автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.05, диссертация на тему:Синтез полиеновых альдегидов-аналогов ретиналя

г и й

. 7 НОЙ №

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ нм.М.И.ЛОМОНОСОВЛ

Специализированный Совет Д 063.41.01

На правах рукописи

КИРИЛЛОВА ЮЛИЯ ГЕННАДЬЕВНА

СИНТЕЗ ПОЛИЕНОВЫХ АЛЬДЕГИДОВ -- АНАЛОГОВ РЕТИНАЛЯ

Специальность 05.17.05

Технология продуктов тонкого органического синтеза

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Москва - 1993

Работа выполнена в Московской Государственной Академик Тощ,' Химической Техно \огпи ич.М В.Ломоносоьа

Научные руководители: кандидат химических наук,

доцент П.И.Мицнер, доктор химических наук, профессор В.И.Швец

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кандидат химических ьоук

Л.А Яновская И-А.Голубкина

Ведущая с-рганизация: НПО "Цитамины"

Защита состоится

ШЗг. в

час. н

заседании специализированного совета Д 063 41.01 при Москокско Го с у да р г т 1> с) 111 о й Акадеши: Тешкой Химической Технологи! им.М.В.Ломоносова.

(117571 Moci-.ua, пр. Вернадского. 06) а аул

С диссертацией можно ознакомиться в Ояб/потеке МИТХТ им.М.В.Ломоносова (119331 Москва, М.Пироговская, д. 1).

Автореферат разослан " "__:_1993г.

Ученый секретарь

Специализированного совета, к.х.и. А И.Лютик

I • Г

Эбщая характеристика работы'

Чктуальност^. проблемы определяется важными биологическими cnoAi. гплми >етнноидов (нроиаводных витамина А и его сгереоизомгрои), которые фоявляются при их вгьимодействии с клеточными :i ядернимл рециптор; ми и ipu (формировании хромофорных цешроз природных ретинилиденпротгндои (иявлению требований, которые предъявляет белковач матрица к молеку \яриой трукгуре ретиноидои, в значительной мере способствует сравнительный анализ оведення природных молекул и их синтетических аналогов, для которых сключаются определенные конфигурационные .¡/»ли канформициошше ереходы. В связи с. этим актуальным представляется разработка новых пусеи •гатеза аналогов ретккоидов, у котгрых в случае сохранения длины полиеновой еии конфигурация определенной — С = С — связи остается фиксированной в роцгссе взаимодействия с белком к при tro функционировании, [астоящая работа является частью плановых научно - исследовательских работ, доводимых на кафедре биотехнологии Московской Государственно;"! акоде> ни энкой химической технологии им.М.В.Ломоносова по разработке методов штеза ретнноидов, их стереонзомеров и аналогов.

ельк? настоящего исследования является разработка методов синтеза аналог<>п гтиналя, характеризующихся наличием в их молекуле неспособной к цис мностью—транс—изомеризации двойной связи и использовании полученных »единений для изучения хромофорное центра бактернородопсина (BP)" . зотаетствующую конфигурацию двойной связи фиксировали введением я данное положение полиеновой цепи циклических фрагментов различного эмера.

>учная новизна работы. Предложены и реализованы методы синтеза способных к изомеризации аналогов 13 — цис— и полностью—щмне--тиналя, содержащих моноеновый цикл различного размера а полиеновой пи. Результаты тестирования синтезированных соединений в реакции генерации с БО и сравнение свойств полученных при этом искусственных тентов с соответствующими модельными альдимишми и натияным БР эволяют представить структуру места связывания хромофора в БР в районе О'" С15'—атомов полиеновой цепи ретинилиденовой группы, ¡аттическая пенн'>ста работы. Ряд синтезированных соединений нередан дад иготовления фотохромных материалов на~ основе БР (Институт биофизики »тки, РАН, г.Пущино), а также для изучения- влияния ретиноидоз на процесс {зференцировки культуры клеток проштлоцггмрной лейкемии человека HL— (Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинннкое«;..

руководства работой принимал участии кандидат химических Наук Ходонов да. (десь и далее приняты следующие сокращения: БР ~ бактериоредопсин, КО — териоопешг, IDA — днчзоиропиламид лития, (lib.il — диизобутилалю>;оп1\рил Р — тетрагадрофураь. К/, — круговой дихроизм.

¡'ЛИ. г.Москва). Разработачкыэ новые оригина чьние подходы могут быть применены 11 синтезе новых аналогов ретпноидов и каротинондов. ! ta защиту выносятся следующие положения:

1. Общий метод синтеза неспособных к изомеризации аналогов ретиналя, ( М'ржащнх мононенасыщенное кольцо и полиеловой цепи и имеющих закрепленную 13 —цне —конфигурацию.

2. Способ синтеза нсизомеризукнчихс.я относительно определенной — С = С — связи аналогов ретиналя. содержащих моносноиый цикл и полненовон цепи и имеющих полностью—транс—конфигурацию, олефнпнропанием по Хорнер/.

3. Результаты тестировании синтезированных аналогов ретиналя в реакции ресинтеза с БО и компьютерное моделирование места связывания хромофорного центра Б1\

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на 2ой, Международной конференции но биохимии клеточных мембран (г. Бари, Италия, 1993 г.) и научном семинаре и лаборатории проф. И.Люггенбурга (Gorlaeus лаборатория Лейденского университета, г.Лейден, Нидерланды). Ilo материалам диссертации оп>б\нкованы 2 статьи.

