автореферат диссертации по безопасности жизнедеятельности человека, 05.26.02, диссертация на тему:Влияние физиологических, экстремальных и патологических состояний организма на рост тканей при культивировании

ргб од

!.-[( гг.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

АРХАНГЕЛЬСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На нравах рукописи УДК: 612.014:578.085.23

ПАЩЕНКО Владимир Петрович

ВЛИЯНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ, ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ОРГАНИЗМА НА РОСТ ТКАНЕЙ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

05.26.02 - безопасность, защита,- спасение и жизнеобеспечение населения в чрезвычайных ситуациях

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

лгглштлъск

Работа выполнена в' Архангельской государственной медицинской якадемии

Научные консультанты:

доктор биол. наук Л. Г. РУЕИЮЕА; доктор медицинских наук, профессор ЛИ. СИДОРОВ.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А. А. ЖАВОРОНКОВ; доктор медицинских наук, профессор Р. Е КАЛА1ШИК0Е; доктор медицинских наук, профессор а Н. АЛЕУТСКИЙ.

Ведущая организация: Институт медико- биологических проблем Государственного научного центра Российской Федерации

Защита диссертации состоится ¿Р^исМ/ ХЪЪЬ. г.

в " /Ь^ часов на заседании специализированного совета Д 034.60.01 при Архангельской государственной медицинской академии по адресу: 163061 г.Архангельск, пр. Троицкий,51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Архангельской государственной медицинской академии.

Автореферат разос^н

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

-1-

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Рост и обновление клеток являются основными физиологичес-;ши процессами в организме, которые тесно связаны с обменом земств и энергии, адаптацией, ■ регенерацией, старением, пато-гнезом заболеваний.

Изучение этих явлений в последние десятилетия проводится а всех системных уровнях,о привлечением всего многообразия □временных математических, физико-химических и медикобиоло-ических методов ( А. И. Зотин, 1974; R С. Мицкевич, 1974; А Д. нознер, 1975; Л. В. Полежаев, 1977; ИМ. Оленов, 1977; .Б. Бахтин, 1980; И. А. Аршавский, lí 82; А. В. Зеленин, А. А. Кутд, . А. Прудовский, 1982; Е. В. Грунте нет, 1985; И. Н. Борцов, ИВ. Дунаев, А. Н.Бажанов, 1986; D.H.Сзгпеу, 1989; . F. Hoffman, 1991).

Среди различных способов изучения роста организма боль-уэ роль играет метод тканевых ¡г клеточных у-льтур, который озволяет непосредственно в контролируемых условиях наблю-ать деление клеток С Н. Г. Хлопш, 1940 ; А. Д. Тимофеевский, 947; С. Я. Залкинд, 1953; Е. А. Лурия, 1972; S. Grain, 1980; L Н. Елюмккн, 1984; Э. II Лежнев, 19.85; É R Никольский,Ю. Б. Еах-ин, Т. Н. Игнатова и др. 1984; КII Божкова, Л. А. Брежес-овский, Е.М. Буравлев и др. 1988; В.С. Акатов, EIL Лавровс-ая и др. 1990; В. П. Туманов, Е. В. Глущенко и др. 1990; LSolursh, 1991; Р. Carón i, С. Schneider, 1991).

Большое научное и практическое значение в настоящее Бреет имеет изучение влияния на рост тканей и клеток организма кстремальных воздействий и связанных" с июли патологических [роцессов. В достаточно общем виде эти проблемы нашли свое юшение в теории стресса , в понятии о паранекрозе , в [редставлениях о патологии клетки (Г. Се лье, I960, 1979; А. П. ивцын, В. А. Шахламов, 1979; Л. Е. Панин, 1983; В. Я Александ-гав, 1985 Р. А. Тигранян,1988,1990). Эти теории, а также наблю-(ения Хейфлика об ограничении числа делений пролиферирутощих теток организма при культивировании и гипотезы о накоплении i клетках генетических повреждений и мутаций, как причины сронической патологии и старения, могут служить дополнительном обоснованием использования именно метода тканевих куль-

тур для изучения состояния клеток и тканей организма при экстремальных воздействиях (Hayflick, -toorhead, 1961; Heyfliok, 1966, 1972; Curtis, 1966, 1971; Harman, 1968; E. Б. Фролькис, 1975; E.H. Никитин, 1982; А. К. Горин, Н. С. Богомолова и др. 1987).

Цель и а а д а ч и исследования.

Цель исследований заключалась в изучении особенностей роста тканей и клеток взрослых животных и человека in vitro при различных физиологических, экстремальных и патологических состояниях организма, в поиске путей использования тканевых культур для ' оценки репродуктивной активности клеток при некоторых экстремальных воздействиях и заболеваниях, а также в дальнейшей разработке самого метода первичных тканевых культур.

Для достижения данной цели были поставлены следующие

ЗаДЗЧИ!

1. Изучить влияние условий постановки первичных тканевых культур от взрослых животных и человека на- количественные и морфологические -особенности роста клеток.

2. Установить количественные 'закономерности и разработать количественные критерии оценки роста культур.

3. Изучить влияние физиологических , экстремальных и патологических состояний организму на количественные параметры роста тканей и клеточную патологию в зоне роста. -

4. Провести оценку влияния на рост тканей животных при культивировании некоторых биологически активных вёадэств, принимающие участие в регуляции физиологических процессов в организме.

б. Оценить возможности использования тканевых и клеточных культур для оценки биологических свойств сыворотки крови человека при различных состояниях организма.

б. Выявить особенности роста тканей человека в культуре при патологии и оценить возможности использования этого метода для диагностики некоторых заболеваний.

Научная новизна.

1. Епервые разработан ряд новых приспособлений и модификаций метода первичных тканевых культур: способ культивирования на миллипоровых фильтрах в пробирках, способ посадки

мрофрагментов ткани на подложку, позволивших улучшить ус-)вия культивирования, упростить методику постановки куль-"Р, повысить точность количественных исследований с исполь-шанием этого метода.

2. Впервые" изучены количественные закономерности роста крофрагменгов ткани взрослых животных и человека в больших [учайных ЕЫборках и установлен экспоненциальный характер юта культур (легких, почек, слизистой бронхов], на основам чего предложен ряд новых критериев оценки роста тканей in культивировании: по максимально растущим культурам и по отношению их со слаборасгущими культурами.

3. Впервые проведено изучение зависимости роста тканей (ганизма in vitro от различных физиологических, зкстремаль-к и патологических состояний организма. Джазано, что при тром общем охлаждении .животных, термическом ожоговом воз-■йствии, и при компенсаторной гипертрофии наблюдается зютп-щия, а при общем облучении животных лучами Рентгена и ток-¡ческом воздействии хлористого кадмия -угнетение роста аней in vitro.

4.Установлено влияние на рост тканей некоторых медиато-

в нервной системы, гормонов , медиаторов воспаления и ак- . ваторов сульфгидрильных групп.

Б. Впервые изучено влияние сыворотки крови человека на ст тканей при некоторых физиологических и патологических стояниях организма: при адаптации к условиям проживания на вере и при алкоголизме.

6. Впервые разработан метод диагностики хронических нес-цифических воспалительных заболеваний бронхов, основанный оценке роста микрофрагментов ткани и патологии клеток в не роста. Показана принципиальная возможность применения ого метода и при заболеваниях почек. Теоретическая и практическая н а ч и м ост ь. Показано, что клетки тканей .выделенные из организма, сох-няют in vitro при кратковременном культивировании физиоло-ческое состояние, присущее ям в организме. Установлены изменения роста тканей in vitro, в зависимое-

ти от состояния организма при экстремальных воздействиях , при этом воспалительные процессы в организме сопровождаются усилением, а дистрофические процессы угнетением роста.

Показано, что метод первичных тканевых культур является адекватным тестом оценки влияния на репродуктивно- активные клетки организма экстремальных и экологических факторов: влияния температуры, токсических вещэств, рентгеноиасого излучения.

Характер роста культур и клеточная патология в зоне роста зависят от особенностей воспалительного процесса в бронхах, при этом катаральная и гипертрофическая формы бронхита сопровождаются усилением роста культур и нарастанием клеточной патологии в зоне роста, а атрофическая форма бронхита - снижением роста биоптатов и дальнейшим нарастанием клеточной патологии . Особенности роста культур и характер клеточной патологии находят свое отражение в структуре боны роста и в нарушении упорядоченности ее строения.

Разработан новый, метод диагностики, и. прогнозирования хронических воспалительных заболеваний бронхов: " Способ прогнозирования течения хронических неспецифических воспали-тельнЬх заболеваний бронхов" (A.c. 1409944, соавт.: В. П. Быков, В. Я. Леонтьев ). ' 1

Разработан "Способ оценки стадии адкоголзма" по влиянию сыворотки ■ больных алкоголизмом "на рост культур печени плода человека (Рац. предл.N 41/85, соавт. НИ. Сидоров).

Разработан "Способ культивирования тканей поджелудочной железы плодов и других органов животных" и человека для целей трансплантации" (Рац. предл.: N 26/83).

Разработан ряд новых устройств для постановки тканевых и клеточных культур : " Пипетка", для суспендировзяия и диспергирования , "Микропилетка" для намерения микрофрагментов ткани, "Устройство для биопсийного анализа", предложено "Устройство для посадки на подложку микрофрагментов биологических тканэй" и др. (A.c. 1018711; 1609401; 1801391; Патент 1785530).

На основании исследований получено пять изобретений четыре рационализаторских предложения отраслевого значения и

осень рационализаторских предложений местного значения.

Полученные данные и разработки используются в педагогичес-ой практике Архангельской государственной медицинской кадемии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Интенсивность' роста и структура зоны роста при культи-ировакии микрофрагментов тканей взрослых животных и чэлове-а определяется не только условиями культивирования, ко тзк-е состоянием клеток и тканей , возрастом и характером пато-игического процесса в организме.

2. Влияние экстремальных к экологических воздействий на 'рганизм сопровождается как активацией, так и угнетением ¡пособности тканей к росту при культивировании. Наблюдаемые [зменения роста тканей взрослых животных и человека преимущественно связаны с воспалительным процессом и дистрофичес-зши нарушениями , факторами, повреждающими репродуктивный шпарат клеток, и вызывающими изменение содержания сульфгнд-¡ильных групп.

3. Путем культивирования при действии ряда веществ ( ад-юналина, • ацетилхолина,гистамина, хлористого кадмия) на летки как непосредствено in vitro , так и в условиях орга-[иэма, удается выявить их индивидуальные биологические особенности . Устойчивость клеток ткани почек взрослых .животных I условиях культивирования к токсическому действию этих ве-рств оказалась выше, чем организма в целом.

4. Биологическая активность сыворотки крови животных и [еловека, определяемая по действию ее на рост клеток в куль-'уре, зависит от функционального состояния организма- донора :рови.

5. Метод тканевых культур позволяет использовать его в ачестве теста для оценки репродуктивной активности клеток фганизма и степени их поражения при экстремальных воздейс-•виях я при патологических состояниях..

Апробация работ ы. Материалы" диссертации до-южены к обсуждены на "Научной межобластной конференции Се->еро-Западных областей FOK? по акклиматизации и краевой патологии человека на Севере " {г. Архангельск, 1969); Научной

конференции "Акклиматизация человека в условиях полярных районов " ( г. Ленинград, 1069); научной конференции "Краевая патология человека на Севере Европейской части СССР"( г. Архангельск, 1971);Всесоюзной конференции "Вопросы медицинской географии Севера Европейской части СССР" (г.Архангельск, 1972); заседании Московского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов и Московского.общества испытателей природы ( Москва,1972)¡сделано сообщение на "школе", организованной НИИ морфологии человека АМН СССР " По культуре клеток и тканей" (Москва, 1973); на Всесоюзной конференции "Адаптация и проблемы обшэй патологии'Ч г. Новосибирск, 1974); Всесоюзном симпозиуме "Генетика и адаптация клеточных популяций" (г. Ленинград, 1975)¡на 4 Международном симпозиуме по приполярной медицине (г. Новосибирск,1978)¡итоговых конференциях НИИ морфологии человека АМН СССР (Москва, 1986-1989);на научной сессии'Архангельского медицинского института (г.Архангельск, 1991); на Юбилейной научной конференции Архангельского медицинского института ( г. Архангельск, 1992); на Итоговой научной конференции Архангельского медицинского института (г.Архангельск 1993). ' •

Публикации. По тематике- диссертации опубликованы 54 печатные работы, в их числе одна монография, четыре авторских свидетельства на изобретения, один патент на изобретение. Получены четыре свидетельства на отраслевые рационализаторские предложения.

