автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.17, диссертация на тему:Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦР-диагностики

На правах рукописи УДК 615.47

Чернышев Андрей Владимирович

0

СОЗДАНИЕ ТЕОРИИ РАБОЧИХ ПРОЦЕССОВ, МЕТОДОВ

РАСЧЕТА И РАЗРАБОТКА ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ

Специальность 05.11.17 — Приборы, системы и изделия медицинского назначения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Московском государственном техническом университете им. Н.Э. Баумана

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор, Викторов В.А.

доктор технических наук, Квашнин С.Е.

доктор физ.-мат. наук, Полетаев А.И.

Ведущая организация: Институт аналитического приборостроения РАН

Защита диссертации состоится 18 октября 2006 г. в 14:30 час. на заседании диссертационного совета Д. 212.141.14 при Московском государственном техническом университете им. Н.Э. Баумана по адресу: 105005, Москва, 2-я Бауманская улица, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГТУ им. Н.Э. Баумана.

Ваш отзыв на автореферат в 2 экз., заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу: 105005, г. Москва, 2-я Бауманская улица, д.5, Ученому секретарю диссертационного Совета Д. 212.141.14.

Автореферат разослан 0 5 СЕН 2006 г.

Желающие присутствовать на защите должны заблаговременно известить совет письмами заинтересованных организаций на имя председателя Совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д212.141.14 Доктор технических наук, профессор

И.Н. Спиридонов

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время объектами научных и диагностических исследований медико-биологических лабораторий всего мира все чаще становятся нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК. Наиболее доступным, достоверным и высокочувствительным методом, позволяющим обнаружить ДНК в пробе и оценить ее количество, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Разработка в 1983 г. сотрудником фирмы «СеШв», США, Кэри Мюлли-сом, метода ПЦР явилась одним из крупнейших методологических открытий в современной молекулярной биологии.

Метод ПЦР, применяемый при анализе ДНК, позволяет сегодня решать такие научно-исследовательские и диагностические задачи, как: диагностика социально значимых заболеваний, например, гепатиты В и С, туберкулез, СПИД; анализ онкологических и генетических заболеваний; генотипирова-ние (в медицине используется, например, для определения антибиотико-резистентных штаммов), в криминалистике — для идентификации личности; в сельском хозяйстве — для селекции ценных пород животных и сортов растений; идентификация генных мутаций; мониторинг экспрессии генов при разработке новых лекарственных средств и многие другие. Уже сейчас методики на основе ПЦР широко используются в научных исследованиях, в практическом здравоохранении и в системе Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор). 0]> ромное значение метод ПЦР имеет в области борьбы с биологическим терроризмом, так как позволяет наиболее быстро и точно обнаружить факт биологического воздействия.

К разработке оборудования для проведения ПЦР приступили практически одновременно с разработкой самого метода. За два десятилетия в про-мышленно развитых странах создано много вариантов устройств для реализации ПЦР — амплификаторов ДНК. Разработка общей теории расчета и создание высокопроизводительного оборудования для ПЦР способны дать дополнительный импульс развитию отечественных высокотехнологических производств и направлены на выпуск продукции, конкурентоспособной на мировом рынке медицинского и научного оборудования.

Актуальность темы диссертации, посвященной созданию теории рабочих процессов, методов расчета и разработке оборудования для проведения ПЦР, подтверждается также тем, что основные ее положения разрабатывались и реализовывались в процессе выполнения работ по договорам и контрактам в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы.

Объектом исследований в данной работе является базовое оборудование для проведения ПЦР-диагностики — амплификаторы ДНК, а предметом

исследований — рабочие процессы, протекающие в этих устройствах и определяющие их технические и эксплуатационные характеристики.

Цель работы: дальнейшее развитие теории рабочих процессов, создание методов расчета и разработка отечественного конкурентоспособного оборудования для ПЦР-диагностики — амплификаторов ДНК различного назначения.

Достижение поставленной цели осуществлялось путем решения следующих основных задач:

1. Изучение теплового взаимодействия реакционной смеси и тепловых блоков амплификаторов ДНК.

2. Разработка общей классификации амплификаторов ДНК.

3. Разработка концептуальной математической модели расчета амплификаторов ДНК.

4. Разработка общих методов расчета амплификаторов ДНК, основанных на различных принципах действия.

5.Проведение теоретических исследований влияния конструктивных и функциональных параметров на основные характеристики амплификаторов ДНК.

6. Проведение исследований, направленных на повышение эффективности и надежности амплификаторов ДНК.

7. Разработка и создание новых типов амплификаторов ДНК.

8. Разработка методики и проведение клинических испытаний созданных амплификаторов ДНК.

Научная новизна работы состоит в следующем:

1. Впервые выделены классификационные признаки и предложена общая классификация амплификаторов ДНК: по типу рабочего тела, способу подвода и отвода теплоты, способу преобразования энергии, типу используемых рабочих емкостей для реакционных ПЦР смесей и пр.

2. В результате впервые проведенных исследований теплового взаимодействия реакционной смеси и теплового блока амплификатора ДНК в ходе ПЦР установлено, что одной из основных причин низкой воспрозводимости результатов проведения ПЦР является неоднородность теплового поля рабочего тела в переходных режимах работы амплификаторов ДНК, которая может достигать ± (7. ..8) К при скорости изменения температуры рабочего тела теплового блока (1,.,1,5) К/с. Впервые разработана математическая модель и произведен расчет энергетического воздействия химических и физико-химических реакций при матричном синтезе цепей и плавлении ДНК на тепловое состояние реакционной смеси. Установлено, что теплота, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций (2,0-10"5... 1,0-10"4 Дж), не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

3. Впервые разработана научная основа для описания рабочих процессов в тепловых блоках амплификаторов ДНК. Создана обобщенная структурная

схема, определяющая характер взаимодействия компонентов теплового блока.

4. На основе обобщенной структурной схемы построена концептуальная модель расчета процессов тепломассопереноса, которая позволяет формировать единый подход к созданию частных математических моделей амплифи-каторов ДНК, базирующихся на различных принципах действия. Концептуальная модель состоит из системы нестационарных дифференциальных уравнений энергии, движения и неразрывности вязкой среды в трехмерной постановке, начальных и граничных условий.

5. Впервые разработана модель расчета термоэлектрических преобразователей энергии на основе законов неравновесной термодинамики.

6. На основе концептуальной модели созданы математические модели расчета различных типов твердотельных амплификаторов ДНК. На основе метода контрольного объема созданы методы и алгоритмы расчета, проведены численные исследования тепловых блоков амплификаторов ДНК и определены конструктивные и функциональные параметры, позволившие обеспечить однородность теплового поля рабочего тела на уровне ±(0,08...0,15) К при скорости изменения температуры от 1,5 К/с до 4,6 К/с.

7. На базе обобщенной структурной схемы и основных законов классической равновесной термодинамики для открытых систем впервые созданы математическая модель и алгоритм расчета пневматического амплификатора ДНК.

Практическая ценность и внедрение результатов работы.

1. Разработаны не имеющие аналогов концептуальная модель расчета, обобщенная расчетная схема и методы расчета, которые могут быть использовании при создании новых типов амплификаторов ДНК, основанных на различных принципах действия. Концептуальная модель и методы расчета позволяют существенно (в 5 - 10 раз) сократить сроки создания данного типа оборудования.

2. Выявлены направления и разработаны способы повышения надежности работы твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов. Предложена новая комбинированная твердотельная электротермоэлектрическая схема амплификатора ДНК, позволяющая качественно изменить условия работы термоэлектрических элементов. Достигнуто значительное (до 100 раз) увеличение количества рабочих циклов функционирования твердотельных устройств на основе термоэлектрических элементов.

3. Математические модели и методики расчета внедрены в практику проектирования в ЗАО «СТМ-Ц», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург. С использованием созданных методик и программ расчета разработаны и серийно производятся ЗАО «СТМ-С», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институт аналитического приборостроения РАН,

г. Санкт-Петербург, следующие типы амплификаторов ДНК: «Циклотемп-2», «Цикдотемп-4», «Циклотемп-106», «Циклотемп-107», амплификаторы ДНК для количественного анализа ДНК в реальном времени - анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АНК 32.

4. С применением созданных методик и программ расчета впервые разработана и изготовлена партия специализированных амплификаторов ДНК, предназначенных для работы с биологическим микрочипами. Устройство запатентовано в Российской Федерации (Пат. 43871 РФ, МПК7 С12М 1/34) и внедрено в Институте молекулярной биологии РАН, г. Москва, и Институте аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург.

5. С использованием разработанных методик и программ расчета разработан опытный образец малогабаритного мобильного пневмомеханического амплификатора ДНК для работы в полевых условиях. Устройство предназначено для проведения оперативной биологической разведки с целью индикации и идентификации агентов биологического воздействия непосредственно в зоне их обнаружения

6. Амплификатор ДНК «Циклотемп-107» и анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АНК 32 прошли приемочно-технические испытания во ВНИИМТ МЗ РФ и клинические испытания в исследовательских центрах и научно-исследовательских институтах МЗ РФ, МО РФ и РАМН, рекомендованы к применению в медицинской практике, внесены в Государственный Реестр изделий медицинского назначения и серийно производятся.

7. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедр «Биомедицинские технические системы и устройства» и «Вакуумная и компрессорная техника» МГТУ им. Н.Э. Баумана.

Достоверность полученных данных подтверждена результатами испытаний созданного оборудования для проведения ПЦР в лицензированных испытательных центрах, хорошей повторяемостью результатов, полученных в условиях реальной эксплуатации, и внедрением, в том числе, в медицинские учреждения.

На защиту выносятся:

1. Основные положения теории рабочих процессов, общая классификация, концептуальная модель расчета и обобщенная структурная схема оборудования для проведения ПЦР — амплификаторов ДНК;

2. Результаты исследований взаимодействия реакционных смесей и тепловых блоков амплификаторов ДНК в ходе ПЦР;

3. Математическая модель и метод расчета твердотельных амплификаторов ДНК и математическая модель термоэлектрических преобразователей энергии — источников тепла на основе законов неравновесной термодинамики;

4. Теоретические и экспериментальные исследования твердотельного на основе термоэлектрических элементов Пельтьс, твердотельного комбиниро-

ванного электропневматического, а так же пневмоэлектромеханического амлификаторов ДНК;

5. Результаты исследований теплового поля рабочего тела;

6. Результаты исследований, направленных на повышение эффективности и надежности амшшфикаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье;

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях и симпозиумах:

1. Научно-технической конференция «165 лет МГТУ им. Н.Э. Баумана», Москва, 1995 г.

2. Всероссийская научно-практической конференция «Применение цепной полимеразной реакции для диагностики инфекционных заболеваний», г. Сочи, апрель 1996 г.

3.Симпозиум международной выставки "Биотехнология", г. Ганновер, Германия, октябрь 1997 г.

4. Третья Российская национальная конференция по тепломассообмену, Москва, Россия, октябрь 2002 г.

5. Пятая международная научно-техническая конференция «Физика и радиоэлектроника в медицине и экологии», г. Владимир, Россия, 2002 г.

6. Третья, четвертая, пятая и шестая научно-технические конференции «Медико-технические технологии на страже здоровья», г. Анталия, Турция, октябрь 2002 г.; г. Шарм Эль Шейх, Египет, октябрь 2003 г.; о. Крит, Греция, октябрь 2004 г; п-ов. Халкидики, г. Салоники, Греция, октябрь 2005 г.

7. Научно-техническая конференция «40 лет Биотехническим системам», г. Санкт-Петербург, СПб ГЭТУ, март 2004 г.

8. Международный симпозиум. «Образование через науку», г. Москва, МГТУ им. Н.Э. Баумана, июнь 2005 г.

Созданное оборудование экспонировалось на российских и международных выставках: «Инновации-99», г. Москва, 1999 г., «Биотехнология», г. Ганновер, Германия, октябрь 1997 г., «Научное приборостроение», 2002, 2003, 2005 гг., г. Москва, «Биотехнология», г. Санкт-Петербург, 2003 г, «Мир биотехнологии», г. Москва, 2003, 2004, 2005, 2006 гг., «Здравоохранение», г. Москва, 2004, 2005 гг., «Генодиагностика», г. Москва, 2004 г., Новосибирск,

2005 г., Третий съезд Общества биотехнологов России, г. Москва, 2005 г.

По результатам выставки «Инновация-99. Технологии живых систем» амплификатор ДНК «Цикпотемп-107» награжден медалью ВВЦ. В

2006 г. амплификаторы ДНК для количественного анализа в реальном времени АНК-16 и АНК-32 награждены золотыми медалями выставки «Мир биотехнологии» в номинации «Медицинское оборудование».

Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований, в разработке методов расчета и создании оборудования для ПЦР-диагностики. Все вошедшие в диссертационную ра-

боту результаты получены лично автором или при его непосредственном участии.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 39 работ, в том числе один патент.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, восьми глав, списка используемой литературы из 181 наименования. Работа изложена 366 страницах текста, включая 127 иллюстраций и 15 таблиц.

Содержание работы

Во введении дается общая характеристика работы, обоснована актуальность темы, сформулирована научная проблематика, определены объект и предмет исследований.

В первой главе представлен обзор современного состояния проблем разработки оборудования для проведения ПЦР, который показал, что большое разнообразие выявленных конструктивных схем обосновывает необходимость определения классификационных признаков, разработки общей классификации и создания концептуальной модели расчета амплификаторов ДНК. Существует целый ряд проблем, решению которых уделяется основное внимание. Это, прежде всего, обеспечение однородности теплового поля рабочего тела; повышение скорости нагрева и охлаждения рабочего тела; снижение динамического разброса температуры рабочего тела в процессе стабилизации температуры; повышение надежности устройства. Решить указанные проблемы необходимо на этапе выбора структурной схемы и разработки конструктивной схемы амплификатора ДНК. Адекватность полученных результатов базируется на результатах расчетно-теоретических исследований на математических моделях, на основе которых определяются основные конструктивные и функциональные параметры.

Темпы развития современной науки требуют значительного сокращения сроков и стоимости разработки данного типа устройств, и способствовать этому могут создание общей концептуальной модели и методов расчета. Решение задачи усложняется и тем, что амплификаторы ДНК в сочетании с реакционной смесью представляет собой биотехническую систему. Успешная разработка или эффективное совершенствование характеристик данной системы возможны лишь при взаимном учете и согласовании параметров всех ее составляющих.

Вопросы разработки методов математического моделирования рабочих процессов в амплификаторах ДНК мало изучены. По принципу действия и назначению данный тип устройств является разновидностью термостати-рующих устройств, работающих в динамическом, управляемом режиме. Некоторые принципы обобщения при создании математической модели выполнены в работе H.A. -Ярышева и Л.Б. Андреевой. Известны попытки решения подобных задач аналитическими методами. Максимально в направлении создания методики расчета прецизионных устройств нагрева/охлаждения, работающих в динамическом режиме, продвинулась О.В. Белова, разработавшая

б

подход, использующий численные методы решения. Однако в ее работе предложена модель только твердотельного варианта исполнения устройства нагрева/охлаждения на термоэлектрических элементах Пельтье. При построении пространственной модели теплового блока расчетные области, в которые входят полупроводниковые материалы, медные спаи и воздух, были заменены на некий эффективный объем, теплофизические свойства которого представлены в виде эффективных плотности и коэффициента теплопроводности.

[Л]у + [А]0(1 -К,),р, = р,К, + р0(1 - К,),

где: К, = у~ — коэффициент преобразования; Vi — объем материала;

р. и р0 - плотность; [А], и [Я^ - коэффициент теплопроводности материала и воздуха соответственно. При решении задач однородности теплового поля данный подход не позволяет учитывать неоднородность теплового потока самого теплового источника — элемента Пельтье. Для описания теплового состояния рабочего тела, через которое тепло передается лабораторным емкостям с исследуемыми образцами, необходимо совместное решение трехмерного нестационарного уравнения теплопроводности всего теплового блока и уравнения энергии для потока теплоносителя в каналах охлаждения тепло-обменного устройства.