Обч.ем и структура работы. Диссертация состоит из »ведения и трех глав. Первая глава представляет обзор литературы. Вторая глава содержит изложение основных результатов собственных исследований. В третьей главе приведено описание проведенных экспериментов. Диссертация изложена на ... страницах машинописного текста, содержит ... таблиц, .. рисунков. Список литературы включает ... наименований.

Результат . работы и их обсуждение Идеология синтеза неизомерпзующихся ретпноидов базируется на двух основных вариантах: -а) введение цикла путем конденсации полненового н циклического синтонов с получением требуемого скелета; б) конденсации полненового и ациклического фрагментов с последующей достройкой цикла или внутримолекулярной циклизацией. Выбор того или иного подхода определяется: а) положением цикла в полиеноьой цени с заданной опфнгурацией н/нли конформацией; б) доступностью исходных синтонов; и), предварительной разработкой стадий конденсации и трансформации линейных синтонов в цикл г) однотипностью химических стадий, В настоящем исследовании били использованы оба подхода, которые позволили ввести в полиеновую цепь цикли различного размера.

Привлечение ряда близких по структуре полие«алей связано со следующим соображением, основанным на аналиче литературных данных: a priori можце било предположить, что белковая матрица накладывает достаточно жесткие спрические требования на объем хромофора. Поэтому направленное изменен««-объема З11.местителя позволило бы сделать вывод о характере взаимодействуя остатков аминокислот полвпептидной цепи БР с хромофорной группой в районе СЮ —С15 атомов.

1. Огитсз нспзоморазугогцихся аналогов 13-цис~рст1г«аля. лш-гез аналоги» 13—цис —реткнгля (!-б) с фиксированной конфигурацией олленовой цепи был осуществлен

(1) х—(гнг)3. (2> Х"-;сн,)х-

(3) X-tCH.ij.

(4) ХМСН2)„-

(5) X=-CXj-CHJ-CH-

¿н,

(О) х=-скг-сн-сн,-

(j-c)

ю Схеме I. Основная стратегия синтеза заключалась в конденсации ;:;ст:о".е:гоаого спитом C1G с соответствующей циклической системой, fa ccuoza проведенных ранее исследований (С.З.Еремшi и др.. 1037 г.) «сходным £ раг>гонтом CU', аозволгнсщнм универсально прнсседнгшть цилшческую :::стему любого объема, б>лл выбран 9 — {2—вротшнч) — Р — иоиол (7). который голучали нз р — ноноаа по известному истоду {J.luyfenbur.c/ и др., 19S0 г.). В ичостве циклических ссставляквдчх была использоаани ¡5 — кетоахдеталн (0 — ;3), волукдоше из соотаетстзуювдвс циклических кетоиов п две стадии но описанной ранее схеме (С.М.Макин и др., 1979 г.). Последияя включает пгрезрищснпс циклических кетоиов з соответствующие триметклсилиловьге зфири я формилирог.анис их в а—положение триэтилортоформплтом п. присутствии ¡кислоты Льюиса.

Ключсвгд стадия синтеза яекзомерцзуюхцкхся аналогов 13 —цис—рстаиаля (t-С) (Схема 1) заключалась в конденсации реактива Иоцнча, приготовленного из ацетилспоасго карбинола (7) к зтилмапшйбро.чида в эфире, с циклическими ¡5 — кетоацеталям;! (3 — 13),' которая приводила к диолипам (24 — 19). Полученные после их. аосегаяоплсняя LiAlH- в THF при 65 —70°С zipanc—диолы (20-25) затем подвергали дегадратадни с одновременным удалением ацетальпой защиты при нагревай::;! з ацетоне в присутствии хсаталхгпгчссклх'количестз НВг, получая целевые альлетадц (1—6).

МзЕг MgBr +

(7>

ОГ<Л

СЖСС!)

(8-13)

Схека 1

Л,

сн;оа)

(14-19) |

(20-25) j '

бС^Чо (i-fi)

<0,14, 20, 1) :'.= {СН2)3-<0,t5,21, 2) X=-(CH2)4-(10, 16, 22. 3) Х"-(СН2)5-(11,17, 23, 4) Х=>-(СН2)е-(12, 1П, 24, 3) Х=-СН2-СН2 ÇH-

"Ч

(13, 13, 25, 6) Х=-СН2-СН-СН2-

СН,

3

Выделение и очистку промежуточных а деталей днолов (14 — 25) осушесгв колоночной хроматографией, а их структуру подтверждал и дитимн ИК УФ— спектров.

Отработка отдельных стадий превращений и хроматографнческнй контрол их протеканием были осуществлены при получении полиеналей (1—4). этом, как и следовало ожидать, выходы промежуточных ацеталей диолов (1420 — 23) били близки (см. Таблицу 1).

Условии выделения целевых аналогов 13 — цис—ретнналя (1—4) также ка побочных соответствующих 9 — цис— изомеров, имеющих большие врем удерживания были отработаны с использованием метода полупреп<1ратик ВЭ/КХ. Соотношение 9 — транс— /9 — цис— изомеров было одинаковым для г аналогов и составляло 4:1 (см. Рис. 1 а-г).

Гозработашхый синтетический подход позволил нам тлкже осуществить сип мотнлциклепентеноиых (5, «) аналогов 13 —цис—ретиналя. И этом слу ацетиленовый спирт С16 (7) вводили в конденсацию по Иоцпчу со смесью кетоацеталеп (12, 13). Эта смесь была получена из рацемического 3 — метил — циклоненгавона (26) (Схема 2).

