автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.18, диссертация на тему:Исследование механических свойств белковых комплексов

На правах рукописи (

Кононова Ольга Геннадиевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ

Специальность 05.13.18 — математическое моделирование, численные методы и комплексы программ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

3 О СЕН 2015

Москва - 2015

005562843

Работа выполнена на кафедре вычислительной математики Московского физико-технического института (государственного университета)

Научный руководитель: Холодов Ярослав Александрович,

кандидат физико-математических наук

Оффициальные оппоненты: Ризниченко Галина Юрьевна,

доктор физико-математических наук, профессор

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет, заведующий сектором информатики и биофизики сложных систем

Гудимчук Никита Борисович, кандидат физико-математических наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, лаборатория физиологии и биофизики клетки, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М. М.

Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Защита состоится «22» октября 2015 г. в 11 час. на заседании диссертационного совета Д 212.156.05 на базе Московского физико-технического института (государственного университета) по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, ауд. 903 КПМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ и на сайте университета http://www.mipt.ru.

Автореферат разослан «14» сентября 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.156.05

Федько Ольга Сергеевна

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

Большие белковые супрамолекулярные комплексы обладают уникальными способостями самостоятельно собираться, разбираться, изменять свою форму и выполнять самостоятельное восстанавление под влиянием контролиру-емного механизма. Эти особенности играют фундаментальную роль в биологии и детальное изучение таких биомолекулярных систем позволяет решить ряд прикладных задач в области биофизических наук.

Одним из наиболее ярких примеров комплексных биомолекулярных структур являются вирусы. Вирусы представляют собой биологические инфицирующие нанострукутуры, которые состоят из нуклеиновой кислоты, упакованной внутри белковой оболочки — катгсида. Биомедицинское значение вирусов как инфицирующих агентов очень велико. Они могут найти применение во многих сферах. Действительно, их наноразмеры, умение самостоятельно собираться, а также возможность изменять свои свойства на генетическом уровне, делают вирусные капсиды привлекательным материалом для биотехнологического использования. Например, в наномедицине их можно использовать в качестве переносчиков генетического материала, а также в качестве биотехнологических и индустриальных биореакторов уникальных наномет-ровых размеров. В связи с этим, изучение динамических, энергетических и биомеханических свойств вирусов и вирусоподобных частиц имеет огромное практическое значение.

Другой пример биомолекуляриых ассамблей — это полимеры микротрубочек (МТ), которые являются главными стержневыми компонентами и важными структурами, определяющими архитектуру клетки, ее полярность и движение хромосом в процессе деления клетки. МТ стабилизируются посредством продольных и поперечных связей между своими субъединицами — тубулинами. Динамика МТ, а именно, их способность подвергаться случайному циклу полимеризации и деполимеризации, играет видную роль во многих клеточных процессах. Тем не менее, до сих пор недостаточно изучена термодинамика поперечных и продольных связей и физические свойства продольных рядов тубулинов, называемых протофиламентами МТ.

Одним из экспериментальных способов изучения больших белковых комплексов, является их наноиндентирование методом атомно-силовой микроскопии (АСМ; англ. Atomic Force Microscopy, AFM). Несмотря на то, что эта технология обладает достаточно высоким уровнем разрешения, она при этом имеет некоторые недостатки: 1) невозможно определить точное положение молекулы, которая подвергается наноиндентированию; 2) отсутствует четкое

изображение объекта после деформации зондом АСМ; 3) в результате этого невозможно определить энергетические характеристики, относящиейся к конкретным событиям в процессе наноиндентирования.

В данной диссертации предлагается многоуровневый подход моделирования, который мы назвали "наноиндентирование in silico". Данный метод позволяет исследовать биомеханику биомолекулярных частиц на компьютере. Метод совмещает в себе моделирование молекулярной динамики (МД) атомарной структур биомолекулярных частиц, а также моделирование динамики Ланжевена их крупнозернистых моделей на основе нативной топологии. Этот уникальный "эксперимент" in silico предоставляет детальное отображение всего процесса деформации биомолекулы путем силового сдавливания, которое можно сравнивать с результатами АСМ эксперимента и использовать в качестве дополнения к ним. Такое моделирование можно применять для углубленного изучения процессов возникновения механической "усталости" в белковых ассамблеях и их структурных коллапсов, которые сложно объяснить с помощью современных экспериментальных методов.

В данной диссертации показывается применение указанного подхода наноиндентирования in silico на примере исследования биомеханических свойств вирусного капсида Cowpea Chlorotic Mottle virus (CCMV) и полимера микротрубочки (МТ). По результатам этого эксперимента была разработана аналитическая модель, способная качественно интерпретировать спектральные линии силы-деформации, получаемые с помощью экспериментов по АСМ. Эта теория связывает наклон, критическую силу, критическую деформацию FX кривых с физическими характеристиками структуры, геометрией и общей формой частицы и индентора. Полученная модель была успешно опробованная на лабораторных данных, полученных для разных вирусных частиц.

