкретных температурных точках происходит индукция определенного пула стрессовых регуляторных белков [Агпобй е1 а]., 1986; Огашпапп е1 а1., 1997]. Во всех вариантах опытов, независимо от значения температуры и момента, когда культуру подвергали температурному воздействию, уровень продукции фермента оставался неизменным либо снижался на 15-20% по отношению к контролю.

Время, час Время,

Рис.15. Влияние солевого стресса на рост культуры (А) и продукцию глутамилэндопептидазы (Б) ВЛтегтедхт при внесении №С1 к экспоненциально растущим клеткам. Стрелки показывают время, когда вносили №С1. 1- №С1 в концентрации 1,5 М вносили на 14-й час культивирования; 2 - ИаС1 в концентрации 1,5 М вносили на 1б-й час культивирования; 3 - культивирование проводили на контрольной среде без внесения дополнительных концентраций №С1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследованы механизмы регуляции биосинтеза внеклеточных гидролаз грамотрицательных и грамположительных бактерий в оптимальных условиях и в условиях стресса (под воздействием ДНК-повреждающих агентов, солевого стресса, температурного стресса, в условиях голодания по фосфату). В качестве объектов исследования были выбраны практически значимые ферменты: хитиназы S.marcescens, секретируемые гуанилспецифичные РНКазы бацилл (B.intermedius, B.pumilus, B.amyloîiquefaciens), глутамилэндопептидаза B.intermedius.

Хитинолитический комплекс S.marcescens и особенности его биосинтеза. Исследовали биосинтез внеклеточных хитиназ и хитобиазы S.marcescens Bu 211 АТСС 9986. Известно, что большинство секретируемых гидролаз S.marcescens, включая хитиназы, индуцируются субстратами [Ball et al., 1990; Peter, 2002]. Нами показана индукция всех ферментов хитинолитического комплекса штамма S.marcescens Bu 211 АТСС 9986 хитином: на среде с хитином происходила одновременная индукция экзо- и эндохитиназ S.marcescens, а также наблюдалось многократное увеличение внутриклеточной активности хитобиазы.

Помимо хитина, в качестве возможного индуктора биосинтеза хитиназ S.marcescens исследовали MC - классический индуктор SOS-ответа клетки [Keller et al., 2001]. SOS-ответ яатяется хорошо изученной системой сигнального реагирования и регулирует синтез ряда вне- и внутриклеточных белков. SOS-система воспринимает нарушение основных процессов жизнедеятельности, прежде всего нарушение целостности генетического аппарата [Smith, Walker, 1998; Newmark et al., 2005]. В зависимости от интенсивности сигнала происходит дифференцированная дерепрессия SOS-генов [Janion, 2001; O'Reilly, Kreuzer, 2004]. Внесение MC в среду с хитином приводило к резкому увеличению общей хитиназной активности S.marcescens Bu 211 АТСС 9986. Эндо- и экзохитиназная активности увеличивались в одинаковой степени. Уровень синтеза хитобиазы в присутствии MC не изменялся. Индукция синтеза хитиназ под влиянием MC свидетельствует о вероятной регуляции синтеза этих ферментов по типу SOS-ответа. Биосинтез хитобиазы S.marcescens регулируется по типу субстратной индукции и не входит в систему SOS-ответа клетки.

В данной работе были исследованы особенности роста мутантного штамма S.marcescens Д5, полученного ранее на кафедре микробиологии КГУ на основе штамма S.marcescens Bu 211 АТСС 9986, и синтеза им хитиназ. Мутантный штамм отличается от исходного более медленным ростом и более длительным временем

генерации. Хитиназная активность штамма Д5 намного превышает активность исходного штамма, причем мутантный штамм активно синтезирует хитиназу в отсутствие индукторов - хитина и МС. Динамика накопления хитиназ в культуральной жидкости мутантного штамма S.marcescens при культивировании на среде без индукторов и исходного штамма при культивировании на среде с МС одинакова: хитиназная активность появляется в культуральной жидкости в конце экспоненциальной фазы роста, увеличивается в процессе роста и достигает максимума в стационарной фазе, то есть хитиназы S.marcescens являются ферментами второй фазы роста, активный синтез которых происходит в стадии замедления роста культуры [Mader et al., 2002].

Изучение состава внеклеточных хитиназ S.marcescens показало, что в культуральной жидкости штамма Вч 211 АТСС 9986 при росте на среде без МС обнаруживается один белок с хитиназной активностью с молекулярной массой 38 кДа. В присутствии МС в культуральной жидкости появляются 4 белка с хитиназной активностью с молекулярными массами 58, 52, 38 и 21 кДа (хитиназы А, В, С и Ci). Мутантный штамм S.marcescens синтезирует все четыре белка с хитиназной активностью в значительных количествах при росте на полусинтетической питательной среде в отсутствие индукторов. Одновременная индукция МС синтеза всех четырех хитиназ и высокий уровень их в культуральной жидкости мутантного штамма свидетельствует о том, что структурные гены этих ферментов индуцируются координирований и, видимо, находятся под контролем одного белка-репрессора. Мутантный штамм S.marcescens Д5 обладает конститутивным синтезом хитиназы и может быть рекомендован в качестве продуцента фермента.

Исходя из полученных результатов, биосинтез всех внеклеточных хитиназ S.marcescens помимо хитина индуцируется МС - индуктором SOS-функций клетки. Ранее была показана индукция МС синтеза других внеклеточных белков S.marcescens, в частности нуклеазы. В промоторе гена нуклеазы S.marcescens обнаружена консервативная последовательность нуклеотидов, необходимая для связывания с LexA-белком и активации SOS-систсмы: CTG Nj0 CAG [Ball et al., 1990; Sweetman et al., 2005]. В настоящее время гены, кодирующие многие хитиназы S.marcescens, клонированы и секвенированы [Harpster, Dunsmuir, 1989; Brurberg et al., 1994, 1995; Gal et al., 1997], однако их нуклеотидные последовательности сильно различаются в зависимости от штамма, и разные штаммы секретируют в среду различный набор хитинолитических ферментов [Watanabe et al., 1997; Suzuki et al., 2002]. Проанализировав известные последовательности генов хитиназ S.marcescens,

мы обнаружили типичные SOS-боксы в промоторах генов хитиназ Л из штаммов S.tnarcescens BJL200 [Brurberg et al., 1994] и S.marcescens QMB1466 [Jones et al., 1986]. Степень гомологии с консервативной последовательностью SOS-бокса составила 60%. Для штамма, изученного в данной работе, гены, кодирующие хитиназы, пока не клонированы, поэтому доказательства индукции синтеза ферментов вследствие активации SOS-системы на генетическом уровне представить нельзя. Тем не менее, мы впервые показали, что MC одновременно индуцирует синтез всех хитиназ, секретируемых бактериями S.marcescens Bu 211 ЛТСС 9986, вероятно, по типу SOS-ответа

Бактериальные хитиназы рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней сельскохозяйственных растений, вызываемых фитопатогенными микромицетами, как основа для создания экологически безопасных биопестицидов, а также для ферментативного гидролиза отходов пищевой промышленности. Тем не менее, получение хитиназ S.marcescens обычно вызывает большие затруднения в связи с низкой продуктивностью бактерий в отсутствие индуктора - коллоидного хитина, получение которого представляет собой трудоемкий и длительный процесс. Максимальный уровень накопления ферментов при росте бактерий на среде с хитином достигается лишь на 6-8-е сутки [Monreal, Reese, 1969]. В присутствии MC, в отличие от хитина, максимальный уровень продукции внеклеточных хитиназ достигается на 18-20-й час роста бактерий. При этом в культуральной жидкости накапливаются все четыре белка с хитиназной активностью. Максимальный уровень хитиназной активности и накопление всех четырех хитиназ в культуральной жидкости мутантного штамма в отсутствие индукторов достигается также на 18-20-й час роста. Мутантный штамм S.marcescens с повышенной хитиназной активностью был использован нами для получения культуральной жидкости с высоким содержанием хитинолитических ферментов и не содержащей хитина, что позволило провести очистку хитиназ и получить индивидуальные ферменты. Хитиназы А и В получены в очищенном состоянии; показано, что хитиназа А является экзохитиназой и имеет две изоформы с pi 6,2 и 4,9-5,2. Хитиназа В имеет одну изоформу (pi 4,9-5,2) и относится к эндохитиназам. Хитиназы S.marcescens с молекулярными массами 58 и 52 кДа соответствуют ранее описанным хитиназам А и В [Brurberg et al., 1995; Suzuki et al., 2002].

Таким образом, установлено, что синтез внеклеточных хитиназ S.marcescens Bu 211 АТСС 9986 координирование индуцируется в условиях активации системы SOS-

ответа. Разработана эффективная биотехнологическая схема получения препарата хитиназ мутанта ого штамма 5./пагсе5сепл Д5, прошедшая испытания в промышленных условиях на ГУЛ Опытный завод АН РБ. Преимущества предлагаемой схемы перед ранее предложенными заключаются в использовании для культивирования продуцента простой полусинтетической среды (модифицированная среда Бантинг), не содержащей коллоидного хитина, и сокращении времени культивирования с 144-168 до 20 часов.

Механизмы регуляции биосинтеза внеклеточных РНКаз ВлМсгтеЖт, В.ритИиз, В.ату1оИдие/аЫет. Внеклеточные низкомолекулярные РНКазы бацилл проявляют широкий спектр биологической активности: они обладают противовирусным эффектом [Куриненко с соавт., 1995; КПаш й а1., 2000]; мутагенными и антимутагенными свойствами [Птвкауа е1 а1., 1995]; мембранотропным, цитотоксическим и противоопухолевым действием [Киппепко е1 а1., 1998; Макают, Шпзкауа, 2003]; ростстимулирующим эффектом [Колпаков с соавт., 2000]. В связи с широкими возможностями практического применения, РНКазы бацилл являются объектом пристального внимания исследователей.

Мы провели сравнительное исследование механизмов синтеза РНКаз В.Шегтей'ш^, В.ритИиз и В.ату1оИдие/ас1епз с использованием традиционных методов и методологии генной инженерии - получения и анализа рекомбинантных штаммов Е.соИ, экспрессирующих гены данных ферментов. Для РНКаз В.Шегтейшя и В.ритИш показано ранее, что они относятся к ферментам второй фазы роста [Знаменская с соавт., 1984; 1994]. Динамика роста культуры и синтеза РНКазы В.ату1оЩиф1с1ет оказалась аналогична таковым В.Шегте&ю и В.ритИиз, все три фермента являются ферментами идиофазы. В.ату1оИцие/аЫеп5 активно синтезирует РНКазу на богатой органической среде, где источником азота служит пептон, источником углерода - глюкоза. В отличие от сред для культивирования В.ШегтесИш: и В-ритИю, оптимальная для синтеза барназы питательная среда содержит Ка2НР04 как источник фосфора.

Экспрессия генов биназы, РНКазы Вр и барназы была проанализирована в рекомбинантных штаммах Е.соИ, трансформированных плазмидами, несущими гены РНКаз под собственными промоторами, гены биназы и барназы под /ас-промотором и ген биназы под промоторами двух других РНКаз. Полученные рекомбинантные штаммы практически не росли и не образовывали РНКазу на средах для бациллярных штаммов. Мы подобрали питательные среды, обеспечивающие

максимальный синтез РНКаз рекомбинантными штаммами, на основе пептона и дрожжевого экстракта. Среды для культивирования штаммов E.coli богаты Ф„, необходимым для роста и размножения клеток. При культивировании на подобранных средах уровень активности РНКаз у бациллярных штаммов и у соответствующих рекомбинантных штаммов, когда гены экспрсссируются с собственных промоторов, был одинаков. РНКазная активность рекомбинантных штаммов E.coli, несущих плазмиды с генами РНКаз под «сильным» fac-промотором, в 5-10 раз превышала активность штаммов бацилл, поэтому данные штаммы предложены нами в качестве продуцентов биназы и барназы. Среды, разработанные для продукции РНКаз рекомбинантными штаммами, заявлены к патентованию и используются для получения ферментов для структурно-функциональных исследований в Институте молекулярной биологии РАН.

Проведен анализ промоторов генов биназы и РНКазы Bp, в результате которого в их составе по обе стороны от -35 области обнаружена последовательность, состоящая из 18 пар оснований, на 50% идентичная консервативной последовательности pho бокса E.coli [Wanner, 1993].- CTGTTTCTTTACATTTCC (идентичные последовательности pho бокса E.coli нуклеотиды подчеркнуты). Последовательность pho бокса является специфическим сайтом активации транскрипции генов E.coli, участвующих в транспорте и ассимиляции фосфора. Эти гены составляют Pho-регулон бактерий - систему комплексного контроля за процессами в клетке [Ellison, McCleary, 2000]. У бацилл система генов, регулируемая экзогенным фосфатом, организована по аналогичной схеме [Shi, Hulett, 1999; Pragai, Harwood, 2002]. Регуляция транскрипции генов Pho-регулона осуществляется с участием сенсорно-регуляторных систем, состоящих из PhoB/PhoR белков у грамотрицагельных и PhoP/PhoR белков у грамположительных бактерий [Вершинина, Знаменская, 2002]. У B.sublilis сенсорно-регуляторные системы, контролирующие фосфатный ответ, процесс спорообразования, процесс анаэробного дыхания и синтез ряда гидролаз, регулируются координирование и активируются в условиях стресса [Eguchi, Utsumi, 2005]. Наличие в промоторах генов биназы и РНКазы Bp последовательности, сходной с pho боксом, указывает на то, что синтез этих ферментов подвержен воздействию регуляторных генов Pho-регулона. В промоторе гена барназы потенциальный pho бокс отсутствует, что исключает взаимодействие с промотором регуляторных белков Pho-регулона.