Основные способы преобразования энергии в амплификаторах ДНК основываются на эффекте Джоуля и термоэлектрических эффектах. Базовые теоретические исследования полупроводниковых термоэлектрических элементов были разработаны А.Ф. Иоффе и его сотрудниками. Дальнейшее развитие методы расчета термоэлементов получили в работах Г.К Котырло, B.C. Мартыновского, Л.И. Анатычука, А.И. Буриггейна, В.М. Зорина, Е.К. Иорда-нишвили, Б.Е. Малковича и других авторов. Большинство известных методов расчета базируются на описании процессов в термоэлементе, изолированном от взаимодействующих с ним тел. При рассмотрении одномерного стационарного температурного поля предполагается, что материал ветвей однороден и изотропен, зависимостью свойств материала от температуры пренебрегают; горячие спаи теплоизолированы; боковые поверхности ветвей термоэлемента адиабатически изолированы; тепловая нагрузка на спаях отсутствует; контактными сопротивлениями пренебрегают; принимается, что теплота Джоуля равномерно расходится к холодным и горячим спаям. Теплота, поглощаемая холодным спаем, термоэлемента составляет:

Ос = ес1Тс - Лс (Т„ - Тс) - - irc (Тн - Тс)1,

теплота, выделяемая на горячем спае, составляет:

Qh = еиТГн -Л„(Тн -Тс) + ±1гК + (Гя -Тс)1,

где: ТС,ТН ,ес,ен,гс,гя-температура, коэффициенты термо-ЭДС и коэффициенты Томсона холодного и горячего спаев соответственно.

Нестационарный режим работы термоэлементов рассматривается, в основном, при определении их быстродействия; при этом определение их рабочих параметров ведется на основе метода Фурье или операционным методом. Известен комплекс нестационарных задач, связанных с определением режима питания термоэлементов. Исходное интегральное уравнение решается при этом методом последовательных приближений, методами теории нелинейных колебаний и др.

Известные методы расчета термоэлементов позволяют с достаточной степенью точности рассчитывать процессы в термоэлектрических устройствах, работающих в условиях термодинамического равновесия. В амплифика-торах ДНК время переходных процессов сопоставимо со временем стабилизации температуры, следовательно, подобный подход для моделирования рабочих процессов не применим.

Построение методики расчета теплового блока на базе термоэлектрических элементов в динамическом режиме заключается в совместном решении задачи нестационарной теплопроводности и теплообмена всех элементов и описания термоэлектрических эффектов методами неравновесной термодинамики. Для этой цели получены нестационарные уравнения тепловых источников в термоэлектрических элементах в зависимости от вектора плотности тока, основывающиеся на принципах, изложенных Э.В. Осиповым.

Решение задачи исследования нестационарного теплового состояния теплового блока амплификаторов ДНК в трехмерной постановке основано на численных методах. В связи с наличием нелинейных граничных условий для достижения приемлемой точности решения необходимо учитывать баланс тепловых потоков во всей расчетной области, что становится возможным при применении метода Ваничева (метод взвешенных невязок) в варианте метода контрольного объема.

На основе проведенного обзора современного состояния разработок оборудования для проведения ПЦР сформулированы цель и задачи диссертационной работы.

Вторая глава посвящена биотехническим аспектам создания оборудования для проведения ПЦР.

Процесс ПЦР — это циклически повторяющаяся обработка содержащего ДНК раствора, в результате которой происходит квазиэкспоненциальное накопление копий определенного фрагмента исходной двухцепочечной ДНК. В состав реакционной смеси кроме двухцепочечной ДНК входят праймеры — два олигонуклеотида-затравки (химически синтезированные одноцепочечные короткие (15 ... 25)-звенные фрагменты ДНК, комплиментарные разным цепям выбранного участка ДНК, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата: дезок-сиаденазинтрифосфат (с1АТР), дезоксигуанозинтрифосфат (<ЮТР), дезокси-цитидинтрифосфат (сГСТР), дезокситимидинтрифосфат (с1ТТР), буферная

ДИК- - : : ;л

к г;-" 'Г 1

, л

4 -у \

2 3 |-циклы

1

2

-- ¡1 П

"гГ

I г

±0,15 К

30 V

система и фермент ДНК-полимераза. В основе ПЦР лежит процесс достройки праймера на матрице ферментом ДНК-полимеразой. Каждый цикл реакции состоит из трех этапов: денатурация исходной двухцепочечной ДНК (разведение спирали); гибридизация праймеров с комплементарными участками исследуемой последовательности при температуре, определяемой длиной и структурой праймеров, и ферментативное достраивание двухцепочечной структуры на заданном участке.

На рис. 1 приведен пример изменения температуры реакционной смеси и соответствующий ему идеализированный цикл процесса ПЦР. На первых дух циклах образуются лишь протяженные копии исходной ДНК. И только на третьем цикле появляются первые две «полноценные» двутяжевые копии выбранного фрагмента исходной ДНК.

При большом количестве циклов (25 ... 30) наблюдается резкое снижение темпа накопления ПЦР-продукта. Вызвано это тем, что концентрация наработанных копий фрагментов ДНК приближается к концентрации оставшихся свободных праймеров, и они начинают реально «конкурировать» в процессе гибридизации.

Приближенное к реальному процессу математическое описание ПЦР может быть представлено в виде: а =0 при «<3и в. =а-(г~'-2) при >и>3, где: б„ - количество фрагмента ДНК, получаемого в ходе реакции, ()0-исходное количество ДНК, п — число циклов реакции; пк — помер цикла, после которого происходит резкое снижение темпов прироста ПЦР-продукта; / -коэффициент, характеризующий качество ПЦР-процесса. В идеальном случае значение / стремится к 2.

Физический смысл коэффициента / в том, что копировать полностью удается не все однотяжевые фрагменты ДНК. Часть из них не успевает гиб-ридизоваться с праймером, на части процесс энзиматической полимеризации не доходит до конца. Величина коэффициента зависит от многих параметров, в том числе от качества оборудования, реализующего протокол теплового процесса. При идентичных условиях проведения процесса ПЦР в различных амплификаторах ДНК будут получаться продукты ПЦР, различающиеся количественно и качественно (наличие и доля побочных продуктов, образо-

373 348 323 298 273

Рис. 1.

Пример изменения температуры реакционной смеси и идеализированный цикл процесса ПЦР

I охлаждение

вание «шмеров» на аналитических гелях и пр.).

В результате проведенного изучения процессов взаимодействия биохимической (реакционная смесь) и технической (амплификатор ДНК) составляющих биотехнической системы удалось обосновать ряд требований, предъявляемых к амплификаторам ДНК. Так, например, установлено, что при увеличении скорости нагрева/охлаждения возможно снижение разброса по выходу ПЦР-продукта. Показано, что, несмотря на достаточно высокую однородность теплового поля рабочего тела в статических режимах ±(0,1...0,15) К, в идентичных образцах наблюдается разброс результатов по наработке ПЦР-продукта. Причина в том, что на переходных режимах однородность теплового поля блока значительно хуже и разброс температуры может достигать ±(7.. .8) К и выше.

Проведено математическое моделирование и численное исследование тепло-физических процессов, имеющих место в лабораторных емкостях с ПЦР-смесями при работе амплифи-катора ДНК. На рис. 2 в качестве примера показаны результаты численного исследования теплового поля реакционной смеси объемом 30 мкл в тонкостенной пластиковой ПЦР-пробирке объемом 200 мкл на 10-й и 100-й секунде процесса нагрева от 290 К до 356 К. На рис. 3 и 4 показаны изменение средней по объему температуры реакционной смеси и максимальный разброс температуры в объеме реакционной смеси в процессе нагрева. Из данных, приведенных на рис. 4, видно, что на первых 20 секундах нагрева разброс температуры в объеме реакционной смеси (30 мкл) может достигать 9 К. В результате численных исследований установлено, что переходные тепловые процессы могут оказывать существенное влияние на протекание ПЦР и должны заканчиваться до завершения каждого стационарного этапа температурного протокола.

310.55 309.21 307.87 306.53 305.20 303.86 302.52 301.18

Юс

100 с

Рис. 2.

Результаты численного исследования теплового поля реакционной смеси объемом 30 мкл на 10-й и 100-й секунде нагрева от 290 до 356 К.

80 120 время, с

Рис. 3.

Изменение средней по объему температуры реакционной смеси (5 ... 30 мкл) в процессе нагрева

Т

-......?.......4........|........|

•Ч .4.- 30 мкл.....I

ч /

—'■^•■•■¡■Г.....420 мкл

' —!■

/ , : - • ■ . ; . 5 МКЛ

I—I—1_. 10 мкл—

40 80 120 160 время, с

Рис. 4.

Максимальный разброс температуры в объеме реакционной смеси (5 ... 30 мкл) в процессе нагрева

Для получения максимально высокой равномерности теплового поля и повышения выхода ПЦР-продукта следует использовать наиболее интенсивные способы подвода теплоты к реакционным смесям и минимизировать их объем, необходимо адаптировать ПЦР-протокол к конкретному типу емкостей (микропробирки, планшеты и пр.), используемых в амплификаторе ДНК. Проведена оценка влияния тепловых эффектов, обусловленных ходом ПЦР на исполнение заданного температурного протокола. Установлено, что теплота (2,0-Ю"5 ...1,0-Ю"4) Дж, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций при матричном синтезе цепей и плавлении ДНК не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

Третья глава посвящена анализу вариантов исполнения и разработке общей классификации и концептуальной модели расчета амплификаторов ДНК. Классификация проведена по двум основным категориям: по принципу действия и по техническим и эксплуатационным характеристикам (рис. 5).

Выявленные квалификационные признаки позволили синтезировать обобщенную структурную схему теплового блока амплификаторов ДНК (рис.6), охватывающую практически все возможные варианты исполнения рассматриваемого типа оборудования.

На обобщенной структурной схеме базируется концептуальная модель расчета амплификаторов ДНК. Расчетная область концептуальной модели включает объект исследования — реакционную смесь и компоненты теплового блока: носитель, рабочее тело, преобразователь энергии, теплообменное устройство и теплоноситель.

Классификация по принципу действия

Рабочее тело

Способ подвода (отвода) тепла

•я с*

ш

111

д

о К К « £В н

82 Я л>

ЯЗЮ СО о* О.

Способ преобразования энергии (нагрев)

1

Способ преобразования энергии (охлаждение)

и о Я"

Я Й

о-©-й-©* 3 "> а

о, £

1

о

>я й

э §

Я дн

X

я* "Я

к й

5-в-2я а

о. £

еа

а

и

в «

к я

О Я

Р ей р

« о

Классификация по техническим и эксплуатационным характеристикам

Применяемые носители

л к ю

о &

о &

к

Защита от испарения

Температурное Вариант

поле исполнения

>8

Рис. 5.

Классификация амплификаторов ДНК

В основу концептуальной модели заложена система нестационарных уравнений в дифференциальной постановке, а также граничные, начальные и конечные условия.

Система уравнений состоит из: уравнения сохранения энергии:

трехмерного нестационарного уравнения теплопроводности: уравнений движения:

р~=~+м-лЛ^к),

Р~ж~=1~~%+М' ^у )' (3)

ш от

и уравнения неразрывности потока:

^-+<Нг(р-й) = 0, (4) о!

где: с — теплоемкость среды, Вт/(кг-К); — мощность объемных источников,

Вт/м3; / —время, с; Г-температура, К; и - вектор скорости, м/с;

р — плотность, кг/м3; [я] — коэффициент теплопроводности, Вт/(м-К),

р — давление, Па; [1 - динамическая вязкость, кг/м-с, Ег — сила тяжести, Н.

Система уравнений (1...4) концептуальной модели расчета, описывающая процессы в расчетной области, соответствующей обобщенной структурной схеме, может быть представлена в виде таблицы 1,

Взаимодействие между компонентами расчетной области описывается одним из видов граничных условий:

й = 0, (5)

{-Щ&алг, =(-[4^/; . к*!. (6)

{-Щ8га*Г, = . кЫ (7)

где: а/- коэффициент теплоотдачи, Вт/(м2 К); Г/— температура жидкости, К; п — вектор нормали к поверхности границы; , , — взаимодействующие поверхности компонентов расчетной области.

Тепловое взаимодействие между компонентами расчетной области концептуальной модели, для каждого конкретного случая, может описываться

одним из видов граничных условий, также представленными в виде таблицы 2.

Начальные условия. В момент времени, < = 0, для всех компонентов расчетной области обобщенной структурной схемы имеется следующее рас-пределени параметров:

Т = Т(1,х,у,2), р = р(г,х,у,=), р = р{1,х.у,2). й = Т(1,х,у,:).

Источник энергии

» Алгоритм управления

Рис.6.

Обобщенная структурная схема теплового блока амплификатора ДНК. Т0, Трс - температура объекта и рабочего тела, Орт ,Огеш! — расход рабочего тела и теплоносителя соответственно.

Конечные условия могут быть заданы в вариантном виде: значение температуры исследуемой точки (расчетной области) достигло заданного значения (ГГг = 7^); время расчета равно заданному - '„¿У, значение исследуемого параметра достигло заданного значения {хт = ).

Таблица 1

Компонент расчетной области Уравнение энергии Уравнение теплопроводности Уравнение движения Уравнение неразрывности

Объект исследования +(1) - +(3) +(4)

Носитель - +(2) - -

Рабочее тело (твердое тело) - +(2) - -

Рабочее тело (газ, жидкость) - +(2) +(3) +(4)

Преобразователь энергии +(1) - - -

Геплообменное устройство - +(2) ■ - -

Теплоноситель - +(2) -КЗ) +(4)

Таблица 2

Взаимодействующие компоненты расчетной области Для уравнений неразрывности и движения Для уравнения энергии

Объект исследов. Носитель (5) (б)

Носитель Рабочее тело (твердое тело) (6)

Рабочее тело (газ, жидкость) (5) (7)

Объект исследования (5) (6)

Внешняя среда (5) (7)

Рабочее тело (твердое тело) Носитель - (6)

Преобразователь энергии - (6)

Внешняя среда - (7)

Рабочее тело (газ, жидкость) Носитель (5) (7)

Преобразователь энергии (5) (7)

Внешняя среда -

Преобразователь энергии Теплообменное устройство - (6)

Внешняя среда (5) (7)

Теплообменное устройство Преобразователь энергии - (б)

Теплоноситель (5) (7)

Внешняя среда (5) (6)

Теплоноситель Теплообменное устройство (5) (6)

Четвертая глава посвящена разработке теории рабочих процессов и созданию на базе концептуальной модели методики расчета твердотельных амплификаторов ДНК. В качестве преобразователей энергии в этих устройствах могут использоваться как термоэлектрические элементы Пельтье (ТЭ), так и электрические нагреватели. Как и любые другие варианты амплификаторов ДНК, твердотельные состоят из теплового блока и системы управления. На рис. 7 приведена конструктивная схема твердотельного амплифика-тора ДНК на базе термоэлектрических преобразователей энергии.

В состав теплового блока устройства входят: пластина-держатель 1 (рабочее тело) для размещения микропробирок 8 с реакционной смесью, датчики температуры 2, радиатор 3, батарея термоэлектрических элементов 5, ограничитель потока воздуха?, теплоизоляция 6 и нагреваемая крышка 17. Система управления включает: предварительный услитель9, АЦП 10, микро-процессорное устройство 11, ЦАП 12, уси- Тепловой блок твердотельного амплифика-литель тока 13, импульс- тора ДНК на основе термоэлектрических ный источник тока 14, элементов Пельтье (см. текст)

устройство ввода/вывода информации 15 и внешнюю ЭВМ с программным обеспечением для сбора и обработки информации 16. При подаче тока заданной полярности на термоэлектрические элементы происходит нагрев пластины-держателя и охлаждение радиатора; при изменении полярности включения тока направление тепловых потоков меняется на противоположное. Во избежание испарения воды из реакционной смеси (во время нагрева) и конденсации ее на крышке и стенках микропробирок 8 в состав устройства включена нагреваемая крышка, температура которой поддерживается в диапазоне (381 ... 388) К.