Цели и задачи работы

Целью данной работы является а) разработка вычислительной методологии, позволяющей исследовать механические свойства больших белковых ассамблей, и Ь) ее применение к исследованию биофизических свойств вирусных капсидов и полимеров микротрубочек; а также для с) создания аналитической модели деформации больших белковых систем для интерпретации результатов экспериментов по силовой спектроскопии.

Задачи работы:

1. Разработка численного подхода наноинденирования in silico, основанного на многоуровневом молекулярном моделировании, который будет являться компьтерным аналогом эксперимента по атомно-силовой микро-

скопии. Данный подход будет являться дополнением к существующему пакету SOP-GPU, использующего ускорение графических процессоров для выполнения моделирования больших белковых структур.

2. Применение разработанной методологии для проведения эксперимента по in silico наноиндентированию вирусного капсида CCMV, сравнение полученных результатов с экспериментальными данными.

3. На основе результатов, полученных в ходе численного эксперимента по наноиндентированию капсида CCMV и согласованных с экспериментальными данными, сделать детальное описание биомеханики вирусного капсида, подверженного внешней силовой нагрузке, а также определить структурные и термодинамические характеристики данного процесса, которые невозможно получить из эксперимента in vitro.

4. Применить методологию многоуровневого моделирования и наноинден-тирования in silico к полимеру МТ и для деформации одного протофи-ламента МТ разной длины. Полученные результаты сравнить с ранее опубликованными данными.

5. Результаты, полученные из эксперимента по численному моделированию силового наноиндентирования полимера МТ и деформации прото-филамента, изпользовать для разрешения структурных переходов, возникающих в МТ под воздействием внешней механической силы, а также для определения термодинамических характеристик тубулиновых интерфейсов в МТ и жесткости при изгибе одного протофиламента.

6. Использовать результаты силового наноиндентирования in silico для проведения детального структурного анализа капсида CCMV и полимера МТ, подверженных внешнему механическому воздействию, чтобы определить основные степени свободы, которые вносят вклад в динамику деформации белковых ассамблей с регулярной геометрией. Разработать теоретическую модель для описания обнаруженных степеней свободы.

7. Основываясь на проведенном анализе, разработать и реализовать аналитическую модель, способную описывать механический ответ системы на внешнюю сдавливающую деформацию, а также определять наиболее важные механические характеристики биомолекул и предсказывать предел их прочности.

8. Разработанную модель применить для описания спектров силы-деформации для различных вирусных капсидов, полученных в лаборатории. Определить механических характеристики этих систем, сравнить с опубликованными ранее результатами.

Научная новизна

Новые современные эксперименты позволяют широко исследовать уникальные физические свойства разнообразных биологических ассамблей. Несмотря на это, из-за сложности организации и больших размеров этих систем, эти эксперименты предоставили большое количество данных, которые почти невозможно корректно интерпретировать без какой-либо начальной информации о ландшафтах энергии. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали новый подход наноиндентирования гп зШсо, который совмещает многомасштабное моделирование (полноатомное моделирование молекулярной динамики и крупнозернистое моделирование динамики Ланжевена) и высокопроизводительные вычисления (ускоренные на графических процессорах) , чтобы исследовать физико-химические свойства и биомеханику больших биомолекулярных ассамблей. В отличие от предыдущих попыток моделирования, которые были основаны на удобных вычислительных методах, мы сможем провести моделирования больших биологических систем, состоящих из ~104—105 аминокислот, на экспериментальной шкале времени 30—60 мс.

Таким образом, данная методология наноиндентирования т вШсо дает нам возможность генерировать теоретически полный спектр силы-смещения, который содержит всю информацию о механических свойствах рассматриваемой системы. Ни один из существующих методов не обладает такой возможностью. Сравнение экспериментов и моделирования позволяет впервые соотнести динамические структурные особенности вирусного капсида/МТ в режиме их переходов в состояние коллапса с их биомеханикой на нанометро-вой шкале, а также разрешить механические и термодинамические характеристики этих структур, которые были недоступны ранее.

Теооретическая и практическая значимость работы

Вирусные капсиды имеют потенциальное применение во многих сферах. В наномедицине они могут служить в качестве поставщиков генов или медикаментов, а также играть роль наноразмерных биореакторов в биотехнологиях. Поэтому понимание детальной динамики, энергетики и биомеханических свойств вируснах частиц представляет большой научный интерес и поможет

сформулировать основные концепции рационального дизайна и проектирования нанореакторов и нанокомпартментов на основе различных белковых оболочек.

Сложность структуры МТ препятствует использованию традиционных кинетических и термодинамических экспериментальных подходов для непосредственного измерения ландшафтов свободной энергии связей между их составными компонентами тубулинами. Форма профилей энергий и даже геометрия и количество участков связывания в моделях МТ до сих пор являются спорными. Физические свойства индивидуальных тубулиновых протофила-ментов также не были до сих пор определены. Величину изгибной жесткости протофиламента важно знать потому, что эти значения имеют непосредственное применение в механизме генерации силы в процессе деполимеризации МТ. Углубленное биофизическое понимание этих биологических функций было затрудненно ввиду отсутствия точной качественной информации о прочности взаимодействий между тубулинами и жесткости при изгибе протофиламента МТ.