Исследование влияния Ф„ на синтез биназы, РНКазы Bp и барназы бациллярными штаммами показало, что синтез барназы конститутивен и не зависит

от присутствия в среде Ф„, синтез биназы и РНКазы Вр репрессируется Ф„. Эти результаты подтвердили предположение, выдвинутое на основе анализа структуры промоторов генов РНКаз: в условиях голодания по фосфату в клетках B.intermedius и B.pumilus (в отличие от B.amyloliquefaciens) активируется система сигнальной трансдукции, подобная системе PhoP/PhoR B.subtilis. В рекомбинантных штаммах E.coli Ф„ подавляет экспрессию генов биназы и РНКазы Вр со своих промоторов, а также экспрессию гена биназы с промотора РНКазы Вр. Экспрессия гена барназы с собственного промотора и гена биназы с промотора барназы не регулируется Фя. Наличие последовательности pho бокса в промоторах генов биназы и РНКазы Вр предполагает, что регуляция транскрипции этих генов под собственными регуляторными областями в клетках E.coli подвергается воздействию внутриклеточных белков-регуляторов РИо-регулона E.coli.

Исследование регуляции биосинтеза РНКаз B.intermedius, B.pumilus и B.amyloliquefaciens продолжили, используя специфический ингибитор транскрипции АД. Обнаружено стимулирующее действие АД на биосинтез биназы и РНКазы Вр и отсутствие подобного эффекта на синтез барназы. Дифференцированное реагирование на воздействие АД, возможно, связано с различиями в структуре регуляторных областей генов РНКаз бацилл, а в процессе активации синтеза РНКаз АД могут быть задействованы регуляторные белки фосфатного регулона.

Итак, показано, что у B.intermedius и B.pumilus функционирует система белков, гомологичная PhoP/PhoR B.subtilis, регулирующая экспрессию генов, продукты которых вовлечены в метаболизм фосфорсодержащих соединений, в данном случае, РНКаз. Регуляция биосинтеза РНКазы B.amyloliquefaciens осуществляется без участия регуляторных белков РЬо-регулона. Базируясь на выявленных регуляторных различиях, внеклеточные РНКазы бацилл можно разделить на две группы. Биосинтез РНКаз типа биназы регулируется фосфором и, вероятно, эти ферменты участвуют в метаболизме азота, утлерода и фосфора, так как данные метаболические пути координирование регулируются генами РЬо-регулона. Барназа не принимает участия в катаболизме и выполняет в клетке защитные функции. Позднее группа регулируемых Ф„ РНКаз бацилл была пополнена РНКазой из B.thuringiensis [Шульга с соавт, 2000], группа нерегулируемых Фя - РНКазой из В.circulons [Знаменская с соавт., 1998]. Это подтверждает нашу гипотезу о том, что в процессе эволюции данные ферменты по функциональным признакам разделились на две группы, подверженные принципиально различным механизмам регуляции процессов биосинтеза.

Механизмы регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы В.ШегтеЛт.

Протеиназы микроорганизмов с узкой субстратной специфичностью широко используются в молекулярной биологии в качестве инструментов изучения первичной структуры белков, а также интересны для исследования развития ферментных систем микроорганизмов в процессе эволюции. Бактерии В.иНегтесНиз 3-19 секретируют несколько сериновых протеипаз, включая глутамилэндопептидазу, специфичность действия которой обусловлена присутствием в субстрате (X-карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот. Исследованы свойства и структурная организация этих ферментов [Руденская 1998; Демидкж, Костров, 1999], однако имеется мало данных о механизмах регуляции биосинтеза глутамилэндопептидаз и остаются неясными их функции. В настоящей работе исследованы механизмы регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы ВлШегтесНиз, проанализирована структура промоторной области гена глутамилэндопептидазы, изучена экспрессия этого гена в рекомбинантных штаммах В.$иЬпИ.ч.

Прежде всего мы разработали среду, обеспечивающую высокий уровень синтеза глутамилэндопептидазы ВАмегтесИм. Воспользовавшись методологией многофакторных экспериментов, подобрали оптимальные концентрации пептона (20 г/л) и Ф„ (0,2 г/л) в среде культивирования. Пути регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы В.хпгегтеИи$ аналогичны таковым, описанным для других сериновых протеиназ бактерий, однако синтез протеииазы не индуцируется органическими субстратами. Гутамилэндопептидаза является ферментом второй фазы роста.

Биосинтез глутамилэндопептидазы В.шеппеЛш! исследовали в рекомбинантных штаммах В.хиЪНШ АПЗ, экспрессируюших ген протеиназы с мультикопийных плазмид рУ и Д58.21 [ЯеЬпкоу е! а1., 1999]. Рекомбинантные штаммы не продуцировали протеиназу на исходной питательной среде, поэтому мы подобрали оптимальные для продукции фермента клетками В.зиЫШх среды. Для жизнедеятельности рекомбинантных штаммов и активной продукции чужеродного белка требуется обогащение питательной среды Ф„ и присутствие в среде казеина или желатина. Рекомбинантные штаммы, экспрессирующис ген целевого продукта с мультикопийных плазмид, являются удобными объектами при разработке эффективных схем очистки ферментов, так как процедура очистки упрощается из-за меньшего количества примесных белков и возможности целенаправленно влиять на экспрессию соответствующих генов и выход ферментов. Полученные штаммы

41

B.subtilis предложены нами в качестве продуцентов глутамилэндопептидазы B.intermedius. Среды, подобранные для продукции протеиназы рекомбинантными штаммами, внедрены в схему получения глугамилэндопсптидазы в препаративных количествах для структурно-функциональных исследований в ИМГ РАН.

С целью установления возможной роли глутамилэндопептидазы B.intermedius в формировании адаптационного ответа клетки исследовали механизмы регуляции синтеза фермента в условиях солевого и температурного стрессов. У B.subtilis установлено как минимум три механизма индукции синтеза белков в условиях солевого стресса: неспецифическая реакция на стресс в результате активации транскрипции независимых генов, кодирующих общие стрессовые белки [Petersohn et al., 2001]; неспецифическая активация транскрипции «^-независимых генов, кодирующих стрессовые белки ClpC, ClpP и др. [Fedhila et al., 2002]; активация сенсорно-регуляторной системы DegS/DegU, обеспечивающей специфическую реакцию на солевой шок [Dartois et al., 1998].

Предприняли анализ регулягорной области i-ена глутамилэндопептидазы с целью обнаружения возможных участков связывания с регуляторными белками. В промоторе гена глутамилэндопептидазы B.intermedius обнаружены -10 и -35 области, характерные для оА-зависимых промоторов. Кроме того, нас интересовало возможное присутствие потенциальных участков связывания с альтернативными о1*-и ов-факторами. с^-фактор необходим для транскрипции генов, кодирующих ряд гидролаз B.subtilis стационарной фазы роста [Haldenwang, 1995]. Этот белок узнает на ДНК не традиционный участок связывания с основным оА-фактором бактериальных клеток, а специфическую последовательность оснований TGGCAC N< TTGCANNN [Ali et al., 2001]. В промоторе гена глутамилэндопептидазы имеется вероятный сайт взаимодействия с белком SigL со степенью идентичности консенсусной последовательности 85%: TGGCTG N7 TTGCAAAT. Следовательно, экспрессия гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в период вегетативного роста осуществляется основной формой РНК-полимеразы, а в период стационарной фазы может происходить посредством активации альтернативного с''-фактора. Возможных сайтов связывания с ^-фактором [Petersohn et al., 2001] в промоторе глутамилэндопептидазы не обнаружено. Дальнейший анализ промотора гена глутамилэндопептидазы позволил выявить последовательность нуклеотидов, на 78% идентичную консервативной последовательности, характерной для DegU-зависимых промоторов: AGAT N1(l

TTGAG и ряд последовательностей, имеющих меньшую степень сходства с данным регуляторным участком. Для B.subtilis показано участие DegS/DegU системы в позитивной регуляции синтеза ферментов деградации в присутствии высоких концентраций солей [Kunst, Rapoport, 1995], поэтому присутствие в промоторе глутамилэндопептидазы B.intermedius потенциального участка связывания с DegU-белком позволило предположить, что синтез фермента в условиях солевого стресса находится под контролем DegS/DegU системы. Исследовали биосинтез глутамилэндопептидазы B.intermedius на средах с высоким содержанием солей. При внесении в среду 2 и 2,5 M NaCl уровень продукции протеиназы увеличивался в 3 и в 4 раза, соответственно. Внесение неорганических и органических солей оказывало сравнимый эффект. При внесении высоких концентраций солей к экспоненциально растущим клеткам B.intermedius также происходила индукция синтеза глутамилэндопептидазы, что коррелирует с данными литературы [Kunst, Rapoport, 1995]. Предложенный механизм регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius подтвердили на генетическом уровне - исследовали экспрессию гена протеиназы в мутантном штамме B.subtilis QB4883 с делецией гена degU [Dartois et al., 1998]. Делеция либо инактивация гена degU ведет к репрессии синтеза DegU-зависимых белков [Klier et al., 1992]. Ген глутамилэндопептидазы B.intermedius в мутантном штамме B.subtilis QB4883 не экспрессировался, независимо от концентрации соли в среде. В контрольном штамме B.subtilis с функциональной DegS/DegU системой уровень продукции протеиназы B.intermedius был высоким. Таким образом, для экспрессии гена глутамилэндопептидазы требуется функциональная форма белка DegU.

Возможно, DegS/DegU-опосредованная позитивная регуляция синтеза глутамилэндопептидазы B.interemedius связана с потенциальной ролью данного фермента при адаптации клеток в период стационарной фазы роста. У B.subtilis в условиях осмотического шока индуцируется система адаптационных реакций, основанных на накоплении клеткой низкомолекулярных органических веществ (осмолитов), выполняющих протекторную функцию. В число таких осмолитов входит набор аминокислот, значительную часть которых составляют пролин и глутаминовая кислота. В реализации этого механизма осмоадаптации важную роль играют протеиназы [Sleator, Hill, 2001]. В условиях солевого шока глутамилэндопептидаза может участвовать в накоплении глутаминовой кислоты в клетках B.intermedius, играя важную роль в поддержании жизнеспособности бактерий.

Реакция клеток B.subtilis на тепловой шок, как правило, опосредована активацией транскрипции с^-зависимых генов [Hecker, Volker, 2001]. Описаны механизмы специфического ответа клеток B.subtilis на тепловой [Eyniann et al., 2002] и холодовой шок [Weber, Marahiel, 2002]. Мы исследовали синтез глутамилэндопептидазы в условиях теплового и холодового стресса, варьируя температуру культивирования на разных стадиях развития культуры. Ни в одном из вариантов эксперимента индукции синтеза фермента не обнаружено.

В условиях солевого стресса происходит индукция биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius с участием сенсорно-регуляторной системы, аналогичной DegS/DegU системе B.subtilis. Регуляция биосинтеза фермента не зависит от активации с^-фактора и функционирования специфических механизмов, индуцирующихся при холодовом и тепловом шоке.

Обобщая полученные результаты, можно сделать следующее заключение. Для биосинтеза всех ферментов, использованных в работе, характерна индукция в условиях стресса посредством различных механизмов: реализации SOS-функций клетки либо активации двухкомпонентных систем транедукции сигнала. Исследованные гидролазы являются ферментами стационарной фазы, которая рассматривается в настоящее время как специфическое состояние клеток, формирующееся в процессе комплексной реакции на стрессы, сопровождающие остановку роста и размножения. Переход к стационарной фазе роста является периодом, когда клетка выполняет отдельные функции, связанные с ростом, но также включается экспрессия генов, продукты которых необходимы для выживания в неблагоприятных условиях [Гсшовлев с соавт., 1999; Sanchez, Olmos, 2004]. Одной из важных физиологических функций хитиназ S.marcescens, гуакилепецифичных РНКаз и глутамилэндопептидаз бацилл является их участие в реализации адаптационного резерва клетки под воздействием агрессивных внешних воздействий.

Полученные теоретические результаты предоставляют новые возможности целенаправленного влияния на уровень синтеза практически ценных белков, каковыми являются исследованные ферменты. Такие возможности основываются на моделировании стрессогенных условий и последующей активации соответствующих сигнальных систем в микробных клетках.

выводы

1. Активный синтез исследованных гидролаз: хитиказ S.marcescens, РНКаз бацилл, глутамилэндопептидазы B.intermedius - происходит в стационарной фазе роста культур бактерий, о чем свидетельствует корреляция нарастания удельной скорости накопления ферментов в культуральной жидкости с периодом падения удельной скорости роста культуры. Динамика синтеза бациллярных РНКаз рекомбинантными штаммами E.coli и глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами B.subtilis аналогична таковой для исходных штаммов-продуцентов. Во всех случаях подобраны питательные среды, обеспечивающие высокий уровень продукции гидролаз.

2. У исходного штамма S.marcescens Bu-211 АТСС 9986 обнаружено четыре белка с хитиназной активностью с молекулярными массами 58, 52, 38 и 21 кДа, обозначенные как хитиназы А, В, С и С,, соответственно. Хитиназа А является экзохитиназой, хитиназа В - эндохитиназой. Биосинтез всех ферментов хитинолитического комплекса индуцируется хитином. Синтез хитиназ S.marcescens Bu-211 АТСС 9986 также координирование индуцируется в условиях активации системы SOS-ответа клетки.

3. Штамм S.marcescens Д5, являющийся мутантом с дерепрессированным конститутивным синтезом хитиназ, продуцирующим большие количества ферментов в отсутствие индукторов, может быть рекомендован в биотехнологии в качестве продуцента хитинолитических ферментов.