Схем

О 05!{СНзЬ ОЗЧСКзЬ О О

р ~р - р-~"р

(20) <27) (23) <12) (13)

При этом, при енлилировашш (20) образовывалась смесь тримегиленлилоп еноловых эфкрон (1:1) (27, 211), которая, в свою очередь на следующей счад! при обработке тризтилортоформнатом, приводила к смеси (5 — кетоацеталеп (: 13), причем последние'не удалось разделить фракционной перегонкой, и дал по Схеме 1 была получена смесь альдегидов (5, 6).

Таблица

Сравнительная таблица выходов при- получении аналогов 13— цчс — ретмиаля (1 6) по стадиям (см. Схему 1) и общий выход целевых альдегидов в расчете на

исходит"! синтои — ацетиленовый карбинол С16 (7).

Конденсация по ! Иоцичу Восстановление ил1Н4 ...... Дегидратация НВг в ацетоне Суммарный выход целевог альдегида' (1 — на (7), %

N Выход % N Выход % N Выход %

(И) 35 (20) 55 (1) 80 ¡5.4

(15) 33 (21) 56 (2) 75 13.8

1 (Н>) 36 (22) 69 ■ !3) 1 70 ¡7.4

! (»'/) 29 (23) 5? ! (41 65 10.7

¡18) +(19) 30 (24)+ (25) 5.5 1 (5) +(6) 75 ¡2.4

'Смесь 9 —транс— к 9—цис —изомеров.

^шшдуалыше полиенали (5, 6) также, как и соответствующие 9 — цис— меры били получены ВЭЖХ в режиме рецикла в системе растворителей ip/гексая 1:9, которую использовали для выделения всех целевых соединений б) этого ряда (см. Рис. 1 д).

уктура пеизомеризующяхея аналогов 13 — час—ретнналя (1—6) была гперждеиа методами.^Н—, ЯМР— и масс— спектроскопии.

А

I Рис. 1. Профиль элюирования реакционной массы

а) альдегида (1) из даола (20), б) альдегида (2) из диада (21), в) альдегида (3) из диола (22), г) альдегида (4) из диола (23), д) смеси альдегидов (5) н (6) из смеси диолоа (24) и (25) дептдрацией НВг в ацетоне. / — 9—траке—, И — 9 —цис—изомер.

Таким образом, предложенная схема получечия фиксированных аналогов 13—цце—репшоидов отличается универсальностью, малостадашостью, доступностью исходных реагентов,

удоалепюрительными суммарными выходами (см. Таблицу 1)

1*

/

"1 ie

h fa

'1

П 1 г

V

п - «л

!. Синтез меизомерозующцхся аналогов полностью—трапе-ретнналя." !в нами был осуществлен синтез неиэомеризующихся относительно ¡делехшой —С»«С—связи полиеновой цепи аналогов полиосвшо—транс— пиля (29-34).

^Х^Чл^/^Лу^о

(29) - (31) .(33)

{Х(иху^о ^^чА^^^о

(30) (32) (34)

»аной методологический подход в синтезе аналогов (20-34) а отличие от анкой выше схемы состоял в том, что включение цикла в полиеловую цепь > осуществлено внутримолекулярной конденсацией ациклического мента. В качестве синтона для введения циклопентенового кольца в еновую цепь был выбран 2—диэтнлфосфорил—нитрил адипинозой кислоты а цихлогехсевового — 2—дяэтилфосфорил—шприл пимелиновой кислоты (36).

ешная часть работы была выполнена в лаборатории профессора итенбурга, Gorlaeys лаборатория, Лейденский университет, г.ЛеОден, рланды.

Получение HOA-.ieim.vefi со встроенным в иолненсвую цепь мононенасыщешшс кольцом состава С5 илц С6 осущестнляли согласно Схеме 3.

Оно представляет собой олефиннровапие по Хорнеру карбонилыюг. предшественника (р —1'онона или альдещда С'З) юнерирозаипым 1п 51/1 фосфопатом (35 или 31). восстановление (¡¡Ьа1 и внутримолекулярную а и .дольную конденсацию. Фосфонагнын реагент (35 или Зй) легко получали и соответствующих дшштрилов — нитрила одпгшночой кислоты (37) п нитрил никелиновой кислоты (3!>) ¡Схема ■!). При взаимодействии с двум эквизалетами 1ЛЗ-\ пронходит оСриюва ¡ше днанпона адипонптркла (37; Последний. реагируя с 1 эквивалентом дизтилхлорфосфата по реакцш нуклеофильпого замещении образует фосфонат. Получепний фосфона немедленно депротоп;!р)ето? действием аннона нитрила, образуя, в сво! очередь, анион 2-дттплфосфорпл "-¿дипоинтрнла (35). В ходе тон >л последовательности реакции был получен анион 2 —диэтилфосфорил-пчмелонитрнла (30) из пимелоннтрилд (30).

Синтез аналога (29) был осуществлен согласно Схеме 5 из р — попон (39).Последний добавляли к раствору аниона фосфоиата (35). При этом, результате олефинировання по Хорнеру, был получен 2 —р-ионилнден-одпгонптрнл (-10) в виде изомерной смеси. Индивидуальный 92—изомер 6ч выделен колоночной хроматографией и далэе подвергнут восстаноллешго сЬЬа! последующей обработкой реакционной смеси суспензией сплнкагеля, воды ледяной уксусной кислоты. При этом, внутримолекулярная альдольна конденсация: приводила к альдегиду (41).

Схема ;

сПЬа! СМ 8Юг НгО

I

V1

°> 211* к/уу^о

Схем;)

Л.

даощока

Р5)

0~Р10Щ

((3Щ

Б.

