автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.05, диссертация на тему:Синтез и изучение биологических свойств производных хроманов и полиеновых жирных кислот

московски! ордена трудового красного знамени инститл

тошои химической технологии ем.н.в.Ломоносова

СпзциадизароввшшЯ соезт д овз.41.01

На правах рукогаюи

ЧЩШОВА Вжторзя Вл&Еялрсгпа

сгзпгпз п пзгшсз Бдаиогачшап свойств проззвощи хроманов п погзшошх пш2и кислот

Специальность 05.17.05 Технология продуктоп тонкого органического синтеза

АВТОРЕФЕРАТ диссэртащш на соискание ученой степени кандидата химических наук

москва - 19э2

Работа , выполнена на кафедра химии и технологи! тонких органических соединений Московского института тонкой химической технологии ем. М.В.Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ -член-корреспондент РАН,

доктор химических наук Р.П.ЕВСТИШША

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ -доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник ' Н.Г.ХРАПОВА

1Л.Д.й'Л!РН0В

НПО "ВиТЛШШ" t

Запита диссертации состоится и_" января 1993 года б_часов но .заседать; специализированного совета; Д 033.41.01 прз !Л1ГХТ ш.М.В.Ломоносова, Москва, 117671, пр.Вернадского, д.68.

С диссертацией мошо ознакомиться б бнблиотоко 1ЛГГХТ

им.М.В.Ломоносова, 119831, Москва, ул. М.Пироговская, д.1.

*

Автореферат разослан "_" декабря 1992 года.

доктор химичесшпс паук, . профессор

I »

ВЕДУЩЕЕ ПРЩРШТИЕ -

Ученый секретарь специализированного повета»

кандидат химических наук А.И.ЛЮГЙК

Актуальность проблем. Витамин Е и полиненасыщенниа кирние кнслоти (П1СЩ), являющиеся важнейшими липофилышми когпснентами биологических мембран, тесно взаимосвязан!! как структурно в составе лтвдшх доменов момбронц, так и функционолыга. ГШКК и система их оксигешфоватшх метаболитов являются ваизтйаими биорегуляторами, что мокет служить основой для создания на их базе лекарствешшх препаратов для прсх|млактики и лечения патологий, связанных с нарушением литгадного обмена, а также заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной и других систем организма. Кромо того, фармакологические препаратц, полученные путем ковалонтного связывания двух и более биологически активных молекул, могут обладать дополнительными фармакологический! свойствами. В частности, присоединение ацилыюго остатка ГОШ позволяет улучаить фармакокинетичоские и фармакодина-мическио характеристики лекарственных средств, а именно: проницаемость чороз биобарьерц. специфичность дойствия, метаболическую устойчивость, а такзта стоить токсичность. Поэтому получение амидов и 1 эфлроп ГПШ{ с различны!.?.! иойромедиатороми и гомостатиками, широко используемыми в мэднщшской практике, является актуальной задачей тшшого оргатнаского с;ттеза.

Учитивая тоспуп структурную и функциональную взаимосвязь 1ШЖК и витатша Е в биомембранвх, актуальной задачей продолжает оста- \ заться исследование молекулярных механизмов их взаимодействия. Ос- : ношше аспекты, действия витамина Е в биомембранах и моделышх системах связана с его антиоксидантпой и мембранотрогаюй активностью, пэзволящай поддергивать сбалансированные условия функционирования клетки в аэробных условиях. Однако, несмотря на большой объем исследований механизма действия витамина Е, в настоящее время нет единого мнения о характере его взаимодействия с липидгшми компонен-

тами биомомбран, а также продуктами перекисного окисления лшшдов (ПОЛ) и рота в указанном процессе элементов структуры молекулы хро-мана. Поэтому значительный интерес может представлять изучение взаимодействия а-токоферола и его структурных аналогов с субстратами и продуктами ПОЛ в модельных и мембранных системах.

Настоящая работа является частью плановых исследований кафедры химии и технологии тонких органических соединений МИТХТ им.М.В.Ломоносова по теме: "Разработка научных и практических основ ресурсосберегающих, экологически безопасных технологий производства поли-ненаскщенных жирных кислот, жирорастворимых витаминов Е и Кц сип-тез их биологически активных производных и аналогов о долги' создания новях препаратов для нужд здравоохранения и сельского хоглШит-ва". ...

Цель работы состояла в изучении модулирующей и структурпрущэй роли витамина Е и его Аналогов в мембранных и немембронных модельных системах оксигенащш лшидов, в такжо в. сннтоао и ньрабогкз для фармакологичаских ксгитипй новых производных ШЩ^ (лшюлзрой, хидоновой, оЯкозштентвэковой п докозагексаеновой) о другими у^рта-кологически активными молэкулаки, о именно: глицином. з'-ежномаолл-ной, Е-аминокапроЕовой, салициловой кислотего! и дофакгаом.

Научная новизна. Методами флуоресцентно» и Ш.'Р-ссттроскогьш • в растворах и в модельных шмбранах изучено взалмодейглтао а-токоферола о жирными кислотами и продуктами их порвичного окисле-' тя. Впервые обнаружено пшшшо специфического взаимодействия мовду а-токоФоролом и гидропероксидаш: жирных кислот. Предлокон новый механизм мембранопротекторного действия витамина Е, который раакгсу-етси через образованно' специфгческих молекулярных ассоциатов - э;с-сшглекса и эксимеро - с високоэнерготическнш продуктами оксигона-цин липидов, чороз последовательное снякениа ойцеИ опоргии окисляй-

щейся мембрашгой системы, а такте через стабилизацию мембраны за счет структурообразующих свойств а-токоферола.