4. Биосинтез РНКаз B.intermedius и B.pumilus индуцируется посредством активации сенсорно-регуляторной системы PhoP/PhoR в условиях голодания клеток по неорганическому фосфату, что обусловлено наличием в промоторах генов РНКаз B.intermedius и B.pumilus последовательностей нуклеотидов, гомологичных специфическому сайту активации транскрипции генов Pho-регулона. Биосинтез РНКазы B.amyloliquefaciens не подвержен регуляции со стороны данной системы, так как в промоторе гена, кодирующего фермент, отсутствует сайт связывания с регуляторным белком PhoP. Эти данные коррелируют с установленным стимулирующим эффектом на синтез РНКаз B.intermedius и B.pumilus специфического ингибитора транскрипции актиномицина Д при отсутствии подобного эффекта на синтез РНКазы B.amyloliquefaciens.

5. Биосинтез глутамилэндопептидазы B.intermedius подвержен контролю со стороны сснсорно-регуляторной системы DegS/DegU и индуцируется в условиях солевого

стресса. Промоторная область гена глутамилэндопептидазы B.intermedius содержит консервативную последовательность нуклеотидов, необходимую для связывания с белком-регулятором клеточного ответа DegU.

6. Механизмы, связанные с активацией альтернативного ов-фактора, а также специфические механизмы, индуцирующиеся при холодовом и тепловом стрессах, не вовлечены в регуляцию биосинтеза глутамилэндопептидазы

B.intermedius.

7. В условиях стресса биосинтез ферментов, использованных в качестве модельных объектов, индуцируется посредством активации различных адаптационных систем: SOS-системы клетки либо двухкомпонентных систем сигнальной трансдукции.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах

1. Знаменская Л.В. Регуляция биосинтеза внеклеточных рибонуклеаз в исходных бациллярных и рскомбинантных штаммах Escherichia coli / Л.В. Знаменская, Л.А. Габдрахманова. Е.Б. Чернокальская, И.Б. Лещинская И Микробиология. -1995. - Т.64, №5. - С. 616-622.

2. Znamenskaya L.V. Phosphate régulation of biosynthesis of extracellular RNases of endospore-forming bacteria / L.V. Znamenskaya, L.A. Gabdrakhmanova, E.B. Chernokalskaya, I.B. Leshchinskaya, R.W. Hartley // FEBS Letters. - 1995. -V.357 - P.16-18.

3. Габдрахманова Л.А. Влияние компонентов питательных сред на накопление внеклеточных бациллярных рибонуклеаз в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов Escherichia coli / Л.А. Габдрахманова, Л.В. Знаменская, С.И. Краснов, Е.Б. Чернокальская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 1996. - Т.65, №5. - С.599-606.

4. Порфирьева О.В. Хитинолитический комплекс Serratia marcescens и особенности его биосинтеза / О.В. Порфирьева, Д.В.Юсупова, Н.Л. Зоткина, Р.Б. Соколова, Л.А. Габдрахманова // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 3. -

C.347-353.

5. Юсупова Д.В. Физиолого-биохимическая характеристика штамма Serratia marcescens с повышенной хитиназной активностью / Д.В. Юсупова, О.В. Порфирьева, Р.Б. Соколова, А.З. Пономарева, Л.А. Габдрахманова // Биотехнология. - 1997. - № 2. - С.3-9.

6. Габдрахманова Л.А. Влияние актиномицина Д на биосинтез внеклеточных рибонуклеаз спорообразующих бактерий / Л.Л. Габдрахманова, Л.В. Знаменская, И.Б. Лещинская // Антибиотики и химиотерапия. - 1997. - Т.42, № 11. - С.15-21.

7. Gabdrakhmanova L.A. Biosynthesis of endochitinase of Serratia marcescens / L.A. Gabdrakhmanova, E.V. Petukhova, R.B. Sokolova, D.V. Yusupova II Microbios.

- 1998. - V.96. - P.157-163.

8. Gabdrakhmanova L.A. Biosynthesis and localization of glutamylendopeptidase of Bacillus intermedius 3-19 / L.A. Gabdrakhmanova, E.V. Shakirov, N.P. Balaban, M.R. Sharipova, I.B. Leshchinskaya, G.N. Rudenskaya // Microbios. - 1999. - V.100.

- P.97-108.

9. Шакиров E.B. Влияние компонентов питательной среды на накопление глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости Bacillus intermedius 3-19 / E.B. Шакиров, Л.А. Габдрахманова Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2000. - Т.69, №1. - С.29-33.

10. Шарипова М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова. М.А. Шилова, Г.Н, Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2000. - Т.69, №5. - С.660-667.

11. Габдрахманова Л.А. Среда для биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Л.А. Габдрахманова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Г.Н. Руденская, С.В. Костров, Т.В. Акимкина, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2000. - Т.69, №5.- С.653-659.

12. Sharipova M.R. Factors influencing the cellular location of proteolytic enzymes of Bacillus intermedius / M.R. Sharipova, E.V. Shakirov, L.A. Gabdrakhmanova. N.P. Balaban, N.V. Kalacheva, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // Med. Sci. Monitor. - 2000. - V.6, №1. - P.8-12.

13. Ilyina A.V. Chitinolytic complex of Serratia marcescens as the tool in obtaining of low-molecular-weight water-soluble chitosan / A.V. Ilyina, V.P. Varlamov, L.A. Gabdrakhmanova. D.V. Yusupova II In: «Progress on Chemistry and Application of Chitin and its Derivatives» (Ed. By Henryk Struszczyk), V. VII, Lodz, Poland. -2001.-P.57-63.

14. Балабан Н.П. Протеиназы Bacillus intermedius, секретирусмые в поздней стационарной фазе роста / Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова Л.А. Габдрахманова. Ю.С. Токмакова, Е.А. Соколова, И.Б. Лещинская // Вестник Нижегородского университета им. Н.ИЛобачевского, серия Биология.

- Вып. 1 (3). - 2001. - С.45-50.

15. Габдрахманова JI.А. Оптимизация среды культивирования для продукции глутамилэндопептидазы Bacillus intennedius 3-19 / Л.А. Габдрахманова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Ю.В. Токмакова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2002. - Т.71, №3. - С.323-329.

16. Balaban N.P. Proteinases from Bacillus intermedius secreted in the late stages of sporulation / N.P. Balaban, L.A. Gabdrakhmanova. MJR. Sharipova, A.M. Mardanova, E.A. Sokolova, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // Med. Sci. Monitor. - 2002. - V.8, N5. -P.168-171.

17. Юсупова Д.В. Динамика накопления белков с хитиназной активностью в культуральной жидкости мутантного штамма и исходного штамма Serratia marcescens в присутствии митомицина С / Д.В. Юсупова, Е.В. Петухова, Р.Б. Соколова, Л.А. Габдрахманова И Микробиология. - 2002. - Т.71, №5. -С.635-638.

18. Gabdrakhmanova L.A. Optimization of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase production by recombinant strain of Bacillus subtilis and localization of glutamyl endopeptidase in Bacillus subtilis cells / LA Gabdrakhmanova, N.P, Balaban, M.R. Sharipova, S.V. Kostrov, T.V. Akimkina, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // Enzyme Microb. Technol. - 2002. - V.31. - P.256-263.

19. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова. М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2002. -Т.71, №4. - С.494-499.

20. Балабан Н.П. Синтез и секреция протеиназ Bacillus intermedius на поздних стадиях спорообразования / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Л .А. Габдрахманова. А.М. Марданова, Ю.С. Токмакова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2003. - Т.72, №3. - С.338-342.

21. Шарипова М.Р. Мембрано-связанные формы сериновых протеиназ Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова. М.А. Шилова, И.Б. Частухина, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2003. - Т.72, №5. - С. 639-644.

22. Балабан Н.П. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы 2 Bacillus intermedius 3-19 / Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова, Л .А. Габдрахманова. Е.А. Соколова, А.В. Гарусов, Е.И. Мильготина, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская//Биохимия. - 2003. - Т.68, №11. - С. 15141521.

23. Габдрахманова Л.А. Гидролитические ферменты спорообразующих бактерий и их физиологические функции: механизмы корегуляции синтеза и секреции ключевых гидролитических ферментов спорообразующих бактерий и процесса спорообразования / Л.А. Габдрахманова, Н.П. Батабан, В.И. Вершинина,

И.Е. Вишняков // Отчеты Академии Наук Республики Татарстан. - Казань.: Фэн.

- 2003.- С. 228-229.

24. Балабан Н.П. Выделение и характеристика сериновой протеиназы 2 Bacillus intermedius 3-19 / Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова. Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская И Биохимия. - 2004. - Т.69, № 4. - С. 519-526.

25. Balaban N. Selection of cultivation medium for production of late stationary phase serine proteinases from Bacillus intermedius t N. Balaban, L. Gabdrakhmanova. M. Sharipova, E. Sokolova, L. Malikova, A. Mardanova, G. Rudenskaya, I. Leshchinskaya // J. Basic Microbiol. - 2004. - V.44, № 6. - P. 415-423.

26. Частухина И.Б. Регуляция биосинтеза внеклеточной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis на стадии спорообразования / И.Б. Частухина, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова, Н.П. Балабан, Д.Р. Сафина, С.В. Костров, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2004. - Т. 73, № 3. - С. 335-342.

27. Частухина И.Б. Особенности биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными клетками Bacillus subtilis в стационарной фазе роста / И.Б. Частухина, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова. Н.П. Балабан, С.В. Костров, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2005. - Т.74, № 1. - С. 39-47.

28. Gabdrakhmanova L. Salt stress induction of glutamyl endopeptidase biosynthesis in Bacillus intermedius / L. Gabdrakhmanova, I. Vishniakov, M. Sharipova, N. Balaban, S. Kostrov, I. Leshchinskaya // Microbiol. Res. - 2005. - V.160, No 3. - P. 233-242.

29. Габдрахманова Л.А. Влияние экзогенных факторов на продукцию глутамилэндопептидазы штаммом Bacillus intermedius 7Р / Л.А. Габдрахманова // Вестник ТО РЭА. - 2005. - Т. 4, № 26. - 50-55.

30. Gabdrakhmanova L.A. Biosynthesis of glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius, strain 7P / L.A. Gabdrakhmanova // J. Microbiol. Immunol. Inf. - 2006.

- in press.

Патенты

1. Габдрахманова Л.А. Способ получения РНКазы Bacillus intermedius (биназы) с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli SURE pML 163 / Л.А.Габдрахманова, О.Н.Ильинская // Заявка на патент per. № 2006125926.

2. Габдрахманова Л.А. Способ получения РНКазы Bacillus amyloliquefaciens (барназы) с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli SURE pML 416 / Л.А.Габдрахманова, О.Н.Ильинская П Заявка на патент per. № 2006125924.

Статьи в материалах конференций

1. Leshchinskaya I. Molecular cloning of RNases from Bacilli / I. Leshchinskaya, L. Znamenskaya, L. Gabdrakhmanova. E. Chemokalskaya // Proceedings of The П UK Congress of Biotechnology. - Brighton, UK, 1994. - P.28-30.

2. Yusupova D.V. Chitinase of mutant strains of S.marcescens: obtaining, purification, biological activity / D.V. Yusupova, O.V. Porfirieva, R.B. Sokolova, L.A. Gabdrakhmanova // Proceedings of the conference «Ecological effects of microorganism action». - Vilnius, Lithuania, 1997. - P.158-161.

3. Шакиров E.B. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius. Биосинтез и выделение / E.B. Шакиров, JI.А. Габдрахманова. Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Р.К. Хуззятова, А.В. Гарусов, И.Б. Лещинская, Г.Н. Руденская // Материалы XI Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов». - Казань, 1998.-С.70-79.

4. Петухова Е.В. Внеклеточные хитиназы Serratia marcescens и особенности их синтеза / Е.В. Петухова, Л.А. Габдрахманова. Р.Б. Соколова, Д.Р. Сафина, Д.В. Юсупова // Материалы конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана". - Щелково, 1999. - С.276-278.

5. Юсупова Д.В. Накопление белков с хитиназной активностью в культуральной жидкости энтеробактерий Serratia marcescens в процессе роста / Д.В. Юсупова, Д.В. Герасименко, Е.В. Петухова, Р.Б. Соколова, Л.А. Габдрахманова // Материалы VI конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». - Щелково, 2001. - С. 365-368.

6. Габдрахманова Л.А. Биосинтез глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в условиях стресса / Л.А. Габдрахманова // Материалы ХШ Международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». - Казань, 2005. - С. 19-20.

7. Юсупова Д.В. Индукция биосинтеза ферментов хитиполитического комплекса Serratia marcescens в условиях стресса / Д.В. Юсупова, Л.А. Габдрахманова. О.Н. Ильинская // Материалы XIII Международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». - Казань, 2005. - С. 102103.

8. Габдрахманова Л.А. Регуляция биосинтеза хитиназ Serratia marcescens в условиях стресса / Л.А. Габдрахманова // Материалы VIII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». — Казань, 2006. - С. 281-285.

Автор посвящает свою работу любимому Учителю, вложившему свою душу и свой талант в создание и развитие Казанской школы микробиологов, Инне Борисовне Лещинской.

Подписано в печать 02.10.2006, Форм. 60 х 84 1/16. Печать ризографическая. Печ.л. 3,25. Тираж 150. Заказ 379.

Лаборатория оперативной полиграфии УМУ КГУ 420045, Казань, Кр.Позициа, 2а Тел. 272-22-54

Введение

Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследований.

1.1. Характеристики загрязненности рабочих жидкостей.

1.2 Влияние загрязненности жидкости на надежность систем и агрегатов.

1.3. Современные методы и средства очистки жидкости в системах приводов.

1.4. Технические требования к фильтрам.

Выводы.

Глава 2. Закономерности формирования загрязнений в рабочих жидкостях гидроприводов при изготовлении и эксплуатации горной техники.

2.1. Источники и интенсивность поступления загрязнений.

2.2 Физический состав и форма загрязнений.

2.3. Фактический уровень загрязненности.

2.4. Формирование гранулометрической кривой в циркуляционных системах.

Выводы.

Глава 3. Влияние загрязненности рабочей жидкости на надежность и экономичность горных машин.

3.1. Качественные закономерности влияния загрязнений на надежность агрегатов и приводов горных машин.