Математическая модель расчета теплового блока твердотельного амплификатора ДНК создана с учетом основных допущений: все рассматриваемые материалы элементов расчетной области однородны по составу и изотропны по теплофизическим свойствам; контакты между отдельными элементами расчетной области приняты идеальными; теплоемкость с, плотность р и коэффициент теплопроводности Л в твердом теле постоянны и не зависят от температуры; для циклического процесса нагрева/охлаждения за-

дан закон изменения вектора силы тока по направлению и по модулю ] = /(г) от времени; температурные деформации элементов системы пренебрежимо малы по сравнению с их линейными размерами.

Расчетная область состоит из следующих элементов: нагреваемая крышка (внешняя среда), воздушная камера (внешняя среда), пластина-держатель (рабочее тело), преобразователь энергии (термоэлектрический элемент и/или электрический нагреватель) и теплообменное устройство. В свою очередь, термоэлектрический элемент состоит из: верхней керамической подложки; верхнего ■медного спая; полупроводниковых переходов; нижнего медного спая и нижней керамической подложки. Теплообменное устройство (радиатор) включает собственно радиатор и поток воздуха в воздушных каналах радиатора.

Тепловой блок. Математическая модель, описывающая процесс переноса тепла в тепловом блоке твердотельного устройства, состоящего из рабочего тела (пластины-держателя), преобразователей энергии и радиатора, описывается трехмерным нестационарным уравнением теплопроводности:

где Sr - мощность внутренних источников (стоков) теплоты. Для пластины-держателя и радиатора Sr — 0. В преобразователях энергии, термоэлектрических элементах и электрическом нагревателе этот член уравнения (5Г) будет состоять из нескольких слагаемых.

Воздушные каналы теплообменного устройства. Передача тепла в каналах радиатора происходит посредством вынужденного конвективного теплообмена. В связи с этим приняты некоторые допущения: при движении воздуха в каналах радиатора существует доминирующее, маршевое направление, движения потока воздуха, совпадающее с направлением канала; вязкой диффузией в доминирующем направлении можно пренебречь по сравнению с вязкой диффузией в направлениях, перпендикулярных доминирующему.

Течение несжимаемой жидкости в каналах радиатора описывается уравнением движения (уравнение Навье-Стокса). С учетом принятых допущений: о возможности не учитывать сжимаемость воздуха, то есть плотность газа постоянна по всему полю потока; вязкость среды постоянна (/и = const) и о существовании маршевого направления, уравнения движения принимают вид:

рс— = Xdiv{gradT ) + £,

т»

(9)

(10)

¿и, „ (32и дги,

Уравнение сохранения энергии для потока газа в каналах радиатора тепло-обменного устройства аналогично уравнению (1), только отсутствует внутренний источник тепла 5Г = 0:

+ с1ы{рсриТ - Х%гас1т)= 0. (11)

Уравнение сохранения массы для потока газа в теплообменном устройстве (в каналах радиатора) или уравнение неразрывности:

^-+сИ\'(ри)=0. (12)

Воздушная камера — замкнутый объем, заполненный воздухом. Передача тепла происходит посредством естественной конвекции. Система уравнений, описывающая процессы теплового взаимодействия, состоит из: уравнения движения воздуха —

= -—+ — (1—£Й'уи + %гас1их), Л дх 3. дх

с1ри др 15,. , , .

Ш ду 3 ду 4

с11 & 3 й:

уравнения сохранения энергии-

+ сИх{рс„иТ-^гас1Т)=0; (14)

уравнения сохранения массы (уравнение неразрывности)-

О, (15)

Начальные и граничные условия являются неотъемлемой частью математической модели и задаются для всех элементов расчетной области.

При разработке математической модели для совместного решения задачи нестационарной теплопроводности и теплообмена всех элементов расчетной области проведено математическое моделирование термоэлектрических эффектов методами неравновесной термодинамики и выведено уравне-. ние закона сохранения энергии для однородной термоэлектрически изотропной среды:

{л :

В полученном уравнении в квадратных скобках находятся тепловые источники:

выделение тепла Джоуля-

3 ,/~\дТ 2 „да дТ .

ду ду дТ ду

сЬ>. (16)

.(Г)/

•'Дж — " Г.Х." JJ ' (17)

выделение/поглощение тепла Пельтье-Томсона —

'--«ж*'-

Решение представленной системы дифференциальных уравнений (9...18) выполняется методом контрольного объема в конечно-элементной постановке, для применения которого разработаны дискретные аналоги всех дифференциальных уравнений системы.

В главе 5 приведены численные исследования твердотельных тепловых блоков амплификаторов ДНК. Исследуются причины возникновения неоднородности теплового поля рабочего тела, к которым, прежде всего, относятся: неоднородность теплофизических свойств материала и теплового потока от источника тепла, подвод или отвод тепла по границам взаимодействия с окружающей средой или элементами конструкции. На рис. 8 и 9 приведены результаты исследования влияния материалов и размеров включений на однородность температурного поля. Ось ординат (с1Т) — разность между температурой поверхности (материал без включений) и температурой поверхности над включением. Так как в действительности величины включений порядка (0,4x0,4x0,4) мм не встречаются, то можно сделать вывод, что они практически не оказывают существенного влияния на неоднородность теплового поля.

0,15

0 ^......

0 4 8 12 Время, с

Рис. 9.

Влияние размера включения на неоднородность теплового поля. 1 — (1x1x1) мм, 2-(0,8x0,8x0,8) мм, 3-(0,6x0,6x0,6) мм и4-(0,4x0,4x0,4) мм Из приведенных на рис. 10 данных видно, что тепловой поток от источника тепла оказывает существенное влияние на распределение температуры в зоне контакта, однако на температурное поле самого рабочего тела —

Время, с Рис. 8.

Влияние материала включения на неоднородность теплового поля. 1— сталь; 2 — медь; 3 — воздушная пора

пластины-держателя с ячейками эта неоднородность практически не влияет. Результаты исследования влияния условий взаимодействия с окружающей средой и геометрических характеристик пластины-держателя представлены на рис.11. Из приведенных результатов следует, что в динамическом режиме (12-ая секунда нагрева - рис.11,а) распределение температуры существенно неравномерное, а в стационарном режиме (этап стабилизации температуры) влияние этих факторов незначительно (рис. 11,6).

а) б)

Рис. 10.

Влияние источников тепла на однородность теплового поля: а — разрез по пластине-держателю, б - вид снизу

а) б)

Рис. 11.

Влияние условий взаимодействия с окружающей средой и геометрических характеристик пластины-держателя: а—динамический режим (12-ая секунда нагрева), б — этап стабилизации температуры

Проведены комплексные численные исследования тепловых блоков различной вместимости (96-, 16- и 32-луночные) на основе термоэлектрических элементов. Были исследованы влияния: режимов работы вентилятора, выбора материала пластины-держателя, мощности элемента Пельтье, геометрических размеров и формы пластины-держателя и других факторов на работу тепловых блоков амплификаторов ДНК. На рис. 12 показаны изменения температуры 96-луночной пластины-держателя (1) и радиатора (2) теплового блока в процессе исполнения температурного протокола.

г

■ се (и

с

-о Н

323

273

О

1000

Данные по влиянию режима работы вентилятора и материала пластины-держателя на характер изменения температуры рабочего тела в ходе процесса приведены на рис. 13 и 14. Из полученных результатов следует, что использование серебра позволяет значительно снизить разброс температуры (до 0,6 К) по пластине держателю в динамическом режиме (рис. 14) и не оказывает существенного влияния на повышение скорости нагрева/охлаждения (рис. 13,6). Хороших результатов в повышении скорости нагрева/охлаждения можно добиться управлением режимом работы вентилятора, применяя для изготовления пластины держателя сплав Д16Т (рис. 13,а).

Улучшение динамических характеристик теплового блока достигнуто совершенствованием геометрической формы пластины-держателя (рис. 15). Кривые изменения температуры для исходного и облегченного варианта при прочих равных условиях показаны на рис. 16. Применение облегченной формы не привело к увеличению неоднородности теплового поля.

373 т-:т-—-[-—"■ -л 373 ■

348 | / 1 \ 1/—'I \\ д- .,348-

500 Время!, с. Рис. 12.

Изменения температуры пластины-держателя в процессе исполнения температурного протокола.

1 - центральная ячейка пластины-держателя, 2 -центр радиатора

И

323 298 273

V г*

г и ¡11

И'

323 ■ 298 273

-А- гРг

Г 1

100 200 300 400 500 0 200 400 600

Время и с Бремя С

а) б)

Рис. 13.

Изменение температуры пластины-держателя, а) в зависимости от режима работы вентилятора. 1 -скорость воздуха 5 м/с, вентилятор работает постоянно, 2 — скорость воздуха 2 м/с, вентилятор включается на режимах охлаждения и термостабилизации; б)- в зависимости от материала пластины-держателя (1 - серебро, 2 - сплав Д16Т)

800

На рис. 17 приведены данные расчета разброса температуры по рабочему телу (пластине-держателю) 32-луночного теплового блока. Из рисунка видно, что на этапах стабилизации температуры максимальный разброс не превышает 0,1 К, а в динамическом режиме разброс находится в пределах (0,3 ...0,4) К.

¡4 £

1.5 1

0.5 0 -0.5

Л

л , é\

i

800

200 400 600 Время 1, с Рис. 14.

Влияние материала детали (пластины-держателя) на разброс температуры. 1 — серебро, 2 - сплав Д16Т

а) б)

Рис. 15.

а - внешний вид облегченной пластины-держателя, б — тепловое поле облегченной пластины-держателя в процессе нагрева

0.4-

373 348

-323 298 273-

у

// >Л У . Z1

¥ 2

Í4 £

50

250

100 150 200 Время t, с

Рис. 16.

Температура центральной ячейки исходного 1 и облегченного 2 варианта пластины-держателя

-0.4

J Wí л* jWW Ч*Ж ¡tm

J т ir

400

100 200 300 Время 1, с Рис. 17.

Разброс температуры по пластине-держателю 32-луночного теплового блока

Глава 6 посвящена разработке методики расчета, численным и экспериментальным исследованиям характеристик пневматических амплификато-ров ДНК. Активная разработка пневматических амплификаторов ДНК обусловлена относительной простотой конструкции и необходимостью создания

12 К/с). Устройства данного типа отличаются большой вместимостью теплового блока и возможностью оптимального, с конструктивной точки зрения, размещения системы детекции при создании количественного амплификато-ра ДНК, предназначенного для работы в реальном времени. В пневматических амплификаторах подвод тепла к носителю (капилляр или микропробирка) с исследуемым образцом осуществляется за счет замещения рабочего тела — воздуха, перемещаемого побудителем расхода через преобразователь энергии.

Для сокращения времени расчета при компоновке и анализе рабочих характеристик исследуемых схем пневматических амплификаторов ДНК создана математическая модель, основанная на основных принципах равновесной термодинамики с сосредоточенными параметрами. Расчетная схема пневматического амплификатора ДНК приведена на рис. 18.

Рг'-Тц нагрев&тгь ввшипяггер

Рис. 18.

Расчетная схема пневматического амплификатора ДНК

Расчетная схема пневматического амплификатора ДНК представляет набор из трех пневматических емкостей, соединенных между собой и с окружающей средой условными дросселями с проходными сечениями/А1,/п,/21 и /зл. На входе в емкость 1 установлен вентилятор, обеспечивающий подачу рабочего тела с расходом С0. Из емкости 1 рабочее тело (воздух) поступает в емкость 2 (расход О,), в которой установлен преобразователь энергии — электрический нагреватель, и далее в емкость 3 (расход С2), и оттуда выбрасывается в окружающую среду (расход С3). Микропробирка с реакционной смесью размещенав емкости З.У1,Р2,У3,р,,р3,р3,Г1,Г1 иТ3 - объемы пневматических емкостей, давление и температура воздуха в емкостях соответственно, ра и Та- давление и температура воздуха окружающей среды. Математическая модель построена с учетом допущений: рабочее тело — идеальный газ, подчиняющийся термодинамическому уравнению состояния; процесс истечения - адиабатический; поток газа — установившийся; течение газа происходит без трения (отсутствуют диссипативные силы). Модель базируется на системе обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ), описывающих

изменение давления, температуры и теплового взаимодействия в открытой термодинамической системе:

^вд-од-^*-,)),

РзКз^ £Й п 2 Ж у ')

Коэффициент теплоотдачи между потоком газа и пробиркой определен по известной зависимости: Ыиж-Я

где Миж — значение числа Нуссельта; А - коэффициент теплопередачи газа при определяющий температуре; - внешний диаметр пробирки, являющийся определяющим размером.

Для расчета числа Нуссельта использована критериальная зависимость для поперечного обтекания тела цилиндрической формы:

=(о,43 + 0,55 • Яе^'. Р£5!)- ег, Кеж

= 0,5 — коэффициент, учитывающий угол между направлением течения

потока и осью цилиндра.

Аналогичным образом вычислен коэффициент теплоотдачи между нагревательным элементом и рабочим телом. Число Нуссельта в данном случае:

Ж = 0,4тес-6 Ргадз-(Рг^г У'"-^;

£•, =(5,/^2)1/6 при < 2; г5=1,12 при ^ 2,

где мг, м/с - средняя скорость газа; V, м2/с — коэффициент кинематической вязкости газа, Рг^ — значение числа Прандгля для газа вычисляются при определяющей температуре, а Рг, — значение числа Прандтля для газа при температуре спирали.

Для решения системы ОДУ используется жестко устойчивый метод

Гира. На базе созданной математической модели проведен комплекс численных исследований. Для проверки адекватности модели и подтверждения правомочности использования полученных результатов создан экспериментальный стенд. Сопоставление результатов теоретических и экспериментальных исследований температур жидкости в микропробирке и рабочего тела в третьей полости (рис. 19) показывают, что расхождение результатов расчета относительно данных, полученных опытным путем, не превышают (5 ... 10) %, что вполне приемлемо для инженерных расчетов и подтверждает правомочность использования разработанной математической модели при создании и исследовании пневматического амплификатора ДНК.

Глава 7 посвящена повышению эффективности и надежности твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье. Данный тип амплификаторов ДНК имеет наиболее высокие технические и потребительские характеристики. Однако наряду с положительными свойствами им присущи недостатки. Прежде всего — это ограниченный ресурс термоэлектрических элементов при работе в динамическом, реверсном режиме. В-работе сформулированы основные технологические и конструктивные направления решения данной проблемы. Кроме того, разработана эффективная система автоматического регулирования температуры, позволяющая отказаться от импульсного (релейного) режима управления. Суть технологических решений заключается в применении новых типов модифицированных ТЭ марки ТМС-127-1.4-6.0 российского производства, выдерживающих до 2000-Ю3 циклов испытаний. Базовые ТЭ отечественного производства, изготовленные по обычной технологии, выдерживают до 18-Ю3 циклов, а лучшие аналогичные модули зарубежного производства (фирмы Ferrotec America Corporation (США) —28-Ю3 циклов. Применение модифицированных модулей позволяет увеличить ресурс работы амплификатора ДНК минимум в (30. ..40) раз.

Конструктивное совершенствование заключается в разработке комбинированной электро-термоэлектрической схемы блока нагрева/охлаждения. В плоскости стыка пластины-держателя и термоэлектрических элементов размещают толстопленочный электрический нагреватель, нанесенный на ке-

30 40 50 время, с

Рис. 19.