Осуществлен синтез ряда ранее но описашшх амидов ШИК с Г-смпномасляной, г-агяшокапроновой кислотам!, глицином и дофамином, а тагам слохашх эфиров ПШК с салициловой кислотой.

Прзтгпгческзя ценность. Отработаны условия препаративного син-тоза омидов ШШС с использовагагсм тиошмднимидазола и вфиров ПНЖ с салициловой кислотой с применением оксалилхлорида, позволявдие получать целевой продукт с выходом порядка 66-85%. Указашшй метод штат стать основой технологии получения этих биологически активных

совдинвний.

В Институте Фармакологии РА1.Ш, ВНЦБАВ (г.Купавна) и ВКНЦ РАМН проводеш биологические истштсгая всех получогашх амидов и эфиров ГИЕН. УстзповдепЬ, что 3-карбоксипропиламид эйкозапентаеновой кислоты обладает гаготер.тчоской и шггигипоксической активностью и может бить рекомендовал в качестве потенциального профилактического и лекарствегагого препарата.

Предлоглп удобный прапаратившй метод синтеза хромана С1а -устойчивого кристаллического соединения, обладающего сравнимыми с а-токоферолом онтиоксидантшля! свойствами. Хроман счз может быть рекомендован в качестве болео доиевого и стаСильпого заменителя витамина Е. , ' Па заялту ешюсятся слэдуь^аз пояеяегем!

- синтез и пзучетга фармакологических свойстп амидов и эфиров поли-пенаевдешшх гиршх кислот:

- синтез в условиях гетерогенного катализа хромана С13:

- изучение анти- л проогссидантшх свойств а-тскоферола и его аналогов в водно-омульсиопной системе вътоокиедэппя этшшшолевта;

- кэутеигп» южотдэЯстеяя а-токофоролз п ого аналогов с ллпдамг.

мирными кислотами и их оксигекнроващшми производными спектральными методами. .

Апробация. Работа в завершенном виде Сила долояена на расширенном заседании кафедры химии и технологии тонких органических соединений М11ТХТ им.М.В.Ломоносова, часть работи долохяна на III Всесоюзной конференции "Биоантиоксвдант", г.Москва, 1989 г. и на Всесоюзном совещании "Кислородсодержащие гатероцикли", г.Краснодар, 1990 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, тезисы 2 докладов и получено положительное ропот» по авторской заявке .

ОЗьси и суруктура работи. Диссертациошшя работа включает ивз-дзнле, обзор ./шторатуршх. дашшх, обсуждений получешшх результатов, акспбрлмантальцую часть, выводы, список цитируемой литература я приложение. сийоть цэлояииа иа стр., содержит слом, таблиц, рисунка и сшблиогр^ы*) из наименований.

ОскоЕкаа [одуозл^ли работ ы их обсуждений.

1. Синтез биологически активных амидов и эФпуов ГТКЖ

Пояьшенаоцщешшэ кфзше кислота (ПНМ) играют caraiyu роль в нормальном функционировании кишх меток. Как сама 1ШК, таи и их производнда, в частности, система оксигешфовашшх метаболитов,' обладают широким спектром биологической активности и могут пригоняться в качестве аффективных фармакологических препаратов, для лочошш и профилактики патологических изменения, визвашых нарувешмки ли-пидного обмена, а такке цолого ряда заболевашШ сердечно-сосудистой, пищеварительной,' репродуктивной и дахатолыюй систем оргшшз-ма. Ковалентноа присоединение молекулы жирной кислота к действующему началу некоторых других лекарстветшх средств, например, нейро-

медиаторов .и гемостатикоз, мозет позволить модифщирсвать биологические свойства последних, а пмэнно: улучшить проницаемость через биологические барьера и тем самим повысить специфичность к органу-мяааш, снизить торапевтачвску» дозу препарата, а также получить новао фарлекологичоские эффекты за счет действия ПНЖК.

С это!! целью на.'.ет Сил синтезирован ряд амидов незаменимых ГОШК - линолевоЗ (9,12-октадекадаеповоЯ) (Ь), арахидоновоЯ (5,8,11,14-Рйкозаютраеповоа) (Аг), 5,8,11,14,17-эПкозапентаеновой (ЕРА) и 4, 7,10, 13,16,19-докозагексэеновой (DGA) кислот с глицином (2-амино-этшювоЯ 1с! ело tu ) (Gly), г-аминомасляной (4-амгаюбутановой) (САВА), e-аузшокепроновоЯ (б-ашшогекевновой) (ЕАКА) кислотам! и дофамином (2-(Э,4-даокспфэш1л)этил-1-агашом) (DOPA), а такяе оффов с салициловой (о-гадроксибепзойной) кислотой (Sal).