Структура и объем -диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования", 7-ми глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и библиографического указателя. Диссертация изложена на 334 страницах машинописи, иллюстрирована 55 таблицами и 50 рисунками, из ко1 торых 30 микрофотографий. Указатель литературы содержит 299 отечественных И 237 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Использованный материал и методы исследования. Для решения поставленных задач экспериментальные исследования проводились

на белых беспородных мышах и крысах. Всего использовано ?. 870 мышей и 15 крыс.

Для оценки роста тканей при культивировании от каждого животного использовали от 40 до 60 микрофрагментов ткани. Есего был проанализирован рост более 114 ООО культур.

Таблица 1

Распределение обследованных больных и жителей Севера

1 1 1 1 1 1 | N ! |п/п| Серия исследований ........ 1 | Общее (количество Число биопсий . .... , Число | культур |

1 1- 1 Больные с патологией бронхов и легких | 181 язв 4 700 |

1 2. | Больные с заболеваниями легких( после оперативного вмешательства). | 76 214 8 560 |

1 3. | Больные с патологией почек | 66 194 7 760 |

! 4. | Плоды человека в возрасте 14-18 недель | 32 120 4 ВОО |

1 5. | 1 1 | 1 Доноры крови,больные алкоголизмом, ?датели Севера 1 319 | 638 12 400 | | |

В клиническом разделе работы для культивирования брали биоптаты, получаемые при диагностических исследованиях или при оперативном вмешательстве. В работе использовалась классификация хронических бронхитов, разработанная в ВНИИ пульмонологии/Ленинград/С А. Г. Бопков, 1980; Г. И. Лукомский и др. ,1982).

Распределениэ больных , обследованных жителей Севера I изученного материала представлено в'табл. 1.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. • 1. Культивирование биоптатов проводили по методу бесплазменных тканевых культур( Д. Пол, 1963). Для культивирования использовали среду N 199 с бычьей ши аутологичной сывороткой и антибиотигами ( 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина ). Культивирование тканей осуществляла« в пробирках по разработанной нами методике, как непосредственно на стенке пробирок, так и на поверхности миллипоровыз фильтров ( типа СЬШГОР /7/ ).Бычью сыворотку получали иа крови от молодых животных на Архангельском мясокомбинате. (В. II Пащенко, Устройство для посадки на подложу микрофрагментов биологических тканей, патент N 1785530, 1991 г.; Использование штативов ШСА для размещения в термостате пробирок с культурами клеток и тканей, /Рац. предложение, 5/78 АГШ1, 1978 г./;Способ культивирования животных тканей на миллипоровых фильтрах с использованием пробирок /Рац. предложение отраслевого значения 0-1295, 2-й МОЛГМИ, 1980 г.).

2. Культуры фиксировали в смеси Еуэна,окраску производили гематоксилином Нараци и эозином (Г. А. Меркулов, 1961). культуры для электронной микроскопии готовили- по общепринятой методике (Ю. А. Ровенский ,1979; Д. Пиз, 1963). Электронную микроскопию проводили на базе НИИ морфологии человека АМН СССР.

3. Получение культур фибробластов эмбрионов.человека проводили путем трипсинизации поверхностных мягких тканей 7-8 недельных эмбрионов ( Д. Шл, 1963). Количество клеток, выросших при культивировании, подсчитывали с помощью счетчиков частиц - Целлоскопа 134 ( Швеция) и Пикоскел. ' При работе с клеточными культурами для повышения точности результатов использовали пипетку для суспендирования и диспергирования клеток ( Е. П.Пащенко "Пипетка", а.с.N 1018711,1982 г.).

4. Оценку роста культур проводили путем подсчета числа клеток в зоне роста и измерением площади клеточной колонии. Плошвдь зоны роста определяли с помощью окулярной сетки или рисовальной насадки к микроскопу ( РА-6 и РА-7 ).

Аналогичным образом оценивали площадь ядер клеток и плотность роста клеток в колонии (Г. Г. Автандилов, 1973). Для морфоиетрических исследований наш предложена "Цветная прозрачная морфометрическая окулярная сетка" (В. П. Паприка,

д. предложение отраслевого значения N 0-1296 , 2-й ЮЛГ-[,1980 ).

5. Митотическуго активность и патологические формы митозов ;енивали по классификации НА. .Алова ( НА. Алов, М. Е. Ас-га, И. А. Казанцева, 1973 ).

6. Статистическую обработку наблюдений проводили с привлечем пакета прикладных программ ( Biomedical Computer 'ograms ) по версии 1975 г., разработанной в Калифорнийском гаверситете- США на базе операционных систем ОС ЕС в вычислить ном центре Белорусского ГУ им. В. И. Ленина, при содейс-!ки ВНИИ медтехника МЗ СССР. Для обработки применяли пакеты зограмм PID,R2D, P3D, R7D, обеспечивающие достаточно полный сализ с использованием параметрических и непараметрических ?тсдов статистического анализа. Обработка проводилась на ВМ-ЕС - 1022 Вычислительного центра Архангельского меди-икского института. Кроме того, для вычислен!:?1 использовался якрокалькулятор E3-34 и персональный компьютер типа IBM PC Н. И. Вальвачев, М. И. Римжа, 1989 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ■

1. Влияние условий культивирования на количественные пара-:етры роста тканей.

Как показали наблюдения, рост культур в значительной стесни зависит от количества в питательной среде сыворотки :рови, используемой как необходимый компонент питательной :реды: при увеличении содержания сыворотки в питательной :реде с 5Z до 30% интенсивность роста культур ткани почек мшей увеличилась в 5,4 раза, однако при дальнейшем увеличе--:ии сыворотки до 40% рост культур снижался. Сыворотка крови хэловека, по сракнению с сывороткой крупного рогатого скота, обладала значительно меньшей активирующей способностью.

Было установлено, что рост . микрофрагментов ткани почек ¿шей обеспечивается при рН 7,33- 7,87, причем сдвиг рН в «юлую зону оказывал менее резкое тормозящее влияние на рост тканей, чем в щелочную , что соответствовало наблюдениям >ccarini, Eagle (1971). В наших опытах оптимальный рост тканей при культивировании наблюдался при рН 7,4. Продувание пробирок смесью кислорода и 5Z углекислого газа уменьшало

смещение рН среды, но не сопровождалось значительным изменением интенсивности роста тканей. В связи-с этим исходное значение рн питательной-среды мы подбирали равным 6,9.

Значительное влияние на рост клеток оказывают и особенности центрального зкепдантата-культивируешго микрофрап,ен-та ткани. В наших исследованиях было показано, что увеличение размеров первичного эксплантата в пределах 0,20- 0,45 >л,Г2 сопровождается некоторым увеличением роста культур. К увеличению роста культур до определенных пределов приводило я увеличение числа эксплантатов в одной пробирке." Центральный эксплантат играет большое значение в развитии колонии клеток,особелно на её ранних этапах роста. Так, было показано, что перемещение первичного эксплантата с поверхности клеточной колонии е первые 72 часа приводило к задерже роста культур в 2 раза по сравнении с контролем. К задерже роста культур на 44,4% приводило и кратковременное смещение с поверхности клеточной колонии первичного микрофрагмента ткани. Эти наблюдения свидетельствует о тесном взаимодействии первичного эксплантата с растущей вокруг него меточной коло нией. • "

2. Количественный анализ особенностей роста первичных тканевых культур •

В ряде работ было отмечено,что рост культур от микрофрагментов одной и той же ткани происходит неравномерно (.ЕЕ Кокииа, Е.Е Артемьева, 1970 ). По мнению БоиКироуа, Но1екоуа, Стпегоуа (1965 ), неравномерность роста культур может быт связана с неодинаковым распределением в ткани клеток , которые сохраняют способность к делению. В наших исследованиях также набдвдалось это явление. В связи с этим мы провели ' изучение роста различных по величине микрофрагментов ткани почек человека ( от 0,01 до 0,28 тГ2 ) на поверхности мил-липоровых фильтров ( СЫНГОР /7/ ).

Как показали исследования, при уменьшении величины первичного эксплантата процент выросших культур резко снижался. В то же время, снижение роста культур происходило и в том случае,когда величина первичного микрофрагмента ткани превышала 0,2 мм"2,что может быть связано с ухудшением условий

рофики клеток. Оценка вариабельности роста культур показала, го она наименьшая при величине микрофрагментов (0,16- 0,20 '<ГЕ ) - 44,7% , в то врет как при увеличении их размеров ээффициент вариации возрастал до 116%, а при их уменьшении 3,040-0,08 тС2 )- до 54,1% . Проведенные исследования по-азали,что неравномерность роста культур зависит от величины сходного зксплантата, при этом оптимальные параметры роста беспечиваются при величине микрофрагмэнтов ткани в пределах ,16-0,2 мм~2.

Характер роста культур в определенной мере зависит от войств подлодки. Мы провели сопоставление роста культур на оверхности стекла, шллипоровых фильтрах СЫШОР 6 (ЧССР), ¡иллипор (НАУ/Р, США ) и Еладипор (МФА-1ЛА 3, СССР ). Наиболее нтенсивный рост культур слизистой бронхов человека нзблю-:злся на поверхности фильтров Миллипор (США) и СЫНПОР ЧССР). При сопоставлении роста эндометрия чз.яовека на мил-ипоровых фильтрах типа СЫШОР с различным диаметром пор /от >,2 до 1,5 мкм. /было показано, что наиболее интенсивный рост ультур в этом случае наблюдался при диаметре пор 0,4 мкм СЫНПОР -6 ).Он был по числу клеток в 2 раза более интенсив-[ым, чем при использовании фильтров СЫНПОР-8 ив 1,6 раза ¡ольше.чем при использовании фильтров СЫНПОР -3 ( диаметр юр 1,5 мкм).

Изучая динамику роста культур от микрофрагментов ткани гочки мышей в роллерных и стационарных бесплазменных культу-)ах на поверхности стекла,мы установили,что латентная фаза )тих культур составляет в среднем 48' часов, логарифмическая [¡аза роста продолжается с 3-го по 8-9 день культивирования. 3 дальнейшем в стационарных культурах число клеток в зоне гас^а остается постоянным до 15-го дня культивирования,а в эоллерных культурах после 9-10-го дня происходит быстрое уменьшение числа клеток в колониях в результате смывания слеток с поверхности стекла и к 15 дню на поверхности стекла остаются лишь единичные клетки.

При культивировании фрагментов ткани почв!? человека в 1 лл среды N199 с 15% аутологической сывороткой развитие куль-сур происходит.более медленно. Латентный период в этом случае 1родолжзется 4-5 дней,фаза логарифмического роста до 15-го цня, а стационарная- до 20-го дня. Аналогичные данные были

получены и при культивировании микрофрагментов ткаки легки человека. /

В дальнейших исследованиях ш проанализировали эакономер ности распределения культур по величине в случайной выборк из 540 микрофрагментов ткани почек, взятых от 9 мышей.