2ШЛ ^ ^ ^ ^ |:(Ег0)гг(0)С1 «у^^сы

0-Р(0Е1)2

0-Р(0Е\)

а

• бс^г

»и» ____ „ (СН2)П ч-|

Схема 5

(39)

(40) П=1 __ (46) 1»«2

СМ

эг-

(41) п=1 2 "

I (47) п»2 СН3

О

ОС ЦсН2)„

(42) п=1 .

(48) а-2 I

(49) П=2 ф 1(44)

бсЛ^Г

(45) п»1 |

(50) п=2 I --

(29) п=1 '

(30) п-2

-СМ/ МаН

СС^СГ

с11Ьа1 5Ю2 НгО

(51) п=1

(52) п=2

X—Ч^ч^

кЛч Цсн2)п

(31) п-1

(32) п*2

Для получения 10,12 —фиксированного аналога полностью—транс — ретн паля (29) алвдегидная группа сиитона (41) была прейращбна в соответствующий метилкетон (43) двухступенчатой процедурой. Во-первых, по известному методу (ЯДСогеу и др., 1968 г.), альдегид (41) бь>л обработан цианистым калием, диоксидом марганца и уксусной кислотой в метаноле с образованием соответствующего метилового эфира (42). Для прямого превращения сложного эфира (42) в метилкетон (43) нами был успешно применен недавно разработанный метод {М.Р.Соокс Зг„ »986 г.), заключающийся в обработке сложного эфира метиллитием в присутствии избытка триметилхлорсилана цри — 100°С. Основной особенностью этой реакции является то, что первичный аддукт, образованный поело , добавления одного эквивалента метиллития эффективно стабилизирован избытком тримэтялхлорсилана (Схема 6).

Схема 6

СН31| П'ЧЖ' (СНз)з5!С1

ОвКСНзЬ СН3

Н+/Н20

нэс

Получающийся при этом снлокснкеталь является устойчивым при это температуре, и не и ступает в реакцию со иторым эквивалентом лнтн органического соединения. Только после кислотной обработки комплек распадается, и получается требуемый метилкетон. Таким образом, добавлени метнллития к раствору эфира (42) и пяти звнвалентов триметилхлорсилана '1 iü' и р и охлаждении (~100°С) с последующей кислотцой обработке; < успензиеЛ силпкагеля и пуды приводило к метилкетону (43). Дальнейший синтез аналога ретиналя (29) заключался в наращиванин п< Хориеру лизтоксифосфорнлацетоннтрнлом (44) кетона (43). Данный npnef является стандартным в химии полиеновых соединений. При иоследуто1це> восстановлении dibal продукта реакции — нитрила (45) был получен апало полностью—транс — ретиналя (29), нонзомеризующннея относительш С(11) =*С(12) двойной связи и содержащий цикл состава С5.

Наращивание цепи на два атома углерода может быть, в принципе осуществлено с использованием конденсации по Хориеру с фосфоилтом генерированным in situ из ацотонитрила, причем выход реакции не зависит от использованного способа олефинирования по Хориеру (см. Таблицу 2) Полиенолв (30) был синтезирован аналогично но Схеме 5 через стадии соединений (40 — 50).

Описанная выше схема общего способа получения 10,12 —фиксированных аналоге» полпостъю-трсшс- ретиналя позволяет также легко синтезировать 13 —дез.четнльнме аналоги (31, 32) исходя из альдегиде» (40, 40) соответственно, (см. Схему 5).

Выделение аналогов ретиналя (29 — 32) из изомерной смеси и очистку всех промежуточных соедекеинй осуществляли колоночной хроматографией. Данная стратегия была использована нами для получения неизомеризующнхея относительно С(13) = С(М) двойной связи С(13)~ деэчетнльных ¿налогов полностью—транс — репшаля ¡33, 34), содержащих, соответственно, цнклопентеновый и цнклогексеновый цикл в полиеиовон цепи {Схема 7) исходь из альдегида С15 (53).

Схема

<35)

(54) (33)

Последний вводили в кондечеацию по Хорнеру с требуемым фосфонатом (За или 36), продукты реакции выделяли колоночной хроматографией с разделением £ - и Т. — изомеров. Восстановление полученных Е — изомеров производны^ дшштрилор (54, 55) <Ш>а1 и их последующую циклизацию проводили р

....алных выше условиях. Выделение аналогов (33, 34) осуществляли хлоночной хроматографией.

Таблица 2

Выходы в реакциях олефиннроваиия различными фосфоиатами по Хорнеру

Фосфонат Метод Карбонильный Выход Соотношение

получения компонент продукта, % E/Z-изомеров

О-ГЦОЕЩ цС-Чх-ч^СН in siiu из (37) (3») 75 4:1

35)

(53) 90 1:1

>-Р(ОЕЧ, .с-^^см. ; in situ из (30) (39) 35 4:1

50)

(S3) : 30' 1:1

О j (ЕЮ)3Р + (40) 00 4<1.

(ЕЮ)аР^СМ C1CH2CN

44)

(49) 75 4:1

• in situ нэ (43) 75 4:1

ацетенитрила

чми выявлены следующие особенности олефшшрованни по Хорнеру: В случае конденсации р — ионона (39), при одинаковом соотношении 9- Е/ч--изомеров (4:1) наблюдали значительное снижение выхода продукта реакции зависимости от используемого фосфоната. Так, в случае фосфоната (35) выход ставил. 75%. тогда как в случае фосфоната (36). только 35% (см. Таблицу 2).

