автореферат диссертации по безопасности жизнедеятельности человека, 05.26.02, диссертация на тему:Молекулярно-генетические аспекты развития лекарственной устойчивости в условиях угрозы развития эпидемия туберкулеза в Архангельской обл.

На правах рукописи

ТУНГУСОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕАСПЕКТЫ РАЗВИТИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ В УСЛОВИЯХ УГРОЗЫ РАЗВИТИЯ ЭПИДЕМИИ ТУБЕРКУЛЕЗА В АРХАНГЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ

05.26.02 — безопасность в чрезвычайных ситуациях 14.00.26 — фтизиатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Архангельск 2004

Работа выполнена в Северном государственном медицинском университете, Норвежском институте общественного здоровья, Осло, Норвегия, университете Осло, Норвегия

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Марьяндышев Андрей Олегович; доктор медицинских наук, профессор Бьюне Гунар

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Голышевская Валентина Ивановна; доктор медицинских наук, профессор Мишин Владимир Юрьевич; доктор медицинских наук, профессор Пащенко Владимир Петрович

Ведущая организация:

НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Защита состоится « » М_2004 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.004.01 при Северном государственном медицинском университете по адресу: 163061, г. Архангельск, пр. Троицкий, 51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Северного государственного медицинского университета.

Автореферат разослан « С( тгр е ЛЯ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.Е. Дерягина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Проблема искоренения инфекционных заболеваний является одной из глобальных проблем современности. Здоровье населения Российской Федерации рассматривается как компонент жизненно важных интересов личности и общества. Концепция национальной безопасности—главный документ Российской Федерации, в основе которого — осуществление безопасности, повышение качества и уровня жизни, обеспечение здоровья населения. Среди инфекционных заболеваний туберкулез легких представляет основную причину смертности и реальную угрозу здоровью населения страны. В сложившихся условиях остро стоит вопрос обеспечения биологической безопасности, которая должна быть предоставлена каждому гражданину согласно Федеральному закону «О безопасности».

Современный этап развития туберкулеза легких характеризуется неуклонным ростом эпидемиологических показателей и изменением биологических особенностей и структуры популяции микобактерий туберкулеза (МБТ), значительную часть которой занимают микроорганизмы, устойчивые к основным противотуберкулезным препаратам, особенно микроорганизмы с множественной лекарственной устойчивостью.

Проблема распространения лекарственно устойчивого туберкулеза является актуальной по ряду причин.

1. Инфицирование лекарственно устойчивыми МБТ представляет собой реальную угрозу здоровью населения и прямую угрозу развития неизлечимого заболевания (С.А. Peloquin, 2002).

2. Арсенал средств, предназначенных для лечения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью, ограничен (М.И.Пе-рельман, 2000). Проблема может быть разрешена при условии использования имеющихся противотуберкулезных препаратов второго ряда и разработки новых. Известно, что препараты второго ряда являются менее эффективными, имеют выраженные побочные действия, токсические эффекты и требуют больших экономических вложений ^А Drobшewski, 1998; Laing, 2000; ВОЗ, 2003).

Изменения в генетическом аппарате МБТ направлены на развитие лекарственной устойчивости и появление новых генотипов возбудителя. МБТ, принадлежащие к семейству W-Beijing, являются хорошим примером. Они обладают повышенной вирулентностью и рядом других преимуществ, которые позволяют сохранить вид МБТ в условиях эффективной химиотерапии. МБТ с множественной лекарственной устойчивостью согласно классификации сте-

пени потенциальной угрозы инфекционных агентов относятся к категории С (М.Л. Пальцев, 2002). В эту категорию включены возбудители инфекционных заболеваний, обладающие высокой трансмиссией и способностью к воспроизводству. В связи с этим особую значимость приобретают вопросы биологической безопасности нации как необходимое условие устойчивого развития страны.

Цель исследования: изучить молекулярно-генетические аспекты развития лекарственной устойчивости у штаммов МБТ, циркулирующих в Архангельской области в условиях чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких, и разработать мероприятия, позволяющие снизить распространение данного заболевания.

Для достижения указанной цели определены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ показателей и профилей лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам первой линии в условиях чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

2 Выявить и проанализировать профили лекарственной устойчивости МБТ, которые обусловливают неблагоприятные исходы туберкулеза легких и способствуют дальнейшему распространению заболевания.

3. Изучить показатели и профили лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам второй линии и предложить эти препараты для лечения больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью.

4. Провести сравнительную генетическую характеристику штаммов МБТ, циркулирующих в гражданском секторе и местах лишения свободы Архангельской области, с использованием анализа полиморфизма фрагментов длин рестрикции (от англ. RFLP — restriction fragment length polymorphism analysis) ДНК и сполиготипирования.

5. Определить эпидемиологическую роль МБТ семейства W-Beijing в создании чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области.

6. Изучить и проанализировать биологические особенности возбудителя туберкулеза, являющиеся причинами широкого распространения лекарственно устойчивых штаммов МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing.

Положения, выносимые на защиту

На протяжении последних лет в Архангельской области сохраняется чрезвычайная ситуация угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого

туберкулеза легких. Особую биологическую угрозу представляет трансмиссия штаммов МБТ, устойчивых к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии, что значительно затрудняет выбор адекватного режима химиотерапии и излечение отданного заболевания.

Доминирование 531TCG-»TTG мутации в гроВ гене и 315 AGC—>АСС мутации в katG гене предусматривает формирование селективных преимуществ у МБТ, обусловливающих развитие и широкое распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью на территории области.

Результаты лечения туберкулеза легких в Архангельской области не достигли должного уровня в связи с большим числом случаев прерванного лечения и распространением лекарственно устойчивых МБТ. Исход заболевания не зависит от принадлежности штамма МБТ, которым инфицирован больной, к семейству W-Beijing. Исход заболевания в первую очередь зависит от чувствительности штамма МБТ к противотуберкулезным препаратам.

В Архангельской области основной причиной туберкулеза легких являются штаммы МБТ, принадлежащие к семейству W-Beijing. Принадлежность МБТ к семейству W-Beijing достоверно коррелирует с наличием устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии. Появление лекарственной устойчивости МБТ к дополнительным препаратам на фоне адекватного и регулярного лечения может быть обусловлено реинфекцией новым лекарственно устойчивым штаммом МБТ.

Рост штаммов МБТ в условиях in vitro характеризуется фенотипическим и генотипическим полиморфизмом. У лекарственно устойчивых штаммов МБТ обычных генотипов происходит замедление роста по сравнению с лекарственно чувствительными штаммами МБТ. Часть лекарственно устойчивых штаммов МБТ семейства W-Beijing характеризуется замедлением роста, у другой части — не отмечено изменения роста после приобретения лекарственной устойчивости. Селективные преимущества МБТ семейства W-Beijing обусловлены особенностями их роста и доминированием 531 TCG —»TTG мутации в гроВ гене.

Концепция работы

Сохранение здоровья населения является приоритетом обеспечения биологической безопасности страны. Среди инфекционных заболеваний туберкулез легких представляет реальную угрозу здоровью населения и занимает ведущее положение в структуре его смертности.

Основное направление работы связано с определением молекулярно-ге-нетических механизмов развития и распространения лекарственно устойчивого туберкулеза легких в зависимости от биологических особенностей возбудителя в условиях чрезвычайной ситуации природного характера.

Ежегодный рост показателей лекарственной устойчивости, распространение МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing, в структуре популяции возбудителя туберкулеза создают условия для трансмиссии лекарственно устойчивых штаммов МБТ, инфицирования восприимчивого населения и развития у него заболевания, излечение которого является сложной задачей. Множественная лекарственная устойчивость, низкая эффективность химиотерапии и широкое распространение резистентности к противотуберкулезным препаратам второго ряда делают туберкулез легких неизлечимым заболеванием.

Для устранения бактериологической угрозы, отрицательного воздействия на жизнедеятельность и здоровье населения необходимо своевременное выявление, прогнозирование развития лекарственной устойчивости и проведение комплекса лечебно-профилактических мероприятий с соблюдением законодательства по национальной безопасности. Основным методом устранения биологической опасности в создавшихся условиях является своевременная и качественная диагностика туберкулеза с применением молекулярно-гене-тических методов, а также лечение больных в соответствии с индивидуальными профилями лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

Научная новизна исследования

Проведен мониторинг показателей лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии в течение 1995—2002 годов и сделан сравнительный анализ индивидуальных профилей лекарственной чувствительности МБТ, выделенных от больных туберкулезом легких в Архангельской области.

Подтверждена роль мутаций в гроВ гене при развитии лекарственной устойчивости к рифампицину, которые служат маркером множественной лекарственной устойчивости. Впервые идентифицированы мутации в кМО гене, обусловливающие развитие лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду при туберкулезе легких в Архангельской области, которые могут служить дополнительным маркером множественной лекарственной устойчивости.

Впервые представлены и проанализированы результаты лечения туберкулеза легких в зависимости от профиля лекарственной устойчивости и принадлежности к семейству W-Beijing.

Впервые изучена лекарственная устойчивость к противотуберкулезным препаратам второй линии и предложены препараты, которые возможно использовать для химиотерапии больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью.

Проведена сравнительная генетическая характеристика штаммов МБТ, вызывающих туберкулез легких в Архангельской области. Впервые идентифицировано распространение МБТ, принадлежащих к семействам Т, Haarlem и LAM, и установлена эпидемиологическая роль МБТ семейства W-Beijing в развитии чрезвычайной ситуации угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких на территории Архангельской области. Доказано, что высокий показатель кластерности МБТ семейства W-Beijing является косвенным индикатором повышения фитнеса МБТ данного генотипа и обусловливает селективные преимущества при распространении лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

Впервые определена роль реинфекции новым лекарственно устойчивым штаммом МБТ на фоне проводимого лечения, что позволяет объяснить появление лекарственной устойчивости к дополнительным противотуберкулезным препаратам на фоне адекватной и регулярной химиотерапии.

Впервые изучены биологические особенности и фитнес штаммов МБТ, обладающих разными профилями лекарственной устойчивости и принадлежащих к разным генотипам. В частности, установлены профили лекарственной устойчивости и виды мутаций в гроВ гене, обусловливающие селективные превосходства МБТ семейства W-Beijing по сравнению с МБТ других генотипов и способствующие широкому распространению и дис-семинации МБТ с множественной лекарственной устойчивостью у новых случаев.

Научно-практическая значимость работы. Внедрение результатов в практику

Изучены распространение лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области и исходы заболевания в зависимости от индивидуального профиля лекарственной чувствительности штамма МБТ и его принадлежности к определенному генотипу. Установлены индивидуальные профили лекарственной устойчивости, затрудняющие лечение туберкулеза легких и приводящие к неблагоприятным исходам (летальный исход и безуспешное лечение).

Установлены точечные мутации в katG и гроВ генах МБТ, позволяющие разработать и внедрить экспресс-методы определения множественной лекарственной устойчивости, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Выявление активной трансмиссии штаммов МБТ семейства W-Beijing и роли реинфекции новым штаммом МБТ на фоне проводимого адекватного регулярного лечения позволяет предложить и внедрить эпидемиологические мероприятия в противотуберкулезных медицинских учреждениях, а именно

разграничение потоков инфекционно опасных больных и изоляцию больных, выделяющих штаммы МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

. Изучение особенностей показателей роста лекарственно устойчивых штаммов МБТ семейства W-Beijing, как характеристики фитнеса, позволило расширить знания в области биологических особенностей возбудителя и сформулировать гипотезу широкого распространения штаммов МБТ семейства W-Beijing.

Основные положения диссертации и вытекающие из них рекомендации в настоящее время используются в педагогической работе на кафедре фтизио-пульмонологии Северного государственного медицинского университета (акт внедрения 2004 год), в практической работе Архангельского областного противотуберкулезного диспансера (АОПД) (акт внедрения 2001 год, 2004 год) и Мурманского областного противотуберкулезного диспансера (акт внедрения 2004 год). Диссертационное исследование выполнено в рамках региональной научно-технической программы «Здоровье населения Европейского Севера», имеет номер гос. регистрации ГР 01200316208.

Бактериологический мониторинг лекарственной устойчивости при туберкулезе легких проводится с 1995 года. За эти годы созданы коллекция штаммов МБТ и компьютерная база данных, состоящая из профилей чувствительности к противотуберкулезным препаратам и индивидуальных рисунков хромосомной ДНК МБТ, циркулирующих в Архангельской области. Созданная база данных используется для проведения научных исследований в рамках молекулярной эпидемиологии и молекулярной генетики, а также для анализа качества практической работы бактериологической службы Архангельской области.

Ежегодно проводится определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам первого ряда радиометрическим методом ВАСТЕС, а также вида мутаций в гроВ гене методом INNO-LiPa ТВ у больных с новыми случаями заболевания. При выявлении множественной лекарственной устойчивости проводится исследование на чувствительность к противотуберкулезным препаратам второго ряда, результаты которого учитываются при выборе противотуберкулезных препаратов и назначении режима химиотерапии.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены: на Осенней конференции микробиологов, г. Осло, Норвегия, 13—14 сентября 2001 г.; Третьей международной встрече «Борьба с инфекционными заболеваниями в странах Балтийского моря и Баренцевом регионе», г. Архангельск, Россия, 24—27 сентября 2001 г.; 32 Всемирном конгрессе Международного союза по борьбе с

туберкулезом и заболеваниями легких, г. Париж, Франция, 1—4 ноября 2001 г.; Форуме инфекционистов, г. Осло, Норвегия, 16—17 ноября 2001 г.; Первой международной научной конференции института международного здоровья, университета Осло, г. Осло, Норвегия, 2—3 мая 2002 г.; Дневном семинаре института общей врачебной практики, г. Осло, Норвегия, 23 октября 2002 г.; Ежегодной научной конференции Норвежского института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 5—6 декабря 2002 г.; Научной конференции по туберкулезу, Норвежского института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 12—13 декабря 2002 г.; Второй международной научной конференции института международного здоровья, университет Осло, г. Осло, Норвегия, 15—16мая2003 г.; Российском съезде фтизиатров, г. Москва, 3—5 июня2003 г.; XVII Всемирном конгрессе по астме и V съезде иммунологов и аллергологов СНГ, г. Санкт-Петербург, 5—11 июля 2003 г.; Скандинавской встрече по туберкулезу, г. Осло, Норвегия, 10 октября 2003 г.; 20 съезде Скандинавского общества антимикробной терапии, г. Оденсе, Дания, 24—26 октября 2003 г.; Ежегодной научной конференции Норвежского института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 4—5 декабря 2003 г.

Публикации

Результаты и основные положения диссертации опубликованы в 23 печатных работах.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 229 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, содержит материалы и методы собственных исследований, их результаты и обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Текст диссертационной работы иллюстрирован 15 рисунками и 40 таблицами. Указатель литературы содержит 34 работы отечественных авторов, опубликованные на русском языке, 16 работ отечественных авторов, опубликованных на английском языке, и 184 работы зарубежных авторов. Библиографические записи литературы составлены в соответствии с ГОСТом 7.80-2000.

Материалы и методы исследования

Комплексное лабораторное (бактериологическое и молекулярно-генети-ческое) исследование проведено с использованием 356 штаммов МБТ, изолированных от больных туберкулезом легких в Архангельской области. Штаммы культивировали на среде Левенштейна-Йенсена и проводили их видовую идентификацию лабораторными тестами: ниациновым тестом и тестом на

наличие нитратредуктазы. МБТ исследовали на чувствительность к противотуберкулезным препаратам радиометрическим методом ВАСТЕС и геноти-пировали с использованием RFLP анализа и сполиготипирования.

Для определения лекарственной чувствительности использованы следующие концентрации противотуберкулезных препаратов первой линии: изониа-зид 0,2 мг/мл, рифампицин 2,0 мг/мл, этамбутол 7,5 мг/мл и стрептомицин 6,0 мг/мл (Т. Hoel, 1991; СВ. Inderlied, 1994; М.А. Pfaller, 1994). Для определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам второй линии использованы следующие концентрации: капреомицин 1,25 мг/мл, этионамид 1,25 мг/мл, канамицин 5,0 мг/мл и офлоксацин 2,0 мг/мл (G.E. Pfyffer, 1999).

