автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.01, диссертация на тему:Значение биоспектрофотометрии нативной флуоресценции клеток покровных тканей и крови для медицинских исследований

На правах рукописи

Сясин Николай Иванович

«Значение биоспектрофотометрии нативной флуоресценции клеток покровных тканей и крови для медицинских исследований»

05.13.01 - системный ан ализ,. управление и обработка информации (биологические науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- Тула - 2005

Работа выполнена в ГУП НИИ новых медицинских технологий Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН доктор биологических наук, профессор

Кандидат биологических наук

Кидалов Владимир Николаевич

Фудин Николай Андреевич Жилина Наталья Михайловна

Ведущая организация: НИИ нормальной физиологии РАМН им. П.К. Анохина

Защита диссертации состоится «Д.?» О у ? Я й }9 % 2005 г. в 1 1~ часов на заседании диссертационного совета Д 212.271.06 при Тульском государственном университете по адресу: г. Тула, ул. Болдина, д. 128.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Тульского государственного университета по адресу: 300600, г. Тула, проспект Ленина, 92.

Автореферат разослан «1 fr» Ш и.72\д 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, А-?) -Тч 1АНО $

профессор * А.З, Гусейнов

ébcoe- 7

f.b 49 i

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Процессы кислородного метаболизма и энергообмена клеток и тканей организма во многом определяются ферментами клеточной дыхательной цепи (ДЦ) или «дыхательного конвейера», обеспечивающего внутриклеточное окисление биологических субстратов. В настоящее время разработан способ оценки клеточного дыхания (КД), использующий естественное нативное свечение клеток живых тканей (аутофлуоресценцию - АФ) под воздействием ультрафиолетового излучения (УФИ). Работами Дж Лаковича (1986), В.Н.Карнаухова (2001), М.М. Потапова (2003) и других установлены широкие возможности использования спектрофотомерии для оценки изменения состояния живых биологических систем.

Установлено, что кратковременное и слабое по интенсивности облучение живых клеток УФИ определенных длин волн в соответствии с законом Стокса вызывает флуоресценцию в видимом диапазоне длин волн, а особенности свечения клеток колеи, крови и других тканей в процессе их жизнедеятельности несут важную информацию об изменениях в функционировании ДЦ. Определены связи АФ с состоянием систем дыхания и крови, обеспечивающих газообменные процессы в организме (В. П. Скулачев, 1998). В настоящее время наиболее распространена регистрация интенсивности свечения клеток (при их возбуждении УФИ) на длинах волн 455 - 465 нм и 520 - 530 нм (А. Ю. Барановский, 1992, A.G.Bohorfoush,1996). По этим показателям получают

косвенную характеристику активности молекул пиридиннуклеотидов и флавопротеидов в процессе КД. Однако недостаточно исследованным остается вопрос о значении изменений интенсивности аутофлуоресценции в других частях спектра. Не полностью исследованы также связи изменений спектра АФ клеток покровных тканей и крови в зависимости от функционального состояния организма, от места снятия информации с поверхности тела у здоровых людей и от состояния функции внешнего дыхания (ФВД) у больных с бронхолегочной патологией. Нельзя считать достаточно обоснованным использование в оценке состояния клеточного дыхания таких параметров аутофлуоресценции (в световом диапазоне длин волн), как показатель % (кси) - по В.Н.Карнаухову (1978) и максимальная интенсивность аутофлуоресценции (1тах). Таким образом, поиск приемлемых для клинической медицины спектрофотомегрических критериев определения клеточного дыхания, отражающих состояние организма здоровых и больных людей требует дополнительного исследования и уточнения.

Цель исследования: оценить диагностическую значимость ряда характеристик спектра аутофлуоресценции клеток покровных тканей и крови практически здоровых, а также больных хронической обегруктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Задачи исследования:

1. На основе экспериментально-клинических наблюдений оценить чувствительность и информативность спектрофотомегрического метода исследования аутофлуоресценции, а также возможность его использования для мониторинга изменения состояния здоровья больных с хроническими обструктивными заболеваниями легких.

2. Исследовать взаимосвязь изменений спектров аутофлуоресценции клеток кожных покровов и эритроцитов при использовании функциональных нагрузочных проб, применяемых в клинике.

3. Выявить особенности аутофлуоресценции клеток покровных тканей и эритроцитов у больных с бронхолегочной патологией и определить диагностически значимые спектрофотометрические маркеры нарушения клеточного дыхания.

Научная новизна.

Впервые уточнены спектрофотометрические параметры КД, наиболее чувствительные к нарушениям ФВД у бопьныхХОБЛ.

На основе статистического анализа результатов установлена взаимосвязь изменений спектра АФ кожных гаяфовов у больных ХОБЛ с показателями внешнего дыхания. Эти связи могут быть использованы при

РОС. НАЦИОНАЛ

БИБЛИОТЕК/

диагностике и контроле за лечением больных с бронхиальной обструкцией. С помощью параметра С выявлена возможность верификации некоторых болезней органов дыхания.

Установлена зависимость спектральных характеристик АФ эритроцитов периферической крови от степени нарушения ФВД.

Практическая значимость.

Усовершенствована методика и определены условия проведения спектрофотометрии клеток кожных покровов и крови практически здоровых и больных лиц. Определены информативные спектральные показатели АФ, использование которых, совместно с параметрами ФВД, позволило отделить больных с необратимой (или частично необратимой) бронхиальной обструкцией (ХОБЛI - На) от больных с обратимой бронхиальной обструкцией (БА).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определение в реальном масштабе времени параметра С и других параметров спектра аутофлуоресценции может быть использовано для динамического наблюдения за больными с бронхиальной обструкцией в процессе лечения.

2. Параметр С более информативен для определения нарушения функции клеточного дыхания у больных ХОБЛ по сравнению с параметром

3. Изменение аутофлуоресценции кожных покровов коррелирует с нарушением ФВД у больных ХОБЛ в отличие от аналогичных показателей, определяемых у больных БА.

Внедрение результатов исследования.

Результаты работы внедрены

1) в Государственном унитарном предприятии НИИ новых медицинских технологий, г, Тула,

2) во ФГУЗ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России.

Апробация и реализация работы.

Результаты диссертации доложены на научных конференциях: Проблемы оценки и прогнозирования здоровья военнослужащих в условиях современной военной реформы -. Науч.-практ. конф. 16-17 февраля 1995 г.- СПб.: ВМедА,; на Третьем международном симпозиуме по электромагнитной экологии (ЭМС - 97). - СП6..-1997; Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии. - СП6.//МЗ РФ, ГНЦП, РАМН. -1997; на 5-ой Российской научно-технической конференции «Электромагнитная совместимость технических средств и биологических объектов. - ЭМС-98. - СПб / РАН, РАЭлТН, РАМН, Военнно-инженерный технический университет и др.- 1998; на Научно-практическом конгрессе «Интегративная медицина - новая идеология здравоохранения России».- СПб.; в ВМедА, 2002, «Проблемы гармонии, симметрии и золотого сечения в природе, науке и искусстве»; на Конференции Винницкого государственного аграрного университета. Винница. - 2003; на Международной научно-практической конференции «Проблемы обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях». - СПб.: ГПС, 27 - 28 октября 2004 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 14 работ (5 журнальных статей, 2 доклада в сборниках трудов, 7 тезисов).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 16 Д. страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, 8 приложений и списка использованной литературы, содержащего 113 отечественных и 42 зарубежный источника. Текст иллюстрирован 8 таблицами и 31 рисунком.

Материалы и методы исследования.

Исследование проводилось Ь три этапа в соответствии со следующей блок-схемой (см. рис. 1)

Рис, 1. Блок-схема исследования

Для исследования АФ использовались два основных комплекса:

Комплекс 1. Предназначался для измерения АФ кожных покровов. Он представлял собой волоконно-оптический флуориметр, основанный на разработках группы сотрудников (ЛЯ. Барский и др.) Государственного оптического института им. С.И. Вавилова (рис. 2).

Принцип его работы состоял в следующем: УФ излучение от ртутной лампы, с соответствующим блоком питания пройдя через теплозащитный и возбуждающий светофильтры по волоконно-оптическому световоду (2) поступало на щуп и через контактный объектив, расположенный на конце щупа, на объект, возбуждая его флуоресценцию. Свет флуоресценции также через контактный объектив по второму волоконно-оптическому световоду (3) через запирающий светофильтр ЖС (б) попадал на монохроматор, состоявщий из дихроичного зеркала (дифракционной решетки) с системой развертки спектра и фотоэлектронного умножителя.

Рис 2. Схема волоконно-оптического спектрофотометра 1- щуп; 2,3-световоды;. 4-источник УФ; 5 - электронный блок 6 - монохроматор; 7 - ЭВМ; 8 - кнопка «пуск».

Электронный блок (5) содержал усилитель фототока, фильтр низкой частоты и буферный каскад сопряжения с персональным компьютером. Это позволило графически или в цифровом выражении регистрировать изменения флуоресценции в относительных единицах. Дополнительные технические характеристики прибора: длина волоконно-оптических световодов - 1600 мм,. наружный диаметр дистального конца щупа - 12 мм, диаметр измеряемого участка объекта 3 мм, напряжение питания - 220В (переменное). Источник возбуждающего излучения - ртутная лампа ультрафиолетового излучения типа ДРШ-250-3, приемник излучения - специальный ФЭУ, длина волны возбуждения 365 нм, спектральный диапазон

флуоресценции 400 - 750 нм. Время измерения - 0,5 сек, аналоговый сигнал вывода информации на внешние регистрирующие устройства - от 0 до +8В, аппаратная погрешность - 2%, методическая погрешность (воспроизводимость измерений) - 2,5%.

Комплекс 2 предназначался для исследования микрообъекгов и представлял собой установку для комплексного анализа малоконтрастных микрообъектов. Она позволяла достичь повышения качества и скорости, а также упрощения анализа люминесцентных спектрофотометрических характеристик микроскопируемых живых, переживающих и динамически изменяющихся клеток. При этом использовались технологии, не требующие предварительной инкубации и специальных видов лабораторной подготовки, окраски и фиксации клеток. Достигалась возможность увеличения микроскопируемых объектов до 5000 крат.

Комплекс состоял из микроскопа ЛЮМАМ-Р1 с эпиобъективом 10 х 0.30 (1), снабженного как источником видимого света (лампа КГР-120), так и ртутной лампой ДРШ-250-3 (ультрафиолетовое излучение) для возбуждения АФ. Лампы питались от соответствующих блоков питания. На микроскопе были установлены две ПЗС телекамеры: черно-белая Panasonic NV-A 50 и цветная Panasonic NV-R, а также спектрофотометрическая насадка СФН-10 (Рис.3).

