автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.01, диссертация на тему:Изучение механизмов устойчивости гетеротрофных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам на примере цист Artemia salina

На правах рукописи

Николаева Юлиана Геннадьевна

Изучение механизмов устойчивости гетеротрофных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам на примере цист Artemia salina

05.13.01 - системный анализ, управление и обработка информации (в биологии)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

□ОЗ

003170972

Работа выполнена в Государственном учреждении «Государственный океанографический институт»

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор Ведущая организация Тульский Государственный Университет

Защита диссертации состоится ^c-f 2008 г. в час на заседании

диссертационного совета Д 212 203 <й?в Российском университете дружбы народов по адресу

117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке РУДН по адресу 117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан «

„UG-tZ, 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Г А. Дроздова

А В Сыроешкин

СП Сяткин ТН Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Для биосистемы, находящейся в неблагоприятных условиях, основной задачей становится поддержание жизнедеятельности с сохранением энергетического потенциала Главным адаптационным механизмом к неблаюприятным воздействиям считается способность организма входить в состояние анабиоза или диапаузы (Зотова ТЮ и др, 2001) В связи с этим возникает вопрос о наличии действующих энергообразующих процессов в диалаузирующей системе в условиях истощения запасов органических веществ, снижения скорости окислительно-восстановительных реакций и синтеза АТФ ниже предела обнаружения (Макрушин А В и др, 2006, Ершов Ю А, 1983) Предполагается, что метаболические, в том числе мембраносвязанные процессы все же происходят, но они сильно замедленны (Гольдовский А М, 1981, Епифанова О Е и др, 1983) Замедленные мембраносвязанные процессы могут обеспечивать поддержание жизни в диапаузирующей системе Градиенты разности температур, перепады давления, влажности, действие корпускулярных поюков, вызывается механо-химической генерацией мембранного потенциала, подобно процессам в тельцах Пачини и дисках Мейснера, и могут выступать поддержкой межфазных потенциалов по причине наличия эффектов Соре и Зеебека и считаться второстепенным механизмом поддержания жизнеспособности (Грю К Э и др, 1962, Фролов В А и др, 2004) Значительные трудности в проведении таких исследований вносит отсутствие предсказательных теоретических моделей, поскольку биообъект является сложной системой В то же время задача изучения устойчивости организма к неблагоприятным условиям становится все более актуальной Исследование общебиологических закономерностей адаптационных свойств биообъекта, а также влияния на него неблагоприятных температурных режимов и действия облучений различной интенсивности может способствовать развитию фундаментальных представлений различий живого и мертвого В то же время механизмы устойчивоста биообъекта к неблагоприятным условиям изучены недостаточно

Для изучения устойчивости биообъекта к неблагоприятным абиотическим факторам необходим системный подход (Хадарцев А А, 1999), который основывается на изучении различных уровней организации биообъекта при его взаимодействии с окружающей средой (Хадарцев А А и др, 2000) Биосистема рассматривается как совокупность внутренне организованных структур, развивающихся во времени и объединенных потоками энергии и вещества Любой компонент биосистемы выполняет определенные функции то отношению к системе в целом, в соответствии со своими качествами и свойствами Каждая подсистема характеризуется определенными параметрам состояния, в частности, набором белков,

липидов, микроэлементов, своими особенностями распределения зарядов на поверхности, различной проницаемостью мембран Параметры состояния одной подсистемы отличаются от аналогичных параметров других подсистем и микросистемы в целом Важной характеристикой каждой из подсистем являются динамические характеристики подсистемы, такие как гидрофобные и полярные взаимодействия, роль водородных связей в динамике подсистем На уровне подсистемы макромолекул белков, чувствительность к регуляции достигается на основе равновесия сил в пределах белковых глобул Вода при взаимодействии с белками выступает как двойственный фактор, стабилизирующий за счет гидрофобного взаимодействия и разрыхляющий за счет конкуренции молекул воды из-за образования водородных связей внутри макромолекул (Аксенов С И, 2004)

В настоящей работе проводилось сопоставление собственных экспериментальных результатов с литературными данными по функционированию организма в нормальных и неблагоприятных условиях на атомном уровне, в частности, при взаимодействии с корпускулярным излучением, на молекулярном уровне, субклеточном (мембрапном), клеточном и организменном уровне организации системы

Важной проблемой является поиск биологических объектов, наиболее адекватно реагирующих на неблагоприятные воздействия и имеющие простую организацию, позволяющую получать информацию о неблагоприятных воздействиях, независящую от таксономического положения организма Кроме того, важен подбор специфичных и высокоинформативных методов исследования влияния различного рода воздействий на биообъект с целью объективизации полученных результатов При исследовании влияния неблагоприятных факторов на живой организм применение могут найти методы, основанные на оценке физических параметров биотестера

В качестве биотестера могут быть использованы высокостойкие цисты жаброногих рачков Artemia salina Известно, что цисты Л salina применяют для оценки степепи загрязнения водной среды, так как толстая оболочка цисты обладает высокой степенью устойчивости (Vos J at al, 1984, Быкова В M и др, 2002, Макрупшн А.В и др, 2006) Благодаря таким свойствам оболочки, циста A salina способна переживать в течение многих лет неблагоприятные условия среды в состоянии анабиоза или диапаузы, когда метаболические процессы в ней сильно замедлены (Урманцев Ю А, 1979, Студеникина ТЛ , 1986) При этом всегда имеется возможность вступления A salina в цикл с помощью влияния адекватного стимула (Епифанова О Е и др, 1988)

Целью настоящей работы явилось изучение механизмов устойчивости диапаузирующих цист A salina к неблагоприятным температурным воздействиям и действию ультраслабых нейтронных потоков с различной интенсивностью

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи*

1. Изучить влияние низких температур на всхожесть цист A salma

2. Оценить концентрацию свободных радикалов, парамагнитных ионов и подвижность фракции протонов в цистах A salina в условиях низких температур в течение длительного периода времени

3. Изучить влияние высоких температур иа всхожесть цист A salina

4. Оценить влияние нагревания (от +25°С до +110°С) на подвижность фракции протонов в цистах A salina

5. Оценить влияние искусственного корпускулярного (нейтронного) потока на подвижность фракции протонов в цистах A salina, концентрацию свободных радикалов и парамагнитных ионов

6. Провести системный анализ реакции цист A salina как биотестера на действие радиационного излучения в условиях космического полета на спутнике и трансконтинентального авиаперелета

Научная новизна. Впервые был использован системный анализ при изучении механизмов устойчивости цист A salina к неблагоприятным условиям Модельный объект изучали как иерархическую систему проводилось сопоставление собственных экспериментальных результатов с литературными данными по функционированию организма в нормальных и неблагоприятных условиях на атомном (при взаимодействии с корпускулярным излучением), молекулярном и организменном уровнях организации системы В работе впервые показано, что при воздействии на цисты A salina высокой температуры (+110°С) живые цисты нагреваются медленнее, чем мертвые Впервые отмечено, что в цистах, после лиофильного высушивания, остается 3 - 4% (от веса образца) подвижной фракции протонов, которые принадлежат водной и липидной фракциям Впервые для выяснения механизмов устойчивости цист изучались возможные механизмы выживания протонной подвижности, концентрации свободных радикалов Впервые изучена роль корпускулярных потоков с использованием высокоинформатавных методов ядерного магнитного резонанса -спиновое эхо и электронного парамагнитного резонанса Научно-практическая значимость работы Научная значимость работы заключается в том, что системный анализ механизмов выживаемости биообъекта при неблагоприятных воздействиях окружающей среды

5

необходимо для понимания и контролирования этих процессов, так как они являются универсальными для всех гетеротрофов Полученные данные о наиболее значимых механизмах устойчивости биотестера к неблагоприятным космогеофизическим воздействиям могут иметь определенное значение для понимания и анализа этих процессов у человека Практическая значимость работы заключается в расширении знаний о выживаемости цист A salina в неблагоприятных условиях, поскольку цисты культивируются как основной белковый источник питания для многих гетеротрофных организмов, а также при глубокой переработке цист получают препараты и вещества, используемые в медицине, производстве высоко стимулирующих биопрепаратов, иммуномодуляторов корректирующих обмен веществ у человека

Основные положепия, выпосимые на защиту:

1. Представлено комплексное системное исследование механизмов устойчивости диапаузирующих цист A salina к различным неблагоприятным воздействиям - резким колебаниям температур и действию корпускулярных (нейтронных) потоков с различной интенсивностью при сравнении реакций организма на атомно-молекулярных и организменном уровнях Одновременное определение подвижности протона в условиях ядерного магнитного резонанса - спинового эха, интегральной кинетики свободно радикальных реакций в клетках, неравновесной кинетики теплопереноса в биомассе могут служить новой совокупностью критериев различения живого и мертвого у организмов, находящихся в состоянии метаболического покоя, анабиоза 2 С помощью метода ядерного магнитного резонанса (спиновое эхо) было показано, что движение фракции протонов в цистах A salina составляет 3 - 4% (от веса образца) и принадлежит липидной и водной фракциям, и эта подвижность одинакова как в опытных, так и в контрольных образцах

3. Выявленную способность цист A salina охлавдаться при нагревании, можно отнести к защитно-приспособительным механизмам устойчивости при неблагоприятных воздействиях.

4. Способность цист, находящихся в неблагоприятных условиях низких температур и интенсивного корпускулярного (нейтронного) потока, сохрапятъ концентрацию свободных радикалов в пределах физиологических значений свидетельствует об измеряемом протекании метаболических процессов, связанных с антиоксидантной защитой

5. Показано, что облучение цист A salina корпускулярным (нейтронным) потоком, приводит к изменениям внутренней протонной подвижности в мертвых цистах A salina при стабилизации этого показателя у живых цист

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждепы па Международной гидробиологической конференции «Водные экосистемы и организмы - 6» (Москва, 2005), на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2006» (Москва, 2006), на Международной гидробиоло1 ической конференции «Водные экосистемы и организмы - 7» (Москва, 2006), на VII международной научи о-практическои конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006), на VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной и физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва, 2007), на II научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2007), на международной конференции «Развитие идей АЛ Чижевского» (Санкт-Петербург, 2007), на XV Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008)

Публикации* по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на -//-/ страницах и состоит из следующих разделов обзора литературы, методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка S¿^источников, из них Та русском и на иностранных языках и приложения Работа содержит & таблицыу&^рисункоп

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования в настоящей работе являются диапаузирующие активированные и неактивированпые толстоскорлуповые цисты A salina, выращенные производителем Алтайского края ООО «Apean» в 2005 году и прошедшие высушивание на производстве

Определение состояния подвижной фракции протонов в цистах A salina проводили методом ядерного магнитного резонанса (Фаррар Т и др, 1973) С помощью этого метода регистрировалась амплитуда сигнала спинового эха и время спин-спиновой релаксации ядер-T¡ Метод позволяет получить информацию о количестве и качестве подвижных протонов, дающих вклад в резонанс и принадлежащих водной, белковой или липидной фракциям системы Это один из наиболее эффективных методов структурного анализа молекул В рабоге были использованы две ЯМР-установки низкого (20 МГц -ЯМР-XL-IOO) и высокого (600МГц

- Avance 600) разрешений Точность измерений составляла не хуже 7% Линейность работы установки контролировалась по эталонному водному раствору CuS04