RFLP анализ проводили с использованием фрагмента ПЦР 245 Ьр элемента IS6110 согласно международным методическим рекомендациям (К. Кгетег, 1999; A.Y. Mitchell, 1999; J.D.A. van Embden, 1993; D. van Soolingen, 1999). Количество копий вставочного элемента IS6110 и приблизительный молекулярный вес фрагментов длин рестрикции, степень сходства или родства МБТ определяли методом UPGMA с помощью компьютерной программы Gel Compar версия 4.1 (Applied Maths, Sint-Martens Latem, Belgium).

Сполиготииирование (Isogen Bioscience BV, Maarssen, The Netherlands), генотипирование в области DR хромосомы (J.W. Dale, 2001; С. Sola, 2001) проводили в соответствии с инструкциями производителя (J. Kamerbeek, 1997).

Для идентификации вида мутаций в гроВ гене штаммы МБТ, устойчивые к рифампицииу, исследовали методом Inno-Lipa Rif. ТВ Assay (Innogenetics N. V., Ghent, Belgium) (H.J. Marttila, 1999; R. Rossau, 1997). У штаммов МБТ, устойчивых к изониазиду, определяли последовательность аминокислот в гене katG для идентификации возможных мутаций (H.J. Marttila, 1996).

55 клинических штаммов МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing (9 чувствительных и 15 лекарственно устойчивых штаммов) и к другим генотипам (11 чувствительных и 20 лекарственно устойчивых штаммов), использованы для изучения фитнеса. Изучение показателей роста МБТ разных генотипов, имеющих разнообразные профили устойчивости к противотуберкулезным препаратам, проводили с использованием системы ВАСТЕС MGIT 960 (ВАСТЕС, Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, Mariland). Штаммы МБТ инкубировали при температуре 37°С в системе ВАСТЕС MGIT 960, распечатку результатов проводили мануально с интервалом в 6 часов, который был установлен во время пилотного исследования.

Проведена оценка результатов лечения больных туберкулезом легких, диагностированных в Архангельской области. Для анализа результатов лечения в зависимости от инфицирования МБТ с разными профилями лекарственной чувствительности использованы 257 штаммов МБТ.

Все цифровые данные подвергнуты статистической обработке при использовании прикладных компьютерных программ Epi Info версия 6.04b (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA; WHO, Geneva, Switzerland) и SPSS for Windows версия 9.0.1 (SPSS Inc., Chicago, IL). Результаты исследований введены в специально разработанную компьютерную базу данных в программе Epi Info. Суммарная статистика вычислялась, и оценка результатов проводилась по критерию Стьюдента (t). Межгрупповые различия определялись по критерию соответствия (X2), наличие же связей между отдельными признаками изучалось с помощью корреляционно-регрессионного анализа (В.А. Колемаев, 1991).

При изучении показателей роста МБТ разных генотипов различия между группами изучены при помощи теста ANOVA. Главным изучаемым показателем являлось время в часах, необходимое для достижения штаммом МБТ роста в 200 единиц, начиная с момента эксперимента. Данный показатель рассчитывали с использованием графиков кривых роста и математической формулы: t-tj/tj-t^y-yj/yj-y,, где t = время в часах, и у = рост в единицах. Лаг фаза роста определена как время в часах от начала культивации штаммов МБТ в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 до начала регистрации положительного роста. Для оценки частоты роста определено время в часах от начала регистрации положительного роста штамма МБТ до достижения им роста в 200 единиц. Для оценки воспроизведения эксперимента использован Wilcoxon тест. Р < 0,05 принят за уровень достоверности.

Результаты исследования и их обсуждение

Молекулярно-генетические исследования МБТ позволили объяснить неуклонный рост эпидемиологических показателей туберкулеза с помощью изменений биологических особенностей и структуры популяции МБТ. Изменения в генетическом аппарате МБТ, появление нового генотипа W-Beijing, возникновение у возбудителя селективных преимуществ вследствие мутационного процесса позволяют сохранить вид МБТ в условиях современной химиотерапии. Поэтому показатель распространения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью в Архангельской области достиг порога угрозы развития эпидемии данного заболевания. Распространение туберкулеза наносит экономический ущерб за счет увеличения нетрудоспособности и смертности населения. Данным инфекционно опасным заболеванием часто поражаются лица в самом экономически продуктивном возрасте — 20—40 лет. Массовое распространение лекарственно устойчивого туберкулеза представляет прямую биологическую опасность для населения области и страны.

Мониторинг показателей лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии (этамбутол, изониазид, рифампицин и стрептомицин) проведен с 1995 по 2002 год. В 1995 году у больных с новыми случаями наблюдалась лекарственная устойчивость к изониазиду (31,3%). Распространение лекарственной устойчивости к изониазиду в 1995 году можно объяснить, опираясь на исторические аспекты лечения туберкулеза легких в Архангельской области. Изониазид был одним из первых противотуберкулезных препаратов, активное применение которого во фтизиатрической практике области началось в шестидесятых годах прошлого века. На протяжении десятилетий до внедрения более эффективного препарата рифампицина именно изониазид оставался основным препаратом для лечения туберкулеза. Его широкое применение в условиях неконтролируемого лечения повлекло развитие и последующее распространение лекарственной устойчивости к изо-ниазиду.

В 1996 году у больных туберкулезом легких с новыми случаями появляется устойчивость к этамбутолу (33,3%) и рифампицииу (16,7%). Появление лекарственной устойчивости к рифампицину у новых случаев способствует распространению множественной лекарственной устойчивости, которая на сегодняшний день представляет серьезную проблему и затрудняет излечение туберкулеза. Устойчивость к рифампицину в Архангельской области является маркером множественной лекарственной устойчивости.

В гражданском секторе Архангельской области на протяжении последних лет продолжается статистически достоверный рост показателей лекарственной устойчивости (Р< 0,05) (рис. 1). Высокие показатели лекарственной устойчивости у больных с новыми случаями наблюдались к стрептомицину (45,7%) и изониазиду (42,9%) в 1998 году. В 1999 году у новых случаев отмечается рост показателя множественной лекарственной устойчивости (14,8%) и трехкратное увеличение показателя лекарственной устойчивости к этамбутолу (29,6%) (Р< 0,05). Показатель множественной лекарственной устойчивости у больных с новыми случаями в 2000 и 2002 годах достигает 33,3% и 42,9% соответственно.

У ранее пролеченных случаев ситуация более серьезная: с 1995 года наблюдается лекарственная устойчивость ко всем четырем препаратам (этамбутолу 14,3%, изониазиду 71,4%, рифампицину 28,6% и стрептомицину 42,9%). Широко распространены штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и активно передаются от ранее пролеченных больных к больным с новыми случаями, что способствует ухудшению эпидемиологической ситуации.

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

□ этамбугол Щизониазид Я рифампицин О стрептомицин

Рис. 1. Динамика показателей лекарственной устойчивости штаммов МБТ, выделенных от больных туберкулезом с новыми случаями заболевания, в гражданском секторе области в течение 1995—2002 гг.

Примечание: *Р < 0,05; **Р < 0,001 (по сравнению со всеми годами)

Статистически достоверный рост показателей лекарственной устойчивости к индивидуальным противотуберкулезным препаратам первой линии, за исключением стрептомицина, наблюдается у больных, ранее пролеченных по поводу туберкулеза, на протяжении всех лет, когда проводился мониторинг (Р<0,05) (рис.2).

В 2001 году изучение распространения лекарственной устойчивости проведено в местах лишения свободы Архангельской области. У больных с новыми случаями зарегистрирован высокий показатель устойчивости к стрептомицину (70,2%); у 30,9% и 42,6% новых случаев наблюдалась устойчивость к этамбутолу и изониазиду соответственно. У больных, ранее пролеченных по поводу туберкулеза, выявлены одинаково высокие показатели (65,0%) устойчивости к изониазиду и стрептомицину, лекарственная устойчивость к этам-бутолу составила 35,0%. Множественная лекарственная устойчивость у больных с новыми и ранее пролеченными случаями составила 34,0% и 55,0% соответственно. Все штаммы МБТ, устойчивые к рифампицину, имели множественную лекарственную устойчивость.

1995 1996 1997 1998 1999 2000 2002

120%

100%

80%

60%

одами)

««падями в

ыет"показахели по обла-

азвития устойчивости к ~ гптомищи

настоящим результа-

40%

ПримечI 20% -

Показа'

системеЗаКлюЧения в несколько раз превосходят дан

сти. В Архангельской ¿бМ&сти уПйминаНйе в анамНезе бойЪНого факта о пре

бывании в заключении не является фактором рискаразв: □ этамбутал В юоишзнд В рифамгащш истре)

противотуберкулезным препаратам, что противоречит I

тамР^-имйнночшйрокэмучрйсйространенйЮУйекйрственноиустйИЧиаЬёти^ мдах лйШе^свБбйдыусуществуетУий?орйчзскйе >объя8ншйз даннвййро

анамнезе указание на пребывание в местах лишения свободы, находилась там в 1970—1980 годах, то есть задолго до начала широкого распространения лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области.

Хронология распространения и динамика показателей лекарственной устойчивости при туберкулезе легких в Архангельской области свидетельствуют, что в области сложилась и сохраняется угроза развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких. Особую тревогу вызывает распространение множественной лекарственной устойчивости, показатели которой превышают таковые в разных областях Российской Федерации.

Множественная лекарственная устойчивость развивается в результате точечных мутаций в гроВ и katG генах. Лекарственная устойчивость к рифам-пицину обусловлена разнообразными мутациями в гроВ гене, среди которых доминирует 531 TCG—»TTG мутация (70,3%). Следующими по частоте распространения поражаются 526 (9,9%) и 516 (6,3%) кодоны гроВ гена. В 92,0% случаев лекарственная устойчивость к изониазиду вызвана 315 мутацей в £яГ(?гене. Лекарственная устойчивость к изониазиду также обусловлена 315 AGC—»ATC мутацией (2,7%) в katG гене и мутациями в других генах (5,4%).

Назначение адекватного режима терапии проблематично в условиях широкого распространения устойчивости к противотуберкулезным препаратам и отсутствия качественных и достоверных методов лабораторной диагностики. На диагностику больного с использованием общепринятых методов посева и тестирования на чувствительность к противотуберкулезным препаратам уходит 10—12 недель. В Архангельской области устойчивость к рифампици-ну служит маркером множественной лекарственной устойчивости. Поэтому экспресс-методы определения чувствительности к данному препарату являются хорошей альтернативой диагностики множественной лекарственной устойчивости, в качестве примера можно использовать метод Inno-LiPA Rif. ТВ или «домашний метод ПЦР».

Чрезвычайная ситуация угрозы развития эпидемии туберкулеза в последние годы вызвана значительным увеличением количества инфекционно опас -ных больных, которые выделяют лекарственно устойчивые штаммы МБТ. Лекарственная устойчивость часто затрудняет лечение туберкулеза легких, что создает опасные резервуары инфекции в обществе и приводит к заражению лекарственно устойчивыми штаммами МБТ здоровых лиц. В связи с этим актуальной проблемой является оценка эффективности применяемых в настоящее время стандартных курсов химиотерапии.

В настоящем исследовании проведена оценка результатов лечения больных туберкулезом легких, диагностированных в гражданском секторе области в 1999 году и в системе заключения в 2001 году. Согласно квартальным отчетам регистрации в 1999 году в гражданском секторе области зарегистрировано 368 больных туберкулезом легких (260 новых случаев и 108 ранее пролеченных случаев), у которых диагноз подтвержден бактериологическими методами. 241 (65,5%) из 368 больных выделяли МБТ методом простой микроскопии. В 2001 году в системе заключения зарегистрировано 220 больных туберкулезом легких (160 новых случаев и 60 ранее пролеченных случаев), у которых диагноз подтвержден бактериологическими методами. 170 (77,3%) из 220 больных выделяли МБТ методом простой микроскопии. Анализ ре-

зультатов лечения в гражданском секторе области и в системе заключения проведен отдельно.

Результаты лечения туберкулеза легких в 1999 году в гражданском секторе области представлены в табл. 1. Благоприятный исход заболевания (излечение и лечение завершено) зарегистрирован у 160 (61,5%) из 260 больных с новыми случаями заболевания и у 35 (32,4%) из 108 больных, пролеченных ранее по поводу туберкулеза. У 34 (13,1%) из 260 больных с новыми случаями лечение закончилось летальным исходом, в том числе 21 (8,1%) больной умер от туберкулеза. Безуспешное лечение зарегистрировано у 26 (10,0%) из 260 больных с новыми случаями заболевания. Следовательно, неблагоприятный исход лечения составляет 60 (23,1 %) случаев. 32 больных (12,3%) из 260 с новыми случаями заболевания прервали лечение, а результат лечения у 8 (3,1%) больных неизвестен, т.к. данные больные выбыли за пределы Архангельской области. Неблагоприятный исход заболевания у ранее пролеченных больных в гражданском секторе области составил 44 (40,7%) из 108.18 (16,7%) из 108 ранее пролеченных больных прервали лечение, а результат лечения у 11 (10,2%) больных неизвестен.

В системе заключения благоприятный исход заболевания (излечение и лечение завершено) зарегистрирован у 121 (75,6%) из 160 больных с новыми случаями заболевания и у 22 (36,7%) из 60 больных, ранее пролеченных по поводу туберкулеза. У 12 (7,5%) из 160 больных с новыми случаями лечение закончилось летальным исходом, в том числе 11 (6,9%) больных умерли от туберкулеза. Безуспешное лечение зарегистрировано у 10 (6,3%) из 160 больных с новыми случаями. Следовательно, неблагоприятный исход лечения составляет 22 (13,8%) случая. Только 1 больной (0,6%) из 160 с новыми случаями заболевания в системе заключения прервал лечение, а результат лечения у 16 (10,0%) больных неизвестен, так как они выбыли за пределы системы заключения и Архангельской области. Неблагоприятный исход заболевания у больных с ранее пролеченными случаями заболевания в системе заключения зарегистрирован у 25 (41,7%) из 60 больных. 3 (5,0%) из 60 больных с ранее пролеченными случаями заболевания прервали лечение, а результат лечения у 10 (16,7%) больных неизвестен, т.к. данные больные выбыли за пределы системы заключения и Архангельской области.

Таким образом, результаты лечения туберкулеза в Архангельской области не достигли цели ВОЗ. Процент благоприятных исходов туберкулеза ниже 85%. В системе заключения процент благоприятных исходов превосходит такой показатель в гражданском секторе, также снижено число случаев безуспешного и прерванного лечения, что может быть объяснено строгим контролем над приемом противотуберкулезных препаратов у заключенных.

Таблица 1

Результаты лечения больных туберкулезом легких, диагностированных в Архангельской области

Результат лечения Гражданский сектор Система заключения

Новые случаи п = 260 (%) Пролеченные случаи п= 108 (%) Новые случаи п= 160 (%) Пролеченные случаи п = 60 (%)

Излечение 137 (52,7) 31 (28,7) * 110(68,8) 19(31,7)*

Лечение завершено 23 (8,8) 4 (3,7) *** 11(6,9) 3 (5,0) ***

Летальный исход От туберкулеза По др. причинам 34(13,1) 21 (8.1) 13 (5,0) 22 (20,4) *** 20(18,5)** 2(1,9)*** 12 (7,5) 11(6,9) 1 (0,6) 10(16,7) ** 10(16,7) ** 0 (0) ***

Безуспешное лечение 26 (10,0) 22 (20,4) ** 10 (6,3) 15 (25,0) *

Прерванное лечение 32(12,3) 18(16,7)*** 1 (0,6) 3 (5,0) **

Переведено 8 (3,1) 11 (10,2)** 16(10,0) 10(16,7) ***

Примечание: *Р < 0,001; **Р < 0,05; ***Р > 0,05 (по сравнению с новыми случаями)

Для изучения влияния устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии на исход туберкулезного процесса проанализировано 257 случаев туберкулеза легких (143 из гражданского сектора и 114 из системы заключения), чьи штаммы МБТ были исследованы на наличие лекарственной устойчивости методом ВАСТЕС.