Проведенные исследования показали,что распределение час тот размеров культур в случайной выборке характеризуете резкой положительной асимметрией ( А = 1,46 ),при этом сред няя величина распределения близка среднему квадратическом отклонению. По этим признакам мы отнесли данное распределени к экспоненциальному распределению (Р. Шторм, 1970).Справедли вость этого вывода была подтверждена при сопоставлении эмпи рического и теоретического распределения. Данное распределе ние известно тем, что оно моделирует многие процессы, свя занные с 'ростам организмов,продолжительностью жизни и выжи ваемостью различных биологических объектов ( Г.Чернов, Л. М вес, 1962 ). Аналогичный характер распределения культур п величине наблюдался и при культивировании ткани легкого че ловека на поверхности мшшшоровых фильтров.

В дальнейших исследованиях было показано, что харакге; распределения культур по величине резко отличается от особенностей распределения по величине мшфофрагментов ткани: 1 то время как распределение величин микрофрагментов ткан) приближается к нормальному .распределение культур остаетс! резко асимметричным. Из полученных данных мы сделали вывод < том, что характер роста культур зависит не только от величины микрофрагментов, но и от характера распределения в тканя: клеток, способных к делению . При этом число микрофрагментов, имеющих значительное число пролиферативно-активных клеток, составляет не более 5-10Х. Оставшиеся 20-30Х микрофрагментов обладают слабой способностью к росту. В эмбриональны: тканях ато соотношение смещэно в сторону увеличения числа а! тивно растущих микрофрагментов ткани.

Статистический анализ особенностей роста тканей при культивировании показывает;что для оценки их роста могут использоваться несколько относительно самостоятельных критериев ) показателей. Эти критерии следующие:

1. Критерий,показывающий процент образовавшихся за определенный промежуток времени клеточных колоний к общему коли-

- 13 -

¡ству использованных для посева микрофрагментов ткани.

2. Критерий, определяемый как соотношение выросших за оп-эдеденный промежуток времени клеток к общему числу микроф-агментов.

3.Рост ткани может оцениваться по максимально растущим неточным колониям ( "лидерам" ).Е атом случае оценивагат-

а возможности к росту клеток из микрофрагментов,сохраняющих аиболее высокие репаративные возможности.

4. Рост ткани может оцениваться как разность между макси-ально и минимально растущими культурами. При этом точки отчета определяются процентом или квартиллями. Эти показатели ценивают соотношение между клетками ,обладающими мансималь-ыми и минимальными репаративными возможностями. О диапазоне астущта культур дает численное представление и среднее вадратическое отклонение.

5. Рост культивируемых тканей может определяться не толь-п по числу клеток в колониях,но и'по площади зоны роста, [лотности роста клеток, или как соотношение двух предыдущих гоказателей.

Предложенные критерии позволяют достаточно полно проанализировать все особенности распределения в тканях клеток,' обладающих различной пролиферативной активностью. Эти критерии могут дополняться изучением митотической активности кле-'ок в зоне роста, подсчетом патологических форм митозов и различного рода аномальных клеток.

Точность данного метода оценивалась нами по общепринятой ¡етодике по величине коэффициента вариации, высчитываемого ак отношение среднего квадратического отклонения к средней, щраиаешй в процентах ( В. УрбахД9б4). Как показали специ-шьно проведенные исследования по сопоставлению парных проб, •очность однократной оценки роста ткани (почек) у животных гри достаточном количестве микрофрагментов ткани /140-300 и 5олее / может достигать 5-10%, а при анализе клинического материала /стандартных биопсий почек и слизистой брохов /15-20% . По принятой в медико-биологических исследованиях щенке,точность метода меныгё 10% указывает на слабую измен-швость признака, в пределах 10-20% -значительную и более 10% - на сильную (И.Г. Венецкий, Г.С. Кильдишев, 1975).В зрактике биологических исследований используются методы,

точность которых составляет, как правило, от 10 до; 20% (В. С. Асатиани, 1965 ). • . .

При планировании и ■ проведении исследований мы руководствовались также рекомендациям! статистической теории ошибок (Е.Е. Еагдатьев,1974; Б.М. Щцголев, 1962;В. Г.Мельников, 1978)'. Изучение метода тканевых культур показало, что при постановке культур и оценке результатов можно исключить различного рода погрешности эксперимента: систематические, случайные и личные. Для проведения исследований нами разработан метод непреднамеренного (случайного) отбора для культивирования микрофрагментов . ткани 'на . поверхность подложки ( Патент N 1785530 ). Проведенные наблюдения также показали, что для обработки наблюдений с использованием тканевых культур целесообразно использовать преимущественно методы непараметрической статистики ( Е. В. Гублер,А. А. Генкин.1973).

3. Морфофункциональные особенности роста тканей взрослых животных и человека при культивировании

Рост тканей при культивировании без. смены питательной среды проходит несколько фаз развития: латентную .которая' завершается миграцией клеток из центрального эксплантата, фазу логарифмического роста, ртационарную и фазу гибели культуры, обусловленную истощэнием питательной среды.

В наших наблюдениях было показано, что продолжительность' латентной фазы роста тканей зависела от-возраста, характера ткани и вида животного. При культивировании ткани почек от мышей 17-18 г первые мигрирующие клетки на поверхности стекла появлялись через 48 часов, а образование клеточных колоний через 48-72 часа культивирования. В то время как у более старых животных -25-30 г образование клеточных колоний задерживалось до 72-96 часов. При культивировании же эмбриональной ткани через 24 часа наблюдалось как бы расползание самого центрального эксплантата по поверхности подложки и сопровождалось образованием органных альвеолярных структур. фи культивировании тканей взрослого человека продолжительность латентной фазы удлиннялась до 4-5 суток. Так, процент выросших культур от микрофрагментов ткани почек урологических больных на 5-е сутки составлял -34,8Х, на 10-й день

- 68,0% , а на 20 -й день -80,IX по отношению к общему количеству использованных микрофрагментов ткани. В целом процент растущих культур на 10-15 день в зависимости от гозраста животного и вида ткани колебался от 65 до 9ОХ.

Характерной особенностью фазы логарифмического роста является резкое повышение митотической активности клеток. Так, по литературным данным, митотический индекс эмбриональных клеток в первичных культурах почек коровы составлял -30,0%о. Митотическая активность клеток почек обезьян - 25,0 -30,0%о ( Я.Е. Хесин.Ф. В. Сушкова, М.И. Митина, 1961; Я. Е. Хесин, 1967; С. Я. Залкинд.Е. II Доссер.В. М. Дорофеева, 1965 ). В то время как митотическая активность клеток коркового вещества почек у крыс в течение суток колебалась в пределах 0,39-0,98 %о , а при регенерации почек на 5-10 сутки она достигала 4,23- 5,40% (А. Г. Курдюмонова, 1961 ).

Наиболее высокую митотическую активность клеток ткани почек мышей весом 20-22 г. .мы наблюдали на 3-4 день культивирования, когда она достигала- 17,7-18,8%о. В последующие дни без смены питательной среды она снижалась до 5-6%о и на 9-10 день составляла 3,4 - 4,4%о: Число патологических митозов на 5 -й день культивирования было равно 17.5". Наиболее частой формой патологии митоза было отставание хромосом в метафазе

- 54,5%, образование мостов - 2,5%, многополюсных митозов -23,2%, рассейвание хромосом -8,6%. Следствием этого было появление в культуре многоядерных и гигантских клеток. Нарастание числа патологических форм митозов, многоядерных клеток мы рассматривали как проявление дизадаптации, вызванное истощением питательной среды. В период стационарной фазы к 7-10 дню культивирования число патологических форм митозов снижалось до 10,3- 11,1% , что могло быть связано с элиминацией нежизнеспособных ¡меток. Одновременно в эту фазу наблюдался распад клеточной колонии: появление свободных участков в зоне роста, обособленных групп клеток и нарастание числа веретенообразных фкбробластсшдобных клеток.

Культура ткани почек человека / урологических больных/ отличалась более медленным ростом, чем почек мышей. Латентный период составлял 4-5 дней. Фаза логарифмического роста продолжалась до 13-15-го дня культивирования. К концу этого периода среднее число клеток в максимально растущих культу-

pax достигало 8-9 тысяч, а к 20-му дню- 8 тысяч. Митотическая активность клеток в этих колониях на 5-й, ■ 7-й и 1Б -й день культивирования составляла соответственно -4,04 %о, 7,08Хо и 4,61%о, а число аномальных клеток соответственно - 2,3%о , 5,5Zo и 2,6 Хо.

Рост in vitro микрофрагментов паренхимы легких человека показал, что ато также сравнительно медленно растущие культуры. Латентная фаза завершилась - на 5-6-й день культивирования. На 5-й день процент растущих культур составлял 32,9% , на 10-й день- 74,9% ,а на 15-й день- 69,5% .При этом среднее число клеток достигало на: 5-й день-39,5 клеток, на 10-й день - 385,5 , а на 15-й день- 507,9 клеток. Особенностью культур легочной ткани человека,по сравнению с культурами ткани лег ких мышей .является появление клеток,содержащих значительное количество темных пылевидных включений. Часто клетки с пылевыми включениями образовывали гигантские симпласты. Митотическая активность клеток в зоне роста культуры легких челове ка на 5-6-й день составляла 0,95%о , на 10-й день- 5,ЗХо и на 15-й день - 0,62 %о. Число патологических форм митозов в эти сроки составляло соответственно-6,7%, 12,7 % и 16,6 % , а число двухядерных клеток - '38,8 %о, 40,0 %о и 35,0 Хо.

Логарифмическая фаза роста культур продолжалась с 5-го по 15-й день культивирования. На Ю-Ji день культивирования среднее число в ¡лакаклалыю растущих колониях колебалось от 1,Б до 10 тысяч клеток. Митотическая активность от 3,0 до 9,0 Хо, количество патологических форм митозов от 0,3 до 1,0%, а число аномальных ¡-«легок от 3,0 до 19,0%о в зависимости от харагаера еаболэвашм.

Плеточный состав зоны роста культур отрпглд >,ярфологичес-Ш1э особенности исходной ткани. Так, при использования ткани почек ньензй ¡.и НЕОждалк появление трех осисг-шх типов глоток: эшгаолшоподобньк полигоональных меток с кругам ядром л более валких того хэ тыла, а также фиброолзстоподобных с 2-2 отросткам!, известных по литературным данным ( С. Я Ззл-к;шд, Л. Г. .Степанова, 1959,1960; Ё. Г. Заславский, 1S59,1981).

Исследования клеток 3 растущих в зоне роста культуры ткани почгк мкшей, с помощь» влэктронной микроскопии такяе ае позволяет более четко идентифицировать клзтки по их происхождений. йибробласяоподсбкые клетки мри электронной микроскопии

имеют достаточно развитый эндоплазматический ретикулум и большое количество митохондрий, в то время как в эпителиопо-добных клетках наблюдались многочисленные включения вакуолей. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии нам не удалось обнаружить признаки достаточно выраженной дифферен-цировки и наличие специализированных структур.

Исследования на сканирующем электронном микроскопе •показали, что между первичным эксплантатом и клетками в зоне рос-га практически отсутствует четкая граница. Поверхность зоны эоста в зависимости от происхождения клеток имеет сложное 1чеистое строение. На поверхности клеток можно было наблюдать тоявление единичных лимфоцитов.

Культура легочной ткани человека также была неоднородна по :воему клеточному составу. В культуре наряду с фибробластопо-;обными клетками можно было выделить обособленные колонии шителиоподобных клеток.