3.2. Исследование чувствительности агрегатов к загрязнению.

3.3. Типовые требования изготовителей агрегатов к показателям загрязненности и экономически оптимальный уровень 115 чистоты жидкости.

Глава 4. Исследование и разработка систем фильтрации для гидроприводов горных машин.

4.1. Назначение, особенности и состав систем фильтрации применительно к приводам горных машин.

4.2 Разработка методики расчета систем фильтрации.

4.3 Рациональные конструктивные решения при разработке и модернизации систем фильтрации.

4.4 Исходные данные для расчета систем фильтрации.

Выводы.

Глава 5. Основные закономерности работы фильтров как составляющих систем фильтрации гидроприводов горных машин.

5.1 Течение жидкости через пористые перегородки.

5.2 Осаждение частиц загрязнений в структуре пористой перегородки.

5.3 Характеристики поровой структуры и эффективность фильтрования.

5.4. Изменение эффективности фильтрования в процессе работы очистителей в составе привода горных машин.

5.5 Некоторые особенности работы фильтров для очистки воздуха.

Выводы.

Глава 6. Параметрические исследования и разработка фильтров, фильтроэлементов и фильтроматериалов для гидроприводов горных машин.

6.1. Параметрические исследования фильтров со сменными 214 фильтрующими элементами.

6.2. Параметрические исследования фильтрующих элементов.

6.3. Параметрические исследования фильтрующих материалов.

6.4. Разработка фильтров и фильтрующих элементов для гидравлических приводов горных машин.

Выводы.

Глава 7. Экспериментальные исследования систем фильтрации гидрофицированных горных машин.

7.1. Подконтрольная эксплуатация горных машин.

7.2. Методы и средства контроля загрязненности жидкости, применявшиеся в ходе исследования.

7.3. Методы и средства испытаний фильтров и фильтроэлементов, применявшиеся в ходе исследования

7.4. Результаты экспериментальной проверки допущений, положенных в основу принятых расчетных моделей.

Выводы.

Актуальность проблемы. Современные горные машины представляют собой дорогостоящие высокотехнологичные изделия, производство и обслуживание которых требует значительной технической культуры. Эффективность, а зачастую даже область применения техники в большой мере определяется качеством вспомогательных систем, которые должны обеспечить, при интенсивной эксплуатации, функционирование силовых агрегатов в оптимальных режимах.

Очевидно, наиболее значимыми вспомогательными системами такого рода являются системы фильтрации, поскольку как минимум 75% неисправностей и 50% простоев мобильных машин обусловлены наличием загрязняющих частиц в топливе, масле, гидрожидкости и воздухе. Косвенным доказательством важности проблемы очистки рабочих жидкостей является и то, что мировой рынок фильтрационных технологий в секторе мобильной техники возрастает на 20-25% ежегодно.

Освоение в производстве качественных фильтрующих материалов, очистителей, контрольно-измерительной аппаратуры, а также разработка соответствующих расчетно-аналитических методов создает новые возможности для удовлетворения жестких требований к промышленной чистоте, обусловленных ростом энерговооруженности мобильных машин. С другой стороны, эффективность решения конкретных задач очистки рабочих жидкостей осложняется необходимостью осуществления полного комплекса технических и организационных мероприятий на всех стадиях жизненного цикла горной техники: при проектировании, изготовлении и эксплуатации.

Таким образом, научная проблема обоснования выбора параметров и разработки систем фильтрации рабочих жидкостей является актуальной, особенно применительно к гидрофицированным горным машинам, для которых характерны:

1. высокие требования к надежности техники при условии ее работы в широком диапазоне температур и повышенной запыленности окружающего воздуха;

2. постоянное повышение энерговооруженности машин, что диктует необходимость применения современных гидроагрегатов, весьма чувствительных к загрязнению;

Зг. необходимость обеспечения технологических гарантий при эксплуатации сложной и дорогостоящей техники в рядовых условиях горных предприятий;

4. крайняя важность продления эффективных сроков службы машин и агрегатов в условиях дефицита средств на ренованцию.

В диссертационной работе обобщены результаты многолетних исследований, выполненных автором или при его непосредственном участии в ИГД им. А.А. Скочинского, НПО «ВНИИСтройдормаш», Компаниях «АРГИС-Холдинг», AGA Group, Inc. и ЗАО «Могормаш», а также на разрезах ПО «Экибастузуголь», «Кузбассуголь» и ОАО «Якутуголь». Работы велись по отраслевым планам Минуглепрома СССР, Минтяжмаша СССР, а также контрактам и договорам с машиностроительными и горнодобывающими предприятиями.

Цель работы. Целью работы является обоснование, выбор параметров и разработка систем фильтрации для обеспечения надежности и повышения эффективности применения гидрофицированных горных машин

Идея работы. Идея работы состоит в реализации экономически оптимальных систем фильтрации и сопутствующего комплекса эксплуатационных мероприятий на основе изучения качественных и количественных взаимосвязей характеристик надежности гидроагрегатов, параметров загрязненности рабочих жидкостей и фильтрующих устройств.

Методы исследований. При выполнении диссертационной работы использовались методы математической статистики, физико-математического моделирования и системного анализа информации, лабораторные, стендовые и эксплуатационные испытания с применением компьютерной и высокоточной измерительной техники.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Математическая модель гидросистемы с произвольной принципиальной схемой, основанная на уравнениях материального баланса и обеспечивающая прогнозирование загрязненности жидкости, является основой для выбора параметров фильтров и систем фильтрации. При моделировании следует учитывать неравномерность распределения механических примесей по гидролиниям, а также изменение интенсивности поступления загрязнений в функции условий производства и эксплуатации гидрофицированной техники.

2. Деградация критических . характеристик агрегатов под действием механических примесей в жидкости является степенной функцией крупности и линейной функцией концентрации загрязнителя.

3. Установление закономерности изменения затрат на эксплуатацию горной техники от класса чистоты применяемых рабочих жидкостей демонстрируют наличие экстремума, причем по мере повышения энерговооруженности машин, оптимум смещается в сторону улучшения чистоты.

4. Функциональная зависимость перепада давления на фильтроэлементе от вязкости жидкости существенно деформирована по сравнению с регламентированной законом Дарси. Отклонение этой функции от линейности описываются соотношениями:

5. Применительно к системам горных машин установлено, что превалирующее влияние на изменение сопротивления гидравлических фильтрующих элементов оказывает механизм фильтрования с постепенным закупориванием пор. Изменение проницаемости фильтрующих элементов для очистки воздуха имеет место, в основном, за счет фильтрования с образованием осадка.

6. Математическая модель рабочего процесса глубинных фильтров со звездообразной шторой демонстрирует опережающий рост грязеемкости пористой перегородки со снижением скорости фильтрации, причем данный эффект увеличивается с уменьшением отношения АРХ/АР0.

Apv = Арзо * vf/30 * exp(-v/2300) Apv = Арзо* vf/130

500 < vf < 3500 сСт) (3500 <vf< 5000 сСт)

7. Неравномерность распределения частиц механических примесей по сечению анализируемого потока является основной причиной смещения оценки загрязненности жидкости на 15-70%. Изокинетический секторный пробоотбор обеспечивает несмещенную оценку загрязненности с минимальным коэффициентом вариации.

Достоверность и обоснованность научных положений, выводов, результатов и рекомендаций подтверждается: корректным применением аппарата теории надежности, математической статистики, физико-математического моделирования и системного анализа; широким использованием специально разработанных и стандартных методов испытаний, а также результатов независимых экспериментальных исследований для проверки теоретических положений; согласованностью результатов теоретических расчетов с лабораторными, стендовыми и эксплуатационными испытаниями, проведенными с использованием высокоточной измерительной и регистрирующей аппаратуры. Расхождение между расчетными и экспериментальными данными не превышает: для загрязненности жидкости - 50% класса чистоты, для ресурса фильтров - 20%, для перепада давления на фильтрах - 10%, для интенсивности поступления загрязнений - 25%, для деградации критических характеристик гидроагрегатов - 15%. Коэффициент вариации результатов при изокинетическом секторном пробоотборе - до 5%.

Научная новизна работы. Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Определены закономерности формирования загрязнений в системах приводов горных машин, в том числе установлено, что механические примеси неравномерно распределены по различным участкам и гидролиниям гидравлической системы Обоснована взаимосвязь между концентрацией загрязнений и деформацией гранулометрической кривой. Разработана математическая модель, описывающая изменения загрязненности жидкости в произвольных гидролиниях многоконтурных гидросистем с учетом особенностей изменения гидравлического сопротивления фильтроэлементов в процессе работы горной машины.

2. Разработана математическая модель процесса изнашивания гидроагрегатов абразивными частицами. На примере аксиально-поршневых гидропередач показано, что деградация критических характеристик агрегатов под действием механических примесей в жидкости является степенной функцией крупности и линейной функцией концентрации загрязнителя.

3. Разработана модель рабочего процесса глубинных гидравлических фильтров с гофрированной шторой, учитывающая изменение эффективности фильтрования по толщине пористой перегородки, а также особенности гранулометрических параметров загрязнителя, характерного для условий эксплуатации горных машин.

4. Определены закономерности изменения гидравлической проницаемости фильтроэлементов при работе с высоковязкими жидкостями.

5. Установлено, что при моделировании фильтроэлементов необходимо учитывать изменения жесткости фильтрующей шторы, а при их нагружении в ходе стендовых испытаний целесообразно ограничивать концентрацию механических примесей величинами от 0.0001 до 0.0003 % по массе. Практическая ценность. Практическая ценность диссертационной работы:

1. Получены аналитические соотношения для расчета относительного ресурса агрегатов в зависимости от физико-механических свойств загрязнителя и проектируемых параметров нагружения.

2. Предложен комплексный критерий экономической эффективности, позволяющий определить оптимальные, с точки зрения эксплуатационных затрат, параметры систем фильтрации. Использование этого критерия позволяет производить оптимизацию технических решений и, таким образом, отказаться от ранее господствующего и вызывающего необоснованные затраты принципа «чем чище, тем лучше».

3. Разработана концепция обеспечения чистоты жидкости при комбинированном использовании фильтров статистической эффективности: рабочих, выбираемых по критерию долговечности, и страховочных, выбираемых по критерию пропускной способности. Создана'методика расчета систем фильтрации, определены области рациональных параметров и оптимальные точки размещения фильтров в системах гидроприводов горных машин.

4. Разработаны принципы оценки" качества проектирования очистителей, базирующихся на использовании критериев эффективности конструкции корпуса фильтра и фильтроэлемента, - а также коэффициента экономичности фильтроматериала.

5. Разработана методика оптимизационного проектирования фильтрующих элементов с гофрированной шторой, позволяющая обеспечить существенную экономию фильтроматериала при одновременном улучшении потребительских характеристик фильтроэлемента.

6. Разработана приборно-методическая база подконтрольной эксплуатации техники, позволяющая экономично выявлять закономерности функционирования, устанавливать характеристики надежности и определять рациональные пути повышения эффективности эксплуатации горных машин.

7. Создана методика испытаний систем фильтрации, включающая технологические последовательности контроля загрязненности жидкости, тестирования фильтроматериалов, фильтроэлементов и фильтров и обеспечивающая экономичное получение комплексных и сопоставимых данных на всех стадиях жизненного цикла горной машины.

8. Разработаны фильтроэлемента, фильтры и системы фильтрации горного и иного оборудования, в том числе:

8.1. системы фильтрации и автономные (мобильные) фильтрационные установки для гидроприводов горных машин: экскаваторов ЭР-12500Ц, ЭШ10/70, ЭГ-5, 204М, РС-5500, буровых станков DMH, бульдозеров Д355, а также других образцов отечественной и импортной (свыше 60 наименований).

8.2. фильтроэлементы серий 690 и 667, АН, АО, АА и AF.

8.3. фильтр Ум-4680 для гидроприводов горных и строительно-дорожных машин, удостоенный медали ВДНХ за 1989 год.

9. Выполнено методическое обеспечение для программных пакетов: «Escape 01. Программа для выбора параметров карьерных экскавационных комплексов», «FD1.0-1.5. Программа для проектирования фильтров», «ARGIS-Filter DATABASE1.1. База данных для управления предприятием по производству фильтров».

Реализация результатов работы.На основании проведенных исследований, под руководством и с непосредственным участием автора:

1. Внедрены в производство (Компания АРГИС) фильтроэлементы- для горных, строительно-дорожных машин и сельскохозяйственных машин, автомобильной техники и станочного оборудования (около 200 типоразмеров).

2. Внедрена в производство (ОАО «Ижорские заводы») система фильтрации карьерного экскаватора ЭГ-5.

3. Разработаны и внедрены (ОАО ХК «Якутуголь») методика и оборудование для контроля загрязненности и фильтрации жидкости в гидроприводах карьерной техники, а также методика и приборы для подконтрольной эксплуатации карьерного оборудования.

4. Разработаны и внедрены в производство (ЗАО «Горнопромышленная финансовая Компания») мобильные фильтровальные установки для эксплуатации горных машин.

Апробация. Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались на научно-технических совещаниях ГКНТ СССР, Минуглепрома и Минтяжмаша СССР, семинарах ИГД им. А.А. Скочинского, Компаний «Аргис», «Могормаш», а также на 18 конференциях в 7 странах, в том числе:

1. III и IV конференция «Промышленная чистота гидросистем и фильтрация»"

1988 и 1990 г.г., а также семинар «Методы ускоренных испытаний агрегатов тракторов на износ», 1988 г. (Челябинск);

2. 45 научно-исследовательская конференция МАДИ, 1987 г.г (Москва);

3. Национальная ярмарка Пловдив-93 (Пловдив, Болгария);

4. Семинар Международного Общества Фильтрации, 1996 г., (Бирмингем, Великобритания);

5. Международный семинар «Фильтровальные бумаги», 1996 г., Москва;

6. Конгресс Международного общества фильтрации FilTech-97, г. Дюссельдорф, Германия;

7. Национальный Конгресс Американского Общества Фильтрации и Сепарации, 1999 г., Бостон, США;

8. Международный Конгресс Filtration-2000, Филадельфия, США;

9. Международная Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы разработки кимберлитовых месторождений: современное состояние и перспективы решения», 2001 г., Мирный, Якутия;

10.4-ая Международная конференция «Фильтрация на Транспорте», 2004 г., Штутгард, Германия.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 51 печатная работа, в том числе монография и 5 авторских свидетельств.