Результаты, полученные с помощью моделирования процесса наноинден-тирования для систем вирусного капсида и МТ будут применены для разработки аналитически простой физической модели, которая позволит описывать деформацию, уплощение (прогиб) и переход в состояние структурного коллапса в биологических частицах, обладающих регулярной геометрией. На данный момент существует большое количество экспериментальных спектров силы-деформации для различных систем, которые требуют смысловой интерпретации. При этом не существует моделей, способных полноценно описывать эти результаты, что ограничивает количество информации, которую можно получить из экспериментальных и теоретических спектральных кривых. Модель, которую мы разработали, позволяет связать наблюдаемые (макроскопические) величины с микроскопическими структурными и геометрическими характеристиками. Эта модель также позволяет исследователям описывать форму спектров силы-деформации, полученных из экспериментов по силовой спектроскопии на отдельных биологических частицах.

Методология и методы исследования

Для решения поставленных задач использовалась методология математического и численного моделирования. Вычислительные эксперименты проводились с применением высокопроизводительных вычислений, а анализ их результатов — при помощи методов механики сплошных сред и математической статистики.

Положения, выносимые на защиту

Положения, выносимые на защиту, отражены в основных результатах работы, приведенных в конце автореферата.

Соответствие паспорту специальности 05.13.18

Работа содержит все необходимые компоненты специальности 05.13.18 — математическое моделирование, численные методы и комплексы програм:

1. Математическое моделирование: Разработана аналитическая физическая модель деформации сферической белковой оболочки под действием внешней механической силы.

2. Численные методы: Разработаны численные процедуры расчета движения сферического индентора и его взаимодействия с биомолекулой с использованием гибридной архитектуры (центральных процессоров + графических сопроцессоров).

3. Комплексы программ: Разработаны новые вычислительные модули для расчета механических характеристик белковых оболочек, которые используются в пакете программ SOP-GPU.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертации опубликованы в 8 работах, из которых 6 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ [1, 3, 4, б, 7, 8], были доложены, обсуждены и получили одобрение специалистов на следующих научных конференциях:

1. Научная конференция Московского физико-технического института — Всероссийская молодёжная научная конференция с международным участием "Проблемы фундаментальных и прикладных, естественных и технических наук в современном информационном обществе" (МФТИ, Долгопрудный, 2011);

2. International Workshop "Computational and Theoretical Modeling of Biomo-lecular Interactions" (Dubna, Russia, 2013);

3. Albany 2015: The 19th Conversation (University at Albany SUNY, Albany, NY, USA, 2015);

Основное содержание диссертации

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения и списка литературы. Общий объем диссертации составляет 109 страниц. Список литературы содержит 110 наименований.

Во Введении приведены актуальность и степень проработанности темы исследования, цели и задачи диссертации, научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы, методология и методы исследования, степень достоверности и апробация результатов.

Глава 1

Содержит краткий обзор рассматриваемых в работе биомолекулярных систем: вирусного капсида Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV) и полимера микротрубочки (МТ). Описываются их роль в биологическом мире, основные физико-химические свойства, а также наиболее важные и потенциальные вопросы, связанные с изучением и пониманием этих систем.

Глава 2

Обзор существующих вычислительных методов для описания механики биомолекул. В частности, приведены примеры использования метода конечных элементов, анализа нормальных мод и полноатомного моделирования молекулярной динамики вируса. Также описаны существующие методы на основе крупно-зернистых моделей, которые использовались для расчета механического воздействия на вирусные капсиды и МТ. Несмотря на то, что эти методы представляют большой прогресс в изучении биомеханики белковых ассамблей, они не дают полной информации о динамики деформации системы под воздействием внешней силы.

Глава 3

Дается представление о том, что такое многоуровневое моделирование биомолекул. Здесь обосновывается использования крупнозернистого моделирования для описания биологических ассамблей, а также представлены модель Самоорганизующегося Полимера (модель СОП) для описания полипептидной цепи.

Модель СОП основана на нативной топологии, в ней каждый аминокислотный остаток представлен единственным центром взаимодействия, который описывается соответствующим Са-атомом. Белковая структура всей молекулы представлена набором Са-Са ковалентных связей длиной а=3.8 А (длина пептидной связи). Функция потенциальной энергии конформации белка Usop определена в терминах координат положения частиц {r¿}=ri, Г2,..., глг, где N — количество аминокислотных остатков, и задается формулой

Usop = Ufene + UfiW + U$bp (1)

В Ур. 1 первое слагаемое — это конечно-растяжимый нелинейный эластичный потенциал (англ. Finitely Extensible Nonlinear Elastic, FENE), который

имеет вид UFene=-щ1 (l ~ (r>'"l"1^ii,i+l) ). Для того чтобы учесть нековалентные взаимодействия, которые стабилизируют начальную структуру в свернутом состоянии (нативные контакты), используется потенциал

Леннарда-Джонса UnJ¡T£h - 2 | А у (англ. Lennard-

Jones potential). Ненативные взаимодействия в потенциале рассматриваются

как отталкивающие С$|р=££Й+2^ fe)^ Е^+'+з^ (%)* С1 " ¿О')-Здесь дополнительное ограничение наложено на все угловые связи, образованные аминокислотными остатками i, i + 1, г + 2 путем включения отталкивающего потенциала с параметрами ег=1.0 ккал/моль и оу=3.8 А. Эти параметры определяют силу и диапазон отталкивания. Параметр e¡t в модели СОП задает величину энергии взаимодействия пары нативных контактов. Этот параметр оценивается на основе результатов полноатомного МД моделирования вирусной частицы в равновесии. Примеры этой оценки для вирусного капсида и полимера МТ также приведены в этом разделе.