Изображение с телекамер регистрировалось на видеомагнитофоне Panasonic Р5 с цветным монитором (3) и на компьютере Pentium IV (4), оснащенном платой видеозахвата (видеобластер). Спектрофотометрическая насадка СФН-Ю (2) позволяла измерять интенсивность АФ на длинах волн от 400 до 700 нм. Интенсивность АФ регистрировалось также на компьютере.

Рис 3. Установка для комплексного анализа малоконтрастных микрообъектов, 1 - микроскоп; 2 - спектрофотометрическая насадка; 3 - видеомагнитофон с монитором; 4 - ЭВМ; 5 -блоки питания; К1, К2 - коммутаторы; Тк1, Тк2 - телекамеры.

Работа состояла из трех частей.

В первой - экспериментальной части работы проведены:

- исследования по доработке аппаратной части комплексов, реперные оптические измерения на растительных и животных биообъектах, подбор режимов регистрации и возбуждения АФ.

- исследования по оценке характера спектров флуоресценции покровных тканей (кожи, слизистых), эндотелия, мышечных тканей, лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов человека (п = 65) и других живых организмов (п = 105).

Во второй - исследовательской части работы проведены:

- исследование АФ клеток различных топографических участков кожи и в биологически активных точках (БАТ) человека при изменении функционального состояния организма (проведение функциональных нагрузочных проб - 250 исследований). Использовались метаболическая («пробный завтрак» (стакан чая и бутерброд) и более обильная пищевая нагрузка (обед из двух блюд), физическая (велоэргометрия) и другие нагрузки;

- исследования АФ клеток БАТ клеток кожи человека в покое и при проведения функциональных дыхательных проб (проба Штанге, дыхание газовыми смесями измененного состава и др. - (80 исследований);

В третьей части работы проводилось кслинико-лабораторное обследование практически здоровых и больных людей (модельное исследование). Контрольной группой для больных с бронхиальной обструкцией (ХОБЛ легкой и средней степени тяжести и бронхиальная астма) были практически здоровые лица. В качестве группы сравнения исследовались больные без патологии органов дыхания.

Всего обследовано 121 человек: 39 практически здоровых и 82 больных (табл. 1).

.1 Таблица 1

Общая характеристика обследованных лиц

Группа Диагноз Пол Средний возраст Количество пациентов Всего

1 (контрольная) Практически Здоровые Муж. 46,0 ± 8,0 19 39

Жен. ' 47,0± 9,0 20

2 (сравнения) Больные без патологии органов дыхакия.-с заболеваниями покровных тканей, суставов*, ИБС и гипертонией Муж. 53,0 ± 6,0 10 22

Жен. 51,0 ± 6,0 12

3 (сравнения) Больные бронхиальной астмой (БА) Муж. 54,0 ± 3,0 4 11

Жен. 52,0 ± 3,0 7

4 (основная) ХОБЛ I Муж. 56,0 ± 4,0 5 5

Жен. -

ХОБЛ II а Муж. 56,0 ± 4,0 35 44

Жен. 56,0 ± 4,0 9

• - основные нозологические единицы этой группы: липоматоз, хронические дерматиты, остеохондроз, хронические артриты (п = 10), обследованы в динамике до и после проведения курса лечебно-оздоровительной гимнастики с элементами психологичесхсой релаксации.

При обследовании больных использованы данные историй болезни и клинического осмотра (жалобы, анамнез, результаты объективного лабораторного обследования и консультации специалистов). У пациентов всех групп проводились измерения спектра АФ клеток кожи в БАТ и определялась максимальная интенсивность аутофлуоресценции эритроцитов. Исследовалось также парциальное давление Ра02 и РаС02 в периферической крови, дополнительно проводилось исследование резервных возможностей сердечнососудистой системы с помощью ультразвуковой эходощшерокардиографии в соответствии с действующими протоколами Минздравсоиразвития РФ. Исследования проведены в 1995 - 2003 г.г.

Критерием отбора выборки больных с бронхиальной обструкцией был возраст от 48 до 65 лет и наблюдаемое снижение параметра ОФВ1 не ниже 50%. Длительность основного заболевания составляла от 3 до 20 лет. Все больные обследовались в фазе ремиссии.

Для оценки тяжести бронхообструкции использовался спирографический показатель ОФВ] и его отношение к ЖЕЛ [ООЬБ 2001]. Легкую степень ХОБЛ определяли при ОФВ1 > 80 % (I), среднюю -при 80 -г 50 % (Па) и 50 + 30% (116).

У всех обследованных оценивались общепринятые показатели функциональных резервов сердечной деятельности по показателям: ЕР ЛЖ Тг - фракция выброса левого желудочка сердца; МОК - минутный объем кровообращения; СОЛЖ - систолический объем левого желудочка; РРАБ (СДЛА) - систолическое давление в легочной артерии (в мм, рт. ст.); АД с„„ - артериальное давление систолическое (в мм рт. ст.) и АД диаст, - артериальное диастолическое давление в мм. рт. ст. [Риягег V. е1 а1., 2001]. Обеспечение газообмена организма контролировалось по показателям: РаС02, мм. рт. ст. - парциальное давление СОа в крови [Нету 1.В., 1991].

При анализе спектров АФ клеток кожи и эритроцитов регистрировались следующие параметры:

• 1_тах - максимальная интенсивность АФ

• I_455 - интенсивность АФ на длине волны 455 нм

• I_5зо - интенсивность АФ на длине волны 530 нм

• 1_тах Эр. - максимальная интенсивность АФ эритроцита

По этим параметрам рассчитывали:

• Д1 - разность интенсивностей на длинах Волн 530 и 455 нм, взятая по абсолютному значению

• 4 (кси) - параметр, равный отношению интенсивности АФ на длине волны 530 нм к интенсивности на длине волны 455 нм

• С - параметр, вычисляемый, как (1_шах -1_мо)/(1_тах -1_455)

Параметр С характеризовал интегралыше особенности изменения спектра АФ на разных длинах волн (в диапазоне 455 - 530 нм.).

В качестве дополнительных методов использовали:

- оценку изменений конфигурации эритроцитов (методики квантитативной эритрограммы, изменения внутренней части тора эритроцитов с формированием в центральной части этих клеток (пеллор) фигур, названных условно-полиморфными сгомами - УПС (А.А. Хадарцев и др. 2000);

- оценку АФ эритроцитов при выстраивании ими краевой линии (ВКЛ) (Г.Н. Якушина и др.2001). Учитывалось, что при нарастании тяжести дисфункции эритрона наблюдался переход ВКЛ эритроцитами от 1 - 2 типов к типам 3-5.

Статистический анализ результатов проводился с использованием критериев описательной статистики и параметрического метода оценки и тетраметрических критериев. Результаты считались статистически значимыми при значении, р < 0,05. Для статистической обработки данных на ЭВМ использовался пакет статистической обработки данных «Статистика-6».

Основные результаты собственных исследований

В первой, экспериментальной, части исследования проведено уточнение зависимости особенностей спектров АФ от режимов работы приборов. Получено подтверждение повторяемости спектров аутофлуоресценции одних и тех же биообъектов, а также адекватности интенсивностных параметров спектра свечения функциональному состоянию объекта. В результате стандартизации работы УФ-биошектрофотометра достигнута высокая идентичность повторных замеров с разницей не более 2-2, 5%.

На графике (рис. 4) представлена зависимость максимальной, АФ кожи от временной экспозиции возбуждающего УФ-излучения («эффект выгорания»). Анализ этого графика показывает, что для получения идентичных значений АФ время экспозиции не должно превышать 5

секунд. Опираясь на этот результат, была проведена модернизация и доработка аппаратной часта комплекса 1. Доработке подверглась как оптическая, так и электронная часть аппаратуры., Важным результатом этой части работы явилось изменение методики регистрации. АФ с клеток колотых покровов человека регистрировалась в течение 2 секунд.

1100 п.

0 5 10 15 20 25 30

Рис. 4. Изменение АФ клеток кожи от экспозиции УФ-облучения/ X - время экспозиции (сек.), У - интенсивность АФ (ед.)

Были проверены различия и повторяемость спектров свечения различных участков тела человека, клеток крови, Максимум АФ расположен на длинах волн 485 - 495 нм у клеток кожи и 472 - 475 нм - у эритроцитов человека.

Во второй части исследовались изменения АФ при различных нагрузочных пробах: метаболических, физических, эмоциональных. Отдельно изучено изменение АФ при различных дыхательных пробах, АФ клеток кожи исследовалась в различных зонах и точках на поверхности тела.

В качестве метаболических нагрузок использован стандартный «пробный завтрак» и обильная пища. Контролировалось изменение спектров флуоресценции до и после приема шшщ.

Установлено, что при приеме пробного завтрака регистрируется индивидуальная реакция в виде слабого или более выраженного усиления шггенсивносга АФ клеток кожи у разных лиц. При этом изменение интенсивности аутофлуоресценции у всех испытуемых было равномерным и пропорциональным йа всех длинах воли. Прием обильной пищи оказывал несколько иные изменения спектра свечения. Так, при измерении АФ у мужчин в области биологически активной точки Лаогун, расположенной в центре ладони, при данной нагрузке по сравнению с пробным завтраком отмечено усиление интенсивности

свечения на 5 - 8%. При измерении АФ в зоне «анатомической табакерки» кисти рук эта нагрузочная проба не приводила к повышению интенсивности АФ. Таким образом, зафиксирован факт разнонаправленного изменения спектра флуоресценции на пищевую нагрузку в различных участках тела.

В период последействия - через 10 минут после приема пищи отмечена тенденция к уменьшению изменений АФ, однако, полное восстановление этого показателя наблюдалось только через 30 - 40 мин. Снижение АФ - этого «энергетического» показателя - могло быть связано с известным в физиологии фактом перераспределения кровотока после еды. Поскольку после указанных проб изменялась лишь интенсивность свечения, а форма спектра не изменялась, можно сделать вывод, что обычные метаболические нагрузки вызывали параллельные и пропорциональные изменения флуоресценции в различных участках спектра АФ.

Функциональная проба с физической нагрузкой осуществлялась на велоэргометре Р\УС-170. При ступенчато-изменяемой нагрузке (до уровня 2/3 анаэробного порога) интенсивность АФ клеток колеи, измеряемая в области «анатомической табакерки» и в области БАТ Лаогун (другие области по условиям исследования были труднодоступны) изменялась так, как показано на рис 5. На графике видно, что интенсивность АФ клеток кожи в период проведения пробы монотонно повышалась. После отмены нагрузки АФ плавно возвращалась к исходному уровню примерно через 15 - 25 минут.