Культуры трахеи и бронхов состояли, в основном, из эпите-сиоподобных клеток двух типов -больших, имегаших обширную ци-■оплазму и большое округлое ядро, и более мелких по размерам ■деток , имеющих высокую митотическую активность. В культуре • лизистой бронхов присутствует и незначительное количество ¡едких фибробластоподобных меток. Исследования, проведенные помощью трансмиссионной электронной микроскопии, также не ыявили присутствия в зоне роста дифференцированных клеток . ри растровой электронной микроскопии поверхность зоны роста мела неоднородный волнистый-и складчатый вид, а клетки были □крыты мелкими микроворсгаками, типичными для культивируе-ых клеток, которые были четко видны при увеличении в 30-50 исяч раз (Ю. А. Ровенский, 1979). Эпителиоподобные клетки име-I слабо различимые между собой границы. Поверхность краевой зны этих клеток была представлена в- виде ламеллоплазмы с кроткими выпячиваниями и рыхлой ячеистой структурой. При яектронной трансмиссионной микроскопии клетки зоны роста леди признаки усиления энергетических и пластических про-

!ССОВ. ,

Таким образом, культура ткани взрослых животных и челове-1 имеет вполне определенные морфэфункциональные особэннос-!, позволяющие идентифицировать ее с исходной тканью. При •поставлен«!! роста тканей взрослых животных и человека с

аналогичными эмбриональными тканями удается отметить .'ряд особенностей : а) культура эмбриональной ткани имеет менее продолжительный латентный период и более высокую митотичес-кую активность клеток; б)зона роста эмбриональных тканей имеет более упорядоченную структуру и однородный клеточный состав; в) в зоне роста эмбриональных тканей встречается значительно меньше патологических форм митозов и аномальных клеток, имеющих вакуолизированную цитоплазму, содержащих по-липлойдные ядра или несколько ядер. Есе это указывает на то, что в культуре ткани находят отражение определенные возрастные дезинтеграционные процессы , обусловленные старением и патологией организма.

4. Рост тканей в культуре при некоторых физиологических состояниях организма и экстремальных воздействиях .

При изучении способности тканей почек мышей к росту при культивировании,в зависимости от физиологических состояний организма и экстремальных воздействий культивирование проводили в пробирках по разработанному нами методу. Микрофрагменты ткани размещали непосредственно на стенке пробирок; Для однократной оценки роста.использовали от 40 до 50 культур. Культивирование осуществляли в среде N199 с 10% бычьей сывороткой и антибиотиками.

Оценку роста тканей старались проводить при тех же' физиологических состояниях, при которых"изучались изменения митотической активности клеток (И. А. Алов, • 1972). Выбор широкого спектра экстремальных воздействий был обусловлен и необходимостью анализа различных механизмов регуляции этого процесса в организме. Рост тканей почек мышей исследовали при следующих состояниях организма.

1.При старении: сопоставлялся рост тканей почек от молодых животных-1-1,5 месяца и взрослых мышей -1-1,5 года.

2. При развитии компенсаторной гипертрофии почки: изучался рост тканей через один, три и шесть дней после удаления у животного одной из почек.

3. Влияние длительного полного голодания: рост тканей изучался через Я и 5 дней полного голодания.

4. Действие на животных лучей Рентгена в дозах 500 и

ООО рентген (облучение проводили на аппарате РУМ-11 в дозах

ЛД/50 и ДЦ/100). Оценку роста культур у животных после обучения дозой в 500 рентген проводили через 2-4 часа, через

и 26 дней. После облучения дозой в 1000 рентген- через 2-4 аса, через 3 и 6 дней .

5. При остром и хроническом охлаждении животных: охлажде-ие мышей проводили при температуре -ю"С в течение полуто-а-двух часов до выраженного холодового наркоза. Рост куль-ур оценивали сразу после охлаждения, через 2-3 часа,-дин,три,пять и семь дней. Хроническое охлаждение животных роводили при постоянном их содержании при температуре +2-4С,Определение роста культур осуществляли через один, два , ять, восемь и 16 дней.

6. Влияние воспалительного процесса: воспаление вызывали ведением под кожу горячего физиологического раствора. Рост пределяли через 2-3 часа, через 1 ,3 ,5, и 9 дней.

7. Рост культур определяли после физической нагрузки, ко-орута вызывали плаванием животных в воде при температуре б'с. Оценку роста тканей почек проводили через 2-3 часа, а акже после ежедневного плавания мышей в течение одного часа . ерез 3,10 и 16 дней.

8.Рост тканей изучался после эфирного и мединалового нар-оэа.

9. При стрессовом состоянии, вызванном помещением живот-ых в клетки ограниченного объема. Рост тканей определяли ерез 1,2, 5,8 и 16 дней их постоянного содержания в этих словиях.

10. Рост тканей почек определяли после болевого раздраже-ия мышей электротоком в камерах в течение 1,5-2 часов.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных,представленных в таблице, при целом яде физиологических и патологических состояниях организма аблюдались изменения роста ткани почек при культивировании, ак, усиление роста происходило при развитии компенсаторной кпертрофии почки, вызванной удалением парного органа, при стром воспалении и в определенные сроки после острого хлаждения. Наоборот, угнетение роста тканей было отмечено осле полного голодания, при старении и при некоторых других ронических экстремальных воздействиях.

Таблица 2

Изменение роста ткани почек мышей in vitro при некоторых экстремальных воздействиях и физиологических состояниях организма

i N Состояние организма Набл. Степень |

¡п/п изме- Изменение досто- |

нения роста в % верности|

(* ) к контролю 1 Р< 1 1

1 1. Старение организма (-) 64,0 0,01 ■ |

1 2. Компенсаторная гипертрофия 1

почки: а) через три дня (+) 60,7?; 0,01. |

6} через шесть дней (+) 31,7% 0,01 |

1 з. Полное- голодание - 5 дней С-) 42,5% . 0,05 I

1 4. Облучение Рентгеном

в дозе: 500 г -7 дней (-) 21,4%.. 0,05 |

1000 г - 3 дня' ■ (-). -43,0% 0,05 |

1000 г - 6 дней •(-) 49,4% 0,001; |

1 5. Острое охлаждение:

а) через 24 часа» (+) 35,0% 0,05 |

: б)'через з дня (+) ' 61,ОХ' 0,01 |

в) через 5 дней (+) 31,0% 0,02 |

1 6. Хроническое охлаждение при • -

при t +2 -+4 С : 8 дней (-) 15,3 0,02 |

1 7. Воспаление.вызванное термическим воздействием: 1 1

а) через 3 дня (+) 63,7% 0,05 |

б) через 5 дней (+) 26,9% 0,05 '|

1 8. Стресс,вызванный гиподинамией

а) через 2 дня (-) 21,2% 0,1 |

б) через 16 дней (-) 20,8% 0,05 | 1

Примечание.В другие сроки наблюдения и при, других экстремальных воздействиях различия между "контрольными" и "опытными" группами были незначительны и статистически недостоверны. *(+)-усиление, (-) - угнетение роста тканей

На основании полученных результатов ,мы высказали предположение, что рост ткани in vitro, как и деление теток, может отражать явления, происходящие в организме при развитии общего адаптационного синдрома (О.И. Кириллов, 1977). Три этом наиболее четко происходят изменения роста в фазу юбидизации и резистентности, когда отмечается усиление )оста тканей при культивировании, а также в фазу истощения, соторая сопровождается угнетением способности тканей к госту при культивировании.

В то же время,рост тканей- более инертный процесс и ¡вменения его в организме наблюдались лишь при более »начительных нарушениях состояния клеток.- при выраженной юспалительной реакции, при дистрофических процессах и при 1ктивации или повреждении репродуктивного аппарата клеток.

5. Влияние биологически активных- веществ на рост тканей при культивировании.

Б дальнейших наблюдениях мы попытались установить дейс-■вие ряда биологически активных веществ, принимающих участие' s регуляции физиологических процессов в организме. Для опытов ¡ы избрали адреналин, ацетилхолин, гистамин, АКГГ, АТФ, АДФ i некоторые вещества сульфгкдрильной природы( цистеин и глп-■атион), а также ингибитор сульфгидрильных групп-хлористый здмий.

Выбор этих веществ был не случаен.- Адреналин и ацетилхо-ин являются основными медиаторами нервной системы. АКГГ-важ-:ейшим гормоном, принимающим участие в развитии реакции тресса. Цистеин и глютатион регулируют деление клеток. Гис-амин способствует фагоцитозу и- пролиферации клеток в .орга-изме, активирует ретикулоэядотелиальную сисгему(а Иэн-ин,194В;Д. Е. Альперн 1959; Е Н. Успенский, 1963; Е Д. Горизон-ов, Т. К Протасова, 1968; Г. А. Бузнйков 1970).

Изучение влияния этих веществ на способность тканей к осту при культивировании мы проводили как в условиях in i tro, так и при введении этих веществ в организм животных, ри внесении их в среду на весь срок культивирования (72 ча-а) в большинстве случаев наблюдалось угнетение роста кудь-ур. Наиболее знччительным действием на рост тканей обладав

адреналин,гистамин. и ингибитор сульфгидрильных групп ".'хлористый кадмий. В пересчете на молярные концентрации статистически достоверное' (Рс 0,05)действие адреналина проявлялось при 3,04 1СГ-5 Ii , гистамина -при концентрации 5,1 10 "-5 М, а действие хлористого кадмия в концентрации Б, 74 10"-4 11, токсическое же влияние ацетилхолина проявлялось при минимальной концентрации 3,44 10"-4 U. Напротив,- действие цистеина и глютатиона проявлялось в широком диапазоне концентраций (от 0,0054% до 0,1%) и отмечалось увеличение роста тканей, что говорит о большом значении этих вещэств и свободных сульфгидрильных групп в процессах роста и деления клеток.

Между тем, в ряде опытов было показано,что при действии адреналина, ацетилхолина и гистамина, но в меньших концентрациях или при уменьшении времени экспозиции с тканью, также может наблюдаться и активация роста. Так, при действии на ■ткань гистамина в 5,1 10"-4 М в течение часа наблюдалось увеличение роста культур на 46,6% по сравнении с контролем (Р < 0,05 ).

Изучение влияния этих веществ ( в тех же концентрациях) на рост тканей при введении их в организм животных показало,что в большинстве ' случаев действие их выражено значительно слабее и по характеру противоположно эффекту, наблюдаемому in vitro,и лишь хлористый кадмий как в том,так и другом случае вызывал угнетение роста.

Таким образом, проведенные исследования показали, что адреналин и ацетилхолин не являются специфическими регуляторами роста ткани. Действие гистамина также проявляется лишь в достаточно высока дозах. Обращало на себя внимание активирующее влияние на рост культур цистеина и глютатиона, которое проявлялось в широком диапазоне концентраций. Вместе с тем, полученные результаты показывают,что рост ткани является достаточно стабильным процессом в организме, по сравнению с реакцией на эти веврства митотической активности клеток (И. А. Алов, 1962;О. И. Кириллов, 1977 ).

- 23 -

5. Оценка влияния сыворотки крови человека на рост клеток in vitro при некоторых физиологических и патологических состояниях организма

Сыворотка человека содержит целый ряд веществ, как авизирующих, так и угнетающих рост клеток. Кроме кейлонов и ан-гикейлонов, влияние на рост тканей могут оказывать некоторые гормоны, биологически активные вещества, продукты метаболизма. ( ЕЕ Кочергина, Н. Е Косова, 1971; А. Еалаж, Л Блажек,_ 1982). Однако в настоящее время не представляется возможным четко идентифицировать и оценить суммарную активность всех этих веществ.

В связи с этим, мы предприняли попытку оценить возможности использования метода клеточных и тканевых культур для оценки биологических свойств сыворотки крови жителей различных районов Европейского Севера. В 'качестве тест-клеток мы использовали первичные культуры тканей почек мышей и фиброб-ласты эмбрионов человека, выделяемые из поверхностных мягких тканей. Фи^робласты эмбрионов человека использовали на третьем пассаже. Клетки культивировали в пенициллиновых флаконах в течение 4-х дней в двух миллилитрах среды N199 с антибиотиками. Испытуемую сыворотку вносили в питательную среду из расчета 15% ее содержания.