Динамика системы расчитывается путем численного пропагирования вперед по времени уравнения движения Ланжевена для каждой частицы с координатами г i в задемпфированном пределе (броуновский предел):

dn дЩгг)

= +9i{t) (2)

В Ур. 2 £/j(r¿) - это полная потенциальная энергия, которая рассматривает все биомолекулярные взаимодействия (Usop), а также взаимодействия частицы с индентирующим объектом — сферическим зондом (Uíip, см. Ур. 3). Кроме того, в Ур. 2 g¿(í) является случайной силой, имеющей нормальное распределение со средним значением в нуле, которая определяет температуру

водной среды вокруг молекулы.

Данная модель была реализована для вычисления на графических процессорах и легла в основу программного пакета БОР-СРи. также представленного в данном разделе.

Глава 4

Описание метода динамической силовой спектроскопии, который используется для измерения механической реакции биомолекулы в ответ на внешнее напряжение. Также представлено полное описание вычислительной процедуры наноиндентирования гп зИгсо. Схематическое изображение этого подхода представлено на Рис. 1.

Рис. 1: Сильно идеализированная схема установки, используемой в динамических силовых экспериментах in vitro и in silico.

В in silico экспериментах по измерению динамической силы, кантилевер представляется виртуальным сферическим шариком, привязанным с помощью гармонической пружины к сферическому шарику радиуса Rup, имити-рующиему зонд кантилевера (Рис. 1). Взаимодействие зонда с биологической частицей описывается потенциалом Леннарда-Джонса:

зонд кантилевера

Z

подложка

(3)

производя, таким образом, индентирование внешней поверхности частицы. В

Ур. 3 Гх и г^р - координаты г-ого шарика (Са-атома) биологической частицы и центра зонда, соответственно; еир = 4.18 ккал/моль и аЫр = 1.0 А— параметры взаимодействия, а суммирование выполняется по всем частицам, взаимодействующих с зондом или другим индентирующим объектом.

Для зонда кантилевера (сфера на Рис. 1), численно решается следующее уравнение движения Ланжевена:

<1тцр диир\гир) ,, о .л \ /л\

= —+ к((г- ^ -г(4)

В Ур. 4 - это начальное положение центра сферического зонда (г/у - это скорость движения базы кантилевера; к - жесткость пружины кантилевера), и коэффициент вязкости 7 соответствует вязкости 77=7.0 х 106 пН пс/нм. Чтобы сгенерировать динамику рассматриваемой биологической частицы, подверженной механическому воздействию, мы решаем Ур. 1-2 для частицы и Ур. 3-4 для индентирующего объекта (сферического зонда).

Двигаясь с постоянной скоростью (г//), база кантилевера (виртуальная частица на Рис. 1) через свой зонд создает линейно зависимую от времени силу {(Ь)=/(£)п в направлении п, перпендикулярном внешней поверхности биологической частицы. Эта сила вызывает механическую нагрузку на частицу. В результате этого, величина силы /(¿)=гу£, сдавливающей частицу, увеличивается прямо пропорционально времени £ со скоростью г у = кг/у. При моделировании прямого индентирования, база кантилевера (и сферической зонд) смещаются в направлении биологической частицы; при моделировании релаксации при уменьшении прилагаемой силы направление движения базы кантилевера (зонда) меняется на противоположное, что влечет за собой уменьшение величины сдавливающей силы до нуля.

Глава 5

Применение подхода наноиндентирования гп ¡Шсо для моделирования силового воздействия на вирусный капсид ССМУ в разных точках симметрии капсида. Полученные спектры силы сравниваются с имеющимися экспериментальными данными, предоставленные нам лабораторией проф. Хайста Дж. Л. Вауте (Бг. вцэ Л. Ь. \Vuite) и проф. Ваутера X. Рооса (Бг. \Vouter Н. Нооб) из Университета Амстердама в Голландии (см. Таблицу 1). Используется анализ нормальных мод и метод главных компонент для того, чтобы описать структурные изменения оболочки в равновесии и вдали от равновесия в процессе индентирования. На основе проведенных численных экспериментов были сделаны следующие выводы:

Таблица 1: Механические свойства капсида CCMV, полученные путем индентирования in vitro и in silico: Средние значения коэффициента жесткости ксар, критической силы F', и критического смещения зонда кантилевера Z*, расчитанные для всех FZ кривых (все типы симметрии).