В гражданском секторе области при сохранении у МБТ чувствительности к протестированным препаратам излечение зарегистрировано у 57,8% и 50,0% новых и ранее пролеченных случаев соответственно. Следует отметить, что у новых случаев высокий процент летальных исходов (53,8%) и безуспешного лечения (29,4%) отмечается при инфицировании больного лекарственно чувствительным штаммом МБТ. При назначении стандартного режима химиотерапии больному, инфицированному чувствительным штаммом МБТ, и при регулярном приеме больным противотуберкулезных препаратов под непосредственным контролем со стороны медицинского персонала существуют все условия для благоприятного исхода заболевания. Большое количество неблагоприятных исходов у новых случаев в гражданском секторе свидетельствует о возможных недостатках во время лечения: не всегда обеспечен регулярный прием противотуберкулезных препаратов. Нельзя исключать возможность реинфицирования таких больных новыми штаммами МБТ, которые заведомо устойчивы к противотуберкулезным препаратам и предопределяют неблагоприятный исход туберкулеза.

В системе заключения организован строгай контроль за лечением, благодаря чему исключен нерегулярный прием противотуберкулезных препаратов. Поэтому у категории ранее пролеченных больных, инфицированных чувствительными штаммами МБТ, нет неблагоприятных исходов, а их проценту новых случаев значительно ниже (9,1%) по сравнению с гражданским сектором области.

При наличии у штамма МБТ устойчивости к одному и более препаратам отмечается снижение процента излечения и увеличение числа неблагоприятных исходов. Особую угрозу представляют собой штаммы МБТ, устойчивые ко всем препаратам первой линии. В гражданском секторе области и в системе заключения штаммы МБТ с множественной лекарственной устойчивостью обусловливают развитие летального исхода и безуспешное лечение больных.

Для выявления статистически достоверных ассоциаций между чувствительностью или устойчивостью штаммов МБТ к противотуберкулезным препаратам первой линии и разными исходами заболевания все больные были распределены по секторам области и результатам лечения. При статистическом анализе результагы лекарственной устойчивости к стрептомицину не учитывались, поскольку данный препарат не входил в режимы терапии, которые получали больные.

Большинство больных с неблагоприятными исходами лечения были инфицированы штаммами МБТ, устойчивыми к этамбутолу, изониазиду и ри-фампицину. Лекарственная устойчивость к каждому из вышеперечисленных препаратов достоверно коррелировала с неблагоприятным исходом лечения, как в гражданском секторе, так и в системе заключения (Р < 0,05). При многофакторном анализе выявлена независимая корреляция между лекарственной устойчивостью крифампицину и неблагоприятными исходами лечения, данная корреляция характерна как для гражданского сектора (Р=0,003), так и для системы заключения (Р=0,03).

Излечение у больных, инфицированных лекарственно чувствительными штаммами МБТ, наблюдалось чаще, чем у больных, инфицированных лекарственно устойчивыми МБТ. Однофакторный анализ регрессии позволил установить, что лекарственная чувствительность ко всем вышеупомянутым противотуберкулезным препаратам достоверно коррелировала с излечением (Р < 0,05). При многофакторном анализе установлено, что чувствительность МБТ к рифампицину является независимым фактором защиты и обусловливает благоприятный исход заболевания. Данная ассоциация характерна как для гражданского сектора области (Р=0,001), так и для системы заключения (Р=0,01).

Устойчивость только к одному противотуберкулезному препарату при своевременно назначенной эффективной схеме химиотерапии не влияет на исход лечения. В стандартную схему химиотерапии нового случая туберкулеза входят четыре препарата: изониазид, рифамницин, пиразинамид и этамбу-тол. Назначение вышеперечисленных препаратов больному, имеющему устойчивость к этамбутолу или изониазиду, не создает условий для развития лекарственной устойчивости, так как в этом случае больной получает три препарата, к которому чувствительна МБТ. Наше исследование показало, что у всех случаев с монорезистентностью к этамбутолу зарегистрировано излечение, но у одного больного с устойчивостью к изониазиду наблюдалось безуспешное лечение, что может быть объяснено недостаточной изоляцией больных, имеющих лекарственную устойчивость. Безуспешное лечение у данного больного может быть обусловлено реинфекцией МБТ, устойчивой к нескольким противотуберкулезным препаратам. Реинфекция также является возможной причиной неблагоприятных исходов у больных, первоначально инфицированных чувствительной МБТ.

Если у больного имеется устойчивость к изониазиду и этамбутолу, то при стандартной химиотерапии больной получает два препарата, к которому чувствительна МБТ (рифампицин и пиразинамид). В нашем исследовании все больные, имеющие лекарственную устойчивость к этамбутолу и изониазиду,

соблюдающие терапевтический режим и регулярно принимающие препараты, были излечены.

У больных с лекарственной устойчивостью к 2—3 противотуберкулезным препаратам более часто наблюдался неблагоприятный исход заболевания. Лечение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью представляло серьезную проблему.

Лекарственная устойчивость затрудняет лечение туберкулеза легких, что создает опасные резервуары инфекции в обществе и приводит к заражению лекарственно устойчивыми штаммами МБТ здоровых лиц. При наличии у штамма МБТ устойчивости к одному и более препаратам отмечается снижение показателя излечения и увеличение числа неблагоприятных исходов. Штаммы МБТ с множественной лекарственной устойчивостью обусловливают развитие летального исхода и безуспешное лечение. Учитывая частое выявление штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью, низкую эффективность проводимых курсов химиотерапии и широкое распространение резистентности к препаратам второго ряда, можно сделать вывод, что в настоящее время в подавляющем большинстве случаев туберкулез является неизлечимым заболеванием. Таким образом, чрезвычайно высокое распространение лекарственно устойчивого туберкулеза легких остро ставит вопрос об обеспечении национальной безопасности.

Профилактикадальнейшего распространения множественной лекарственной устойчивости должна быть ориентирована на лечение больных противотуберкулезными препаратами второй линии, подобранными в соответствии с профилем лекарственной устойчивости штамма МБТ, которым инфицирован больной. В Архангельской области для лечения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью планируется применение следующих противотуберкулезных препаратов второй линии: капреомицин, этио-намид, канамицин и офлоксацин. В Архангельской области имеется опыт применения данных препаратов для лечения туберкулеза легких до внедрения международных стандартов в 1998 году, поэтому не исключено, что часть штаммов МБТ, циркулирующих на территории области, может иметь устойчивость к данным препаратам.

Изучение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам второй линии проведено с использованием 77 штаммов МБТ, изолированных от больных туберкулезом легких с множественной лекарственной ус -тойчивостью. Только 1 из 77 (1,3%) штаммов МБТ чувствителен ко всем протестированным противотуберкулезным препаратам второй линии, он был изолирован от больного туберкулезом легких из гражданского сектора облас-

ти. Монорезистентность к этионамиду и капреомицину выявлена в 41,6% и 5,2% случаях соответственно. Монорезистентности к канамицину не наблюдали. Показатели лекарственной устойчивости к этионамиду (90,0%—93,6%) и капреомицину (33,3% — 44,7%) были практически одинаковы в системе заключения и гражданском секторе. Устойчивость к двум препаратам одновременно в разных комбинациях установлена в 27,3% случаях, а к трем препаратам —в 24,7% случаях.

В гражданском секторе (рис. 3) большинство больных (95,5% новых и 92,0% ранее пролеченных случаев) инфицировано МБТ с лекарственной устойчивостью к этионамиду. Одинаково высокие показатели лекарственной устойчивости к капреомицину и канамицину наблюдались у больных с новыми (31,8%) и у больных с ранее пролеченными (56,0%) случаями. Все штаммы МБТ, изолированные в гражданском секторе, были чувствительны к офлоксацину.

В системе заключения (рис. 3) 63,3% штаммов МБТ были изолированы от больных с новыми случаями. Самые высокие показатели лекарственной устойчивости у больных с новыми (94,7%) и у больных с ранее пролеченными (81,8%) случаями зарегистрированы к этионамиду. Показатели лекарственной устойчивости к капреомицину и канамицину не имели статистических различий.

Широкое распространение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам второй линии создает чрезвычайную ситуацию угрозы развития лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области и ставит под сомнение излечение данного заболевания. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам второй линии обусловлена циркуляцией таких штаммов МБТ на территории области и их активной трансмиссией у населения. Отсутствуют достоверные различия показателей лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам в гражданском секторе области и в системе заключения, что позволяет использовать одинаковые препараты для лечения. Терапевтический режим химиотерапии должен состоять как минимум из четырех препаратов на стадии интенсивного лечения и трех препаратов на стадии продолжения лечения. Согласно нашим результатам в Архангельской области обосновано применение офлоксацина для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью. Применение этионамида бесполезно вследствие почти 100% устойчивости к данному препарату. Канамицин и канреомицин могут использоваться для лечения 58,4% и 57,1% больных соответственно. Остро стоит проблема поиска дополнительных альтернативных препаратов, которые позволят контролировать распространение туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью.

Изучение молекулярной генетики МБТ, циркулирующих в Архангельской области, позволило объяснить широкое распространение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам за счет высокой доли участия МБТ семейства '-ВеЩщ. Данное семейство представлено 44,5% штаммами МБТ, циркулирующими среди гражданского населения, и 76,3% штаммами МБТ, циркулирующими среди заключенных в местах лишения свободы.

Распространение МБТ семейства '-Вещ^ в историческом аспекте представляет научный интерес. Широкое распространение данного семейства описано на территории северо-западной части России, в частности в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (Нарвская О.В., 2002), где частота его выявления составила 53% в течение 1996—2001 годов. Широкое распространение МБТ семейства '-Веу1щ на территории страны может быть обусловлено его недавним появлением и последующим распространением (Мокро-усов И.В., 2002). Учеными предпринята попытка реконструкции эволюции МБТ семейства '-Веу1щ на территории России. Такие МБТ с родственными индивидуальными рисунками хромосомной ДНК выявлены в Санкт- Петер -бурге, центральной части России и Западной Сибири. Популяция МБТ семейства '-Веу1щ является клональной и представляет собой отдельную под-

группу семейства, распространенную на территории страны (Мокроусов И.В., 2002). Некоторые из индивидуальных рисунков ДНК штаммов МБТ семейства '-Вещ^, изолированные от больных в Архангельской области, входят в кло-нальную подгруппу данного семейства, распространенную на территории России (рис. 4).

Рис. 4. Дендрограмма кластеризации, показывающая генетическое сходство 31 индивидуального рисунка ДНК, полученного при КИР анализе 114 штаммов МБТ, изолированных от больных туберкулезом легких в местах лишения свободы Архангельской области

Примечание: Указаны индивидуальные рисунки ДНК '-Вещтщ МБТ и количество штаммов, соответствующее каждому рисунку. Штаммы, принадлежащие к подгруппе семейства '-Вещщ;, распространенные на территории России указаны (•).

Молекулярно-генетические исследования МБТ в Архангельской области проводятся с 1995 года. Ретроспективный анализ индивидуальных рисунков хромосомной ДНК штаммов МБТ, изолированных от больных туберкулезом легких в течение 1995—1997 годов, выявил только 6 штаммов МБТ, принадлежащих к семейству '-Вещ^. Эти штаммы МБТ были изолированы в 1997 году, распространение семейства '-Веуг^ в этом году составило 7,0%. Можно утверждать, что МБТ семейства '-Вещ^ появились в Архангельской об-

ласти в конце девяностых годов прошлого века, после чего они получили широкое распространение. В начале настоящего века они стали основной причиной, вызывающей туберкулез легких в Архангельской области.

Использование сполиготипирования позволило идентифицировать в Архангельской области штаммы МБТ, принадлежащие к семействам Т, Haarlem и LAM. Семейство Т представляет самую старую на сегодняшний день ветвь эволюции МБТ, оно представлено 5,2% штаммами МБТ. Распространение семейств LAM и Haarlem составляет 3,4% и 1,3% соответственно.

Причины широкого распространения и доминирования МБТ семейства W-Beijing полностью не изучены. Преобладание W-Beijing МБТ предполагает наличие у них селективных преимуществ по сравнению с МБТ других генотипов. Одним из преимуществ является повышенная способность к накоплению мутаций в хромосомном материале, обусловливающих развитие лекарственной устойчивости. В гражданском секторе Архангельской области W-Beijing МБТ часто устойчивы к стрептомицину (73,6%) и изониазиду (62,3%) и несут прямую угрозу распространения лекарственной устойчивости. Инфицирование такими МБТ статистически достоверно коррелирует с лекарственной устойчивостью к этамбутолу (Р = 0,04), изониазиду (Р=0,001), ри-фампицину (Р < 0,001), стрептомицину (Р < 0,001) и множественной лекарственной устойчивостью (Р< 0,001).

В местах лишения свободы показатели устойчивости к изониазиду у штаммов МБТ разных генотипов не имели статистически достоверных отличий и составляли 47,1% для W-Beijing семейства и 44,4% для остальных генотипов. Штаммы МБТ семейства W-Beijing характеризовались высокой частотой устойчивости к стрептомицину (77,0%), рифампицину (41,4%) и этамбутолу (36,8%). При многофакторном анализе установлено, что только лекарственная устойчивость к стрептомицину (Р= 0,02) достоверно коррелирует с принадлежностью штамма МБТ к семейству W-Beijing.

У штаммов МБТ других генотипов множественная лекарственная устойчивость составляет всего 10,6%. Большинство штаммов МБТ (66,7%), принадлежащих к семейству Т, были чувствительны ко всем препаратам, 25,0% штаммов МБТ были устойчивы к изониазиду или этамбутолу, и 8,3% штаммов МБТ обладали устойчивостью к двум перечисленным препаратам. Все штаммы МБТ, представляющие семейство Haarlem, были чувствительны. Штаммы МБТ, принадлежащие к семейству LAM, были чувствительны (25,0%), устойчивы к 2—3 препаратам (50,0%) и ко всем препаратам одновременно (25,0%). Таким образом, штаммы МБТ семейств Т, Haarlem и LAM не несут угрозы распространения лекарственной устойчивости, как это делают МБТ, принадлежащие к семейству W-Beijing.

Использование метода RFLP анализа позволило установить роль реинфек-ции другим штаммом МБТ в эпидемиологии туберкулеза. Изучение реин-фекции проведено с использованием штаммов МБТ, изолированных от 22 больных в разное время в течение 1995—2000 годов. У 7 из 22 больных (31,8%) отмечено выделение штаммов МБТ с разными рисунками хромосомной ДНК согласно RFLP анализу. Индивидуальные рисунки ДНК первого и последующих штаммов МБТ, изолированных от одного больного, отличались друг от друга по количеству вставочных элемиггов 1S6110 и по их локализации. Штаммы МБТ от одного больного были изолированы с промежутком времени в 52—363 дня. Это позволяет исключить эволюционные изменения штаммов МБТ. Обычно изменения в генетическом материале МБТ, затрагивающие один вставочный элемент 1S6110, происходят в течение 3—4 лет (D. van Soolingen, 2001). Таким образом, у 7 из 22 больных (31,8%) первый и последний штаммы МБТ являются разными, что объясняется реинфекцией новым штаммом МБТ.

Впервые дифференцировать возможную реинфекцию другим штаммом МБТ заставил случай, у которого первый штамм МБТ обладал множественной лекарственной устойчивостью, а повторный штамм МБТ был чувствителен ко всем противотуберкулезным препаратам первой линии. Анализ RFLP рисунков позволил установить, что первый штамм МБТ с множественной лекарственной устойчивостью принадлежал к семейству W-Beijing, в то время как второй, чувствительный, штамм МБТ имел другой генотип.