Рис. 5. Изменение АФ при нагрузочной пробе Р\УС-170. Х- 1- 5ст,- ступени нагрузки, 1-5м время отдыхав минутах

Весьма существенными были изменения АФ при проведении дыхательных проб с задержкой и форсированным дыханием. Даже дыхательные маневры, осуществляемые для исследования функции внешнего дыхания при определении жизненной емкости легких и форсированной жизненной емкости легких, оказались способными заметно изменить интенсивность АФ клеток кожи (см. рис. 6).

Существенно иной оказалась реакция изменения клеточного дыхания на пробу Штанге (см. рис.7). На представленном графике видно, что задержка дыхания на 30 секунд вызывала выраженное (на 36%) уменьшение интенсивности АФ клеток кожи к первой минуте последействия. В дальнейшем происходило волнообразное изменение АФ с постепенным увеличением интенсивности, но даже к 15 минуте интенсивность АФ не достигала исходного уровня. На исходный уровень АФ возвращалась только к 25 - 30 минуте.

Рис. 6. Изменение интенсивности АФ при проведении дыхательных маневров. На верхнем рисунке: спирограмма при проведении спокойного и форсированного дыхательных

маневров,

Х- ось времени; на нижнем графике по оси Х- время в секундах, У - интенсивность АФ.

При использовании пробы Штанге в качестве нагрузочной пробы удалось установить, что в разных областях и точках кожного покрова человека изменение АФ клеток различно.

«if Л*'

последействие

Рис. 7. Изменение клеточного дыхания при проведении пробы Штанге На осях: X -1 -15м - время в минутах; У- интенсивность АФ (ед.)

На рис. 8 представлены изменения интенсивности АФ в различных точках тела при проведении этой пробы. Наиболее «информативной» оказалась БАТ Лаогун, а наименьшие изменения АФ зарегистрированы на ушной раковине.

1000 800 600 400 200

M фон б проба

Щш-*

пНиг

т. Лаогун

анат. ухо (мочка) табакерка

Рис. 8. Изменение интенсивности АФ на разных участках тела при проведении пробы Штанге.

Чрезвычайно важной для дальнейших исследований была велоэргометрическая проба PWC-170 с т.н. возвратным дыханием. Когда испытуемый при ступенчато-изменяемой нагрузке по данным измерительного комплекса достигал 2/3 анаэробного порога, он, продолжая педалирование, переключался на дыхание из резинового мешка (возвратное дыхание). При этом концентрация кислорода во вдыхаемом воздухе уменьшалась до 15%, а концентрация С02 повышалась до 8.5% (гиперкапния). Параллельно регистрировались изменения АФ на нескольких длинах волн. Характер изменения АФ представлен на рисунке 9. Достижение испытуемым 2/3 анаэробного порога характеризовалось умеренным изменением АФ клеток кожи, как это было описано выше.

Рис. 9. Велоэргометрическая нагрузка с возвратным дыханием По оси X - 1 -3 мин. - время последействие; по У - интенсивность АФ на указанных длинах волн

С началом возвратного дыхания при гиперкапническом воздействия интенсивность свечения неравномерно увеличивалась на всех контролируемых длинах волн. По мере адаптации после воздействия неоптимальной газовой среды снижение флуоресценции приобретало все более неравномерный характер. На третьей минуте наибольшие изменения наблюдались в синей области спектра, в то же время желто-зеленая область (530 нм.) не протерпела существенных изменений, что указывало на разную степень «отклика» пиридиннуклеотидов и флавопротеидов на кратковременное гиперкапническое воздействие. Изменение формы спектра сопровождалось сдвигом максимума аутофлуоресценции в коротковолновую (синюю) область - к длине полны 470 нм.

Из вышесказанного следует, что при проведении сложных функциональных проб для корректной характеристики процесса биологического окисления у обследуемых необходимо учитывать изменения интенсивности свечения в более широком диапазоне длин волн спектра АФ. При анализе изменений КД этому требованию может отвечать интегральный параметр - С, позволяющий учитывать как изменения интенсивности, так и сдвиг спектра по оси длин волн.

При анализе АФ клеток различных участков тела человека обнаружен факт ее асимметрии. Это дополнило известные знания об асимметрии в функциях и строении рук (киральность) и в деятельности правого и левого полушарий головного мозга. В ее в основе - асимметрия обмена веществ на аналогичных участках правой и левой стороны тела [A.A. Яшин, 2003]. При сравнении спектров АФ клеток кожи в симметричных участках тела у практически здоровых мужчин и женщин среднего возраста в качестве ориентиров для анализа были выбраны симметричные биологически активные точки (БАТ) меридианов китайской акупунктурой системы [В.А Табеева., 1998]. У каждого человека оценивали несколько участков головы, живота и спины, отдельно ушной раковины, туловища и конечностей.

Установлено, что в целом интенсивности свечения симметричных участков кожной поверхности головы, туловища, верхних и нижних конечностей справа и слева отличаются не более, чем на 3 - 5% в группе практически здоровых мужчин и женщин.

Анализ полученных в собственных экспериментальных сравнительных исследованиях данных позволил сделать заключение, что при исследовании спектров АФ клеток колеи с целью оценки их параметров, сопряженных с КД необходимо выполнить следующие требования'.

обследуемый должен быть отдохнувшим не менее 30 минут после физической нагрузки, в спокойном эмоциональном состоянии, исследования должны проводиться не ранее чем через 20 - 30 минут после метаболических нагрузок, при динамических наблюдениях снятие показателей должно проводиться с одних и тех же участков поверхности тела, причем в качестве ориентиров удобно использовать координаты БАТ китайской акупунктуры.

При проведении исследований АФ клеток кожи вместе со снятием других функциональных показателей удобным участком (по критериям информативности, воспроизводимости и доступности) является правая ладонная поверхность (у правшей) - зона локализации БАТ Лаогун.

Полученные в экспериментальной части исследования данные подтвердили высокую чувствительность и повторяемость спектров аутофлуоресценции клеток кожных покровов у практически здоровых людей. Установлена возможность регистрации отклика спектрофотометрических показателей на различные функциональные нагрузки, в том числе и на те, которые используются для оценки функционального состояния организма больных с болезнями органов дыхания.

В третьей части исследований оценивались спектрофотометрические показатели больных с необратимой (или частично обратимой) и с обратимой бронхиальной обструкцией. В этом модельном исследовании нами были обследованы больные с ХОБЛ легкой и средней степени тяжести и больные бронхиальной астмой.

У всех обследованных лиц в общей сложности регистрировалось 29 клиника-лабораторных показателей.

В результате статистической оценки взаимосвязи параметров спектров аутофлуоресценции, характеризующих КД клеток покровной ткани (БАТ Лаогун правой ладони) с изменениями ФВД установлено следующее:

При сравнении средних значений контролировавшихся показателей статистически значимые отличия по Стьюденту между группами (1 + 2) (контроля и сравнения) и (3 + 4) (больные ХОБЛ и БА) обнаружены для 12 показателей (табл.2). В то же время не обнаружено существенных групповых различий 17 показателей, в числе которых эритроциты, концентрация гемоглобина, число лейкоцитов и СОЭ, что позволяет считать рассматриваемые группы однородными по данным показателям.

При анализе корреляций показателей газового обмена (Ра02, и РаС02) не выявлено существенных связей с большинством контролируемых переменных. Только в немногочисленной группе 3 больных БА (9 пар наблюдений) ранговая корреляция Ра02 с переменной С составила т=0,75. По всей выборке корреляции переменной Ра02 мм, рт. ст. с показателями Imax, MOCso%, MOC7s% и С0С25.75% слабо выражены (г = 0,26 -

0,3), но статистически значимы. Это позволило считать обследуемый контингент практически однородным и по показателям газового обмена.

При оценке средних (табл.2, рис. 10) у лиц 1 и 2 групп и у больных БОД обнаружены следующие достоверные отличия в восьми показателях ФВД и двух характеристиках спектра аутофлуоресценции кожи и эритроцитов (Табл.2)

Таблица 2.

Отличия в показателях ФВД и КД между группами 1 | 2 (контроля и сравнения) и 3 1 4 (больные ХОБЛ и БА)

Показатель Группы сравнения (1) и (2) Группы сравнения (3) и (4)

п 1 п 1 Р

ФЖЕЛ, %Д 94, 10 34 9,18 83, 91 56 10, 71 < 0,0001

ЖЕЛ, %Д 91, 73 34 9,81 86, 61 59 9,4 4 < 0,0015

ОФВ1, %Д 94, 40 63 3,53 69, 59 61 9,0 9 < 0,0001

ПОС, %Д 93, 79 24 3,81 74, 22 56 15. 53 < 0,0001

МОС25, %Д 74, 46 24 6,25 49, 26 59 19, 43 < 0,0001

МОС 50, %Д 79, 50 24 18,3 8 36, 42 59 12. 06 < 0,0001

МОС75, %Д 73, 88 24 22,6 2 30, 51 59 13, 42 < 0,0001

СОС25-75, %Д 62, 88 24 8,27 38, 44 56 14, 43 0,0001

Д1 80, 81 63 61,3 2 89, 88 26 86, 24 >0,0 5

1,6 2 63 0,80 1,7 5 26 1,3 6 >0,0 5

С 0,1 8 63 0,07 0,4 7 26 0,3 9 < 0,0001

I та эр. 1,8 3 30 0,18 1,6 3 23 0,2 0 < 0,0001

соэ 7,4 6 61 2,56 9,8 1 25 3.3 7 < 0,001

Лейкоциты, 10.* 7,3 2 60 1.39 8.1 3 25 1,7 7 < 0,028

СРБ 0,2 4 43 0,43 0,5 2 25 0,5 9 < 0,029

«А /|

0,5

г5""*!

□ 1+2 гр.

□ 3+4 |р.

Рис. 10. Средние значения показателей аутофлуоресценции клеток кожи (С) и(1гшхэр) в группах 1+2 и 3 + 4

В табл. 3 приведены значения статистики Фишера Р, полученные при проведении дискриминшгшого анализа - разделения всей выборки на 2 класса (группы (1+2) и (3+4)) - по каждой переменной в отдельности. В этом случае величина Р-статистики характеризует разделяющую способность используемых в анализе переменных, В таблице показано, что из показателей ФВД наиболее информативны (по различиям между

больными с патологией дыхательной системы и группами сравнения) ОФВь МОС50 %, МОС75%, что не противоречит данным других исследователей (Кузнецова В.К., Кирюхина Л.Д., 1997; Кокосов А.Н., 2003).

. При этом среди спектральных характеристик АФ показатели \ и АI в этих двух выборках не имели существенных отличий, а Си 1тахэр существенно различались.

Таблица 3.