Определение концентрации свободных радикалов и парамагнитных ионов в цистах A salina проводили с использованием электронного парамагнитного резонанса как основного метода анализа количественных и качественных закономерностей образования свободных радикалов и парамагнитных ионов Измерения проводились на спектрометре 3-х сантиметрового диапазона РЭ-1307 Сигналы свободных радикалов рассчитывались при комнатной температуре и мощности СВЧ - 0,5 мВт, а парамагнитных ионов - 10 мВт Точность измерений составляла не хуже 10% Постоянная времени - 0,1 с, напряженность магнитного поля для свободных радикалов составляла - 3340 ± 10 Гс, для парамагнитных ионов-3340 ± 150 Гс

Метод определения влияния высоких и низких температур па цисты A salina Влияние низких температур. Образцы цист A salina помещали в холодильную камеру, с температурой -10°С, максимально на 70 дней Через каждые 14 суток 70-ти дневного эксперимента часть образцов вынимали, промывали от солей водой и осаждали центрифугированием Затем их лиофильно высушивали при -20°С в условиях вакуума 10"3 мм рг ст Контролем служили цисты, не подвергавшиеся воздействию низких температур Опыты ставили в трех параллельных пробах и повторяли трижды

Влияние высоких температур. Эксперименты проводились в ячейке, нагреваемой тосолом из жидкостного термостата фирмы "Те г тех" Контроль за стационарным значением температуры и однородностью нагрева по всей площади ячейки осуществлялся с помощью злектротермометра "VT-01 " и ртутных термометров с одинаковой температурной шкалой Ячейка была разработана и выполнена на базе ГУ "ГОИН", Москва Навески живых и мертвых цист A salina помещали в ячейки и нагревали систему до +110°С Через каждые 10 минут в течение 3 часов фиксировали данные термометров и отбирали пробы на выклев

Биологические эксперименты по развитию цист проводили с использованием камеры Богарова и водных растворов с солевым составом собственной разработки, рН= 8,2 (Матвеева И С и др, 2004) Наблюдение за вылуплением A salina велось визуально, и их количество подсчитывалось с помощью бинокулярного микроскопа Контрольные мертвые образцы цист экспонировали в сушильном шкафу при температуре +150°С, в течение 9 часов Опыты ставили в трех параллельных пробах и делали 9 повторов

Облучение цист A salina искусственным потоком тепловых нейтронов проводили на установке, которая состояла из источника нейтронов (н) ИНК1-06 2S2Cf с активностью потока - 1,42 104 н/с (± 8%), полиэтилена в качестве замедлителя нейтронов, кюветы для цист

8

и 3Не-счетч№ нейтронов типа СИ14Н Детектор нейтронов через усилитель-дискриминатор был подсоединен к устройству счета импульсов Расчет плотности потока нейтронов от источника 2S2Cf, который имеет мощность эквивалентно дозе образца и энергетического спектра, проводили по методу Монте-Карло (Матвеева И С и др, 2004)

Определение влияния фоновых воздействий в воздушном, водном и земном пространствах на цисты A salina

Эксперименты в стратосфере по природному облучению живых и мертвых цист A salina проводили на орбитальном биоспутнике КА «Фотон-МЗ» Цисты были помещены в корпус космического аппарата в условия атмосферы Полет продолжался 12 суток Контролем служили цисты, находящиеся в рабочей лаборатории, на уровне второго этажа капитального пятиэтажного кирпичного строения ГОИН, Москва

Эксперименты в тропосфере по природному облучению живых и мертвых цист A salina проводили при трансконтинентальных авиаперелетах на борту воздушного судна «АН-12», вылетающего по маршруту Москва - Екатеринбург - Новосибирск - Чита -Хабаровск - Петропавловск-Камчатский - Москва Параллельно с экспериментами по корпускулярному (нейтронному) облучению проводили регистрацию нейтронного потока специальным счетчиком СРПН4 производства НИИИТ Минатома на земной поверхности (Плотникова Н.В и др, 2007) Полет проходил на максимальной высоте 11600 м с посадками в пунктах назначения, длительность всего полета составила 10 часов

Эксперименты е Атлантическом океане по природному облучению живых и мертвых цист A salina на трансконтинентальном меридиональном разрезе проводили с борта судна «Академик Йоффег>, следовавшего по маршруту Балтийск - Ушуая (Огненная Земля) -Балтийск в течение 150 суток

Эксперименты в условиях различной этажности по природному облучению живых и мертвых цист A salina проводили в подвальном и чердачном помещениях капитального пятиэтажного кирпичного строения (ГОИН, Москва), в течение 7 суток В лесном биоценозе цисты экспонировали в течение 16 суток

Данные обрабатывали с помощью статистических методов g-теста и распределения Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Описание препаратов цист A salina, их физиологические характеристики

В качестве биообъекта были взяты активированные и неакгивированные живые и мертвые диапаузирующие сухие цисты, находящиеся на стадии ранней гаструляции Ошосительная влажность образцов составила 2,7%

Механизмы устойчивости цист A salina к неблагоприятным абиотическим факторам 1. Влияние низких температур на цисты A salina

Для оценки всхожести цист в условиях длительного промораживания, неактивированные сухие цисты помещали в холодильник при постоянной температуре -10°С в течение 70-и суток Их доставали порциями, промывали, осаждали центрифугированием и проращивали по 100 штук от каждого забора в искусственной морской воде Контролем служили цисты, не подвергнутые воздействию низких температур При помещении в морскую воду через 24 часа и далее до 70-и суток они имели всхожесть 5 - 10% Промораживание неактивировашшх цист при -10°С в течение 47-х суток выявили только 2% всхожести цист, а к 70-м суткам инкубации наблюдалась их максимальная всхожесть равная 92%

Таким образом, нами было определено, что длительное нахождение цист при средненизкой температуре приводит к резкому максимальному скачку их всхожести на 70-е сутки промораживания Наши данные согласуются с литературными данными, где отмечается, что в природе активация цист A salina происходит в зимний период времени, когда у береговой линии соленых озер цисты находятся в диапаузе на протяжении 70-и дней Стимулирующим фактором при продуцировании диапаузирующих (зимних) цист A salina обычно становится температурный фактор при сочетании с повышением концентрации солей (Студеникина Т Л, 1986)

В эти сроки промораживания в контрольных и опытных образцах цист A salina нами изучалась концентрация парамагнитных ионов (Мп}\ Си2*, Fe2*, Fe3*) и концентрация свободных радикалов методом ЭПР-спектроскопии Концентрация парамагнитных ионов у активированных в течение 70-е суток цист при -10°С выявила следующие закономерности На рисунке 1 представлена концентрационная зависимость парамагнитных ионов от длительности промораживания цист A salina

£ $

С

в

/Л

\

я

/

\

\

S

I

S

\

« I

Рис. 1 Влияние длительности промораживания цист A salina при -l(fC на концентрацию парамагнитных ионов (п = 7, Р = 0,95)

« )t Ь1 » V И <• 7»

.I.IIHс шмсп iqt<i40j>.t>K]ii'..uin>i. о гъи

Концентрация парамагнитных ионов, измеренная в опытном (активированном) образце цист на 70-е сутки промораживания в 2,5 раза ниже, чем в контрольном образце В диапазоне от 17 до 47 суток концентрация парамагнитных ионов не превышает контрольных значений Эти данные согласуются с ответом цист на их всхожесть при длительном промораживании, поскольку значите снижения концентрации парамагнитных иоиов в опытном образце также наблюдается на 70-е сутки

Аналогичным образом производилось измерение концентрации свободных радикалов в опытном образце цист, промороженном при -10°С в течение 70-и суток, которая не отличалась от контрольных значений Это свидетельствует о сбалансировании свободнорадиххтьных процессов в этих экспериментальных условиях Возможно, это связано с мощной защитной эндогенной антиоксидаптпой системой и устойчивостью мембранных образований цист A salina

Таким образом, достоверно зафиксирован ход метаболических процессов в цисте в период ее низкотемпературной активации Протекание метаболических реакций в цисте при низкотемпературной активации приводит к изменениям степени окисления элементов, в результате исчезает их парамагнетизм, что и регистрируется спектрометром Такое явление возможно только при наличии протонной подвижности в системе Эти данные явились основанием для изучения подвижности фракции протонов в цистах A salina при их замораживании Поэтому нам представлялось важным изучить влияние высоких температур на содержание подвижной фракции протонов в цистах A salina и на их всхожесть 2. Влияние высоких: температур на цисты A salina

Живые и мертвые цисты (контроль) помещали в ячейку в диапазоне температур от +25° до +110°С в течение 175 минут Как видно из рисунка 2а на каждом из временных этапов эксперимента от 1 -й до 175-й минуты кинетика нагрева биомассы мертвых цист A salina увеличивалась по экспоненте пропорционально увеличению температуры термостата ячейки Повышение температуры биомассы живых цист не соответствовало повышению температуры биомассы мертвых Живые цисты нагревались в аналогичном диапазоне времени медленнее на 1е - 5°С, что достоверно при данных условиях эксперимента Всхожесть образцов цист, после нагрева в ячейке, на 30-й минуте эксперимента составила 90%, на 60-й минуте - 3%, а на 90-й минуте - 0%

Таким образом, наблюдается эффект «самоохлаждения» живых цист и найдены условия их термоустойчивости - абсолютный максимум времени самоохлаждения живых образцов цист составляет 70 ± 15 мин в диапазоне температур от +40°С до +47°С, что

соответствует, разнице температур между термостатом и биомассой ЛТ = 45° ± 10°С при выбранных условиях эксперимента (рис. 7.6).

!

, /

v

/

О М .111 611 » ](« 121! 1« 161) 1» ifjk'Míi ншрштт). мин

51) №

Рис. 2. Зависимость температуры биомассы i¡ucm от их времени нагревания: а - ответ живых (черная линия) и мертвых (серая линия) цист A.salina на нагревание при постоянной массе и одинаковой насытит плотности; 6 - зависимость разности температуры биомассы живых ifucm (fjJ и температуры биомассы мертвых цист (f j от температуры биомассы мертвых цист (f J A.salina (п = 9, р- 0,99).

Вероятно, высокие температуры способствуют к перераспределению элементов в системе, что приводит к возникновению затухающих колебательных процессов в олигомерных мембранных ферментах (Романовский Ю.М. и др. 2002), которые рсзулыируютея в эффекте охлаждения мембранных компонентов клетки. Это - возможный механизм защиты от тепловой денатурации белков, который реализуется при достаточной биомассе цист A.salina. Индуцированные температурой изменения структуры подвижных протонов изучено нами по времени спин-спиновой релаксации протонов методом ЯМР-спиновое эхо.

3. Изменение подвижности фракции прогонов цист A.salina, индуцированные высокой и низкой температурой

Изучение подвижной фракции протонов в живых и мертвых цистах A.salina, после экспериментов по их краткосрочному замораживанию в токе жидкого азота и нагреванию в термостатируемой ячейке, представлены на рисунке 3. Состояние подвижной фракции протонов оценивали по времени спин-спиновой релаксации протонов - Т, метода ЯМР-спиновое эхо.