В первой серии наблюдений км изучали изменение сеойств сыворотки у жителей Заполярья в зависимости от сроков проживания на Севере. Сыворотку крови получали у жителей Нарьян-Мара. Результаты оценки биологических свойств сыворотки крови показали, что в течение первых 10 лет ее свойства изменялись незначительно. Однако после 10- летнего пребывания на Се-, вере биологическая активность сыворотки заметно повышалась,и максимальные ее значения были отмечены у постоянных жителей Крайнего Севера - как русских, так и ненцев. Сопоставление полученных нами данных с исследованиями других авторов показывают, что увеличение способности сыворотки крови стимулировать рост фибробластов у жителей Заполярья совпадает с рез-ки.1 увеличением в. крови 'перекисного окисления липидов (Р. й. Данилова, 1982).

На чаш взгляд, полученные данные .возможно,свидетельствуют 9 то:», что в сыворотке крови лиц, длительно проживающих на

Севере, и постоянных жителей Заполярья увеличивается содержание веществ, стимулирующих жизнедеятельность клеток организма.

Б другой серш! наблюдений в качестве тест-культуры использовали клетки ткани почек белых мышей. Биологические свойства сыворотки крови сопоставляли у жителей различных районов Архангельской области ( доноров крови и женшдн второй половины беременности ). Для однократной оценки свойств сыворотки использовали 20 микрофрагмеитов ткани почек,эксплантированных на поверхность миллипоровых фильтров СЫНПОР-7. Сыворотку в пи-татзльну» среду вносили из расчета 15% ее содержания. Результаты наблюдений показали,что при использовании тканевых культур почек мышей не удается обнаружить существенного различия в биологических свойствах сыворотки крози у лиц, проживающих на Севере и Юге Архангельской области. Однако об-равдег на себя внимание низкая биологическая активность сыворотки крови у беременных женщин ( почти в 2 раза), по сравнению с другими жителями этих районов.

Результаты, полученные нами,также находятся в определенном соответствии с наблюдениями изменения Продолжительности жизни эритроцитов у этих групп населения (Г. К Дегтевз, А. Г. Иарачев ,1980). Было, в частности,показано,что у беременных женщин наблюдается значительное сокращение продолжительности жизни , эритроцитов ( .. СШЭ) до 23-28 суток.

Более углубленные исследования корреляции биологических' свойств, сыворотки крови, определяемых'методом тканевых культур, с некоторыми биохимическими и морфологическими изменениями крови мы провели при изучении патогенеза алкоголизма. В качестве тест- клеток использовали фибробдасты 7-8 недельных эмбрионов человека. Культивирование проводили в пеницил-линовых флаконах. Сыворотку крови вносили в питательную среду из расчета 15% ее содержания . Клинические исследования проводили по специально разработанной программе (П. И.Сидоров). Обработку данных осуществляли на компьютере ЦЦР-11/40. "Результаты наблюдений представлены в таблице з. ,

Из представленной таблицы видно,что у больных алкоголизмом по мере лечения наблюдается снижение биологической активности сыворотки. Е&и сопоставлении полученных данных с контрольной группой интактных к алкоголю студентов (среднее чис-

ло клеток - 433-+14,3 тыс. )было обнаружено,что статистически достоверное повышение активности сохраняется до 29 дня абстиненции (Р < 0,01 ).

Таблица 3

Зависимость биологических свойств сыворотки крови от некоторых показателей крови у больных алкоголизмом

1 N |п/п Показатели крови Дни а б с т и 5-20 121-35 | 36-50 н e н 51-65 ц и и | -------1 66-90 | 1

1 1. К -во больных 19 17 8 7 1 5 I

1 2. Число выросших 524i 497t 468i 454i 436t 1

клеток( тыс. /мл ) 24 18 L. 28 43 |

1 з. Эритроциты млн/мл 4,7* 4,7t . .4,6* 4,58* -------1 4,5* |

0,05 0,1 0,1 0,1 0,02 |

1 4. Лейкоциты тыс/мм 4,6t 4,8* 5,5* 4,9t 5,2t |

0,3 0,4 0,4 0,6 0,9 |

1 5. .СОЭ мм/час 11, Dt 9,4* 8,6* 6,4t -------1 5,7* |

2,1 1,6 1,8 1,7 2,3 |

6. Билирубин 0,44* 0,21« 0,5* 0,25* 0,16* I

мг/% 0,2 0,03 0,18 0,06 0,1 1 1

Изучение корреляционной зависимости изменений биологичвс-й активности сыворотки и физико-химических показателей эволило установить, что имела место положительная корреля-1 между биологической активностью сыворотки и количеством «роцитов крови, обратная корреляционная зависимость с постелями СОЭ ( Р < 0,01 ) и выраженная обратная корреляция »нем абстиненции ( р < 0,005 ). Корреляционной зависимости было обнаружено между свойствами сыворотки и изменениями ¡ирубша.

У больных алкоголизмом .по сравнен™ с контрольной группой же происходило снижение средней продолжительности жизни

эритроцитов до 45,6 суток( Г. Е Дегтева, П. Е Сидоров, Е С. Ише-ков, 1983). При дальнейшем исследовании патогенеза алкоголизма методам тканевых к клеточных культур ( 77 больных) была обнаружена достаточно высокая обратная корреляционная зависимость между свойствами сыворотки и продолжительностью регулярного пьянства (г =-0,5 ).При этом терапия больных алкоголизмом тетурамом не влияла на биологические свойства сыворотки этих больных, в то время как использование нейролептиков приводило к достоверному снижению биологической репродуктивной активности сыворотки крови этих больных.

Полученные результаты позволяют предполагать,что высокая биологическая активность сыворотки крови больных алкоголизмом в первые дни абстиненции обусловлена множеством деструктивных катаболических процессов, происходящих в организме этих больных, вследствие чего сыворотка крови насышдется продуктами диссимиляции. Не исключается и усиленная выработка веществ,активирующих рост клеток и тканей. Эти данные согласуются с концептуальными представлениями о патогенезе алкоголизма и, в частности, работами Г. П. Колупаева, (1980 ), и А. В. Смирнова с соавт. , (1980), в которых было показано, что при развернутой стадии алкоголизма у больных развивается выраженная компенсаторная гипертрофия в гепатолиенальной и гепаторенальной системах.

7. Использование тканевых культур для оценки патологии

легких и почек Проведенные исследования показали,что рост тканей ir\ vitro зависит от физиологического состояния организма донора ткани. Ткани при культивировании проявляют высокую чувствительность к действию различных биологически активных веществ. Рост тканей в значительной мере зависит от репродуктивной активности сыворотки крови, свойства которой также определяются функциональным состоянием организма. Есе эти данные послужили основанием для разработки методологических принципов использования тканевых культур для диагностики и прогнозирования течения некоторых хронических заболеваний.

С этой целью мы изучили особенности роста микрофрагментов тканей, получаемых от больных с заболеваниями слизистой бронхов, легких и почек. Культивирование ткани проводили на поверхности ыиллипоровых фильтров СЫНГОР /7/ по разработан-

ной нами методике. Биоптаты ткани получали при диагностических исследованиях и при оперативных вмешательствах. Культивирование осуществляли в течение десяти дней при температуре 28 С. При исследовании оценивали площадь гоны роста,число выросших клеток, мнтотическук активность, патологические Форш митозов и число аномальных клеток. Ва аномальные принимали клетки, имеющие полиплойдные ядра( площадь которых превышала 700 мкм"2), многоядернмз' клетки (имеющее 3 и более ядер),клетки с множественной вакуолизацией цитоплазмы, клетки с выраженной фрагментацией ядер.

А. Использование тканевых культур для диагностики заболеваний слизистой бронхов.

При анализе полученного ■ материала ш сопоставили рост тканей слизистой бронхов и цитофиэиологические пакааатели клеток зоны роста с характером воспалительного процесса в бронхах, оцениваемого по клиническим признакам.

Полученные результаты показали, что.при хроническом бронхите на/Зшэдается значительное усиление роста тканей при культивировании по сравнении с небольшой группой больных, у которых изменения е бронхах выражены слабо. Ш мере нарастания тяжести заболевания-отмечалась также некоторая тенденция к усилении роста мккрофрагментов ткани in vitro, ■ увеличении числа аномальных клеток к снижении. штотической активности .

При сопоставлении роста тканей в зависимости от степени воспалении было установлено,что наиболее интенсивный рост ткани наблюдался при третьей степени воспаления - при хроническим катаральном бронхите, и при второй степени воспаления- при хроническом гипертрофическом бронхите. Кроме того , в целом, рост клеток при гипертрофическом бронхите был выше,чем при хроническом катаральном бронхите.

Аналогичным образом мы сопоставили интенсивность роста культур и некоторые свойства растущих клеток слизистой бронхов с патологией легких. Результаты показывают, что повышение роста тканей при культивировании наблюдалось при острых абсцессах и гангренах, а наиболее низкие показатели репродуктивной активности клеток отмечались при опухолевых заболеваниях легких. Больше всего аномальных клеток наблюдалось при

бронхоэктатической болезни и при опухолевых заболеваниях легких, а наиболее высокая митотическая активность -в культурах у больных с острой пневмонией.

На основании полученных результатов, мы пришли к заключению, что рост клеток ткани in vitro модно рассматривать как неспецифический показатель репродуктивной активности клеток и степени их повреждения при патологии. При зтом активация роста тканей при культивировании свидетельствует об усилении репаративной активности клеток, способных к делению. Напротив, снижение роста культур,нарастание в зоне роста числа аномальных клеток и патологических форм митозов свидетельствует о поражении этих клеток ткани.

Дня изучения корреляции роста клеток с некоторыми патофизиологическими показателями мы провели кх сопоставление. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Как видно из данных,представленных в таблице,имеет место обратная корреляционая зависимость роста культур с числом аномальных клеток и патологических митозов. На основании статистического анализа материала нами были выделены ориентировочные границы роста культур и числа аномальных клеток для заключения о характере нарушения репаративной активности клеток эпителия бронхов и возможном исходе заболевания.

Таблица 4

Корреляция интенсивности роста тканей in vitro с некоторыми цитофизиологическими показателями клеток в зоне роста

I N | п/п

Интенсивность роста культур (число клеток)

К -во|Аномаль-наб. |ные клет-|ки в Хо

Митот. актив, в

Патологич. митозы в 7.

100 - 500 501 - 1000 1001 - 2000 2001 - 4000 4001 -12000

19 22 31 31 19

|19,2% 2,9 |10,4± 1,8 |10,It 1,1 | 5,7i 0,7 | 3,lt 0,4 .1_

6,5*1,7 8,6±1,3 8,5*1,4 9,4*1,5 6,6*1,1

3,3* 3,0 0,9i 0,1 1,1* 0,3 0,6* 0,1 D,3i 0,1

Указанные конкретные количественные параметры носят ус-

ловный характер, т. к. установлены на основании определенного и ограниченного контингента больных. Между тем, принцип подхода позволяет решить задачу и при других условиях. Положительный эффект предложения заключается в том,что позволяет получить новую информацию о состоянии репаративных возможностей клеток ткани.

Используя полученные результаты,мы провели сопоставление оценок состояния больных, полученных при клиническом эндоскопическом исследовании, при стандартном патогистологическом исследовании и с помощью культивирования . Результаты сопоставления показали, что из 39 обследованных у 31 больного при эндоскопическом исследовании была констатирована возможность благоприятного исхода заболевания ( 80,0 -12,7% ) , при патогистологическом обследовании этот прогноз был подтвержден только у 23 -х больных ( 59,0 -15,5% ), в то время как при культивировании ткани такой прогноз был установлен лишь у 14 больных (35,4 -15,2%). В целом, у этой группы больных при эндоскопическом исследовании значительно чаще, чем при патогистологическом и на основании культивирования делалось заключение о благоприятном исходе заболевания.