Индентирование kCap у Н/м F', нН Z*, нм

in vitro 0.17±0.01 0.71±0.08 21.0±3.6

in silico 0.11±0.01 0.77±0.03 24.7±2Л

1. Физические свойства белковой оболочки являются динамическими, но при этом локальными характеристиками структуры, так как механическая реакция капсида зависит не только от точки приложения зонда, но также от глубины индентирования (см. Таблицу 2).

2. Механические характеристики капсида, а именно его критическая сила сдавливания и критическое смещение базы кантилевера, почти не зависят от того, как быстро меняется внешняя сдавливающая сила, но зависят от геометрии механического воздействия, так как механический ответ системы меняется в зависимости от размеров зонда кантилевера.

3. Степень обратимости механических деформаций в белковой оболочке напрямую зависит от глубины индентирования. Динамические свойства, такие как обратимость и необратимость индентирования, могут быть сопоставлены с механическими характеристиками, такими как упругие и неупругие деформации.

4. В упругом режиме деформации преобладают смещения перепендику-лярные поверхности оболочки по сравнению с равновестными смещениями капсомеров, но в режиме близком к переходу в состояние коллапса эти движения взаимосвязаны и происходят одновременно с движениями вдоль поверхности оболочки.

5. Изменения энтропии и энтальпии одновременно вносят вклад в увеличение прочности капсида, в то время как его подцатливость и переход в состояние коллапса сопровождаются, в основном, изменением только в энтальпии (см. Таблицу 2).

Данные результаты помогли значительно продвинуться-в понимании физических свойств капсида ССМУ, обнаружить множество динамичных мод, которые приводят к упрочнению или поддатливости системы, охарактеризовать (не)обратимые деформации вириона и описать роль неравновесных коллективных мод смещений капсомеров и их связь с термодинамическими функци-

Таблица 2: Механические и термодинамические свойства капсида ССМУ, полученные из индентирования гп вШсо, выполненного вдоль осей симметрии 2-ого, 3-его и 5-ого порядков: Критическое значение силы глубина индентирования X*, коэффициент жесткости ксар и термодинамические функции: свободная энергия Гиббса АСгп4, изменение энтальпии АНгпг1, изменение ЭНТРОПИИ ТАБгпЛ-

Симметрия F", нН X", нм fccap» Н/м AGi„d, МДж/моль AHind, МДж/моль TASinc¡, МДж/моль

2-ого порядка 0.71±0.02 9.1±1.0 0.11 4.5 11.5 7.0

3-его порядка 0.68±0.02 11.9±0.5 0.10 5.1 11.7 6.6

5-ого порядка 0.69±0.02 14.2±0.5 0.12 4.1 12.5 8.4

Таблица 3: Сравнение механических свойств решетки МТ, определенные с помощью наноиндентирования гп ьНго и гп вШсо: константа упругости МТ - Кмт, значение критической силы индентирования - Р" и критического смещения базы кантилевера - 2*.

Индентирование Кмт, пН/нм F*, нН Z*, нм

in silico (Rtip=15 нм) 51.8±2.8 0.62±0.07 23.8±2.2

in silico (üt¿p=10 нм) 61.4±6.6 0.76±0.04 26.9±1.3

in vitro (Rtip= 20 нм) 74.0±13.0 0.40±0.10 17.2±3.5

ями. Так как эти свойства, скорее всего, могут быть расширены на широкий класс различных вирионов, данные результаты представляют значение для понимания наномеханики других белковых оболочек.

Глава 6

Описывается изучение биомеханических и физико-химических свойств МТ с помощью методологии наноиндентирования in silico. Для фрагмента полимера МТ длиной 8 димеров тубулинов было проведено индентирование в семи разных точках на поверхности решетки, используя радиус зонда кантилевера RtiP=Ю и 15 нм. Полученные результаты хорошо сравниваются с имеющимися экспериментальными аналогами, опубликованными де Пабло и др. (de Pablo et al., Phys. Rev. Lett. 91, 2003) и Шаапом и др. (Schaap et al., Biophys. J. 91, 2006) (см. Таблицу 3)

Во-первых, в результате данного исследования были определены структурные переходы в полимере МТ, а также механизм деформации и коллапса МТ под действием внешней сдавливающей силы (Рис. 2). Было показно,

что сдавленная МТ ведет себя как система твердых элементов, соединенных сетью поперечных и продольных упругих связей. В условиях небольших деформаций цилиндр МТ упруго отвечает на внешнее воздействие, подвергаясь непрерывным деформациям. Однако, после сжатия на 6—8 нм димеры а/3-тубулинов прогибаются, что вызывает уплощение цилиндра МТ. Дальнейшее сжатие вызывает диссоциацию поперечных контактов между соседними протофиламентами, которое затем сменяется разрывом продольных связей между димерами, но не внутри димеров (Рис. 2).

0.6

0.2

0 3 6 9 12 15

Деформация X, нм

Рис. 2: Суммарное представление механизма деформации МТ.