В Случае альдегида С15 (53) в отличие от кетона (39) наблюдали иное отношение изомеров (1:1), что может быть обусловлено стерическимп 1КТорами. При этом вновь было зафиксировано значительное снижение )хода продукта реакции. Так, в случае фосфоната (36)' выход (90%) был в три за выше, чем в случае фосфоната (36) (30%) (см. Таблицу 2).

В случае наращнпатшя полпеновой цепи на два атома углерода три пользовании фосфоната (44) (Схема 5) или пpit использовании фосфоната, ■лученного in siiu из ацетонитрила выход п соотношение 137; — /13Z-изомероа щественно не отличаются (см. Таблицу 2). '

ким образом, разработанный новый способ введения моноенового кольца в диеновую цепь позволил получить шесть новых аналогов полностью—троне — тиийля (29 — 34) по единой стратегии, включающей послодонателик'си. двух ионных реакций — олефиннроваиия по Хорнеру генерированным in situ

фосфоиатом. полученным из дшгитрила, и восстановления dibal продуктов конденсации с последующей внутримолекулярной альдольнон конденсацией.

3. Подтверждение структуры целевых соединений спектральными методами.

Структура целевых неизомериэующихеи аналогов 13 — цис—ретнналя (1—0) н лпостью—трапе — ретнналя (29 — 34) была подтверждена данными Ul — , ^с—ЯМР— и УФ —спектроскопии, а также масс—спектрометрией.

Масс — спектромет рнч.

Нами была применена техника масс —спектрометрии высокого разрешения для подтверждения структуры новых аналогов ретнналя (1 — 6) и (20 — 34). Полученные экспериментальные величии молекулярных ионов, в пределах экспериментальной ошибки, соответствуют расчетным для соответствующих соедиений.

1H — ЯМР — спектроскопия.

Все вновь синтезированные аналоги ретнналя (1—0, 20 — 34). были охарактеризованы данными 'Н —ЯМР —спектроскопии и в каждом случаи спектр находился в полном соответствии со структурой соединения. В Таблице 3 приведены значения химических сдвигов полненален 11 — 6) и (29 — 34), также как и известные из литературы данные для полностью—транс — ретииаля (50), 13— цис — ретииаля (57), а также 13—дезметил— полностью-транс — ретииаля (58).

Нумерация атомов углерода в молекулах ретиноидов приведена согласно правилам 1UPAC для этого класса соединений. Нумерация дополнительных атомов углерода встроенных в полиеновую цепь, мононенасыщенных цнкло). приведена на последней странице автореферата.

tSÇ — ЯМР — спектроскопия.

50 MHz 13С — ЯМР - спектры были зарегистрированы для аналогов 13—цис— ретнналя (1—С) и 100 MHz 13С —ЯМР —спектры — для аналогов полностью— транс— ретииаля (29 — 34). При атом во всех спектрах был обнаружен единственный сигнал, отвечающий карбонильной гр-,:пе, а также точно соответствующий структуре набор сигналов для каждого полиеналя в областях sp2 и sp^

Спектроскопия в УФ— и видимой области.

Для всех целевых альдегидов (1 — 6) и (29 — 34) были зарегистрированы УФ— спектры (Таблица 4, см. ниже). Полу- енные дачные максимумов поглощения позволяют сделать вывод о хорошем соответствии полученных модифицированных полиеновых структур природным ретиноидам — полностыо-транс—ретяналю (56) и 13— цис — ретинзлю (57) (см. Таблицу 4).

Таблица 3

Значения химических сдвигов (б, м.д.) сигналов протонов аналогов ретиналя (1—6, 29 — 34), помюстью-транс—ретиналя (56), 13— цис — ретиналя (57) я _полностью—транс — 13—дезметил — ретиналя (511). _