Для работа* использовали гирше кислота, получегашо из подсолнечного пасла (L), препаратов "Биополяеп" (Аг) и "Эпаден" (ЕРА и BGA). Пэрзоторифякацией исходного сирьл эталовш спиртом получали смэсь зтшговгп офиров (ЭЭ) гася, содоряацую 55-603 (ЭЭ-Ъ), 20-3056 (ЗЭ-Аг), 25-353 (ЭЭ-ЕРА) я 20-252 (ЭЭ-DGA). Последующая 3-х ступенчатая адцуктотшая кристаллизация с мочевиной давала концентрата, содор^сгцие 93-1 OOS (ЗЭ-L), 70-755 (ЭЭ-Аг), 60-653! (ЭЭ-ЕРА) и 20-25$ (ЭЭ-DGA). ЗЭ линодзвоЯ кислота очицалп колоночной хроматографией на спдшсегзлэ, а СЭ арахидоновоЯ, эйкозаяонт'аеновой и докозагоксаано-воЯ ira слот гаделяли пз копцентратоп с помощью препаративной 0Ф- | ВЭНЗС, получая целевые соедлпотгя с содерзсшто?.! основного вещества 97-99% (по дшпшм ГНХ). :

Лгадц ШСЖ получалп по схега 1 ацнлировапиен Gly (XIV), GABA (XV) п ЕАКА (X7I) , а такта DOPA (XVII) иявдазолвдеми L (X), Аг (XI), EPA (XII) и DGA (XIII) о аплосфоро инертного газа в срода ди-мэтяг.$ор.'гл-!да Ш'?А) прп то;.!Порптура 100" С в присутствии пиридина.

Для получения имидазолидов ГОШ использован метод о применением раствора тионилдиимидазола (III) в тетрагидрофуране. Амиды жирных кислот получали с выходом 65-8555, причем в наибольшая степени на выход влияла растворимость аминокислот или амина в ДОВА.

схема 1.

ТГФ Н-- Й J-И Н--

+ $001, -. I И-а-Н-1 +2 I ЮМШ

I ТУ С-I . I '—J

(II) (III)

4 Т=^Н

(I)

R-C00H

(IX)

R-CO-1

(V-VIII)

V. X.

VI. XI.

VII, XII,

VIII, XIII,

1г®

(Х-ПИ)

XVIII - XXI

XXII - XXV

xxvi - гах

•а

> 1Г-НН, (XIV-XVII)

ДМФА, пиридин

100'с*

(IV)

R-00-mi-R'

XXX - XXXIII

XIV, XVIII. XXII, . XXVI XXX

XV, XIX, XXIII, XXVII, XXXI

XVI, XX, XXIV, XXVIII, XXXII

xvii, XXI, XXV, XXIX, XXXIII

(XVIII-XXIII) Ra-(CHa)„ (ciia-cH-ai)a<cii3 )„ciia R=- (CHS) я (СН^-СГМИ),, (GH, )„CIIa R«- (СНГ), (СНг-С;!=С1)ЕСН^ОТэ IU.-CIIs(CHa-CII--<CI!)eCIL,CH,

R'B-CifaCOOn n'r.-iGIjiaOOai

R'--<caa)ecooii 7 R'—

OH

Для скитоза еффов ЕШ был выбран ххорапгидридныЯ штод (схема 2).

схема 2.

COCI COCI

(xmv)

COOH (XXXIX)

n-сосл

хлороформ

RC001

хлороформ, BtaH, бО'С

<g^ocon

COOH (XL-XLIII)

(V-VIII)

(XXXV-XXXVIII)

V, Ш, XL

R--(сн,), (си.-сп-ся), (ai,)4cn,

VI. XXXVI, XLI , n—(Cna),(CÎ!1-CîUCII)1.(ai,)fcCH,

VII, XXXVII, XLII , R—(СИя),(СИа-СИ-СН).СН,СПа vin, XXXVIII, XLI и R--aia{(3!,-ai«ai)aCH,cn,

Хлорапгадрядц L (XXXV), Ar (XXXVI ), ЕРА (XXXVII ) и TOA (XXXVIII) получает роекциаа о онсвлншюрлдо!! (XLII) п хлорофорлэ и баз пыдэгэпяя вводила во взаимодействие с салициловой кислотой (XLVII) в хкорофйргэ при БО*С в присутствии трнэтила'сша. Отработанная иг'.с! г.'этодика позволив получать о-карбоксифэгсшэвце офирн IÏÏCK (XL-XLIII ) с выходом 80-653. .

Структура и индивидуальность всех полученпих соединений бита подтверждена о пс;.:спья методов !"<-, УО-, 1 Н-ШР-спэктроскопш,' ТСХ и олеггэнтппм снагазом. '

Синтозггровгшмэ я оффн глрннх кислот били переданы для

биологичосюпс зсслодопапгЗ в Институт Сзрмако-сгсп РАМИ, ВКНЦ РАМН h do ШЩБАВ (г.Купавна). Пропэдешшо испытания л'т птзотных показали, что 3-ксрбсксппрспилс:.од ойкозапентйоновой'кислоты обладает ги-потермлческоЗ и ептагяпокспчоскоЯ активностью и гжгэт бить рекомендован в качество потонциального профилактического п лекарственного препарата.