На рисунке 3 показано, что для нормальной жизнедеятельности цист А.ваИпа оптимальная температура внешней среды должна находиться в диапазоне от -15°С до +35°С, при этом время спин-спиновой релаксации протонов (Тв цистах равно 100 мс ±15 мс, а температура биомассы находится в пределах от 0° до +20° ± 5°С. Выживаемость цист подтверждается данными о всхожести опытных образцов. В случае если условия внешней среды ухудшаются, то цисты способны выживать в следующих температурных пределах: от -20°С до -65°С и от +70"С до +110°С. При этом, когда температура биомассы имеет экстремально отрицательные значения, Г, находится в промежутке от 50 мс до 100 мс, и экстремально положительные значения - от 70 мс до 95 мс.

Рис. .?. Время спин-спиновой релаксации протонов, как функция температуры биомассы цист Л.заИпа. Прерывистыми стрелками показаны оптимальные (1, 2) и неблагоприятные (3, 4) температурные режимы. Стрелкой (5) показано значение Т2 у мертвых г/ист. достигаемое длительной инкубагщей (175 мин.) при +110°С, которое было принято за контрольное значение (р = 0.95).

Таким образом, при оптимальных условиях среды протонная подвижность в живых цистах имеет самые высокие значения. В случае если условия среды становятся неблагоприятными и даже экстремальными - протонная подвижность в цистах уменьшается, что свидетельствует о наличии более прочных протонных связей в живых цистах по сравнению со значением мертвых образцов. Влияние промораживания и нагревания приводят к изменениям гидратации в цистах, а результатом этих изменений является новое равновесие сил в пределах биоструктур цисты как определяющее условие ответа биосистемы на неблагоприятное воздействие. Движение фракции протонов в цисте происходит за счет ослабления гидрофобных взаимодействий в их макромолекулах. Воздействие воды на биоструктуры цисты определяется гидратацией полярных групп, гидрофобными эффектами и возможностью внедрения молекул воды в водородные связи внутри макромолекул и мембранных образований. В результате такого воздействия молекулы воды определяют

1М-110-

<10807060-

/ ; I

/- ; / /

Л/

-П У

V

-1-!-1-1-!-1-!-1-1—

-<¿0 -40 -20 У 2» 40 60 80 НК>

равновесие сил в пределах биоструктур, что является важным условием в устойчивости системы к неблагоприятным воздействиям

Помимо вариации температурных условий нами было изучено действие на цисты другого физического фактора корпускулярного излучения (тепловых нейтронов), изменяющегося на порядки у поверхности Земли в зависимости от высоты над уровнем моря и космогеофизических факторов (в том числе солнечных вспышек) К нейтронному ультраслабому излучению (тепловых энергий) крайне чувствительны все водород-содержащие системы, включая воду и живые организмы

4 Влияние корпускулярного (нейтронного) потока на метаболические характеристики цист A salina

При воздействии искусственного нейтронного потока, создаваемого источником нейтронов ИНК-06 с высокой активностью на живые цисты A salina, изучено состояние подвижной фракции протонов методом ЯМР-спиновое эхо, концентрации свободных радикалов и парамагнитных ионов методом ЭПР-спектроскопии Контролем служили не облученные живые и мертвые цисты (Табл 1)

Таблица 1

Метаболические характеристики живых и мертвых цист A salina после облучения ж искусственным нейтронным потоком с активностью 1,42 104 н/с

Группа Время сшш-спиновой релаксации протонов Т2, % Концентрация свободных радикалов, % Кояцен грация парамагнитных ионов (Mn1+,Cu2+, Fe2+, Fe3+), %

Контрольная, а) живые цисты 100,0 ±1,7 14,1 ±1,4 0,14 ±0,1

Контрольная, б) мертвые цисты 58,3 ±1,0* 18,2 ±1,8 0,08 ±0,1*

Опытная, в) живые цисты, облученные искусственным нейтронным потоком 150,1 ±2,5** 15,3 ±1,5 0,11 ±0,1**

* достоверность различий измеряемого параметра Гз в контрольной группе мертвых цист по отношению к контрольной группе живых г/ист (р = 0 95)

** достоверность различий измеряемого параметра Т2 в опытной группе по отношению к контрольной группе живых 11ист (р = 0,95)

В таблице 1 показано, что в опытных живых цистах (б), после их облучения высокоинтенсивным искусственным нейтронным потоком, на 61% увеличивается протонная подвижность по сравнению с мертвыми контрольными образцами и па 33% по сравнению с живыми контрольными образцами цист (о) Это свидетельствует об особых условиях

изменения состояния вещества в живых цистах при их облучении и об ускорении метаболических процессов в системе В этих условиях концентрация свободных радикалов во всех трех изучаемых образцов (а, б, в) достоверно не различалась между собой, что свидетельствует о стабилизации свободнорадикальных процессов

Измерение концентрации парамагнитных ионов проводилось в образцах (а, б, в) ив аналогичных условиях В контрольном образце живых цист (а), концентрация составила 14% от веса образца, в образце мертвых цист (б) - 8% от веса образца и в облученном образце живых цист (в), концентрация парамагнитных ионов составила 11% от веса образца, что достоверно выше концентрации в контроле мертвых цист По-видимому, их резистентность к облучешпо обусловлена особенностями структуры их оболочек и активностью защитной антиаксидантиой системы После облучения нейтронным потоком образцов цист (в) гистологических и морфочогических изменений нами не обнаружено (Матвеева И С и др, 2004)

Таким образом, было показано, что активное облучение нейтронным потоком способно оказывать влияние на общую подвижность в диапаузируюгцем организме, у которого, изначально, все процессы сильно замедленны Эти факты демонстрируют прямое воздействие облучения на живую систему В литературе приведены данные исследований по облучению цист A salina искусственным потоком тепловых нейтронов Облучение привело к 4-кратному ускорению развития науплиусов, а также к изменению соотношения в элементных профилях по марганцу и мышьяку, тогда как соотношения других элементов (алюминий, хром, никель, медь, кадмий, свинец) у опытных образцов цист A salina осталось неизменным Также обнаружено различие между поглощением/рассеянием тепловых нейтронов живыми и мертвыми цистами (Матвеева И С и др, 2004) Следовательно, искусственное высокоактивное нейтронное облучение способно оказывать системное положительное воздействие на цисты A salina, которое может тормозить или наоборот активизировать в ней генетические и физиологические процессы, такие как механохимическая генерация оболочки Вместе с тем, энергия природного (фонового) нейтронного потока разной интенсивности, возрастающая с высотой, очень высока Попадая в живые системы, нейтронный поток может вызывать ряд интенсивных физико-химических процессов в локальных объемах, таких как ионизация и образование новых элементов, приводя в отдетъных случаях к деструкции системы (Гак Е 3 и др, 2007) Поэтому, нам представилось значимым зарегистрировать ответ живых и мертвых цист A salina на облучение их природным (фоновым) естественным потоком тепловых нейтронов на различных высотах

5. Циста А.яаИпа как биотестер «скрытых» воздействий на человека

Эксперименты по природному естественному облучению живых и мертвых цист А.$аИпа нейтронным потоком проводили в стратосфере на орбитальном биоспутнике, в тропосфере при трансконтинентальном авиаперелете, над уровнем моря при трансатлантическом круизе и в разных условиях на земной поверхности. Далее в лабораторных условиях было изучено состояние подвижной фракции протонов в живых и мертвых цистах А.ваИпа методом ЯМР-спиновое эхо (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость времени релаксации протонов живых (черная линия) и мертвых (прерывистая линия) цист A.salina от интенсивности нейтронного потока на различных высотах. За 100% взят контрольный образец цист, который находился в нормальных условиях лаборатории на высоте 130м над уровнем моря.

На рисунке 4 показано, что не зависимо от пребывания в стратосфере (281 км), в тропосфере (11600 м), в условиях различной этажности (от 118 м до 141 м) и над уровнем моря (18 м) подвижность фракции протонов в живых диетах достоверно не изменялась и имела пределы от 105 мс до 147 мс, что не отличалось от контрольных значений. В отличие от живых цист у мертвых образцов, облученных природным потоком в идентичных условиях, в большинстве случаев наблюдаются различия в протонной подвижности между опытными и контрольными образцами. В мертвых цистах состояние фракции протонов в не зависимости от высоты изменяется следующим образом: на высоте 118 м над уровнем моря, время спин-спиновой релаксации протонов составило 82 мс, что достоверно ниже контрольных значений; на высоте 120 м, время релаксации составило 154 мс, что достоверно выше контрольного времени релаксации; над уровнем моря время релаксации протонов равнялось 114 мс, что так же что достоверно ниже контроля; на 141 м, время релаксации составило 180 мс, что достоверно выше контрольного времени релаксации; на высоте 11600 м, время релаксации составило 122 мс, что нсотличалось от контрольного времени релаксации; на высоте 281 км наблюдался слабый протонный сигнал, который был недетектируем установкой. Полученные

175 и низ кии •Т протонный '! сигнал g

150 эс

т * 7 31 о > i i ц п •■■'' I f Л л 1

¿4 в ИИ! 7 Г ■••' ' _ *

7550- i ж

10' № 10" 10* 10"'

Mlllt-FK HHtUA 1Ъ HCihpoiUIOHI ГНШЖИ 1МД VJXmlR'M \!0[>JI, Н/м"

данные свидетельствует о более чувствительной системе цисты к облучению после наступления ее гибели

Таким образом, по времени релаксации протонов живые цисты, эксионируемые на различных высотах от уровня моря до Земной орбиты, оказываются стабильнее, чем мертвые Нестабильность протонной подвижности в мертвых образцах объясняется деструкцией всей системы на макромолскулярном уровне Возможно, тепловые нейтроны выступают в роли раздражителя по отношению к внутренней среде покоящиеся биосистемы, тем самым, помогая ей находиться в анабиозе продолжительный период При этом система не нуждается в расходе собственной энергии

Следовательно, комбинацию препаратов сухих живых и мертвых цист A salina можно рассматривать в качестве биотестера интенсивного нейтронного потока воздействующего на человека при высотных полетах Биологический феномен ответа организма мертвой цисты A salina является чувствительным показателем для неблагоприятного эффекта на человека, вызванного космическим и авиа- полетом Говоря о проблеме биологических эффектов радиоактивного фона, особое внимание следует уделять космическому излучению, его вариациям и опасности для человека

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе был проведен системный анализ экспериментальных исследований с целью изучения механизмов устойчивости диапаузирующих цист A salina к неблагоприятным факторам резким колебаниям температур и воздействию нейтронного потока различной интенсивности Переход к торможению процессов жизнедеятельности цист A salina, при вхождении в анабиоз, меняет характер устойчивости их биологических структур и организма в целом Устойчивость биоструктур цист должна обеспечиваться за счет их высокой стабильности в состоянии покоя и лабильности при своем активном функционировании (при выходе из анабиоза) в присутствии воды, а также за счет значительного снижения температуры и способности противостоять другим повреждающим факторам (радиация, кислород и т д) В качестве возможного адаптационного механизма устойчивости цист A salina изучено действие высоких и низких температур, отражающее реальные неблагоприятные условия покоящихся цист A salma в зимний и летний периоды, а также действие на них корпускулярного (нейтронного) излучения