В связи'с этим, мы провели пятилетнее наблюдение за группой больных иэ 27 человек,сопоставляя между собой патогисто-яогический прогноз заболевания с прогнозом,полученным на ос-ювании результатов культивирования ткани слизистой бронхов, I с действительным клиническим исходом заболевания у этих юльных через пять лет наблюдения. Подученные результаты [редставлены в таблице 5.

Из 'представленных в таблице результатов следует, что ис-ользованиэ тканевых культур в комплексе с патогистологичес-ими и клиническими методами позволяет более точно прогнози-овать отдаленный исход заболеваний бронхов.

Большое значение для оценки степени поражения культивиру-лэй ткани имеет оценка структурных особенностей зоны роста, ¡следования показали, что по мере развития хронического ганхита от простого катарального к хроническому атрофичес-)му происходит нарастание деструктивных явлений в зоне рос-I: появление полостей, своеобразной тяжистости, зон уплотне-и и разрежения роста, появления потоков фибробластов, оча-в пораженных .клеток и др. Причем эти структурные особенное-

ти клеточной колоний также в значительной мере зависели от характера патологического процесса в бронхах.

Таблица 5

Сопоставление клинического исхода заболевания у больных ХНЗЛ за 5 лет наблюдения с патогистологическим прогнозом и заключением, сделанным на основании культивирования ткани слизистой бронхов in vitro

1 1 Прогноз заболевания |

1 N Методика прогноз. Благоп- |Неопре- |Неблагоп- |

I п/п 1__ * риятный 1деленный |риятный 1 __________1__________1__________I

1 — 1 1. Патогистологический ----------1----------1----------1 I I 1

1 прогноз 44,8г18,7£|51,8tl9,27.| 3,717,27. |

1 2. Прогноз по резуль- 1 I 1

1 татам культивирова- 29, 6tl7,5E 140,7*18,8% 129,6i 17,5% |

1 ния 1 1 1

1" " 1 з. Клинический исход _ _ - -- - - | 1 1 1

1 заболевания через 1 1 1

1 5 лет 22,2115,9Г. 140,7±18,8% |37,OilS, 67. | 1 1 !

1. При простом катаральном бронхите наблюдается усиление роста клеточной колонки, ее размеры достигают 3,3-5,5шГ2. Число аномальных клеток не превышает 4,1%о. Зона роста состоит из мелких однородных клеток, имеющих высокую митотичес-кую активность. В зависимости от степени поражения клеток наблюдаются определенные стру.ттурнке нарушения организации клеточной колонии: появление отдельных аномальных клеток, образование валика уплотнения по периферии и др.

2. Цри гипертрофической форме бронхита отмечатся значительный размер клеточной колонии - до 5,5-3,0 мм"2 , число аномальных клеток достигает 9£о и более. Наблюдаются и значительные нарушения структурной организации клеточной колонии." При обшрм преобладании мелких, интенсивно дедяпдася эпителио-подобных клеток в зоне роста появляется значительное число

измененных клеток. В зоне роста образуются своеобразные тя-жистые структуры, участки многослойного роста клеток, по периферии колонии появляется окантовка крупными аномальными клетками.

3. При атрофическом бронхите происходит выраженная декомпенсация репаративных возможностей ткани , которая сопровождается снижением роста культур. Площадь клеточной колонии, как правило, менее 3,3 мм~2. На фоне значительного числа аномальных клеток наблюдаются нарушения упорядоченности структуры зоны роста: появление свободных полостей,"тяжистости" , значительного числа полиплойдных и многоядерных клеток, появление фибробластов и снижение митотической активности. (A.c. 1409944 AI ,В. П. Пащенко,В.П Еыков и В. Я. Леонтьев).

Таким образом ,по мере развития патологического процесса в.бронхах происходит нарастание дезинтегративных явлений,нарастание клеточной патологии,нарушение взаимодействия клеток, снижение митотической активности. В связи с этим, можно высказать предположение,что наблюдения Hayflick (1965 ) об ограниченности репаративных ресурсов клеток организма, могут реализовываться на уровне отдельных микроучастков ткани и актуально ставить вопрос об их микропатологии.

Проведенные исследования показали, что использование тканевых культур для оценки характера патологического процесса, наряду с другими методами,позволяет уточнить диагностику и прогнозирование ряд^ заболеваний.

В, Некоторые особенности роста тканей почек in vitro

Принципы, разработанные при культивировании фрагментов слизистой бронхов, были использованы нами и для оценки репа-ративной активности ткани почек урологических больных. Биопсии у больных брали в момент проведения операций. Забор фрагментов ткани осуществляли как из пораженного, так и непораженного отделов почек.

Сопоставление роста микрофрагментов ткани точек и различных цитофизиологических показателей от возраста и пола больных не выявило каких-либо существенных различий. Статистически достоверное увеличение роста микрофрагментов ткани было обнаружено лишь в возрастной группе- 20-34 года, по сравне-

- 32 -

нию с группой больных-35-44 года.

Сопоставление особенностей роста микрофрагментов ткани почек в зависимости от характера'патологии также не выявило значительных различий. Среднее число клеток в отдельных группах больных мало отличалось друг от друга, лишь при сопостав-. лении больных с гидронефрозом и мочекаменной болезнью отмечалось статистически достоверное различие в величине среднего квадратического отклонения ( Р<0,04 ). Статистически достоверные различия были обнаружены также в характере распределения размеров ,( площадей) ядер клеток у больных туберкулезом и опухолевыми заболеваниями.

Отсутствие достаточно четких различий между отдельными группами, на наш взгляд, обусловлено в значительной мере тем, что патология почек у оперируемых больных,как правило, носит сложный комбинированный характер. В связи с этим, мы попытались Еыделить группы больных с минимальным числом сопутствующей патологии, сопоставив больных с опухолевыми и воспалительными заболеваниями (пиэлитом и гидронефрозом).

Результаты сопоставления показали, что статистически достоверные различия обнаруживаются между группой опухолевых больных и больных с пиэлитом ( Р < 0,05 ).При этом наблюдается увеличение роста клеток у больных с воспалительными процессами в почках. Кроме того, наблюдалось определенное увеличение числа аномальных клеток в группе больных с гидро-• нефрозом, что, по-видимому, может указывать на значительное поражение их при этом заболевании .

Полученные результаты подтверждают мнение,что воспалительные процессы в организме сопровождаются увеличением способности к росту клеток тканей при культивировании. Между тем, в каждой группе больных наблюдался значительный разброс результатов. В группе опухолевых больных коэффицент вариации составлял 67,4%, в группе больных с гидронефрозом- 89,6%, а в группе больных пиэлитом- 58,9%. Ещз более значительными были колебания в количестве аномальных клеток у опухолевых больных-84,5%, больных гидронефрозом- 113,25, больных пиэлитом- 118,2%.

Более четкие результаты были получены нами при сопоставлении результатов культивирования тканей с патогистологи-ческим диагнозом. Результаты сопоставления представлены в

табдь 6.

Таблица 6

Зависимость роста клеток микрофрагменгов ткани почек урологических больных от характера заболевания ( патогистологический диагноз )

1 N Показатели | |Хроническое воспаление |

|п\п 1 Опухоле- 1 1

1 1 вые забо- | Катара-| С атро- С призна- |

1 1 левания | льное | фией ками |

11 I 1 1 1 1 1 1 склероза | 1

11. Число набл. | 10 1 6 | 12 4 1

1 2. К-во клеток в | 1 1 1

1 зоне роста |4829*848 |6394±157|6670*1027 7297*2586 |

1 з. Иитотич. актив. | 6,4*1,7 1 3,0*1,91 3,6*0,8 4,5*2,5 |

1 4. 1 Аномаль. клет. | 1 2,2i0,5 1 1,8*0,Б| 1 1 3,6*1,1 0,5i0,2 | 1

Из представленной таблицы видно,что относительно слабый рост наблюдается при опухолевых заболеваниях, в то время как при воспалении происходит статистически достоверное. поЕше-ние роста тканей при культивировании,достигая наибольших значений при' Есспалзжш с признаками склероза. Эти данные таге® показывают,что рост культур in vitro целесообразно рассматривать как индивидуальный нэспецяфячэский показатель реиаративиьк во2.моднютеД клеток и степени их поражения.

Из основании полученных данных мн таккэ выделили пограничные значения рссга культур и других цитофигиологичс-ских показателей для ориентировочной оценки результатов культивирования микрофрагмэнтов ткани почек.

. Особенностью структуры клеточной колонии ткани почек является довольно частое появление клеток с псняп?эйся вакуоли-знронаяой цитоплазмой и лолиплойдными ядраш, которые могут в 5-7 ррз превышать по плслэди ядра других клеток.

Структурные особенности клеточной колонии культуры почек отражает репродуктивные возможности клеток исходной ткани. Признаками интенсивного роста клеток являются: большие раз-

меры клеточкой колонии, упорядоченная однородная структура , однотипный клеточный состав колонии .Наоборот, морфологическими признаками низкой репродуктивной активности явяются: малые размеры клеточной колонии,контурированный ее край, небольшое число делящихся клеток. Е зависимости от характера патологии, структура клеточной колонии нарушается появлением больших клеток с полиплойдными ядрами, вакуолизированной цитоплазмой, обособленными микроколониями клеток,появлением свободных полостей и длинных цитоплазматических " мостиков" между отдельными клетками.

Рост ткани почек плодов человека, по сравнению с почками взрослых людей, отличался однородной структурой и ровной поверхностью зоны роста, в ней значительно реже встречались клетки с полиплойдными ядрами и уплотнения в виде многослойного роста. В центральной части культуры плодов почек наблюдались очаги органотипического роста в виде булавовидных вздутий и многослойного роста.

Таким образом, с возрастом и при патологии происходит дезинтеграция роста клеточной колонии почек,нарушение упорядоченности и однородности структуры клеточной колонии, снижение митотической активности и появление патологических клеточных форм.

В. Культивирование ткани паренхимы легких in vitro от больных хроническими заболеваниями ленда:

Шкрофрагменты ткани паренхимы легких человека отличались сравнительно слабой способностью к росту при культивировании. По морфологической структуре культура ткани паренхимы легкого не была однородна, зона роста состояла в основном из двух типов ' клеток : крупных фибробластопсдобных и колоний эпителиоподобных клеток.

Исследования показали, что наибольший процент выросших культур на 10-й день культивирования был в группе больных туберкулезом - 69,07., в группе больных злокачественными новообразованиями он составлял - 54,8Х,а у больных саркоидозок - 48,7Z. Между тем, установить достаточно четкие различия в сравниваемых группах было довольно затруднительно в связи со значительными колебаниями роста тканей у отдельных больных и

неоднородностью клеточного состава в зоне роста. При культивировании микрофрагыентов ткани паренхимы легких было, в частности,констатировано появление в зоне роста значительного количества симпластов у больных с бронхоэктатической болезнью, а также большого количества двухядерных клеток у больных саркоидозом.

Возможность использования метода культивирования тканей для диагностики и прогнозирования состояния репродуктивной активности некоторых тканей позволило нам предпринять попытку модифицировать биопсийньй анализ засчег уменьшения количества ткани, необходимой для проведения исследований. Для этой цели нами предложено устройство для проведения биопсий-ного анализа с использованием метода тканевых культур (А. с. N1801331 1А 1). Указанное устройство позволяет ограничиться минимальным количеством ткани,необходимым для проведения исследований.

Метод бесплазмэнных тканевых культур был использован нами для осущэствления трансплантации культур B-клеток плодов человека и свиней больным сахарным диабетом, которая проводилась в г.Архангельске по совместной программе с ГОШ Т и ПО Ü3 СССР (ЕЕ Бычихин,В. Е Пащенко,Т.Р. Романова и др., 1987; В. Е Пащенко, 1987 ; В. Е Елкмкин, В. П. Пащенко, в. Е Федотов , Н. В. Садовникова, 1983 ). Исследования показали, что культивирование микрофрагментов ткани поджелудочной железы, на поверхности миллипоровых фильтров обеспечивает условия для высокой секретороной активности В-клеток.

