автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.07, диссертация на тему:Ультрафиолетовая спектрометрия жидких биологических сред и разработка методов анализа поликомпонентных сред

На правах рукописи

Коноплев Георгий Асадович

УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ ЖИДКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА ПОЛИКОМПОНЕНТНЫХ СРЕД

Специальность 05.11.07 - Оптические и оптико-электронные

приборы и комплексы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном электротехническом университете «ЛЭТИ» им В.И. Ульянова (Ленина)

Научный руководитель - доктор технических наук, доцент Василевский А. М.

Официальные оппоненты

доктор технических наук, профессор Семенов Г. Б. доктор технических наук, профессор Сидоренко В. М.

Ведущая организация -

Научно-исследовательский центр экологической безопасности РАН

Защита диссертации состоится « Я » С/НУ НУ 2005 г. в часов на заседании диссертационного совета Д212.238.08 в Санкт-Петербургском государственном электротехническом университете «ЛЭТИ» им В.И. Ульянова (Ленина) по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 5.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке университета Автореферат разослан « /2 » /Ус/Л 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Смирнов Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Метод абсорбционного спектрального анализа широко используется в на> ке и технике Преимуществами данного метода являются оперативность, высокая воспроизводимость, малый объем пробы, неинвазив-ность, возможность реализации мониторинга состава среды в проточном режиме, сравнительно невысокая стоимость используемой аппаратуры, отсутствие необходимости в использовании реактивов, низкая трудоемкость и возможность автоматизации. Особое место спектральные методы анализа занимают в биомедицинских исследованиях, где более чем в 30% аналитических методик используется оптическая регистрация. Отметим лишь несколько основных направлений этих исследований - контроль экологического состояния среды обитания человека, клинико-лабораторные биохимические исследования нативных жидких биологических сред (ЖБС) организма, мониторинг процессов при проведении эфферентной терапии, фармакологические исследования, контроль качества пищевых продуктов.

Наиболее информативной для спектрального анализа ЖБС является ультрафиолетовая (УФ) область, где, с одной стороны, лежат электронные полосы поглощения многих хромофорных групп, а с другой, располагается «окно прозрачности» воды, которая является растворителем во всех жидких средах естественного происхождения. Современные УФ спектрофотометры построены на основе многоэлементных приемников излучения, полностью автоматизированы, передают спектры непосредственно на компьютер, что дает возможность проводить анализ в реальном масштабе времени.

Количественный абсорбционный анализ базируется на законе Бугера-Ламберта-Бера, устанавливающем линейную зависимость спектрального показателя поглощения однородной среды от концентрации, и принципе аддитивности, согласно которому показатель поглощения смеси равен сумме показателей поглощения отдельных компонентов. Многими исследователями показано, что закон Бера и принцип аддитивности соблюдаются лишь для слабоконцентрированных сред Кроме того, обычно анализ проводится на одной или нескольких дискретных длинах волн, как правило, соответствующих максимумам характеристических полос поглощения компонентов среды, в то время как информация о составе ЖБС рассредоточена в широком спектральном интервале. Поэтому, применение классического абсорбционного спектрального анализа для исследования ЖБС и жидких лекарственных форм, когда концентрация может изменяться в широких пределах, в случае однокомпонентных сред приводит к значительным погрешностям, а для поликомпонентных сред практически исключено.

Цель настоящей работы - разработка и исследование методов спектрального анализа ЖБС и их компонентов в УФ области спектра, снимающих ряд ограничений классической абсорбционной спектрофотометрии применительно к поликомпонентным средам.

Основные задачи, которые необходимо решить для достижения указанной цели включают в себя следующее:

построение математической модели, описывающей зависимость спектральных характеристик поглощения ЖБС в УФ области спектра от концентрации ком-

понентов;

разработка методики определения параметров модели для конкретной ЖБС и расчета концентрации компонентов по спектру;

оценка эффективности модели применительно к анализу однокомпонентных биологических сред в Широком диапазоне концентраций;

экспериментальное исследование разработанных моделей для анализа поликомпонентных сред - перитонеального диализата больных, страдающих хронической почечной недостаточностью (ХПН), и поликомпонентных жидких лекарственных сред.

Методы исследований.

Для решения поставленных задач использовались методы абсорбционного спектрального анализа по электронным спектрам поглощения, аналитические методы аппроксимации функций многих переменных, методы оптимизации, статистические методы оценки степени достоверности результатов. Научная новизна рг.боты состоит в следующем:

Сформулирована математическая модель, описывающая спектральные характеристики поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области при изменении концентрации в широких пределах.

Разработана новая методика анализа однокомпонентных сред с учетом нелинейной зависимости показателя поглощения от концентрации в пределах информативной области спектра.

Разработан метод спектрофотометрического определения концентрации доминирующего компонента в поликомпонентных средах.

Впервые обнаружены индивидуальные особенности УФ спектров экстинк-ции перитонеального диализата больных страдающих ХПН, и предложена методика классификации спектров диализата по форме кривой пропускания. Практическая значимость работы заключается в следующем. Разработанная методика может быть использована в клинико-биохимических лабораториях учреждений практического здравоохранения при анализе жидких поликомпонентных сред, а также для оперативного контроля эффективности детоксикационных мероприятий.

Результаты работы подтверждены актами внедрения Городского центра ге-мокоррекции г. Санкт-Петербурга и научно-исследовательской лаборатории фармакологических исследований СПб химико-фармацевтической академии. Научные положения выносимые на защиту:

- Математическая модель, описывающая спектральные характеристики поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области, должна учитывать возможное несоблюдение закона Бера и принципа аддитивности путем введения в разложение показателя поглощения по концентрации членов высших порядков.

- Количественный спектрофотометрический анализ ЖБС в УФ области спектра должен проводится в пределах всего информативного для исследуемой среды спектрального диапазона.

- Методика спектрального анализа, основанная на предлагаемых принципах, позволяет существенно повысить точность анализа однокомпонентных сред в широком диапазоне изменения концентрации, а также дает возможность

проводить анализ сложных поликсмпонентных сред по доминирующему

компоненту.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях:

- Вторая международная конференция молодых ученых и специалистов "Оп-тика-2001", Санкт-Петербург, 2001.

- Международный оптический конгресс «Оптика-XXI век», Санкт-Петербург, 2002.

- VIII Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная ин-форматика-2002», Санкт-Петербург, 2002.

- IX Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная ин-форматика-2004», Санкт-Петербург, 2004.

- VI Международная конференция «Прикладная оптика», Санкт-Петербург, 2004.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них - 2 статьи, тезисы к 7-ми докладам на международных и национальных научно-технических конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы, включающего 73 наименования и одного приложения. Основная часть работы изложена на 109 страницах машинописного текста. Работа содержит 68 рисунков и 21 таблицу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследований, определены цели и задачи, показана научная новизна и практическая значимость работы, изложены основные научные положения, выносимые на защиту, и описана структура диссертации.

В первой главе рассмотрены существующие методы количественного абсорбционного спектрального анализа однокомпонентных и поликомпонентных ЖБС в ультрафиолетовой области спектра. Рассмотрены важнейшие характеристики ЖБС, проведен анализ современных методов исследования состава наиболее значимых ЖБС, приведены примеры использования УФ спектрофотометрии для анализа состава ЖБС. Проанализированы основные факторы, ограничивающие возможность применения УФ спектрофотометрии для исследования ЖБС.

Большинство известных методов количественного спектрофотометрического анализа базируются на следующих основных принципах:

- Предполагается соблюдение классического закона Бугера-Ламберта-Бера и принципа аддитивности.

- Измерения проводятся на одной или нескольких дискретных длинах волн.

- Молярные показатели поглощения всех компонентов считаются известными.

При этом задача расчета концентрации по спектру сводится к решению линейного уравнения в случае однокомпонентной среды или системы линейных уравнений для поликомпонентной среды (метод Фирордта).

Известно, что закон Бера и принцип аддитивности соблюдаются лишь в слабоконцентрированных средах, когда межмолекулярные взаимодействия не оказывают заметного влияния на показатель поглощения среды. В ЖБС данное допущение, как правило, не выполняется, так как концентрации многих компонентов значительны и могут изменяться в широких пределах. Спектры поглощения компонентов ЖБС в большинстве случаев перекрываются, поэтому информация о составе ЖБС рассредоточена в широком спектральном диапазоне и методики проведения измерений на нескольких дискретных длинах волн имеют ограниченное применение. Кроме того, в состав ЖБС входит большое количество веществ, концентрация и молярный показатель поглощения которых неизвестны.