Во-вторых, на основе результатов наноиндентирования гп вгЫсо были расчи-таны свободные энергии диссоциации поперечных и продольных межтубули-новых связей, балланс между прочностью которых играет критическую роль в динамическом поведении МТ. Энергии поперечных и продольных связей ДС;^ и ДСгопд, соответственно, составляют 6.9±0.4 ккал/моль и 14.9±1.5 ккал/моль на интерфейс. Эти оценки согласуются с результатами проведенного структурного анализа, который показывает, что 1) поперечные интерфейсы а-а и /3-/3 образуются с помощью 11 и 14 гидрофобных и электростатических связей, соответственно; и) продольные связи между димерами и внутри димера стабилизируются с помощью 38 и 26 гидрофобных и электростатических связей, соответственно. Разница между двумя значениями энер-

Переходныи режим (дискретные структурные изменения)

разрыв поперечных

разрыв продольных

Линейный режим (упругая деформация)

гий ДД(?=ДС;опэ—ДС;а(=8.0 ккал/моль близка к значению 11 квТ, которое было получено ранее.

В данном разделе также описывается моделирования изгибающей деформации одного протофиламента МТ разной длины (8, 16, 24, 32 димера тубули-нов). На основе результатов этого моделирования была расчитала жесткость при изгибе для одного протофиламента, которая составляет 18,000-26,000 пН-нм2 и показывает, что протофиламенты тубулинов достаточно жесткие. Все вместе эти результаты имеют важную связь с определением механизма генерации силы МТ.

Глава 7

Проводится детальный анализ результатов силового индентирования т яШсо капсида ССМУ и предлагается аналитическая модель Флуктуирующих Нелинейных Пружин (ФНП) для описания экспериментальных спектров, полученных с помощью динамической силовой спектроскопии. Анализ показал, что существует как минимум два типа возбуждений, определяющих силовую деформацию и коллапс биологических ассамблей: (1) локальное изменение кривизны в небольшой контактной области, образованной индентирующим объектом и биологической частицей, и (2) изгиб большей части структуры биологической частицы, котороая напрямую не контактирует с индентором (см. Рис. 3).

Для того чтобы описать вклад в силу деформации Р(хн,хь) в результате локального изменения кривизны Рн{хн) вследствие механического взаимодействия двух сферических объектов (Рис. 3), использовалась модель Герца, согласно которой

' НрагЩгр/{Краг + Пир) ' Х^2 (5)

где 11раг и Кцр — радиусы частицы и пндентора, соответственно, и Бн — постоянный коэффициент, который равен И н=0.7Ъ{{1-а2н) / Ен+{1-а%р) / Еир), где Ец и Ецр — модули Юнга и а н и ацр — коэффициенты Пуассона частицы и зонда, соответственно. Так как Еир^>Ен, Ду=0.75((1 - а2н)/Ен).

Чтобы описать вклад в силу деформации Е(хн, хь) от изгиба Рь(хь), боковая сторона частицы была разделена на вертикальные искривленные структурные элементы, расположеные параллельно (Рис. 3(с1)). Так как хь мало (Рис. 3), то потенциальную энергию одного элемента можно расчитать с помощью гармонического приближения Еь1/2 ^(к(хь,1) - к0)2<И, где к0 — это начальная кривизна и к(хь,1) — текущая кривизна участка длины бокового

Рис. 3: Типы механического возбуждения (степени свободы), которые вносят вклад в деформацию частицы X (координату реакции), показанные на примере оболочки ССМУ. На панелях (а) — (с) показан герцев тип деформации. Панель (с) — профиль оболочки ССМУ в режиме герцевой деформации, показывающий участки структуры, обладающие наибольшей потенциальной энергией и наименьшей потенциальной энергией (синим). Панели (с!) — (Г) отображают деформации, происходящие от изгиба структурных элементов ("балок"). На панели (Г) отображен профиль оболочки ССМУ в условиях герцевой деформации и деформации, происходящей от изгиба боковых элементов, показывающий распределение потенциальной энергии. На панели показан переход капсида из состояния перед коллапсом (слева) в состояние полного коллапса (справа). На панели (Ь) показана схема модели ФНП.

элемента ей, I является параметром, описывающим эллиптическую форму бокового элемента в декартовых координатах (0<1< Яраг—хь/2). Здесь Еъ1 — жесткость при изгибе, которая представлется как произведение модуля Юнга Еь и геометрического момента инерции I, Ь — длина бокового элемента. Используя для описания формы структурного элемента формулу для эллипса, можно найти кривизну к(хь,1) для каждого значения хЪ- Подставив в формулу для потенциальной энергии, проинтегрировав по I, получаем энергию изгиба одного структруного элемента для каждого значения хъ■ Взяв производную этого выражения по хь, мы находим силу изгиба одного элемента. Так как хь мало, можно разложить правую часть полученного выражения для силы в ряд по степеням хь, сохранив только первый линейный член. Получается

9Еь1п , ,

ЛЫ = -^щ— 'хь (6)

Объединим вместе вклад всех боковых элементов и сложив вместе Ур. 5 и

Ур. 6, находим силу деформации

Р(хн,хъ) = Рн(хн) + Рь{хь) = кн ■ х%2 + Ыкь ■ хь (7)

где кн={В.РагЯир/{Краг + Яцр)1/2)/Оц — это коэффициент жесткости "гер-цевой пружины" (Ур. 5), а кь=9Еь1тт / (8Щаг) — коэффициент жесткости бокового элемента.