Сопоставление результатов теоретических

и экспериментальных исследований. ТЖ{Э),ТЖ,Т3 Т3(3)- экспериментальное и расчетное значения температуры реакционной смеси и воздуха в полости 3

рамическую подложку. Это позволяет отказаться от использования термоэлектрических элементов Пельтье как источника тепла. Нагрев и стабилизация температуры пластины-держателя обеспечивает выделение тепла в электрическом нагревателе. Термоэлектрические элементы выполняют две функции: используются в качестве теплового насоса в режиме охлаждения пластины-держателя и в качестве вариаторов тепловых потоков. Впервые применение термоэлектрических устройств в качестве вариаторов теплообмена, реализующих обратный тепловой цикл и усиливающих (или ослабляющих) теплообмен, было описано B.C. Мартыновским и В.А. Наером. Применив комбинированную схему, можно создать эффект "теплового ключа", то есть достичь результата, при котором теплота, выделяемая электрическим нагревателем, не передается на радиатор или значительно снижается.

Численные исследования, проведенные на математической модели расчета твердотельных амплификаторов ДНК, подтвердили работоспособность комбинированной схемы теплового блока. Установлено, что работа термоэлектрических элементов в режиме «теплового ключа» позволяет снизить мощность электрического нагревателя без существенной потери динамических показателей устройства. Амплификаторы ДНК, созданные на основе предложенных решений, находятся уже более пяти лет в реальной эксплуатации без замены термоэлектрических элементов. Это практическое подтверждение решения проблемы повышения надежности и ресурса данных изделий.

Глава 8 посвящена разработке, созданию и клиническим испытаниям амплификаторов ДНК. На основе предложенной в работе общей классификации и обобщенной структурной схемы синтезированы частные структурные схемы семейства твердотельных и пневматических устройств. На их базе и с учетом результатов численных исследований разработаны конструкции и созданы новые амплификаторы ДНК различного назначения.

Твердотельные амплификаторы ДНК Амплификаторы ДНК: «Циклотемп-2», «Циклотемп-4» (рис. 20) и их более поздняя версия — «Циклотемп-106» (рис. 21) предназначены для обслуживания научно-исследовательских работ. Вместимость теплового блока — 24 микропробирки объемом 0,5 мл. Скорость изменения температуры (0,6... 1,0) К/с, точность поддержания температуры ± 0,1 К. Амплификаторы ДНК «Циклотемп-2», «Циклотемп-4» и «Циклотемп-106» прошли успешные испытания в ряде ведущих российских и зарубежных исследовательских центров.

Рис.20. Рис.21.

Амплификатор ДНК «Циклотемп-4» Амплификатор ДНК «Циклотемп-1 Об»

Прецизионный программируемый термостат «Циклотемп-107» - амплифиа-катор ДНК (рис. 22) предназначен для проведения любых лабораторных работ, требующих термостатирования реакционных смесей, и, прежде всего, для проведения ПЦР. Основные области применения — практическая медицина, фундаментальная наука, сельское хозяйство, судебно-медицинская экспертиза, система Роспотребнадзора. Отличительными характеристиками амплификатора ДНК «Циклотемп-107» являются: большая вместимость теплового блока - количество ячеек для образцов - 96 (0,2 мл) или 60 (0,5 мл); сменяемость теплового блока; высокая точность поддержания температуры (±0,15 К) и равномерности теплового поля рабочего тела (±0,15 К); высокая надежность. В данном устройстве используются 6 элементов ТМ-127-1,4-6,0 серии ТМС. Средняя скорость изменения температуры в цикле нагрев/охлаждение (313 К— 368 К— 313 К) — более 2,2 К/с; ресурс работы до замены микроохладителей — не менее 5 лет. Амплификатор ДНК «Циклотемп-107» снабжен системой защиты от испарения воды из реакционной смеси.

Рис. 22. Рис. 23.

Амплификатор ДНК Анализатор нуклеиновых кислот

«Циклотемп-107» АНК 32

Анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16 и АНК 32 (рис. 23) — одни из первых отечественных амплификаторов ДНК для количественного анализа в реальном времени включают: тепловой блок для проведения ПЦР и оптический блок для измерения сигнал флуоресценции образца. Изменение сигнала в ходе ПЦР пропорционально изменению количества ампликона в реакционной смеси. Четырехцветное измерение сигнала флуоресценции дает возможность наблюдать четыре независимых реакции в одном образце одновременно. Программное обеспечение позволяет задавать и контролировать условия проведения ПЦР и измерения флуоресценции, а также обрабатывать результаты и выдавать их в заданном виде. Количество ячеек для образцов — 16/32 (0,2 мл). Температурный диапазон - (273 ... 372) К. Точность поддержания температуры: ±0,1 К. Разброс температуры рабочего тела: ±0,15 К. Средняя скорость изменения температуры в цикле нагрев/охлаждение более 1,5 К/с.

Рис. 24.

Амплификатор ДНК для проведения ПЦР на биологических микро-

Рис. 23. Мобильный пневмомеханический амплификатор ДНК

Амплификатор ДНК для проведения ПЦР на биологических микрочипах (рис. 24) разработан по заказу института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Биологические микрочипы состоят из массива трехмерных гидрофильных' ячеек геля, расположенных на гидрофобной поверхности стекла. Основная область применения — практическая медицина, сельское хозяйство, судебно-медицинская экспертиза и др. Данные амплификато-ры ДНК применяются в лаборатории биологических микрочипов в целом ряде приложений таких, как обнаружение возбудителей туберкулеза, идентификация вирусных агентов в донорской крови, детекция возбудителей особо опасных инфекций.

Отличительными особенностями данного типа амплификатора ДНК являются малые масса (0,15 кг) и габариты - (110x70x105) мм. Потребляемая (пиковая) мощность — 30 Вт при напряжении питания теплового блока - 12 В. Тип носителя исследуемых образцов - предметные стекла «in situ» или био-

логические микрочипы. Температурный диапазон - (308 ... 373) К. Точность поддержания и разброс температуры рабочего тела ±0,15 К и ±0,1 К соответственно. Средняя скорость изменения температуры: (3,5 ... 4,6) К/с.

Пневматические амплификаторы ДНК

С применением основных положений данной диссертации и на основе результатов численных исследований создан тепловой блок пневматического малогабаритного пневмомеханического амплификатора ДНК (рис. 23). Целью разработки является создание отечественного устройства с максимально высокими техническими характеристиками и возможностью работы в полевых условиях. Он может быть использован для проведения оперативной биологической разведки с целью индикации и идентификации агентов биологического воздействия по структуре их ДНК. Отличительными особенностями данного амплификатора ДНК являются малая масса (0,1кг) и габариты — (110x30x105) мм. Потребляемая (пиковая) мощность - 8 Вт при напряжении питания — 12 В. ПЦР проводится в одной микропробирке объемом 0,2 мл. Температурный диапазон: (308 ... 373) К. Точность поддержания и разброс температуры рабочего тела ± 0,2 К и ±0,1 К соответственно. Средняя скорость изменения температуры до 3,5 К/с.

Амплификаторы ДНК «Циклотемп 107», АНК 16 и АНК32 прошли приемочно-технические и клинические испытания, рекомендованы для применения в медицинской практике и внесены в государственный Реестр изделий медицинского назначения.

Основные результаты и выводы

1. Выделены основные классификационные признаки, на которых предложена общая классификация, позволяющая синтезировать новые структурные и конструктивные схемы амплификаторов ДНК.

2. Проведено исследование взаимодействия реакционной смеси и теплового блока амплификаторов ДНК. Показано, что с теплофизической точки зрения для получения максимального выхода ПЦР-продукта следует снижать объем реакционной смеси, интенсифицировать процесс отдачи тепла от рабочей среды к реакционной смеси и адаптировать температурный протокол процесса ПЦР для каждого типа амплификатора ДНК. Установлено, что одной из основных причин пониженной воспроизводимости результатов проведения ПЦР является неоднородность теплового поля рабочего тела в переходных режимах работы амплификаторов ДНК. Впервые произведен расчет энергетического воздействия химических и физико-химических реакций в ходе ПЦР на тепловое состояние реакционной смеси. Установлено, что теплота, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций (2,0-10"5 ...1,0-10"') Дж не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

3. Разработана теория рабочих процессов, предложена методология расчета и создания оборудования для ПЦР-диагностики, основу которых составил системный подход к исследованию параметров амплификаторов ДНК.

4. Создана обобщенная структурная схема, определяющая характер взаимодействия компонентов теплового блока. На основе обобщенной структурной схемы построена концептуальная модель расчета процессов теготомассопере-носа, которая позволяет формировать единый подход к созданию математических моделей амплификаторов ДНК, базирующихся на различных принципах действия.

5. На базе концептуальной модели расчета создана математическая модель расчета твердотельных амплификаторов ДНК, включающая общую расчетную схему, математическую модель твердотельных амплификаторов ДНК, математическую модель расчета термоэлектрических преобразователей энергии на основе законов неравновесной термодинамики. Разработаны методики и алгоритмы расчета твердотельных амплификаторов ДНК.

6. Проведены комплексные численные исследования влияния конструктивных и функциональных параметров на основные характеристики тепловых блоков амплификаторов ДНК. Проведены численные исследования различных вариантов тепловых блоков твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье и твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК, в результате которых получены общие рекомендации по проектированию тепловых блоков твердотельных амплификаторов ДНК, направленные на повышение скорости нагрева/охлаждения и снижения разброса температуры рабочего тела.

7. На основе обобщенной структурной схемы создана математическая модель пневматического амплификатора ДНК. В основу модели заложены законы классической равновесной термодинамики для открытых систем. Созданы метод и алгоритм численного расчета пневматического амплификатора ДНК. Сопоставление результатов теоретических и экспериментальных исследований температур реакциошюй смеси и рабочего тела показали, что отклонение результатов расчета относительно данных, полученных опытным путем, не превышает (5...10) %. Подтверждено, что в пневматических амплификаторах ДНК реально достичь скорости изменения температуры рабочего тела (5...10)К/св диапазоне от 298 К до 363 К.

8. Проведены исследования работы амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов, позволяющая в 30 ... 40 раз повысить ресурс их работы. Предложена комбинированная электро-термоэлектрическая схема блока нагрева/охлаждения, позволяющая отказаться от циклического режима работы термоэлектрических элементов. Численные исследования на базе созданной математической модели подтвердили работоспособность данной схемы. Амплификаторы ДНК, созданные на основе предложенных решений, находятся более пяти лет в реальной эксплуатации без замены термоэлектрических элементов, что на практике подтверждает решение проблемы повышения надежности и ресурса данных изделий.

9. Основные положения данной диссертации внедрены в практику создания и проектирования оборудования для ПЦР - диагностики в ООО «НПФ СТМ-

зо

Ц», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институте аналитического приборостроения (ИАнП) РАН, г. Санкт-Петербург.

10. На базе основных положений данной диссертации проведены исследования, разработаны и производятся следующие виды оборудования:

- амплификаторы ДНК: «Циклотемп-4», «Циклотемп-106» и «Циклотемп-107». Амплификатор ДНК «Циклотем-107» рекомендован Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ к серийному производству и применению в медицинской практике и внесен в Реестр изделий медицинского назначения. Совместное серийное производство амплификаторов ДНК «Циклотемп-107» организовано ОАО «Приборный завод Сигнал» и ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск;

- анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АНК 32 - амплификаторы ДНК для количественного анализа (разработаны в ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург совместно с МГТУ им. Н.Э. Баумана), рекомендованы к серийному производству и применению в медицинской практике и внесены в Реестр изделий медицинского назначения. Серийное производство анализаторов нуклеиновых кислот АНК организовано ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург совместно с ОАО «Приборный завод «Сигнал» и ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск;

- амплификаторы ДНК для проведения ПЦР в биологических микрочипах. Данный тип устройств, впервые создан в России и является одним из первых в мировой практике;

- тепловой блок пневматического малогабаритного мобильного амплифика-тора ДНК. На базе данного устройства в ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург проводится разработка малогабаритного экспресс-анализатора на присутствие биологических агентов непосредственно в зоне предполагаемого воздействия.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах

1. Никитин Ю.Ф., Рыков H.A., Чернышев A.B. Основы расчета нестационарных процессов в теплоэлектрических приводах исполнительных устройств пневматических и вакуумных систем // Труды МВТУ им. Н.Э. Баумана. - М.: Изд-во МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1978. - № 269, вып. 4. - С. 22-23.

2. Никитин Ю.Ф., Терентьев ОД., Чернышев A.B. Моделирование исполнительных устройств систем управления //Известия Вузов. - 1985. - №11. -С. 48-50.

3. Вопросы теории и расчета пневмопривода /М.Н.Кокорев, A.A. Рязанов, A.B. Чернышев; МВТУ им. Н.Э. Баумана. - М., 1984. - 48 с. -Деп. в ЦИНТИхимнефтемаш 06.06.84, № 1120.

4. Чернышев A.B., Белова О.В. Разработка, расчет и проектирование пневмоэлектромеханического и электровакуумного оборудования. Термоста-тирующие устройства. Мет. ук. - М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1997. — 16 с.

5. Чернышев A.B., Белова O.B. Метод решения сопряженной задачи конвективного теплообмена на примере термосТатирующего устройства И Вестник МГТУ. Сер. Машиностроение. - 1998. - № 4. - С. 77-87.

6. Чернышев A.B. Повышение эффективности программируемых термо-статирующих устройств на основе термоэлектрических микроохладителей // Конверсия в машиностроении. — 2002. - № 6. - С. 134-139.

7. Чернышев A.B. Основы теории расчета электропневмомеханического оборудования для анализа ДНК / Научное приборостроение. — 2002. -Том 12, № 1.-С. 53-65.

8. Чернышев A.B., Друца В.Л. Проблемы создания оборудования для медицинской ПЦР диагностики // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2004. - № 12. - С. 18.

9. Белова О.В., Чернышев A.B. Метод математического моделирования тепловых источников в термоэлектрических элементах Пельтье /Научное приборостроение. - 2004. - Том 14, № 1. - С. 51-57.

10. Чернышев A.B., Бакай Д.А. К вопросу исследования однородности теплового поля пластины держателя твердотельного амплификатора ДНК / Научное приборостроение. — 2004. - Том. 14, №4 - С. 10-19.

11. Моделирование теплового состояния микропробирок с образцами в ходе полимеразной цепной реакции / A.B. Чернышев, Д.А. Бакай, В.Е. Курочкин, В.Н. Соколов, Е.Ю. Скоблилов // Научное приборостроение. - 2005. -Том 15, №3. - С. 54-62.

12. Разработка математической модели пневматической системы термостабилизации /А.В.Чернышев, К.Е.Демихов, A.B. Полынков и др. // Научное приборостроение. — 2006. -Том 16, № 1. - С. 53-65.

13. Пат. 43871 РФ, МПК7 С12М 1/34. Программируемый термостат. / A.B. Чернышев, A.B. Полынков (РФ) - № 43871. Заявлено 24.08.2004; Опубл. 10.02.2005 Бюл. №4.-2 с.

14. Чернышев A.B., Белова О.В. Разработка обобщенной структурной и концептуальной модели амплификаторов ДНК / Научное приборостроение. -2006. - Том 16, № 2. - С. 58-65.

15. Моделирование тепловых процессов в ПЦР-смеси амплификатора ДНК /А.В.Чернышев, О.В.Белова, B.JI.Друца, A.A.Крутиков //Технологии живых систем. - 2006. - Том 3, № 3. - С. 3-16.

16. Чернышев A.B. Исследование тегоюфизических процессов в термоблоке амплифактора ДНК / Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. — 2005.-№9, С. 40-46.

Подписано к печати 14.07.06г. Зак. Объем 2,25 пл. тир. 120 Типография МГТУ им. Н.Э. Баумана 105005, Москва, ул. 2-я Бауманская, 5

Перечень условных обозначений.