Сохранение способности к выживанию в различных неблагоприятных температурных режимах свидетельствует об организменной устойчивости цист, поскольку устойчивость представляет собой прочность биосистемы по отношению к внешним условиям Снижение времени релаксации протонов при низкой температуре (-65°С) свидетельствует об упрочнении протонных связей в живой биосистеме Можно предположить, что подвижность протонов обеспечивается следующими процессами с одной стороны, при низкой температуре уменьшается вклад гидрофобных взаимодействий в структуре белков, а с другой стороны, увеличивается концентрация солей в системе, что приводит к увеличению ионной силы раствора Сохранность состояния подвижных протонов и сбалансированность свободнорадикальных процессов при промораживании цист, возможно, свидетельствует о наличии мощной защитной эндогенной антиоксидантной системой и устойчивостью мембранных образований и является защитным механизмом, позволяющим выживать A salina в естественных условиях среды обитания Устойчивость проявляется в сопротивляемости биосистемы по отношению к изменению внешних условий и к действию неблагоприятных факторов среды При анабиотических температурах в макромолекулярных соединениях и организме цисты A salina происходят структурные перестройки, отличающиеся от процессов, протекающих в ее организме в активном состоянии Такое явление возможно только при наличии подвижной фракции протонов в системе Фракция подвижных протонов в организме A salina способствует его "устойчивости к низким температурным воздействиям Вместе с тем известно, что в летнее время года при повышении температуры до +100°С на солнце у уреза

18

воды цисты A salina остаются жизнеспособными Было обнаружено явление изменения времени релаксации подвижной фракции протонов и эффект «самоохлаждения» живых цист после воздействия на них высоких температур (+70°С) Наши данные подтверждают ранее проведенные исследование (Матвеева И С и др, 2004) по изучению влияния высоких температур на систему В этих исследованиях показано, что температуры способствуют к перераспределению элементов в системе и это приводит к возникновению затухающих колебательных процессов в олигомерных мембранных ферментах, результирующихся в эффекте охлаждения мембранных компонентов клетки Возможно, при самоохлаждении в цисте A salina возникают колебательные процессы, что может являться мехапизмом защиты от тепловой денатурации бетков При облучении образцов живых цист Л salina искусственным потоком тепловых нейтронов подвижность протонов водной и липидной фракций в образце увеличивается Эти данные важны в биологическом аспекте, они подтверждают мнение других исследований (Матвеева И С и др, 2004), что даже слабые потоки тепловых нейронов являются «посредниками», позволяющими живым организмам ощущать целый ряд космофизических событий, в дополнение к известным климатическим факторам С нашей точки зрения корпускулярное излучение является фактором, оказывающим прямое влияние на функционирование живых систем на всех уровнях организации от простейших до человека.

Объективизация результатов, полученных в данной работе, оказалась возможна при использовании высокоинформативных биофизических импульсных методов электронного парамагнитного и ядерного магнитного резонансов С помощью этих методов были получепы объективные данные о том, что цисты, характеризуются наличием сбалансированной системой защиты к неблагоприятным условиям, сформировавшимся в ходе эволюции

Таким образом, в настоящей работе помимо конкретных вопросов, касающихся физиологического аспекта цист в различных неблагоприятных условиях, нами были сделаны попытки оценить глобальные механизмы устойчивости гетеротрофов к неблагоприятным абиотическим факторам, включая компоненты биосферы и космогеофизические факторы, что определяет системность нашего исследования

выводы

1. Комбинирование методов исследования на ядерном (ЯМР-спиновое эхо), атомном (ЭПР-спектроскопия) и организменном уровне позволяет различать живые и мертвые цисты A salina, и количественно определять скорость их метаболизма в период диапаузы

2. Оптимальным сроком для максимальной всхожести цист являются 70-е сутки в условиях их

средненизкого (-10°С) промораживания, когда в цисте происходит снижение концентрации парамагнитных ионов при сбалансированности свободнорадикальных процессов, и неизменность подвижности липидной и водной фракции протонов

3 Оптимальными условиями для максимально высокой всхожести сухих цист Л salina при их нагревании является температура равная +40°С и длительность пагревания - 60 минут

4. Нагревание (от +25°С до +110°С), как живых, так и мертвых цист A salina не приводит к

уменьшению подвижности фракции протонов, в идентичных условиях сухие живые цисты нагреваются медленнее мертвых

5. В цистах A salina, подвергавшихся облучению искусственным корпускулярным (нейтронным) потоком (с активностью до 20 н/с м2) снижается концентрация парамагнитных ионов, возрастает подвижность фракции протонов и не изменяется концентрация свободных радикалов

6 Системный анализ показал, что при радиационном облучении живых цист A salina на орбитальном спутнике и в тропосфере при авиаполете в них не меняется подвижность фракции протонов, в то время как в мертвых образцах эта подвижность меняется пропорционально активности ионизирующего излучения

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Николаева Ю Г, Николаев Г М, Фролов В А, Сыроешкин А В Изучение состояния воды у покоящихся активированных яиц Aríemia salmo L с помощью метода ЯМР-сшшовое эхо // Труды научной конференции «Водные экосистемы и организмы - 7» -Москва -2005 - С 70-71

2 Николаева Ю Г, Николаев Г М, Фролов В А, Сыроешкин А В , Бруй С В , Царева Г А. Влияние низких температур на цисты Artemia salina в течение их активации // Ecological studies, hazards, solutions - Москва - 2006 - С 39

3 Николаева 10 Г, Сыроешкин А В Некоторые особенности выживания при высоких температурах покоящихся форм Artemia salina // XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», - Москва - 2006 - С 169-170

4 Плотникова Н В , Николаева Ю Г , Фролов В А, Лапшин В Б , Сыроешкин АВ К вопросу о корпускулярном облучении человека на больших высотах // VII научно-пракшческая международная конференция «Здоровье и образование в XXI веке» -Москва - 2006 - С 397

5 Николаева ЮГ, Николаев ГМ, Тимофеев КН, Фролов ВА, Сыроешкин А В Изучение состояния воды у покоящихся форм Artemia salina II Вестник РУДН - 2007 -№ 1 - С 5-8

6 Николаева Ю Г, Плотникова Н В , Зенченко Т А, Мерзлый А М, Лапшин В Б, Фролов В А, Сыроешкин А В Дозиметрия корпускулярных потоков и влияние облучения на живые организмы во время авиаперслстов Москва - Северный пошос и Москва -Камчатка, (проблемы экстремального туризма и перемещения спортсменов) // VI международная научная конференция студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной и физической культуры, физиотерапии и курортологии» - Москва - 2007 - С 44

7 Плотникова Н В , Лапшин В Б , Николаева Ю Г, Фролов В А, Сыроешкин А В Санаторное и SPA-лечение и поток тепловых нейтронов исследование поля и модельные эксперименты // VI международная научная конференция студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной и физической культуры, физиотерапии и курортологии» - Москва - 2007 - С 45

8 Николаев Г М, Николаева Ю Г, Савельев И Б, Тимофеев К Н Механизм адаптации цист покоя Artemia salina в экстремальных условиях // II научная конференция с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» - Петрозаводск -2007 - С 108

9 Николаева Ю Г, Плотникова Н В , Сыроешкин АВ , Фролов В A, Artemia salina как биосенсор вторичных корпускулярных потоков // Материалы международной конференции «Чтения Чижевского» - Санкт-Петербург -2007 - С 119

10 Плотникова Н В , Лапшин В Б , Затров В Ю , Колесников М В , Патеев М Р, Николаева Ю Г , Зенченко Т А, Бекетов В В , Мерзлый А М, Сыроешкин АВ Нейтронное поле Земли макромасштабная, мезомасштабная и микромаеппабная вариабельность // Материалы международной конференции «Чтения Чижевского» - Санкт-Петербург -2007 -С^'ХОЬ

И Николаева ЮГ Адаптационный механизм выживания толстоскорлуповых цист Artemia salma в экологических условиях среды обитания // XV всероссийская молодежная научная конференция «Актуальные проблемы биологии и экологии» -Сыктывкар -2008 -C4Í£-¿0'¿

12 Николаева ЮГ, Фролов В А, Сыроешкин А В Влияние низких температур на диапаузирующие цисты Artemia salina II Естественные и технические науки — 2008 -№3 - С 21-25

Николаева Юлиана Геннадьевна (Россия)

Изучение механизмов устойчивости гетеротрофных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам на примере цист Artemia salina

Проведен системный анализ и представлено комплексное исследование механизмов устойчивости диапаузирующих цист A salina к различным неблагоприятным воздействиям -резким колебаниям температур и действию корпускулярных (нейтронных) потоков с различной интенсивностью С помощью метода ядерного магнитного резонанса было показано, что движение фракции протонов в цистах A salma составляет 3 - 4% (от веса образца) и принадлежит лшгадной и водной фракциям, и эта подвижность одинакова как в опытных, так и в контрольных образцах Выявленную способность цист A salina охлаждаться при нагревании, можно отнести к защитно-приспособительным механизмам устойчивости при неблагоприятных воздействиях Способность цист, находящихся в неблагоприятных условиях низких температур и интенсивного корпускулярного (нейтронного) потока, сохранять концентрацию свободных радикалов в пределах физиологических значений свидетельствует о наличии в них системы антиоксидантной защиты Показано, что облучение цист A salina корпускулярным (нейтронным) потоком, вызывает биологический ответ в мертвых цистах Л salina, то есть внутренняя протонная подвижность в мертвых образцах цист увеличивается

Yuliana G Nikolaeva, (Russia)

Studying of mechanisms of stability heterotropheous organisms to adverse to abiotic factors on example cysts Artemia salma

System analysis of mechanisms of stability diapause cysts A salina to various adverse influences is submitted to sharp fluctuations of temperatures and action of corpuscular (neutron) fluxes with various intensity With method of nuclear magnetic resonance it has been shown, that movement of fraction protons in cysts A salina is 3 - 4% (of dry sample) lipids and water fractions This mobility is identical both in test, and m samples control samples The revealed ability of cysts A salina during heating, it is possible relate to protective adaptive mechamsms coolmg of stability at adverse effects The ability of cysts to sustain the constant free radical concentrators (in the physiological intervals) during intensive corpuscular (neutrons) radiation and low temperature conditions argues about the presence in them systems antioxidant protection The irradiation cysts A salma is shown by a corpuscular (neutron) flux, that, causes the biological answer in dead cysts A salma, that is internal proton mobility m dead samples cysts increases

Подписано в печать 13 05 2008 г Печать на ризографе Тираж 100 экз Заказ № 1058. Объем 1,3 п л. Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН 7718532212, г Москва, ул Маросейка, д 6/8, стр 1, т 623-08-10, \v\vw а1Гауи2000 ш

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности гетеротрофных организмов.

1.1.1. Общие сведения о метаболизме гетеротрофных организмов. » ' t *

1.1.2. Циста как покоящаяся форма.

1.1.3. Особенности биологии жаброногого рачка A.salina.

1.2. Механизмы устойчивости гетеротрофных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам.

1.2.1. Проблема устойчивости.

1.2.2. Адаптивное значение анабиоза.

1.2.3. Особенности воздействия воды на биосистему.

1.3. Влияние неблагоприятных факторов на жизнедеятельность гетеротрофных организмов.

1.3.1. Влияние низких температур и высушивания.

1.3.2. Влияние высоких температур и аноксия.

1.3.3. Влияние вторичных корпускулярных потоков.

1.4. Некоторые методы изучения интегральных метаболических характеристик биосистемы.

1.4.1. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса.