то мл Соединение

1 3 4 5 в 29 30 31 32 33 34 56 57 58

о 1.46 (.45 1.45 1.46 1.46 1.4В 1 49 1.49 1.49 1.49 1.49 1.49 1.49 1.49 1.49

3 1.01 1.61 1-61 1.61 1.53 1.58 1.63 1.63 1.63 1 63 1.03 1.63 1.153 1.63 1.03

4 2.04 2.02 2.03 2 02 2.04 2.04 2.01 2.04 201 2.04 2.01 2.04 2.04 2.04 2.04

7 б.ЭЗ 0.23 6.29 6.30 6.30 631 6.24 6.35 в 2 в 6 39 ь.зо 6. .44 6.34 6.35 (5.38

5 6.15 6.19 6.17 6.14 0.14 6.14 0.39 6.64 6,39 0 65 6.20 6Л1 6.1 в 6.18 6 17

0 6.20 в.оа 6.20 6.20 6.18 6.1В _ - - 6 и 6.36 6.19 6.23 6.1«

1 6.80 6,92 6.83 6.94 в.87 8.86 7.09 7.30 6 01- 7.07 6.76 6.71 7.14 7.05 7,07

2 7.13 7.26 7.15 7.17 7.09 7.09 - - _ - _ - 6.17 7.28 В 46

3 7.40 7.22 7.07 6.3« - - 7.21 1

4 5.97 6.14 609 6.16 - _ 5.97 5.85 (>.)£

5 1022 1038 ¡ало 1030 1017 К117 1013 1017 9.61 3.59 981 9.47 Ю11 103) 9.57 |

17 1.03 1 02 1.02 1.02 1.02 1.02 1.02 1.05 I 05 1.05 1.05 1.04 ! 04 1.(11 1.04 1

3 1.71 1.72 1.72 1.71 1.70 1.70 1 70 1.75 1.76 1.75 1.73 1.УЗ 1.72 1.72 1.72

) 2.00 1.99 2 03 200 1.98 1.90 2 02 2.05 2.00 2.05 1.99 2.03 2 03 2.02 2.03

) 2.83 2.51 2 59 2.70 2.77 2.35 2.40 2 40 _ - - - 2.33 2.14

2.67 2.51 2.53 2.52 2.06 2.90 2.69 2.34 2.69 2.31 2.74 2.35 - -

1.92 1.61 1.55 1.50 3.17 2.35 2.78 1.79 2.80 1.80 2.74 1.76 -

_ 1 в» 1.55 1.50 - ~ - 2,51 - 2.53 - 2.55 - -

_ — 1.55 1.50 - - - . _ - - ■ _ - -

- — _ 1.50 - ' _ - - • - _ - - -

— - _ 1.11 - - - - - _ -

- - 1.07 - - - - - - - - -

4. Взаимодействие аналогов ретиналя с н~бутпламппом 1мнпъ" ретиналя, его стереоизомеров и многочисленных аналогов с л — шмтгом являются традиционными соединениями для моделирования »действия этих полиенплчй с г — аминогруппой лизина в хромофорных >ах природных рстинилиденпротеидов. Поэтому приготовление указанных минов и исследование их физико-химических свойств представляет гадимый этап работы, предшествующий изучению продуктов юдействия синтезированных аналогов ретиналя с апобелками, п частности.

гение альдимпнов синтезированных нами аналогов ретнналя с к — амином осуществлялось в присутствии молекулярных сит ЗЛ? митаноло, н

атмосфере аргона. В этих условиях реакция протекала с коллчествеК«\ . выходом, а выделение целевых соединений проводилось путем удаления избыт*, амина я вакууме. Далее мы исследовали спектральные свойства синтезированных альдимино» как в форме оснований, так и сопряженных кислот (Таблица 1). , *

5. Взаимодействие неизомсризующихся аналогов ротиналя с БО. Все синтезированные нами аналоги ретиналя были тестированы далее в реакции рекомбинации с БО. Последний получали после светозависимого гидроксиламинолизи БР в составе пурпурных мембран Halobucterium tiaiobium. Образующийся при этом1 ретииальоксим удаляли из апомембрак экстракцией насыщенным раствором 0 — цнклодекстрина. При инкубации апомембран с 13-цис- или полностью—троне — ретицалем практически мгновенно образуется нековалентный комплекс, который постепенно превращается в исходный БР (?.макс БР: форма, адаптированная к темноте 558 им, к свету — 568 им; пигмент, сдержащий индивидуальный 13—цис—хромофор — 548 нм). ¿i Jligi'^mpTOW'g нензаи<?рщщшшхся,.»3,-. реотлздя.ц-вк БО,

При инкубации опомембран с циклопентеновым аналогом (1) за 30 мин наблюдали полный его переход в нековалентный комплекс (Хмакс ^20 им) с последующим превращением в пигмент Хмакс 548 им. Полное завершение регенерации при 20°С — около трех сугок (Рис. 2 а). Поведение циклсгексенопого аналога' (2) было принципиально иным (Рис. 2 б). Его взаимодействие с БО как при 20°С, так и при 40°С Приводило к образованию желтого комплеса с тонкой структурой электронного спектра (Хтах 370, 395, 415 нм), без последующего батохромного сдвига. Полученный сдвиг полосы был интерпретирован нами как образование нековалентного комплекса на основании анализа КД-спектров продуктов взаимодействия альдегидов (1) и (2). с БО и результатов экспериментов по вытеснению аналога (2) из комплексе с БО При этом форма КД—спектра продукта взаимодействия полиеналя (2) и нековалентного комплекса аналога (1) были близки. *

Из структурных особенностей синтезированных нами метилциклопентеновых . аналогов следует, что соединение (0) имеет метальный заместитель в месте наибольшего различия циклоиентекоиого и циклогексенового аналогов, тогда как аналог (5)—в положении, где их объемы весьма близки. В связи с этим a priori мы предполагали: если встраивание в БО лимитировано только объемом циклического заместителя, то реакция аналога (0) с БО ие должна приводить к образованию пигмента, в то время как поведение аналога (S) может быть сходном со встраиванием в апомембраны альдегида (1). i - 1 *

Проведенная нами в течение 2 недель при 5°С рекомбинация с апомембранами аналогов (5) и (6) показала, что поведение полиеналя (5) повторяет картину регенерации циклопентенрвого аналога (1): происходит образование пигмента с Хмцкс 548 нм. При этом процесс образования нековалентного комплекса был замедлен в 3 раза по сравнению с аналогом (1), а значения максимумов

V

12. . - •■ V ' It

поглощения совпадали для обоих пигментов. Взаимодействие же альдегида (0) < •БО заканчивалось на стадии образования нековалентиого комплекса, что полностью соответствует поведению циклогексенового аналога (2) (см. Рис.2 п, г).

Рис. 2. Уф■•-< иектры взаимодействия альдетдов: а) (1), б) (2|, а) (5), г) ¡6) с GO. Запись проводим: 1 — через 1 мин; 2 — через 6 мин; 3 — через 4 час; 4 -через 24 часа.