2. Получеш'.э диалога а-тоткуТарола - хромана, С. „ п ' оксигзнпроваштх

пропзЕодгшх тарных кислот. ПЗГПС и 1« оякгзнироваяные метаболита является субстратами и

регуляторами многих ферментативных и нафермонтатнвных процессов жизнедеятельности организма, в которых ваетая роль отводится витамину Е. Согласно современным представлениям физиологическая активность этого соединения определяется кошфотными элементами его структуры [Barton G.W., 1986). Для изучения влияния структурных различий молекулы хромана на процессы взаимодействия витамина Е с жирными кислотами, их оксигенировашшми производными и липидаш были использованы а-токоферол и ого анвлоги с различным строошюм боковой цепи и хроманового ядра (схема 3), в том число хромал Cia, (Впа^зые полученный нами в .условиях геторогошюго катализа (С7.п'?", л также оксигешфовашшо щгоизводныо линолевой кнслоты - гпдро-

.ппршссида ЛГОЮЛ9В0Й КИСЛОТЫ И ГИДРОКСКЖНО^ЭЕЗЯ '"10"ЭТЕ.

схема 3.

(XLIV) R4«>Ra-na=CIIa, R„-(XLV) ¡.t».Iia=i»a»CM,.' li»»Ciia

(XLVI)

(XLIV-XLVIII)

v

(XLVI 11) R^R^R,««!,,, H4"=

Для синтеза хромана С1а (2,5,7,8-тетрамэтил-2-трэдоцилхроман-6-ола) (XLVIII) - аналога а-токофоролэ с нзразвзтшшщой боковой цепью эквивалентной длины был выбран метод гетерогенного катализа с использованном алюмосиликата А11ВД-3, разработашшй рзиае на коядро ХТТ0С МИТХТ им.М.В. Ломоносова для а-токоферола.

Для получения ключевого ciurroim - 3-иотнлгоксаД')ц-1-он-3-ол.з (IV) бронированном додезсан-1-ола ШДХ) .трйхбрсмлсшм фосфором в

растворе эфира бал получен 1-бровдодекан (L), который затем переводила а пентадекан-2-он (LIÎI) реакцией с ацетоуксусным - îиром (LI) с eucokisi для данного тепа реакций выходом порядка 72% (схема 4).

Одпоствлййый переход от кетона (LUI) к З-метилгексадец-1-ен-3-олу (LV) осуществлял:! по реакции Нормана с вигашлапшйбромидом (LIV). Взаи.юдействнем 2,3,Б-тр1:метилбонзогндрохинона -1,4 (LVI) со спиртом (LV) в условиях гзторогетюго катализа в толуоле получен хрсман Cla (XLVIII) (схема 4).

Структура ц индивидуальность промеяуточных соединений (ЬШ) и (LV), а такта хромана С1Э (XLVIII) подтверждались методами ИК-, УФ-'Н-ШР-спактроскстп!, ТСХ п элементши анализом. ;

vf

гК

(XLIX)

(III)

-"Vs/ (LV)

Щ

соси

I а

сосоапа

РВг,

п-еп

-со,'

rf

"VV

(L)

/-Ч/Ч/

. (LUI)

¿г

3

V

схема 4.

СНаСОСИаСООС2Н, (LI)

CHa-Cînj30r (LIV)

m^oi

СП,

3

on

. Cil

лшщ-з

JJ толуол ЯП1

но'с

J

3

(XLVIII)

Гидропорокспды лпполовой кислоты и этилстюлэата выделяли из смеси продуктов евтоохнсдоппя хкноловой кислоты и ее этилового офи-ра с по:го:зьп препаративной ВЗТХ.

. ,. - ю - I '

Гидроксилинолевые кислоты получали восстановлением ооответсву-ющих гидропероксидов л!шолевой кислоты боргидридом натрия в растворе водного метанола,

3. Исследование взаимодействия а-токофэрола и его аналогов с поли-ненасшценными жирными кислотами и продуктами их первичного

окисления.

Основные аспекты действия витамина Е связаны о его антиокси-дантными свойствами и о поддержанием структурно-функциональной целостности мембраны за счет его взаимодействия с сцилысг.^1 остатками ПШК, входящими В СОСТаВ ЛИПИДОВ, СВОбОДЫМЛ виршам кислотна п продуктами их отгслопия, Однако в пастолщзо нрэмд пот единого »•чз-шш о характере такого взаимодействия и роли в ном идашс елэ-мбитоБ структуры молекулы хрзмшт. В связи с от,? пс\:л было изучено взаимодействие а-токоферолэ и ого структурных аналогов о субстратами и продуктами ПОЛ в мэдельшх кембранвд и цэ.^скЗ^шиагг системах.

3.1, йзутакио анти- и пузогг.цттгл. споЯотд но молг-лй

окисления оггллгоюлэптг. в водко-зкулдйчошю;< тустгорэ.

Для сравнительного изучэшю енти- и прооксвдапшых сеэДета аналогов а-токсфэрола о различном строением боковой цогга наги била исследованы процессы пвтоокнелония иилланолаата в Еодно-имульбион-ном растворе в присутствии а-токоХэрола <ХШ),.хромай С. (XIV) и хромана С1а (ХШП). в концентрациях 0,66 и 5,0 мол.Я.

В водно-вмульсиошюй систомо при концентрации 0,'65 иэл.й а-токоферол и его аналоги не проявляли антиоксидантшх свойств вплоть до накопления 6 мол.51 гидропероксидов (ГП) (100 ч.). Однако в дальнейшем процесс окисления в присутствии хроманов стабилизировался, в то время как в контрольном образце (отиллинолэат) накопле-

шю гидропороксидов ускорялось (рис.1 ,а).