При анализе только профилей лекарственной чувствительности штаммов МБТ, изолированных от одних и тех же больных в разные промежутки времени, трудно дифференцировать реинфекцию, поскольку абсолютное большинство повторных штаммов имеет лекарственную устойчивость к дополнительным противотуберкулезным препаратам. Появление дополнительной лекарственной устойчивости на фоне регулярного и адекватного лечения может быть обусловлено реинфекцией новым штаммом МБТ с лекарственной устойчивостью к дополнительным препаратам.

Модель трансмиссии лекарственно чувствительного и устойчивого туберкулеза легких будет неполной без упоминания роли реинфекции в данном процессе. Реинфекция может наблюдаться как у здоровых, инфицированных индивидуумов, так и у больных туберкулезом на фоне лечения и при наличии контакта с другим инфекционно опасным больным. Реинфекцию следует дифференцировать, если больной на фоне адекватного и регулярно проводимого лечения продолжает или начинает снова выделять штамм МБТ, устойчивый к дополнительным противотуберкулезным препаратам. Индикатором реинфекции является выделение больным штаммов МБТ с отличными друг от друга индивидуальными рисунками ДНК.

В настоящее время, в эру процветания антибактериальных препаратов, эволюция патогенных микроорганизмов, как никогда, направлена на сохранение видов, в результате чего у многих микроорганизмов вследствие мутационного процесса появляются новые генотипы, обладающие эффективными механизмами трансмиссии и повышенной вирулентностью. МВТ, принадлежащие к семейству W-Beijing, являются хорошим примером и широко распространены в Архангельской области. Инфицирование МВТ семейства W-Beijing коррелирует с развитием лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Это может быть обусловлено повышенной способностью МВТ мутировать и приобретать лекарственную устойчивость. Лекарственная устойчивость к рифампицину у МВТ семейства W-Beijing часто (81,4%) развивается в результате 531 TCG —»TTG мутации в гроВ гене. Разная частота распространения мутаций в гроВ гене МВТ свидетельствует о том, что превалирование тех или иных мутаций может быть за счет специфических изменений в генетическом аппарате МВТ, обладающих селективными преимуществами и позволяющих пролиферацию и распространение таких мутантов. Широкое распространение мутации 531 TCG —»TTG у МБТ семейства W-Beijing по сравнению с МВТ других генотипов создает условия для селекции лекарственно устойчивых МБТ семейства W-Beijing.

Доминирование 531 TCG—>TTG мутации в гроВ гене у МБТ семейства W-Beijing может быть объяснено особенностями фитнеса. Понятие фитнеса является комплексным и включает в себя способность микроорганизма к рансмиссии, вирулентности, репродукции и сохранению вида (Cohen Т., 2003). Принадлежность к разным генотипам, разнообразные профили устойчивости к противотуберкулезным препаратам, мутации в генетическом аппарате, метаболизм и фитнес оказывают непосредственное влияние на более или менее успешное распространение отдельных штаммов МБТ.

Изучение фитнеса, а именно его показателя — эффективности репродукции или роста в условиях in vitro — у МБТ семейства W-Beijing до нашего исследования не проводилось. Изучение характеристик роста МБТ проводилось на жидкой питательной среде и культивировании в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960. Изучались показатели роста МБТ, чувствительных и устойчивых к противотуберкулезным препаратам первой линии и принадлежащих к семейству W-Beijing и другим. Основным изучаемым показателем было время, необходимое для достижения роста в 200 единиц.

. Среднее время для достижения роста в 200 единиц у лекарственно чувствительных и устойчивых штаммов МБТ обычных генотипов составило 136,1 час (95% конфиденциальный интервал 126,9—1453) и 162,6 часов (95% конфиденциальный интервал 152,9—172,2) соответственно. Статистический анализ выявил

достоверное замедление роста лекарственно устойчивых МБТ обычных генотипов по сравнению с лекарственно чувствительными МБТ (Р=0,001) (рис. 5).

Статистически достоверные отличия роста наблюдались у штаммов МБТ с разными мутациями в гроВ гене (7=0,01). Быстрым ростом характеризуются штаммы МБТ с мутацией 516 GAC—»GTC (144,6 часа), у штаммов с мутацией 533 CTG —»CCG (200,6 часа) отмечается медленный рост, а у штаммов МБТ с 531TCG—»TTG (165,9 часа) и 526 САС->ТАС (181,2 часа) мутациями наблюдаются средние показатели роста.

Фитнес МБТ генотипа W-Beijing имеет своеобразные отличия. У лекарственно устойчивых МБТ наблюдается две тенденции: у части МБТ отмечается замедление роста и фитнеса, в то время как у других МБТ рост не снижается (рис. 6). Для достижения роста в 200 единиц чувствительным штаммам МБТ потребовалось 143,9 часа (95% конфиденциальный интервал 133,9—153,9), в то время как лекарственно устойчивым штаммам — 154,8 часа (95% конфиденциальный интервал 143,4—166,3), прежде чем их рост составил 200 единиц. Различия в росте лекарственно чувствительных и устойчивых МБТ семейства W-Beijing не были статистически достоверными (Р= 0,17).

Штаммы МБТ с доминирующей мутацией 531 ТСв —>ТТв использовали 144,6 часа для достижения роста в 200 единиц, что соответствовало показателям лекарственно чувствительных штаммов МБТ семейства '-Вещ^. Остальные лекарственно устойчивые штаммы МБТ имели замедление роста (163,8 часов до достижения роста в 200 единиц).

Все штаммы МБТ с множественной лекарственной устойчивостью, характеризующиеся доминирующей 531 ТСв—)ТТв мутацией в гроВ гене, отличаются эффективным ростом и фитнесом и несут угрозу распространения множественной лекарственной устойчивости.

Для устранения бактериологической угрозы необходимо своевременное выявление, прогнозирование развития лекарственной устойчивости и проведение комплекса лечебно-профилактических мероприятий с соблюдением законодательства по национальной безопасности. В условиях чрезвычайной ситуации угрозы развития лекарственно устойчивого туберкулеза легких приобретают важность мероприятия, направленные на обеспечение биологической безопасности населения. Основным методом профилактики дальнейшего распространения лекарственной устойчивости является своевременная диагностика и лечение больных в соответствии с профилем лекарственной

чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Для снижения распространения лекарственно устойчивого туберкулеза легких следует модифицировать бактериологическую диагностику. Внедрение качественных методов определения лекарственной чувствительности с использованием моле-кулярно-генетических технологий позволит диагностировать множественную лекарственную устойчивость у больных туберкулезом в течение нескольких дней после забора материала. При своевременной диагностике множественной лекарственной устойчивости можно избежать длительного приема неэффективных препаратов и амплификации резистентности за счет подбора терапии с учетом лекарственной чувствительности.

Существует несколько альтернативных методов для быстрой и качественной диагностики лекарственной устойчивости: ВАСТЕС, MGIT, TBAlert и молекулярно-генетические методы, направленные на выявление мутаций в гроВ и кшО генах. Отечественными учеными разработан метод, основанный на ПЦР в гроВ и кшО генов. Он позволяет идентифицировать МБТ, имеющие 531 TCG —>"ГГО мутацию в гроВ гене и 315 AGC —>АСС мутацию в кшО гене (Мокроусов И.В., 2003). Таким образом, своевременная диагностика туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью позволит проводить изоляцию инфекционно опасных больных, назначать адекватную химиотерапию, снижать продолжительность бактериовыделения и предотвращать инфицирование здоровых лиц и реинфекцию других больных.

В сложившихся условиях борьба с лекарственно устойчивым туберкулезом легких должна быть ориентирована на своевременную диагностику, предупреждение амплификации лекарственной устойчивости и пресечение транс -миссии лекарственно устойчивых МБТ. Вышеперечисленное вытекает из результатов настоящего исследования и соответствует интересам безопасности Российской Федерации.

ВЫВОДЫ

1. На протяжении последних лет (с 1995 по 2002 год) в Архангельской области сохраняется чрезвычайная ситуация угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких. Высокие показатели лекарственной устойчивости у новых случаев заболевания свидетельствуют о циркуляции и трансмиссии лекарственно устойчивых штаммов МБТ, что создает реальную угрозу здоровью населения.

2 Среди исследованных штаммов МБТ первичная множественная лекарственная устойчивость в гражданском секторе и системе заключения составила 13,5% и 34,0% соответственно. Лекарственная устойчивость

к изониазиду и рифампицину обусловлена генетическим полиморфизмом в кшО и гроВ генах.

3. Лечение лекарственно чувствительного туберкулеза легких приводит к благоприятным исходам заболевания при условии назначения стандартного режима химиотерапии и регулярного приема больными противотуберкулезных препаратов. Устойчивость МБТ к двум (изониазид и рифампицин) и более противотуберкулезным препаратам часто приводит к безуспешному лечению и летальному исходу, увеличению продолжительности бактериовыделения и распространению инфекции среди населения Архангельской области.

4. Широкое распространение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам второй линии (этионамид 92,2%, капреоми-цин 42,9% и канамицин 41,6%) способствует развитию чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам второй линии обусловлена циркуляцией таких штаммов МБТ на территории области и их активной трансмиссией среди населения гражданского сектора и системы заключения.

5. Изучение молекулярной генетики МБТ в Архангельской области позволило идентифицировать МБТ семейства '-Вещ^, распространение которых в гражданском секторе и системе заключения составило 44,5% и 76,3% соответственно. Уровень трансмиссии туберкулеза в системе заключения в несколько раз превышает таковой в гражданском секторе области.

6. В области наблюдается активная трансмиссия лекарственно устойчивых штаммов МБТ, принадлежащих к семейству '-Вещ^, связанная с повышением фитнеса МБТ данного генотипа. Принадлежность штамма МБТ к семейству '-Вещ^ не оказывает существенного влияния на результат лечения туберкулеза. Неблагоприятные исходы лечения при инфицировании штаммом МБТ семейства '-Вещ^ вызваны, прежде всего, широким распространением лекарственной устойчивости у данного семейства МБТ.

7. Селективные преимущества '-Вещ^ штаммов среди других генотипов МБТ обусловлены особенностями их фитнеса, доминированием 531 ТСв —»ТТв мутации в гроВ гене, возможными компенсаторными мутациями, восстанавливающими снижение фитнеса вследствие развития лекарственной устойчивости. Все это объясняет широкое распространение и диссеминацию МБТ семейства '-Вещ^, а также возникновение чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекар -ственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Необходимо продолжать проводить ежегодный мониторинг показателей лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам, развивать бактериологическую лабораторию в АОПД, внедрять методы качественного определения лекарственной устойчивости МБТ (ВАСТЕС, МОГТ, ТВЛ1ег1 и другие) к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии, используя разработанные критерии лекарственной устойчивости, и проводить внутренний и внешний контроль качества определения лекарственной устойчивости.

2. Идентифицированные точечные мутации в гроВ и кМОгенах, служащие маркерами множественной лекарственной устойчивости, позволяют разработать и внедрить экспресс-методы определения лекарственной устойчивости к рифамиицину и изониазиду. Эти методы должны быть основаны на амплификации гроВ и кМО генов с помощью ПЦР, они обеспечат качественную и быструю диагностику множественной лекарственной устойчивости и позволят проводить неотложные мероприятия по устранению чрезвычайной ситуации развития угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

3. Внедрить сполиготипирование, экспресс-метод генотипирования, основанный на ПЦР, позволяющий выявлять больных, инфицированных штаммами МБТ семейства '-Веу1щ, которые обладают повышенной способностью к развитию лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам и играют важную роль в создании чрезвычайной ситуации развития угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

4. Для предупреждения распространения '-ВеЩ^ штаммов МБТ внедрить специализированную программу лечения больных с множественной лекарственной устойчивостью.

5. Изучить лекарственную чувствительность к новым альтернативным противотуберкулезным препаратам при использовании автоматизированных методов исследования (ВАСТЕС, МОГТ, ТВ Л1ег1 и др.). Разработать и внедрить индивидуализированные схемы лечения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью.

6. Для предупреждения реинфекции больных другим штаммом МБТ, обладающим лекарственной устойчивостью, особенно множественной лекарственной устойчивостью, необходимо усилить проводимые противоэпидемические мероприятия в противотуберкулезных медицинских учреждениях.

7. Продолжить изучение биологических особенностей возбудителя туберкулеза, особенно штаммов МБТ семейства W-Beijing, и их роли в возрождении туберкулеза в Архангельской области, распространении лекарственной устойчивости и создании чрезвычайной ситуации раз -вития угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулезалегких.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Toungoussova O.S. Tuberculosis in the Arkhangelsk oblast / O.S. Toungoussova //Hmstkonferansen i mikrobiologi, Oslo, Norway. —13—14 September2001. — P. 14.

2. Spread of Mycobacterium tuberculosis drug-resistant strains belonging to the Beijing family in the Arkhangelsk region, Russia/O.S. Toungoussova, P. Sandven, A.O. Mariandyshev et al. // 3rd International Meeting Combating Infectious Diseases, Arkhangelsk, Russia.—24—27 September 2001. — P. 29—30.

3. Drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis belonging to the Beijing family in the Arkhangelsk oblast, Russia /O.S. Toungoussova, P. Sandven, A. Mariandyshev et al. //32nd IUATLD World Conference on Lung Health, Paris, France. International Journal ofTuberculosis and Lung Disease—2001. — №11. — P.S238.

4. Toungoussova O. Characteristics and importance of drug resistant Mycobacterium tuberculosis of the Beijing genotype in the Arkhangelsk oblast, Russia /O. Toungoussova//Infeksjons forum, Oslo, Norway. —16—17 November 2001.—P. 18.

5. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза в Архангельской области /О.С. Тунгусова, П. Сандвен, А. О. Марьяндышев и др. //Экология человека. — 2001.—№ 3. — С. 21—24.

6. Молекулярная эпидемиология микобактерий туберкулеза в Баренц -регионе России и Норвегии /АО. Марьяндышев, О.С. Тунгусова, Д. А. Каугант, П. Сандвен //Проблемы туберкулеза. — 2001. — № 6. — С. 17— 19.

7. Туигусова О.С. Молекулярные механизмы развития лекарственной устойчивости у микобактерий туберкулеза (обзор литературы) /О.С. Тунгусова, А.О. Марьяндышев //Проблемы туберкулеза. — 2001. — № 6. — С. 48—49.

8. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза в Баренц-регионе России и Норвегии /АО. Марьяндышев, О.С. Тунгусова, Д.А. Каугант, П. Сандвен//Проблемы туберкулеза.—2002.—№2.—С. 41—43.

9. Tuberculosis treatment outcomes in relation to resistance to the first line anti-tuberculosis drugs in Arkhangelsk oblast, Russia /O. Toungoussova, D.A Caugant, P. Sandven et al. //First Student's Scientific Conference. Global

Challenges in Health and Health Research, Institute of International Health, University of Oslo, Norway. — 2—3 May 2002.—P. 8.

10. Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis strains isolated from patients with pulmonary tuberculosis in the Archangels, Russia / O.S. Toungoussova, D.A. Caugant, P. Sandven et al. //International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. — 2002."—№ 6(5). — P. 405—414.

11. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains ofthe Beijing genotype in the Archangel oblast, Russia /O.S. Toungoussova, P. Sandven, A.O. Mariandyshev et al. //Journal ofClinical Microbiology. — 2002.—№40. — P. 1930—1937.

12. Drug-resistant tuberculosis in Archangel prison /O.S. Toungoussova, G. Bjune, P. Sandven, D.A. Caugant //Annual Conference ofthe Institute ofPublic Health, Oslo, Norway.—5—6 December 2002. — P. 26.

13. Toungoussova O. Molecular epidemiology of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in Arkhangelsk, Russia /O. Toungoussova /ЛГВ research conference, Norwegian Institute ofPublic Health, Oslo, Norway. — 12—13 December 2002. — P. 15.