1.4.2. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса.

1.5. Биоиндикаторы химических и физических факторов окружающей среды.

1.5.1. Биоиндикаторы загряз1 гения воды.

1.5.2. Биоиндикаторы ионизирующих излучений.

1.6. Проблемы комплексного обеспечения жизнедеятельности человека вне биосферы Земли.г

1.6.1. Космическое ионизирующее излучение.

1.6.2. Особенности нейтронного потока атмосферы.

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Определение подвижности протонов методом ядерного магнитного резонанса.

2.3. Определение концентрации радикалов и ионов методом электронного парамагнитного резонанса.

2.4. Метод рассеяния моноэнергетических нейтронов. •

2.5. Метод определения влияния высоких, и низких температур на цисты A.salina.

2.5.1. Влияние низких температур.

2.5.2. Влияние высоких температур.59>

2.6. Определение влияния фонового радиационного воздействия ввоздушном, водном и земном пространствах на цисты A.salina.

ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние низких температур на цисты A.salina.

3.2. Влияние замораживания на подвижность фракции* протонов в ц и стах А. salina.

3.3. Влияние высоких температур на цисты A.salina.

3.4. Влияние нагревания на подвижность фракции протонов в цистах A.salina.

3.5. Влияние искусственного нейтронного потока с экстремально высокой активностью на подвижность фракции протонов в цистах A.salina.

3.5.1. Влияние природного (фонового) нейтронного потока, изменяющегося с высотой, на подвижность фракции протонов в цистах A.salina.

Актуальность проблемы. Для биосистемы, находящейся в неблагоприятных условиях, основной задачей становится поддержание жизнедеятельности с сохранением энергетического потенциала. Главным адаптационным механизмом к. неблагоприятным воздействиям считайся способность организма входить в состояние анабиоза или диапаузы. В связи с этим, возникает вопрос о наличии действующих энергообразующих процессов в диапаузирующей системе в условиях истощения запасов органических веществ, снижения скорости окисли гельно-восстановительных реакций и синтеза АТФ ниже предела обнаружения [84]. Предполагается, что метаболические, в том числе мембраносвязанные процессы все же происходят, по они сильно замедленны [44, 53]. Замедленные мембраносвязанные процессы могут обеспечить поддержание жизни в диапаузирующей системе. Градиенты разности температур, перепады-давления, влажности, действие корпускулярных потоков, а также механохимическая генерация мембранного потенциала, подобно процессам в тельцах Пачини и дисках Мейснера, могут выступать поддержкой межфазных потенциалов по причине наличия эффектов Соре и Зеебека и счшаться второстепенным механизмом поддержания жизнеспособности [48, 117]. Значшельные трудности в проведении таких исследований! вносит 0гсу1сгвие предсказательных теоретических моделей, поскольку биообъект является сложной системой. В 10 же время задача изучения устойчивости организма к неблагоприятным условиям становится все более актуальной. Исследование общебиологических закономерностей адаптационных свойств биообъекта, а также влияния па него неблагоприятных температурных режимов и действия облучений различной интенсивности может способствовагь развитию фундаментальных представлений различий живого и мертвого. В то же время механизмы устойчивости биообъекта к неблагоприятным условиям изучены недостаточно.

Для изучения устойчивости биообъекта к неблагоприятным абиотическим факторам необходим системный анализ, который основывается на изучении различных уровней организации биообъекта при его взаимодействии с окружающей средой. В настоящей работе проводилось сопоставление собственных экспериментальных результатов с литературными данными по функционированию организма в нормальных и неблагоприятных условиях на атомном уровне, в частности, при взаимодействии с корпускулярным излучением, на молекулярном уровне, субклеточном (мембранном), клеточном и оргаиизменном уровне организации системы.

Важной проблемой является поиск биологических объектов, наиболее адекватно- реагирующих на неблагоприятные воздействия и имеющие простую организацию, позволяющую получать информацию о неблагоприятных воздействиях, независящую от таксономического положения организма. Кроме того, важен подбор специфичных и высокоинформативных методов исследования влияния различного рода воздействий на биообъект- с целью объективизации полученпых результатов. При исследовании влияния неблагоприятных факторов на живой организм применение могут найти методы, основанные на оценке физических параметров биотестера.

В качестве биотсстера могут быть, использованы высокостойкие цисты жаброногих рачков Artemia salina. Известно, что цисты A.salina применяют для оценки степени загрязнения водной среды, так как толстая оболочка цисты обладает высокой степенью устойчивости [164, 37, 84]. Благодаря таким свойствам оболочки, циста A.salina способна переживать в течение многих лег неблагоприятные условия, среды в состоянии анабиоза или диапаузы, когда метаболические процессы в ней сильно замедлены [113, 109]. При этом всегда имеется возможность вступления A.salina в цикл с помощью влияния адекватного стимула [54].

Нерешенной задачей является также отсутствие удачно подобранного комплекса высокоинформативных методов регистрации метаболических процессов в диапаузирующей системе при неблагоприятных условиях. Кроме того, в этих условиях остаются неизученными-физические пределы возможности покоящейся неметаболизирующей формы оставаться жизнеспособной в период диапаузы.

Целью настоящей работы явилось изучение механизмов устойчивости диапаузирующих цист A.salina к неблагоприятным температурным воздействиям и действию ультраслабых нейтронных потоков с различной интенсивностью.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние низких температур навсхожесть цист A.salina.

2. Оценить концентрацию свободных радикалов, парамагнитных ионов и подвижность фракции протонов в цистах A.salina в условиях низких температур в течение длительного периода времени;

31' Изучить влияние высокихтемпературнавсхожестьцист A.salina. 4. Оценить.влияние нагревания (от +25°G до +110°С) на подвижность-фракции? протонов в цистах A .saliha. 5J, Оцепить влияние: искусственного корпускулярного (нейтронного) потока на подвижность фракции протонов вцистах A.salina, концентрацию свободных, радикалов и парамагнитных ионов. 6. Провести системный анализ реакции цист A:salina как биотестера на действие радиационного излучения в условиях космического* полета на спутнике и трансконтинентального авиаперелета:.

Научная новизна: Впервые был использован системный анализ при изучении механизмов устойчивости: цист A.salina к неблагоприятным; условиям. Модельный объект изучали как; иерархическую систему: проводилось сопоставление собственных экспериментальных результатов с литературными данными по функционированию организма в нормальных и неблагоприятных условиях на атомном (при взаимодействии с корпускулярным излучением), молекулярному субклеточном (мембранном), клеточном и организменном уровнях организации системы. В работе впервые показано, что при воздействии на цисты A.salina высокой температуры (+110°С) живые цисты нагреваются медленнее, чем мертвые. Впервые отмечено, что в цистах, после лиофильного высушивания, остается 3 — 4% (от веса образца) подвижной фракции прогонов; которые принадлежат водной и липидной фракциям. Впервые для выяснения механизмов устойчивости цист изучались возможные механизмы выживания: протонной подвижности, концентрации свободных радикалов. Впервые изучена роль корпускулярных потоков с использованием высокоинформативных методов ядерного магнитного резонанса - спиновое эхо и электронного парамагнитного резонанса.

Научно-практическая значимость работы

Научная значимость работы заключается в том, что системный анализ механизмов выживаемости биообъекта при неблагоприятных воздействиях окружающей среды необходим для понимания и контролирования этих процессов, так как они являются .универсальными для всех гетеротрофов. Полученные данные о наиболее значимых механизмах устойчивости биотестера к неблагоприятным космогеофизическим воздействиям могут иметь определенное значение ^ для понимания и анализа этих процессов у человека. Практическая значимость работы заключается в расширении знаний о выживаемости цист A.salina в неблагоприятных условиях, поскольку цисты культивируются как основной белковый источник питания для многих гетеротрофных организмов, а также при глубокой переработке цист получают препараты и вещества, используемые в медицине, производстве высоко стимулирующих биопрепаратов, иммуномодуляторов, корректирующих обмен веществ у человека. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Представлено комплексное системное исследование механизмов устойчивости диапаузирующих цист A.salina к различным неблагоприятным воздействиям -резким колебаниям температур и действию корпускулярных (нейтронных) потоков с различной интенсивностью при' сравнении реакций- организма на атомно-молекулярных и организменном уровнях. Одновременное определение подвижности протона в условиях ядерного магнитного резонанса - спинового эха, интегральной кинетики свободно радикальных реакций в клетках, неравновесной кинетики теплопереноса в биомассе могут служить новой совокупностью критериев различения живого и мертвого у организмов, находящихся в состоянии метаболического покоя, анабиоза.

2. С помощью метода ядерного магнитного резонанса (спиновое эхо) было показано, что движение фракции протонов в цистах A.salina составляет 3 - 4% (от веса образца) и принадлежит липидной и водной фракциям, и эта подвижность одинакова как в опытных, так и в контрольных образцах.

3. Выявленную способность цист A.salina охлаждаться при нагревании, можно отнести к защитно-приспособительным механизмам устойчивости при неблагоприятных воздействиях.

4. Способность цист, находящихся в неблагоприятных условиях низких температур и интенсивного корпускулярного (нейтронного) потока, сохранять концентрацию свободных радикалов в пределах физиологических значений свидетельствует об измеряемом протекании- метаболических процессов, связанных с антиоксидантной защитой.

5. Показано, что облучение цист A.salina корпускулярным (нейтронным) потоком, приводит к изменениям внутренней протонной подвижности в мертвых цистах A.salina при стабилизации этого показателя у живых цист.

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной гидробиологической конференции «Водные экосистемы и организмы - 6» (Москва, 2005); на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам' «Ломоносов - 2006» (Москва, 2006); на Международной гидробиологической конференции «Водные экосистемы и организмы - 7» (Москва, 2006); на VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); на VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной и физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва, 2007); на II научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Пегрозаводск, 2007); на международной конференции «Развитие идей А.Л. Чижевского» (Санкт-Петербург, 2007); на XV Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008). Публикации: по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 112 страницах и состоит из следующих разделов: обзора литературы, методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка 167 источников, из них 125 на русском и 42 на иностранных языках и приложения. Работа содержит 4 таблицы, 20 рисунков.

выводы

1. Комбинирование методов исследования на ядерном (ЯМР-спиновое эхо), атомном (ЭПР-спектроскопия) и организменном уровне позволяет различать живые и мертвые цисты A.salina, и количественно определять скорость их метаболизма в период диапаузы.

2. Оптимальным сроком для максимальной всхожести цист являются 70-е сутки в условиях их средненизкого (-10°С) промораживания, когда в цисте происходит снижение концентрации парамагнитных ионов при сбалансированности свободнорадикальных процессов, и неизменность подвижности липидной и водной фракции протонов.

3. Оптимальными условиями для максимально высокой всхожести сухих цист A.salina при их нагревании является температура равная +40°С и длительность нагревания - 60 минут.

4. Нагревание (от +25°С до +110°С), как живых, так и мертвых цист A.salina не приводит к уменьшению подвижности фракции протонов, в идентичных условиях сухие живые цисты нагреваются медленнее мертвых.

5. В цистах A.salina, подвергавшихся облучению искусственным корпускулярным о нейтронным) потоком (с активностью до 20 н/с-м ) снижается концентрация парамагнитных ионов, возрастает подвижность фракции протонов и не изменяется концентрация свободных радикалов.