Выборочные значения статистики Фишера К, полученные при проведении дискрииинантного анализа - разделения всей выборки на 2 класса (группы 1 + 2 и группы 3+4)

Переменная

ОФВ,. %д 406,21 ФЖЕЛ,%Д 21,29

мое». %Д 158,28 ^ шах эр 15,25

мое,5 %д 117,03 соэ 12,38

СОС25.75. %Д 60.09 ЖЕЛ,%Д 6.17

мос25. %Д 38,47 Лейк.10.ы 5,01

П0С,%Д 36,92 СРБ 4,98

с 33.89

Примечание: в таблице приведены только статистически значимые данные на уровне р < 0,05 при разделении на 2 класса переменные в порядке убывания их значимости.

Наиболее показательными оказались результаты дискримишнтного анализа по всем переменным. С его помощью выявлена невысокая информативность показателя £ (рис.11). Частота средневысоких абсолютных величин этого показателя - £ - не более 1, 6 (наиболее частые случаи при оценке здоровых лиц) в контрольной группе 1 составила 68,3%, в группе 2 - у больных без патологии органов дыхания - 72.7% (3 группа), а у больных ХОБЛ (группа 4) -86.7%.

С-'-'*-г лр д л, ^.г.м';. е ¿¡-.у группах неКллЬд*'ниэ

'12 Г"

I

:■ 10 Г

■ЯШ Урл/пЯД 1 Мйт-ру-йгиг-ШШ Группа »

г К«

Рис. 11. Дискриминантый анализ. Распределение \ во всех группах наблюдения. По оси Х- параметр по У - число наблюдений

Вместе с тем, установлено, что переменные ОФВ! и С позволяют разделить всех наблюдаемых на 3 группы (с высокой степенью надеяшости). Больные ХОБЛ (4 груша) четко отделятся от остальных трех групп по показателю С: наблюдение можно отнести к 4 группе, если С больше 0,45 (2 ошибки из 89 наблюдений, или 97,75% правильной классификации). При этом группы больных 3 и 4 отделяются от групп контроля и сравнения (группы 1, 2) по показателю ОФВь наблюдение относится к группам (1) - (2), если ОФВ] больше 87% (1 ршибка из 89 наблюдений или 98,87% правильной классификации).

Следовательно, информативная переменная С позволила отделить группу 4 (ХОБЛ) во всем массиве наблюдений от групп 1,2 и 3 (рис. 12). Группы 1 и 2 этой переменной не разделялись.

щ

■т

т ■ ш

СИ Си*

................. 1 1 ] . ■ ! : "1 '( (о Г ......... а............. .....................) ............. ; . и™............... : ? Н . ...... > Е: X \ 11:. 1 V. !' ; 1 1 .;

: (.Ж^Ж^КЙ л, • ................... ................. ' ; 1 5 ' ' -4У* . 5

я. \. щ: го 'Щ т

■о*:«,ад

да . да 85.. ад.

Рис. 12 Разделение наблюдавшегося контингента на группы по переменным ОФВ, и С

Другие показатели ФВД, такие как МОС50%, МОС75%, СОС25-75% также можно было использовать для разделения наблюдаемых на группы, но результат был менее выраженным.

Такие показатели, как СОЭ, число лейкоцитов и эритроцитов, ФЖЕЛ, РаС02 в каждой группе варьировали по всему диапазону значений и не позволяли выделить ни одну из групп наблюдения.

При анализе массива представленных переменных с интервалами снижения ОФВ1 в 10% от должной величины (или с шагом понижения ОФВ1 на 10%) при ОФВ) менее 80% можно говорить о наличии бронхиальной обструкции (рис.13). При ОФВ1 от 80% до 89% в данной подгруппе возможны варианты -либо человек практически здоров, либо возможно наличие начальной степени бронхиальной обструкции, у лица без явных признаков ХОБЛ.

Рис.13. Распределение лиц по убывающим величинам ОФВх с шагом в 10% по группам контроля и сравнения в по отношению к основными группами больных ХОБЛ и Б А. На осях: X - ОФВ 1 с шагом в 10%, У - число наблюдений

Выявлена высокая информативность показателя С отражающего интегральную характеристику асимметрии полученного спектра АФ клеток кожи, В отличие от данного показателя другие характеристики спектра аутофлуоресценции (!„,,«, 1_4«,1_*зо, %г параметр, Д1 - параметр), оказались менее информативными. Они могут быть использованы лишь для индивидуального исследования больных с

бронхиальной обструкцией, поскольку их связи с показателями ФВД (особенно с ОФВО оказались менее значимыми, чем у параметра С.

Анализ связи свечения клеток кожи и эритроцитов в УФ-лучах позволил установить наличие существенной связи переменной С с числом эритроцитов лишь в группе практически здоровых и больных 3 группы (рис. 14). Вместе с тем, обнаружено снижение средней интенсивности аутофлуоресценции эритроцитов от 1 группы к группе 4. При этом 1гаах эр коррелировала с Д1 клеток кожи (г - -0,278), возрастом пациентов (г = - 0,375), числом лейкоцитов в крови (г - - 0,322), а, главное, с рядом показателей ФВД: ОФВ, (г = 0,400), МОС50% (I- 0,364), МОС25% (г = 0,351).

Рис. 14. Регрессии переменной С по числу эритроцитов в группах 1 (практически здоровые) и 3 (больные БА) с уровнями значимости 0,055 и 0,03.

На осях: X - на обоих графиках количество эритроцитов * 1012 ,У - переменная С

Практическое значение имеют полученные данные о пределах изменения показателя С у практически здоровых и больных людей. У практически здоровых, больных без патологии органов дыхания и больных БА он изменялся в пределах от 0,09 до 0,31. У больных ХОБЛ1 его значения может изменяться от 0,45 до 0,56, а у больных ХОБЛ На - от 0,63 до 0,82 (рис. 15).

□ Пр:здоров ®Б&3 БОД ОБА ОХОБЛ1 О ХОБЛ 11а

Рис. 15. Границы отличий переменной С в группах практически здоровых и больных.

Эти цифры могут служить ориентиром практическим врачам для верификации начальных стадий ХОБЛ.

Обсуждение результатов.

Полученные в работе данные подтверждают, что изменения спектральных характеристик АФ клеток кожи и эритроцитов периферической крови позволяют косвенно, но с достаточной степенью информативности оценить состояние дыхания на клеточном (тканевом) уровне в организме обследуемых больных. Следовательно, спектрофотометрические показатели (С, и в меньшей степени I т,х, 1_4к, 1_<цц ) отражают интегральную оценку текущих в тканях процессов биологического окисления по отклику на кратковременную УФ-сгимуляцию.

Исследованиями установлено, что ухудшение параметров ФВД у больных ХОБЛ легкой и средней степени тяжести, при компенсированной газообменной функции и сердечной деятельности сопровождалось снижением интенсивности свечения эритроцитов (I тах зр) периферической крови. Так как в этих клетках нет митохондрий, а процессы биологического окисления редуцированны, то можно предположить, что снижение интенсивности АФ в большей степени отражает снижение интенсивности энергообменных процессов в этих клетках в целом, чем изменение активности ферментов дыхательной цепи, которые в эритроцитах имеют существенные отличия от процессов, происходящих в ядросодержащих клетках. У больных ХОБЛ эритроциты в препаратах для оценки феномена ВКЛ и в клеточной взвеси характеризуются меньшей (на 12 -18%) интенсивностью свечения, а также меньшей шириной спектра (до 570 нм).

Для клинического наблюдения за больными с бронхиальной обструкцией наиболее информативным показателем АФ клеток кожи и имеющим наиболее существенные связи с показателями ФВД представляется показатель С. Это связано с тем, что он дает интегральную характеристику изменений асимметрии полученных спектров аутофлуоресценции. Предлагавшийся ранее биофизиками показатель § недостаточно чувствителен к изменению функционального состояния организма у таких больных. Следовательно, его нельзя считать информативным маркером нарушения КД в тканях у больных с БОД. Он может лишь ограниченно использоваться при исследовании состояния конкретного больного.

В целом, полученные данные свидетельствуют о перспективности практического использования оценки спектров АФ кожи у больных с бронхиальной обструкцией для динамического неинвазивного мониторинга за процессами биологического окисления в их организме.

Выводы

1.Спектрофотометрия аутофлуоресценции клеток кожи - чувствительный, неинвазивный и удобный метод мониторинга за состоянием клеточного дыхания больных с бронхиальной обструкцией.

2. Изменения параметров спектра аутофлуоресценции клеток кожных покровов более выражены при дыхательных нагрузочных пробах, по сравнению с физическими и метаболическими нагрузками. При всех этих пробах параметр Д1 клеток кожи слабо коррелирует с 1гам эр.

3. Наиболее информативным показателем спектрофотометрии клеток кожных покровов у больных с необратимой (или частично обратимой) обструкцией является параметр С, сопряженный с работой «клеточного дыхательного конвейера», имеющий существенные связи с показателями ФВД. Спектральные характеристики аутофлуоресценции - I тах, Д1, 14551 I яо и особенно £ - менее информативны, имеют существенные индивидуальные отличия, характеризуются менее выраженными связями с функциональными и клинико-лабораторными показателями.

4. Выявлено снижение средней интенсивности аугофлуоресценции эритроцитов от 1 группы к труппе 4.

Практические предложения:

1. При исследовании клеточного дыхания у практически здоровых людей и больных ХОБЛ спектрофотометрическим методом целесообразно учитывать изменения параметра С.

2. Для верификации необратимой (или частично обратимой) обструкции у больных ХОБЛ легкой и средней степени тяжести целесообразно дополнить исследование показателей функций внешнего дыхания (ОФВ) и др.) параметрами АФ, характеризующими клеточное дыхание.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. К оценке изменений клеточного дыхания покровных тканей при локальном воздействии слабых постоянных магнитных полей// 5-ая Российская научно-техническая конференция «Электромагнитная совместимость технических средств и биологических объектов, - ЭМС-98. - СПб / РАН, РАЭлТН, РАМН, Воннно-инженерный технический университет и др. - 1998 - С, 68-69. (Соавт, Алексеева Ю.О., Бибикова Л.А., Кидалов В.Н).

2. Реакция эритроцитов движущейся крови млекопитающих на действие постоянных и импульсных электромагнитных полей низкочастотного диапазона // Фиологический журнал им. И,М. Сеченова .-1995.Т. 81.-N 12, с.115 - 120, (Соавторы: Игнатьев В,В., Кидалов В.Н., Самойлов В.О., Суббота А.Г., ' Суховецкая Н.Б),

3. Изменение конфигурации тора эритроцитов и формирование условных полиморфных стом в углеводных средах в тестировании экстремальных состояний// Проблемы оценки и прогнозирования

здоровья военнослужащих в условиях современной военной реформы/ Матер. Науч.-практ. Конф. 16-17 февраля 1995 г.- СПб.: ВМедА.- С.47 -48. (Соавт. Кидалов В.Н., Суховецкая Н.Б).