Таким образом, на основании представленных в работе исследований, представляется необходимым вьщелить тканевые культуры взрослых животных и человека в самостоятельное направление исследований. Неравномерность роста тканей при культивировании в случайной Еыборке микрофрагментов от животных и человека показывает, что в развитии патологии большое значение могут иметь локальные характеристики ткани. В работе было показано, что рост тканей при культивировании зависит от общего физиологического состояния организма и характера патологического процесса. Изучение характера роста тканей при культивировании и клеточкой патологии позволяет, з определенной степени, уточнить ¡типический, патогистологи-¡еский диагноз и прогноз заболевания. Проведенные наблюдения

показали, что метод тканевых культур позволяет выявить новые свойства клеток, которые недоступны для непосредственного изучения другими методами.

ВЫВОДИ

1.Poct тканей взрослых животных и человека при культивировании in vitro зависит от ряда условий: характера подложки, рН среды, способов разжигания тканей .на подложке, свойсте сыворотки. Значительное влияние на интенсивность роста культур оказывают свойства первичного эксплантата (вид ткани, возраст донора), используемого для культивирования, который является основным источником пролиферативно активных клеток в зоне роста.

2. Интенсивность роста культур, полученных от достаточно большой, непреднамеренной (" случайной") выборки микрофрагментов ткани, подчиняется резко асимметричному экспоненциальному распределению, которое не совпадает с распределением размеров самих микрофрагментов ткани, используемых для культивирования, что указывает на определенную независимость этих показателей.

3. Количественные исследования показали, что воспроизводимость результатов при использовании тканевых культур для оценки роста тканей взрослых животных и человека может дос-, тИгать 5-10%, а точность клинических исследований с использованием биопсийного материала- до 15%. Дальнейшее повышение точности наблюдений может .достигаться, в частности, засчет увеличения числа микрафрагментов ткани и совершенствования критериев оценки их роста. ■ *

4. Зона роста тканей взрослых животных и человека при

бесплазменном культивировании является по свое),(у клеточному составу смешанной .состоящей как из эпителио-, так и фиброб-ластоподобных клеток, при этом ее структурные морфологичэс-кие особенности обусловлены соотношением и функциональными свойствами клеток в исходной ткани.

5. Морфологические и электронно-микроскопические исследования клеток зоны роста тканей почек, легких и слизистых бронхов взрослых животных и человека показали, что в краткосрочных культурах (10-15 дней) этих тканей имеют место повышение пролифератизной активности клеток и их миграции в зону роста .

6.Изучение роста тканей организма in vitro показало, что при различных физиологических и экстремальных состояниях организма наблюдалось как усиление, так и угнетение репродуктивной активности клеток организма:

а) усиление роста клеток ткани почек мышей i.n vitro наблюдалось при образовании в организме очага воспаления, при развитии компенсаторной гипертрофии почт. Клетки тканей молодых животных в равных условиях росли лучше, чем более старых, ■ Усиление роста тканей наблюдалось после однократного острого охлаждения;

б) угнетение роста клеток in vitro наблюдалось, после однократного оОщэго облучения животных лучами Рентгена в дозе 500 г и 1000 г , при полисам голоданюг мышей в течение 5 двей.и при длительном постоянном охлаждении ;

в) изменения роста ткани почек при культивировании не наблюдалось при физической нагрузке различной продолжительности, при болевом раздражении и после эфирного и мединало-вого наркоза.

7. Изучение влияния на рост клеток in vitro и in vivo ряда биологически активных веществ:, адреналина, ацетилхолинЗ, гнстамина, АКТ Г, цистеина, глятатиона, АТФ и хлористого кадмия показало, что наиболее значительное угяетаэдэе влияние на рост клеток оказывают адреналин, гистамин и хлористый кадмий, в то время как преимущественно актгсвирующэе действие на рост культур оказывали цистеин и глвтатион. При этом ус-

тойчиеость клеток in vitro к токсическому действию адреналина, адатнлхолина, гистамина и хлористого кадмия была выше, чем самого организма .

8.Использование метода культивирования ткани для целей диагностики заболеваний основано на комплексной оценке интенсивности роста клеток (численности клеток в зоне роста) в соотношении с количеством в зоне роста аномальных клеток, патологических форм митозов, степенью нарушения упорядоченности структуры зоны роста. Рост тканей организма in vitro можно рассматривать в качестве интегративного неспецифического показателя репродуктивных и репаратквных возможностей некоторые тканей организма и степени поражения клеток, способных к росту при культивировании.

Q. Рост культур биоптатов слизистой бронхов больных в значительной мере зависел от характера патологического процесса в бронхах и легких:

а) при простом катаральном бронхите наблюдалось усиление роста клеточной колонии,а зона роста состояла из мелких однородных клеток, имеющих высокую ш¡готическую активность. I зависимости от степени поражения бронхов наблюдались структурные нарушения клеточной колонии: появление аномальных клеток, образование валика уплотнения по периферии, "размывание" четких границ клеточных колоний;

б) при гипертрофической форме хронического бронхита наблюдалось значительное увеличение размеров клеточных колони* и возрастание числа аномальных клеток. Наблюдалась усиление нарушения структурной однородности и упорядоченности клеточных колоний. Б зоне роста отмечалось появление " тяжистос-ти"- цитоплазматических перемычек между клетками, и окантовки колонии крупными клетками;

в) при атрофическом бронхите наблюдалась выраженная декомпенсация репродуктивных и репаративных возможностей клеток культивируемых тканей,что сопровождалось снижением рост; культур,появлением значительного количества аномальных клеток и более резко выраженными нарушениями однородности i упорядоченности структуры зоны роста клеточных колоний: появлением свободных полостей,нарастанием "тяжистости", значи-

телы.ого числа многоядерных клеток, фибробластов и снижением митотической активности.

10. Показало, что интенсивность и характер роста в культуре микрофрагментов ткани почек от больны:-: эаакеит от особенностей патологии почек. При этом, по сравнении с опухолевыми заболвЕЕ :-шями воспалительные процессы сопровождаются усилением роста. Патологические игм^кеккя в ткани лсчгк при их культивировании проявляются нарушением однородности ч упорядоченности зоны роста клеточной колонии, появлением значительного количества аномальных клеток н нарушением межклеточных взаимодействий.

11. Метод клеточных к тканены:-: культур г^оёволяет оценить интегративкую биологическун активность сыворотки кро2Н человека при различных физиологически:': и экстремальных состояниях организма, соотношение в ней зкткватороа к ингибиторов роста клеток. Увеличение биологической активности сыворотки крови было отмечена при длительном проливании человека в районах Крайнего Севера и у больных алкоголизмом, а угнетелие-у женщин во второй половине беременности.

1Е. }.йтод первичных тканевых культур взрослых животных и человека может служить адекватной моделью- и тестом для предварительного изучения различных,экстремальных воздействий на состояние клеток и тканей организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Модифицированный метод первичных тканевых культур, с использованием пробирок и миллипоровых фильтров , приспособленный для количественных исследований роста клеток, может быть рекомендован:

а) для изучения свойств клеток при различных физиологических , патологических и экстремальных состояниях организма;

б) для оценки влияния на клетки и ткани организма животных и человека различных токсических и лекарственных Ееществ, а также других экстремальных воздействий;

е) для оценки влияния на клетки сыворотки крови и других биологических жидкостей организма при патологических и экстремальных состояниях ;

г) в качестве доступного метода, не требующего сложного оборудования, для начального ознакомления студентов с методами культивирования тканей в медицинских и биологических учебных заведениях.

2."Способ прогнозирования течения хронических неспецифических воспалительных заболеваний бронхов"( А. с. N1409944, соавт.: В. IL Быков и В. Я. ЛеонтьеЕ), может быть использован в клинико-диагностических лабораториях для оценки степени поражения эпителия слизистой бронхов у больных ХКЗЛ.

3. " Пипетка" ( А. с. 1018711 ) может быть рекомендована в производство в качестве оборудования для лабораторий тканевых и клеточных культур и использована для суспенднрования и диспергирования клеточных взвесей или получения суспензий.

4. " Микропипетка" (A.c. 1509401) может быть рекомендована для производства в качестве . лабораторного оборудования биологических лабораторий и использована для оценки размеров микрофрагментов тканей и биологических объектов.

5. "Устройство для посадки на подложку микрофрагментов биологических тканей"( Патент N 1785530 ) может быть использовано для промышленного производства в качестве оборудования для лабораторий тканевых и клеточных культур,позволяющего упростить эксплантацию микрофрагментов тканей и микроагрегатов клеток на подложки для культивирования , а также других биологических объектов на соответствующие носители.

6. "Устройство для биопсийного аиализа"(А. с. 1801391) может быть использовано для взятия биопсии из исследуемого участка ткани животных и человека для последующего анализа роста микрофрагментов и оценки характера клеточной патологии непосредственно на стилете для забора микрофрагментов ткани. Преимущество его обусловлено взятием минимального,по

- 41 -

сравнению с обычной биопсией,количества ткани.

7. "Способ культивирования тканей поджелудочной железы плодов и других органов животных и человека для целей трансплантации", который заключается в том,что культивирование микрофрагментов ткани осуществляется на перфорированных носителях, пригодных для трансплантации. Преимущество состоит в лучшем прикреплении клеток к поверхности носителя , более интенсивном росте и высокой секреторной активности , чем на стекле. Мажет бьггь рекомендован для клинического использования в качестве метода трансплантации В-клеток.

8. "Способ оценки стадии алкоголизма"(Рац. предложение совметно с П. И. Сидоровым), заключается в оценке влияния сыворотки крови больных алкоголизмом на клетки печени плода человека. Оценка стадии алкоголизма проводится по характеру роста культур. Может быть использована как дополнительный метод оценки стадии алкоголизма в клинических условиях.

9. Предложения для практического использования, представленные в виде отраслевых рац. предложений и рац, предложений местного значения: " Цветная прозрачная морфомэтрическая окулярная сетка", "Использование штативов 1ЮА для размещения в термостате пробирок с культурами клеток и тканей","Способ культивирования тканей с использованием пористой накладки из капрона","Устройство для фиксации мелких лабораторных животных, оперируемых для удаления почек и надпочечников" ' могут быть использованы в экспериментальных исследованиях.

Списрк работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Влияние охлаждения на рост клеток почки в культуре ткани // 5 Поволжская конференция физиологов, биохимиков и фармакологов с участием морфологов. -1969. -С. 268-269.

2. Влияние сероводорода и магилмеркапгана на клетки эмбри-1НОВ человека в культуре тканн // Груды Казанского медицине-сого института. -Казань. -1969. -С. 195-196.

3. Влияние некоторых ингибиторов и активаторов сульфгид-дальных групп белков на клетки эмбрионов человека в культу->е// Гигиена населенных мест. -Киев. - 1969. -С. 46-48.

4.' Влияние охлаждения'животных на репродуктивную актив-юсть клеток почки, определяемую методом тканевых культур

VАкклиматизация -человека в условиях полярных районов. "Ленинград. - 1969. - С. 153-154.

5. Методика использования тканевых культур для изучения клеточной реактивности при охлаждении животных // Акклиматизация и краевая патология человека на Севере. -Архангельск. -1370. - С. 135-137.

6. Елияние охлаждения животных на рост клеток почки в культуре ткани // Акклиматизация и краевая патология человека на Севере.- Архангельск.-1970.-С. 140-141.

7. Состояние организма и рост клеток почки в культуре ткани // Акклиматизация и краевая патология человека на Севере. - Архангельск. -1970. -С. 142-144.

8. Влияние однократного охлаждения на рост кусочков почки в культуре ткани // Акклиматизация и краевая патология человека на Севере.-Архангельск.-1970.-С. 138-139.

9. Влияние экстремальных воздействий на рост почечной ткани е культуре // Билл, экспериментальной биологии н мзд. -1970. - N 8. - С. 94-98.