14. Mycobacterium tuberculosis resistance to the second line anti-tuberculosis drugs in Archangel /O.S. Toungoussova, A. Mariandyshev, D.A. Caugant et al. // Second Student's Scientific Conference. Global Challenges in Health and Health Research, Institute ofInternational Health, University of Oslo, Norway. —15—16 May 2003.—P. 51.

15. Особенности ростаМ tuberculosis, обладающих лекарственной устойчивостью и принадлежащих к разным генотипам /О.С. Тунгусова, А.О. Марь-яндышев, Д. А. Каугант и др. //Туберкулез сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. — М., 2003. — С. 92.

16. Лекарственная устойчивость М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам второго ряда в Архангельской области / О.С. Тунгусова, А.О. Марьяндышев, Д.А. Каугант и др. //Туберкулез сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. — М., 2003.—С. 92.

17. Лекарственная устойчивость и результаты лечения туберкулеза легких в Архангельской области /О.С. Тунгусова, Н.И. Низовцева, ТВ. Тоичкина идр. //Аллергология и иммунология.—2003.—Т. 4 — № 2 — С. 98—99.

18. Распространение микобактерий туберкулеза генотипа Beijing у больных туберкулезом легких в Архангельской области /О.С. Тунгусова, П. Санд-вен, А.О. Марьяндышев и др. //Аллергология и иммунология. — 2003. —Т. 4 — №2. — С. 98.

19. Тунгусова О.С. Бактериология и молекулярная генетика микобактерий туберкулеза/О. С. Тунгусова. —Архангельск: Северный научный центр Северо-Западного отделения РАМН, Северный государственный медицинский университет, 2003. — 101 с.

20. Molecular epidemiology and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolates in the Archangel prison, Russia: predominance of the W-Beijing clone family/O.S. Toungoussova, A.O. Mariandyshev, G. Bjune et al. //Clinical Infectious Disease.—2003.—№ 37._p. 665—672.

21. Impact of drug resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis strains ofthe W-Beijing genotype /O.S. Toungoussova, D.A. Caugant, P. Sandven et al. //20th Annual Meeting of the Scandinavian Society for Antimicrobial Chemotherapy, Odense, Denmark. — 24—26 October 2003.—P. 5.

22. Drug resistance and fitness of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing genotype /O.S. Toungoussova, D.A. Caugant, P. Sandven et al. //Annual Conference of the Institute of Public Health, Oslo, Norway. — 4—5 December 2003.—P. 47.

23. Тунгусова О.С. Молекулярная генетика микобактерий туберкулеза/ О.С. Тунгусова //Проблемы туберкулеза. — 2003.—№ 2. — С. 43—45.

Подписано в печать 3.03.2004. Формат 60х84/|6. Усл.-печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 252

Издательский центр СГМУ

г. Архангельск, пр. Троицкий, 51, каб. 330 Телефон (8182) 20-61-90

m-8 0 9 1

Список сокращений, принятых в диссертации

Введение

Глава! Обзор литературы

1.1. Эпидемиология туберкулеза в мировом масштабе

1.2. Эпидемиология туберкулеза в Архангельской области

1.3. Лечение туберкулеза

1.4. История развития и классификация лекарственной устойчивости

1.5. Молекулярно-генетические механизмы развития лекарственной устойчивости

1.6. Исторические и молекулярно-генетические аспекты распространения МВТ семейства W-Beijing

1.7. Лекарственная устойчивость и фитнес МВТ

Резюме

Глава П. Методология научного исследования (материалы и методы)

2.1. Материалы исследования

2.1.1. Штаммы МБТ

2.1.2. Больные туберкулезом легких

2.2. Методы исследования 66 2.2.1. Видовая идентификация штаммов

Глава III.

Глава IV.

Глава V.

2.2.2. Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам

2.2.3. Идентификация мутаций в гроВ гене, обусловливающих устойчивость к рифампицину

2.2.4. Определение последовательности аминокислот в ксйО гене и идентификация мутаций, обусловливающих лекарственную устойчивость к изониазиду

2.2.5. Анализ полиморфизма длин рестрикции ДНК

2.2.6. Сполиготипирование

2.2.7. Культивирование МБТ в системе МШТ для изучения характеристик роста, как показателя фитнеса

2.2.8. Статистический анализ данных

2.2.9. Используемые определения

Лекарственная устойчивость МБТ к противотуберкулезным препаратам первой линии в Архангельской области

Влияние лекарственной устойчивости МБТ на результаты лечения туберкулеза легких

4.1. Результаты лечения туберкулеза легких в Архангельской области

4.2. Результаты лечения туберкулеза легких в зависимости от чувствительности к противотуберкулезным препаратам первой линии 108 Лекарственная устойчивость МБТ к противотуберкулезным препаратам второй линии

Глава VI. Молекулярная генетика МВТ, выделенных у больных туберкулезом легких в Архангельской области

6.1. Молекулярная генетика МБТ, изолированных от больных туберкулезом в гражданском секторе области

6.2. Молекулярная генетика МБТ, изолированных от больных туберкулезом в местах лишения свободы

6.3. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей штаммов МБТ, циркулирующих среди гражданского населения и заключенных Архангельской области

6.4. Роль реинфекции в эпидемиологии туберкулеза

6.5. Моделирование механизмов развития туберкулеза легких

Глава VII. Биологическая характеристика штаммов МБТ семейства W-Beijing

7.1. Показатели роста, как индикатор фитнеса штаммов МБТ, принадлежащих к разным генотипам

7.1.1. Пилотное исследование. Разработка методологии эксперимента

7.1.2. Воспроизведение результатов

7.2. Показатели роста штаммов МБТ, не принадлежащих к семейству W-Beijing

7.3. Показатели роста штаммов МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing

7.4. Показатели роста парных штаммов МБТ, изолированных от одних и тех же больных в разные промежутки времени после приобретения лекарственной устойчивости к дополнительным препаратам 182 7.5. Гипотеза широкого распространения штаммов МВТ семейства \¥-Веутд, основанная на анализе фитнеса

Обсуждение результатов

Выводы

Актуальность проблемы

Проблема искоренения инфекционных заболеваний является одной из Глобальных проблем современности и угроз здоровью [23]. Здоровье населения Российской Федерации рассматривается как компонент жизненно важных интересов личности и общества. Концепция национальной безопасности [26] - главный документ Российской Федерации по безопасности, основным элементом которого является осуществление безопасности, повышение качества и уровня жизни и обеспечение здоровья населения. Среди инфекционных заболеваний туберкулез легких представляет основную причину смертности и ведущую угрозу здоровью населения страны. В сложившихся условиях остро стоит вопрос обеспечения биологической безопасности, которая должна быть предоставлена каждому гражданину согласно Федеральному закону «О безопасности» [24].

Современный этап развития туберкулеза легких характеризуется неуклонным ростом эпидемиологических показателей и изменением биологических особенностей и структуры популяции микобактерий туберкулеза (МБТ), значительную часть которой занимают микроорганизмы, устойчивые к основным противотуберкулезным препаратам, особенно микроорганизмы с множественной лекарственной устойчивостью.

Проблема распространения лекарственно устойчивого туберкулеза является актуальной по нескольким причинам.

1. Инфицирование лекарственно устойчивыми МБТ представляет собой реальную угрозу здоровью населения и прямую угрозу развития неизлечимого заболевания [159].

2. Арсенал средств, предназначенных для лечения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью, ограничен [9]. Проблема может быть разрешена при использовании имеющихся и разработке новых противотуберкулезных препаратов второго ряда. Известно, препараты второго ряда являются менее эффективными, имеют выраженные побочные действия и токсические эффекты и требуют больших экономических вложений [82,120, 229].

Изменения в генетическом аппарате МБТ направлены на развитие лекарственной устойчивости и появление новых генотипов возбудителя. МБТ, принадлежащие к семейству \V-Beijing, являются хорошим примером, они обладают повышенной вирулентностью и рядом других преимуществ, которые позволяют сохранить вид МБТ в условиях эффективной химиотерапии. МБТ с множественной лекарственной устойчивостью согласно классификации степени потенциальной угрозы инфекционных агентов относятся к категории С [22]. В эту категорию включены возбудители инфекционных заболеваний, обладающие высокой трансмиссией и способностью к воспроизводству. В связи с этим особую значимость приобретают вопросы биологической безопасности нации как необходимого условия устойчивого развития страны.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования - изучить молекулярно-генетические аспекты развития лекарственной устойчивости у штаммов МБТ, циркулирующих в Архангельской области в условиях чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких, и разработать мероприятия, позволяющие снизить распространение данного заболевания.

Для достижения указанной цели определены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ показателей и профилей лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам первой линии в условиях чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

2. Выявить и проанализировать профили лекарственной устойчивости МБТ, которые обусловливают неблагоприятные исходы туберкулеза легких и способствуют дальнейшему распространению заболевания.

3. Изучить показатели и профили лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам второй линии и предложить противотуберкулезные препараты второй линии для лечения больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью.

4. Провести сравнительную генетическую характеристику штаммов МБТ, циркулирующих в гражданском секторе и местах лишения свободы Архангельской области, с использованием анализа полиморфизма фрагментов длин рестрикции (от англ. RFLP - restriction fragment length polymorphism analysis) дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и сполиготипирования.

5. Определить эпидемиологическую роль МБТ семейства W-Beijing в создании чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области.

6. Изучить и проанализировать биологические особенности возбудителя туберкулеза, являющиеся причинами широкого распространения лекарственно устойчивых штаммов МБТ, принадлежащих к семейству Веут&

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На протяжении последних лет в Архангельской области сохраняется чрезвычайная ситуация угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких. Особую биологическую угрозу представляет трансмиссия штаммов МБТ, устойчивых к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии, что значительно затрудняет выбор адекватного режима химиотерапии и излечение данного заболевания.

Доминирование 531 ТСО—>ТТО мутации в гроВ гене и 315 АСтС—>АСС мутации в ШО гене предусматривает формирование селективных преимуществ у МБТ, обусловливающих развитие и широкое распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью на территории области.

Результаты лечения туберкулеза легких в Архангельской области не достигли должного уровня в связи с большим числом случаев прерванного лечения и распространением лекарственно устойчивых МБТ. Исход заболевания не зависит от принадлежности штамма МБТ, которым инфицирован больной, к семейству \\МЗеуп^. Исход заболевания в первую очередь зависит от чувствительности штамма МБТ к противотуберкулезным препаратам.

В Архангельской области основной причиной туберкулеза легких являются штаммы МБТ, принадлежащие к семейству АУ-Веуц^. Принадлежность МБТ к семейству \У-Веуи^ достоверно коррелирует с наличием устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии. Появление лекарственной устойчивости МБТ к дополнительным препаратам на фоне адекватного и регулярного лечения может быть обусловлено реинфекцией новым лекарственно устойчивым штаммом МБТ.

Рост штаммов МБТ в условиях in vitro характеризуется фенотипическим и генотипическим полиморфизмом. У лекарственно устойчивых штаммов МБТ обычных генотипов происходит замедление роста по сравнению с лекарственно чувствительными штаммами МБТ. Часть лекарственно устойчивых штаммов МБТ семейства W-Beijing характеризуется замедлением роста, у другой части МБТ данного генотипа не отмечено изменения роста после приобретения лекарственной устойчивости. Селективные преимущества МБТ семейства W-Beijing обусловлены особенностями их роста и доминированием 531 TCG—>TTG мутации в гроВ гене.

КОНЦЕПЦИЯ РАБОТЫ

Сохранение здоровья населения является приоритетом обеспечения биологической безопасности страны. Среди инфекционных заболеваний туберкулез легких представляет реальную угрозу здоровью населения и занимает ведущее положение в структуре их смертности.

Основное направление работы связано с определением молекулярно-генетических механизмов развития и распространения лекарственно устойчивого туберкулеза легких в зависимости от биологических особенностей возбудителя в условиях чрезвычайной ситуации природного характера.

Ежегодный рост показателей лекарственной устойчивости, распространение МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing, в структуре популяции возбудителя туберкулеза создают условия для трансмиссии лекарственно устойчивых штаммов МБТ, инфицирования восприимчивого населения и развития у него заболевания, излечение которого является сложной задачей. Множественная лекарственная устойчивость, низкая эффективность химиотерапии и широкое распространение резистентности к противотуберкулезным препаратам второго ряда делают туберкулез легких неизлечимым заболеванием.

Для устранения бактериологической угрозы, отрицательного воздействия на жизнедеятельность и здоровье населения необходимо своевременное выявление, прогнозирование развития лекарственной устойчивости и проведение комплекса лечебно-профилактических мероприятий с соблюдением законодательства по национальной безопасности. Основным методом устранения биологической опасности в создавшихся условиях является своевременная и качественная диагностика туберкулеза с применением молекулярно-генетических методов и лечение больных в соответствии с индивидуальными профилями лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведен мониторинг показателей лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии в течение 1995-2002 годов и сделан сравнительный анализ индивидуальных профилей лекарственной чувствительности МБТ, выделенных от больных туберкулезом легких в Архангельской области.

Подтверждена роль мутаций в гроВ гене при развитии лекарственной устойчивости к рифампицину, которые служат маркером множественной лекарственной устойчивости. Впервые идентифицированы мутации в ксйО гене, обусловливающие развитие лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду при туберкулезе легких в Архангельской области, которые могут служить дополнительным маркером множественной лекарственной устойчивости.

Впервые представлены и проанализированы результаты лечения туберкулеза легких в зависимости от профиля лекарственной устойчивости и принадлежности к семейству W-Beijing.

Впервые изучена лекарственная устойчивость к противотуберкулезным препаратам второй линии и предложены препараты, которые возможно использовать для химиотерапии больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью.

Проведена сравнительная генетическая характеристика штаммов МВТ, вызывающих туберкулез легких в Архангельской области. Впервые идентифицировано распространение МВТ, принадлежащих к семействам Т, Haarlem и LAM, и установлена эпидемиологическая роль МБТ семейства W-Beijing в развитии чрезвычайной ситуации угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких на территории Архангельской области. Доказано, что высокий показатель кластерности МБТ семейства W-Beijing является косвенным показателем повышения фитнеса МБТ данного генотипа и обусловливает селективные преимущества при распространении лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

Впервые определена роль реинфекции новым лекарственно устойчивым штаммом МБТ на фоне проводимого лечения, которая может объяснить появление лекарственной устойчивости к дополнительным противотуберкулезным препаратам на фоне адекватной и регулярной химиотерапии.

Впервые изучены биологические особенности и фитнес штаммов МБТ, обладающих разными профилями лекарственной устойчивости и принадлежащих к разным генотипам. В частности, установлены профили лекарственной устойчивости и виды мутаций в гроВ гене, обусловливающие селективные превосходства МБТ семейства W-Beijing по сравнению с МБТ других генотипов и способствующие широкому распространению и диссеминации МБТ с множественной лекарственной устойчивостью у новых случаев.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Изучены распространение лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области и исходы заболевания в зависимости от индивидуального профиля лекарственной чувствительности штамма МВТ и его принадлежности к определенному генотипу. Установлены индивидуальные профили лекарственной устойчивости, затрудняющие лечение туберкулеза легких и приводящие к неблагоприятным исходам (летальный исход и безуспешное лечение).

Установлены точечные мутации в кагЭ и гроВ генах МВТ, позволяющие разработать и внедрить экспресс методы определения множественной лекарственной устойчивости, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Выявление активной трансмиссии штаммов МВТ семейства \V-Beijing и роли реинфекции новым штаммом МВТ на фоне проводимого адекватного регулярного лечения позволяет предложить и внедрить эпидемиологические мероприятия в противотуберкулезных медицинских учреждениях, а именно разграничение потоков инфекционно опасных больных и изоляцию больных, выделяющих штаммы МВТ с множественной лекарственной устойчивостью.