Исходя из этого, к спектрофотометрическим методам анализа ЖБС предъявляются следующие требования:

- Учет несоблюдения закона Бера и принципа аддитивности

- Возможность проведения анализа при сильном перекрытии спектров поглощения отдельных компонентов

- Широкий рабочий диапазон концентраций

- Использование для анализа всей информативной спектральной области

- Возможность определения одного или нескольких основных компонентов в присутствии множества других слабо поглощающих веществ, концентрация и молярный показатель поглощения которых неизвестны. Применяемые в настоящее время спектрофотометрические методики не

удовлетворяют одновременно всем вышеперечисленным требованиям. Таким образом, для достижения цели работы необходимо решить ряд задач- Разработать математическую модель поглощения однокомпонентной среды в широком интервале длин волн в условиях несоблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера.

- Разработать математическую модель поглощения поликомпонентной ЖБС в условиях несоблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера и принципа аддитивности.

- Разработать методику градуировки и расчета концентрации по предложенным моделям, с целью определения концентрации отдельного компонента в поликомпонентной среде.

- Исследовать спектры экстинкции ЖБС и их основных компонентов с целью выявления корреляционных связей между концентрацией и спектральными характеристиками поглощения и определить информативные спектральные диапазоны.

- Экспериментально исследовать применение предлагаемых методик применительно к однокомпоиентным и поликомпонентным ЖБС.

Вторая глава посвящена разработке математической модели, описывающей спектральные характеристики поглощения однокомпонентных и поликомпонентных сред в зависимости от концентрации компонентов.

При построении модели учтены следующие характерные особенности ЖБС'

Гс'" V

к=Рс с= ; к =

к. .V

- Спектральная информация о составе исследуемой среды рассредоточена в широком интервале длин волн.

- Наличие межмолекулярных взаимодействий приводит к отклонению от закона Бера и принципа ад дитивности

- Кроме определяемых компонентов исследуемая среда содержит также мешающие компоненты, спектральные характеристики и концентрация которых неизвестны.

Ультрафиолетовый спектр поглощения можно рассматривать как функцию зависимости показателя поглощения от длины волны кл(Я), заданную в интервале длин волн Л,... ?п. При использовании спектрофотометров на основе многоэлементных приемников излучения функция кя (Я) определена в конечном числе точек (дискретных длин волн) и трансформируется в вектор к размерное 1ью ЛР, равной числу ячеек фотоприемника. Направление вектора характеризует форму спектра, а его длина - общий уровень поглощения.

В наиболее общем виде модель поглощения ^-компонентной среды можно представить в виде математического оператора Р преобразующего вектор концентраций компонентов С в вектор значений показателя поглощения к:

(1;

При соблюдении закона Бугера-Ламберта-Бера и принципа аддитивности, лежащих в основе классического абсорбционного спектрального анализа, Р является линейным оператором. В сложных средах данные условия не выполняется, и требуются более развитые модели, предполагающие наличие нелинейной зависимости показателя поглощения от концентрации. Построение таких моделей требует значительных усилий даже для однокомпонентных сред, а для многокомпонентной среды, состав которой изменяется произвольно, представляет собой чрезвычайно сложную задачу, которая в настоящее время не решена.

Задача количественного спектрального анализа заметно облегчается, если априори известно, что процессы изменения концентрации компонентов анализируемой среды носят в той или иной степени согласованный характер. В частности, проведенные исследования показали, что для ЖБС в процессе детоксикационных мероприятий, ряда жидких лекарственных форм, характерно постоянство формы спектра при значительных вариациях общего уровня поглощения. Данный факт обусловлен тем, что концентрации информативных (оказывающих заметное влияние на спектр поглощения) компонентов в таких средах изменяются приблизительно пропорционально.

Вначале рассмотрим однокомпонентные среды. Разложим зависимость кх(С) в ряд Тейлора по степеням концентрации:

Коэффициент разложения первого порядка представляет собой молярный показатель поглощения классического закона Бугера-Ламберта-Бера. При малых концен-

трациях члены высших порядков пренебрежимо малы, зависимость кх(С) можно считать линейной, и выражение обращается в закон Бугера-Ламберта-Бера. С ростом концентрации вклад членов высших порядков становится заметным В работе показано, что для исследуемых сред в разложении можно ограничиться первыми двумя членами. Коэффициент разложения второго порядка назовем молярным по-

(2)

казателем поглощения второго порядка е\ :

кх{С)=ехС + е?С\ (3)

Молярные показатели спектрального поглощения первого и второго порядка не могут быть рассчитаны теоретически, поэтому параметры модели применительно к конкретной среде должны быть определены экспериментально в ходе градуировки. Для этого необходимо приготовить набор из I проб исследуемой среды с известной концентрацией, измерить их спектры и определить границы информативной спектральной области. На каждой длине волны информативного спектрального диапазона составим систему уравнений, решая которую методом наименьших квадратов можно вычислить спектральные компоненты вектора молярных показателей поглощения £л:

С, С,2

c,cl

„

Б12) К

=>с£,=кд^£л=(стс)"'сгкл.

Переходя к поликомпонентным средам по аналогии с (3) имеем: кл(С,,С2...С,) = ¿(sMC, + ej?C?)+ YZsfiC,CJ,

J*'

(4)

(5)

где

д\ дС,дС,

е ет-

молярный показатель поглощения второго порядка, учитывающий взаимодействие между i-м и j-м компонентами среды;

молярные показатели поглощения первого и второго порядка для i-ro компонента.

Рассмотрим случай, когда необходимо определить концентрацию только одного компонента поликомпонентной среды, поглощение излучения которым вносит наибольший вклад в суммарное поглощение среды в используемой для анализа спектральной области Условно все мешающие компоненты можно разделить на две группьг 1) группа компонентов, концентрация которых изменяется от пробы к пробе практически пропорционально изменениям концентрации определяемого компонента; 2) группа компонентов, концентрация которых изменяется независимо от концентрации определяемого компонента. Выразим концентрации компонентов первой группы через концентрацию определяемого компонента С, = gtC, причем g, = const, концентрации компонентов второй группы заменим их средними значениями для исслед>емой среды С, = С, Элементарные преобразования выражения (5) дают:

к,(С) = + {ех + А ех)С + (*?> + Дв<2> )с2. (6)

Таким образом, вклад р поглощение среды всех компонентов за исключением определяемого может быть учтен введением в зависимость (3) всего трех дополнительных коэффициентов - поправок к молярным показателям поглощения определяемого компонента Дгя и Дб^2>, учитывающих интегральный вклад компонентов первой группы, и постоянной составляющей к°х, учитывающей интегральный вклад компонентов отнесенных ко второй группе. Вышеуказанные коэффициенты являются характеристикой не конкретного вещества, а исследуемой среды в целом, и будут различными по величине для одного и того же определяемого компонента в различных средах Они не могут быть рассчитаны теоретически, и должны быть определены из экспериментальных данных в ходе градуировки самостоятельно для каждой исследуемой среды.

Градуировка проводиться по набору проб поликомпонентной среды, концентрация определяемого компонента в которых измерена одним из биохимических методов. Предварительно для определяемого компонента, в ходе исследования од-нокомпонентных модельных растворов, вычисляют молярные показатели поглощения первого и второго порядка. Поправки к°, Ае;, Л г!2' находят из системы уравнений аналогичной системе (4) с помощью метода наименьших квадратов

Процедура вычисления концентрации по измеренному спектру для простых моделей, таких как закон Бугера-Ламберта-Бера, сводится к применению обратного оператора к вектору значений показателя поглощения С = к. Предложенная модель представляет собой оператор, который аналитически не может быть обращен, поэтому для расчета концентрации необходимо использовать мегод оптимизации. Подставляя концентрацию в разложение (6) можно рассчитать и восстановить спектр поглощения кга"т =- РС во всем информативном спектральном диапазоне. Варьируя элементы вектора С, и добиваясь наилучшего совпадения измеренного к и рассчитанного к°°ст спектров, можно вычислигь концентрацию основного компонента. Общепринятым численным критерием степени идентичности восстановленного и экспериментально зарегистрированного спектров является квадрат модуля разности векторов к и к*"'" :

Д = к - к90™ 2 = § (к„ - к°„ - е'аС - <(2)С2} (7)

Для оценки степени достоверности полученных результатов необходимо вычислить коэффициент подобия формы восстановленного и реального спектров 5,(к,к'ост), под которым здесь понимается нормированное скалярное произведение

векторов к и к"*"1. Коэффициент подобия зависит только от формы спектральной кривой и не зависит от общего уровня поглощения.