Введение.

Глава 1. Обзор современного состояния разработки оборудования для

ПЦР-диагностики - амплификаторов ДНК.

1.1. Конструктивные схемы оборудования для ПЦР-диагностики.

1.2. Проблемы разработки оборудования для ПЦР-диагностики.

1.2.1. Обеспечение однородности температурного поля рабочего тела.

1.2.2. Повышение скорости нагрева/охлаждения рабочего тела.

1.2.3. Снижение динамического разброса температуры рабочего тела в процессе стабилизации температуры.

1.2.4. Повышение надежности блока нагрева/охлаждения в циклическом режиме.

1.3. Обзор методов расчета оборудования для ПЦР-диагностики.

1.3.1. Обзор методов расчета термостатирующих устройств.

1.3.2. Обзор методов расчета тепловых источников.

1.3.3. Обзор и выбор метода решения теплового состояния.

1.4. Выводы к главе 1. Постановка цели и задач исследования.

Глава 2. Биотехнические аспекты создания оборудования для ПЦРдиагностики.

2.1. Молекулярно-биологические основы процесса ПЦР.

2.2. Коэффициент «качества» процесса ПЦР.

2.3. Биотехнический подход к анализу процесса ПЦР.

2.4. Моделирование теплового состояния реакционной смеси в ходе ПЦР.

2.4.1. Математическая модель теплового состояния реакционной смеси.

2.4.2. Результаты численного эксперимента.

2.5. Энергетическая оценка влияния химических и физико-химических реакций в ходе ПЦР на тепловое состояние реакционной смеси.

2.6. Выводы к главе 2.

Глава 3. Разработка общей классификации и концептуальной модели расчета оборудования для ПЦР-диагностики.

3.1 Классификация оборудования для ПЦР-диагностики.

3.1.1. Классификация по принципу действия.

3.] .2. Классификация по техническим и эксплуатационным характеристикам.

3.1.3. Анализ классификационных признаков.

3.2. Концептуальная модель расчета оборудования для ПЦРдиагностики.

3.2.1. Обобщенная структурная схема.

3.2.1.1. Структурная схема теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

3.2.1.2. Структурная схема пневматического устройства.

3.2.1.3. Структурная схема комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

3.2.2. Концептуальная модель расчета.

3.3. Выводы к главе 3.

Глава 4. Теория рабочих процессов и разработка методики расчета твердотельных амплификаторов ДНК.

4.1. Математическая модель расчета теплового блока твердотельного амплификатора ДНК.

4.1.1. Основные допущения.

4.1.2. Расчетная область.

4.1.3. Система уравнений.

4.1.4. Граничные и начальные условия.

4.2. Разработка методики расчета твердотельного устройства.

4.2.1. Дискретный аналог уравнения теплопроводности для теплового блока.

4.2.2. Дискретный аналог уравнения Навье-Стокса в каналах радиатора.

4.2.3. Дискретный аналог уравнения энергии в каналах радиатора.

4.2.4. Дискретный аналог уравнения Навье-Стокса в воздушной камере.

4.2.5. Дискретный аналог уравнения неразрывности в воздушной камере.

4.2.6. Дискретный аналог уравнения энергии в воздушной камере.

4.3. Математическая модель расчета преобразователей энергии твердотельных амплификаторов.

4.3.1. Вывод уравнения сохранения энергии для неравновесных процессов в термоэлектрических элементах Пельтье.

4.3.2. Вывод закона сохранения энергии для нестационарных условий.

4.3.3. Обобщенные законы теплопроводности и электропроводности в анизотропной среде.

4.3.4. Вывод закона сохранения энергии для однородной термоэлектрически анизотропной среды для нестационарных условий.

4.3.5. Вывод закона сохранения энергии для однородной термоэлектрически изотропной среды.

4.3.6. Вывод дискретного аналога закона сохранения энергии для однородной термоэлектрически изотропной среды.

4.4. Алгоритм расчета.

4.5. Еыводы к главе 4.

Глава 5. Численные исследования твердотельных амплификаторов ДНК.

5.1. Исследование физических факторов, влияющих на воспроизводимость результатов амплификации ДНК.

5.1.1. Факторы, влияющие на однородность теплового поля рабочего тела

5.1.1.1. Взаимодействие рабочего тела с окружающей средой и элементами конструкции.

5.1.1.2. Неоднородность теплофизических свойств рабочего тела.

5.1.1.3. Неоднородность теплового потока от преобразователя энергии.

5.1.2. Численные исследования однородности теплового поля рабочего тела.

5.1.2.1. Математическая модель.

5.1.2.2. Неоднородность теплофизических свойств рабочего тела.

5.1.2.3. Исследование влияния теплового потока от преобразователя энергии и взаимодействия с окружающей средой на однородность теплового поля рабочего тела.

5.2. Численные исследования процессов в тепловых блоках твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов

Пельтье.

5.2.1. Математическая модель твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.2.1.1. Расчетная область.

5.2.1.2. Система уравнений.

5.2.1.3. Начальные и граничные условия.

5.2.2. Численное исследование 96- луночного теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.2.3. Численное исследование 16- луночного теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.2.4. Численное исследование 32-луночного теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.3. Численные исследования твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.3.1. Математическая модель твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.3.1.1. Расчетная область.

5.3.1.2. Система уравнений математической модели.

5.3.1.3. Начальные и граничные условия.

5.3.2. Численное исследование твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.3.3. Экспериментальные исследование твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.4. Выводы к главе 5.

Глава 6. Разработка методики расчета. Численные и экспериментальные исследования характеристик пневматического амплификатора ДНК.

6.1. Математическая модель пневматического амплификатора ДНК.

6.1.1. Расчетная схема пневматического амплификатора ДНК.

6.1.2. Расчетные зависимости.

6.1.3. Принятые допущения.

6.1.4. Математическая модель расчета переходных процессов.

6.1.5. Метод решения.

6.1.6. Расчетно-теоретические исследования конструктивных и функциональных параметров пневматического амплификатора ДНК.

6.1.6.1. Исходные параметры.

6.1.6.2. Результаты расчета.

6.2. Экспериментальные исследования.

6.2.1. Экспериментальный стенд.

6.2.2. Результаты экспериментальных исследований.

6.3. Выводы к главе 6.

Глава 7. Повышение эффективности и надежности твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

7.1. Повышение ресурса работы амплификатора ДНК в циклическом режиме за счет применения эффективных ТЭМО.

7.2. Повышение ресурса работы амплификатора ДНК в циклическом режиме за счет применения эффективных законов управления и регулирования.

7.2.1. Синтез системы автоматического регулирования амплификатора ДНК.

7.2.2. Экспериментальные исследования системы автоматического регулирования амплификатора ДНК на основе ТЭМО.

7.2.3. Разработка блока нагрева/охлаждения амплификатора ДНК с управляемым усилителем тока.

7.3. Разработка и исследование комбинированной электротермоэлектрической схемы блока нагрева/охлаждения с целью повышения ресурса амплификатора ДНК.

7.3.1. Математическая модель расчета процессов в тепловом блоке комбинированного электро-термоэлектрического амплификатора ДНК.

7.3.2. Численные исследования комбинированного электротермоэлектрического амплификатора ДНК.

7.4. Выводы к главе 7.

Глава 8. Разработка, создание и клинические испытания оборудования для ПЦР-диагностики.

8.1. Разработка и создание твердотельных амплификаторов ДНК.

8.1.1. Разработка и создание твердотельных амплификаторов ДНК на базе термоэлектрических преобразователей энергии.

8.1.2. Разработка и создание тепловых блоков анализаторов нуклеиновых кислот для проведения ПЦР в реальном времени. 327 v

8.1.3. Разработка и создание комбинированного электропневмомеханического амплификатора ДНК для проведения ПЦР в биологических микрочипах.

8.2. Разработка и создание малогабаритного мобильного пневмомеханического амплификатора ДНК. 337 ^

8.3. Клинические испытания.

8.4. Выводы к главе 8.

Актуальность. В настоящее время объектами научных и диагностических исследований медико-биологических лабораторий всего мира все чаще становятся нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК. В ходе исследований ставятся задачи, не только требующие определить наличие исследуемой нуклеиновой кислоты в образце, но и определить ее исходное количество и нуклеотидную последовательность (сиквенс). Наиболее доступным, достоверным и высокочувствительным методом, позволяющим обнаружить ДНК в пробе и оценить ее количество, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Разработка в 1983 году сотрудником фирмы «Cetus», США, Кэри Мюллисом, метода полимеразной цепной реакции является одним из крупнейших методологических открытий в современной молекулярной биологии. За это он в дальнейшем был удостоен Нобелевской премии.

Принцип метода полимеразной цепной реакции широко используется как в научных исследованиях, так и для диагностики в практическом здравоохранении, в системе Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор).

Полимеразная цепная реакция - это циклическая температурозависимая ферментативная реакция, в ходе которой происходит квазиэкспоненциальный рост количества специфического фрагмента исходной двухцепочечной ДНК. В процессе ПЦР накапливается достаточное количество молекул ДНК для достоверной визуальной детекции этого фрагмента. В настоящее время в России основным методом анализа продуктов ПЦР является гель-электрофоретическое разделение ДНК с последующей визуализацией продуктов разделения путем облучения геля на дпине волны 254 нм. Свечение фрагментов ДНК происходит благодаря интеркалирующему агенту - бромистому этидию, добавленному в гель. Флуоресценция молекулы бромистого этидия многократно возрастает в результате его связывания с продуктами ПЦР. Наличие продуктов амплификации (полосы в геле) дает исследователю информацию о присутствии в исходном образце ДНК-мишени, а отсутствие продуктов амплификации говорит об отсутствии в исходном образце ДНК-мишени. На практике, необходимо получить такое количество продукта ПЦР (копий ДНК), которое возможно обнаружить тем или иным доступным методом. Очевидно, чем чувствительнее способ обнаружения, тем раньше в ходе реакции образуется пороговое количество ДНК - то есть количество ДНК, которое можно достоверно обнаружить с использованием какого-либо метода детекции. Цикл, при котором образуется пороговое количество ДНК, называется пороговым. В тоже время, количество циклов реакции, при которых образуется пороговое число ДНК, зависит от исходного количества ДНК в пробе. Следовательно, каждому начальному количеству ДНК соответствует определенное значение порогового цикла реакции, определив которое и используя калибровочную прямую, можно определить исходное количество копий ДНК. Основным условием для реализации данного подхода является необходимость оценки динамики изменения количества продукта непосредственно в ходе реакции. На практике это может быть осуществлено путем измерения сигнала флуоресценции. По динамике изменения сигнала флуоресценции оценивается динамика изменения количества ДНК. Такой процесс называют ПЦР с детекцией сигнала в реальном масштабе времени (real-time PCR), или кинетической ПЦР.

Полимеразная цепная реакция, используемая при анализе ДНК, позволяет сегодня решать такие научно-исследовательские и диагностические задачи, как:

- анализ фрагментов ДНК для диагностики социально значимых заболеваний, таких как гепатиты В и С, туберкулез, СПИД и многих других инфекционных заболеваний, а также онкологических и генетических заболеваний;

- генотипирование (в медицине используется для определения антибиотико-резистентных штаммов (туберкулез), в криминалистике -для идентификации личности, в сельском хозяйстве - при селекции ценных пород животных и сортов растений);

- идентификация генетических мутаций;

- мониторинг экспрессии генов при разработке новых лекарственных средств;

- поиск и изучение новых генов;

- мониторинг экологической безопасности (экологический профиль микроорганизмов);

- определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК;

- молекулярно-биологические исследования;

Важнейшее значение метод получил в свете событий, произошедших 11 сентября 2001 года в США. Теоретическая возможность биологического терроризма перешла в область реальных фактов. По своим губительным для человечества свойствам биологический терроризм сопоставим с ядерным оружием. Однако выявить носителя биологического воздействия практически невозможно. Наиболее эффективным способом снижения поражающего фактора является как можно более скорое обнаружение факта воздействия и принятие дальнейших мер по его локализации и нейтрализации. Применение ПЦР для этих целей является одним из наиболее эффективных и оперативных методов определения факта воздействия. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, воздух, почва и т.д.). В США разрабатываются и выпускаются комплекты мобильного оборудования для проведения ПЦР в полевых условиях.

Наиболее широкое практическое применение метод имеет в медицине, так как выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. Данное свойство метода делает его незаменимым в современных диагностических исследованиях. Метод обладает серией таких преимуществ, как:

- возможность прямого определения наличия возбудителя;

- высокая чувствительность;

- высокая специфичность;

- универсальность процедуры выявления различных возбудителей;

- высокая скорость получения результата анализа;

- возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Суть данных преимуществ заключается в следующем.

Прямое определение наличия возбудителей: многие традиционные методы диагностики, например, иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфичного участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции [1].

Высокая специфичность метода ПНР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя, фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров. Последовательность более 15 нуклеотидов уникальна, и поэтому праймер способен образовывать полностью комплементарную связь только с единственным участком ДНК. Следовательно, если такой участок в исследуемой ДНК есть, то дальнейший ход реакции возможен. Если нет, накопление продукта не происходит. Это практически исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПНРЛ анализа составляет 10. 10 клеток в пробе (чувствительность л г иммунологических и микроскопических тестов-10 .10 клеток).

Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

Высокая скорость получения результата анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированные методы обработки биоматериала, детекции продуктов реакции, автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4,0 . 4,5 часа.

Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике.

Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции.

Масштаб практического использования ПЦР определяется очень большим количеством факторов, таких как разработка и сертификация новых методик; разработка, производство, испытание и сертификация диагностических наборов; создание и производство соответствующего оборудования.

К разработке оборудования для реализации ПЦР приступили практически одновременно с открытием самой реакции. Для успешного протекания полимеразной цепной реакции необходимо устройство, в котором можно обеспечить изменение температуры реакционной смеси по' заданному закону и с определенной степенью точности. Одним из первых серийно выпускаемых приборов данного назначения стал прибор фирмы CETUS - «Perkin Elmer 9600» (USA).

Наиболее распространенное название устройств данного класса -амплификаторы ДНК. За прошедшие годы к разработке и производству амплификаторов ДНК приступили десятки фирм в промышленно развитых странах. Созданы и серийно выпускаются амплификаторы ДНК, обладающие различными техническими характеристиками, отличающиеся принципом действия и предназначенные для работы в различных условиях. Лидерами в производстве данного оборудования являются такие зарубежные фирмы, как Perkin Elmer, Bio Rad, MJ Research (США), Techne (Великобритания),

Eppendorf, Biometra (Германия). Среди отечественных производителей - ЗАО «ДНК Технология, ЗАО «Компания Биоком», ЗАО «Ресурс Прибор», ЗАО «СТМ-Ц», ОАО «Приборостроительный завод Сигнал», Институт аналитического приборостроения РАН. Необходимость создания оборудования для ПЦР-диагностики, отвечающего современным и постоянно меняющимся требованиям, определяется:

- постоянным развитием естественных наук в направлении исследований в области молекулярной биологии и генетических исследований;

- созданием новых методов диагностических исследований в практической медицине;

- проведение молекулярно-генетических исследований при идентификации личности при проведении судебно-медицинских экспертиз;

- проведением следственных действий правоохранительными органами в процессе противодействия биологическому терроризму.

Создание оборудования данного класса способствует развитию отечественного высокотехнологичного производства и направлено на выпуск продукции конкурентоспособной на мировом рынке медицинского и научного оборудования.