4. Люминесцентный метод анализа изменений тканевого дыхания //Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии,- Сборник материалов. - СП6.//МЗ РФ, ГНЦП, РАМН. -1997- С.45 - 46. (Соавт. Самойлов В.О., Кидалов В.Н, Бигдай Е.В.).

5. Люминесцентный метод анализа воздействий слабых магнитных полей на организм / Материалы 3-го международного симпозиума по электромагнитной экологии (ЭМС - 97).- СП6..-1997. С. 89. (Соавт. Кидалов В. Н., Комаров А. Н., Самойлов В. О.).

6. Клеточные и гуморальные реакции периферической крови на воздействия слабого низкочастотного переменного магнитного поля (ПеМП 50 Гц) //' 5-ая Российская научно-техническая конференция «Электромагнитная совместимость технических средств и биологических объектов, - ЭМС-98. - СПб / РАН, РАЭлТН, РАМН, Военно-инженерный технический университет и др. - 1998 - С. 67-68.(Соавт. Кидалов В.Н., Комаров А.Н., Малышев М.Е., Самойлов В.О., Сесь Т.П.).

7. Биофизический анализ воздействий слабых электромагнитных излучений //"Электромагнитная совместимость технических средств и биологических объектов." ЭМС-97. - С.Пб. 1997. С 57. (Соавт. Е.В. Бигдай, В.Н. Кидалов, А.Н. Комаров, В.О. Самойлов),

8. Жидкокристаллические свойства крови и возможности их применения в нетрадиционных медицинских исследованиях/ЛЗесгаик новых медицинских технологий .- 2002. - Т .IX, № 2. - 25 - 28. (Соавт. Кидалов В.Н., Хадарцев A.A., Якушина Г.Н).

9. О новых возможностях исследований малоконтрастных биологических объектов для целей экстренной диагностики состояния людей в условиях чрезвычайных ситуаций / Вестник новых медицинских технологий - 2003, Т.Х, № 1 - 2. С. 79 - 81. (Соавт. Кидалов В.Н., Куликов В.Е., Хадарцев

A.A., Якушина Г.Н.).

10. Ранние реакции периферического пула эритроцитов в регистрации последствий экстремальных воздействий на человека и животных/ Вестник новых медицинских технологий - 2003, Т.Х. К» 3. С. 59-61. (Соавт. Кидалов В.Н Красильникова Н.А, Хадарцев A.A., Якушина Г.Н.).

11. Проявления киральности в организме человека. Новые исследования на микроскопическом уровне// Вестник новых медицинских технологий - 2003, Т.Х. № 3. С. 6 - 8. (Соавт. Кидалов В.Н., Красильникова Н. А).

12. Гармония в системе клеточных субпопуляций крови. Значение вурфовых величин эршрона в оценке реакций организма на экстремальные воздействия //Проблемы гармонии, симметрии и золотого сечения в природе, науке и искусстве. Сб. научн. Трудов Винницкого государственного аграрного университета. Винница.-2003-Вып,15,- CJ92 - 203 (Соавт. Кидалов В.Н., Красильникова Н.И., Куликов

B.Е., Якушина Г.Н.).

13. Возможности биоспектрофотометрии свечения нативных покровных тканей и клеток крови // Материалы международной нучно-практической конференции «Проблемы обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях» - СПб - ГПС 27-28 окт. 2004г. С.58, (Соавт. Кидалов В.Н,, Макарова Н.В.)

14. Изменения аутофлуоресценции кожи здоровых людей при проведении дыхательных проб.// Реабилитационно-восстановительные технологии в физической культуре, спорте, восстановительной, клинической медицине и биологии. - Тула - 2004 г. С 59 - 64.

РНБ Русский фонд

2006-4 13491

Введение.

Глава 1. Аутофлуоресценция, клеточное дыхание и современные возможности его неинвазивного исследования для оценки функционального состояния организма здоровых и больных людей (Обзор литературы).

1.1. Возможности использования аутофлуоресценции тканей и клеток в медицине при патологии дыхательной системы.

1.2. Значение изменений красного ростка крови в обеспечении функций внешнего и клеточного дыхания при заболеваниях дыхательной системы.

1.3 Нарушения внешнего и клеточного дыхания при неспецифических заболеваниях дыхательной системы и способы их определения.

1.4. Технологии оценки аутофлуоресценции и возможности спектрофотометрии в регистрации клеточного дыхания живых , биообъектов.

1.5. Значение эритроцитов в процессах биологического окисления

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Характеристика экспериментальных и исследовательских наблюдений.

2.2. Клннико-лабораторные наблюдения.:.А(> V

2.3.Приборная база и методы исследования клеточного дыхания.

2.3.Ход измерений и обработки результатов.

2.4. Методы статистической обработки.

Глава 3. Собственные исследования:

Экспериментальные исследования по оценке чувствительности и воспроизводимости спектров аутофлуоресценции живых биообъектов в зависимости от функционального состояния организма

Глава 4. Сопоставление изменений показателей внешнего и клеточного дыхания у больных с бронхиальной обструкцией и у практически здоровых людей.

Актуальность исследования.

Возросшие масштабы загрязнения окружающей среды различными отходами современных производств, техногенными электромагнитными излучениями и другими искусственно созданными человеком факторами среды способствуют возникновению существенных нарушений функций различных систем организма и состояния здоровья людей. Одной из ведущих причин смертности в промышленно развитых странах становится патология органов дыхания. Так, например, за последнее десятилетие смертность от хронических обструктивных1;:,болегме>?'легких (XQ6J1) выросла на 28 % [2, 107].

Болезни, входящие в группу XO?JI с годами прогрессируют [87, 113]. При этом накапливаются изменения в иммунной системе, функциональном статусе эритроцитов, возникают признаки аутоинтоксикаций, дизэргозов, нарушений функций газообмена- и биологического окисления (или клеточного дыхания) и гемореологические нарушения [37, 77, 122]. До сих пор, диагностика и наблюдение (мониторирование) за больными in situ и за изменениями дыхательных функций представляет во многом сложную' проблему [91, 92]. Ряд исследователей отмечает тесную связь между изменениями общесоматических функциональных показателей с симптоматикой ХОБЛ и выраженностью морфологических изменений в различных органах и системах, включая систему крови [87, 88]. Последняя оказалась высоко чувствительной к воздействию различных стресс-факторов [126, 136].

Установлено, что характер изменения функции дыхания при хронических заболеваниях зависит от реактивности организма конкретного человека. Важными компонентами такой реактивности являются ферментные системы, обеспечивающие клеточное дыхание, то есть процессы биологического окисления, сопряженные с энергообменом в покровных и внутренних тканях, а также клетках крови и, особенно, в ее самой многочисленной клеточной компоненте - эритроне [23, 26].

В последние годы определены зависимости основных функций эритроцитов и их движения по сосудам от электродинамических*/ механических и морфологических характеристик клеток. Установлено, что ч конфигурация эритроцитов в значительной степени влияет на кинетику крови в целом и имеет существенные связи с уровнем обмена веществ и энергии в тканях [43,45].

Изменение формы эритроцитов во многом определяет их структурнофункциональную полноценность, определяет реакцию эритроцитов в потоке < крови при воздействии на организм внешних электромагнитных полей, других физических факторов и при развитии патологии [31, 35,130, 153]. Показано, что между участками макро- и микрососудистого русла (мест основного функционирования эритроцитов) в здоровом организме имеют место гармоничные причинно-следственные отношения, которым I.W. Forrester дал название "петли обратных связей". В них, как в замкнутых цепочках взаимодействия, могут развиваться явления не тольк$„ находящиеся в связи с предшествующими событиями, но (по его мнению) и не находящиеся в такой связи. Указанные связи могут оказаться мишенями патологических процессов или внешних воздействий, способных влиять на дыхательную и другие системы и вызывать разнонаправленные реакции эритрона, изменения функций внешнего дыхания и газообмена в тканях [47, 63]. Так увеличение уровня гемоглобина и количества эритроцитов в крови наблюдаются в период адаптации человека к относительной гипоксии npiF нахождении в условиях Арктики, Антарктики или высокогорья и при длительном течении ХОБЛ [ 17, 18, 30 ].

Выраженное изменение числа циркулирующих по сосудистой системе эритроцитов, хотя и вызывает включение компенсаторных реакций (транзиторное усиление пролиферации эритроцитов и гиперплазию красного костного мозга и др.), но нередко, сопровождается нарушениями капиллярного кровотока (спазмами и парезами артериол, полнокровием венул, расширением капилляров со сладжированием и стазированиелг' кровотока в них). Подобные изменения микроциркуляции изменяют электрический заряд эритроцитов, активность характерных для них гликолитических процессов и ведут к изменениям их формы [3, 23]. В итоге, все это закономерно приводит к нарушению газообмена и клеточного дыхания различных тканей. Однако до сих пор конкретные характеристики нарушения этих процессов у больных исследованы недостаточно.

Ряд работ Б.Чанса и его последователей [94, 97, 108, 123] обусловил возможность использования биоспектрофотометрии для оценки функциональных изменений состояния клеточного дыхания живых клеток и -систем различного уровня организации с использованием их ультрафиолетового зондирования с последующим измерением их нативной флуоресценции (аутофлуоресценции). Однако в настоящее время лишь в небольшом числе исследований даются конкретные рекомендации nq„ использованию аутофлуоресценции для оценки изменения клеточного дыхания. Такие рекомендации практически отсутствуют для больных с бронхолегочной патологией, хотя фундаментальными исследованиями установлено, что нарушения процессов внешнего дыхания и газообмена и у таких больных закономерно приводят к изменениям обмена веществ на тканевом и клеточном уровне [47, 79].

В работах, в которых исследовались изменения функции внешнего" дыхания (ФВД) при XQ67I показано, что уменьшение ОФВь нарушение вентиляционно-перфузионных отношений, транссосудистого обмена, дисбаланс кровотока между суженными и расширенными легочными сосудами, нарушения гистоструктуры воздухоносных путей, возникновение деформаций аэрогематического барьера существенно осложняют насыщение крови кислородом, а также тканевой обмен, включая процессы внутриклеточного биологического окисления. [108, 121]. Вместе с тем, вне поля зрения исследователей, как правило, оказываются возможности использования для оценки изменений клеточного дыхания, анализа спектров флуоресценции живых клеток и тканей больного организма.