Ч ^ кеоап

5(к, к—) = 1000 " " , ц • (8)

В том случае, если величина коэффициента подобия превышает пороговую величину 8л!1р, результат расчета концентрации можно считать достоверным Конкретное значение 5 определяется экспериментально исходя из особенностей анали-

зируемых сред и рабочего интервала длин волн. Наши исследования показали, что для однокомпонентных сред пороговый коэффициент подобия целесообразно выбирать равным Б„ар = 990, для многокомпонентных сред - ?>тр = 950

В третьей главе представлены результаты применения разработанного метода для анализа однокомпонентных сред.

УФ спектрофотометрия в силу простоты, оперативности и невысокой стоимости анализа широко используется для контроля состава многих однокомпонентных сред и, прежде всего, жидких лекарственных форм. Возможности классического абсорбционного спектрального анализа в этой области существенно ограничены тем, что концентрация в таких средах может изменяться в очень широких пределах, что приводит к высокой погрешности результатов, обусловленной несоблюдением линейного закона Бугера-Ламберта-Бера. Методы расчета концентрации по градуировочным графикам и номограммам, к которым часто прибегают в таких случаях, архаичны и не дают возможность эффективно автоматизировать процедуру анализа.

Предложенная в диссертационной работе методика позволяет преодолеть указанное ограничение путем перехода от линейного закона Бера к аппроксимации зависимости кл(С) квадратичным полиномом, и использования для анализа не одной дискретной длины волны, а всего информативного спектрального диапазона

В работе приводятся результаты экспериментальных исследований по предложенной методике для анализа основных компонентов ЖБС организма' человеческий альбумин (один из белков плазмы крови), мочевая кислота, глюкоза, а также цианокобаламин (фармакологическая форма витамина В^). Для каждого из перечисленных веществ были приготовлены наборы растворов известной концентрации и сняты их спектры. Затем в соответствии с (4) была проведена градуировка, в ходе которой во всем рабочем интервале длин волн были рассчитаны молярные показатели спектрального поглощения первого и второго прядка. Отметим, что для альбумина зависимость к; (С) в исследуемом диапазоне концентраций хорошо описывается линейным законом, и молярный показатель поглощения второго порядка £(/} близок к нулю.

Для регистрации спектров использовался многоканальный автоматизированный спектроанализатор, основные технические характеристики которого приведены в табл. 1.

Таблица 1

Технические характеристики спектроанализатора. _

Рабочий спектральный диапазон 198-406 нм

Спектральное разрешение 0.4 нм

Дифракционная решетка вогнутая, 4-х секционная

Источник излучения дейтериево-неоновая лампа ДНМ-15

Фотоприемник УФ ПЗС (512 элементов)

Время регистрации одного спектра 8 мс - 2 с

Погрешность измерения коэффициента пропускания 8Т, не более ±5%

Внешний интерфейс LPT

Данные проведенных исследований УФ спектров пропускания компонентов ЖБС позволяют получить результаты количественного абсорбционного спектрального анализа этих сред как с использованием классического подхода (по закону Вера на одной дискретной длине волны), так и по предложенному методу Кроме того, для расчета концентрации альбумина в растворах были использованы эмпирические формулы Варбурга-Кристиана и Каркара. В табл. 2 приведены данные об относительной погрешности определения концентрации компонентов 8С С по классической и предложенной методикам в исследованном диапазоне концентраций Дополнительно, в таблице 3 сопоставлены результаты расчета концентрании мочевой кислоты по классической (по закону Бугера-Ламберта-Бера на длине волны 293 нм) и разработанной (в спектральном интервале 230 .320 нм) методикам При определении концентрации по классической методике для расчета молярного показателя поглощения использовался раствор мочевой кислоты в минимальной концентрации 0.015 ммоль/л.

Таблица 2

Погрешность спектрофотометрического определения концентрации некоторых од-

нокомпонентных сред.

Вещество Диапазон концентраций Относительная погрешность определения концентрации ВС С (усредненная по всему диапазону концентраций)

по классической методике по предложенной методике

Альбумин 1-5 г/л 20-50 % 8.8 %

Мочевая кислота 0.015-0.06 ммоль/л 15.8% 47%

Цианкобаламин 0.017-0.147 ммоль/л 25.0 % 76%

Глюкоза 5-40 г/л 20 7 % 3.3 %

Таблица 3

Сопоставление результатов спектрофотометрического анализа растворов мочевой __кислоты по классической и разработанной методикам.___

С, ммоль/л (истинная концентрация) Результаты спектрального анализа

по классической методике по предложенной методике

С, ммоль/л ЬС С,% С, ммоль/л дС С,%

0.6 0.330 45.0 0.586 2.3

0.15 0 138 8.0 0.157 4.7

0.06 0.054 10.0 0.055 8.3

0.015 0.0150 0 0.0155 3.3

Из данных табл. 2 следует, что предлагаемый метод позволяет снизить относительную погрешность спектрофотометрического определения концентрации дС С по сравнению с классическими подходами более чем в 3 раза для всех исследуемых сред. Из табл. 3 видно, что при использовании одной и той же градуировки погрешность расчета по предложенному методу не превышает 10 % в условиях изменения концентрации среды в широких пределах (более чем на порядок), в то

время как при применении классического подхода погрешность значительно возрастает при увеличении концентрации, достигая 45% при концентрации 0.6 ммоль/л.

Таким образом, разработанный метод дает возможность проводить автоматизированный количественный абсорбционный спектральный анализ однокомпо-нентных жидких сред в условиях изменения концентрации в широких пределах и несоблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера, с погрешностью не превышающей 10... 15%.

В четвертой главе рассматривается применение разработанного метода для анализа одной из сложных для анализа и важных для диагностики и лечения ХПН жидкой биологической среды - перитонеального диализата.

Перитонеальный диализ (ПД) применяется лечения больных с терминальной стадией ХПН, и наряду с гемодиализом является единственным способом поддержания их жизни. Данный метод лечения основан на принципе диффузионного обмена, а также фильтрационного и конвекционного переноса через естественную «перитонеальную мембрану» накапливающихся в организме больных низкомолекулярных уремических токсинов, а также жидкости из крови в диализирующий раствор, находящийся в полости брюшины. В настоящее время ПД получает все большее распространение в клинической практике, так как в своей эффективности он не уступает гемодиализу при существенно меньшей стоимости.

Для определения дозы ПД используют тест перитонеального равновесия, в ходе которого больному проводят несколько перитонеальных обменов различной длительности и однократно берут пробу крови. Выводимый из полости брюшины диализат подвергается биохимическому анализу на содержание мочевины, креати-нина, мочевой кислоты, белка и глюкозы. Последняя искусственно вводится в состав диализата для создания осмотического градиента и выведения жидкости. Результаты анализа диализата и крови вводятся в специализированную компьютерную программу, с помощью которой производится расчет параметров адекватности диализа. Процедура биохимического анализа диализата отнимает значительное время и требует использования дорогостоящих реактивов. Кроме того, существующие методы и аппаратура для клинико-биохимических исследований оптимизированы для исследования плазмы крови, и при анализе диализата, где концентрация компонентов существенно ниже, могут давать неточные результаты. Применение разработанных методов УФ абсорбционного спектрального анализа ЖБС дает принципиальную возможность проводить количественный анализ оперативно и без применения реактивов.

Диализат представляет собой чрезвычайно сложную поликомпонентную среду. Методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии показано, что в его состав входят практически все компоненты плазмы крови относящиеся к низко- и среднемолекулярному пулу. В настоящее время не существует методик, которые позволяли бы проводить количественный спектральный анализ подобных сред.