По принципу действия амплификаторы ДНК относятся к классу электропневмомеханических устройств, а по назначению - к изделиям медицинского назначения для молекулярно-генетических исследований. Современная практика сложилась таким образом, что допуск к лабораторному применению подобных устройств осуществляется органами контроля Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Практически все типы амплификаторов ДНК, выпускаемых в настоящее время, имеют или существенное ограничение по производительности и ресурсу работы, или низкую точность подержания заданной температуры рабочего поля и низкую скорость изменения температуры. Предложено несколько вариантов конструктивных решений, направленных на повышение эффективности работы устройств. Некоторые фирмы, в том числе «Biometra» (Германия), выпустили устройства, в которых тепловые блоки изготовлены из серебра с позолотой контактных поверхностей. Данное решение позволило несколько повысить эффективность устройства, но привело к значительному удорожанию изделия, и без того недешевого. Средняя стоимость подобных устройств составляет 3,5 . 4,0 тысяч долларов США.

Центральной проблемой при создании оборудования для ПЦР-диагностики является проблема повышения его эффективности. Решить данную задачу возможно на основе математического моделирования и исследования рабочих процессов. На сегодняшний день вопросы теории рабочих процессов и разработки методов расчета оборудования для ПЦР-диагностики мало изучены. Некоторые принципы обобщения определены в работе Н.А. Ярышева и Л.Б. Андреевой [2], в которой проведены анализ и систематизация вариантов исполнения и методов расчета термостатирующих устройств различных типов. Математическая модель разработана на основе закона сохранения энергии при значительном наборе допущений. В работе получено дифференциальное уравнение объекта термостатирования, находящегося во внутреннем объеме термостатирующего устройства. Предложенный метод дает достаточно хорошие результаты, но обладает следующими недостатками: не позволяет рассчитывать тепловые процессы в динамическом режиме; нельзя рассчитать тепловые поля по объему рабочего тела; расчет конкретной задачи требует значительных преобразований и выкладок; количество решаемых на его основе задач ограничено.

Известны попытки решения подобных задач и аналитическими методами. Предложенный B.C. Зарубиным [3] подход имеет те же ограничения. Максимально в направлении создания методики расчета прецизионных устройств нагрева и охлаждения, работающих в динамическом режиме, продвинулась О.В. Белова [4]. Автором разработан метод расчета, сочетающий в себе конечно-элементную и конечноразностную дискретизацию и использующий численные методы решения на несогласованных сетках. Однако в работе предложена модель только одного варианта исполнения устройства нагрева/охлаждения - на термоэлектрических элементах Пельтье. Кроме того, при построении пространственной модели теплового блока автор заменяет расчетные области, в которые входят полупроводниковые материалы и медные спаи, на некий эффективный объем, теплофизические свойства которого представлены в виде эффективных плотности и коэффициента теплопроводности. Предложенный подход был оригинальным шагом на пути построения практически первой пространственной модели расчета тепловых процессов в динамическом режиме. Однако при решении задачи исследования однородности теплового поля метод не позволяет учитывать неоднородность теплового поля самого источника (в данном случае -элемента Пельтье), а мощность источника в общем случае зависит от пространственных координат и времени.

Темпы развития современных методов исследований порождают очень важное требование - значительное сокращение сроков и стоимости разработки устройств. При этом еще на этапе проектирования необходимо обеспечить максимально высокий уровень конструктивного решения и технических характеристик создаваемых устройств. Для решения данной задачи необходимо снабдить разработчика общей концептуальной моделью и методами расчета, которые позволили бы провести расчетно-теоретические исследования вариантов исполнения конструкций, основанных на различных принципах действия. Требуется обобщить накопленный на сегодняшний день опыт создания подобного оборудования и разработать общую классификацию, которая помогла бы обосновано выбрать и оценить вариант конструкции.

Решение задачи усложняется также тем, что амплификаторы ДНК в сочетании с образцами, содержащими биологический материал, а более точно - реакционной смесью, представляют собой биотехническую систему (БТС). Успешная разработка или эффективное совершенствование характеристик данной системы возможны лишь при взаимном учете и согласовании параметров всех ее составляющих. Широко распространенной ошибкой является создание новых и совершенствование имеющихся технических средств без учета особенностей биохимических процессов.

Таким образом, объектом исследований в данной работе является оборудование медицинского назначения для ПЦР-диагностики -амплификаторы ДНК. Предметом исследований, соответственно, являются рабочие процессы, протекающие в данных устройствах, определяющие их технические и эксплуатационные характеристики.

Актуальность темы диссертации, направленной на создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработку оборудования для ПЦР-диагностики, подтверждается тем, что она связана с выполнением работ по Федеральной целевой научно-технической программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002 - 2006 годы.

Научной новизной обладают следующие результаты, полученные в диссертации:

1. Впервые выделены классификационные признаки и предложена общая классификация амплификаторов ДНК: по типу рабочего тела, способу подвода и отвода теплоты, способу преобразования энергии, типу используемых рабочих емкостей для реакционных ПЦР смесей и пр.

2. В результате впервые проведенных исследований теплового взаимодействия реакционной смеси и теплового блока амплификатора ДНК в ходе ПЦР установлено, что одной из основных причин низкой воспрозводимости результатов проведения ПЦР является неоднородность теплового поля рабочего тела в переходных режимах работы амплификаторов ДНК, которая может достигать ± (7.8) К при скорости изменения температуры рабочего тела теплового блока (1. .1,5) К/с. Впервые разработана математическая модель и произведен расчет энергетического воздействия химических и физико-химических реакций при матричном синтезе цепей и плавлении ДНК на тепловое состояние реакционной смеси. Установлено, что теплота, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций (2,0-10'5. 1,0-10"4 Дж), не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

3. Впервые разработана научная основа для описания рабочих процессов в тепловых блоках амплификаторов ДНК. Создана обобщенная структурная схема, определяющая характер взаимодействия компонентов теплового блока.

4. На основе обобщенной структурной схемы построена концептуальная модель расчета процессов тепломассопереноса, которая позволяет формировать единый подход к созданию частных математических моделей амплификаторов ДНК, базирующихся на различных принципах действия. Концептуальная модель состоит из системы нестационарных дифференциальных уравнений энергии, движения и неразрывности вязкой среды в трехмерной постановке, начальных и граничных условий.

5. Впервые разработана модель расчета термоэлектрических преобразователей энергии на основе законов неравновесной термодинамики.

6. На основе концептуальной модели созданы математические модели расчета различных типов твердотельных амплификаторов ДНК. На основе метода контрольного объема созданы методы и алгоритмы расчета, проведены численные исследования тепловых блоков амплификаторов ДНК и определены конструктивные и функциональные параметры, позволившие обеспечить однородность теплового поля рабочего тела на уровне ±(0,08.0,15) К при скорости изменения температуры от 1,5 К/с до 4,6 К/с.

7. На базе обобщенной структурной схемы и основных законов классической равновесной термодинамики для открытых систем впервые созданы математическая модель и алгоритм расчета пневматического амплификатора ДНК.

Практическая ценность и внедрение результатов работы.

1. Разработаны не имеющие аналогов концептуальная модель расчета, обобщенная расчетная схема и методы расчета, которые могут быть использовании при создании новых типов амплификаторов ДНК, основанных на различных принципах действия. Концептуальная модель и методы расчета позволяют существенно (в 5-10 раз) сократить сроки создания данного типа оборудования.

2. Выявлены направления и разработаны способы повышения надежности работы твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов. Предложена новая комбинированная твердотельная электро-термоэлектрическая схема амплификатора ДНК, позволяющая качественно изменить условия работы термоэлектрических элементов. Достигнуто значительное (до 100 раз) увеличение количества рабочих циклов функционирования твердотельных устройств на основе термоэлектрических элементов.

3. Математические модели и методики расчета внедрены в практику проектирования в ЗАО «СТМ-Ц», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург. С использованием созданных методик и программ расчета разработаны и серийно производятся ЗАО «СТМ-С», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург, следующие типы амплификаторов ДНК: «Циклотемп-2», «Циклотемп-4», «Циклотемп-106», «Циклотемп-107», амплификаторы ДНК для количественного анализа ДНК в реальном времени - анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АНК 32.

4. С применением созданных методик и программ расчета впервые разработана и изготовлена партия специализированных амплификаторов ДНК, предназначенных для работы с биологическим микрочипами. Устройство запатентовано в Российской Федерации (Пат. 43871 РФ, МПК7 С12М 1/34) и внедрено в Институте молекулярной биологии РАН, г. Москва, и Институте аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург.

5. С использованием разработанных методик и программ расчета разработан опытный образец малогабаритного мобильного пневмомеханического амплификатора ДНК для работы в полевых условиях. Устройство предназначено для проведения оперативной биологической разведки с целью индикации и идентификации агентов биологического воздействия непосредственно в зоне их обнаружения

6. Амплификатор ДНК «Циклотемп-107» и анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АНК 32 прошли приемочно-технические испытания во ВНИИМТ МЗ РФ и клинические испытания в исследовательских центрах и научно-исследовательских институтах МЗ РФ, МО РФ и РАМН, рекомендованы к применению в медицинской практике, внесены в Государственный Реестр изделий медицинского назначения и серийно производятся.

7. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедр «Биомедицинские технические системы и устройства» и «Вакуумная и компрессорная техника» МГТУ им. Н.Э. Баумана.

Работа содержит восемь глав.

В первой главе представлен обзор современного состояния разработки оборудования для ПЦР-диагностики - амплификаторов ДНК. Рассмотрены конструктивные схемы оборудования, проведен анализ существующих проблем разработки оборудования и методов расчета. Сформулированы цель и задачи исследования.

Во второй главе исследованы биотехнические аспекты создания оборудования для ПЦР-диагностики, введено понятие коэффициента «качества» ПЦР, предложено уточненное описание процесса наработки выбранных фрагментов исходной ДНК при проведении ПЦР, дано обоснование необходимости повышения скорости нагрева/охлаждения реакционной смеси в переходных этапах реализации температурного протокола и точности поддержания температуры на этапах стабилизации. Проведено исследование теплового состояния реакционной смеси в ходе ПЦР. Впервые дана оценка влияния тепловых эффектов, обусловленных ходом ПЦР на исполнение заданного температурного протокола. Установлено, что теплота (2,0-10"5 .1,0-10"4 )Дж, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций при матричном синтезе цепей и плавлении ДНК не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

В третьей главе проведен подробный анализ конструктивных схем оборудования для ПЦР-диагностики, выявлены классификационные признаки и синтезирована обобщенная структурная схема. Разработана концептуальная модель расчета оборудования для ПЦР-диагностики.

Четвертая глава посвящена разработке теории рабочих процессов и созданию на базе концептуальной модели методики расчета твердотельных амплификаторов ДНК. Разработаны расчетная схема, математическая модель и методика расчета твердотельных амплификаторов ДНК. Получено нестационарное уравнение тепловых источников в термоэлектрических элементах.

В пятой главе проведены численные исследования твердотельных тепловых амплификаторов ДНК. Исследованы физические факторы, влияющие на воспроизводимость результатов амплификации ДНК. Проведены численные исследования однородности теплового поля рабочего тела. Проведены численные исследования твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье и твердотельного комбинированного электро-пневматического амлификатора ДНК для проведения ПНР в биочипах.

Шестая глава посвящена созданию теории рабочих процессов и разработке методики расчета пневматических амплификаторов ДНК. Разработаны расчетная схема, математическая модель и методика расчета. Проведены численные и экспериментальные исследования.

Седьмая глава посвящена повышению эффективности и надежности твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье. Выявлены основные направления и разработаны методы повышением эффективности и надежности амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

Восьмая глава посвящена разработке, созданию и клиническим испытаниям амплификаторов ДНК. На основе предложенной в работе общей классификации и обобщенной структурной схемы синтезированы частные структурные схемы семейства твердотельных и пневматических устройств. На их базе и с учетом результатов численных исследований разработаны конструкции и созданы новые амплификаторы ДНК различного назначения. Амплификаторы ДНК «Циклотемп 107», АНК16 и АНК 32 прошли приемочно-технические и клинические испытания, рекомендованы для применения в медицинской практике и внесены в государственный Реестр изделий медицинского назначения.

Основные результаты и выводы

1. Выделены основные классификационные признаки, на которых предложена общая классификация, позволяющая синтезировать новые структурные и конструктивные схемы амплификаторов ДНК.

2. Проведено исследование взаимодействия реакционной смеси и теплового блока амплификаторов ДНК. Показано, что с теплофизической точки зрения для получения максимального выхода ПЦР-продукта следует снижать объем реакционной смеси, интенсифицировать процесс отдачи тепла от рабочей среды к реакционной смеси и адаптировать температурный протокол процесса ПЦР для каждого типа амплификатора ДНК. Установлено, что одной из основных причин пониженной воспроизводимости результатов проведения ПЦР является неоднородность теплового поля рабочего тела в переходных режимах работы амплификаторов ДНК. Впервые произведен расчет энергетического воздействия химических и физико-химических реакций в ходе ПЦР на тепловое состояние реакционной смеси. Установлено, что теплота, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций (2,0-1 О*5 .1,0Т0*4 )Дж не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

3. Разработана теория рабочих процессов, предложена методология расчета и создания оборудования для ПЦР-диагностики, основу которых составил системный подход к исследованию параметров амплификаторов ДНК.

4. Создана обобщенная структурная схема, определяющая характер взаимодействия компонентов теплового блока. На основе обобщенной структурной схемы построена концептуальная модель расчета процессов тепло-массопереноса, которая позволяет формировать единый подход к созданию математических моделей амплификаторов ДНК, базирующихся на различных принципах действия.

5. На базе концептуальной модели расчета создана математическая модель расчета твердотельных амплификаторов ДНК, включающая общую расчетную схему, математическую модель твердотельных амплификаторов ДНК, математическую модель расчета термоэлектрических преобразователей энергии на основе законов неравновесной термодинамики. Разработаны методики и алгоритмы расчета твердотельных амплификаторов ДНК.

6. Проведены комплексные численные исследования влияния конструктивных и функциональных параметров на основные характеристики тепловых блоков амплификаторов ДНК. Проведены численные исследования различных вариантов тепловых блоков твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье и твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК, в результате которых получены общие рекомендации по проектированию тепловых блоков твердотельных амплификаторов ДНК, направленные на повышение скорости нагрева/охлаждения и снижения разброса температуры рабочего тела.

7. На основе обобщенной структурной схемы создана математическая модель пневматического амплификатора ДНК. В основу модели заложены законы классической равновесной термодинамики для открытых систем. Созданы метод и алгоритм численного расчета пневматического амплификатора ДНК. Сопоставление результатов теоретических и экспериментальных исследований температур реакционной смеси и рабочего тела показали, что отклонение результатов расчета относительно данных, полученных опытным путем, не превышает (5. 10) %. Подтверждено, что в пневматических амплификаторах ДНК реально достичь скорости изменения температуры рабочего тела (5. 10) К/с в диапазоне от 298 К до 363 К.

8. Проведены исследования работы амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов, позволяющая в 30 . 40 раз повысить ресурс их работы. Предложена комбинированная электро-термоэлектрическая схема блока нагрева/охлаждения, позволяющая отказаться от циклического режима работы термоэлектрических элементов. Численные исследования на базе созданной математической модели подтвердили работоспособность данной схемы. Амплификаторы ДНК, созданные на основе предложенных решений, находятся более пяти лет в реальной эксплуатации без замены термоэлектрических элементов, что на практике подтверждает решение проблемы повышения надежности и ресурса данных изделий.

9. Основные положения данной диссертации внедрены в практику создания и проектирования оборудования для ПЦР - диагностики в ООО «НПФ СТМ-Ц», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институте аналитического приборостроения (ИАнП) РАН, г. Санкт-Петербург.