Структура и объемработы. Диссертация состоит из введения, 7 глав и заключения. Изложена на 374 страницах машинописного текста, включая 212 рисунков, 63 таблиц, список литературы из 233 наименований и 4 приложения.

ВЫВОДЫ

Разработана методика подконтрольной эксплуатации, позволяющая выявить закономерности функционирования, установить характеристики надежности и определить рациональные пути повышения эффективности использования горных машин. Благодаря четкой методической проработке мероприятий, подконтрольная эксплуатация может быть осуществлена силами персонала служб, главного механика, и не требует постоянного контроля силами исследователей или сервис-инженеров.

Разработана-приборно-методическая база для анализа режимов нагружения с целью прогнозирования ресурса агрегатов. Установлено, что средние (эквивалентные) нагрузки на привод горных машин в большинстве случаев существенно ниже номинальных, что, несмотря на высокую динамичность рабочего процесса, обеспечивает возможность существенного повышения реальной долговечности агрегатов за счет более качественного кондиционирования рабочей жидкости.

Обоснованы требования к точности контроля промышленной чистоты в зависимости от задач обслуживаемых экспериментов. Показано, что, учитывая особенности ожидаемых параметров загрязненности и физике исследуемых процессов, можно смягчить требования к точности и, таким образом, уменьшить стоимость контроля жидкости, не жертвуя качеством получаемых результатов. Разработана технологическая последовательность контроля загрязненности жидкости с учетом реальных условий эксплуатации горных машин.

Создана конструкция пробоотборника, обеспечивающего представительную выборку всех "слоев" потока жидкости в трубопроводе. Испытания подтвердили, что'изокинетический пробоотбор с применением разработанной конструкции обеспечивает несмещенную оценку загрязненности с минимальным коэффициентом вариации.

Но основании анализа физических процессов фильтрации, а также номенклатуры используемых в мировой практике тестовых процедур и характеристик пористых перегородок, была определена минимальная информативная совокупность параметров, достаточная для сравнительного анализа фильтроматериалов. К этой совокупности следует отнести: герметичность, проницаемость, сопротивление продавливанию, толщину и базовый вес. Разработана технологическая последовательность сравнительных испытаний. Предложен комплекс испытаний систем фильтрации, позволяющий существенно сократить расходы на. проведение экспериментов за счет использования сопоставимых данных тестирования фильтроматериалов, фильтроэлементов и фильтров в терминах международной системы стандартизации ISO.

6. Экспериментально установлено, что при испытании макетов фильтрующих элементов необходимо, кроме принципов гидродинамического подобия, соблюдать также неизменность характеристик жесткости фильтрующей шторы. Результаты испытаний позволяют сделать вывод, что уменьшение высоты макетов фильтроэлементов с большим вериткальным габаритом более, чем вдвое нежелательно, так как, из-за изменения жесткости гофр, результаты теста в области больших перепадов давления становятся неадекватными.

7. Установлено, что, при использовании метода испытаний фильтроэлементов с многократной циркуляцией вопрос выбора величины рабочей концентрации загрязнений является ключевым с точки зрения обеспечения точности и устойчивости результатов испытаний. Так, для метода с многократной циркуляцией и однократным впрыском загрязнителя оптимальной является концентрация 1 мг/л, поддержание которой позволяет снизить ошибку определения гряеемкости в 3-7 раз, по сравнению с рекомендациями стандартов IS016889 и ISO 4572.

8. Экспериментально подтверждена справедливость теоретического положения об изменении гидравлического сопротивления фильтрующих элементов преимущественно под влиянием постепенного закупоривания пор. При этом погрешность модели незначительно превосходит ожидаемую величину, и составляет около 4%. Параметры поровой структуры фильтроматериалов, равно как и изменение физической природы загрязнителя не приводит к смещению оценки грязеемкости на основании предложенной модели.

Погрешность определения абсолютных величин грязеемкости фильтроэлементов составляет от 10% до 16%, и может быть снижена за счет:

- более точного определения значений коэффициентов отфильтровывания с использованием современных автоматических счетчиков частиц и соответствующих методов статобработки;

- меньших технологических флуктуаций параметров фильтроматериалов с повышением точности их изготовления.

Результаты экспериментальных исследований, проведенных на примере гидроприводов экскаваторов, позволяют сделать вывод о справедливости положения о постоянстве загрязненности жидкости в гидросистеме в процессе эксплуатации. Практически вариация величины концентрации частиц размером 5-100 мкм составляет 8-14%, что сопоставимо с ошибкой измерений.

В диссертации, представляющей законченную научно-исследовательскую работу, решена научно-техническая проблема обоснования, выбора параметров и разработки систем фильтрации, вносящая существенный вклад в ускорение научно-технического прогресса в области создания гидропривода горных машин, что позволяет существенно повысить надежность и эффективность гидрофицированного горного оборудования, а также увеличить конкурентоспособность отечественной техники.

Основные научные и практические результаты заключаются в следующем:

1. Выявлены закономерности формирования, проникновения и удаления загрязнений в рабочей жидкости систем приводов горных машин. Показано, что, несмотря на интенсивную циркуляцию жидкости, механические примеси в гидросистемах распределяются неравномерно, причем характер гранулометрических кривых для различных гидролиний принципиально разный. Это открывает новые возможности для эффективной организации систем фильтрации. Установлено, что применение специальных технологических мероприятий по предотвращению проникновения загрязнений может уменьшить величину интенсивности поступления загрязнений в гидросистемы горных машин в 4-4.5 раза.

2. Определено, что для горных машин 65-80% потерь рабочего времени из-за неисправностей гидроприводов обусловлено воздействием загрязнений в рабочей жидкости. Показано, что поддержание оптимального уровня промышленной чистоты позволяет многократно увеличить ресурс основных агрегатов и безотказность привода в целом. Результатами промышленной эксплуатации подтверждено, что только за счет внедрения рациональных систем фильтрации обеспечивается снижение интенсивности отказов привода в 1.8-2 раза и реализация коэффициента готовности свыше 98%.

3. Моделирование абразивного износа с учетом конструктивных особенностей триад трения в гидромашинах позволило получить соотношения для расчета относительного ресурса агрегатов в зависимости от физико-механических свойств загрязнителя и проектируемых параметров нагружения. Теоретически обосновано и подтверждено результатами экспериментальных исследований, что деградация критической характристики агрегата есть степенная функция крупности и линейная функция концентрации загрязнителя. Выявление количественной взаимосвязи между изменением-выходных характеристик гидроприводов и параметрами загрязняющих частиц позволило создать методику расчета экономической эффективности кондиционирования рабочей жидкости. Данная методика позволяет перейти к проектированию оптимальных систем фильтрации, отказавшись от ранее господствующего и вызывающего необоснованные затраты принципа «чем чище, тем лучше».

4. Выявлены особенности конструкций и условий эксплуатации горных машин, формирующие специфические требования к конструктивному исполнению систем фильтрации. На основе созданных математических моделей разработана методика расчета потребительских характеристик систем фильтрации и выбора параметров очистителей для гидравлического привода с произвольной принципиальной схемой. Предложена концепция обеспечения чистоты жидкости при комбинированном использовании фильтров статистической эффективности: рабочих, выбираемых по критерию долговечности и страховочных, выбираемых по критерию пропускной способности.

5. Определены закономерности работы фильтрующих элементов, в том числе в условиях холодного климата. Установлены новые закономерности изменения перепада давления на фильтроэлементах при изменении вязкости жидкости в широком диапазоне и предложены эмпирические соотношения, обеспечивающие расчет гидравлической характеристики фильтроэлемента с погрешностью не более 6-10%, что в 15-20 раз меньше погрешностей известных методов. Впервые получены уравнения для аналитического прогнозирования ресурса фильтрующих элементов с погрешностью не более 20%, практическое применение которых дает возможность гарантировать бесперебойную работу очистителей в течение всего межремонтного срока горной машины.

6. Разработана методика оптимизационного проектирования фильтрующих элементов с гофрированной шторой, учитывающая характеристики долговечности и позволяющая обеспечить существенную экономию фильтроматериала при одновременном улучшении потребительских характеристик фильтроэлемента. Предложен ряд критериев оценки конструкции фильтров и фильтроэлемеитов, существенно облегчающих выбор параметров покупных и проектирование новых изделий.

7. Разработаны методологические основы экспериментальных исследований, определяющих технологические последовательности контроля загрязненности жидкости, тестирования фильтроматериалов, фильтроэлемеитов и фильтров, и обеспечивающих получение комплексных и сопоставимых данных на всех стадиях жизненного цикла горной машины. В том числе создана приборно-методическая база подконтрольной эксплуатации, включающей анализ режимов нагружения техники и позволяющей экономично выявлять закономерности функционирования, устанавливать характеристики надежности и определять рациональные пути повышения эффективности эксплуатации горных машин.

8. На базе выполненных исследований разработаны и внедрены в производство конструкции фильтрующих элементов общепромышленного применения, в том числе специальные фильтрующие элементы серий «690» и «667» для тяжелых экскаваторов, а также уникальный фильтр Ум-4680 (модификация - АРГИС-Ф-НТ25016010), удостоенный медали ВДНХ СССР.

9. С использованием предложенных методических принципов и технических решений по созданию систем фильтрации разработаны технические задания на создание новых горных машин и комплексов (9 наименований), гидроприводы карьерных экскаваторов (3 наименования), на стадии эксплуатации усовершенствованы системы фильтрации карьерного и иного промышленного оборудования, внедрены системы сервисного обслуживания на горных предприятиях.

10. Разработанные методы, расчетные соотношения и алгоритмы легли в основу создания следующих программных продуктов: Escape 01. Программа для выбора параметров карьерных экскавационных комплексов (1990-1991), FD1.0-1.5. Программа для проектирования фильтров (1992-1997), ARGIS-Filter DAT ABASE 1.1. База данных для управления предприятием по производству фильтров (1993-1995).

1. R.J Wakeman, E.S. Tarleton. Filtration. Equipment Selection Modeling and Process Simulation. Oxford, Elsever Science Ltd, UK, 1999. - 446 p.

2. Удлер Э.И. Фильтрация углеводородных топлив. Томск, Изд-во Томского университета, 1981. 152 с.

3. Удлер Э.И. Фильтрация нефтепродуктов. Томск, Изд-во Томского университета, 1987.-217 с.

4. Коваленко В.П., Ильинский А.А. Основы техники очистки жидкости от механических загрязнений. Москва, Химия, 1982. 270 с.

5. Бродский Г.С., Гозман А.Д., Верескунов В.Н. Фильтры для сливных линий гидросистем мобильных машин и их работа в зоне высоких значений вязкости рабочей жидкости. М., «Мировая горная промышленность», № 3,1997. с. 76-80.

6. Rushton A. General overview of solid/liquid separation technology. Filtech Europa'97. One day course solid/liquid separation, lecture #1. Dusseldorf, Germany, 1997.

7. Жужиков B.A. Фильтрование. M., Химия, 1980 398 с.

8. Бродский Г.С. Повышение надежности гидрофицированных роторных экскаваторов путем создания систем кондиционирования рабочей жидкости. Дисс. к.т.н., М., ИГД им. А. А. Скочинского, 1986

9. Dickenson Т.С. Filters and filtration handbook. Oxford, Elsever Science Ltd, 1997. -1079 p.

10. Rubov K.L. Air Filtration. International conference & exposition. "Filtration'99", Chicago, USA, paper #1.

11. Brown R.C. Air filtration. An Integrated Approach to the theory and Applications of Fibrous Filters. Oxford, Pergamon Press, UK, 1998. 272 p.

12. Crane K.C.A., Morris S.R. Laser-Drilled Stainless Steel Filter Screens ("Laserscreens"): Application Regimes. Advances in Filtration & Separation Technology. V.13b., p. 876 -884. American Filtration & Separation Society, Northport, USA, 1999.

13. Коновалов B.M., Скрицкий В.Я., Рокшевский B.A. Очистка рабочих жидкостей в гидроприводах станков. М, Машиностроение, 1976. 288 с.

14. McCrone W.C., Drafts R.G., Delly J.S. The Particle atlas. Ann Arbor Science Publishing Inc, Michigan, USA, 1976 627 p.

15. Davies C.N. The separation of airborne dust and particles. Proceedings of Inst. Mech. Eng., v. Bl, USA, 1952. p. 185-198

16. Рыбаков K.B., Дмитриев Ю.И., Поляков A.C. Авиационные фильтры для топлив, масел, гидравлических жидкостей и воздуха. М., Машиностроение, 1982. 158 с.

17. П.Григорьев М.А., Борисова Г.В. Очистка топлива в двигателях внутреннего сгорания. М., Машиностроение, 1991 -208 с.

18. Бродский Г.С., Зуев В.И., Кирсанова К.Ш. Определение ресурса бумажных фильтрующих элементов для гидравлических приводов. М., «Вестник машиностроения», 1992, №3, с.29-32.

19. Тимиркеев Р.Г., Сапожников В.М. Промышленная чистота и тонкая фильтрация рабочих жидкостей летательных аппаратов. М., Машиностроение, 1986 152 с.

20. Киселев М.М. Топливно-смазочные материалы для строительных машин: Справочник. М., Стройиздат, 1988-271 с.