Необходимым условием, при котором возможен анализ по спектрам поглощения, является наличие корреляционных связей между концентрацией определяемых компонентов и экстинкцией исследуемой среды в рабочей спектральной области. Для выявления таких корреляционных связей применительно к перитоне-

альному диализату, для группы больных во время проведения теста черитонеаль-ного равновесия были взяты пробы выводимого диализата. Затем для каждой пробы параллельно были сняты УФ спектры пропускания и проведен биохимический анализ, в ходе которого в частности определялась концентрация креатинина и мочевой кислоты.

Исследования показали, что информативной спектральной областью (уровень поглощения коррелирует с концентрацией компонентов) для перитонеального диализата является интервал длин волн 220...350 нм, где лежат полосы основных компонентов исследуемой среды. Наличие сильного поглощения нативного диализата в этой области потребовало при регистрации спектров использовать разведение дистиллированной водой в пропорции 1:3 (рис. 1).

200

220

240

260 280 300

Длина волны, нм

Рис. 1. Спектры пропускания диализата разведенного в пропорции 1 3 (время нахождения диализата в полости брюшины 2-10 часов)

При сопоставлении полученных данных удобнее использовать не абсолютные величины концентрации, а нормированные значения С = С С0. где Со концентрация в пробе наиболее продолжительного (10-ти часового) обмена. Для оценки изменения уровня поглощения в рабочей спектральной области предложено ввести интегральный параметр С, определяемый из соотношения-

ч ¡%

в = \кх<1Х \k\dl А, =245 нм Х2=265 нм. (9)

д, / я.

По результатам наших исследований с ростом концентрации креатинина и мочевой кислоты в пробах увеличивается и интегральный параметр б. Коэффициенты корреляции между нормированной концентрацией С' и параметром С для мочевой кислоты и креатинина превосходят величину 0 95, что свидетельствует о наличии

тесной корреляционной связи уровня поглощения и концентрации выделенных компонентов.

Дополнительно, путем сравнения спектров экстинкции диализата и спектров поглощения креатинина и мочевой кислоты в концентрациях найденных в ходе биохимического анализа было показано, что данные компоненты являются доминирующими в суммарном поглощении диализата и, следовательно, могут быть определены как основные компоненты по разработанному методу.

Предложенная в данной диссертации модель поглощения поликомпонентной среды может применяться лишь в тех случаях, когда соотношение концентрации компонентов, а, следовательно, и форма кривой поглощения, сохраняются практически постоянными от пробы к пробе. Для отдельного больного это условие выполняется с высокой точностью (рис. 1), в то время как для разных больных они различаются. В связи с этим были исследованы спектры экстинкции проб диализата полученные от 42 больных, получавших лечение ПД в Санкт-Петербургской городской больнице №12 - центре гемокоррекции. В процессе исследований проб • перитонеального диализата разных больных было установлено, что форма спектрограммы в информативной УФ области носит выраженный индивидуальный характер, и значительно изменяется от больного к больному Для спектральной области 240...320 нм, где изменения в форме кривых были существенными, были выделены несколько характерных типов кривых пропускания, которые условно обозначены как типы «А», «В» и «С» (рис. 2). Обнаруженные индивидуальные особенности спектров могут быть обусловлены присутствием в диализате двух компонентов, относительное содержание которых в плазме крови различается у разных больных, причем в указанной области предположительно лежат полосы собственного поглощения этих компонентов.

Рис. 2 Основные типы («А». «В» и «С») УФ спектров пропускания перитенеально-го диализата.

Установлено, что отношение величин интегральной экстинкции /-¡^ в двух спектральных областях АХ г 255 .265 нм и ЛЛ2= 288....298 нм объективно отражает наблюдаемое различие в спектрах, относящихся к различным типам, и может быть рекомендовано в качестве количественного параметра характеризующего форму кривой;

= ¡к{ЛЩ. (10)

^ ДЛ) / ЛАг

Параметр ^ Г2 был рассчитан для всех спектров экстинкции перитонеального диализата каждого больного. Затем был выделен диапазон изменения /\ Г2 для групп больных (0.5... 1.7), который был разделен на ряд интервалов с шагом 0.2. Далее было подсчитано число больных для каждого интервала и построена гистограмма зависимости числа пациентов от величины Т7, . Статистический анализ показал, что наблюдаемое распределение, представленное на рис. 3, математически может быть описано нормальным законом (РХ[Щ =1.00. ст - 0.23.). При этом каждому из типов (А, В и С), на которые ранее были классифицированы спектры по форме, был поставлен в соответствие диапазон изменения параметра ^ /*"2 шириной в 2сг: тип А - (Р] -а), тип В - ^-а ... ^ + сг), тип С ¿¡ + <7...^ ^ нЗа).

— т

04 06 08

Ж Я

'ШЭксп данные НРасп Гаусса

"вЁ!

ш

1 12 14 16 11

Рис. 3. Гистограммы индивидуальных особенностей УФ спектров экстинкции перитонеального диализата, полученных экспериментально и соответствующее распределение Гаусса.

Длительные наблюдения динамики формы УФ спектров пропускания перитонеального диализата показали, что для конкретного больного форма кривой со-

храняется почти постоянной: вариации параметра ^ 'Рг не превышают ±0 06, что существенно меньше а = 0.23 (наблюдения проводились на группе из 6 больных в течение 1.5 лет).

Выполненные исследования показали, что в области длин волн 250...300 нм в УФ спектрах пропускания диализата присутствуют информационные признаки, по крайней мере, двух компонентов, вклад которых в результирующее поглощение среды определяет форму кривой пропускания. Отношение концентраций этих компонентов (по уровню поглощения) в пробах диализата индивидуально для каждого больного, практически не изменяется в ходе длительных наблюдений и распределено по нормальному закону. Анализ спектров поглощения возможных компонентов диализата позволяет предположить, что полоса поглощения в области длин волн 280...300 нм может быть отождествлена с мочевой кислотой. Полоса поглощения 250...270 нм, может быть отождествлена со многими низкомолекулярными веществами пуриновой и пиримидиновой групп - аденозином, уридином, псевдо-уридином.

Была проведена экспериментальная оценка молекулярного веса второго компонента, основанная на предположении, что скорость выведения вещества через перитонеальную мембрану находится в обратной зависимости от молекулярной массы вещества- чем меньше масса, тем быстрее происходит диффузия. Скорость выведения компонента в процессе диализа может быть определена по полученным экспериментальным данным, что в свою очередь позволяет определить молекулярную массу. По результатам исследований, с учетом усреднения по группе больных, молекулярная масса второго компонента составляет Мт =220 ±17 дальтон.

Предложенная классификация спектров на типы по форме кривой позволила применить разработанные в диссертационной работе методики для УФ абсорбционного анализа состава перитонеального диализата. Для этого необходимо для каждого типа спектра определить поправочные коэффициенты к\, , Аг'2). Для каждого измеренного УФ спектра пропускания диализата определяется тип кривой (по параметру ^ Р2), а затем определяется концентрация компонентов (с учетом результатов градуировки для этого типа).

Для спектров, относящихся к каждому из типов «А», «В/> и «С», с учетом результатов исследований спектров поглощения однокочпонентных сред, были определены поправочные коэффициенты к'1, Дгл, Ке'Р для двух компонентов: креа-тинина и мочевой кислоты. Затем для группы из семи больных (шесть проб диализата для каждого больного, всего 42 пробы) по спектрам экстинкции диализата была рассчитана концентрация креатинина и мочевой кислоты. Была проведена метрологическая оценка полученных результатов путем сопоставления с данными биохимического анализа. Относительная погрешность определения концентрации мочевой кислоты не превышает 8%, креатинина - 18%. Имеет место тесная корреляция между результатами биохимического и спектрофотометрического анализа: коэффициент корреляции составляет рАс11г = 0.95 для мочевой кислоты и рСг = 0.86 для креатинина, что говорит о достоверности получаемых с помощью разработанного метода результатов.