10. На базе основных положений данной диссертации проведены исследования, разработаны и производятся следующие виды оборудования:

- амплификаторы ДНК: «Циклотемп-4», «Циклотемп-106» и «Циклотемп-107». Амплификатор ДНК «Циклотем-107» рекомендован Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ к серийному производству и применению в медицинской практике и внесен в Реестр изделий медицинского назначения. Совместное серийное производство амплификаторов ДЖ «Циклотемп-107» организовано ОАО «Приборный завод Сигнал» и ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск;

- анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АЖ32 - амплификаторы ДНК для количественного анализа (разработаны в ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург совместно с МГТУ им. Н.Э. Баумана), рекомендованы к серийному производству и применению в медицинской практике и внесены в Реестр изделий медицинского назначения. Серийное производство анализаторов нуклеиновых кислот АЖ организовано ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург совместно с ОАО «Приборный завод «Сигнал» и ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск;

- амплификаторы ДНК для проведения ПЦР в биологических микрочипах. Данный тип устройств, впервые создан в России и является одним из первых в мировой практике;

- тепловой блок пневматического малогабаритного мобильного амплификатора ДНК. На базе данного устройства в ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург проводится разработка малогабаритного экспресс-анализатора на присутствие биологических агентов непосредственно в зоне предполагаемого воздействия.

1. Molecular Diagnostics / Edited by George P. Patrinos, Wilhelm Ansorge. -Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo: Elsevier Academic Press, 2005. -461 p.

2. Ярышев H.A., Андреева Л.Б. Тепловой расчет термостатов. JL: Энерго-атомиздат, 1984. - 176 с.

3. Зарубин B.C. Температурные поля в конструкции летательных аппаратов. М.: Машиностроение, 1978. - 155 с.

4. Белова О.В. Разработка метода расчета и исследование прецизионных устройств нагрева и охлаждения. Дисс. . канд. техн. наук (05.04.06). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2000. -104 с.

5. Пат. 5656493 (США), МКИ5 С12М 3/02. System for automated performance of the polymerase chain reaction / Kary B. Mullis, Larry Johnson, Richard A. Leath etc. (США); The Perkin-Elmer Corporation (США). № 199505. Заявлено 18.03.94. Опубл. 12.08.97.

6. Пат. 5795547 (США). МКИ6 B01L 9/00. Thermal Cycler / Rolf Mozer, Lukas Birrer (Швейцария); Roche Diagnostic Systems. Inc. (США). № 735943. Заявлено 23.10.96. Опубл. 18.09.98.

7. Пат. 5229580 (США), МКИ5 Н01В 3/02. Block for holding multiple sample tubes for automatic temperature control / Michael J. Chioniere (США); Automated Biosystems, Inc. (США). № 895943. Заявлено 09.06.92. Опубл. 20.07.93.

8. Patent 5616301 (США), МКИ6 ВО 1L 9/00. Thermal Cycler / Rolf Mozer, Lukas Birrer (Швейцария); Hoffman La Roche Inc. (США). № 301932. Заявлено0709.94. Опубл. 01.04.97.

9. Пат. 6015534 (США), МКИ7 B01L 3/00. PCR Sample Tube / John Girdner Afwood (США); The Perkin-Elmer Corporation (США). № 08/422740. Заявлено1404.95. Опубл. 18.01.2000.

10. Пат. 5942432 (США), МКИ5 С12М 3/00. Apparatus for fluid impingement thermal cycler / Douglas H. Smith, John Shigeura, Timothy M. Woudenberg (США); The Perkin-Elmer Corporation (США). № 08/946512. Заявлено 07.10.97. Опубл. 24.09.99.

11. Пат. 5187084 (США), МКИ5 С12Р 19/34. Automatic air temperature cycler and method of use in polymerase chain reaction / G. Anders Hallsby (США); The Dow Chemical Company (США). № 542384. Заявлено 22.06.90. Опубл. 16.02.93.

12. Пат. 5455175 (США), МКИ5 С12М 1/34. Rapid thermal cycling device / Carl T. Wittwer, David R. Hillyrd, Kirk M. Ririe (США); University of Utah Research Foundation (США). № 179969. Заявлено 10.01.94. Опубл. 03.10.95.

13. Пат. 5123477 (США), МКИ5 F25D 29/00. Thermal reactor for biotechno-logical processes / Jonathan M. Tyler (Канада); Unisys Corporation (Канада). № 346412. Заявлено 02.05.89. Опубл. 23.08.92.

14. Пат. 4028891 (Германия), МКИ5 В 01 L 7/00. Vorrichtung zur Behandlung von Proben mit vorgegebenen Temperatur-Zeit-Profilen /Gebr. Leibisch, 4800 Bielefeld (Германия). №4028891.9-52; Заявлено 12.09.90; Опубл. 03.09.92.

15. Пат. 6054263 (США), МКИ7 С12М 3/00. Thermal cycler including a temperature gradient block / John Lewis Danssaert, Robert James Shopes, Daniel Davis Shoemaker (США); Stratagene (США). № 09/115175; Заявлено 14.07.98; Опубл. 25.08.2000.

16. Пат. 6197572 (США), МКИ7 С12М 1/40. Thermal Cycler Having Automatically Positionable Lid /Rolf Schnecheli (Швейцария); Roche Diagnostic Corporation (Швейцария). № 09/302713; Заявлено 30.04.99; Опубл. 06.03.2001.

17. Пат. 347478 (США), МКПО D24/216. Laboratory instrument for handling biomolecular samples / Arthur J. Pinkney (Великобритания); Hybaid Ltd. (Великобритания). № 874576; Заявлено 27.04.92; Опубл. 31.05.94.

18. Пат. 5601141 (США), МКИ 6 F24D 29/00. High Throughput Thermal Cycler / Steven J. Gordon, Anthony J. Christopher (США); Intelligent Automation Systems, Inc. (США). № 959775; Заявлено 13.10.92; Опубл. 11.02.97.

19. Беляев H.M., Рядно A.A. Методы нестационарной теплопроводности: Учебное пособие для ВУЗОВ. М.: Высшая школа, 1978. - 328 с.

20. Тепло- и массообмен. Технический эксперимент: Справочник /Е.В. Аметистов, В.А. Григорьев, Б.Т. Емцов и др.; Под общ. ред. В.А. Григорьева, В.М. Зорина. М.: Энергоиздат, 1982. - 512 с.

21. Физические величины: Справочник / А.П. Бичев, Н.А. Бабушкина, A.M. Братковский и др.; Под ред. И.С. Григорьева, Е.З. Михайлова. М.; Энергоатомиздат, 1991. - 1232 с.

22. Принципы анализа и синтеза биотехнических систем: Учеб. Пособие / В.И. Лощилов, С.И.Щукин, В.И.Иванов; Под ред. В.И. Лощилова. М.: МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1988. - 64 с.

23. А.с. 166933 (СССР). Способ термостатирования и устройство для его осуществления / Зорин И.В. // Кл.17с, 3/08. Б.И.- 1964.- №24.

24. А.с. 219258 (СССР). Устройство для термостатирования холодных спаев пермопар / Зорин И.В. //Кл.42с, 12/01. «Изобретения. Промышленные образцы. Товарные знаки».- 1968.- №18.

25. Muller Н. Der Einfluss pulsierenden Ggleichstroms auf das Betreib-sverhalten thermoelektrisher Kuhlgerate. 1967. - B. 41. - №3. - S. 236-240 (РЖЭЭ, 1967, 7nl3).

26. Stoesker W.F., Chaddock I.B. Trancient performance of a thermoelectric refrigerator under step-currant control // ASHRAE Journal. 1963. - V. 5. - № 9. H. 61-67. (РЖЭЭ, 1964,4п24; РЖХ. 1964. 4.47.317).

27. Мартыновский B.C., Наер В.А. Исследование полупроводниковых вариантов тепловых потоков // Теплоэнергетика. 1962. -№ 6. - С. 68-71.

28. Мартыновский B.C., Семенюк В.А., Томашевич М.Н. Оптимизация конструкции термоэлектрических охлаждающих батарей // Холодильная техника. 1970.-№ 2. - С. 31-35.

29. Иорданишвили Е.К., Малкович Б.Е.-Ш. О возможности управления температурой холодного спая термоэлемента // Вопр. радиоэлектрон. Сер. ТРТО.- 1971.-№2.-С. 74-81.

30. Никитин Ю.Ф., Рыков Н.А., Чернышев А.В. Основы расчета нестационарных процессов в теплоэлектрических приводах исполнительных устройств пневматических и вакуумных систем // Труды МВТУ им. Н.Э. Баумана. 1978. - № 269, Вып.4. - С. 22-23.

31. Никитин Ю.Ф., Рыков Н.А., Чернышев А.В. Исполнительные устройства одноразового действия: Учебное пособие М.: МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1978.-31 с.

32. Теплотехнический справочник / Под общ. ред. В.Н. Юренева, П.Д. Лебедева. Т.1. - М.: Энергия, 1975. - 744 е., Т.2. - М.: Энергия, 1976. — 896 с.

33. Исаченко В.П., Осипова В.А., Сукомел А.С. Теплопередача. М.: Энергия, 1981.-416 с.

34. Теплотехника / Под общ. ред. А.П. Баскакова. М.: Энергоиздат, 1982. -261 с.

35. Зорин И.В., Зорина З.Я. Термоэлектрические холодильники и генераторы. Л.: Энергия, 1973. - 136 с.

36. Тайц Д.А., Карпов В.Г. Расчет термоэлектрических охлаждающих термостатов со статическим регулятором температуры // Холодильная техника. 1967.-№6. -С. 31-33.

37. Тайц Д.А. Разработка и исследование тепловых схем термоэлектрических охлаждающих термостатов: Дисс. . канд. техн. наук. Одесса, Одесский технологический институт пищевой и холодильной промышленности, 1968.- 143 с.

38. Иоффе А.Ф. Полупроводниковые термоэлементы. М., JL: Изд-во АН СССР, 1956.- 188 с.

39. Термоэлектрическое охлаждение / А.Ф. Иоффе, JT.C. Стильбанс, Е.К. Иорданишвили и др. М., Л.: Изд-во АН СССР, 1956. - 108 с.

40. Анатычук Л.И., Семенюк В.А. Оптимальное управление свойствами термоэлектрических материалов и приборов. Черновцы: Изд-во «ПРУТ», 1992.-264 с.

41. Котырло Г.К., Лобунец Ю.Н. Расчет и конструирование термоэлектрических генераторов и тепловых насосов: Справочник. Киев: Наукова думка, 1980.-327 с.

42. Анатычук Л.И. Термоэлементы и термоэлектрические устройства: Справочник. Киев: Наукова думка, 1979. - 740 с.

43. Бурштейн А.И. Физические основы расчета полупроводниковых термоэлектрических устройств. М.: Физматгиз, 1962. - 135 с.

44. Каганов М.А., Привин М.Р. Термоэлектрические тепловые насосы. Л.: Энергия, 1970.- 150 с.

45. Термоэлектрические охладители / Э.М. Лукишер, А.Л. Вайнер, М.Н. Сомкин и др. М.: Радио и связь, 1983. - 176 с.

46. Иорданишвили Е.К., Бабин В.П. Нестационарные процессы в термоэлектрических и термомагнитных системах преобразования энергии. М.: Наука, 1983.-320 с.

47. Ингберман М.И., Фромберг Э.М., Грабой Л.П. Термостатирование в технике связи. М.: Связь, 1979. - 144 с.

48. Каганов М.А., Ривкин А.С. Воспроизведение заданного временного хода температуры с помощью полупроводниковых элементов //ИФЖ. 1973. -Вып. 24, №5. - С. 902-907.

49. Гроот С. де, Мазур П. Неравновесная термодинамика. М.: Мир, 1964.- 456 с.

50. Осипов Э.В. Твердотельная криогеника. Киев: Наукова думка, 1977. -236 с.

51. Кошляков Н.С., Глинер Э.Б., Смирнов М.М. Основные дифференциальные уравнения математической физики. М.: Физматгиз, 1962. - 767 с.

52. Лыков А.В. Некоторые аналитические методы решения задач нестационарной теплопроводности / Изв. АН СССР, Энергетика и транспорт. -1969.-№2.

53. Тихонов А.Н. Об остывании тел при лучеиспускании, следующем закону Стефана-Больцмана / Изв. АН СССР. География и геофизика. 1937. -№3.-С. 461-479.

54. Видин Ю.В., Иванов В.В. Температурное поле в неограниченной пластине, нагреваемой радиацией и конвекцией одновременно / Изв. МВО СССР. Авиационная техника. 1965. - №4. - С. 56-64.

55. Иванов В.В. Исследование нестационарной теплопроводности в условиях аэродинамического нагрева //Вопросы теории тепло- и массообмена: Сб. научных трудов / Минск, 1970. С. 231 -244.

56. Коздоба Л.А., Чумаков В.Л. Решение нелинейных задач нестационарной теплопроводности / Теплофизика высоких температур. 1970. - Т. VII, №5.-С. 276-287.

57. Федоткин И.М., Айзен A.M. Асимтотические методы в задачах тепло-массопереноса. Киев: Виша школа, 1975. - 198 с.

58. Pafalski P., Zyszkowski W. Lagrangian approach to the поп-linear boundary heat transfer problem // AIAA Journal. 1968. -V. 6. - № 8. - P. 1143-1162.

59. Vujanovic В., Djukic Dj. On one variational principle of Hamilton's type for non-linear heat transfer problem // International J. Heat and Mass transfer. 1972.- V.15.-№5.-C. 1111-1123.

60. Патанкар С. В. Численные методы решения задач теплообмена и динамики жидкости. М.: Энергоатомиздат, 1984. - 152 с.

61. Годунов С.К., Рябенький B.C. Разностные схемы (введение в теорию): Учебное пособие. М.: Наука, Главная редакция физико-математической литературы, 1977. - 439 с.

62. Скибин А.П. Вариант конечно-элементного метода контрольного объема для решения задач тепломассообмена. Дисс. . канд. техн. наук (05.14.05). - М.: Моск. гос. техн. ун-т им. Н.Э. Баумана, 1993. - 222 с.

63. Калиткин Н.Н. Численные методы. М.: Наука, Главная редакция физико-математической литературы, 1978. - 512 с.

64. Ши Д. Численные методы в задачах теплообмена: Пер. с англ. / Под ред. В.И. Полежаева. М.: Мир, 1988. - 250 с.

65. Скибин А.П., Червяков В.В., Югов В.П. Метод конечных элементов, основанный на интегрировании по контрольному объему, для двумерных нестационарных эллиптических задач //Известия АН. Энергетика. -1995. №1. -С. 142-151.

66. Зенкевич О. К. Метод конечных элементов в технике: Пер. с англ. / Под ред. Б.Е. Победри. М.: Мир, 1975. - 541 с.

67. Норри Д., де Фриз Ж. Введение в метод конечных элементов: Пер. с англ. / Под ред. Г.И. Марчука М.: Мир, 1981. - 304 с.

68. Самарский А.А. Введение в численные методы. М.: Наука, 1987. -459 с.

69. Чернышев А.В., Белова О.В. Разработка, расчет и проектирование пневмоэлектромеханического и электровакуумного оборудования. Термоста-тирующие устройства: Мет. ук. М.: Изд-во МГТУ, 1997. - 16 с.

70. Чернышев А.В., Белова О.В. Метод решения сопряженной задачи конвективного теплообмена на примере термостатирующего устройства //Вестник МГТУ им. Н.Э. Баумана. Серия Машиностроение. 1998. - №4. -С. 77-87.

71. Чернышев А.В. Основы теории расчета электропневмомеханического оборудования для анализа ДНК // Научное приборостроение. 2002. - Том 12, № 1.-С. 53-65.

72. Baliga B.R., Patankar S.V. A new finite element formulation for convection-diffusion problems // Numerical Heat Transfer. 1980. - V.3. - P. 393-409.

73. Червяков B.B. Исследование теплофизических свойств углерод-углеродных композиционных материалов в условиях высоких температур; Дисс. . канд. техн. наук (01.04.14). М.: МГТУ им. Н.Э.Баумана, 1993. -102 с.