Рис.1. Динв?яжа автоокисления этпллшгалеата по накоплению диеновых копызгатов 234 км) в присутствии о-токоферола (4 —-+—),

хромала С1 (3 •—х--) п хромзна С13 (2 —*••••) в концентрации 0,65 мол. 2 (а) и 6,0 кол. 8 (б); контроль (1 --»-).

Эф1<зкт отсутствия .антпоксидантних свойств мокло объяснить тем, что в гсщэллах, образупзпся в водпогмульсионном растворо, концентрация а-тонсфэрола п его аналогов достаточно высока п поэтому на начальной стадии окисления (до 6 мол.Я ГП, 100 ч.) хроманн оказывали на окпслящувся систему слабое проокспдаптное действие. Другим зозмояшм объяснением могэт Сыть то, что прл отсутствии внутренних инициаторов окисления (исходное содержание ГП в исследуемом этилли-

нолаате но превыавло 0,05$) хром а: ш могла семи выступать з роли инициаторов перекиского окисления ЛНКК.

При концентрации 5,0 мол.S все хромаш оказывали выраженное проокпидантное действие (рис.1,0). Било отмечено, что при накоплении достаточно больного количества порвичных продуктов окисления (19 мол.*) скорость их распада начинала прасыпать скорость образования (кинетические кривые проходили через максимум и в УФ-споктре появлялись новые полосы в области 270-280 нм, соответствующие вторичным продуктам окисления).

В водно-шульсионпой система всо хромаш обладал! приблизп-

ичмыю одинаковой анти- и прооксидантной активностью, несмотря на

' г'

иго. что ранее па мог^ли нздкофазного окислошш этиигсголзатг* ^бшго

ьпаказано, что с у^оньшенкем длшш боковой угхоьодорол'ой ur,.¡a вптп-окоидантная активность хромаков падает, а проокет'лг.пптся роэрастц-ет. По псей вероятности, в мицелля^ш,* системах ^трцосс образозшпш первичных продуктов 'окисления атшшяюлеата ллттнруотсл но pt'î?.^-тивноотью взаимодоЯствия хронана о пороксилыпзм родщ^лоч, а доступностью субстрата для окисления. Кроне того, хромай оз/адпл более высокой анткоксидантной ектишостью но сравнен;:» о г»-токоферолом и хроманом С1а. По-шгдтюму, из-за пиызой стабильно-ста хромгшоксилыюго ' радикала и, следовательно, наибольшей способности К ош1слошго XpOîJSH Ct оис'гроз преврг'щоотся в xiüioh, которий такко обладает антиокевдшгтши ссоПствги! (Llndsoy J.A., 1935J. .

3.2. Изучошю взаимодействия а-токоферояа и его опагюгоп о__r.ip:;'"';!

кислотами и их пронпво^тш-щ катодом флуоресцентной спектроскошги.

D зкеиернлзитв по изучит» проотидантних свойств а-токсЗорила и ого лаапогеп (рис.1,6) oïi,¡очлю, что в |.юдолык«; с»;ста/.о, ■ содор-кедоЗ хроманы, скорость распада порвичш» прздктои окисшпш fe«o-читолььо 1,'зньшо, lieu в коптрохыюм chuto. Зи> 1.шст сьидлйльство-

вать о том, что молокули хромана взаимодействуют с гидронероксидами хирных кислот, стабилизируя их и предотвращая образование вторичных продуктов.

Для ответа на, вопрос о характера возмогсного взаимодействия витамина Е с гидропороксидами киршх кислот била проведена серия экспериментов по исследованию спектров флуоресценции а-токоферола и его смесей с гидропероксидами линолевой кислоты в ацетонитриле при различ1шх кощентрациях компонентов. Кроме того, исследовано взаимодействие а-токоферола (ХЫУ), хромана СА (XIV), хромана С4. (ХШ1) 'I токо.па (Хъу'1 ) - с клркини га!слотами различной стопсни по-насццвхшости - олеппосой, лшоловой, арахидоновоп и докозагексаено-вой, производима лшолавой кислоты - этиллинолеатом, гидропорокси-XV гл ."-.толовой киедотц и этшшшолоата, рицткшвой :шслотой и гид-рокснлшюлсьой кисло той.

Вило показано, что интенсивность флуоресценции а-токофорола (к,,сп_ "25 нм) а аио'штальной его пени зависит от ого концентрации в рйс.'игра. Тм, при уайлгшш концентрации шве 5-Ю~':.! исСлидилооь яв.'!вгп:о ко'тцентрвцкетюго чумгад, характеризующееся сникениим ин-тонси.м^остп испускания при 325 ил. При этом во всем диапазоне нс-СЛОДС.Г'Г:11.1!и концентраций (5-Ю5 - 1'ШЛ) «-тикоГерол ооразовыьал окси:«)р, обладавший спектральными хорпкторисгиквки, отличными от Пфаш&рислт осиошмго ноноиориого состоянии, а и-.:гшю, ^¡¡^ 345 нч и \(П1 380 им, причем'ннтонспшость испускания эксимерной iopf.ii! ). порастали при уездичепин коьцеитршит «-тсК'>"0(Лла.