Таким образом, предложенные математические модели и разработанные методы расширяют возможности УФ абсорбционной спектрометрии и могут быть применены для анализа сложных поликомпонентных жидких биологических сред

Автор выражает благодарность заслуженному деятелю науки РФ, д.т.н, профессору Бузникову А.А за неоценимую помощь в подготовке работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Основным результатом работы является новая методика количественного спектрофотометрического анализа ЖБС в УФ области в широком диапазоне концентраций. В рамках решения поставленных задач получены следующие результаты:

1 Разработана математическая модель, описывающая зависимость спектрального показателя поглощения однокомпонентных и поликомпонентных ЖБС в УФ области в условиях несоблюдения линейного закона Бугера-Ламберта-Бера и принципа аддитивности, Сформулировано условие, при котором недиагональные элементы матрицы показателей поглощения второго порядка могут быть заменены поправками к диагональным элементам. Предложен способ учета поглощения компонентов с неизвестной концентрацией и молярным показателем поглощения.

2. Разработана методика расчета молярных показателей поглощения второго порядка для однокомпонентных сред и многокомпонентных сред для случая отдельного определяемого компонента.

3. Предложена методика количественного спектрофотометрического анализа ЖБС с помощью разработанной модели в широком спектральном диапазоне. На примере однокомпонентных сред показано, что при работе в широком диапазоне концентраций использование данной методики позволяет снизить относительную погрешность спектрофотометрического определения концентрации более чем в 3 раза по сравнению с классическими методиками.

4. Исследованы спектры экстинкции перитонеального диализата для большой группы больных страдающих хронической почечной недостаточностью. Обнаружены индивидуальные особенности формы спектра, присущие каждому больному; спектры условно классифицированы на три типа. Введен количественный параметр, характеризующий изменения формы спектра у разных больных Установлено, что больные в исследуемой группе (42 чел) распределены по данному параметру в соответствии с нормальным законом.

5. Предложенный метод спектрофотометрического анализа использован для определения концентрации мочевой кислоты и креатинина в перитонеальном диализате. При сопоставлении с данными биохимического анализа относительная погрешность определения концентрации мочевой кислоты не превышает 8%, креатинина- 18%

Опубликованные работы по теме диссертации:

1. Василевский, A.M. Исследование спектров поглощения альбумина и мочевой кислоты в УФ области спектра / A.M. Василевский, Г.А. Коноплев, Н.В. Корнилов // Оптический журнал. - 2001 - Т.68. №1. - С.76-78.

2. Василевский, A.M. Применение ультрафиолетовой сиектрофотометрии для анализа перитонеального диализат / A.M. Василевский, Г.А. Коноплев // Оптический журнал. - 2004 - Т.71, №3. - С. 64-66.

3. Коноплев, Г.А. Автоматизированный многоканальный спектрофотометр для мониторинга жидких биологических сред / Г.А. Коноплев // Оптика-2001: тр. второй междунар. конф. молодых ученых и специалистов, 16-19 окт. 2001 г., г. С.-Петерб. - СПб.: изд-во СПбГИТМО (ТУ), 2001. - С. 14.

4. Василевский, A.M. Определение белка в перитонеальном диализате методом ультрафиолетовой спектрофотометрии / A.M. Василевский, Г.А. Коноплев // 0птика-2002: тр. науч. молодежной шк., 14-17 окт. 2002 г., г. С.-Петерб. - СПб: * изд-во СПбГИТМО (ТУ), 2002. - С. 29.

5. Василевский, A.M. Компьютерный контроль состава жидких биосред по спектрам экстинкпии в УФ области спектра / A.M. Василевский, Г.А. Коноплев // Региональная информатика-2002: материалы седьмой санкт-петербургской межд. конф., 26-28 нояб. 2002 г., г. С.-Петерб. - СПб.: изд-во СПОИСУ, 2002. -Ч. 2.-С. 126.

6. Василевский, A.M. Оптико-электронная информационно-измерительная система экологического мониторинга жидких сред / A.M. Василевский, Г.А. Коноплев, НВ Корнилов // Региональная информатика-2002: материалы седьмой санкт-петербургской межд. конф., 26-28 нояб. 2002г., г. С.-Петерб. - СПб.: изд-во СПОИСУ, 2002. - Ч. 2. - С. 126-127.

7. Василевский, А.М Программное обеспечение для обработки УФ спектров экс-тинкции жидких сред / А.М.Василевский, Г А. Коноплев // Региональная ин-форматика-2004: материалы девятой санкт-петербургской межд. конф.. 22-24 июня 2004 г., г. С.-Петерб - СПб.: изд-во СПОИСУ, 2004 - С. 354-355

8. Василевский, A.M. Анализ индивидуальных особенностей УФ спектров экс-тинкции диализата больных хронической почечной недостаточностью / А М Василевский. Г А Коноплев // Региональная информатика-2004: материалы девятой санкт-петербургской межд. конф., 22-24 июня 2004 г., г. С -Петерб. - СПб.: изд-во СПОИСУ, 2004 - С. 318.

9. Василевский, A.M. Автоматизированная оптико-электронная система монито- i ринга состава жидких биологических сред по спектрам экстинкции в УФ области спектра / Василевский A.M., Коноплев Г А., Лесиовская Е.Е. // Прикладная

оптика- сб тр. шестой междунар конф., 18-21 окт. 2004 г.. г. С.-Петерб -СПб.: изд-во СПбГИТМО (ТУ). 2004. - С. 120-123

Подписано в печать 03.05.2005. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового орипинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/305. П. л. 1.0. Уч.-изд. л. 1.0. Ъфаж 100 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес юр.: 194017, Санкт-Петербург, Скобелеве кий пр., д. 16. Адрес факт.: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 5. тел.: (812) 327 5098

»- 9855

РНБ Русский фонд

2006-4 6056

Содержание.

Введение.

1. Современные методы анализа жидких биологических сред.

1.1. Краткая характеристика жидких биологических сред человека.

1.2. Существующие методы клинико-биохимического анализа.

1.3. Количественный абсорбционный спектральный анализ жидких биологических сред в УФ области.

1.3.1. Электронные спектры поглощения органических молекул. Основные принципы лежащие в основе УФ спектрофотометрии.

1.3.2. Примеры использования прямой УФ спектофотометрии для анализа поликомпонентных ЖБС.

1.3.3. Спектрофотометры для клинико-биохимических исследований. 32 Ф 1.4. Методы контроля состава жидких биологических сред в процессе детоксикационных мероприятий.

1.4.1. Перитонеальный диализ. Тест перитонеального равновесия.

1.4.2. Исследование состава диализата хроматографическими и масс-спектрометрическими методами.

1.4.3. Применение спектрального анализа для контроля состава диализата.

1.5. Постановка задач исследования.

Выводы по главе 1:.

2. Разработка метода спектрофотометрического анализа ЖБС.

2.1. Основные требования, предъявляемые к математической модели поглощения ЖБС в УФ области спектра.

2.2. Спектральный анализ однокомпонентных сред в ультрафиолетовой области.

2.2.1. Математическая модель поглощения однокомпонентных сред.

2.2.2. Методика проведения градуировки.

2.2.3. Методика расчета концентрации по спектру.

2.3. Спектральный анализ многокомпонентных сред в УФ области.

Выводы по главе 2:.

3. Применение метода для анализа однокомпонентных сред.

3.1. Автоматизированный многоканальный спектроанализатор.

3.2. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов глюкозы.

3.3. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов сывороточного альбумина.

3.4. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа цианкобаламина.

3.5. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов мочевой кислоты.

• 3.6. Применение разработанной методики для количественного анализа препарата содержащего гидрохинон.

Выводы по главе 3:.

4. Количественный анализ перитонеального диализата методом УФ абсорбционной спектрометрии.

4.1. Разработка методики регистрации спектров экстинкции перитонеального диализата.

• 4.2. Исследование формы спектральной кривой.

4.3. Обоснование принципиальной возможности применения количественного спектрального анализа в УФ области для исследования состава диализата.

4.4. Учет влияния светорассеяния на спектр экстинкции диализата.

4.5. Исследование динамики процесса выведения веществ различной молекулярной массы через перитонеальную мембрану.

4.6. Определение концентрации мочевой кислоты и креатинина в перитонеальном диализате методом УФ спектрофотометрии.

Выводы по главе 4:.