Это обусловливает необходимость изучения взаимосвязи между характером хронических заболеваний дыхательной системы и спектрофотометрическими показателями аутофлуоресценции, сопряженными с клеточным дыханием для целей неинвазивного мониторинга за t» состоянием организма больных X06JI.

Цель исследования: оценить диагностическую значимость ряда характеристик спектра аутофлуоресценции клеток покровных тканей и л крови практически здоровых, а также больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Задачи исследования

1. На основе экспериментально-клинических наблюдений оценить чувствительность и информативность спектрофотометрического метода исследования аутофлуоресценции, а также возможность его использования для мониторинга изменения состояния здоровья больных с хроническими обструктивными заболеваниями легких.

2. Исследовать взаимосвязь изменений спектров аутофлуоресценции клетои кожных покровов и эритроцитов периферической крови при использовании функциональных нагрузочных проб, применяемых в клинике.

3. Выявить особенности аутофлуоресценции клеток покровных тканей и эритроцитов у больных с бронхолегочной патологией и определить диагностически значимые спектрофотометрические маркеры нарушения клеточного дыхания.

Научная новизна.

Впервые уточнены спектрофотометрические параметры КД, наиболее чувствительные к нарушениям ФВД у больных ХОБЛ.

На основе статистического анализа результатов установлена взаимосвязь изменений спектра АФ кожных покровов у больных ХОБЛ с показателями внешнего дыхания. Эти связи могут быть использованы при диагностике и контроле за лечением ХОБЛ. С помощью параметра С выявлена f» возможность верификации некоторых болезней органов дыхания.

Установлена зависимость спектральных характеристик АФ эритроцитов периферической крови от степени нарушения ФВД.

-> Положения, выносимые на защиту

1. Определение в реальном масштабе времени параметра С и других параметров спектра АФ может быть использовано для динамического** наблюдения за работой «клеточного дыхательного конвейера» у больных ХОБЛ легкой и средней степени тяжести в процессе лечения.

2. Параметр С более информативен для определения нарушения функции клеточного дыхания у больных ХОБЛ по сравнению с параметром ^.

3. Изменение аутофлуоресценции кожных покровов коррелирует с нарушением ФВД у больных ХОБЛ в отличие от аналогичных показателей, определяемых у больных БА.

Практическая значимость работы и ее реализация

При исследовании клеточного дыхания у практически здоровых людей и больных ХОБЛ спектрофотометрическим методом целесообразно учитывать изменения параметра С.

Для верификации необратимой (или частично обратимой) обструкции у больных ХОБЛ легкой и средней степени тяжести целесообразно дополнить исследование показателей функций внешнего дыхания (ОФВ1 и др.) параметрами АФ, характеризующими клеточное дыхание.

Апробация работы

Проблемы оценки и прогнозирования здоровья военнослужащих в условиях современной военной реформы. - Науч.- практ. конф. 16-17 февраля 1995 г.- СПб.: ВМедА.

Третий международный симпозиум по электромагнитной экологии (ЭМС - 97). - СПб.-1997, Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии. - СП6.//МЗ РФ, ГНЦП, РАМН. -1997.

5-ая Российская научно-техническая конференция «Электромагнитная совместимость технических средств и биологических объектов. - ЭМС-98. - СПб / РАН, РАЭлТН, РАМН, Воннно-инженерный технический университет и др.- 1998.

Научно-практический конгресс «Интегративная медицина - новая идеология здравоохранения России» . - СПб.: ВМедА, 2002.

Проблемы гармонии, симметрии и золотого сечения в природе, науке и искусстве. Конференция Винницкого государственного аграрного университета. Винница. - 2003.

Международная научно-практическая конференция «Проблемы обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях». - СПб.: ГПС, 27 - 28 октября 2004 г. - С.43.

По теме диссертационного исследования опубликовано 14 научных работ.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования и основные положения диссертации используются во ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России ( г.Санкт-Петербург) и в ГУП НИИ новых медицинских технологий (г.Тула).

Структура и объем диссертации:

Объем диссертации 147 с. Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения материалов, заключения, выводов, 8 приложений и списка литературы {113 отечественных и 41 зарубежных источников), 8

Результаты исследования свидетельствуют о более интенсивном свечении ладонной поверхности в области БАТ Лаогун, чем снаружи кисти в зоне анатомической табакерки или на наружно-боковой поверхности мизинца.

Прнложснпе 4

Изменение аутофлуоресценции (АФ) тканей и клеток крови живых организмов при воздействии электромагнитных волн низкочастотного диапазона

Все живое на Земле и, особенно, человек находится под постоянным воздействием малоинтенсивного искусственного электромагнитного поля в диапазоне от крайне низких до крайне высоких частот, что может сказываться на работе клеток различных систем [52, 152, 176]^.

Не вызывает сомнений факт эффективности воздействия слабых нихкочастотных электромагнитных полей (НЧ ЭМП) на живые организмы (в частности на человека) [13, 22,165]. НЧ-терапия успешно используется при различных заболеваниях пищеварительной, сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата, дыхательной системы, урогенитального тракта, кожных заболеваниях, эндокринной патологии, в стоматологической практике, педиатрии [98,111].

Оценка АФ при слабых воздействиях на биообъект переменных НЧ ЭМИ проведена с учетом того, что в отношении макроорганизма является установленным факт влияния ЭМИ на перемещение ионов, на свойства иммунной системы, свойства китайской акупунктурной системы меридианов, которая объединяет во взаимодействии циркуляторную, нервную, эндокринную и иммунную системы [26,148, 176].

Ниже представлены материалы по аутофлуоресценции клеток покровных тканей, формы и характера флуоресценции клеток крови при воздействии на организм человека НЧ ЭМИ.

На описанном в Главе 2 стенде, состоящем из катушек , соединенных с генератором сигналов специальной формы Г6-36 и позволявшем генерировать низкоинтенсивные ЭМИ различной частоты в аутоэксперименте исследованы изменения АФ клеток кожи под воздействием в течение 1 минуты на область предплечья или кисти руки человека (обследовано 6 человек) низкочастотного ЭМИ с частотами, соответствующими начальным числам гармонического ряда Фибоначчи - от 1 до 34 Гц.

Обычными лабораторными методами (подсчет лейкоцитограммы) оценить ответную реакцию в процессе облучения не удалось. Очевидно, что это было связано с тем, что прокол пальца для забора крови представлял собой более интенсивный стресс-агент, чем воздействие НЧ ЭМИ указанной низкой интенсивности. УФ-флуоресцентная биоспектрофотометрия оказалась более чувствительным методом регистрации влияния НЧ, чем определение гемограммы. Воздействие НЧ ЭМП на локальный участок тела (на пальцы или предплечья рук) было абсолютно безболезненным. Однако и оно вызывало индивидуальные ответные реакции АФ в ответ на УФ-возбуждение их кожных покровов, что регистрировалось спектрофотометрией на протяжении 5 минут, с интервалами в 1 минуту.

2>s>

Так у С. (рис. >) наиболее выраженное увеличение АФ кожи наблюдалось после облучения руки НЧ ЭМИ с частотой 13 Гц, а наиболее выраженное снижение свечения выявлялось на частоте 21 Гц.

Рис/30. Изменение аутофлуоресценции кожи в аутоэксперименте с НЧ ЭМП у практически здоровых мужчин С. и К.

К фоновым значениям уровни интенсивности аутофлуоресценции покровных тканей возвращались у всех испытуемых (6 чел) в интервале 7-9 минут после облучения НЧ ЭМП.

Таким образом, в этом исследовании обнаружена индивидуальность ответной реакции живого организма на НЧ ЭМИ.

Результаты этого эксперимента показывают, что при исследовании спектров АФ биообъекта необходимо исключить воздействие на него промышленных ЭМП НЧ (от 1 до 50 гц) и не начинать эти исследования ранее, чем через 10 минут после такого воздействия.

1. Агроскин Л. С Папаян Г. В. Цитофотометрия. Л., Наука, 1

2. Физический практикум электричество и оптика. 1968.- 665-679.

3. Антонов Н.С, Стулова факторы риска, О.Ю., Зайцева О.Ю. Эпидемиология, В кн.: Хронические профилактика. М. Наука, обструктивные заболевания легких. М.: ЗАО «Изд-во Бином», 1998.-С. 6 6 8 1

4. Алексанин С., Лесничий В.В. и др. Морфофункциональная характеристика клеток крови у людей, длительное время проживающих на радиоактивно-загрязненной местности Отчет о НИР 8-95-В2 "Вагранка": ВМедА. СПб. -1995. 133 с.

5. Аронов Д.М. Функциональные пробы с физической нагрузкой. Руководство для врачей Под ред. Е.И. Чазова. М. -1992.,Т.1 350 с.

6. Архипов М.Е., Субботина Т.И., Яшин А. А. Киральная асимметрия биоорганического мира: теория, эксперимент. Тула: «Тульский полиграфист». 2002. 242 с.

7. Айсанова З.Р., Кокосов А.Н., Овчаренко СИ. и др. Хронические обструктивные болезни легких. Федеральная программа. М.: МЗРФ, ВНО Пульмонологов. Б.г., 6.N.

8. Акоев И.Г., Мотлох Н.Н. Биофизический анализ предпатологических и 1984.-288 с.

9. Айсанова З.Р. Механизмы ограничения физической работоспособности у больных хроническими обструктивными заболеваниями легких.: Автореф. дисд ра мед.наук. М., 1994. -235 с.

10. Барановский А.Ю. Способ определение деструктивнопредлейкозных состояний. М.: Наука,

11. Бретшнайдер Б., Курфюрст И. загрязнений: 1989. -288с.

12. Биолюминесценция медузы Aequorea t1p://www.fbm.msu.rii/Academics/Manuals/BioPhvs/BPh01/hem m eth /hemBS.html) 14. 15

13. Берстон М. Гистохимия ферментов. М.: Мир, 1965. 464 с. Браун Г. Уолкен Дж. Брумберг Жидкие кристаллы и биологические структуры: М.: «Мир», 1982. 198 с. Е.М., Барский И.Я., Папаян Г.В. Двухволновой микрофлуориметр Оптико-механическая промышленность. 1967.-N 9, с. 62.

14. Бурлакова Е.Б. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веш,еств и физических факторов низкой интенсивности//Росс. химический жури. 1999, Т. XLIII. 5. 3-11. 18.

15. Васильев Е.П.Хронический бронхит в условиях Якутии//Автореф. дис. д-ра мед. наук, М., 1992. 28 с. Величковский Б. Т. Молекулярные и клеточные 9 1 8

16. Владимиров Ю. А., Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в основы экологической пульмонологии Пульмонология.- 2000.— 3.— Охрана воздушного бассейна от Технология и контроль:Пер.с англ. Л.:Химия, //Оптико-механическая промышленность.-

17. Владимиров В.А., Измалков В.И. Катастрофы и экология. М.: ЦСИГЗ, 2000. 380 с.