6. Системный анализ показал, что при радиационном облучении живых цист A.salina на орбитальном спутнике и в тропосфере при авиаполете в них не меняется подвижность фракции протонов, в то время как в мертвых образцах эта подвижность меняется пропорционально активности ионизирующего излучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе были проведены экспериментальные исследования с целыо изучения механизмов устойчивости диапаузирующих цист A.salina к неблагоприятным факторам: резким колебаниям температур и воздействию нейтронного потока различной интенсивности. Переход к торможению процессов жизнедеятельности цист A.salina, при вхождении в анабиоз, меняет характер устойчивости их биологических структур и организма в целом. Устойчивость биоструктур цист должна обеспечиваться за счет их высокой стабильности в состоянии покоя и лабильности при своем активном функционировании (при выходе из анабиоза) в присутствии воды; а также за счет значительного снижения температуры и способности противостоять другим повреждающим факторам (радиация, кислород и т.д.). В качестве возможного адаптационного механизма устойчивости цист A.salina изучено действие высоких и низких температур, отражающее реальные неблагоприятные условия покоящихся цист A.salina в зимний и летний периоды, а также действие на них корпускулярного(нейтронного) излучения.

Сохранение способности к выживанию в различных неблагоприятных температурных режимах свидетельствует об организменной устойчивости цист, поскольку устойчивость представляет собой прочность и сопротивляемость биосистемы по отношению к изменению внешних условий и к действию неблагоприятных абиотических факторов. Снижение времени релаксации протонов при низкой температуре (-65°С) свидетельствует об упрочнении протонных связей в живой биосистеме. Можно предположить, что подвижность протонов обеспечивается следующими процессами: с одной стороны, при низкой температуре уменьшается вклад гидрофобных взаимодействий в структуре белков, а с другой стороны, увеличивается концентрация солей в системе, что приводит к увеличению ионной силы раствора. Сохранность состояния подвижных протонов и сбалансированность свободнорадикальных процессов при промораживании цист, возможно, свидетельствует о наличии мощной защитной эндогенной антиоксидантной системой и устойчивостью мембранных образований и является защитным механизмом, позволяющим выживать A.salina в естественных условиях среды обитания. Устойчивость проявляется в сопротивляемости биосистемы по отношению к изменению внешних условий и к действию неблагоприятных факторов среды. При анабиотических температурах в макромолекулярных соединениях и организме цисты A.salina происходят структурные перестройки, отличающиеся от процессов, протекающих в ее организме в активном состоянии. Такое явление возможно только при наличии подвижной фракции протонов в системе. Фракция подвижных протонов в организме A.salina способствует его устойчивости к низким температурным воздействиям. Вместе с тем известно, что в летнее время года при повышении температуры до +100°С на солнце у уреза воды цисты A.salina остаются жизнеспособными. Было обнаружено явление изменения времени релаксации фракции протонов и эффект «самоохлаждения» живых цист после воздействия на них высоких температур (+70°С). Наши5 данные подтверждают исследование [117] по изучению влияния высоких температур на систему. В этих исследованиях показано, что температуры способствуют к перераспределению элементов в системе и это приводит к возникновению затухающих колебательных процессов в олигомерных мембранных ферментах, результирующихся в эффекте охлаждения мембранных компонентов клетки. Возможно, при самоохлаждении-в цисте A.salina возникают колебательные процессы, что может являться механизмом защиты от тепловой денатурации белков. При облучении образцов живых цист A.salina искусственным потоком тепловых нейтронов подвижность протонов водной и липидной фракций в образце увеличивается. Эги данные важны в биологическом аспекте, они подтверждают мнение других исследований [85], что даже слабые потоки тепловых нейронов являются «посредниками», позволяющими живым организмам ощущать целый ряд космофизических событий, в дополнение к известным климатическим факторам. С нашей точки зрения корпускулярное излучение является фактором, оказывающим прямое влияние на функционирование живых систем на всех уровнях организации от простейших до человека.

Объективизация результатов, полученных в данной работе, оказалась возможна при использовании высокоинформативных биофизических импульсных методов электронного парамагнитного и ядерного магнитного резонансов. С помощью этих методов были получены объективные данные о том, что цисты, характеризуются наличием сбалансированной системой защиты к неблагоприятным условиям.

Таким образом, в настоящей работе помимо конкретных вопросов, касающихся физиологического аспекта цист в различных неблагоприятных условиях, нами были сделаны попытки оценить глобальные механизмы устойчивости гетеротрофов к неблагоприятным абиотическим факторам, включая компоненты биосферы и космогеофизические факторы, что определяет системность нашего исследования.

1. А. с. № 2150196 (РОССИЯ). Способ подготовки цист артемии (Artemia salind) / Е.Е. Гусев. Опубл. в Б.И., 2000. № 7.

2. А. с. № 235506 (СССР). Способ подготовки яиц артемии к массовому культивированию путём их промораживания. В.А. Копец, П.М. Воронов, К.А. Воскресенский, И.1Х1. Хайдаров. Опубл. в Б.И., 1973. № 10.

3. А. с. № 935044 (СССР). Способ получения науплиусов из яиц ракообразных / И.Б. Богаткова, Ж.И. Ерофеева. Опубл. в Б.И., 1982. № 22.

4. Абрагам А. Ядерный магнетизм / Пер. с англ. М.: ИЛ, 1963. С. 551.

5. Агулова Л.П. Принципы адаптации биологических систем к космогеофизическим факторам // Биофизика, 1998. Т. 43. Вып. 4. С. 571-574.

6. Аксенов С.И: Исследование динамической структуры глобулярных- белков импульсными методами ядерного магнитного- резонанса // Молекуляр. биология, 1983. Т. 17. № 3. С. 475-483.

7. Аксенов С.И. О состоянии воды в биологических объектах с малой влажностью // Анабиоз и преданабиоз микроорганизмов. Рига: Зинатне, 1973. С. 41-50.

8. Аксенов С.И., Воронков А.Е., Николаев Г.М., Гельфанд В.Е. Спектрометр спинового эха для исследования состояния воды в растительных и животных тканях// Науч. докл. высш. школы: Биол. Науки, 1971. № 12. С. 109-117.

9. Аксенов С.И., Горячев С.Н., Фатеева М.В., Никитина Т.Н. Исследование различных штаммов дрожжей рода Saccharomycodes с разной устойчивостью к лиофилизации методом спинового эха ЯМР // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1973. №5. С. 729-736.

10. Аксенов С.И., Никитин В.А. О влиянии дезинтеграции клеток дрожжей на медленные компоненты спада спинового эха ЯМР от высушенной биомассы // Дезинтеграция микроорганизмов. Пущино-на-Оке: Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов, 1972. С. 315-320.

11. Аксенов С.И., Никитин В.А., Шкидченко А.Н., Кудрявцев А.А. Исследование лиофилизированной биомассы дрожжей Candida utilis, взятыхна разных фазах роста, методом спинового эха ЯМР // Микробиология, 1975. Т. 44. №3. С. 546-551.

12. Аксенов С.И., Николаев Г.М. Исследование состояния воды в биологических объектах с малой влажностью методом спинового эха // Связанная1 вода в дисперсных системах. М.: Изд-во МГУ, 1972. Вып. 2. С. 154-167.

13. Аксенов С.И., Филатов А.В. Исследование внутреннего движения в глобулярных белках по температурной зависимости времени спин-решеточной релаксации // Биофизика, 1979. Т. 24. № 2. С. 324-325.

14. Аксенов С.И., Филатов А.В. Сравнительное исследование характеристик спада спинового эха ЯМР протонов различных глобулярных белков в воде // Биофизика, 1979. Т. 24. № 4. С. 602-605.

15. Ас. № 1124899 (СССР). Способ подготовки к инкубации яиц ракообразных / В. П. Рыбкин. Опубл. в Б.И., 1984. № 43.

16. Аузиня Л.П., Зикманис П.Б., Бекер М.Е. Влияние обезвоживания на жирнокислотный состав липидов дрожжей Saccharomyces II Прикл. биохимия и микробиология, 1979. Т. 15. № 6. С. 822-826.

17. Баев В.И., Волкова З.А., Максимов II.A. Значение гликолиза в тканях при сочетанном воздействии гиперкапнии, гипоксии и гипотермии // Физиол. журн. СССР им. И.М. Сеченова, 1978. Т. 64. № 6. С. 858-863.

18. Бекер М.Е. Биомембраны микроорганизмов при обезвоживании, регидратации и реактивации // Биомембраны. Структура, функция и методы исследования. Рига: Зинатне, 1977. С. 216-235.

19. Бекер М.Е. Обезвоживание микробной биомассы и экстрацеллюлярных метаболитов. Рига: Зинатне, 1967. С. 364.

20. Бекер М.Е., Аузан С.И., Аузиня Л.П., Лайвениекс М.Г., Блумберг Я.Э., Зикманис П.Б. Нарушение барьерной функции мембран микроорганизмов при обезвоживании и регидратации // Биомембраны. Структура. Функции.

21. Медицинские аспекты. Рига: Зинатне, 1981. С. 196-209.

22. Белишева Н.К., Кужевский Б.М., Сигаева Е.А., Панасюк М.И:, Жиров В.К. Модуляция функционального состояния крови вариациями интенсивности нейтронов у поверхности земли // Докл. Академии Наук,,2005: Т. 407. № 5. С. 687-691.

23. Белоус A.M.,, Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наук, думка, 1982. С. 255.

24. Бенгард К. Е. Влияние первичной обработки и качества мороженного рачка артемия салина// Рыболовство. Москва, 1988. № 4. С. 85-86.

25. Бернал Док. Возникновение жизни / Пер. с англ. М-: Мир, 1969; С. 391.

26. Биоиндикация загрязнения; наземных экосистем / Под редакцией Р. Шуберт М. 1988. С. 348.

27. Бириггейн Я.А. Высшие paKu (Malacostraca) П Жизнь пресных вод СССР. М., 1940, Т. 1. С. 405-430.

28. Бланков Б.И., Клебанов Д.П. Применение лиофилизации в микробиологии. М.: Медгиз, 1961. С. 263.

29. Бойкова Э.Я: Применение простейших в токсикологических исследованиях // Экспериментальная водная токсикология; 1991. Выи. 15. С. 155-164.

30. Брандтс Д.Ф. Конформационные переходы белков в воде и в смешанных растворителях // Структура и стабильность биологических макромолекул / Пер. с англ. М.: Мир, 1973. С. 174-254.

31. Братолтобова-Цулукидзе JI.C. Гордеев Ю.П., Лягушин В.И., Маркелова Т.Н.,

32. Нечаев О.Ю., Панасюк М.И., Сараева М.А., Смирнов J1.A., Шаврин Л.И., Ширяева В.Л. Аппаратура и предварительные результаты для мониторинга проникающей радиации на орбитальном комплексе «МИР» // Космические исследования, 1991. Т. 29. Вып. 3. С. 487-490.

33. Бурдин К.С. Основы биологического мониторинга. М., 1985. С. 158. Криволуцкнй Д.А. Биоиндикация система «экологической тревоги» // Биоиндикаторы и биомониторинг. Загорск, 1991. С. 228-229.

34. Быкова В.М., Немцев' С.В. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана / Получение, свойства и применение. Наука, 2002. С. 7-23.