Кроне того, нами было показано, что пигмент, образованный пиклопентеновцм аналогом (1) способен к фотонндуцированиому гидролизу. Так, освещение згого препарата в течение 4-х часов приводило к сдвигу полосы поглощения с 548 ни до 420 им, с последующим возвращением к исходной величине в темноте (см. Рис. 3). Для доказательства вопроса, вызывает ли действие света на пигмент фотонндуцироваиный гидролиз альдимина и образование нековалентною комплекса аналога (1) с БО, мы проводили эксперименты по вызеснспию полностью—транс — ретиналем цнклопентенового аналога (1) из всех .вышеперечисленных форм (пигмента, иековалентного комплекса, пигмента после 4-х часового действия света) (Рис. 4). Как видно из Рис. 4, добавление даже избытка ретиналя не приводит к вытеснению аналога (J) из его пурпурного комплекса. Добавление полностью—транс — ретишчля к нековалентному комплексу аналога (1) приводи? к постепенному вытеснении? ретиналем аналога (1) из комплекса, причем образование БР существенно замедленно, что указывает на способность полкекаля (1) ингибпровать реснитез БР. Принципиально' иная ситуация возникает после действия света, ¡вызывающего переход пурпурного комплекса аналога |1) в желтый Прибавление ретиналя к последнему (Рис. 4) приводит к кинетической кривой, представляющей собой суперпозицию кривых, характеризующих

я

взаимодействие ретиналя с нековалентным комплексом • (участок А) ковалентиым комплексом (участок Б), образованными цнклонснтенов аналогом (1)

Рис. 3. УФ—спектры действия света ковалентный комплекс аналога (1). 1 исходный спектр пигмента, 2 — спек после 5-ти часового - освещен пигмента. ' \ ',

1'нс. 4. Кинетические . кривые взаимодействии полностью— транс— ретина 1я с различными мембранными препаратами, сформированными на основе цнклопаитенового аналога (1) (1, ,2. ,3), а такжо исходными лцомембранами (4). I1 — пигмент <. Хмакс 548 - им; 2 — иековалентный комплекс с Хмакс 420 нм; 3 —. препарат, полученный после освещения

пигмента в течение 4-х часов; 4 05 * ' , 10 - 15

— контроль: взаимодействие полностью—транс —ретиналя с апомембранами. Л

— поглощения суспензии через 0,5 мин после добавления ретиналя; ДА =» At -Ас, где А{ — ;логло*цение суспензии в момент, указанный на оси абсцисс.

Полученные данные позволяют сделать следующие выводы: 1) Циклоиентеиовы аналог (1) в темноте образует прочную алхдиминную связь с аминофуппой i практически не вытесняется'ретиналем или вытесняется очень медленно. 2) npi действии света на этот аналог образуется иековалентный комплекс. Взаимодействие с БО альдегидов (3, 4) не приводило к каким либо спектралыш> сдвигам, то есть связывания этих соединений с апомембранами не происходит. 5.2 Взаимодействие нендомеризующихсх поиюстъю-транс - аналогов /,..... . ■ ретиналя 129 — 341 с BQ, • ' . . ■

БО реагировал при Комнатной температуре с избытком полиеналя (29) с . образованием в течение нескольких секунд аналога БР с Хмакс 624 нм. Поднос превращение в аналог |5Р завершается за 30 минут. Полученный аналог EF проявляет спето — темновую адаптацию. . При выдерживании последнего 'в темноте в течение нескольких дней Хмакс изменяется до 608 им: Полное возвращение к . светоадаптированной форме (Хмакс, 624) происходит при освещении видимым све1ом в течение нескольких минут.

Избыток альдегида (31) реагировал при комнатной . температуре с БО с образованием соответствующего аналога БР с Хмакс 603 нм. Модная конверсия

"П

| Гс*>

03

о

со

8

о м

а

У

а

со

р

и

к) о

а.

От

Й

4 I

I £

Й

I I

I

Соединение

Амдпгад

Оспсза.чис

Сопряженная кислота

Некогалеитиьш комплекс

Хромопротеид

Наличие фотоцикла

Транспорт поо^оиов

Беисозый

сдбиг, см

-1

II

I я

Й р

т I

Ш С

О 5

п а о о

а

я о

й и

з 8

1 -о

и ¡3

а

к ь

° Й

в " о

а< и

9 я

Б> ^

Л >

р 8

*

а

о

5

2 5

а Е,

немедленно приводило к полному вытеснению альдегидов (30), ¡32), (33) и (3«)"п : иекооалецтных комплексов и образованию БР, что свидетельствует об отсутствии образования аледимшшой связи с е — аминогруппой l.ys^6 Следует отметин,, что результаты экспериментов по встраиванию этого ряда соединений (29-34) в апомембраны при 5°С совпадали с описанными выше (при 20°С), за исключением альдегида (33). В этом случае наблюдали очень медленную конверсию полиеналя в пигмент с Хмакс 562 им, причем последний оказался t устойчивым к действию полностью—транс—ретиналя и lie проявлял ' способности к свето —темповой адаптации.

Таким образом результаты встраивания показали, что все аналоги, содержещие J цнклонентоног.ое кольцо (1, 29, 31, 33) образуют с БО соответствующие аналоги J БР, тогда как взаимодействие с БО нолнецалей, содержащих цикл состава С6 (2, j, 30, 32, 34) останавливается не стадии образования нековалентных комплексов. fi

6. Компьютерное моделирование места связывания хромофора о БР. ■

Поскольку результаты встраивания синтезированных ретиналей в БО определяются, прежде всею, особенностями их строения и ограничениями .1 б'-лковой матрицы, дальнейший анализ данных но рекомбинации был осуществлен при помощи компьютерных программ, позволяющих,, с одной стороны, оценить объем и конформацнонные особенности встроенных в полненовую цепь моноеновых циклов (Alchemy И), и, с другой стороны, структуплые особенности взаимодействия модифицированного хромофора с остатками аминокислот полиечовой цепи БР (Skeleton)*. Расчеты структур циклов показали, что их объемы отличаются друг от друга незначительно. Так различие между циклопешеновым и циклогексеновым фрагментами составляет приблизительно 3,4 A3 (вне зависимости от конфшурации полионовой цепи), такая ж<- разыща между циклопептеновым и мегплцпклопентеновым остатками (см. Рис. 5 а-е). , '