Изучение особенностей показателей роста лекарственно устойчивых штаммов МВТ семейства \V-Beijing, как характеристики фитнеса, позволило расширить знания в области биологических особенностей возбудителя и сформулировать гипотезу широкого распространения штаммов МВТ семейства \V-Beijing.

Основные положения диссертации и вытекающие из них рекомендации в настоящее время используются в педагогической работе на кафедре фтизиопульмонологии Северного государственного медицинского университета (акт внедрения 2004 год), в практической работе Архангельского областного противотуберкулезного диспансера (АОПД) (акт внедрения 2001 год, 2004 год) и Мурманского областного противотуберкулезного диспансера (акт внедрения 2004 год). Бактериологический мониторинг лекарственной устойчивости при туберкулезе легких проводится с 1995 года, за эти годы созданы коллекция штаммов МВТ и компьютерная база данных, состоящая из профилей чувствительности к противотуберкулезным препаратам и индивидуальных рисунков хромосомной ДНК МБТ, циркулирующих в Архангельской области. Созданная база данных используется для проведения научных исследований в рамках молекулярной эпидемиологии и молекулярной генетики, а также для анализа качества практической работы бактериологической службы Архангельской области.

Ежегодно проводится определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам первого ряда радиометрическим методом ВАСТЕС и определение вида мутаций в гроВ гене методом ШЖ)-1лРа Ш£ ТВ у больных с новыми случаями заболевания. При выявлении множественной лекарственной устойчивости проводится исследование на чувствительность к противотуберкулезным препаратам второго ряда, результаты которого учитываются при выборе противотуберкулезных препаратов и назначении режима химиотерапии. Диссертационное исследование выполнено в рамках региональной научно-технической программы «Здоровье населения Европейского Севера», имеет номер гос. регистрации ГР 01200316208.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и обсуждены: на Осенней конференции микробиологов, г. Осло, Норвегия, 13-14 сентября 2001 г.; третьей международной встрече Борьба с инфекционными заболеваниями в странах Балтийского моря и Баренцевом регионе, г. Архангельск, Россия, 2427 сентября 2001 г.; 32 Всемирном конгрессе Международного союза по борьбе с туберкулезом и заболеваниями легких, г. Париж, Франция, 1-4 ноября 2001 г.; Форуме инфекционистов, г. Осло, Норвегия, 16-17 ноября

2001 г.; Первой международной научной конференции института международного здоровья, университета Осло, г. Осло, Норвегия, 2-3 мая

2002 г.; Дневном семинаре института общей врачебной практики, г. Осло, Норвегия, 23 октября 2002 г.; Ежегодной научной конференции Норвежского института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 5-6 декабря 2002 г.; Научной конференции по туберкулезу, Норвежского института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 12-13 декабря 2002 г.; Второй международной научной конференции института международного здоровья, университет Осло, г. Осло, Норвегия, 15-16 мая 2003 г.; Российском съезде фтизиатров, г. Москва, 3-5 июня 2003 г.; XVII Всемирном конгрессе по астме и V съезде иммунологов и аллергологов СНГ, г. Санкт-Петербург, 5-11 июля

2003 г.; Скандинавской встрече по туберкулезу, г. Осло, Норвегия, 10 октября 2003 г.; 20 съезде Скандинавского общества антимикробной терапии, г. Оденса, Дания, 24-26 октября 2003 г.; Ежегодной научной конференции Норвежского института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 4-5 декабря 2003 г.

ПУБЛИКАЦИИ

Результаты и основные положения диссертации опубликованы в 23 печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 229 енстраницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, содержит материалы и методы собственных исследований, их результаты и обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Текст диссертационной работы иллюстрирован 15 рисунками и 40 таблицами. Указатель литературы

ВЫВОДЫ

1. На протяжении последних лет (с 1995 по 2002 год) в Архангельской области сохраняется чрезвычайная ситуация угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких. Высокие показатели лекарственной устойчивости у новых случаев заболевания свидетельствуют о циркуляции и трансмиссии лекарственно устойчивых штаммов МБТ, что создает реальную угрозу здоровью населения.

2. Среди исследованных штаммов МБТ первичная множественная лекарственная устойчивость в гражданском секторе и системе заключения составила 13,5% и 34,0% соответственно. Лекарственная устойчивость к изониазиду и рифампицину обусловлена генетическим полиморфизмом в \zatG и гроВ генах.

3. Лечение лекарственно чувствительного туберкулеза легких приводит к благоприятным исходам заболевания при условии назначения стандартного режима химиотерапии и регулярного приема больными противотуберкулезных препаратов. Устойчивость МБТ к двум (изониазид и рифампицин) и более противотуберкулезным препаратам часто приводит к безуспешному лечению и летальному исходу, увеличению продолжительности бактериовыделения и распространению инфекции среди населения Архангельской области.

4. Широкое распространение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам второй линии (этионамид 92,2%, капреомицин 42,9% и канамицин 41,6%) способствует развитию чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам второй линии вызвана циркуляцией таких штаммов МБТ на территории области и их активной трансмиссией среди населения гражданского сектора и системы заключения.

5. Изучение молекулярной генетики МВТ в Архангельской области позволило идентифицировать МВТ семейства \V-Beijing, распространение которых в гражданском секторе и системе заключения составило 44,5% и 76,3% соответственно. Уровень трансмиссии туберкулеза в системе заключения в несколько раз превышает таковой в гражданском секторе области.

6. В области наблюдается активная трансмиссия лекарственно устойчивых штаммов МВТ, принадлежащих к семейству \У-Веушд, связанная с повышением фитнеса МВТ данного генотипа. Принадлежность штамма МВТ к семейству \У-Веуп^ не оказывает существенного влияния на результат лечения туберкулеза. Неблагоприятные исходы лечения при инфицировании штаммом МВТ семейства \У-Веушд вызваны, прежде всего, широким распространением лекарственной устойчивости у данного семейства МВТ.

7. Селективные преимущества \^-Веуищ штаммов среди других генотипов МВТ обусловлены особенностями их фитнеса, доминированием 531 ТСО—»ТТО мутации в гроВ гене, возможными компенсаторными мутациями, восстанавливающими снижение фитнеса вследствие развития лекарственной устойчивости. Все это объясняет широкое распространение и диссеминацию МВТ семейства Ш-Веу^, а так же возникновение чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Необходимо продолжать проводить ежегодный мониторинг показателей лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам, развивать бактериологическую лабораторию в АОПД, внедрять методы качественного определения лекарственной устойчивости МБТ (ВАСТЕС, МШТ, ТВАкЛ и другие) к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии, используя разработанные критерии лекарственной устойчивости и проводить внутренний и внешний контроль качества определения лекарственной устойчивости.

2. Идентифицированные точечные мутации в гроВ и ка(С генах, служащие маркерами множественной лекарственной устойчивости, позволяют разработать и внедрить экспресс методы определения лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду. Эти методы должны быть основаны на амплификации гроВ и ка(С генов с помощью ПЦР, они обеспечат качественную и быструю диагностику множественной лекарственной устойчивости и позволят проводить неотложные мероприятия по устранению чрезвычайной ситуации развития угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

3. Внедрить сполиготипирование, экспресс метод генотипирования, основанный на ПЦР, позволяющий выявлять больных, инфицированных штаммами МБТ семейства \V-Beijing, которые обладают повышенной способностью к развитию лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам и играют важную роль в создании чрезвычайной ситуации развития угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

4. Для предупреждения распространения штаммов МБТ внедрить специализированную программу лечения больных с множественной лекарственной устойчивостью.

5. Изучить лекарственную чувствительность к новым альтернативным противотуберкулезным препаратам при использовании автоматизированных методов исследования (ВАСТЕС, М01Т, ТВА1е11 и др.). Разработать и внедрить индивидуализированные схемы лечения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью.

6. Для предупреждения реинфекции больных другим штаммом МБТ, обладающим лекарственной устойчивостью, особенно множественной лекарственной устойчивостью, необходимо усилить проводимые противоэпидемические мероприятия в противотуберкулезных медицинских учреждениях.

7. Продолжить изучение биологических особенностей возбудителя туберкулеза, особенно штаммов МБТ семейства \¥-Веут§, и их роль в возрождении туберкулеза в Архангельской области, распространении лекарственной устойчивости и создании чрезвычайной ситуации развития угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.

1. Анализ результатов лечения туберкулеза в Архангельской области за 1999 год /А.О. Марьяндышев, Н.И. Низовцева, Т.В. Тоичкина, Е.И. Никишова //Борьба с инфекционными заболеваниями в странах Баренц региона. -2001.-С. 33-35.

2. Биологические свойства лабораторных штаммов и клинических изолятов микобактерий с множественной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам /А.А. Корнеев, В.И. Голышевская, Э.В. Севастьянова и др. //Проблемы туберкулеза 1999. - № 2. - С. 44-47.

3. Вирулентность микобактерий туберкулеза /Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская, С.Н. Васильева и др. //Проблемы туберкулеза. 2002. - № 10. -С. 33-36.

4. ВИЧ инфекция в Северо-западном федеральном округе в 2001 году: Информационный бюллетень /СПб.: Бостон-спектр, 2002. 28 с.

5. Вишневский Б.И. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза на северо-западе России /Б.И. Вишневский, Е.Б. Вишневская //Проблемы туберкулеза. 2003. - № 5. - С. 42-45.

6. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных на Северо-Западе России /О.В. Нарвская, И.В. Мокроусов, Т.Ф. Оттен, В.И. Вишневский //Проблемы туберкулеза. 1999. - № 3. - С. 39-41.

7. Диагностика, клиника и тактика лечения остропрогрессирующих форм туберкулеза легких в современных эпидемиологических условиях /А.Г. Хоменко, В.Ю. Мишин, В.И. Чуканов и др. //Проблемы туберкулеза. -1999.-№ 1. С. 22-27.

8. Ильина Т.Я. Резистентность микобактерий туберкулеза у впервые выявленных больных туберкулезом и при рецидивах заболевания /Т.Я. Ильина, А.А. Жангиреев, О.А. Сидоренко //Проблемы туберкулеза. -2003.-№5.-С. 19-21.

9. Кибрик Б.С. Некоторые особенности лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза у больных с остропрогрессирующими деструктивными формами туберкулеза легких /Б.С. Кибрик, О.Г. Челнонова //Проблемы туберкулеза. 2003. - №8. - С. 3-5.

10. Ю.Левашев Ю.Н. Состояние и перспективы борьбы с туберкулезом на северо-западе России /Ю.Н. Левашев //Проблемы туберкулеза. 2003. - № 10.-С. 3-9.

11. Н.Лялина Е.Л. Туберкулез легких у лиц, бывших в заключении /Е.Л. Лялина, Н.А. Рогожина, В.Н. Гурьянов //Проблемы туберкулеза. 2003. - № 4. - С. 44-45.

12. Марьяндышев А.О. Лечение больных туберкулезом. Программа краткосрочной химиотерапии больных туберкулезом /А.О. Марьяндышев, Н.И. Низовцева, В.И. Дитятев. Архангельск: Северный государственный медицинский университет, 2001. - 26 с.

13. Министерство Российской Федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий. Защита населения и территорий в чрезвычайных ситуациях /Под ред. М.И. Фалеева. Калуга: ГУП «Облиздат». 2001. - 480 с.

14. Мишин В. Ю., Макиева В. Г., Поспелов JI. Е. и др. //Материалы Юбилейной сессии ЦНИИТ РАМН. М., 2001. - С. 56-57.

15. Молекулярная характеристика клинических мультирезистентных штаммов микобактерии туберкулеза, изолированных в России /Е.В. Генерозов, Т.А. Акопян, В.М. Говорун и др. //Молекулярная генетика микробиология вирусология 2000. - № 1. - С. 11-17.

16. Молекулярная эпидемиология туберкулеза /О.В. Нарвская, И.В. Мокроусов, Е.В. Лимещенко и др. //Большой целевой журнал о туберкулезе. 2000. - № 78. - С. 4-6.

17. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных, оперированных по поводу туберкулеза легких /О.В. Нарвская, Б.И. Вишневский, A.B. Елькин и др. //Проблемы туберкулеза 2002. - № 3. - С. 50-53.

18. Особенности клинической картины и лечения туберкулеза у ВИЧ-инфицированных больных /О.И. Аухтун, B.C. Голанов, Н.Г. Березин, E.H. Кирбятьева//Проблемы туберкулеза. 2002. - № 11. - С. 21-23.

19. Пальцев М.А. Биологическое оружие проблема национальной безопасности России /М.А. Пальцев //Национальная безопасность. - 2002. -№1-2.

20. Политология. Курс лекций. /ОмГПУ. Омск., 1995.

21. Правительство Российской Федерации Закон «О безопасности» /Закон Правительства Российской Федерации. 5 марта 1992. - № 2446-1.

22. Правительство Российской Федерации. О реализации Федерального закона «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской

23. Федерации». Постановление Правительства Российской Федерации № 892 от 25.12.2001.

24. Президент Российской Федерации Концепция национальной безопасности /Указ Президента Российской Федерации. -17 декабря 1997. № 1300.

25. Пунга В.В. Туберкулез в России /В.В. Пунга, Л.П. Капков //Проблемы туберкулеза. 1999. № 1. - С. 14-16.

26. Рудой Н.М. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза /Н.М. Рудой. М.: Медицина, 1969. - 255 с.

27. Теория вероятностей и математическая статистика: Учебн. пособ. //Под ред. В.А. Колемаева.- М.: Высш. шк., 1991.- 400с.

28. Туберкулез легких, вызванный Mycobacterium tuberculosis различных генотипов /Н.В. Сапожникова, Л.А. Скворцова, М.В.Павлова и др. //Проблемы туберкулеза. 2003. - № 10. - С. 13-15.

29. Ускоренная культуральная диагностика туберкулеза с использованием автоматизированных систем ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВАСТ /О.А. Иртуганова, Н.С. Смирнова, А.М. Мороз, В.И. Литвинов //Проблемы туберкулеза 2002. - № 1. - С. 58-62.

30. Характеристика циркулирующих на северо-западе России штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием сполиготипирования /О.В.

31. Нарвская, И.В. Мокроусов, Е.В. Лимищенко и др. //Проблемы туберкулеза. 2002. - № 4. - С. 44-48.

32. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes /В. Lopez, D. Aguilar, H. Orozco et al. //Clin. Exp. Immunol. 2003. - № 133. - P. 30-37.

33. A multi-institutional outbreak of highly drug-resistant tuberculosis. Epidemiology and clinical outcomes /T.R. Frieden, L.F. Sherman, K.L. Maw et al. //JAMA. 1996. - № 276. - P. 1229-35.

34. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex /R. Brosch, S.V. Gordon, M. Marmiesse et al. //PNAS. 2002. - № 99. - P. 36843689.

35. Albino J.A. Multidrug-resistant tuberculosis /J.A. Albino, L.B. Reichman //Current. Opin. Infect. Dis. 1997. - № 10. - P. 116-122.

36. Amikacin in the treatment of pulmonary tuberculosis /B.W. Allen, D. Mitchison, Y.C. Chan et al. //Tubercle. 1983. - № 64. - P. 111-118.

37. Andersson D.I. The biological cost of antibiotic resistance /D.I. Andersson, B.R. Levin //Current. Opin. Microbiol. 1999. - № 2. - P. 489-493.

38. Anti-tuberculosis drug resistance in community and prison patients, Orel oblast, Russian Federation /Р. Spradling, E. Nemtsova, T. Aptekar et al. /Ant. J. Tuberc. Lung. Dis. 2002. - № 6. - P. 757-762.

39. Anti-tuberculosis drug resistance in the world. Report No. 2. Prevalence and trends. /The WHO/IUATLD Global project on anti-tuberculosis drug resistance surveillance. 2000. - 253 p.

40. Bifani P.J. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains /P.J. Bifani, B. Mathema, N.E. Kurepina //Trends. Microbiol. -2002. -№ 10.-P. 45-52.