Актуальность исследований. Метод абсорбционного спектрального анализа широко используется в науке и технике. Преимуществами данного метода являются оперативность, высокая воспроизводимость, малый объем пробы, неинвазивность, возможность реализации мониторинга состава среды в проточном режиме, сравнительно невысокая стоимость используемой аппаратуры, отсутствие необходимости в использовании реактивов, низкая трудоемкость и возможность автоматизации. Особое место спектральные методы анализа занимают в биомедицинских исследованиях, где в более чем 30% аналитических методик используется оптическая регистрация. Отметим лишь несколько основных направлений этих исследований - контроль экологического состояния среды обитания человека, клинико-лабораторные биохимические исследования нативных жидких биологических сред (ЖБС) организма, мониторинг процессов при проведении эфферентной терапии, фармакологические исследования, контроль качества пищевых продуктов.

Наиболее информативной для спектрального анализа ЖБС является ультрафиолетовая (УФ) область, где, с одной стороны, лежат электронные полосы поглощения многих хромофорных групп, а с другой, располагается «окно прозрачности» воды, которая является растворителем во всех жидких средах естественного происхождения. Современные УФ спектрофотометры построены на основе многоэлементных приемников излучения, полностью автоматизированы, передают спектры непосредственно на компьютер, что дает возможность проводить анализ в реальном масштабе времени.

Количественный абсорбционный анализ базируется на законе Бугера-Ламберта-Бера, устанавливающем линейную зависимость спектрального показателя поглощения однородной среды от концентрации, и принципе аддитивности, согласно которому показатель поглощения смеси равен сумме показателей поглощения отдельных компонентов. Многими исследователями показано, что закон Бера и принцип аддитивности соблюдаются лишь для слабоконцентрированных сред. Кроме того, обычно анализ проводится на одной или нескольких дискретных длинах волн, как правило, соответствующих максимумам характеристических полос поглощения компонентов среды, в то время как информация о составе ЖБС рассредоточена в широком спектральном интервале. Поэтому, применение классического абсорбционного спектрального анализа для исследования ЖБС и жидких лекарственных форм, когда концентрация может изменяться в широких пределах, в случае однокомпонентных сред приводит к значительным погрешностям, а для поликомпонентных сред практически исключено.

Цель настоящей работы - разработка и исследование методов спектрального анализа ЖБС и их компонентов в УФ области спектра, снимающих ряд ограничений классической абсорбционной спектрофотометрии применительно к поликомпонентным средам.

Основные задачи, которые необходимо решить для достижения указанной цели включают в себя следующее: построение математической модели, описывающей зависимость спектральных характеристик поглощения ЖБС в УФ области спектра от концентрации компонентов; разработка методики определения параметров модели для конкретной ЖБС и расчета концентрации компонентов по спектру; оценка эффективности модели применительно к анализу однокомпонентных биологических сред в широком диапазоне концентраций; экспериментальное исследование разработанных моделей для анализа поликомпонентных сред - перитонеального диализата больных, страдающих хронической почечной недостаточностью (ХПН), и поликомпонентных жидких лекарственных сред.

Методы исследований.

Для решения поставленных задач использовались методы абсорбционного спектрального анализа по электронным спектрам поглощения, аналитические методы аппроксимации функций многих переменных, методы оптимизации, статистические методы оценки степени достоверности результатов. Научная новизна работы состоит в следующем: Сформулирована математическая модель, описывающая спектральные характеристики поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области при изменении концентрации в широких пределах.

Разработана новая методика анализа однокомпонентных сред с учетом нелинейной зависимости показателя поглощения от концентрации в пределах информативной области спектра.

Разработан метод спектрофотометрического определения концентрации доминирующего компонента в поликомпонентных средах.

Впервые обнаружены индивидуальные особенности УФ спектров экс-тинкции перитонеального диализата больных страдающих ХПН, и предложена методика классификации спектров диализата по форме кривой пропускания.

Практическая значимость работы заключается в следующем: Разработанная методика может быть использована в клинико-биохимических лабораториях учреждений практического здравоохранения при анализе жидких поликомпонентных сред, а также для оперативного контроля эффективности детоксикационных мероприятий.

Результаты работы подтверждены актами внедрения Городского центра гемокоррекции г. Санкт-Петербурга и научно-исследовательской лаборатории фармакологических исследований СПб химико-фармацевтической академии.

Научные положения выносимые на защиту: - Математическая модель, описывающая спектральные характеристики поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области, должна учитывать возможное несоблюдение закона Бера и принципа аддитивности путем введения в разложение показателя поглощения по концентрации членов высших порядков.

- Количественный спектрофотометрический анализ ЖБС в УФ области спектра должен проводится в пределах всего информативного для исследуемой среды спектрального диапазона.

- Методика спектрального анализа, основанная на предлагаемых принципах, позволяет существенно повысить точность анализа однокомпо-нентных сред в широком диапазоне изменения концентрации, а также дает возможность проводить анализ сложных поликомпонентных сред по доминирующему компоненту.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях:

- Вторая международная конференция молодых ученых и специалистов "0птика-2001", Санкт-Петербург, 2001.

- Международный оптический конгресс «Оптика-XXI век», Санкт-Петербург, 2002.

- VIII Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная информатика-2002», Санкт-Петербург, 2002.

- IX Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная информатика-2004», Санкт-Петербург, 2004.

- VI Международная конференция «Прикладная оптика», Санкт-Петербург, 2004.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них - 2 статьи, тезисы к 7-ми докладам на международных и национальных научно-технических конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы, включающего 73 наименования и одного приложения. Основная часть работы изложена на 109 страницах машинописного текста. Работа содержит 68 рисунков и 21 таблицу.

Выводы по главе 4:

1. При регистрации спектров поглощения перитонеального диализата в кварцевых кюветах оптической толщиной d = 5 мм оптимальное пропускание образца достигается при разведении диализата дистиллированной водой в пропорции 1:4.

2. Имеет место тесная корреляционная связь между уровнем поглощения диализата и концентрацией креатинина и мочевой кислоты, что говорит о наличии принципиальной возможности прямого спектрофотометрическо-го определения концентрации данных компонентов.

3. Форма спектрограммы диализата в информативной УФ области носит выраженный индивидуальный характер, и значительно изменяется от больного к больному, но остается постоянной для каждого конкретного больного как при увеличении длительности обмена в рамках одного сеанса (растет только общий уровень поглощения), так и при длительных наблюдениях (год и более). Для спектральной области 240.320 нм, где изменения в форме кривых были существенными, визуально можно выделить несколько характерных типов кривых пропускания, которые условно обозначены как типы «А», «В» и «С».

4. Обнаруженные индивидуальные особенности могут быть объяснены вариациями относительного содержания двух компонентов, имеющих полосы собственного поглощения в спектральных областях АЯ/= 255 .265 нм и AXj=" 288.298 нм, предположительно мочевой кислоты и адено-зина.

5. Статистический анализ показал, что распределение числа больных по количественному параметру, характеризующему форму кривой, математически может быть описано нормальным законом, т.е. носит случайный характер.

6. По предложенной методике была проведена градуировка и рассчитана концентрация мочевой кислоты и креатинина в перитонеальном диализате для группы больных. При сопоставлении с данными биохимического анализа относительная погрешность определения концентрации мочевой кислоты не превышает 8%, креатинина - 18%; коэффициент корреляции между результатами биохимического и спектрофотометрического анализа составляет pAcUr = 0.95 для мочевой кислоты и рСг =0.86 для креатинина, что говорит о достоверности получаемых с помощью разработанного метода результатов.

Заключение

Целью настоящей работы явились разработка и исследование методов спектрального анализа ЖБС и их компонентов в УФ области спектра, снимающих ряд ограничений классической абсорбционной спектрофотометрии применительно к поликомпонентным средам.

В ходе достижения цели работы предварительно были проанализированы данные о составе и существующих методах исследования состава однокомпонентных и поликомпонентных ЖБС, в том числе особенности контроля состава ЖБС в процессе детоксикационных мероприятий. Рассмотрен опыт применения классической абсорбционной УФ спектрометрии в клинико-лабораторном анализе; выполнены экспериментальные исследования УФ спектров поглощения ряда однокомпонентных сред - жидких лекарственных форм (растворы альбумина, глюкозы, мочевой кислоты, витамина Bj2), и поликомпонентной ЖБС - перитонеального диализата. Проведенные исследования позволили сформулировать ряд требований, предъявляемых к методам количественного абсорбционного УФ спектрального анализа ЖБС:

S Учет вероятного несоблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера и принципа аддитивности;

Возможность проведения анализа при сильном перекрытии спектров поглощения отдельных компонентов;

S Широкий рабочий диапазон концентраций;

S Использование для анализа всей информативной спектральной области;

S Возможность определения одного или нескольких компонентов в присутствии множества других, концентрация и молярный показатель поглощения которых неизвестны.