Гораздо более существенным отличием, при сравнении циклов, являются конформацнонные особенности строения циклических фрагментов н их влиАние на полиеноиую цепь. При этом следует отметить, что цикл С5, с одной стороны . конформационно более жесткий по сравнению с циклом Сб, с другой стороны его влияние на изменение плаиарности соцряжениой полиеновой цепи минимально. В случае циклогексечового фрагмента влияние на сопряжение цепи более существенно, так как ают цикл конформационно более подвижен. С другой стороны, использование программы Skeleton, позволило нам оценить наименьшие расстояния от атомов СЮ, СИ, С12, С13, С14, и Ç15 полиеновой цепи ретиналя до ближайших аминокислотных остатков (за исключением Ly5216j Пр,» этом было установлено, что ближе прочих к этому участку хромофора (< 3,8 А) расположены остатки Thr^O Trp'82 Trp'3®, Tyr'®^. «rro

" A'ciiemy !1 (TRIPOS Associates St. Louis. Mo., Sigma, версия для IBM PC). Skeleton (Институт Физико—Химической Биологии им.А.Н.Белозерсь'ого, версия для IBM PC).

хорошо согласуется с данными опубликованных ранее исследовании аналогов БР, полученных направленным мутагенезом (С. К1югапа и др., 1087 г.)

V-(у

-У-М

М-

Рис. 5. Молекулярные модели фрагментов аналогов: а) (I) и ¡2), б) ¡2) и (С), к) (2) н (5), г) (20) и (30), д) (30) и (31), <:} (33) л (34). полученные с использованием программы А1сЬсту П. Приведены проекции на плоскость параллельную (Л) и перпендикулярную (Б) полиеновон цепи.

Таким оГ,, ¡зом, полученные ламп результаты тестировании аналогов ретиналя и их коитп.ютерный анализ свидетельствуют о том, чту в районе С(10|—С(1.51 атомов Ш -.неновой ценч в хромофорном центре БР имеются жесткие стерические затруднения, обусловленные строением белковой матрицы.

Выводы:

1. Предложен и экспериментально осуществлен путь синтеза аналогов 13 — цис ретиналя, содержащих вклю-.'епнук; а монотонасыщенный цикл С(13) = С(М) — связь, исходя из стштонг. С16 - 9-(2-прочинил) — р — ¡юнолд с" использованием реакции Иоцича.

2. Разработан новый способ получения иетомерчэующихся полностью— транс— аналогов ретиналя о\ефинированием по Хорнеру карбонильных предшественников фосфонатама, генерированным!: /п ¡Ни, с последующей внутримолекулярной циклизацией полученых ациклических производных в альдегиды, содержащие моноеновый цикл в полиеяоьой цепи.

3. На основе конденсации:

—. |5 — ионоб& с 2—диятоксифосфорилгекса-1,6—динитрплом или 2 — диэтоксифосфорилгегпа—1,7—динитрнлом синтезированы аналоги 'юлностьк>— транс—ретиналя, содержащие включенную в моконеиасыщенный цикл С(11) = С(12)-связь.

— альдегида С';5 с 2—дьэтоксиф<.ч:ф&рчлгекса—1.6—дншггрнлом или 2-диэтоксифосфорилгепта ~ 1,7—динитрилом синтезированы аналоги 0(13) — дезметил ~ полностью—трппс — ретиналя, содержащие включенную в моноеновый цикл 0(13) =С(14)— связь.

•1. Пронедоно тестирование синтезированных аналогов ротиналя в реакции рекомбинации с БО. Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии жегп-.их стернческих ограничений, иакладьыемых белковым оьруженнгм хромофора в районе С(!0) — С{15) атомов полли повой цеип,

(

Осноипое содержания диссертации опубликовано и работах:

1. Кириллова Ю.Г., Еремин C.B., Хнгршы Л.В., Мнцнер Б.И. Цчклопентеновый и циклогексеновиш аналоги ротиналя по —разному реагируют с бактериоопсиьом. // Биоорган, химия, IЭЭЗ. Т 19., N fi„ С. 82;>~835.

2. Кириллова Ю.Г., Хитркпа Л.В.. Ходонов ДА. Взаимодействие яотилциклопен'геиових аналоги): I.'1 — ци>—ротиналя с бактериоопспном.// Биол мембраны, 1993,'Г. 10, N 4, С. 44'/-448.

3 Khitiina L.V., Kirillova Yu.G., Khottonov А.Л. The boundary ol bacteriorhodopsin cliiDmopUore binding site. // Abstract Volume of 2iwl 1UBMB Conference Biorbe.nUiry o[ Cell Membranes, Bari, Italy, 1393., P. 286,

*). M.Groesbeek, Yu.G.Kirill vv, R.iioo'f and J. Lugtenbu;g. Synthesis oi six novel reiir.als uiitl their interaction with bacterioopsin. {accepted for publication in Rec. Trrtv. Chlm. Pays-Bas.).

Усл.печ.л.1,3 Уч. из я..'!. 1,1 Формат 60x90/16 Заказ 226 Тиоак -30 Бесплатно

Ротапринтная "Ы1ГГХТ им.Ломоносова 1.1. Пироговская ул.,д.1