41. Billington O.J. Physiological cost of rifampin resistance induced in vitro in Mycobacterium tuberculosis /O.J. Billington, T.D. McHugh, S.H. Gillespie //Antimicrobial. Agents. Chemother. 1999. - № 43. - P. 1866-1869.

42. Blower S.M. Problems and solutions for the Stop TB partnership //S.M. Blower, C.L. Daley //The Lancet Infect. Dis. 2002. - № 2. - P. 374-376.

43. Blower S.M. Understanding, predicting and controlling the emergence of drug-resistant tuberculosis: a theoretical framework /S.M. Blower, J.L. Gerberding //J. Mol. Med. 1998. - № 76. - P. 624-636.

44. Brooks G.F. Medical microbiology /G.F. Brooks, J.S. Butel, S.A. Morse. -McGraw-Hill: Medical Books, 2001. 176 p.

45. Cantwell M.F. Tuberculosis in sub-Saharan Africa: A regional assessment of the impact of the human immunodeficiency virus and National Tuberculosis Control Program quality /M.F. Cantwell, N.J. Binkin //Tubercle. Lung. Disease. 1996.-№77.-P. 220-225.

46. CDC. Acquired multidrug-resistant tuberculosis Buenaventura, Colombia //MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1998. - № 47. - P. 759-761.

47. CDC. Epidemiologic notes and reports nosocomial transmission of multidrug-resistant tuberculosis among HIV-infected persons Florida and New York //MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. -1991. - № 40. - P. 585-591.

48. CDC. Epidemiologic notes and reports nosocomial transmission of multidrug-resistant tuberculosis to health-care workers and HIV-infected patients in an urban hospital Florida //MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1990. - № 39. -P. 718-722.

49. CDC. Evaluation of a directly observed therapy short-course strategy for treating tuberculosis in Orel oblast, Russian Federation, 1999-2000 //Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2001. - № 50. - P. 204-206.

50. CDC. Outbreak of multidrug-resistant tuberculosis Texas, California, and Pennsylvania //MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1990. - № 39. - P. 369372.

51. CDC. Screening for tuberculosis and tuberculosis infection in high risk populations //MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 1995. - № 44. - P. 3-17.

52. CDC. Tuberculosis treatment interruptions in Ivanovo oblast, Russian Federation, 1999 //Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2001. - № 50. - P. 201-204.

53. CDC. WHO/IUATLD Global project on anti-tuberculosis drug resistance surveillance //TB Notes. 1997. - № 4. - P. 15-18.

54. Characterization of the katG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis /D.A. Rouse, Z. Li, G.H. Bai, S.L. Morris //Antimicrobial. Agents. Chemother. 1995. - № 39. - P. 2472-2477.

55. Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by spoligotyping /H. Soini, X.I. Pan, A. Amin et al. //J. Clin. Microbiol. 2000. 38. - P. 669-676.

56. Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Middle East IS. Ahmad, G.F. Araj, P.K. Akbar et al. //Diagnostic. Microbiol. Infect. Dis. 2000. - № 38. - P. 227-232.

57. Characterization of rpsL and rrs mutations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse geographic localities /S. Sreevatsan, X. Pan, K.E. Stockbauer et al. //Antimicrob. Agents. Chemother. -1996.-№40.-P. 1024-1026.

58. Characterization of streptomycin resistance mechanisms among Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in New York City /R.C. Cooksey, G.P. Morlock, A. McQueen et al. //Antimicrob. Agents. Chemother. 1996. - № 40. -P. 1186-1188.

59. Clinical microbiology procedures handbook /Isenberg, Henry D. ed. American Society for Microbiology Washington: D.C., 1992.

60. Cohen T. The effect of drug resistance on the fitness of Mycobacterium tuberculosis /T. Cohen, B. Sommers, M. Murray //Lancet Infect. Dis. 2003. -№ 3. - P. 13-21.

61. Cole S.T. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis /S.T. Cole, A. Telenti //Eur. Respir. J. 1995. - № 20. - P. 701-713.

62. Cole S.T. Mycobacterium tuberculosis drug-resistance mechanisms /S.T. Cole //Trends. Microbiol. 1994. - № 2. - P. 411-414.

63. Comparison of a radiometric method (BACTEC) and conventional culture media for recovery of mycobacteria from smear-negative specimens /M.A. Morgan, C.D. Horstmeier, D.R. de Young, G.D. Roberts //J. Clin. Microbiol. -1983.18.-P. 384-388.

64. Compensatory aphC gene expression in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis /D.R. Sherman, K. Mdluli, M.J. Hickey et al. //Science. 1996. - P. 272-p. 1641-1643.

65. Correlation of molecular resistance mechanisms and phenotypic resistance levels in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis /A. Meier, P.

66. Sander, K-J. Schaper et al. //Antimicrob. Agents. Chemother. 1996. - № 40. -P. 2452-2454.

67. Crofton S.J. Clinical tuberculosis /S.J. Crofton, N. Hörne, F. Miller. London: Macmillan, 1999. - P. 222.

68. Cross-resistance in M. tuberculosis to kanamycin, capreomycin, and viomycin /J.K. McClatchy, W. Kanes, P.T. Davidson, T.S. Moulding //Tubercle. 1977. -№58.-P. 29-34.

69. Decentralization of the DOTS programme within a Russian penitentiary system /A. Slavuckij, V. Sizaire, L. Lobera et al. //Europ. J. Publ. Health. 2002. - № 12. - P. 94-98.

70. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis /A. Telenti, P. Imboden, F. Marchesi et al. //Lancet. 1993. - № 341. - P. 647-650.

71. Detection of rifampin resistance among isolates of Mycobacterium tuberculosis from Mozambique /D.A. Caugant, P. Sandven, J. Eng et al. //Microbial Drug Resist. 1995. -№ 1. - P. 321-326.

72. Dhandayuthapani S. Interactions of OxyR with the promoter region of the oxyR and ahpC genes from Mycobacterium leprae and Mycobacterium tuberculosis IS. Dhandayuthapani, M. Mudd, V. Deretic //J. Bacteriol. 1997. - № 179. - P. 2401-2409.

73. Douglass J. A ribosomal gene mutation in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates /J. Douglass, L.M. Steyn //J. Infect. Dis. -1993.-№ 167.-P. 1505-1506.

74. Drobniewski F.A. The rapid diagnosis and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis a molecular story /F.A. Drobniewski, S.M. Wilson//J. Med. Microbiol. - 1998. - № 47. - P. 189-196.

75. Drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis exhibit a range of virulence for mice /D.J. Ordway, M.G. Sonnenberg, S.A. Donahue et al. //Infect. Immun. 1995. - № 63. - P. 741-743.

76. Drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Russia /V.N. Stepashina, E.A. Panfertsev, O.V. Korobova et al. IIInt. J. Tuberc. Lung. Dis. -1999. -№3.- P. 149-152.

77. Drug-resistant tuberculosis in prisons in Azerbaijan: case study /R. Coninx, G.E. Pfyffer, C. Mathieu et al. //BMJ. 1998. - № 316. - P. 1423-1425.

78. Dunlap N.E. The use of RFLP as a tool for tuberculosis control: utility or futility? /N.E. Dunlap //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - № 4. - P. S134-S138.

79. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages /M. Zhang, J. Gong, Z. Yang et al. //J. Infect. Dis. 1999.-№ 179.-P. 1213-1217.

80. Epidemiological evidence of the spread of a Mycobacterium tuberculosis strain of the Beijing genotype on Gran Canaria Island /J.A. Caminero, M.J. Pena, M.I. Campos-Herrero et al. II Am. Respir. Crit. Care. Med. 2001. - № 164. - P. 1165-1170.

81. Ethambutol inhibition of glucose methabolism in mycobacteria: a possible target of the drug IG. Silve, P. Valero-Guillen, A. Quemard et al. //Antimicrobial. Agents. Chemotherapy. 1993. - № 37. - P. 1536-1538.

82. Exogenous re-infection as a cause of recurrent tuberculosis in a low-incidence area /A.S. Boer, M.W. Borgdorff, E. Vynnycky et al. //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -2003,-№7.-P. 145-152.

83. Expression of katG in Mycobacterium tuberculosis is associated with its growth and persistence in mice and guinea pigs /Z. Li, C. Kelley, F. Collins, D. Rouse //J. Infect. Dis. 1998. - № 177. - P. 1030-1035.

84. Fischer B. Epidemiology of mycobacterial resistance (especially Mycobacterium tuberculosis) /B. Fischer //Chemother. 1999. - № 45. - P. 109120.

85. Genetic alterations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis: mapping of mutations conferring resistance /A. Meier, P. Kirschne, F-C. Bange et al. //Antimicrob. Agents. Chemother. 1994. - № 38. - P. 228-233.

86. Gillespie S.H. Evolution of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: clinical and molecular perspective /S.H. Gillespie //Antimicrobial. Agents. Chemother. 2002. - № 46. - P. 267-274.

87. Global distribution of Mycobacterium tuberculosis spoligotypes /1. Filliol, J.R. Driscol, D. van Soolingen et al. //Emerg. Infect. Dis. 2002. - № 8. - P. 13471349.

88. Herr E.B.Jr. Chemical and physical characterization of capreomycin /E.B.Jr. Herr, M.O. Redstone //Ann. N. Y. Acad. Sei. 1996. - № 135. - P. 940-946.

89. Hirano K. Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated mostly in Asian countries and their rapid detection by Line Probe Assay /K. Hirano, C. Abe, M. Takahashi //J Clin Microbiol.1999.-№37.-P. 2663-2666.

90. Historic and recent events contribute to the disease dynamics of Beijing-like Mycobacteriun tuberculosis isolates in a high incidence region /M. Richardson,

91. W.P. van Lilt, G.D. van der Spuy et al. //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2002. - №6.-P. 1001-1011.

92. Hoel T. Radiometric and conventional drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis IT. Hoel, J. Eng //APMIS. 1991. - № 99. - P. 977-980.

93. Honore N. Streptomycin resistance in mycobacteria /N. Honore, S.T. Cole //Antimicrob. Agents. Chemother. 1994. - № 38. - P. 238-242.

94. Huang C.H. Non- radoactive probe for the rapid identification of Mycobacterium avium complex from clinical specimens /C.H. Huang, D.L. Jungking //Mol. Cell. Probes. 1991. - № 5. - P. 277-280.

95. Identification of a W variant outbreak of Mycobacterium tuberculosis via population-based molecular epidemiology /P.J. Bifani, B. Mathema, Z. Liu et al. //JAMA. 1999. - № 282. - P. 2321-2327.

96. In vitro and in vivo laboratory studies on the antituberculosis activity of capreomycin /W.B. Sutton, R.S. Gordee, W.E. Wick, L.V. Standfield //Ann. N. Y. Acad. Sci. -1966. № 135. - P. 947-959.

97. Inadequacy of the current WHO re-treatment regimen in a central Siberian prison: treatment failure and MDR-TB /M.E. Kimerling, H. Kluge, N. Verzhnina et al. //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 1999. - № 3. - P. 451-453.

98. Inderlied C.B. Antimicrobial susceptibility testing: present practices and future trends /C.B. Inderlied //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - № 13.-P. 980-993.

99. Inderlied C.B. Manual of clinical microbiology /C.B. Inderlied, P.R. Murray, E.J. Baron et al. Washington: American Society for Microbiology, 1999.-P. 1601-1623.

100. Influence of anti-tuberculosis drug resistance on the treatment outcome of pulmonary tuberculosis patients receiving DOTS in Riyadh, Saudi Arabia /R.

101. Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis ß-ketoacyl ACP synthase by isoniazid IK. Mdluli, R.A. Slayden, Y. Zhu et al. //Science. 1998. - № 280. -P. 1607-1610.

102. Interpreting DNA fingerprint clusters of Mycobacterium tuberculosis /J.R. Glynn, J. Bauer, A.S. de Boer et al. IIInt. J. Tuberc. Lung. Dis. 1999. - № 3. -P. 1055-1060.

103. Investigation and control of a large outbreak of multi-drug resistant tuberculosis at a central Lisbon hospital /M.M. Hannan, H. Peres, F. Maltez et al. //J. Hosp. Infect. 2001. - № 47. - P. 91-97.

104. IS6/70-RFLP and spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis isolates in Iran IM. Doroudchi, K. Kremer, E.A. Basiri et al. //Scand. J. Infect. Dis. 2000. - № 32. - P. 663-668.

105. Jacobs R. F. Multiple-drug resistant tuberculosis /R.F. Jacobs //Clin. Infect. Dis. 1994. -№19. -P. 1-10.

106. Kimerling M.E. The Russian equation: an evolving paradigm in tuberculosis control /M.E. Kimerling //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - № 4. - P. S160-S167.

107. Laing R.O. Tuberculosis drug issues: prices, fixed-dose combination products and second-line drugs /R.O. Laing, K.M. McGoldrick //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - № 4. - P. S194-S207.

108. Lefford M.J. The ethionamide sensitivity of British pretreatment strains of Mycobacterium tuberculosis /M.J. Lefford //Tubercle. Lond. 1966. - № 47. -P. 198-206.

109. Manual of clinic microbiology /G.D. Roberts, E.W. Koneman, Y.K. Kim et al. Washington: American Society of Microbiology, D.C., Mycobacterium, 1991.-304-339 p.

110. Marttila H.J. Molecular genetics of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis /H.J. Marttila. Turku: Turun Yliopisto, 1999. 200 p.

111. McClure W.R. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis /W.R. McClure, C.I. Cech //J. Biol. Chem. 1978. - № 253. - P. 8949-8956.

112. Medical and social analysis of prisoners with tuberculosis in a Russian prison colony: an observation study /F. Drobniewski, Y. Balabanova, M. Ruddy et al. //Clin. Infect. Dis. 2003. - № 36. - P. 234-235.

113. Medical Research Council. Streptomycin treatment of pulmonary tuberculosis /Medical Research Council //BMJ.- 1948. № 2. - P. 769-782.

114. Middlebrook G. Automatable radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media /G. Middlebrook, Z. Reggiardo, W.D. Tigerit //Am. Rev. Respir. Dis. 1977. - № 115. - P. 1066-1069.

115. Middlebrook G. Some observations on the pathogenicity of isoniazid resistant variants of tubercle bacilli /G. Middlebrook, M.L. Cohn //Science. -1953. -№118. -P. 297-299.

116. Migliori G.B. Problems to control TB in Eastern Europe and consequences in low incidence countries /G.B. Migliori, R. Centis //Monaldi. Arch. Chest. Dis. 2002. - № 57. - P. 285-290.

117. Missense mutations in the catalase-peroxidase gene, katG, are associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis /B. Heym, P.M. Alzari, N. Honore, S.T. Cole //Mol. Microbiol. 1995. - № 15. - P. 235-245.

118. Mitchell A. Y. DNA fingerprinting: RFLP analysis /A.Y. Mitchell //Molecular mycobacteriology. New York, 1999. - P. 131-151.

119. Mitchison D. The segregation of streptomycin resistant variants of Mycobacterium tuberculosis into groups with characteristic resistance /D. Mitchison //J. Gen. Microbiol. -1951. № 5. - P. 596-604.

120. Mitchison D.A. How drug resistance emergence as a result of poor compliance during short course chemotherapy for tuberculosis /D.A. Mitchison //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 1998. - № 2. - P. 10-15.

121. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis in Norway /U. Dahle, P. Sandven, E. Heldal, D.A. Caugant //J. Clin. Microbiol. 2001. - № 39.-P. 1802-1807.

122. Molecular epidemiology of tuberculosis in Cuba outside of Havana /R. Diaz, K. Kremer, P.E. de Haas et al. //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 1998. - № 2. - P. 743-750.

123. Molecular evidence for independent occurrence of IS6110 insertions at the same sites of the genome of Mycobacterium tuberculosis in different clinical isolates /Z. Fang, D.T. Kenna, C. Doig et al. //J. Bacteriol. 2001. - № 183 - P. 5279-5284.

124. Morlock G.P. Characterization of spontaneous, in vitro-selected, rifampin-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv /G.P. Morlock, B.B. Plikaytis, J.T. Crawford //Antimicrobial. Agents. Chemother. 2000. - № 44.-P. 3298-3301.