18. Владимиров Ю.А., Бурштейн Э.А. Спектры люминесценции ароматических аминокислот и белков Биофизика. 1960. Т.5, N 4 C 3 8 5 391.

19. Воробьев А. И. (ред.). Руководство по гематологии. М.: Медицина, 1985.- Т. 1 2 370 390.

20. Гречканев О.М., Сенников П.Г., Татарский А.А. спектральных методов анализа в Применение оценке биологического действия промышленного загрязнения //Измерительная техника.1992.-№3.-С.61-62.

21. Государственный (правильность и стандарт Р ИСО 5725-2-2002 методов и «Точность результатов прецизионность) измерений. Часть 22. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений. М.: Изд. официальное.

23. Горяйнов И. И., Князева Л. А., Князева Л. И., Конопля А. И., Конопля Е. Н. Иммуномодулирующее действие эритроцитов после магнито-лазерного облучения ВПМТ.— 1996.- Т. 3, 1. 34-36.

24. Гублер Е.В., Генкин А.А., Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л.: Медицина, 1973. 110 с.

25. Гурвич А.А., Еремеев В.Ф., Карабчиевский Ю.А. Энергетические основы митогенетического излучения и его регистрация на фотоэлектронных умножителях. М. —1974, 98 с. 34. 35.

27. Жилина Н.М. Прогностический индекс эндогенной интоксикации Вестник новых медицинских технологий. 1998.- Т.5, 3 4. 81- 84. 38.

28. Загрядский В.П., Сулимо-Самуйло З.К. Методы исследования в физиологии труда. Л.: ВМедА, 1991. 110 с. Захарова Н.Б., Хвостова Н.В., Шведова Р.Ф. Значение эритроцитарных повреждения белкового и липидного состава мембран в развитии снижения текучих свойств крови при экстремальных состояниях Вопросы мед. химии. 1991. Т. 1.

29. Заславская P.M., Векленко Г.В., Тейблюм М.М. Временная организация функции внешнего дыхания у больных хронической обструктивной 41. 42. болезнью легких пожилого возраста Клиническая медицина. 2004. -Т.82. №7. 36

30. Заидель А. Н., Островская Г. В., Островский Ю. И. Техника и практика спектроскопии. М. Наука, 1976., гл. 13. 333

31. Зуев B.C., Ушаков И.Б., Окунев A.M. Электромагнитные излучения как СИ-19. 43.

33. Игнатьев В.В., Кидалов В.Н. Образование эхиноцитов как релаксационный процесс.//Тез.док.1У международной технических конференции "Электромагнитная 493 495.

34. Информационные медико-биологические технологии/ Веревкин Е.Г. и др. под ред. Княжева В.А., Судакова К.В.. М.: ГЭОТАРМед.-2002.-280с. 47. 48.

35. Иржак Л.И. Дыхательные функции крови в индивидуальном развитии млекопитающих. М.-Л.:Наука. -1964. 184. с. Кадомцев.Б. Б. динамика и информация. М: Изд-во ред.журн. «Успехи физ. наук». 1997. 400 с. Калинина Н.М., Дунягина Н.М., Давыдова Н.И. и др. совместимость фактор геронтологического риска//Актуальные проблемы интегративной медицины. Воронеж-Москва., 2001. средств и биологических объектов." ЭМС-96. СПб. -1996.

36. Каманина Н.В., Кидалов В.Н. Изучение эффекта выравнивания эритроцитов в нематическои жидкокристаллической среде Письма в ЖТФ. 1996. Т.22, вып.14. 39 42.

37. Каманина Н. В. Отличие и взаимосвязь эффекта ориентирования эритроцитов в нематическои жидкокристаллической среде от электрических вибраций Frohlicha Письма в ЖТФ.- 1997.- Т. 23, 2 3 С 7 2 4

38. Карнаухов В. Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки. М., 1978.-208 с.

39. Кетлинский А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. Спб.: Гиппократ. 1992. 256 с.

40. Кидалов В.Н. Красные клетки 1фови эритроциты в новых информационных технологиях контроля за состоянием здоровья.

41. Кидалов В. Н., Лысак В. Ф. Квантитативная эритрограмма и возможность ее использования в клинике и эксперименте Лабораторное дело.- 1989.- 8.- 3 6 40.

42. Кидалов В. П., Комаров А. П., Самойлов В. О. и др. Люминесцентный метод анализа воздействий слабых магнитных полей на организм Материалы 3-го международного симпозиума по электромагнитной экологии (ЭМС 97).- СПб.: ГК РФ по высш. образованию, Минсвязи РФ, МАНВШ и др., 1997.-С. 1 2 0 122.

43. Кидалов изменений В.Н., Якушина Г.Н. и Значение свечения дисгармонических эритроцитов при конфигурации выстраивании ими краевой линии. Матер.науч.конф., посвящ. 80-

44. Комлев А.Д., Калинина Н.М., Сысоев К.А. и др. Цитокиновый профиль у больных хронической обструктивной болезнью легких //Мед. иммунология. -2002. Т.4.№ 1. 87- 92

45. Кларк Дж. М. Токсическое действие кислорода Медицинские проблемы подводных погружений. Пер. с англ. 190- 246. 60.

46. Ютиорин Л.И., Тиунов Л.А. Функциональная неравнозначность эритроцитов. Л.: Наука, 197. 125 с. Коркушко О.В,, Иванов Л.А,, Вентиляционная функция легких у больных хроническим бронхитом пожилого старческого возраста //Терапевт.архив. 1995. №3. 11- 12.

47. Клячкин Л.М., Щегольков А.Л. Курортная терапия в практической

49. Кост Е.А.. Люминесцентная микроскопия в гематологии. Справочник по клинико-лабораторным методам исследования. М.: Медицина, 1975.- 191 -231

50. Хроническая обструктивная патология легких у взрослых и детей. Руководство для врачей Под редакций проф. Кокосова А.Н. СПб., СпецЛит, 2004. 304 с.

51. Корягин А. С, Ястребова А. А., Крылов В. Н., Корнаухов А. В. Влияние миллиметровых волн на устойчивость мембран эритроцитов, перекисное окисление липидов и активность ферментов сыворотки крови Миллиметровые волны в биологии и медицине".- 2000,- 2(18). 7- 9. Г.И. пульмонологии Интерпретация //Новые Санкт-Петербургские крови и мочи. М.1988. врачебные ведомости. -2000. 3. 67 -67 анализов ЬСлиническое значение анализов. М.: АОЗТ «САЛИТ» 1995.

52. Кукес В.Г., ЦойА.Н. Оценка клинической эффективности препарата тровентол при бронхоспазме различного генеза Новые возможности бронхорасширяющей терапии. -Л.:

53. Farmos Report (Farmos Group LTD, Finland. 1990. Vol.5. Ser.A.- 1 P 2 4 3 3

54. Кузнецова B.K., Кирюхина Л.Д. Диагностические возможности спировелоэргометрии в выявлении начальных нарушений газообмена Сб.матер. Всеросс. Науч.-практ. Конф. «Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии» СПб.: МЗ РФ, РАМН, ГНЦП МЗ РФ. 1997. 61 63.

55. Кулаков Ю.В. Диагностика и лечение магнитотропных заболеваний легких. Новые Санкт-Петербургские врачебные ведомости. 1999. №1. 56 58 70. 71.

56. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986.-250 с. Ленниджер А. Основы биохимии (пер. с англ.) 1985. Т 2 7 3 1 с. Левкова Е.А., Хомчук Т.Ф., Басова Е.А. и др. Дифференциальнодиагностические и лечебно-тактические аспекты хронических обструктивных заболеваний легких. Материалы третьего Всемрфного конгресса по иммунологии и аллргологии Аллергология и иммунология. 2004. -Т.5,

57. Лисовский В.А., В.В. Щедрунов, Барский И.Я. Напаян Г.В., и др. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии. Л.:Наука, 1984.-236 с.

58. Лисовский В. А., Кидалов В. Н., Гущ В. В. Трансформация эритроцитов как диагностический тест в клинической практике Лабораторное дело.- 1986.- 10.- 594- 598.

59. Луцик Т.К. Исследование промежуточных продуктов импульсного радиолиза флавоноидов: Дис. на соиск. уч. степени М.: Мир.

60. Методы проточной цитометрии в медицинских и биологических исследованиях Под. ред. М. Потапнева. Минск: Б АН. 2003. 305 с.

61. Муромцев В. А., Кидалов В. Н. Медицина в 21 веке. От древнейших традиций до высоких технологий. СПб.: ИНТАН, 1998.-131 с. 81.

62. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах.-М.: Мир. 1984.—214 с. Нефедов Е. И., Протопопов А. А., Хадарцев А. А., Яшин А. А. Биофизика полей и излучений. Часть

63. Физико-биологические основы информационных процессов в живом веш;еств. Тула, 1998.-С. 117-192

64. Нестеренко А.О., Кузнеченков В.П.,Симоненко В.Б. Новое в гигиеническом 84. нормировании неионизирующих излучений //Тез.докл.науч.конф. Л. 1989. 50

65. Немцева Е. В. Высшие электронно-возбужденные состояния в бактериальной исследования биолюминесценции: спектроскопические (http://asf.ur.ru/VNKSF/Tezis/v7/Base/Tesis.php-

66. Никифоров A.M., Каташкова Г.Д., Шишмарев Ю.Н. и др. Диагностика и медицинская реабилитация ликвидаторов аварии на ЧАЭС и других радиационных катастроф: Информационное письмо.— М.: 1995.- 66с.

67. Овчинников М.М., Подгорный Г.Н. Влияние нехроматичности излучения на отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бэра при фотометрических измерениях в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях //Клиническая лабораторная диагностика. -2004,№3,С. 1 6 2 1

68. Овчаренко СИ. Хронические обструктивные заболевания легких (современны концепции и перспективные 88. направления) Терапевтический архив. 1996. 8. 86 —

69. Палеев Н. Р., Ильченко В. А. Болезни органов дыхания: Руководство для врачей Под ред. П. Р. Палеева.- М., 1989.- Т. З.-С. 110-176.-Т.1.-С.112-459.-Т.2.-С. 5 1 7

70. Петросян В. И., Лисенкова Л. А., Синицын Н. И., Киричук В. Ф. Теория и практика спектрально-волновой диагностики и прецизионно-волновой терапии Радиотехника. 1996.- 9. 35-43.