Определив степени свободы, наиболее подходящие для описания деформации частицы хн и хъ, можно построить статистическую модель механической реакции биологической частицы, подверженной деформации вдоль заданной оси. Биологическая частица представлена как набор из N одинаковых структурных элементов, которые взаимодействуют с индентором через герцеву "подушку". Каждый элемент может быть либо устойчивым, либо необратимо ломаться. Это дает возможность ввести случайную величину, связанную, соответственно, со степенью повреждения (1 и степенью целостности в набора боковых элементов, следующим образом (1—п/Ы и э=(Ы — п)/Ы=1 — (1, что дает относительное количество поврежденных (сломаных) и целых (устойчивых) боковых элементов, соответственно (0<с1, в< 1). Однако, вероятность того, что частица перейдет в состояние коллапса (останется целой) можно интерпретировать как вероятность того, что боковая часть структуры сломается (останется целой). Перейдя к пределу при больших значениях У, <1 и я становятся непрерывными случайными величинами с функциями распределения Ррь), й(Ръ)=РгоЪ(Рь=Кьхь)=^ър(Р1)йР1> и з^г-сЦРь^^р^Р!,.

В терминах вероятности того, что частица перейдет в состояние коллапса или останется целой, полная сила деформации имеет вид Р(хн, хь)=кн+ Кь ■ хьз(хь). Для того чтобы промоделирования вероятность коллапса частицы (1(хь) или вероятность того, что она останется целой я(хь), использовалось распределение Вейбулла с коэффициентом изменения силы и параметром формы т я(хь) —ехр [— (К^хь/Р£)т]. Собрав все вместе, получаем полную силу деформации:

Р(хн,хь) = кн • 4/2 + Къ ■ хьехр[-(Къхъ/Рь)т] (8)

Ур. 8 является основным результатом данной работы. Функция двух переменных Р(хн,хь) содержит всю информацию о механике частице и ее статистических свойствах. Механические характеристики частицы содержатся в герцевом коэффициенте упругости (кн) и в коэффициенте упругости изогнутых боковых элементов (Къ). Модель ФНП была использована для аппроксимации результатов моделирования силового наноиндентирования капсида

Деформация X, нм

Рис. 4: Сравнение усредненных экспериментальных спектров силы-деформации (данные показаны точками), полученных для разных вирусных капсидов, с теоретическими FX кривыми (сплошная линия), полученными с использованием модели флуктуирующих нелинейных пружин. На нижней вставке показаны двумерная поверхность F{xh, хь) (Ур. 8) как функция хн и хь. Красная кривая показывает равновестную (основную) траекторию, которая является минимум вдоль кривых, полученных пересечением F(xii,xb) с плоскостью хь=Х — хн- Черные кривые — отдельные реализации стохастических траекторий силы-деформации.

CCMV, а также результатов АСМ экспериментов по механическому нано-индентированию пустой оболочки CCMV, пустого капсида TrV, вириона TVV (содержащего молекулу РНК) и вириона AdV (содержащего молекулу ДНК), выполненных в лаборатории проф. Хайста Дж. JI. Вауте и проф. Ваутера X. Рооса (Университет Амстердама, Голландия) (см. Рис. 4): Полученные с помощью модели основные механические характеристики рассматриваемых систем, такие как модуль Юнга герцевой деформации белкового слоя оболочки, модуль Юнга изгибной деформации боковых стенок белковой оболочки, а также параметры для функции распределения вероятности перехода оболочки в состояния коллапса для разных значений силы, хорошо дополняют ранее опубликованные экспериментальные результаты по силовому наноин-дентированию этих систем.

В Заключении приведены основные результаты диссертации.

Основные результаты диссертации

1. Разработан вычислительный подход динамической силовой спектроскопии in silico, который позволяет моделировать эксперименты по нано-индентированию биологических частиц. Этот подход полностью имитирует in vitro эксперимент ACM в смысле условий приложения внешней силы и общей постановки эксперимента. Главное преимущество этого подхода состоит в том, что мы имеем полный контроль над рассматриваемой системой в течение всего процесса деформации. Детальное молекулярное разрешение на нанометровой шкале, получаемое с помощью данного метода, позволяет точно определять структурные изменения, происходящие в системе, что дает предложенному методу значительное преимущество.

2. Разработанный подход динамической силовой спектроскопии in silico, описанный в данной работе, был использован для построения энергетических ландшафтов, лежащих в основе динамики деформации различных систем, представляющих собой примеры больших биологических ассамблей. Это целый капсид вируса CCMV без своего генетического материала, фрагмент полимера микротрубочек (МТ), состоящий из восьми димеров и фрагменты протофиламентов МТ различной длины.

3. В результате аккуратного моделирования силового наноиндентирова-ния in silico для капсида CCMV показано, что уникальные особенности структуры частицы, связанные с ее геометрией, определяют физико-химические свойства вирусного капсида. Получена детальная картина процессов, происходящих в белковой оболочке во время сдавливания, которая доказывает, что физические свойства капсидов являются динамическими и локальными характеристиками структур. Более того, эти свойства меняются с изменением глубины деформации и зависят от маг-нитуды и геометрии механического воздействия. Интересно отметить, что переход капсида CCMV в состояние коллапса не сопровождается значительными локальными перестройками в структуре, подразумевая, что переход в состояние коллапса происходит за счет глобального преобразования формы, а не структурных изменений.