!'-....; и ЧТО ООрВДОЬ<ш,ТО ЗКСКгэр.) (15) ИрОГ.СИОЛ'ЛТ ПО

нрнсоД'5н.п.Л «яки ох!.1!;-,), лсссцнация происходит •¡сли^откни различна /••.порт- ..ыкчпсри'Х ОЛО 'ОТЦ Ы-)Ь0у:.\ЗД1№.Л К ШИи .«'•у -и-а т«.:со-1«{.л:а и, ка.с сладс1; , геопчтрни иилекул СЕоч '!.. г/>П.

ьувоз0. „ ^исп. аТОН '---. а ТОП -► 330 им

аТШ

. „ "'исп. 1аХОН*.аХОН)1-> 1аХОН ТОН*) (--. (аТШ-аТОН)" -► 380 им

(В)

При добавлении лшюлевой кислоты или ео производных (этиллино-лаата, гидропероксида лшюлевой кислоты и его этилового эфира) к раствору а-токофорола в ацотонитриле происходило снижешт интенсивности флуоресценции последнего,'причем зависгаюсть величины относительного тушения от концентр^'щи исследуемых воществ в координатах Штерна-Фольмера имола прямолинейный характер. Эффект тувения в этом случао был наиболее ярко выражен для гидропероксида лшюлевой кислоты.

В экспериментах с линолевой кислотой величина относительного тушения не зависела от вязкости раствора (гексан, нонан), но на нео сильно влияла полярность среда (гексан, ацэтонитрил). Кроме того, эффективность взаимоде"1твия а-токофорола с жирными кислотами возрастала с увеличением степени ненасыдонности последних (К01=100, 19, Кдг=178, Кцдд-258 моль"1 ), но оставалась значительно ниже эффективности взаимодействия между а-токоферолом и гидропероксидом лшюлевой кислоты (К«667 моль-1). Это позволило сделать вывод о высокой аффшпюста взаимодействия гидропероксильной группы с хрома-ном.

Полученные экспериментальные дашшо позволили предположить, что при взаимодействии молекул возбужденного а-токоферола и жирной кислоты или ее гидропероксида образуется нофлуоресцирущий комплекс - эксиплекс (А), возникающий за счет донорно-акцепторных взаимодей-

ствий и стабилизированный экситоннш резонансом.

При исследовании зависимости интенсивности флуоресценции а-токофорола от ого концентрации в присутствии различных количеств гидропероксида линолевой'кислоты оказалось, что тушение флуоресценции а-токоферола происходит во всем диапазоне исследованных концентраций (5>1СГб - ЫСГ3М). При этом о увеличением относительного количества гидропероксида вирной кислоты (аТОН:ЮОН 1:0; 1:0,5: 1:1; 1:2) наблюдалось сникешю минимальной пороговой концентрации сиютушния а-токоферола. Кроме того, при добавлении тушитоля интенсивность флуоресценции мономерного состояния (^сп 325 им) а-токоСоро/ш шгалзаь, о интенсивность испускания экспмэра (\1СП 3S0 iL") Еозрастала.

Тешш образом, iig основании экспериментальных дашшх можно предпалоють, что з ассладэвашой мэдолькой системе при облучошш УО-сеотсм образование зкашлоксо (А) г,*эг,ду оксигвппровашюй «ирной хзслотоЯ п с-'юксфоролсм стабилизирует везбуздешюэ состояние хро-иштз .и обяэгчгот процесс его ассоциацга в экэтмрр (В), что проявляется а уезди 10Ц5чИ r.tTTiHif;;iui;nß'nj фдуореси.тг.м гссдодн&го и з сии.: ■ in'ffl .'.ьпсст.чыюП герог'одлл концентрации ссмотуиэнчн непомерной фор-

1SI. I

hvB03ö. . ¿ООН аЗОЯ----> uTCÜ ■ luSOII-HOOL]

"(А) •

uTOH

a'XOH

loTOIMIOall* -

WOH

(В)

Для того, чтобы определить характер взаимодействия и вклад от-делышх частой молекул в образующийся яксиплекс (А), проведена сорил экспергнентов по изучению тушения флуоресценция а-токоферола и

его аналогов (XLIV-XIVII) (схема 3) оксигенированными производными жирных кислот различной структуры- гидропероксидами линолавой кислоты, гидроксилинолевой и рицинолевой кислотами.

Полученные результаты показали, что длина и разветвленность боковой цепи, а также наличие заместителей в хромановом ядро не оказывают существенного влияния на устойчивость вксиплекса,

(КХШ=667, KXLV=61KXXVI=833,3, КХШ1°412,4 моль_1 )• Относительное тушение флуоресценции а-токофорола (XLIV) и хромана Ct (XLV) было практически одинаково. Отсутствие метальных групп в хромановом ядре молекулы токола (Xiyi), по-видимому, уменьшает стори-ческпе затруднения в образовали комплекса, и поэтому еффоктивность ассоциации в этом случае несколько выше. Снижение оффоктивности комплексообразовЫшя хроманом С1в (XLVII), по-видимому, мохэго объяснить экранированием фонольного гидроксила хроманопого ядра болео гибкой неразветвленной алкилыюй цепью гфи определешшх со конфор-мациях.'

Сравнение взаимодействия а-токофорола с линолавой кислотой и ее оксигенировагашш произвол.' .jmh показало, что все исслодовашшэ. вещества являются тушителями флуоресценции а-токоферола, причем вф-фокт убивал в ряду 1Ш > LOOH > Rio «LH.