В рамках решения поставленных задач получены следующие результаты:

1. Разработана математическая модель, описывающая зависимость спектрального показателя поглощения однокомпонентных и поликомпонентных ЖБС в УФ области в условиях несоблюдения линейного закона Бугера-Ламберта-Бера и принципа аддитивности. Предложенная модель базируется на следующих принципах:

Учет нелинейного характера зависимости спектрального показателя поглощения от концентрации компонентов путем аппроксимации зависимости к{Х) полиномом второго порядка, введение матрицы молярных спектральных показателей поглощения второго порядка;

Замена недиагональных элементов матрицы показателей поглощения второго порядка поправками к диагональным элементам (предварительное суммирование по строкам) на основании экспериментальных данных, согласно которым для исследуемой группы сред форма спектральной кривой меняется незначительно;

Учет влияния компонентов с неизвестной концентрацией и молярным показателем поглощения путем введения в зависимость к(Л) эмпирических поправочных коэффициентов.

2. Разработана методика расчета молярных показателей поглощения второго порядка для однокомпонентных сред и многокомпонентных сред для случая отдельного определяемого компонента. Методика дает возможность рассчитать молярные показатели поглощения второго порядка по спектрам поглощения набора проб среды, концентрация компонентов в которых предварительно была измерена одним из биохимических методов.

3. Предложена методика количественного спектрофотометрического анализа ЖБС с помощью разработанной модели в широком спектральном диапазоне, в основе которой лежит определение концентрации с помощью оптимизационных методов. На примере однокомпо-нентных сред показано, что в условиях изменения концентрации в широких пределах (более чем на порядок) использование данной методики позволяет снизить относительную погрешность спектрофото-метрического определения концентрации более чем в 3 раза по сравнению с классическими методиками. Подтверждено, что для каждой из исследуемых сред погрешность 5С/С не превышает 10. 15% во всем рабочем диапазоне концентраций.

4. Исследованы спектры экстинкции перитонеального диализата для большой группы больных страдающих хронической почечной недостаточностью. В ходе исследований установлены следующие факты: >^При использовании для регистрации спектров кварцевых кювет оптической толщиной 5 мм, для расширения информативного спектрального диапазона и достижения оптимального, с точки зрения минимизации погрешности измерений, уровня пропускания пробы можно рекомендовать разведение диализата дистиллированной водой в пропорции 1:3. ^Между уровнем поглощения диализной жидкости в интервале длин волн 220.350 нм и концентрацией ряда компонентов существует тесная корреляционная связь, что указывает на принципиальную возможность применения абсорбционной спектрометрии для анализа перитонеального диализата. ^Имеют место индивидуальные особенности формы спектра пропускания диализата, присущие каждому больному; спектры условно классифицированы на три типа. Введен количественный параметр, характеризующий изменения формы спектра у разных больных. Установлено, что больные в исследуемой группе (42 чел) распределены по данному параметру в соответствии с нормальным законом. Сделано предположение, согласно которому обнаруженные индивидуальные особенности обусловлены вариациями относительного содержания двух компонентов: мочевой кислоты и аденозина в плазме крови больных.

5. Предложенный метод спектрофотометрического анализа использован для определения концентрации мочевой кислоты и креатинина в пе-ритонеальном диализате. Имеет место тесная корреляция полученных результатов с данными биохимического анализа: по мочевой кислоте РAcUr ~ 0-95, по креатинину = 0.86. Относительная погрешность определения концентрации мочевой кислоты не превышает 8%, креатинина- 18%.

Разработанный метод может быть использован в биохимических лабораториях диагностики учреждений практического здравоохранения при анализе поликомпонентных жидких биологических сред по доминирующему компоненту, для оперативного контроля эффективности детоксикационных мероприятий, при исследовании состава сточных вод, в фармакологии.

1. Бабко А.К. Фотометрический анализ / А.К. Бабко, А.Т. Пилипенко. М.: Химия, 1968.-386 с.

2. Бабушкин, А.А. Методы спектрального анализа / А.А. Бабушкин, П.А. Бажулин, Ф.А. Королев и др. М.: Изд-во МГУ, 1962. - 510 с.

3. Беликов, В.Г. Анализ лекарственных веществ фотометрическими методами. Опыт работы отечественных специалистов / В.Г. Беликов // Рос. хим. журнал. 2002. - Т. XLVI, № 4. - С. 52-56.

4. Берштейн, И.Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии / И.Я. Берштейн, Ю.Л. Каминский. Л.: Химия, 1986. - 198 с.

5. Василевский, A.M. Применение ультрафиолетовой спектрофотометрии для анализа перитонеального диализата / A.M. Василевский, Г.А. Коноплев // Оптический журнал. 2004 - Т.71, №3. - С. 64-66.

6. Василевский, A.M. Исследование спектров поглощения альбумина и мочевой кислоты в УФ области спектра / A.M. Василевский, Г.А. Коноплев, Н.В. Корнилов // Оптический журнал. 2001 - Т.68, №1. - С.76-78.

7. Венкстерн, Т.В. Спектры поглощения минорных компонентов и некоторых олигонуклеотидов рибонуклеиновых кислот / Т.В. Венкстерн, А.А. Баев. -М.: Наука, 1967.- 80 с.

8. Гиллер, А. Электронные спектры поглощения органических соединений / А. Гиллер, Е. Штерн М.: Взд-во иностр. лит., - 1957. - 387 с.

9. Малогабаритные многоканальные оптические спектрометры / В.В. Городецкий и др. // Оптический журнал. 1995. - №7. - с.3-9.

10. Перитонеальный диализ в таблицах и схемах / А.К. Гуревич и др. -СПб.:Иизд-во СПбМАПО, 2003. 55 с.

11. Гуревич, К.Я. Перитонеальный диализ: Методические рекомендации для врачей / К.Я. Гуревич и др. СПб.: Изд-во СПбМАПО, 2003. - 98 с.

12. Демченко, А.П. УФ спектрофотометрия и структура белков / А.П. Демченко. Киев: Наукова Думка, 1981. - 210 с.

13. Справочник биохимика / Р. Досон и др. М.: Мир, 1991. - 544 с.

14. Компьютерная спектрофотометрия в медицинской диагностике / А.А. Елисеев и др. // Вестник Томского гос. ун-та. 2000. - №269. - с. 113117.

15. Зайдель, А.Н. Основы спектрального анализа / А.Н. Зайдель. М.: Наука, 1965.-324 с.

16. Зайдель, А.Н. Техника и практика спектроскопии / А.Н. Зайдель, Г.В. Островская, Ю.И. Островский М.: Наука, 1976. - 392 с.

17. Камышников, А.С. Справочник по клинико-биохимической диагностике: в 2 т. / А.С. Камышников. Минск: Беларусь, 2000.

18. Карнаухова, Л.И. УФ-спектроскопия биологических макромолекул (учебно-методическое пособие) / Л.И. Карнаухова, Е.Н. Тупицын. Саратов: изд-во Саратовского гос. ун-та, 2002. - 15 с.

19. Коптюг, В.А. Атлас спектров: ИК-, УФ-, КР- и ПМР спектры растворителей / В.А. Коптюг, ред. Новосибирск: ИОХ; НИЦ МС, 1978. -136 с.

20. Костюченко, А.Л. Интенсивная терапия послеоперационных осложнений / А.Л. Костюченко, К.Я. Гуревич, М.И. Лыткин. СПб: Спецлит, 2000. - 575 с.

21. Лавренчик, В.Н. Постановка физического эксперимента и статистическая обработка его результатов / В.Н. Лавренчик. М.: Энергоатомиз-дат, 1986.-272 с.

22. Биохимия человека: в 2 т. / Р. Мари и др. -М. Мир, 1993 Т. 1. -414 с.