4. Выполнено углубленное исследование динамики и биомеханики МТ, в результате которого получены структурные детали, лежащие в основе поперечных и продольных тубулиновых взаимодействий. Проанализировав траектории, полученные в ходе эксперимента in silico, в которых

происходит непосредственное влияние на тубулиновые связи, определены средние значения энергий диссоциаций поперечных и продольных связей. Эти значения вместе с измеренным значениями жесткости при изгибе для тубулиновых протофиламентов подтверждают гипотезу о том, что МТ способна генерировать силу, достаточно большую, чтобы сдвинуть хромосомы в процессе деления клетки.

5. На основе результатов, полученных с помощью методологии наноин-дентирования in silico, проведено исследование основных структурных изменений и степеней свободы, характеризующих поведение биологической частицы под действием внешней сдавливающей силы. Предложена новая аналитическая модель Флуктуирующих Нелинейных Пружин деформации биологической частицы, чтобы охарактеризовать спектры силы-деформации, получаемые из экспериментов по динамическому сдавливанию. Эта аналитическая модель совмещает в себе элементы механики сплошных сред, а также статистику экстремальных событий, чтобы описать механическую деформацию и коллапс биологических частиц.

6. Разработанная теория успешно применена, чтобы охарактеризовать механические свойства пустых и заполненных вирусных частиц икосаэд-ральной геометрии, сдавливаемых сферическим объектом. В результате получены основные характеристики данных систем, которые описывают их поведения в условиях приложения внешней силы.

Список публикаций автора по теме диссертации

1 Kononova О., Snijder J., Brasch M., Cornelissen J., Dima R.I., Marx K.A., Wuite G.J.L., Roos W.H., Barsegov V. Structural transitions and energy landscape for cowpea chlorotic mottle virus capsid mechanics from nanomanipulation in vitro and in silico // Biophys. J. - 2013. - V.105, N.8. - P.1893-1903.

2 Кононова О.Г., Жмуров A.A. Исследование микромеханических свойств вирусных капсид методами молекулярной динамики на графических процессорах, // Труды 54-й научной конференции МФТИ: Всероссийской научной конференции "Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе". Том 2. Управление и прикладная математика. М.: МФТИ, 2011. - С.29-30.

3 Kononova О., Kholodov Y., Theisen К.Е., Marx К.A., Dima R.I., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L., Barsegov V. Tubulin bond energies and microtubule biomechanics determined from nanoindentation in silico 11 J. Am. Chem. Soc. - 2014. - V.136, N.49. -P.117036-17045.

4 Kononova O., Kholodov Y., Theisen K.E., Marx K.A., Dima R.I., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.h., Barsegov V. Tubulin bond energies and microtubule biomechanics determined from nanoindentation in silico //J. Biomol. Struct. Dyn. / SUNY Albany, NY, USA, 2015. - V.33. - P.35-36.

5 Kononova О., Barsegov V. Mechanical properties of microtubules from nanoindentation experiments in silico 11 Computational and theoretical modeling of biomolecular interactions / Dubna, Russia, 2013. - V.33. - P.92-93.

6 Kononova O., Jones L., Barsegov V. Order statistics inference for describing topological coupling and mechanical symmetry breaking in multidomain proteins // J. Chem. Phys. - 2013. - V.139, N.12. - P.121913.

7 Zhmurov A., Kononova O., Litvinov R.I., Dima R.I., Barsegov V., Weisel J.W. Mechanical transition from a-helical coiled coils to /З-sheets in fibrin(ogen) // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - V.134, N.50. - P.20396-20402.

8 Kononova 0., Litvinov R.I., Zhmurov A., Alekseenko A., Cheng C.H., Agarwal S., Marx K.A., Weisel J.W., Barsegov V. Molecular mechanisms, thermodynamics, and dissociation kinetics of knob-hole interactions in fibrin // J. Biol. Chem. - 2013. - V.288, N.31. - P.22681-22692.

Личный вклад соискателя в работах с соавторами

1. Разработка вычислительного подхода динамической силовой спектроскопии in silico, который позволяет моделировать эксперименты по на-ноиндентированию биологических частиц.

2. Проведение моделирования силового наноиндентирования in silico для капсида CCMV, анализ полученных результатов, описание физических и биомеханических свойств вирусных частиц.

3. Проведение моделирования силового наноиндентирования in silico для капсида МТ и изгибной деформации протофиламента, анализ полученных результатов, расчет энергии тубулиновых взаимодействий и изгибной жесткости протофиламента.

4. Разработка новой аналитической модели Флуктуирующих Нелинейных Пружин для описания'деформации биологической частицы. Применение модели для описания экспериментальных спектров силы-деформации.

Кононова Ольга Геннадиевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 20.08.2015. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 359. Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)» Отдел оперативной полиграфии «Физтех-полиграф» 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9