21. Золотарь А.И., Гольдбухт А.Е. Разработка технологии изменения служебных свойств минеральных масел, прошедших эксплуатацию в карьерном оборудовании, для их вторичного использования. Отчет ИГД им. А,А,Скочинского №0103612000, 1994 г.-31 с.

22. Акинфиев А. А. Современные конструкции зарубежных пневмоколесных экскаваторов. М., ЦНИИТЭСтроймаш, 1990. 57 с.

23. Алексеев В.И., Марченко С.Ю.,Одинцов В.А. и др. Определение классов чистоты рабочих жидкостей на экскаваторах ЭО-3322А, Оборудованных фильтрами линейными и центробежным сепаратором. Отчет №ЭК-2/505-81, Красноярск, КФ ВНИИСтройдормаш, 1982 г. -64 с.

24. Advances in engine filtration media. Filtration & Separation, Oxford, V.37, №10 (December), 2000, p.20-23.

25. Башева A.A., Балашова H.A., Филлипов Б.И. и др. Исследование надежности гидрооборудования строительных и дорожных машин в эксплуатации. Отчет Х-Д М290987. М.,МАДИ, 1987 г. 131 с.

26. Mc.Crone W.C., Drafts R.G., Delly J.S. The particle atlas. Michigan, Ann Arbor Science Publishers Inc., 48106,1976 - 627 p.

27. Purchas D. Handbook of filter media. Elsevier Science, Oxford, UK, 1996. 577 p.

28. Сушкова Г.Н. Результаты обработки методами матстатистики исследований по загрязненности рабочих жидкостей и смазочных масел горно-шахтного оборудования. В сб.: Промышленная чистота гидросистем и фильтрация, Челябинск, 1983, с. 41-43

29. Финкельштейн 3.J1. Применение и очистка рабочих жидкостей для горных машин. М., Недра, 1986 г.-232 с.

30. Белянин П.Н., Данилов В.М. Промышленная чистота машин. М., Машиностроение, 1982 г. -224 с.

31. Барышев В.И., Максакова И.В. Классификация загрязнений по качеству. М., «Мировая горная промышленность», № 3, 1997 г. с. 57-62.

32. Дрекслер П., Фаатц X., Файхт Ф. Проектирование и сооружение гидроустановок. Учебный курс гидравлики, том 3. Mannesmann Rexroth, RSU 00 281/10.88, Lor-am-Main, 1988-375 p.

33. Бродский Г.С., Сухорукое А.Н., Зуев В.И., Башева А.А. Результаты испытаний фильтров и фильтрующих элементов для СДМ. М., «Строительные и дорожные машины», №11-12,1992, с.7 -9.

34. Никитин Г.А., Чирков С.В. Влияние загрязненности жидкости на надежность работы гидросистем летательных аппаратов. М., Транспорт, 1969 г. 183 с.

35. Башта Т.М Машиностроительная гидравлика. М. Машиностроение, 1971 г. 670 с.

36. Рокшевский В.А., Татьков В.В., Ливада Г.Ф., Рябошапка В.М. Снижение содержания воздуха и воды в рабочих жидкостях гидравлических систем. М., НИИмаш, 1981 г.-58 с.

37. Скрицкий В.Я., Рокшевский В.А. Эксплуатация промышленных гидроприводов. М.,Машиностроение, 1984 г. 176 с.

38. Барышев В.И. Повышение технического уровня и надежности гидропривода тракторов и сельхозмашин в эксплуатации. Афтореферат дисс. д.т.н., М.,МИИСП, 1991 г.-39 с.

39. Рыбаков К.В. Фильтрация авиационных топлив. М., Транспорт, 1977 г. 164 с.

40. Белянин П.Н. Центробежная очистка рабочих жидкостей авиационных гидросистем. М., Машиностроение, 1976 г. 328 с.

41. Очистка рабочей жидкости в гидроприводах металлообрабатывающего оборудования. Методические рекомендации. М., НИИмаш, 1982 г. 55 с.

42. Козин Г.Ю., Бродский Г.С., Мельников А.С. Современные карьерные гидравлические одноковшовые экскаваторы. М., ЦНИЭИуголь, 1989 38 с.

43. Kyung-Ju Choi, Qing Ye. Simulation of air filtration through fibrous media using the Monte-Carlo method. Fluid/Particle Separation Journal, V.l 1, No.3, 1998, p.290-299

44. Jena A.K., Gupta K.M. Pore size distribution in filter materials. Filtration-99. Book of Papers. Chicago, 1999, p. 23/1-23/11

45. R.G.Akers, G.I.Stenhaus, rep. C92/76, "Contamination in fluid power systems/ Univ.of Bath, 13-15 April 1976", London New York, 1977, pl44.

46. Блюмин C.B. Исследование влияния гидравлических сопротивлений и тепловых режимов на параметры объемных гидроприводов горных машин для открытых работ. Дис. к.т.н., М.,1980, с.179.

47. Бродский Г.С., Верескунов В.Н. Эффективные методы пробоотбора для оценки загрязненности рабочей жидкости в гидравлических системах. М., «Мировая горная промышленность», № 3,1997 г. с. 63-69.

48. Fitch Е., Iengar S. Filter selection for fluid power systems.-Proceeding Conf. Fluid & Automatic, 1976, p.Bl/l-Bl/14.

49. Кошеленко Г.П. Гидрообъемный и гидродинамический привод строительных и дорожных машин. Строительные и дорожные машины. М., 1984, №4, с.14-15.

50. Степнов М.Н. Статистическая обработка результатов механических испытаний. М., "Машиностроение", 1972 г. 232 с.

51. Абрамов Е.И., Колесниченко К.А., Маслов В.Т. Элементы гидропривода. Справочник. Киев, Техника, 1969 г. 319 с.

52. Molter L., Lindenthal G. How to measure the fractional grade efficiency correctly for ISO 9000. Filtration & Separation, Oxsford, #9 (September), 1995, p.6

53. CHEMetrics Inc., Perfecting simplicity in water analysis. Calverton, USA, 2000 40 p.

54. Сапожников B.M. Монтаж и испытания гидравлических и пневматических систем летательных аппаратов. М., Машиностроение, 1979 г. 256 с.

55. Смирнов Н.В., Дудин-Барковский В.И. Курс теории вероятностей и матстатистики.М.,"Наука",1969 г. 511 с.

56. Crow E.L., Davis F.A., Maxfield M.W. Statistics manual. Dover Publications, NY, USA, 288 p.

57. Fitch E.C. Fluid contamination control. FES Inc., OK, USA, 1988 433 p.

58. Волков Л.И. Управление эксплуатацией летательных комплексов. М., Высшая школа, 1981 г.-368 с.

59. Беленков Ю.А., Нейман В.Г., Селиванов М.П., Точилин Ю.В. Надежность объемных гидроприводов и их элементов. М., Машиностроение, 1977 г. 167 с.

60. Oliver G.W. Uber die Wirtschaftlichkeit der Uberwaschung der Verschmultzung bei Hydrauliksystemen von Werkzeugmaschinen Technica, 1971, No. 19, s. 1845-1848

61. Морсин B.M., Васильченко B.A. и др. Разработка методики испытаний аксиально-поршневых гидромашин. Отчет П-1622, ЦНИП ВНИИСтройдормаш, 1981 г. 341 с.

62. Адлин А.И. Совершенствование структуры и выбор параметров гидропривода карьерных роторных экскаваторов. Дисс. к.т.н., М., 1983,214 с.

63. Подшипники качения. Каталог-справочник. М., НИИТавтопром, 1972 г. -465 с.

64. Трение между поршнем и цилиндром аксиально-поршневых гидромашин. Экспресс-информация. Серия «Детали машин», №27, Реф. 152, М., ВИНИТИ, 1979 г.-38 с.

65. Докукин А.В., Рогов А.Я„ Фейфец Л.С. Радиально-поршневые гидромоторы многократного действия. М., Машиностроение, 1980 г. 288 с.

66. Ptak Т. J., Tondeau Al, Martin Al. Initial gravimetric and fractional efficiencies of engine air filters. Advances in Filtration and Separation Technology, V.13a, USA, Boston MA Northport Al, USA, 1999, p. 28-33.

67. Икрамов У.А. Расчетные методы оценки абразивного износа. М., Машиностроение, 1987 г. -288 с.

68. Кащеев В.Н. Аброазивное разрушение твердых тел. М., Наука, 1970 г. 248 с.

69. Fitch Е.С., Bench L.S. A new theory for the contaminant sensitivity of fluid power pumps. 72-CC-6, Six Annual Fluid Power Conference, FPP Center, Oklahoma State University, Stilwater, OK, USA, 1972. p. 72-81.

70. Хрущов М.М., Бабичев М.А. Исследования изнашивания металлов. М., Изд-во АН СССР, 1960 г.-234 с.

71. Крагельский И.В., Алисин В.В. и др. Трение, изнашивание и смазка. Кн. 2. М., Машиностроение, 1979 г. 358 с.

72. М.М. Тенненбаум. Износостойкость конструкционных материалов и деталей машин при абразивном изнашивании. М., Машиностроение, 1966 г. 331 с.

73. Лозовский В.Н. надежность гидравлических агрегатов. М., Машиностроение, 1974 г. -320 с.

74. Яременко О.В. Рекомендации по проведению подконтрольной эксплуатации насосов. М., Цинтихимнефтемаш, ХМ-46 №5, 1975 г. 34 с.

75. Sommerfeld A. Zur Hydrodynamishen theorie der Shmiermittel-reibung. Z.Math.Physik, vol.50, 1904, p. 97-155

76. Hydrodynamic Bearing Design. Lecture 26. The University of Tennessee at Martin, Martin school of engineering, 24 p. www.utm.edu, 2002.

77. Козырев С.П. Гидроабразивный износ металлов при кавитации. М., Машиностроение, 1971 -217 с.

78. Bugli N. Engine air induction filters competitive evaluations and design factors. "Filtration'99", Chicago, USA, paper #18.

79. Treuhaft M.B. The use of radioactive tracer technology to measure engine ring wear in response to dust ingestion. SAE Technical paper 930019, 1993.

80. Schwant B.W. Influence of lube oil filter performance on engine wear in city buses. SAE Technical paper 902238,1990.

81. Ptak T.J. Advances in automotive liquid filtrtation. "Filtration'2001", Chicago, USA

82. Staley D.R. Correlating lube oil filtration Efficiencies with engine wear. SAE Technicalpaper 881825,1988.

83. Brodski G. Fluid & air purification in industrial hydraulic drives. Filtration 2000, Philadelphia, USA, 2000,15 p.

84. Brodski G. Current Development of Filter Media & Cartridges for Automotive & hydraulic Systems. Dusseldorf Europe Filtration Congress. Filtech'99, p. H35-H48.

85. Бродский Г.С., Даутов P.P., Слесарев Б.В. Системы обеспечения надежности гидропривода инструмент внедрения современной карьерной техники на горных предприятиях России. М., «Горная промышленность», №1, 2002, с. 45- 49.

86. Двайт Г.Б. Таблицы интегралов и другие математические формулы. М., Наука, 1983 -176 с.

87. ATICO Internormen - Filter. Highest technology and quality for hydraulic and lubricating-oil systems. Zanesville, Ohio, USA, 2001 - 8 p.

88. Rausch, K. Which filters are most effective? Hydraulics & pneumatics, February 2002, p.31-33.

89. Faisandier J. La filtration des fluids hydrauliques. Energie fruide, 1977, №94, s.l, p. 55-61.

90. Pall Corp. Contamination control for industrial fluid systems. Filter assemblies. www.pall.com, 2002 r.

91. Donaldson. Industrial Hydraulics. High pressure filters, www.donaldson.com, 2002 r.

92. Parker filtration. Hydraulic filtration division. Low/medium/high pressure filters. www.parker.com, 2002 r.

93. Васильченко B.A., Житкова C.A., Акользина JI.C. Под ред. Гречина Н.К. Гидравлическое оборудование строительных, дорожных и коммунальных машин. М., ЦНИИТЭстроймаш, 1978,468 с.

94. С.Ю.Суровиков, В.В.Гордиенко, В.А.Сучков и др. Исследование эффективности сливных (линейных и встроенных) и воздушных фильтров в гидросистемах экскаваторов 3,4 и 5 размерных групп, П-2177. М., 1988,64 с.

95. Изделия марки Filtron. www.filtron.ru. 2002 г.

96. Filter Factory, Inc. Quality air filters and filtration systems, USA www.thefilterfactory.com, 2002 r.

97. Ideas and applications. Filter includes automatic pulsating self-cleaning system. Hydraulic and pneumatics, March 2002, p. 10.

98. Tell-Tale tank mounted return line filters, Parker Hannifin PLC, Great Britain, 1884,12 p.

99. Стенды СОГ повышают чистоту систем ГПА. Прогрессивные технологии, М., www.sogl.narod.ru, 2002 г.

100. It's clear. The Donaldson TopSpin™ pre-cleaner can maximize your intake system. Donaldson Company Inc., MN, USA, brochure No. F111107,2002,4 p.

101. Spinner II Moder 400 HD oil cleaning centrifuge. T.E.Hungins Inc., TX, USA, 2002, 2 P

102. Oiltech environmentally conscious products, www.oiltech.com, 2002.

103. Filtration of the future. The world finest magnetic system protection. www.magnom.com, 2002

104. Dahl diesel fuel filter/water separator solves fuel system problems. www.dieselsite.com, 2002

105. Свешников B.K., Усов A.A. Станочные гидроприводы. Справочник. М., машиностроение, 1988 г., 512 с.

106. Понизовкин А.Н., Власко Ю.М., Ляликов М.Б. и др. Краткий автомобильный справочник. М., НИИАТ, 1994 г., 779 с.

107. Удлер Э.И., Зуев В.И. Фильтрующие топливно-масляные элементы из бумаги и картона. Томск, Изд-во Томского университета, 1983,140 с.