35. Влияние солнечной активности на биосферу: Проблемы космической биологии. М.: Наука, 1978. Т. 43. С. 233.

36. Володичев Н.Н., Кужевский Б.М., Нечаев О.Ю., Панасюк М.И. Резкоевозрастание потока нейтронов во время солнечного затмения 22 июля 1990 года // Космические исследован., 1992. Т. 30. № 3. С. 422-424.

37. Воронов П.М. Влияние температуры на жизнеспособность яиц Artemia salina I/ Зоол. журн., 1974. Т. LIII. Вып. 4. С. 546-549.

38. Гак Е.З., Белишева Н.К., Гак М.З. О роли космических лучей в гидрологических и биофизических процессах // Проблемы космической безопасности. С-Пб.: Изд-во «Интан», 2007. Книга. 11. Ч. 3. Г. 1. С. 229-251.

39. Говорунов И.Г. Нефелометрический и флуориметрический анализ барьерных свойств мембран E.coli после низкотемпературных воздействий: Авто-реф. дис. канд. биол. наук. Оболенск, 1984. С. 20.

40. Голдовский A.M. Анабиоз. Л.: Наука, 1981. С. 156.

41. Горшков Г.В., Лятковский Н.М. Нейтронный каротаж // Вестник ЛГУ, 1946. С. 12.

42. Горшков Э.С., Бондаренко Е.Г., Шаповалов С.Н. и др. // Биофизика, 2001.1. Вып. 5. С. 816-818.

43. Граевский Э.Я. Стеклообразное состояние протоплазмы в условиях глубокого охлаждения //Успехи биологии, 1948. Т. 25. № 2. С. 185-202.

44. Грю К.Э., Иббс Т.Д. Термическая диффузия в газах, пер. с англ., М., 1956.

45. Гусев М.В., Гохлернер Г.Б. Свободный кислород и эволюция клетки. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. С. 224.

46. Понтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР / Пер. с англ. М.: Мир, 1984. С. 478.

47. Дубров А.П. Симметрия биоритмов и реактивности. М., 1987. С. 175.

48. Дятлов С.Е. Роль и место биотестирования в комплексном мониторинге загрязнения морской среды // Экология моря, 2000. Вып. 51. С. 83-87.

49. Епифанова О.Е., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. М.: Наука, 1983. С. 181.

50. Епифанова О.Е., Терских В.В., Полуновский В.А. Регуляторные механизмы пролиферации клеток. М.: Итоги науки и техники, ВИНИТИ, 1988. Т. 10. С. 126-161.

51. Зикманис П.Б., Аузан С.И., Аузиня Л.П., Бекер М.Е. Периодичность дыхательной активности дрожжей Saccharomyces cerevisiae при регидратации обезвоженных популяций // Изв. АН Латв. ССР. 1984л№ 10. С. 86-88.

52. Иберла К. Факторный анализ. М.: Статистика, 1980. С. 398.

53. Иванов В.Б. Клеточные основы роста растений. М.: Наука, 1974. С. 171

54. Иванова-Казас О.М. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных:

55. Членистоногие. М., 1979. С. 224.

56. Игнатов С.Г., Красильников В.А., Перелыгин В.В., Капрельянц А.С., Островский Д.Н. Исследование функциональных и структурных изменений мембранного аппарата E.coli после низкотемпературного замораживания // Биохимия, 1981. Т. 46. № 11. С. 1996-2003.

57. Израэль Ю.А., Филиппова Л.М., Инсаров Г.Э., Семеновский Ф.Н., Семенов С.М. Фоновый экологический мониторинг состояния окружающей природной среды. Влияние загрязнений на биологические системы. Гидрометеоиздат, 1983. С. 9.

58. Имшенецкий А.А., Комолова Г.С., Лысенко С.В., Гамуля Г.Д. О влиянии глубокого вакуума на активность некоторых ферментов // Докл. АН СССР, 1968. Т. 182. №4. С. 971-972.

59. Ионова В.Г., Сазанова Е.А., Сергеенко Н.П. и др. // Биофизика, 2003. Вып. 2. С. 380-384.

60. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях. Н.: Наука, 1981. С. 144.

61. Календо Г.С. Ранние реакции клеток на ионизирующее излучение и их роль в защите и сенсибилизации. М.: Энергоиздат, 1982. С. 96.

62. Кикнадзе Г.С., Есаков Б.П., Кузьминых С.Б., Комаров В.М. Опыт оценки степени загрязнения водной среды по изменениям периода биения сердца дафнии // Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1983. С. 13.

63. Константинов А.С. Общая гидробиология: Учеб. для биол. Спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М., Высшая школа, 1986. С. 15-20.

64. Кратасюк В.А., Егорова О.И., Есимбекова Е.Н. и др. Люциферазный биотест для определения степени пораженности фузариозом зерна пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология, 1998. № 6. С. 688-691.

65. Кратасюк В.А., Ким Н.Б. Биосенсоры на основе люциферазы, иммобилизованной в крахмальные мембраны. Препринт № 94 Б. Кр-ск: Ин-т Физики СОАНСССР, 1988. С. 23.

66. Крепе Е.М. Клеточные липиды и их роль в адаптации водных организмов к условиям существования. В кн.: Физиология и биохимия морских и пресноводных животных. Л.: Наука, 1979. С. 3-21.

67. Крепе Е.М. О путях развития эволюционной биохимии. В кн.: Эволюционная физиология: Руководство по физиологии. Л., 1979. С. 394425.

68. Кудряшева Н.С., Зюзикова Е.В., Гутник Г.В. Механизм действия солейметаллов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro II Биофизика, 1999. Т. 44. № 1. С. 244-250.

69. Кужевский Б.М., Нечаев O.K., Сигаева E.J1. Сезонный ход анизотропиипотоков тепловых нейтронов вблизи поверхности Земли // Вестник МГУ, Серия 3. Физика и Астрономия, 2002. № 1. С. 55-58.

70. Кужевский Б.М., Нечаев О.Ю., Шаврин П.И. Анизотропия тепловых нейтронов в атмосфере Земли // I геомагнетизм и аэрономия, 1995. Т. 35. № 2. С. 166-170.

71. Кузмин Ю.Д. Регистрация интенсивности нейтронного потока на Камчатке в связи с прогнозом землетрясений // Материалы научно-технической конференции, 17-18 января 2006, Петропавловск-Камчатский, Геофизическая служба РАН. С. 149-155.

72. Кузнецов A.M., Тюлькова Н.А., Кратасюк В.А. и др. Изучение характеристик реагентов для биолюминесцентного тестирования // Сибирский экологический журнал, 1997. № 5. С. 459-465.

73. Кузьмина Р.И., Пестеренко Г.В., Терешкова Г.М. Реактивация микроводорослей из состояния сухого анабиоза // Биотехнология и биоинженерия: Тез. симпоз. Рига: Зинатне, 1978. С. 94-95.

74. Лапин В.И., Шатуновский М.И. Особенности состава, физиологическое и экологическое значение липидов рыб // Успехи совр. биол., 1981. Т. 92. С. 380-394.

75. Липсон А.Г., Бардышев И.И., Кузнецов В.А., Ляхов Б.Ф. Аномальные поглощения тепловых нейтронов в меди в присутствии сильных механических напряжений // Физика твердого тела, 1998. Т. 40. № 2. С. 254259.

76. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновой метки в молекулярной биологии. М.: Наука, 1974. С. 256.

77. Лозина-Лозинский Л.К. Анабиоз и устойчивость живых систем // Журн. общей биологии, 1973. Т. 34. № 2. С. 253-262.

78. Лозина-Лозинский Л.К. Действие охлаждения на клетки и организм как мультифакторный процесс // Цитология, 1982. Т. 24. № 4. С. 371-390.

79. Магнитное поле и жизнедеятельность организмов: Проблемы космическойбиологии. М.: Наука, 1978. Т. 37. 266 С. 72.

80. Макрушии А.В., Ляигузова И.В. Оболочка пропагул беспозвоночных и растений: избирательная проницаемость и барьерные свойства // Журн. общ. биол., 2006. Т. 67. № 2. С. 120-126.

81. Медельяновский А.Н. Системные механизмы гомеостаза // Успехи физиол. наук. 1982. Т. 13. № 3. С. 96-126.

82. Мелехов Е.И. О возможном принципе регуляции повреждения и защитной реакции клеток// Журн. общ. Биологии, 1983. Т. 44. № 3. С. 386-397.

83. Минеев Ю.В. Космические исследования. Научные технологические результаты // ВИНИТЛ, 1990. Т. 32. С. 118.

84. Михайлова Г.А. // Биофизика. 2001. Вып. 5. С. 922-926.

85. Недев К.Н., Хургин Ю.И. Исследование поверхностного слоя белковой глобулы: Гидратация молекулы а-химотрипсина // Молекуляр. Биология,1977. Т. 9. №4. С. 761-767.

86. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971. С. 342.

87. Николаев Г.М., Маторин Д.И., Аксенов С.И. Состояние воды и функционирование первичных реакций фотосинтеза у лишайника Placoleconora melanophthalma из холодных пустынь Восточного Памира // Науч. докл. выс. школы: Биол. науки, 1977. № 1. С. 101-106.

88. Обзор зарубежного опыта разведения артемии для использования ее в аквариуме // ВНИИ мор. рыбн. хоз-ва и океанографии, ЦНИИ информ. и техн-экон. исслед. рыбн. хоз-ва. Сост.: Л.В. Спектрова, 1984. С. З.

89. Петросян А.Г., Дятлов С.Е. Шкала токсичности для оцинки яркости морського середовища з використанням науплиальных стадий Artemia salina L. \\ Висник Одеського держ. университету, 2000. Том. 5. Вип. 1. С.222-227.

90. Петросян В.И., Синицин Н.И., Елкин В.А., Башкатов О.В. Взаимодействие водосо держащих сред с магнитными полями // Биомедицинскаярадиоэлектроника, 2000. Вып. 2. С. 10-18.

91. Плаксин И.Н., Джемардини Ю.А., Малышева Н.Г., Старчук Л.П. Исследования факторов, влияющих на определение лития и бора в продуктах обогащения по ядерной реакции (п, а) // Цветные металлы, 1965. С. 6.

92. Плотникова Н.В., Николаева Ю.Г., Фролов В.А., Лапшин В.Б., Сыроешкин

93. A.В. К вопросу о корпускулярном облучении человека на больших высотах. // Научные труды VII научно-практической международной конференции «Здоровье и образование в XXI веке». М., 2006. С. 397.

94. Плотникова Н.В., Смирнов А.Н., Колесников М.В., Семёнов Д.С., Фролов

95. B.А., Лапшин В.Б., Сыроешкин А.В. Аномальные изменения плотности потока тепловых нейтронов в биоценозах у поверхности земли // Бюл. экспер. биол. мед., 2007. Т. 143. №> 4. С. 394-497.

96. Постхумус А.С. Мониторинг состояния и воздействия загрязнения атмосферы // Загрязнение воздуха и жизнь растений, Л.: Гидрометеоиздат, 1988. С. 98-125.

97. Пучков Е.О., Говорунов И.Г., Евтодиенко Ю.В., Косарев Н.В. Действие шока, вызванного низкой температурой, и внеклеточного образования льда на внешнюю и цитоплазматическую мембраны E.coli К-12 // Микробиология, 1983. Т. 52. № 1. С. 136-139.