71. Печатников В. А., клеточных суспензий 1985.- 87-106. 91.

72. Путов И. В., Федосеев Г. Б. Руководство по пульмонологии. Л.: Медицина, 1984.-С. 20-

73. Путинцева О.В., Артюхов В.Г., Калаева Е.А. Оценка состояния фотоповреждения хромофоров гемового и глобинового компонентов УФ-облученных молекул и электрофоретических Корнеев В. Н., Афанасьев В, П., методом проточной цитофлуориметрии. Печатникова Л. М. Комплекс для статистического анализа Сб. Автоматизация цитологических исследований. Пущино.

74. Романовский Чернавский Математическая биофизика М.: Наука. —1984. 304 с. Рогаткин Д.А., Моисеева Л.Г., Современные методы биоспектрофотометри. Барыбин В.Ф., Черный В.В. лазерной в клинической биофотометрию Введение

75. Самойлов В.О. Элементы квантовой биофизики. СПб СПбГТУ, 2001.-43 с. Стандарты (протоколы) диагностики и лечения неспецифическими 97. заболеваниями легких. Приказу МЗ РФ 300 от 09.10.1998. 40 с. Соловьев В.Н., Самойлов В.О. Исследование люминесценции пиридин-нуклеотидов и флавопротеидов в зоне рецепторного эпителия языка лягушки.- Физиол. журн. СССР. -1977а. Т.63, N 10, с. 1476-1478.

76. Табеева Д.М. Руководство по иглорефлексотерапии. М.: больных с к Приложение

77. Таппоне М.В. КВЧ-пунктура. М.: Логос, Колояро. 1997. 314 с. Угарова Н. Н. Бровков Л. Ю. Взаимосвязь структуры белковой глобулы и спектров биолюминесценции люциферазы светляков Известия Академии наук. Серия Химическая. 2001, 1670 1679. 105.

78. Федосеев Г.Б. Хронический бронхит/ТНовости фармакотерапии. 2000.-№7.-С.11-

79. Хабибулова З.И., Вишневский А.А., Захаров Г.А. и др. Инфракрасный анализ структуры эритроцитарных мембран при бронхиальной астме//Медицинский академический журн. 2003. 3 С 166-167.

80. Чучалин А.Г., Шварц Г.Я. Тровентол в профилактике и лечении хронических 108. обструктивных болезней легких. М.: РЦ «Фарммединфо». 2003. 312 с. Черногрядская Н. А., Розанов Ю. М., Богданова М. С Боровиков Ю. Ультрафиолетовая флуоресценция клетки.М.: Наука, 1978. 280 с.

81. Щербаковский З.С.. Фотометрические характеристики элементов оптических систем и их измерение. Учебное пособие (ЛИТМО). Л 1990.- 90с. ПО.

82. Шмелёв Е. И. Хроническая обструктивная болезнь лёгких Терапевтический архив. 1999.- Т. 71, 12. 74—

83. Шевелкин А.В. Установка для прижизненной флуоресцентной микроскопии с системой компьютерного анализа изображения// Вестник новых медицинских технологий.-2003. Т. X, 4. 65 -66.

84. Эткинс П. Порядок и беспорядок в природе Пер. с англ. М. 1987.-218 с.

85. Aizava R. Endoscjpic detection of Hematoporphirin derivative fluorescein tumors/ZLasers and Hematoporphirin derivative in Cancer.Tokio. 1983. P.21 24.

86. Balode Z. Assessment of radio-frequency electromagnetic radiation by the micronucleus test in bovine peripheral erythrocytes Science of the Total Environment. 1996. Vol. 180, N. 1. P. 81 85. 116. 117. 118. 119.

87. Bolin B. The carbon cycle Scientific American. 1970.— Vol. 223, N.3.-P. 124-

88. Bohinski R.S. (Бохински) Современные воззрения в биохимии.— М.: Мир. 1987. 544 с. Buist A.S. Risk factors for COPD//Eur. Resp. Rev.-1996.-Vol.6. P 253-258. BTS guidelines for manegement of chronic obstructive pulmonary disease// Thorax. 1997. Vol.5. (Suppl), S.l 2 8 Eker C Montan S., Jaramillo E. et al. Clinical spectral characterization of colonic mucosal lesions using autofluorescence and delta aminolevulenic acid serialization//Gut. 1999. Vol. 44. P.511-518.

89. Chance В., Thorell B. Fluorescence measurements of mitochondria pyridine nucleotide in aerobiosis and anaerobiosis Nature. 1959. Vol. 184, N 4691. P.931. 122.

91. Structure, Mechanizm and Biochemistry/ Ed. P.R. Ortiz de Montellano. N.Y. London, 1988. P. 345 385, Chance В., Schoener В. Fluorometric studies of flavin component of

92. Chance В., Williams G.R. The respiratory chain phosphorylation// Adv. Enzymol. 1956. V. 17. P. 65

93. Global initiative for chronic obstructive lung diseases. NHLBJ/WHO Workshop.-2

94. Galvanovskis J., Sandblom J., Bergqvist В., Gait S., Hamnerius Y. The influence of 50-Hz magnetic fields on cytoplasmic Ca oscillations in human leukemia T-cells Science of the Total Environment. 1996. Vol. 180, N. 1. 127. 128. and New York. 1977. P.

95. Grundler G.,Kaiser F., Keilmann F. Walleczek J. Mechanisms of electromagnetic 129. interaction with cellular systems Naturwissenschaften. 1992. -Vol.79. P. 551 559. Han Z.Y., Chen M., Lu J.R. et all. Hypoxia induced increase of MDA and echinocytes fi"om etrythrocytes in rabbits blood with special reference to inhibition Physiologica. 130. 131.

96. Hilton G. Effects of thermal trauma on dog erythrocyte ATP-ase and shape Bums. 1985. Vol. 12. N 2. P.78

97. Henry J. B. (Ed.)Clinical diagnosis fiid management by laboratory methods. 18* ed. Philadelphia: W.V.Sanders Co, 1991 860 p. Howard Petty http://www.fbm.msu.ru/Academics/Manuals/BioPhys/BPhO 1 /hem_me th/hemB6.html 133. 134. http://www.krugosvet.ru/articles/02/l 000292/1000292al .htm. Hursts the Hearyt. (USA, 10* ed.: Valentin Fuster, R.Wayne Alexander, Robert A.O Rourke). Companies Inc. 650 p. 2001:.The McGraw-Hill of the increase by MPEG-SOD.//Acta P. 19-

98. Chandrasekhar S. Liquid Crystals Cambridge Univ.Press, London

99. Ivkova М. N., Pechatnikov V. A. and Ivkov V. G. Mechanism of fluorescent Response of the Probe Dis. 1984, C. 3 7.

100. Kaiser F. Coherent oscillations their role in the interaction of weak ELM-fields with cellular systems// Neural Network World. 1995. Vol. 5 P 7 5 1 7 6 2

101. Kamanina N. V., Kidalov V. N. A studi of the lining up of red blood cells in a nematic crystal medium Tech. Phys. Lett. 1996. Vol. 22, N.

102. American Institute of Physics. P. 5 7 1 572.

103. Khodr Hicham, Hider Robert C Catherine A. Jonathan E. Brown, Riceevans. Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant propertiesx Journal of Biochem. 1998, Vol. 330. P. 1173 1178.

104. Kreuzer F., Yahr W.Z. Influence of red cell membrane of diffusion oxigen Journal of Appl. Physiol. 1960. -V.15. N.6. P.1117 1122.

105. Marino A. A. Time-dependent hematological changes in workers exposed to electromagnetic fields American Industrial Hygiene Association Journal. 1995. Vol. 56, N. 2. P. 189 192.

106. Falk В., Owman C.H. Detailed metodoloqycal description of the fluorescence method for the cellular demonstration of bioloqical monoamines //Acta universitatis ludensis, section 11. 1965. P. 7 49.

107. Wanner A., Salathe M, ORiordan Т.О. Mucocilyare Clearence in the airways// Amer. Journal of Respir. Crit. Care Medicine. 1996. Vol.154.-P.1868-1902.

108. Petty, H. R., Worth, R. G., Kindzelskii, A. L. Imaging Sustained Dissipative Patterns in the Metabolism of Individual Living Cells Physical Review Letters. 2000, 84, P. 2754 2757).

109. Revina A.A. Proceedings. Radiation-chemical contribution to the study of polyfunctional activity of natural pigments The Ill-d Int.

110. Refvem Olav K, Morland L.Rehabilitation programme for chronic obstructive lung disease Joint Russian-Norwegian conference "Ac6tual Problems of Pulmonology" SPb. 4 5 June. 2004. -P.39.

111. Roshchupkin D. I., Kramarenko G. G., Anosov A. K. Effect of extremely low frequency electromagnetic radiation and ultra-violet radiation on aggregation of thymocytes and erythrocytes Biofizika. 1996.-Vol. 41, N. 4 P. 866-869.

112. Sidorov V., Mayackay M. The determinan on of blood in material evidence with luminescent methods// Medicina Legalis Baltica. 1999.-Vol.11.-P. 5 5 5 8

113. Siggaard-Andersen O., Ulrich A., Gothgen I.H. Classes of tissue hypoxia. //Acta Anaesthesiologica Scandinavica. Supplementum. 1995.-B.107.-P.137-142.

114. Sipoez Т., Urobaroba K. Influence of radiation on shape of Erythrocytes Acta Phys Univ Comenianae.- 1985.- V. 26.- 163 p.

115. Siafaras N.M.,Vermere P..Pride N. at al. Optimal assessment and management of chronic obstructive pulmonary Diseases (COPD)// Eur.Resp. Journal.- 1999. V o l 8 P.1398 1420.

116. Schmid-Schonbein H., Rieger H., Fischer T. Blood fluidity as consequence of cell fluidity: flow properties of blood and flow behavior of blood in vascular diseases// Angiology. 1980. V.31. P.99-121. 152. The British Guidelines of Asthma Management: 1995 review and position statement. Thorax, 1977.-52 suppl. I. P 1 2 1

117. Traikov L. L, Markov M. S., Kuzmanova M. A., Ivanov S. P. Use of lectins as indicators for magnetic field action on erythrocyte membranes Reviews on Environmental Health 1994.- Vol. 10, N.

118. Tweeddle P.M., Legget R.I., Fleney D.C. Effect of chronic hypercapnia on erythrocyte pH and oxygen binding of haemoglobin Bulletin European de Physiopathologie Respiratorie. 1976. N 12. 125 -127.

119. Tomasbarberan F,A., Blazquez F.F.M.A., Garciaviguera C, Tomaslorente F. HPLC of honey flavonoids Journal of Chrom. 1993.-Vol. 634.-P. 4 1 4 6