108. Nalle Plastic Inc. The evolution of extruded thermoplastic netting. Filtration & Separation, v.23, No. 10,1996.

109. Williams С J Testing the performance of spool wound cartridge filters. Filtration and Separation 29(2), 1992, p. 162-168.

110. Yarn wound cartridges. Pyramid Technologies Inc., www.pyramidfilters.com, 2002

111. Filtration plastic netting and tubing. InterNet, Inc., MN, USA, 2000. 5 p.

112. METALEX. Manufacturer of quality expanded metal. IL, USA, 2000.11 p.

113. Helix International. Why use spiral filter cores? www.helixinternational.com, 2002

114. Perforated Tubes, Inc. Range of wall thickness for various tube diameters. www.perflubes.com, 2002

115. Naltex. Precision flow control. Biplanar filtration netting. Nalle Plastics, Inc., TX, USA,2000. lip.

116. Клеи и заливочные массы для фильтровальной промышленности. Доклад фирмы Клейберит. Семинар по фильтрационным материалам. НАМИ, Москва, 2002 г. 34 с.

117. Murphy W.F. The effect of surface area on dust capacity. Dixie Chapter of AFS, October 23, 1997, 18p.

118. Automotive filter paper. Modern phenolic resins. Gessner & Co. GbmH, News & Facts, №2

119. Automotive filter paper. HP-High performance. Gessner & Co. GbmH, News & Facts, №12

120. H.-R. Petri, A.Voss. ECONOFIL. Economical filter paper with excellent performance. Paper 29/99E, J.C.Binzer, Germany, 2000, 8. p

121. Grafe Т., Cogins M., Barris M., Schaefer J., Сапера R. Nanofibers in filtration applications in transportation. Filtration'2001, Chicago, USA

122. Willis A. Air filtration using glass fiber media. The Journal of the filtration society, UK, V.2(2), 2002, p.p. 13-15

123. Petri H-R. Low energy curing filter papers. Paper 15/96 GB, J.C. Binzer, Germany, 2000,6 p.

124. Battenfield J. A new generation of filter media for hydraulic oil. Paper 29/99 E. J.C. Binzer, Germany, 2000,6 p.

125. Technostat Technical Data. Hepworth Air Filtration, Filtration'98, Atlantic City, USA

126. Texel Filter Media Performance. Texel Inc., Filtration'98, Atlantic City, USA

127. Battenfield J. laminated media for liquid filtration. Paper 17/97 E. J.C. Binzer, Germany, 2000,6 p.

128. Precision metal mesh. InterNet, Inc., MI, USA, 2001, 8 p.

129. HYDAG Filter Elements. Product catalogue. Hydac, Germany, 2002.11 p.

130. Fuel filter that absorbs free water. Product news. Filtration & Separation, Oxsford, V.37, №10 (December), 2000, p. 14.

131. Johnston P.R. The viscous permeability of a mat of randomly arrayed fibers as a function of fiber diameter and packing density. Fluid/Particle Separation Journal, 2,1989, p.15-16.

132. Johnston P.R. The permeability of filter medium. Filtaraton news, V.17, №4, p.p.80-81,66,1999.

133. Johnston P.R. About pore-size distribution. Filtaraton news, V.17, №3, p.p.52-54, 1999.

134. Klein G.-M., Durst M., Banzhaf H. Filtration requirements and new filtration concepts for modern diesel injection systems. The Journal of the filtration society, UK, V.2(2), 2002, p.p.30-33

135. Gustavsson J. Can we trust air filters? Filtration & Separation, Oxsford, V.37, №2 (March), 2000, p. 16-22.

136. Whitt R.Estimating mean flow pore of fibrous webs. Fluid/Particle Separation Journal, V.3, №3, 2000, p. 189-192

137. Bugli N., Bennet C., Smith B. Performance and service life of engine air cleaner. The Journal of the filtration society, UK, V.l(2), 2001, p.p.7-11

138. Jaroszcyk Т., Fallon S.L., Connor M.J. Filtration performance of high efficiency cabin filters for operator protection in dusty environments. Fluid/Particle Separation Journal, V.13,№2,2000, p. 156-164

139. Kyung-Ju Choi. Designing Multi-layered filtration media. Filtration 2000, Philadelphia, USA, 2000, 3 p.

140. Rucker J. Reticulated polyurethane foam for the filtration industry. Filtration 20001, Chicago, USA, 2001, 12 p.

141. Sonic Dry Clean, Inc. world leader in air filter cleaning technology. CA, USA, 2000.48 p.

142. Tsai P.P. Defects in nonwoven filter media on filtration. Advances in Filtration & Separation Technology. V.13a., p. 71 82. American Filtration & Separation Society, Northport, USA, 1999.

143. Fletcher R.A., Verkouteren J.R, Windsor E.C и др. SRM 2806 (ISO medium test dust in hydraulic oil): a particle contamination standard reference material for the fluid power industry. Fluid/Particle Separation Journal, V.12, №2,1999, p.80-93

144. Particle technology for quality assurance and research. PALAS, Partikel-und lasermeBtechnik, Karlsruhe, Germany, 1999, 12 p.

145. Чертов А.Г. Единицы физических величин. М., Высшая школа, 1977,287 с.

146. Chevron research and technology Co. Glossary of termsand tests. Lubricant services group, Chevron R&T Co., USA, 2000, 78 p.

147. HUTTE справочная книга для инженеров, архитекторов, механиков и студентов. Изд. 13, М., Государственное книжное издательство, 1931 г., Т.1, 1448 с.

148. Matthews С. ASME engineer's data book. The American Society of Mechanical Engineers, USA, 251 p.

149. Докукин A.B. Основные проблемы горной науки. М., Недра, 1979,383 с.

150. Fluid and contamination control. Hydraulic fluid power fixed displacement pumps/ Flow degradation due to classified AC fine test duat contamination. ISO/TC 131/SC6(WG6-4) 189,1981, 8 p.

151. Kerschmann R. DVI: Digital volumetric imaging. A new technology for high-resolution three-dimentional simulation and microanalysis of fiber-based materials. "Filtration'2001", Chicago, USA

152. Sintered porous media bronze. Porvair, UK, 2000.2 p.

153. DAHL diesel fuel filter/water separator, www.dieselproducts.com, 2002.

154. Пономарев H.H., Григорьев M.A., Борисова Г.В., Усанов Ю.А. Фильтры для очистки топлива и масла автомобильных и тракторных двигателей. Обзорная информация. М, НИИАвтопром, 1979,43 с.

155. Steel Breathers. Des-Case Corporation, www.des-case.com, 2002

156. Relief vents. Bulletin F1297-4. Lube Devices, Inc., www.lubdevices.com, 2002

157. High pressure in-line 4300 & 4400 series filters. Norman Filter Company, LLC, www.normanfilters.com, 2002

158. Filter Ratings: Impact of Test Dust Changes on Filter Performance. Pall Corporation, www.domino.pall.com, 2002

159. History of filtration (After F.M.Tiller). Fluid/Particle Separation Journal, Vol.14, №1,2002, p.39-42

160. Impact of changes to ISO Standards on reported filter performance and fluid cleanliness. Pall Corp., www.pall.com, 2002.

161. Hoeg A., Mirad R. What is dynamic filter efficiency? Hy-Pro Corp., www.filterelement.com/DFE.pdf, 6 p.

162. Маев B.E., Бродский Г.С. Проблемы качества фильтрующих элементов, производимых в России. «Стандарты и качество», №7, 1999, с. 80-84

163. Lofiis T.S., Lanius М. A new method for combination full-flow and bypass filtration: Venturi Combo. Fleetguard division of Cummins Engine Co., paper No. 972957, Society of Automotive Engineers, Inc., USA, 1997, 6 p.

164. Stehouwer D.M. Effects of extended service intervals on filters in diesel engines. Proceedings of International Filtration Conference, Southwest Research Institute, USA, 1996.

165. Butler J.L., Stewart J.P., Teasley R.E. Lube oil filtration effect on diesel engine wear. SAE paper No. 710813,1971.

166. Ponice A.L., Schmitt R.H. Modern hydraulic fluids balanced performance testing. HPMP, August 1977, P. 307-312.

167. TripleR. Excellence in oil filtration. Micron rated filter element for all hydraulic oils. Triple R Manufacturing, Inc., www.triple-rrr-oilcleaner.com, 2002

168. The concept of FiltrOil oil management system. FiltrOil North America, http://www.filtroil.com, 2002.

169. Мингалев А. А. Снижение динамической нагруженности фильтров гидросистемы трактора. Труды НПО «НАТИ»: Исследование гидроприводов промышленных тракторов, М, 1984, с. 25-30.

170. Giant cartridge housing. Bui. No. GH-1, Keystone filter division, USA, 1997,4 p.

171. Ultra High Efficiency Radial Seal Filters. Caterpillar, USA, www.cat.com, 2002

172. Laminated nonwoven metal fiber filters. Fuji filter MFG Co. Ltd, Japan, www.fujifilter.co.jp, 2002

173. Leakage measurement system. REN Corporation, USA, www.rencorp.com, 2002.

174. Complete PMI Product Listing. Porous Materials Inc., USA, www.pmiapp.com, 2002

175. Бродский Г.С. Основные принципы и методы разработки экономически целесообразных систем фильтрации для гидрофицированных машин. М., «Мировая горная промышленность», № 3, 1997 г. с. 45-57.

176. Jaroszczyk Т., Fallon S.L., Pardue В.А. Analysis of engine air cleaner efficiency for different size dust distribution. Fluid/Particle separation journal, V.14, №2, p. 75-88, 2002.

177. Poon W.S., Liu B.Y. A bimodal loading test for engine and general purpose air cleaning filters. SAE Technical Paper №970674,1997.

178. Kittelson D.B., Watts W.F., Johnson J.P. Fine particle emission on Minnesota Highways. University о Minnesota, MN/RC-2001-12,2001.

179. Barris M. High density packing technology for advanced air intake system -POWERCORE™. Donaldson Co., 5th International Filtration Conference, Stuttgart, 1st day, p. 50-64,2002.

180. Forna R. Water-fuel separation filter an unavoidable choice for the diesel direct injection system. Ahlstrom, 5th International Filtration Conference, Stuttgart, 1st day, p. 70-75,2002.

181. Knuckmann K., Kolczyk M., Fluid management with oil and diesel fuel filter systems. Mann+Hummel, 5th International Filtration Conference, Stuttgart, 1st day, p. 23-27,2002.tVi

182. Hudhes V. Can a quantitative contaminant specification be released for a jet fuel. 5 International Filtration Conference, Stuttgart, 1st day, p. 28-31,2002.

183. Rao P.B., Tao X., Wegrzyn K. Cyclic multi-pass test with vibration and other test variables. 5th International Filtration Conference, Stuttgart, 1st day, p. 65-69,2002.

184. Butler I., Bergmann L., Homonoff E., Weismantel G.E. The filtration technology handbook. INDA, Raleigh, USA, 37 p., 2002.

185. High efficiency, high dust loading and low pressure drop in single layer material. Sandler AG. Filtration+Separation, Nov., 2002. p.40-41.

186. Rudolf A., Peters C., List S. Testing of air filters for car cabins F&S International edition, №1,2001, p.40-43.

187. Бродский Г.С. Эффективность современных фильтрационных технологий при эксплуатации горных машин. М., Горная промышленность, №5, 2002, с. 2-6.

188. Jena A., Gupta K. Measurement of pore volume and flow through porous materials. A non-mercury novel technique. Material testing, Munchen, Germany, #6,2002,4 p.

189. Gupta K., Jena A. Substitution of alcohol in porometers for bubble point determination. Advances in Filtration & Separation Technology. V.13b., p. 833 844. American Filtration & Separation Society, Northport, USA, 1999.

190. PMI porometers. Porous Materials, Inc., Ithaca, NY, USA, 2002, 8 p.

191. Room air and vacuum cleaner filtration media. Hollingsworth & Vose Co., USA, 2002, 6 p.

192. Guide to oil system monitoring in aircraft gas turbine engines. Aerospace information report AIR#1828, SAE, 1984, p.

193. Madhavan P. Monitoring fluid system debris via diagnostic filters. Pall Corp., www.pall.com, 2002

194. Бродский Г.С., Шмарьян E.M., Гавинский IO.А. Инструментальный комплекс для исследования и контроля эксплуатационных параметров тяжелых экскаваторов. В книге: 10-я Конференция по молекулярной электронике, Краснодар, 1986 г.

195. Data acquisition devices (Dataloggers), www.omega.com, 2002

196. Hydac International. Test point series 1620. Hydac technical Corp., Hycon division, USA, 2002,4 p.

197. Sullivan R.C., White D.J., Jeude M.J. US Army helicopter hydraulic system cleanliness: observations & possible solutions. 5th International Filtration Conference, Stuttgart, 2st day, p. 1-6, 2002.

198. Mayer E. Porometry characterization of filter media. Filtaraton news, V.20, №5, p.p. 12,14,16,18,20,22,24,2002.

199. Johnston P.R. Whadaya mean? Filtaraton news, V.20, №5, p. 10-11,2002.

200. Tank Mounted Return Line Filter. Type T / Model TTF. Parker Filtration BV -Parker Arlon, Netherlands, 2003, 8 p.206. 12AT/5 OAT Series. Spin-on filters. Parker Hannifin Corp., USA, 2003, 8 p.

201. Donaldson Company selected to develop filtration system for U.S. Army Abrams-Clusader common engine program, www.donaldson.com, 2003.

202. You've got the power; we've got the protection. Centriguard centrifugal filters. Fleetguard, USA, 2002,6 p.

203. Introducing Donaldson Powercore Filtration Technology. A compact air filter that outperforms the others. Catalogue. Donaldson Co., USA, 2003,6 p.