TaraiM образом, получошше Бкспоримонтальнне дашшэ позволили предположить, что оксиплекс (А) образуется за счет донорио-акцепторного взаимодействия мекду фонольным гидроксилом хромана и атомами кислорода или углерода, сопряженными с двойншт связями молекулы жирной кислоты. Валиую роль в эффективности образования вк-сиплекса (А), по-видимому, играет поляризовашгость связи пороксиль-ного, алкоксильиого и алкилыгого радикалов с атомом водорода, максимальная степень которой достигается при конъюгации свободной пари р-элоктронов с сопряжэшюй диеновой системой у LOH и ЮОП. Кроыэ

того, определенный вклад в стабильность эксиплекса, по всей вероятности, вносит образовать п-комплекса мегсду ароматической системой хроманового ядра и двойными связями жирной кислота.

Мояго Т8К.-!Э предпологл1ть, что процессы образования эксимера а-токоферола и его эксиплекса с гидропероксидами жирных кислот играют важную роль в механизма антиоксидангного и мембранопротектор-ного действия витамина Е. В реальных биосистемах при взаимодействии а-токоферола в основном состоянии с высокоэнаргетическим лигшдшми радиолами, вероятно, тоюю образуется возбуждешшй донорно-окцзпторшй комплекс (ьксшизкс), внутри которого происходит пэро-распрэдодопио энергии и игмонониа гаомотрш нолэкулы, а-токоферола, сопрс*с:;г^'- ;;с-сл увзлачаккои допоршх свойств его Гмдроксилыюй группы [2ст М., 1990). Следствием этого является передача атома водорода па пстхйшй радикал с образоватаоч стабильного продукта. Образуемся этой окспмзр а-токоферола - сл-здугдая стадия з цепи посладоватолепого сииодгал 8Ыбрг>::! 01'сл:г-1|;.1,:г.сл системы, распадоот-

зя с с'роьоаа:;«.ем а-токс>Фзрсла и и-токсрерс^сильного радикала: * . « аТШ * '

аГОН + П- -----» Ш-Н-ОхТ! —^ ГаТО-И~ОаТ)

До й-о П" Х|

П-ЮО Ш [аТОН + аТСМ

Тшспн образом, в процессе перекис!Юго окисл'ения липилов и других биологических процессах с участием вдсокоэнергатичоских. компонентов гап'иС1фуюдгя и стабилизирующая роль а-токоферола сводится к способности образовывать специфические молекулярные структуры, в кото} их :трс:т^хпд'.1т посппдопатолыюэ спикенпэ да'ргга со очог :ппу-чиго.чигчх и свгиздучато*: иих н«;р«иочоп. Результатом этого пгс.а :с,сл :шл;мге.! суобллип« ¡и^кз^ирг^'пгг^с^'х пи-гуктом.

3.3. Изучение взаимодействия «-токоферола с фосфолипидами, жирными кислотами и их оксигенировашшми производными методом

31 Р-ЯМР-спектроскогши. Известно, что а-токоферол участвует в специфическом гидрофобном взаимодействии с пцил_ными цепями компонентов мембран, а также свободными жирными кислотами, шгоелируя их хаотрогаюе действие и предотвращая отрицательное воздействие фосфолипазы Аа. В связи о этим важное значение приобретают исследования влияния а-токофорола на структурную организацию липидов в момбране.

Целью нашей работы явилось исследование взаимодействия а-токофорола с фосфолипидами, гарными кислотам^ и продуктами их

первичного окисления в модолышх мембранах, содержащих яичный лецл-

и

тин и лизолецитин. В качества метода была выбрана Р-ЯМР-спектро-скопия, позволяющая определить структуру агрегатов в дисперсии лп-

ПИДОВ.

И-з представлешшх на рис.2 спектров видно, что исходный сигнал лизолецитана (рис.2,а) в 60 % водной суспензии имеет отчетливо выраженную изотропию, характерную для мицеллярных структур.

-40

-40

Гис.2 Р-ЯЫР-споктрц лизофосфатидилхолино (а) И эквимолярной смзси

лизофосфатиднлхолина и а-токофорола в 50 ыас.й врдаоЯ диспор-сии (б).

При исследовании образцов, содержащих эквимолярное количество лизолецитшш и а-токоферола (XI.IV) или ого аналогов - хромала С! (XIV) и хромана С1а (ХЬУП) - показано, что а-токоферол способствует сохранению бислойной организации лизофосфатидллхолина (рпо.2,6), а в случае хроманов СА а С1В упорядочешшя упаковка липида практически не образуется. По-видимому, а-токоферол, встраиваясь между молекулами лизофосфатидилхолина, создает предпосылки для их упаковки в бислой, т.е. обладает ярко выраженной мембраноструктурируицей активностью, что можно объясш!ТЬ комплементарностью динамических форм лизофосфатидилхолина и а-токоферола.

Такая динамическая структура а-токоферола (большое соотношение мекду объема?ли гидрофобной я полярной частей молекулы) должна при вводошш в фосфатидалхолиновый бислой вызывать образование гексагональной фазы, которая играет важную роль в функционировании мембра-1Ш. 3 связи с этим наш было изучено взскэдойствие яичного фэсфа-тидилхолина с а-токофоролои в водной дисперсии.