98. Пучков Е.О., Пинчукова В.А. Фазовое состояние липидов и повреждающее действие замораживания-оттаивания на мембраны E.coli II Биосинтез и метаболизм липидов. М., 1979. С. 164-167.

99. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Теория и практика криогенного и сублимационного консервирования. Киев: Наук, думка, 1984. С. 263.

100. Рапли Дж., Янг П., Толлин Т. Исследование термодинамических и других параметров взаимодействия воды с белками // Вода в полимерах / Пер. с англ. М.: Мир, 1984. С. 114-136.

101. Рафалес-Ламарка Э.Б., Николаев В.Г. Некоторые методы планирования и математического анализа биологических экспериментов. Киев: Наук, думка, 1971. С. 120.

102. Руднева И.И. Артемия. Перспективы использования в народном хозяйстве. Киев, 1991. С. 314.

103. Сизов А.Д. Возможная связь «аномальных» сигналов в мостике Уитсона с положением планет// Биофизика. 2001. Вып. 5. С. 811-815.

104. Спектрова Л.В. Живые корма для рыб и беспозвоночных: Автореф. канд. биол. наук, М., 1990. С. 6.

105. Студеникина Т.Л. Биологические особенности рачка Artemia salina (L.) соленых озер юга Западной Сибири: Автореф. канд. биол. Наук / АН СССР, Сиб. отд-ние, Биол. ин-т. Новосибирск, 1986. С. 9-16.

106. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. Биология в 3-х т. / Мир, 2004. Т. 3. С. 436.

107. I.e. Ванин А.Ф. Налбандян Р.М. Свободные радикалы нового типа в дрожжевых клетках // Биофизика. 1966. Т. 10. С. 167.

108. Троицкий О.А., Баранов Ю.В., Демин В.А. Внешние электронное и электростатическое воздействия на материалы. Упрочнение и разупрочнение, изменение структуры и хрупкости под влиянием облучения и полей. М.: МГИУ, 2002. С.274.

109. Утевский A.M. Авторегуляция биологической системы на температурной шкале // Криобиология и криомедицина. 1977. № 3. С. 9-11.

110. Фаррар Т., Беккер-Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР / Пер. с англ.1. М.: Мир, 1973. С. 164.

111. Фролов А.В. Выживаемость, скорость роста и состав липидов ARTEMIA SALINA при различных условиях культивирования: Автореф. канд. биол. наукМ., 1988. С. 16-20.

112. Фролов Е.Н., Белоногова О.В., Лихтенштейн Г.И. Исследование подвижности спиновых и мессбауэровских меток, связанных с макромолекулами // Равновесная динамика нативной структуры белка. Пущено: ИБФ АН СССР, 1977. С. 99-142.

113. Хайлов К.М. Принципы системного исследования и конкретная биология,// Системные исследования: Ежегодник. 1979. М.: Наука, 1980. С. 128-139.

114. Хаустов В.Н. Эффективность использования диапаузирующих яиц артемии разного качества при производстве товарных яиц // Вестник алтайской науки: Проблемы агропромышленного комплекса. Барнаул, 2001. Вып. 1. Т. 2. С. 35-36.

115. Шварц К., Гольдфарб Т. Поиск закономерностей в физическом мире / Пер. с англ. под ред. Л.Л. Декабрунд. М.: Мир, 1977. С. 357.

116. Шкорбатов Г.Л. К построению общей теории адаптации // Журн. общ. Биологии, 1982. Т. 43. № 6. С. 775-787.

117. Шмидг П.Ю. Анабиоз. М.: Изд-во АН СССР, 1955. С. 436.

118. Шноль С.Э. Макроскопические флуктуации формы дискретных величин как следствие арифметических и космофизических причин // Биофизика, 2001. Вып. 5. С. 775-782.

119. Эшби У.Р. Введение в кибернетику / Пер. с апгл. под ред. В.А. Успенского. М.: И.Л., 1959. С. 432.

120. Aksyonov S.I. Water as a regulator in biological systems // Studia Biophys., 1981. V. 84. N 1. P. 37-38. Microfiche 1/1-6.

121. Aksyonov S.I., Goryachev S.N., Faleeva M.V., Nikitina T.N. On the origin of slow components of NMR spin-echo decay in dried yeast and their correlation with yeast resistance to drying // Studia Biophys., 1976. V. 58. P. 121-129.

122. Anderson D.T. Embryology and phylogeny in Annelida and Arthropoda // Oxford, Pergamon Press, 1973.

123. Blears D.J., Danyluk S.S. Proton wide-line NMR spectra of hydrated proteins // Biochim. Biophys. Acta., 1968. V. 154. N 1. P. 17-27.

124. Bossuyt E., Sorgeloos P. Technological aspects of the bath culturing of Artemia in high densities. The brine shrimp Artemia. V. 3. Ecology, culturing, use in aquaculture, 1960. P. 456.

125. Bruggerman E., Sorgeloos P. Improvementin the decapsulation Technique of Artemia cyst// Internat. Symp. On the Brine shcrimp Artemia Salina / Corpus Christy, Texas, USA, 1979. P. 479.

126. Calcott P.H., MacLeod R.A. Protection of E. coli from slow freezing by new class of crioprotectants: Ionophores // Crioletters, 1981. V. 2. N 1. P. 48-53.

127. Calcott P.H., MacLeod R.A. Protection of E. coli from slow freezing by new class of crioprotectants: Ionophores // Crioletters, 1981. V. 2. N 1. P. 48-53.

128. Dwidedi S.N., Ansari S.K.R., Ahmed M.M. Mass culture of brine shrimp under controlled conditions in cement pools at Bombay, India. In: The brine shrimp Artemia. V. II. Ecology, culturing, use in aquaculture. Wetteren, Belgium, 1980. P. 175-183.

129. Dyatlov S. Comparison of Ukrainian standard methods and new microbiotests for water toxicity screening and Biomonitoring \\ Edited by Guido Persoone, Colin Janssen and Wim de Coen / Amsterdam: Kluwer Academic Pablishers, 2000. P. 229-232.

130. Folch J., Lees M.,Stanley G.H.S. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem., 1957. V. 226. № 1. P. 497.

131. Gaubin Y., Pianezzi В., Planel H. Radiation-induced in late effects and in development capacities of exposed Artemia cysts // Mechanisms of Ageing and

132. Development, 1985. V. 32. N 1. P. 21-32.

133. Goh N. K., Chou L. M. Bioactivity Screening of Singapore Gorgonians: Antimicrobial Actiivity, Toxicity To Artemia salina, and Efficacy Against Plasmodium berhei. Zoological Science, 1998. 15: 805 812.

134. Hand A.S., Gnaiger E. Anaerobic dormancy quantified in Artemia embryos: a calorimetric test of the control mechanism. Science 239, 1425-1427.141.'Jardetzky O., Roberts G.C.K. NMR in molecular biology. New York: Acad. Press, 1981. P. 16.

135. Johnson D.A, Evaluation of various diets for optimal growth and survival of selected life stage of Artemia. In: The brine shrimp Artemia. V. 3. Ecology, culturing, use in aquaculture. Wetteren, Belgium74 Universe Press, 1960. P. 456.

136. Kauzmann W., Moore K, Schulz D. Protein densities from X-ray crystallography coordinates //Nature, 1974. V. 248. N 5447. P. 447-449.

137. Keshavarz E., Nakai S. The relationship between hydrophobicity and interfacial tension of proteins // Biochim. Biophys. Acta., 1979. V. 576. N 2. P. 269-279.

138. Kim J.K., Wilson M.J., Yanch J.C. Design of a californium-based epithermal neutron beam for neutron capture therapy // Phys. Med. Biol., 1993. V. 38. N 8. P. 1145-1155.

139. Koga S.H., Chigo A., Nunomura K. Physical properties of cell water impartially dried Saccharomyces cerevisiae // J. Biophys., 1966. V. 6. N 5. P. 665-674.

140. Kuntz I.D., Kauzmann W. Hydration of proteins and polypeptides // Adv. Protein Chem., 1974. V. 28. P. 239-345.

141. Linderstrdm-Lang K, Schellman J.A. Protein structure and enzyme activity // Enzymes. 2nd ed. New York: Acad. Press, 1959. V. 1. P. 443-510.

142. Mazur P. Cryobiology: The freezing of biological systems // Science, 1970. V. 168. N3934. P. 939-949.

143. Muzzarelli R.A.A. Chelating, firm-forming and coagulating ability of thechitosan-glucan complex from Aspirigilis niger industrial wastes // Biolug. and

144. BiotechnoL, 1980. V. 22. N 4. P. 885-896.

145. Palmer J.D. Organizmie spatial orientation in very weak magnetic field // Nature, 1963. V. 198. № 4885. P. 1061-1062.

146. Pat. USP № 4446025. Method of and apparatus for pre-treating make-up water contaminated with nutrients/ Assaf; Gad (Rehovot, ILV Cohen; Yehuda (Elat, EL). May 1, 1984.

147. Pat. USP № 4593647. Method and device of producing artemia offspring/Sorgeloos Patrick P (BE); Verslchele Danny H (BE); Leger Philippe P J M (BE); Lavens Patrick A (BE), 1986-06-10.

148. Pat. USP № 5958406 Crustacean and fish derived multifunctional enzyme / de Faire; Johan R. (VaUhotma, SE); Franklin; Richard L. (London, GB); Kay; John (Cardiff, GB); Lindblom; Ragnvald (Muang Rayong, TH), Aug. 31, 1999.

149. Pat. WO № 0027218. Composite, paniculate feed for fry or for larvae of other marine organisms and method of manufacturing the starting feed / Wathne Einar (NO), Homme Jan Morten (NO), 2000-05-18.

150. Perniyakov E.A., Burstein E.A. Relaxation processes in frozen aqueous solutions of proteins: Temperature-dependencc' of fluorescence parameters // Studia Biophys., 1975. V. 51. N 2. P. 91-103.

151. Rafiee P., Matthews C.O., Bagshaw J.C, Macrae Т.Н. Reversible arrest of Artemia development by cadmium // Can. J. Zool., 1986. V. 64. N 8. P. 1630-1642.

152. Santos C., Sorgeloos P. Succesful inoculation of Artemia and production of cysts in man-made salterns in the Philippines. In: The brine shrimp Artemia. V. 3. Ecology, culturing, use in aquaculture. Vettcren, Belgium: Universe Press, 1980. P. 456.

153. Steel KG., Ross A.E. Survival of frecze-dried bacterial cultures // J. Appl. Bacterid., 1963. V. 26. N 3. P. 370-375.

154. Sussman M.V., Chin L. Nuclear magnetic resonance' spectrum changes accompanying Rigor mortis // Nature, 1966. V. 211. P. 414-415.

155. Vanhaecke P., Sorgeloos P. International study on Artemia. XIX. Hatching data for re-evaluation of the "hatching efficiency" // Aquaculture., 1962. V. 30. P. 4352.

156. Vos J., Leger P., Vanhaecke P., Sorgeloos P. Quality evaluation of brine shrimp solt ponds // Hydrobiologia. 1984. V. 108 № 1.

157. Watanabe Т., Kitjima C., Fujita S. Nutritional values of live organisms used in Japan for mass propagation of fish: a review // Aquaculture, 1983. V. 34. P. 115143.