23. Моран, Р. Лабораторная оценка снабжения тканей кислородом: газы крови и СО оксиметрия (лекция) / Р. Моран // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - №2. - С.25 - 32.

24. Островский, П.М. Экспериментальная витаминология: справочник / П.М. Островский. Минск: Наука и техника, 1978. - 550 с.

25. Пейсахсон, И.В. Оптика спектральных приборов / И.В. Пейсахсон. Л.: Машиностроение, 1975. - 312 с.

26. Рубин, В.И. Биохимические методы исследования в клинике / В.И. Рубин, Э.Г. Ларский, Л.С. Орлова Саратов: изд-во Саратовского ун-та, 1980.-320 с.

27. Свердлова, О.В. Электронные спектры в органической химии / О.В. Свердлова. JL: Химия, 1985 - 248с.

28. Сидоренко, В.М. Молекулярная спектроскопия биологических сред / В.М. Сидоренко М.: Высшая школа, 2004. - 191 с.

29. Чупрасов, В.Б. Программный гемодиализ / В.Б. Чупрасов. СПб: Фолиант, 2001.-256 с.

30. Якушенков, Ю. Г. Теория и расчет оптико-электронных приборов / Ю.Г. Якушенков. М.: Логос, 2004. - 470 с.

31. Beaven, G.H. Ultraviolet Absorption spectra / G.H. Beaven, E.R. Holiday // Advanced Protein Chemistry. 1951. - Vol.7. - P. 380-384.

32. Bergstrom, J. Uraemic toxins / J. Bergstrom, P. Furst // Replacement of renal function by dialysis / Ed. J.F. Maher. 3rd ed. - Dordrecht: Kluwer Academic, 1989.- P. 354-389.

33. Bland, J.M. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement / J.M. Bland, D.G Altman. // The Lancet. 1986. -№ 8. -P. 307-310.

34. Churchill, D.N. Practical methods for assessing dialysis efficiency during peritoneal dialysis / D.N. Churchill // Kidney Int. 1994. - Vol. 46, Suppl. 48.-P. S7-S13.

35. Contreras, P. Molecules in the middle molecular weight range: Critical review of methods of separation from fluids of uremic patients / P. Contreras, R. Later, J. Navarro //Nephron. 1982. - Vol .32. - P. 193-201.

36. Davis, W. Determination of urinary constituents in solutions by least-square resolution of ultraviolet spectrums / W. Davis, E. Schonfeld, A.H. Kibbey // Clin. Chem. 1968. - Mol. 14. №8. - P. 310-325.

37. Fasman, G.D. Nucleic Acids / G.D. Fasman (ed.). New-York: CRC Press, 1975.-Vol. l.-P. 121-156.

38. Fridolin, I. On-line monitoring of solutes in dialysate using absorption of ultraviolet radiation: technique description. / I. Fridolin, M. Magnusson, L.-G. Lindberg // Int. J. Artif. Organs. 2002. - Vol. 25, №8. - P. 748-761.

39. Fridolin, I. On-line monitoring of solutes in dialysate using wavelength-dependent absorption of ultraviolet radiation /1. Fridolin, L.-G. Lindberg // Med. Biol. Eng. Comput. -2003. Vol. 41. - P. 263-270.

40. Hue, N. V. Manganese toxicity in a hawaiian oxisol affected by soil pH and organic amendments / N. V. Hue, S. Vega, J. A. Silva // Soil Science Society of America J. 2001. - Vol. 65. - P. 153-160.

41. Gal, G. Continuous monitoring of the efficiency of hemodialysis by recording the UV transmittance of the dialysis solution / G. Gal, J. Grof, E. Kiss // Acta Chir. Hung. 1983 - Vol. 24, №4 - P. 231-239.

42. Gal, G. Continuous UV photometric monitoring of the efficiency of hemodialysis / G. Gal, J. Grof// Int. J. Artif. Organs. 1980. - Vol. 3, № 6. - P. 338-341.

43. Groves, W.E. Sperctrophotometric determination of microgram quantities of protein without nucleic acid interference / W.E. Groves, C.F. Davis, B.H. Sells / Anal. Biochem. 1968. - Vol.22. - P. 195-210.

44. Kandoussi, A. Quantification of /^-microglobulin and albumin on plasma and peritoneal dialysis fluid by a noncompetitive immunoenzymometric assay / A. Kandoussi, C. Cachera, D. Pagniez // Clin. Chem. 1993. - Vol. 39, №1, - P. 93-96.

45. Kirschenbaum, D.M. Molar absoptivity and Aj^ values for protein at selected wavelengths of the ultraviolet and visible regions / D.M. Kirschenbaum // Anal. Biochem. 1973. - Vol.55, №1 - P. 340-343.

46. Knudson, E.J. Time-concentration studies by high-performance liquid chromatography of metabolites removed during hemodialysis / E.J. Knudson, Y.C. Lau, D.A. Dayton // Clin. Chem. 1978. - Vol. 24, №4. - P. 686-691.

47. Kupcinskas, R. A Method for optical measurement of urea in effluent hemo-dialysate: Dissertation for PhD degree / R. Kupcinskas: Worcester Polytechnic Institute. Worcester, 2000. - 128 p.

48. McNichols, R.J. Optical glucose sensing in biological fluids: an overview / R.J. McNichols, G.L. Cote // J. of Biomedical Optics. 2000. - Vol. 5, № 1. -P. 5-16.

49. Oreopoulos, D.G. Peritoneal dialysis: Where is it now and where is it going? / D.G. Oreopoulos, T. Lobbedez, S. Gupta // The Int. J. Artif. Organs. 2004. -Vol. 27, №2. -P. 88-94.

50. Ringoir, S. An update on Uremic Toxins / Ringoir S. // Kidney Int. 1997. -Vol. 52, Suppl. 62. - P. S2-S4.

51. Roggan, A. Optical Properties of Circulating Human Blood in the Wavelength Range 400 2500 nm. / A. Roggan, M. Friebel, K. Dorschel // J. of Biomedical Optics. - 1999. - Vol. 4. - P. 36 - 46.

52. Scopes, R.K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm / R.K. Scopes // Anal. Biochem. 1974. - Vol.59, № 1. - P. 277-282.

53. Sennfal, K. Comparison of hemodialysis and peritoneal dialysis — a cost-utility analysis / K. Sennfalt, M. Magnusson, P. Carlsson // Peritoneal Dialysis Int. 2002. - Vol. 22. - P. 39-47.

54. Smat, R.D. p-Cresol and uric acid: Two old uremic toxins revisited / R.D. Smat, G. Glorieux, Hsu Chen, R.C. Vanholder // Kidney Int. 1997. -Vol.52, Suppl.62. - P. S8-S11.

55. Toshimitsu, N. Mass spectrometry in the search for uremic toxins / N. To-shimitsu // Mass Spectrometry Reviews. 2001. - Vol. 16. - P. 307-332.

56. Uhlin, F. Estimation of delivered dialysis dose by on-line monitoring of the ultraviolet absorbance in the spent dialyzate / F. Uhlin, I. Fridolin, L.-G. Lindberg // Am. J. Kidney Dis. 2003. - Vol. 41, №5. - P. 1026-1036.

57. Vanholder, R.C. Assessment of urea and other uremic markers for quantification of dialysis efficacy / R.C. Vanholder, R.V, De Smet, S.M. Ringoir // Clin. Chem. 1992. - Vol. 38, №8. - P. 1429-1436.

58. Webster, G.C. Comparison of direct spectrophotometric methods for measurement of protein concentration / G.C. Webster // Biochemistry et biophysics acta. 1970. - Vol. 207, №.2. - P. 371-373.

59. Winder, A.F. Correction of light-scattering errors in spectrophotometric protein determination / A.F. Winder, W.L.G. Gent // Biopolymers. 1971. -Vol.10, №7.- P. 1243-1251.

60. Wollenberger, A. Ultraviolet absorption of creatinine / A. Wollenberger // Acta Chem. Scand. 1953. - Vol. 7, №2. - P. 445-446.

61. Woods, A.H. Absorption of proteins and peptides in the far ultraviolet / A.H. Woods, P.R. O'Bar//Science.-Vol. 167.-P. 179-181.