125. Multidrug-resistant tuberculosis in prison inmates, Azerbaijan /G.E. Pfyffer, A. Strassle, T. van Gorkum et al. //Emerg. Infect. Dis. 2001. - № 7. - P. 855861.

126. Multiple drug-resistant Mycobacterium tuberculosis: evidence for changing fitness following passage through human hosts /S.H. Gillespie, O.J. Billington, A. Breathnach, T.D. McHugh //Microb. Drug. Resist. 2002. - № 8. - P. 273279.

127. Murray M. Molecular epidemiology of tuberculosis: achievements and challenges to current knowledge /М. Murray, E. Nardell //Bull. World. Health. Org. 2002. - № 80. - P. 477-482.

128. Musser J.M. Antimicriobial agent resistance in Mycobacteria: molecular genetic insights /J.M. Musser //Clin. Microbiol. Rev. 1995. - № 8. - P. 496514.

129. Mutation to rifampin resistance at the begining of the RNA polymerase p subunit gene in Escherichia coli /N.A. Lisitsyn, E.D. Sverdlov, E.P. Moiseyeva et al. //Mol. Gen. Genet. 1984. - № 196. - P. 173-174.

130. Mutations in the rpoB and katG genes leading to drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Latvia /Т. Tracevska, I. Jansone, L. Broka et al. 113. Clin. Microbiol. 2002. - № 40. - P. 3789-3792.

131. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype emerging in Vietnam /D.D. Anh., M.W. Borgdorff, L.N. Van et al. //Emerg. Infect. Dis. 2000. - № 6. - P. 302-305.

132. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains associated with febrile response to treatment /R. Van Crevel, R.H.H. Nelwan, W. de Lenne et al. //Emerg. Infect. Dis. 2001. - № 7. - P. 880-883.

133. Mycobacterium tuberculosis drug resistance in a suburban community in southern Mexico /M.L. Garcia-Garcia, M.E. Jimenez-Corona, A. Ponce de Leon et al. Hint J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - № 4. p. S168-170.

134. Nachega J.B. Tuberculosis drug resistance: a global threat /J.B. Nachega, R.E.Chaisson //Clin. Infect. Dis. 2003. - № 36. - P. S24-S30.

135. Niemann S. IS 6110 fingerprinting of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Germany during 1995 /S. Niemann, S. Rusch-Gerdes, E. Richter //J. Clin. Microbiol. 1997. - № 35. - P. 3015-3020.

136. Normark B. H. Evolution and spread of antibiotic resistance /B.H. Normark, S. Normark //J. Internal. Med. 2002. - № 252. - P. 91-106.

137. Origin and interstate spread of a New York City multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clone family /P.J. Bifani, B.B. Plikaytis, V. Kapur et al. //JAMA. 1996. - № 275. - P. 452-457.

138. Outcomes of patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis treated with ofloxacin/levofloxacin-containing regimens /W.W. Yew, C.K. Chan, C.H. Chau et al. //Chest. 2000. - № 117. - P. 744-751.

139. Pablos-Mendez A.R. The relationship between delayed or incomplete treatment and all cause mortality in patients with tuberculosis /A.R. Pablos-Mendez, T.F. Sterling, T.R. Frieden //JAMA. 1996. - № 276. - P. 1223-1228.

140. PCR-based methodology for detecting multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis Beijing family circulating in Russia /1. Mokrousov, T. Otten, A. Vyazovaya et al. IIEur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - № 22. - P. 342-348.

141. Peloquin C.A. Therapeutic drug monitoring in the treatment of tuberculosis /C.A. Peloquin//Curr. Opin. 2002. - № 62. - P. 2169-2183.

142. Perelman M. I. Tuberculosis in Russia /M.I. Perelman //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - №. 4. - P. 1097-1103.

143. Pfaller M. A. Application of new technology to the detection, identification, and antimicrobial susceptibility testing of Mycobacteria /M.A. Pfaller //Am. J. Clin. Pathol. 1994. - № 101. - P. 329-337.

144. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia /1. Mokrousov, O. Narvskaya, T. Otten et al. //Res. Microbiol. 2002. - № 153. - P. 629-637.

145. Pio A. Tuberculosis handbook I A. Pio, P. Chaulet. Geneva: World Health Organisation, 1998. - 222 p.

146. Portaels F. Addressing multi-drug resistant tuberculosis in penitentiary hospitals and in the general population of the former Soviet Union IF. Portaels, L. Rigouts, I. Bastian //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 1999. - № 3. - P. 582-588.

147. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia ID. Van Soolingen, L. Qian, P.E.W. de Haas et al. //J. Clin. Microbiol. 1995. - № 33. - P. 3234-3238.

148. Primary structure of Escherichia coli RNA polymerase. Nucleotide substitution in the p subunit gene of the rifampicin resistant rpoB255 mutant /Y.A. Ovchinnikov, G.S. Monastyrskaya, V.V.Gubanov et al. //Mol. Gen. Genet. -1981. № 184. - P. 536-538.

149. Pyle M. M. Relative numbers of resistant tubercle bacilli in sputa of patients before and during treatment with streptomycin /M.M. Pyle //Proc. Staff. Meet. Mayo. Clin. 1947. - № 22. - P. 465-473.

150. Ramaswamy S. M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update IS. Ramaswamy, J.M.Musser //Tubercle. Lung. Dis. 1998. - № 79. - P. 3-29.

151. Rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by sequencing and Line probe assay /H.J. Marttila., H. Soini, B.I. Vyshnevskiy et al. //Scand. J. Infect. Dis. 1998. - № 30. - P. 129-132.

152. Rapid identification of a point mutation of the Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (katG) gene associated with isoniazid resistance /F.R. Cockerill, J.R. Uhl, Z. Temesgen et al. IIJ. Infect. Dis. 1995. - № 171. - P. 240-245.

153. Rattan A. Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspectives I A. Rattan, A. Kalia, N. Ahmad //Emerg. Infect. Dis. 1998. - № 4. - P. 195-209.

154. Raviglione M.C. The TB epidemic from 1992 to 2002 /M.C. Raviglione //Tuberculosis. 2003. - № 83. - P. 4-14.

155. Reichman L.B. How to ensure the continued resurgence of tuberculosis /L.B. Reichman //Lancet. 1996. - № 8995. - P. 175-177.

156. Reichman L.B. Timebomb. The global epidemic of multi-drug-resistant tuberculosis /L.B. Reichman, J.H. Tanne. New York: McGraw-Hill, 2001. -127-138 p.

157. Restriction fragment analysis of cromosomal DNA defines different strains of Mycobacterium tuberculosis /S.A. Shoemaker, J.H. Fisher, W.D. Jones, C.H. Scoggin //Am. Rev. Resp. Dis. 1986. - № 134. - P. 210-213.

158. Restriction fragment length polymorphism study of Mycobacterium tuberculosis in Thailand using IS6110 as probe /P. Palittapongarnpim, P. Luangsook, S. Tansuphaswadikul et al. //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 1997. - № l.-P. 370-376.

159. Retreatment tuberculosis cases. Factors associated with drug resistance and adverse outcomes /A.L. Kritski, L.S.R. de Jesus, M.K. Andrade et al. //Chest. -1997.-№ 111.-P. 1162-1167.

160. Retrospective analysis of the Beijing family of Mycobacterium tuberculosis in preserved lung tissues /L. Qian, J.D.A. van Embden, A.G.M. van der Zanden et al. //J. Clin. Microbiol. 1999. - № 37. - P. 471-474.

161. RFLP patterns and risk factors for recent tuberculosis transmission among hospitalized tuberculosis patients in Rio de Janeiro, Brazil /F.C. Fandinho, A.L.

162. Kritski, C. Hofer et al. //Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2000. - № 94. - P. 271-275.

163. Rifampin- and multidrug-resistant tuberculosis in Russian civilians and prison inmates: dominance of the Beijing strain family /F. Drobniewski, Y. Balabanova, M. Ruddy et al. //Emerg. Infect. Dis. 2002. - № 8. - P. 13201326.

164. Riska P. F. Molecular determinants of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis /P.F. Riska, W.R. Jacobs, D. Alland //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -2000.-№ 4. P. S4-S10.

165. Salyers A.A. Bacterial pathogenesis. A molecular approach /A.A. Salyers, D.D. Whitt. Washington: ASM Press D.C., 2002.

166. Scorpio A. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus /A. Scorpio, Y. Zhang //Nature. Med. 1996. - № 2. - P. 662-667.

167. Seventy percent of the M. tuberculosis isolates in Hong Kong represent the Beijing genotype /M.Y. Chan M. Y., M. Borgdorff M., C.W. Yip et al. //Epidemiol. Infect. 2001. - № 127. - P. 169-171.

168. Siddiqi S.H. BACTEC 460TB System. Product and procedure manual, revision /S.H. Siddiqi. D. Sparks, MD, USA.: Becton Dickinson Microbiology Systems, 1995.

169. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology /J. Kamerbeek, L. Schouls, A. Kolk et al. //J. Clin. Microbiol. 1997. - № 35. - P. 907-914.

170. Single nucleotide polymorphisms in genes associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis /S.V. Ramaswamy, R. Reich, S.J. Dou et al. //Antimicrobial. Agents. Chemother. 2003. - № 47. - P. 1241-1250.

171. Snider D. E. The global threat of drug-resistant tuberculosis /D.E. Snider, K.G. Castro //N. Engl. J. Med. 1998. - № 338. - P. 1689-1690.

172. Spacer oligonucleotide typing of bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex: recommendations for standardised nomenclature /J.W. Dale, D. Brittain, A.A. Cataldi et al. //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2001. - № 5. - P. 216219.

173. Spoligotype database of Mycobacterium tuberculosis: biogeographic distribution of shared types and epidemiologic and phylogenetic perspectives /C. Sola, I. Filliol, M.C.Gutierrez et al. //Emerg. Infect. Dis. 2001. - № 7. - P. 390-396.

174. Spread of drug-resistant pulmonary tuberculosis in Estonia /A. Kruuner, S.E. Hoffner, H. Sillastu et al. //J. Clin. Microbiol. 2001. - № 39. - P. 3339-3345.

175. Spread of strain W, a highly drug-resistant strain of Mycobacterium tuberculosis, across the United states /T.B. Agerton, S.E. Valway, R.J. Blinkhora et al. //Clin. Infect. Dis. 1999. - № 29. - P. 85-92.

176. Standard short-course chemotherapy for drug-resistant tuberculosis treatment outcomes in 6 countries /M.A. Espinal, S.J. Kim, P.G. Suarez et al. //JAMA. 2000. - № 283. - P. 2537-2545.

177. Starke J. R. Drug-resistance in tuberculosis: mechanisms and prevention /J.R. Starke //Pediatric. Pulmonology. 1997. - № 16. - P. 154-156.

178. Stern V. Problems in prisons worldwide, with a particular focus on Russia /V. Stern //Annals. New. York. Academy, of Science. 2001. - № 953. - P. 113119.

179. Stop TB working group on DOTS-Plus for MDR-TB. A prioritised research agenda for DOTS-Plus for multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) /Stop TB working group on DOTS-Plus for MDR-TB //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -2003.-№7. -P. 410-414.

180. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology /J.D.A. Van Embden, M.D. Cave, J. Crawford et al. //J. Clin. Microbiol. 1993. - № 31. - P. 406-409.

181. Survey of drug-resistant tuberculosis in northwestern Russia from 1984 through 1994 /M.K. Viljanen, B.I. Vyshnevskiy, T.F. Otten et al. //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998. - № 17. - P. 177-183.

182. Takayama K. Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis IK. Takayama, J.O. Kilburn //Antimicrobial. Agents. Chemotherapy. 1989. - № 33. - P. 1493-1499.

183. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis IY. Zhang, B. Heym, B. Allen et al. //Nature. 1992. - № 358. - P. 591-593.

184. The molecular basis of antibiotic action /E.F. Gale, E. Cundliffe, P.E. Reynolds et al. New York: John Wiley & Sons, 1981.

185. The nature and consequence of genetic variability within Mycobacterium tuberculosis M. Kato-Maeda, P.J. Bifani, B.N. Kreiswirth, P.M. Small //J. Clin. Investig. 2001. - № 107. - P. 533-537.

186. The rpsL gene and streptomycin resistance in single and multiple drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis /J. Nair, D.A. Rouse, G-H. Bai, S.L. Morris //Mol. Microbiol. 1993. - № 10. - P. 521-527.

187. Treatment outcome of relapse and defaulter pulmonary tuberculosis patients IT. Sevim, G. Atac, G. Gungor et al. //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2002. - № 6. -P. 320-325.

188. Tsukamura M. Cross-resistance relationships among the aminoglucoside antibiotics in Mycobacterium tuberculosis HA. Tsukamura, S. Mizuno //J. Gen. Microbiol. 1975. - № 88. - P. 269-274.

189. Tuberculosis control and molecular epidemiology in a South African gold-mining community /P. Godfrey-Faussett, P. Sonnenberg, S.C. Shearer et al. //Lancet. 2000. - № 356. - P. 1066-1071.

190. Tuberculosis guide for low-income countries /D.A. Enarson, H.L. Rieder, T. Arnadottir, A. Trebucq. Paris: International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases, 1996. - P. 65.

191. Use of Molecular techniques to distinguish between treatment failure and exogenous reinfection with Mycobacterium tuberculosis /A. Kruuner, L. Pehme, S. Ghebremichael et al. //Clin. Infect. Dis. 2002. - № 35. - P. 146-155.

192. Van Soolingen D. Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements /D. Van Soolingen //J. Intern. Med. 2001. - № 249. - P. 1-26.

193. Vennesland K. The demonstration of naturally occurring streptomycin resistant variants in the human strain of tubercle bacillus H-37RV /K. Vennesland, R.H. Ebert, R.G. Bloch //Science. 1947. - № 106. - P. 476-477.

194. Werngren J. Drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype does not develop mutation-conferred resistance to rifampin at an elevated rate /J. Werngren, S.E. Hoffner //J. Clin. Microbiol. 2003. - № 41. - P. 1520-1524.

195. WHO Geneva/IUATLD Paris. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis /WHO Geneva/IUATLD Paris //Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -1998.-№2.-P. 72-89.

196. World Bank. Investing in health: world development report 1993 / World Bank. New York.: Oxford University Press, 1993.

197. World Health Organization, Communicable Diseases Programme. Global tuberculosis control /World Health Organization. Geneva: World Health Organization, 2002. - 275 p.

198. World Health Organization. Report on TB epidemic. Global TB programme /World Health Organization. Geneva: World Health Organization, 1997.

199. World Health Organization. TB, a global emergency /World Health Organization. Geneva: World Health Organization, 1994.

200. World Health Organization. TB: groups at risk, WHO report on the tuberculosis epidemic/ World Health Organization. Geneva: World Health Organization, 1996.

201. World Health Organization. Treatment' of tuberculosis (rev 3). WHO/CDS/TB/2003.313. /World Health Organization. Geneva: WHO, 2003.

202. World Health Organization. Treatment of tuberculosis: guidelines for national programmes /World Health Organization. Geneva: World Health Organization, 2003.

203. World Health Organization. Tuberculosis. /World Health Organization. -Geneva: World Health Organization, 2003, fact sheet №4.

204. World Health Organization. Tuberculosis. Geneva: World Health Organization, 2000, fact sheet №104.

205. World Health Organization. WHO global report on tuberculosis /World Health Organization. Geneva.: WHO, 1996.

206. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review /J.R. Glynn, J. Whiteley, P.J. Bifani et al. //Emerg. Infect. Dis. 2002. - № 8. - P. 843-849.

207. Yerokhin V. V. Tuberculosis in Russia and the problem of multiple drug resistance /V.V. Yerokhin, V.V. Punga, L.N. Rybka //Annals. New. York. Academy, of Science. 2001. - № 953. - P. 133-137.