204. Fluid power accessories. Catalogue. Arrow Pneumatics, USA, 2002,15 p.

205. Porous metal design guidebook. Metal Powder Industrial Federation (www.mpif.org), USA, 2003,24 p.

206. Mould list. High porous sintered bronze. GKN Sinter Metals, USA (gkn-filters.com), 2002,21 p.

207. Filter Elements. High porosity sintered materials. GKN Sinter Metals, USA (gkn-filters.com), 2002, 28 p.

208. Kasmark W.J. Activated carbon: Why it used? How does it work? How it applied in HVAC applications? D-Mark, Inc., USA, 2000.

209. Гаевик Д.Т. Справочник смазчика. M., Машиностроение, 1990,351 с.

210. Технико-эксплуатационные характеристики машин фирмы Caterpillar. Справочник. США, 1997,2618 с.

211. Бродский Г.С. Фильтры и системы фильтрации для мобильных машин. М., Горная Промышленность, 2003, 359 с.

212. Бродский Г.С., Слесарев Б.В. Повышение надежности гидропривода и совершенствование управления эксплуатацией мощных экскаваторов с использованием измерительно-информационных комплексов. «Гидравлика и Пневматика», №18,2005, СПб.

213. Матвеенко A.M., Зверев И.И. Проектирование гидравлических систем летательных аппаратов. М., Машиностроение, 1982,296 с.

214. Brodski G. Off-line and bypass filtration solutions for the hydraulic drives of mobile machines. Filtration in transportation. 4th Int. Conference, Stuttgart, Germany, 2004

215. Мышляев Б.К. О направлении работ по дистанционному и автоматизированному управлению комплексами. «Уголь», 1995, №9, с. 45-46

216. Докукин А.В., Красников Ю.Д., Хургин З.Я. Статистическая динамика горных машин, М., Машиностроение, 1978,239 с.

217. Бродский Г.С. , Одинцов В.А. Разработка сапунов для гидробаков строительных и дорожных машин. В сб. Промышленная чистота гидросистем и фильтрация, Челябинск, 1990.

218. Голего Н.Л. Внешние признаки видов изнашивания деталей машин. Альбом. Киев, Изд.ин-та ГВФ, 1961,134 с.

219. Бродский Г.С„ Этингоф Е.А„ Гозман А.Д. Методы диагностики гидроприводов экскаваторов. ЦНИИТЭИтяжмаш, вып.2, №7, 1987

220. Бродский Г.С„ Этингоф Е.А„ Гозман А.Д. Диагностика состояния гидромашин как средство повышения надежности карьерных гидравлических экскаваторов, Научные сообщения ИГД им. А.А. Скочинского, 1988, с. 66-75

221. А.С.Мельников, Г.С.Бродский, А.Д.Гозман. Стенд для испытаний гидроагрегатов на чувствительность к загрязнению. АС №950949 F04B51/00, 1988.

222. Башева А.А., Балашова Н.А., Бродский Г.С., Соловьев С.В. Определение эффективности фильтров для очистки рабочих жидкостей на байпасной линии в гидросистемах экскаваторов. Отчет №291288, МАДИ, 1989, 127 с.

223. Козин Г.Ю., Мельников А.С., Бродский Г.С., Гозман А.Д. Способ регенерации фильтроэлемента. АС №1542575 B01D29/62,1990.

224. Балабышко А.М., Зимин А.И. Гидродинамическое диспергирование. М., Наука, 1998,338 с.

225. Определения основных параметров фильтров

226. Абсолютная тонкость фильтрации (АТФ): размер частиц, 100% которых задерживается фильтром

227. Номинальная тонкость фильтрации (НТФ): размер частиц, 95% которых задерживается фильтром

228. Средняя (медианная) тонкость фильтрации (СТФ): размер частиц, 50% которых задерживается фильтром

229. Коэффициент отфильтровывания (P;r): величина, рассчитываемая по формуле:1. PiR = (Nn-Ni2)/Nn

230. Здесь Nil ? Ni2 количество частиц размерной группы (i) соответственно до и после фильтра. Частица принадлежит размерной группе i{ dimin, dimax}, если dimin < х < dimax , х - размер частицы;

231. БЕТА-коэффициент (Рх): величина, рассчитываемая по формуле:1. Px=Nx1/Nx2

232. Здесь Nxi , Nx2 количество частиц размером больше «х» мкм соответственно до и после фильтра.

233. БЕТА -характеристика: зависимость величины рх от размера частиц, которая может быть отображена кривой или семейством точек в координатах «рх х». Коэффициент полноты фильтрации , или отсева (рт): величина, рассчитываемая по формуле:1. Pm=(Gpl-Gp2)/Gpl

234. Здесь Gpi, Gp2 концентрация частиц загрязнений, выраженная в процентах (%) отмассы жидкости, соответственно до и после фильтра.

235. Коэффициент пропуска пыли (Рта): величина, рассчитываемая по формуле:1. Pma=Gp2/Gpi

236. G-характеристика: зависимость грязеемкости от перепада давления на фильтре, которая может быть отображена кривой или семейством точек в координатах «G -Ар».

237. Удельная грязеемкость (g): грязеемкость, отнесенная к единице площали фильтроэлемента, и измеряемая в г/м2

238. Ресурс фильтра: время работы фильтра, соответствующее реализации его грязеемкости, измеряемое в часах

239. Пропускная способность (номинальная): величина потока жидкости, который может быть пропущен через чистый фильтр при определенном (номинальном) перепадде давления на нем

240. Q-характеристика: зависимость пропускной способности от перепада давления на фильтре, которая может быть отображена кривой или семейством точек в координатах «Q Ар».

241. Применимость показателей качества фильтров и фильтроэлемеитовпо ГОСТ Р 50553-93

242. Параметр Фильтр (фильтроэлемент) установлен в систему:

243. Топливную Масляную Гидравлическую Воздушную

244. Габаритные, присоединительные размеры и масса + + + +

245. Номинальный поток рабочей жидкости (среды)

246. Номинальное давление (разряжение)

247. Гидравлическая (аэродинамическая) характеристика

248. Номинальный перепад давлений + + +1. Продолжение таблицы

249. Параметр Фильтр (фильтроэлемент) установлен в систему:

250. Топливную Масляную Гидравлическую Воздушную

251. Максимальный перепад давлений на фильтроэлементе + + + +*>

252. Сопротивление потоку воздуха в зависимости от расхода воздуха . +

253. Разрушающий перепад давлений на фильтроэлементе + *> + *> + + *>

254. Абсолютная тонкость фильтрации + *> +

255. Номинальная тонкость фильтрации + + +

256. Коэффициент отфильтровывания + *> + #> +

257. Коэффициент (полнота) отсева + + *>

258. Коэффициент пропуска пыли +1. Грязеемкость + -)

259. Полнота отделения воды + *> + *>

260. Перепад давлений, соответствующий срабатыванию индикатора загрязненности + *> . + *> + *>

261. Степень негерметичности предохранительного клапана

262. Перепад давлений, соответствующий началу открытия предохранительного клапана +*>

263. Ресурс (срок службы) + + + +

264. Данный параметр применяется ограничено, то есть не является обязательным для всех изготовителей

265. Расчет системы фильтрации гидропривода карьерного экскаватора1. Исходные данные ск Исходная концентрация загрязнений в утилизируемой гидрожидкости (класс 19/17) Количество частиц, шт/м3, размера5 мкм > 15 мкм5,000,000,000 130,000,000

266. Ос2 Требуемая концентрация загрязнений в утилизируемой гидрожидкости (класс 17/13) Количество частиц, шт/м3, . размера5 мкм > 15 мкм1,300,000,000 80,000,000

267. Ct Исходная концентрация загрязнений в утилизируемом топливе (класс 20/17) Количество частиц, шт/м3, размера5 мкм > 15 мкм10,000,000,000 1,300,000,000

268. Cfl Требуемая концентрация загрязнений в утилизируемом топливе (класс 15/10) Количество частиц, шт/м , размера5 мкм > 15 мкм320,000,000 10,000,000

269. C3dsr Требуемые концентраций загрязнений для агрегатов системы управления (класс 15/10) Количество частиц, шт/м , размера5 мкм > 15 мкм320,000,000 10,000,000

270. APzo Начальные перепады давления на фильтрах 20,000 Па (0.02 Мпа)

271. AP L-il zmaz Максимальные перепады давления на фильтрах 350,000 Па (0.35 Мпа)

272. Qk Подача заправочного насоса 0.002 м3/с (120 л/мин)

273. Qi Подача насосов открытого контура 0.056 м3/с (3360 л/мин)

274. Q12 Подача насоса подпитки замкнутого контура 0.003 м3/с (180 л/мин)q2 Подача насоса замкнутого контура 0.016 м3/с (960 л/мин)

275. Q3 Подача насоса управления 0.0007 м3/с (42 л/мин)

276. Qt Средняя подача топливного насоса 0.00007 м3/с (176 кг/мч)

277. Интенсивность поступления загрязнений в открытый контур, шт/м /с 500,000 240,5001. Продолжение таблицы

278. Интенсивность поступления загрязнений в замкнутый контур, шт/м3/с 128,000 70,000

279. V, Объем жидкости в открытом контуре 3.95 м3 (2950 л)v2 Объем жидкости в замкнутом контуре 0.6 м3 (600 л)kflsu Поправочный коэффициент ресурса заправочного фильтра 200

280. Rzdsr Требуемые ресурсы фильтров 3,600,000 с (1000 мч)

281. Rtdsr Требуемый ресурс топливного фильтра 900,000 с (250 мч)3ef Коэффициент эффективности корпусов фильтров 0.61. Расчетная схема1. Расчетные формулы1. Уравнения концентрации

282. С, =K,*V, + C2*Qi2. / Qi2+ Qi*(Pis~ lyPis] C2 =K2*V2+(C1*Q12/pu)]/Q12c3 =c,/p3 1. Ck2 = Ck / Pk Ct2 =Ct/pt

283. Уравнения для расчета р-коэффициентов

284. Pis = Ci * Qi / (С, * Qi + Qi2*( C, C2) - ? ,*V,) Pi =Qi/ CCQi + ОзУРи" Рз/Qs) P12 =C1*Q12/(C2*Q12-^2*V2)1. Проверочные неравенства

285. Ci*Qi + Ci*Q.2 >C2*Q12 + Ci*VI C2*Qi2 >^2*V2

286. Уравнения для расчета площадей фильтрующих элементов

287. Fi =RZdsr *(Pi l)/Pi*Ci*Qi/gz '

288. F,2 =Rzdsr*(Pl2-l)/Pl2*C,*Q12/gz

289. F3 =Rzdsr*(P3-l)/P3*C1*Q3/gz

290. Fk = Rzdsr *(Pk- l)/Pk*Ck*Qk/gz

291. Ft = Rtdsr *(Pt- l)/Pt*Ct*Qt/gz

292. Уравнения для расчета удельного энергопотребления:

293. АР eqfz = (APzo*АРzmax)1/2 APzo . / [1 ~(APzo / APzmax)1/2] - 0.089 МПа Wfs - [APz0*(l - aef) + ДРeqfz]* (Q, + QI2 + Q3 + Qk + Qt)

294. Параметр Для частиц размером5 мкм 15 мкм1. Р. 1 1.231. Pi 2 2.12 3.081. Зз 4.06 8.001. Рк 3.85 5.001. Pt 31.25 130.001. F, 5.74 м2 1. F,2 1.08 м2 1. F3 0.51 м2 1. Fk 0.04 м2 1. Ft 0.28 м2

295. Суммарная цена фильтровальных установок, $/мч 4,23

296. Удельное энергопотребление, кВт/мч 6.78

297. Максимальная погрешность расчета концентраций 6.56%1. Примечание:

298. Принятые для расчета потребных площадей фильрующих элементов значения удельных грязеемкостей приведены в таблице (по данным 88. и табл. 2.3, глава 2)

299. Параметр Материал Удельная грязеемкостьт/и1 106 частиц / м2gi ЮР (целлюлозная бумага) 140 490,000gl2 16VG (стеклобумага) 120 420,000g3 10VG (стеклобумага) 85 297,500gk 10VG (стеклобумага) 85 297,500gt 6VG (стеклобумага) 83 290,500

300. При средней массе частиц 0.35* 106 шт/мг

301. Ценовые показатели для фильтров и фильтрующих элементов приняты согласно прайс-листу ATICO Internormen - Filter, 2002 год

302. В качестве примера принят экскаватор массой 300 т., с вместимостью ковша 15-17 м3 и установочной мощностью привода 1100 кВт

303. Отказы фильтров в процессе эксплуатации горных машин

304. Отказ Причина Пути устранения

305. Негерметичность вследствие повреждения уплотнений при замене фильтроэлемента Конструктивный дефект корпуса фильтра Модернизация конструкции уплот-нительного узла согласно рекомендациям 5,33,34, 225.

306. Выход из строя датчика перепада давления Повышение вибростойкости электросистемы, применение современных конструкций 217.

307. Потеря герметичности фильтроэлемента за счет «смятия» при монтаже Применение развитой монтажной направляющей

308. Отказ байпасного клапана Поломка пружины Применение байпасных клапанов современных конструкций 217.1. Заедание золотника

309. Потеря герметичности фильтроэлемента из-за дефектов изготовления Некачественные запчасти Входной контроль запчастей, использование квалифицированных поставщиков

310. Потеря герметичности фильтроэлемента при загрязненной фильтрующей шторе Несоответствие прочности фильтроэлемента характеристике байпасного клапана Разработка фильтроэлементов повышенной прочности

311. Повышенная загрязненность жидкости при относительно чистом, работоспособном фильтроэлементе Расчетная характеристика фильтроэлемента не реализуется из-за постоянной работы байпасного клапана Выбор фильтров с запасом по условному проходу

312. Методические рекомендации по контролю загрязненности при разработке и эксплуатации систем фильтрации для для горных машин

313. Первая задача решается путем определения коэффициента вариации результатов измерений по вышеописанной методике (см. раздел «Реальные ошибки контроля загрязненности»), .

314. Объем квалификационных испытаний, сколь бы значителен он не был, все же существенно меньше суммарного объема анализов при периодическом контроле.