10. Изменение активности АТС-азы и рост ткани от животных в культуре после охлаждения // Материалы XXX научной сессга: АГМИ. -Архангельск. -1971. -С 35-37. ( в соавт. В. П. Реселов)

11. Елияние гистамина, ацетилхолина и адреналина на рост ткани почек в культуре // Материалы XXX научной сессии АГМИ. - Архангельск.-1971. - С. 156-158.

12. К вопросу использования метода тканевых культур для количественной оценю! роста тканей и статистической обработки наблюдений // Материалы XXX научной сессии АГМИ. -Архангельск. - 1971.- С. 158-159.

13. Влияние некоторых природных факторов Крайнего Северг на цитофизиологическое состояние клеток организма // Вопрос! медицинской географии Севера Европейской части СССР. - Апатиты. - 1972. - С. 40-42.

14. Изучение роста почечной ткани в культуре при физической нагрузке к некоторых экстремальных состояниях организм; // Тезисы докладов научно- методической конференции по проблемам физического воспитания и спортивной медицины на .Севере. -Архангельск. - 1972. - С. 62-64.

15. Использование метода тканевых культур в эксперимента: на животных // Вопросы краевой патологии. - Архангельск. -

972. - С. 198-200.

16. Влияние пониженной температуры и общего облучения жи-ютных рентгеновским! лучами на способность к росту культур очек // Действие физических агентов на организм жиеот-:ых. -Одесса. -1972. - С. 600-601.

17. ПролифератиЕный потенциал тканей организма при охлаж-ении // Медико-биологические проблемы адаптации часеления в словиях Крайнего Севера.- Новосибирск.-1974. - С. 60-61.

18. Изучение адаптационного потенциала клеток организма [етодом культивирования // Тезисы докладов Всесоюзной конфе-енции по адаптации и проблемам общей патологии. - Новоси-ирск. - т. 2.- 1974.- С. 166-168.

19. Количественная оценка жизнеспособности почечной ткани :ри различных воздействиях на организм донора // Билл, экс-ериментальной биологии и мед.- 1976.-Ы 12.- С. 1514-1515.

20. Изучение клеточной адаптации организма // Механизмы :овреждения резистентности, адаптация и декомпенсация. Тез. ;окладов 2-го Всесоюзного съезда патофизиологов. - т. 2. - Таш-:ент .- 1976.- С. 416.

21. Внешние и внутренние факторы адаптации к холоду /Тез. докладов 2-го Всесоюзного съезда патофизиологов.

.2. Ташкент,-1976. - С. 332-333. ( в соавт. В. В. Аристова, Ю. Р. еддер,. С. П. Борисова и др.).

22. Изучение адаптации клеток организма методом культиви-ювания // 'Тезисы 4-го Международного симпозиума по приполярной медицине.- Новосибирск.-'1978.- т. 1. - С. 146-147.

23. Количественная оценка свойств сыворотки крови и неко-орых'биологически активных веществ с помощью тканевых куль-ур // Материалы по актуальным вопросам современной гистопа-ологии. - Москва. - 1978. - С. 26-27.

24. Влияние условий культивирования на количественную 'Ценку жизнеспособности тканей организма // Егалл. экспери-¡ентальной биологии и мед.- N 11.-1978,- С. 629-631.

25. Особенности роста легочной ткани человека в бесплаз-генной тканевой культуре // Материалы по актуальным вопросам ^временной гистопатологии . - Москва. -1979. - С. 25-27. ( в оавт. В. А. Ерагиным ).

26. Некоторые количественные особенности роста фрагментов ■кани легких и почек в первичной культуре // Материалы по

актуальным вопросам современной гистопатологии. - Москва. -

1980.- С. 92- 93.

27. Изучение адаптации клеток организма путем культивирования // Адаптация человека в различных климато-географичес-ких и производственных условиях. Тезисы докл. 111 Всесоюзной конференции в Ашхабаде . -Новосибирск. -1981. - т. 5. -С. 132-134 .

28. Влияние сьшоротки больных алкоголизмом на репродуктивную активность эмбриональных клеток человека // Материалу по актуальным вопросам современной гистопатологии. - Москва. -

1981.- С. 97-80 . { в соавт. П. И. Сидоров, а С. Ишеков).

29. Биологическая активность сыворотки крови у доноров и беременных женщин Европейского Севера // Эколого- гигиениче ские и клинические вопросы жизнедеятельности человека в условиях Севера. Материалы Всесоюзной конференции. - Новосибирск.-1980. - С. '24-25 .

30. Влияние холодовой травмы на регенерацию тканей поче» // Острое и хроническое поражение холодом. Тромбоэмболия легочной артерии.- Москва.-. 1982. - С. 53-54 .

31. Ранние формы алкоголизма. Возможности методики клеточных культур в диагностике алкоголизма // Депон. ВИНГ1 центр. 17. Инв. N 0283.0049652 . - Москва. - 1982 . ( в соавт. И. Д. Муратова, И И. Сидоров , Н. С. Ишеков и др. ).

32. Влияние сыворотки крови жителей Заполярья на репродуктивную активность фибробластов эмбрионов человека в культуре // Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии. - Москва. - 1982. - С. 54 .

33. Функциональные и морфологические особенности культур, полученных из поджелудочной железы плодов человека // Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии. -Москва - 1983.- С.77-78. ( в соавт. В.Е Влюмкин, ЕЕ Федотов, Н В. Садовников ).

34. Цветная прозрачная морфометрическая сетка // Изобретательство и рационализация в медицине. - Москва. -1983. - С. 11!

35. Клинико- морфологические изменения органов дыхант при заболеваниях легких в условиях Архангельской области. /. Депон. ЕНИГИ, центр. 17. Инв. N 0283.0055275 .- Москва -1983. (в соавт. А. Г. Марачев, А. Г. Носов,С. С. Решетников и др.)

36. Влияние сыворотки больных алкоголизмом на рост пер

вичных культур плодов человека // Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии. - Москва - 1983. - С. 65-66. (в соавт, П. И. Сидоров, а Л. Чуркин, И. Н. Борисов).

37. Морфофункциональная характеристика культур, полученных из микрофрагментов поджелудочной железы плодов человека .'/ Проблемы трансплантологии и искусственных органов. Труды ШШТ и ПО Ш СССР. - Москва. - 1983. - С. 75- 78. (в соавт. В. Н Влюмкнн, В. П. Федотов,Н. В. Садовникова)

38. Влияние сыворотки крови больных алкоголизмом на репродуктивную активность фибробластов эмбрионов человека // Курн. Невропатологии и психиатрии.- 1984. -N2,-вып. 2. - т.ЬХХ XIV. - С. 240-243 .(в соавт. П. К Сидоров, Н С. Ишеков )

39. Использование мягких полиэтиленовых пакетов для культивирования клеток и тканей // Изобретательство и рационализация в медицине. - Москва. - 1985. - С. 31-32.

40. Использование первичных культур для диагностики хро-яических неспецифических воспалительных заболеваний бронхов '/ Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии. - Москва. -1986. - С. 58-59. (в соавт. с В. П. Быковым,В. а Леонтьевым ).

41.(Влияние сыворотки крови больных алкоголизмом на рост первичных культур почечных клеток плодов человека // Нурн.: Невропатологии и психиатрии . - N 2. -1987 . - С. 237-1239 . ( в зоавт. П. И. Сидоров, И. а Борисов, Е Л. Чуркин ).

42. Культивирование микрофрагментов ткани поджелудочной железы плодов чеовека на поверхности миллипоровых фильтров ,'/ ' Современные проблемы экспериментальной и клинической эндокринологии. IV съезд эндокринологов Украинской ССР. -Киев. -1987.- С. 287.

43. Использование культур В- клеток для коррекции дисгор-мональных нарушений при сахарном диабете // Современные гсроблеты экспериментальной эндокринологии. IV съезда эндокринологов Украинской ССР. - Клев. - 1987. - С. 52- 53. ( в соавт. Н. П. ■ Бычихин, Т. Р. Романова, В. и. Сатыбалдыев , Л. А. (.¡ельничук ).

44. Использование первичных тканевых культур для диагностики течения бронхитов // Актуальные проблемы адаптации и здоровья населения Севера.- Архангельск.- 1991.- С. 123 -124. ; в соавт. В. П. Быков, В. Я. Леонтьев ).

- 46 -

45. Изучение роста тканей животных при стрессе и при воздействии ряда биологически активных веществ методом культуры ткани // Актуальные проблемы адаптации и здоровья населения Севера.- Архангельск.- 1991.- С. 43-45.

46. Некоторые особенности роста микрофрагментов ткани почек в культуре при патологии // Актуальные проблемы адаптации и здоровья населения Севера. - Архангельск. - 1992. - С. 151-153. С в соавт. A.A. Ошурков, Э. И. Данилко ).

47. Некоторые ультраструктурные особенности клеток в первичных культурах, легких и бронхов // Актуальные проблемы адаптации и здоровья населения Севера. - 1992.- С. 17-19.

48. Пипетка для суспендирования и диспергирования, используемая при постановке тканевых и клеточных культур // Сб. Изобретательство и рационализация в медицине, М. ,- 1992, С. 23-24.

49. Опыт культивирования тканей при физиологических и патологических состояниях организма. Депонирована ВИНИТИ,

N 1904- В93, от 07.07.1993,Москва, 1993 ,С. 7В. (Монограф.)

Изобретения по теме диссертации.

1. Пипетка ( для суспендирования и диспергирования, используемая при постановке тканевых и клеточных культур ).-АЕторское свидетельство N 1018711 .-1982 г.

2. Способ прогнозирования течения хронических неспецифических воспалительных заболеваний бронхов. Авторское свидетельство U 1409944 AI.-1988, (Соавт. В. П. Быков и В. а Леонтьев).

3. Ыикропипетка. Авторское свидетельство N 1509401 , 1989.

4. Устройство для посадки на подложку микрофрагментов биологических тканей. П а т е н т N 1785530,1991 г.

5. Устройство для биопсийного анализа . Авторское свидетельство N 1801391 1А1 ,1993.

Рационализаторские предложения по теме диссертации.

1. Цветная прозрачная морфометрическая окулярная сетка // Рац. предложение отраслевого значения N 0-1296 2-й М0ЛШ1 .

Шсква. - 1980.

2. Способ культивирования животных тканей на миллипоровых ильтрах с использованием пробирок // Рац. предложение от-аслеЕОИЗ значения N 0-1295 2-й М0ЛГШ1 .-Москва .-1980 .

3. Устройство для фиксации мелких лабораторных животных, перируемых для удаления почек, надпочечников и других орга-ов // Рац. предложение отраслевого значения N О- 1648,2- й ЭЛГМИ. - Москъа. - 1981.

4. Использование мягких полиэтиленовых пакетов ( мешоч-эв) для культивирования клеток и тканей // Рац. предложение граслевого значения N 0-1608, 2-й МОЛГМИ. -Шсква.-1981 .

5. Использование штативов 1ЮА (штативов для получения голбиков скошенного агара в пробирках) для размещения в эрмостате пробирок с культурами клеток и тканей // Рац. редлсжение N 5/78 , АГШ. - Архангельск. -1978 .

6. Способ культивирования тканей с использованием порисуй накладки из капрона // Рац. предложение М 34/83 , АГШ . -рхангельск.-1983 .

7. Способ оценки стадии алкоголизма // Рац. предложение 41/85, АГМИ .-Архангельск.-1985. (в соавт. с П. И. Сидоровым).

8. Насадка к пипетке для суспендирования и диспергирова--1Я // Рац. предложение Ы 40/85 , АГШ - Архангельск. -1985.

9. Способ культивирования тканей поджелудочной железы подов и других органов животных и человека для целей транс-интации // Рац. предложение N 35/83, АГ№1 - Архангельск. -383 . •