74. Кавтарадзе Р.З. Локальный теплообмен в камерах сгорания дизелей; Дисс. . докт. техн. наук (05.04.02). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1991. — 361 с.

75. Элементы систем автоматизированного проектирования ДВС. Алгоритмы прикладных программ / Под общ. ред. P.M. Петриченко. Л.: Машиностроение, 1990. - 328 с.

76. Флетчер К. Численные методы на основе метода Галеркина: Пер. с англ. Л.В. Соколовский / Под ред. В.П. Шидловского. М.: Мир, 1988. -352 с.

77. Сегерлинд Л. Применение метода конечных элементов: Пер. с англ. А.А. Шестакова / Под ред. Б.Е. Победри. М.: Мир, 1979. - 392 с.

78. Prakash С., Patankar S.V. A Control-Volume Finite-Element Method for Predicting Flow and Heat Transfer in Ducts of Arbitrary Cross Sections. Part I: Discription of the Method //Numerical Heat Transfer. 1987. - Vol. 12. -P. 389-412.

79. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain-reaction / K. Mullis, F. Faloona, S. Schart etc. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986.-V. 51.-P. 263.

80. Mullis K., Faloona F. Specific syntesis of DNA in vitro by polymerase catalysed chain-reaction // Meth. Enzymol. 1987. - № 155. - P. 335-350.

81. Кэри Б. Мюллис. Необычная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция // В мире науки. 1990. - №6. - С. 26-34.

82. Fitch J. Patrick. An engineering introduction to biotechnology / by J. Patrick Fitch p. cm. // Published by SPIE The International Society for Optical Engineering. Tutorial texts in optical engineering. - 2002. - V. 5 -№ 5.-127 p.

83. PCR technology // by Ehrlich H.A., ed. N.Y.: Stokton Press, 1989. -240 p.

84. ДНК-типирование в судебной медицине / Ю.В. Кухарьков, Г.Ф. Пучков, С.Р. Боровко, Н.А. Миклевич //Мн.: 00 «БелАКК», 2003. -93 с.

85. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология. 1991. - Том 25. - Вып. 4. - С. 926-936.

86. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Пособие для студентов биологических факультетов. М.: МЦНМО, 2002. -248 с.

87. Чернышев А.В., Друца B.JI. Проблемы создания оборудования для медицинской ПЦР-диагностики // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.-2004.-№12. С. 18.

88. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. -М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

89. Чернышев А.В., Бакай Д.А. К вопросу исследования однородности теплового поля пластины-держателя твердотельного амплификатора ДНК / Научное приборостроение. 2004. - Том. 14, №4 - С. 10-19.

90. Лойцянский Л.Г. Механика жидкости и газа: Учеб. для вузов. М.: Дрофа, 2003.-840 с.

91. Кюрджиев Ю.В. Моделирование рабочих процессов, разработка и модернизация пневматических систем и агрегатов с учетом образования конденсата рабочего тела; Дисс. . канд. техн. наук (05.04.06). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2004. - 163 с.

92. Моделирование теплового состояния микропробирок с образцами в ходе полимеразной цепной реакции / А.В. Чернышев, Д.А. Бакай, В.Е. Курочкин, В.Н. Соколов, Е.Ю. Скоблилов // Научное приборостроение. 2005. -Том 15, №3. - С. 54-62.

93. Патанкар С. В. Численное решение задач теплопроводности и конвективного теплообмена при течении в каналах: Пер. с англ. Е.В. Калабина. -М.: Издательство МЭИ, 2003. 312 с.

94. Nucleic acids in chemistry and biology / Edited by G. Michael Blackburg, Michael J. Gait. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press, 1996. -378 p.

95. Rosing J., Slater E.C. The value of for hydrolysis of ATP / Biohim. Biofis. Acta. 1972. -V. 267. - P. 275-290.

96. Справочник биохимика / P. Досон, Д. Элиот, У.Элиот, К. Джонс: Пер. с англ. B.J1. Друца, О.Н. Королева-М.: Мир, 1991.-544 с.110. http://www.biochem.roche.com/lightcycler/.111. http://www.corbetresearch.com/.

97. Зысина-Моложен Jl. М., Зысин J1.B., Поляк М.П. Теплообмен в турбо-машинах. Л.: Машиностроение, 1974. - 336 с.

98. Абрамович Г.Н. Прикладная газовая динамика. М.: Наука, 1976. -888 с.

99. Хейвуд Р.У. Термодинамика равновесных процессов. Руководство для инженеров и научных работников: Пер. с англ. М.: Мир, 1983. - 304 с.

100. Петухов Б.С., Генин Л.Г., Ковалев С.А. Теплообмен в ядерных энергетических установках. М.: Энергоатомиздат, 1986. - 472 с.

101. Кочубей А.А., Рядно А.А. Численное моделирование процессов конвективного переноса на основе метода конечных элементов. Днепропетровск: Издательство ДГУ, 1991. - 223 с.

102. Макаров Д.В. Численное моделирование течения и теплообмена в системе компланарных каналов; Дисс. . канд. техн. наук (05.07.05). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1995. - 115 с.

103. Белова О.В., Чернышев А.В. Метод решения сопряженной задачи конвективного теплообмена на примере термостатирующего устройства // Вестник МГТУ. Сер. Машиностроение. 1998. - № 4. - С. 77-87.

104. Коленко Е.А. Термоэлектрические охлаждающие приборы. M.-JL: Изд-во АН СССР, 1963.- 190 с.

105. Пехович А.И., Жидких В.М. Расчеты теплового режима твердых тел. -Л.: Энергия, 1976.-352 с.

106. Кит Г.С., Побережный О.В. Нестационарные процессы в телах с дефектами типа трещин. Киев: Наукова думка, 1992.-216 с.

107. Дульнев Г.Н., Заричняк Ю.П. Теплопроводность смесей и композиционных материалов: Справочная книга. Л.: Энергия, 1974. - 264 с.126. http://polikor/net/podi/htm/.127. http://www.kyocera.coM.jp/.

108. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод / Ю.П. Лысов, В. Флорентьев, А. Хорлин,

109. К. Храпко, В. Шик, А.Д. Мирзабеков //Докл. Акад. Наук СССР. 1988. -303.-С. 1508-1511.

110. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by co-polymerization / V. Vasiliskov, E. Timofeev, S. Surzhikov, A. Drobyshev, V. Shick, A. Mirzabekov // BioTechnique. 1999. - V. 27. - P. 592-606.

111. MAGlChip: Properties and applications in genomic studies / A. Mirzabekov, A. Kolchinsky // Genomic Technologies: Present and Future / Eds. D. J. Galas & S. J. McCormack. Norfolk: Horizon Scientific Press. - 2002. - Vol. 1, Ch 6. -P. 163-196.

112. Automated Polymerase Chain Reaction In Capillary Tubes With Hot Air /С.Т. Wittwer et al. //Nucleic Acids research. 1989. - V. 17. - №11 -P. 804-809.

113. Hoeskstra M.F. Use of a gas chromatograph oven for DNA amplification by the polymerase chain reaction //Biotechniques. 1988. - №6. - V. 10. -P. 932-936.

114. Heat Transfer Characteristics for Jet Array Impingement with initial Cross-flow / Florschuetz. L.W. et al. //Journal of Heat Transfer. 1984. - 106. -P. 34-41.

115. Hamadah T.T. Air jet impingement cooling of an array of simulated electronics packages / Heat Transfer in electronics. 1989. -№ 111. - P. 97-105.

116. Никитин Ю.Ф., Терентьев О.Д., Чернышев A.B. Моделирование исполнительных устройств систем управления //Известия Вузов. 1985. -№11. -С. 48-50.

117. Кокорев М.Н. Вопросы теории и расчета пневмопривода / М.Н. Кокорев, А.А. Рязанов, А.В. Чернышев; МВТУ им. Н.Э. Баумана. М., 1984. - 48 с. - Деп. в ЦИНТИхимнефтемаш 06.06.84, № 1120.

118. Мамонтов, М.А. Тепломеханика тела переменной массы основа теории пневмогазоприводов / М.А. Мамонтов // Пневматические приводы и системы управления: Сб. науч. тр. - М.: Наука, 1971. - С. 8-18.

119. МанькоП.С. Исследование, создание и оптимизация быстродействующего электропневматического клапана; Дисс. . канд. техн. наук (05.04.06). -М.: МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1987. 145 с.

120. Попов Д.Н. Механика гидро- и пневмоприводов: Учебн. для вузов. -М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2002. 320 с.

121. Роуч П. Вычислительная гидродинамика: Пер. с англ. В.А. Гущина, В.Я. Митницкого / Под ред. П.И. Чушкина. М.: Мир, 1980. - 612 с.

122. Беляев Н.М. Расчет пневмогидравлических систем ракет. М.: Машиностроение, 1983.-219 с.

123. Бэр Г.Д. Техническая термодинамика. Теоретические основы и технические приложения: Пер. с англ. М.: Мир, 1977. - 518 с.

124. Техническая термодинамика: Учебник для вузов /Под ред. В.И. Крутова.-М.: Высшая школа, 1981.-439 с.

125. Техническая термодинамика: Учебник для вузов /В.А.Кирилин,

126. B.В. Сычев, А.Е. Шейндлин. М.: Энергоатомиздат, 1983. -416 с.

127. Глаголев К.В., Морозов А.Н. Физическая термодинамика: Учеб. пособие. М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2004. - 272 с.

128. Разработка математической модели пневматической системы термостабилизации / А.В. Чернышев, К.Е. Демихов, А.В. Полынков и др. //Научное приборостроение.-2006. Том 16. -№ 1. - С. 53-65.

129. Пневмогидравлические системы. Расчет и проектирование: Учебн. пос. для технических вузов / Н.М. Беляев, Е.И. Уваров, Ю.М. Степанчук; Под ред. Н.М. Беляева. М.: Высш. шк., 1988. - 271 с.

130. Вукалович М.П., Новиков И.И. Термодинамика. М.: Машиностроение, 1972.-670 с.

131. Герц Е.В., Крейнин Г.В. Расчет пневмоприводов: Справочное пособие. М.: Машиностроение, 1975. - 272 с.

132. Лыков А.В. Тепломассообмен: Справочник. М.: Энергия, 1978. -480 с.

133. Романенко Н.Т. Агрегаты пневматических систем летательных аппаратов. М.: Машиностроение, 1976. - 98 с.158. http://www.ferrotec-america.com/.

134. Пат. 2234765 (Россия), МКИ7 H01L 35/32. Термоэлектрический модуль /В.А. Желязняков (Россия). №2234765. Заявлено 22.10.2003; Опубл. 08.08.2006. Бюл. №4.-2 с.

135. Пат. 2117362 (Россия), МКИ6 H01L 35/28. Термоэлектрический охлаждающий модуль /В.Т. Каменский (Россия) -№2117362. Заявлено 12.03.1998; Опубл. 08.10.1998. Бюл. №4.-2 с.

136. Пат. 10289 (Россия), МКИ6 H01L 35/28. Термоэлектрический охлаждающий модуль / В.Т.Каменский (Россия) № 10289. Заявлено 16.12.1998; Опубл. 08.10.1998. Бюл. №4.-2 с.162. http://www.sctbnord.com/

137. Чернышев А.В, Повышение эффективности программируемых термостатирующих устройств на основе термоэлектрических микроохладителей // Конверсия в машиностроении. 2002. - № 6. - С. 134-139.

138. Чернышев А.В. Разработка и исследование электропневмовакуумного лабораторного и диагностического оборудования // Научно-техническая конференция «165 лет МГТУ им. Н.Э. Баумана»: Тезисы докладов. М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1995. - С. 108.

139. Чернышев А.В., Прокофьев А.В. Комплекс лабораторного оборудования для ПЦР анализа // Биотехнология: Каталог Международной выставки; раздел Российские технологии (Ганновер: 18-21 октября) -М.: Министерство науки РФ, 1997.- 132 с.

140. Приборы для секвенирования и анализа ДНК. Отчет о НИОКР (за-ключ.) / МГТУ; Руководитель Чернышев А.В. Гос. контракт 6/1; № ГР 01.200.117184; Инв. № 02200108561.- М., 2000. - 271 с.

141. Пат. 3616264 (США), МКИ6 С12К 1/10. Temperature-controlled discrete sample analyzer / Robert A. Ray, Jams C. Sternberg (США); Beckman instruments, Inc. (США). № 837697. Заявлено 30.06.69.

142. Пат. 43871 (Россия), МКИ С12М 1/34. Программируемый термостат. /А.В.Чернышев, А.В. Полынков (Россия) №43871. Заявлено 24.08.2004; Опубл. 10.02.2005. Бюл. №4.-2 с.

143. Reducing the Threat of Biological Weapons //Science and technology review. http://www.llnl.gov/str/.

144. Uncovering Bioterrorism //Science and technology review http://www.llnl.gov/str/.

145. Rapid field detection of biological agents // Science and technology review -http ://w w w. llnl .gov/str/.

146. Пат. 6699713 (США), МКИ7 C12M 1/34. Polymerase chain reaction system / William L Benett, James B. Richards, Paul L. Stratton et. al. (США); The Regents of the University of California (США). № 09/752794. Заявлено 29.12.2000. Опубл. 02.03.2004.

147. Чернышев А.В. Общая концепция создания электропнемо-механического оборудования для проведения полимеразной цепной реакции

148. Производство амплификаторов ДНК «Циклотемп-107» передано на приборный завод «Сигнал» г. Обнинск, Калужской области и в ЗАО «Ресурс Прибор». :

149. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

150. РЕГИСТРАЦИОННОЕ УДОСТОВЕРЕНИЕ29/07030601/2868-02 от16 января 20Чода

151. Действительно до26 июня 20У года1. Класс: 2а1. ШШВДВШСКОЕ ИЗДЕЛИЕ

152. Термостат-амплификатор высокоскоростной прецизионный программируемый "Циклотемп-107"нормативный документ ТУ 9452-006-05969415-2001 "Термостат-амплификатор высокоскоростной прецизионный программируемый "Циклотемп-107"организация-разработчик

153. ООО "НПФ СТМ-Ц", Москва ОКПО 05969415предприятие-производитель

154. ООО "НПФ СТМ-Ц", Москва ОКПО 05969415

155. ЗАРЕГИСТРИРОВАНО В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В ГОСУДАРСТВЕННЫЙ РЕЕСТР МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

156. Государственная регистрация^дредусматривает периодический контроль производства в целях обеспечения кач^^^Г-эЭ^^^ности, безопасности медицинских изделий,

157. Заместитель Министра VWBlAJf А. В. Катлинскийподпись, печать) (И.О. Фамилия)1. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

158. Акадёши наук, ^ашсг-Пет^б^г^ ОКЙО 04699534дй техники

159. Руководитель Федеральной служб по надзору в сфере адравоохранещ и социального развития 5шш

160. ОКПО 10856015 ОКЮД 33 204, ОКОГУ 49001 ОКАТО 24915000000, ОКФС 42, ОКОПФ 47

161. УТВЕРЖДАЮ: Главный инженер ПЗ«СИГН1. На№1. АКТо внедрении результатов докторской диссертации Чернышева А.В. « Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦР- диагностики»

162. Все перечисленное оборудование рекомендовано Министерством здравоохранения и социального развития РФ к применению в медицинскойщРшяАш щшт efirasBb, г Шдаж ШШ1

163. УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор1. АКТо внедрении результатов докторской диссертации Чернышева А.В.

164. ЗАО «Ресурс Прибор» в своей производственной деятельности использует ряд результатов, полученных А.В. Чернышевым в докторской диссертации «Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦРдиагностики :

165. Организовано производство тепловых блоков анализатора нуклеиновых кислот АНК-16 и АНК32. Данная продукция выпускается по заказу Института аналитического приборостроения РАН;