Введение в водную дисперсию лецитина у;::э 10 мол.% а-токо>форола приводило к иакеиешпо вида спектра, которое гдапю киторпро'ыровать, как наличие в лшгадной системе двух различных бпслсйннх фаз (рно.3,6). При усо.тачошш количества а-токоферола до 40 мол." п 3,Р-1ШР-спектро лецитина появлялся сигнал с гаком 7 и.д., с обращенной атыотрией и меньшей шириной, характерный для образования гексагональной Фазы (рис.3,в).

Интересно отметить, что в аналогичных условиях эксперимента аналоги а-токоферола с измененной боковой цепью хроман С4 (XIV) и хроман С1Э (ХШП) не встраивались в фосфатидилхолиновые бислои. По-видимому, модификация углеводородной цепи а-токоферола приводит к изменения предпочтительной конГюрмации молекулы хромана и харак-. тврп ов вааимодойотвия о лигмдашм окружопиом. Слодотвиьи отот'о лп -

ляется разделение фаз на гидрофобную, содержащую хроман, и бислой-ную лилидную.

Рис.3 " Р-ЯМР-спектри яичного фоофатидалхолшт (ФХ) (а), смасей ОХ

- в-токоферол (аТ) ((О шл.Ж) (б),ФХ - а-Т (40 мол.2) (в), Ш -а-Т (40 мод.Ж) - олеиновая кислота (10 мол.Ж) (г), ФХ - а-Т (40 мол.%) - рицинолэвзя кислота (10 иол.%) (д) и ФХ - а-Т (40 пол.%)

- -гидропероксид лпноловой кислоти (10 мол.%) (в) в 50 мае.Ж водной дисперсии.

Как Соло показано в экспериментах с использованием флуоресцентной спектроскопии а-токофэрол способен образовывать комплакси с високоэне.ргеткчоаз:,-; продуктами ПОЛ в гоыогашшх растворах, ггрнчом образование таких вообукдзшт ассоциатов может бпть ключевым мо-

ментом в механизме его антиоксидантного действия. Поэтому ми исследовали взаимодействие а-токофорола со свободными жирными кислотами и их оксигенированними производными - олеиновой кислотой, рициноле-вой кислотой и гидропероксидом линолевой кислота, в составе водных

о«

дисперсий фосфатидилхолина методом Р-ЯМР-спектроскопии.

При введешш 10 мол.Ж жирной кислоты в> водную дисперсии лецитина и 40 мол.Ж а-токофорола, наблюдалось заметное изменешто 31

Р-ЯМР-спектря лецитина. Включение олеиновой кислоты приводило к усилению сигнала гексагональной фазы (рис.3,г). При замене олеиновой кислоты на кислородсодержащие жирные кислоты описанный аффект усиливался (рис.З.д.е). Ко.тгоство образуются гексагональной и изотропной фаз превышало кппичостло остзвкейся СислоСноП структуры липидов. Тагом образом, кирше кислоты и продукта их окисления усиливали модифицируемо роздСптпио а-токо1'эрода на мембрану, причем оксстгэкировшр'во еоедяш'пш гтошияп» г.'н.чт-т.шно больший синергизм витемтцг В. гтолсггем, "то чоде&шгав лмшдоой структуры может объясняться тем, что прч тюзрастшмп кошю^тряти а-токоферола происходит его ассоциация и образование гексагональной фазы за счет его структурообра^у^^ свойств. Этот эффект значительно усиливается мгрними кчслоти.-л, особенно оксмгенированнши, которые, по-видимому, способствуют ассоциации а-токоферола и возникновению в плоскости бислоя его еысоких локальных концентраций. В то же время, увеличение концентрации а-токоферола и его взаимодействие с порвич-нимн продуктами окисления липидов мояет приводить к образованию гексагональной фазы, которое в реальных биосистемах коррелирует с активацией килплексп ферментативных процессов репарации мом^ранн, включающих реакции деацилкровнния - рол-цилированкя.

На основании полученных зксперикентнльнах данных ; вю пр'^.но-локить, что «-токоферол является универсальным протектором елкимг'л-

чоских мембран, сочетающим в себе антиоксидантную и структурирующую Функции. С одной стороны, образованна комплекса с высокоэнергетическими продуктами нерекисного окисления приводит к снижению анергии систоыц, что создает предпосылки для нейтрализации активных частиц. С другой стороны, дестабилизация мембраны под действием продуктов гидролиза окисленных фосфолипидов мокет быть незначительной за счет структурообразующих свойств а-токофорола.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны удобные преп ративныо методики получения амидов и эфиров ГШЖК с использованием тионилдиимидазола и оксалилхлорида, соответственно.

2. Получен ряд амидов и эфиров линолевой, арахипоновой, эйкозапен-таеновой и докозагексаеновой кислот, которые переданы в Институт Фармакологии РАШ, ВКНЦ РАМН и ВШШАВ (г. Купавна) для проведения фармакологических испытаний. Показано, что 3-карбоксипропиламид эйко; лентаеновой кислоты обладает гипотерми-ческой и антигиттоксической активность!).

3. Впервые в условиях гетерогенного катализа осуществлен синтез аналога а-токофврола с неразветвлешгой боковой цепью - хромана

4. Изучены анти- и прооксиданише свойства а-токоферола. хромана С1а и хромана С,, на модели автоокислетая этиллинолеата в водной эмульсии. Показано, что анти- и прооксидантные свойства хроманов на зависят от длины и разветвленное™ боковой углеводородной цепи.

5. Методами флуоресцентной и Р-ШР-спектроскогпга изучено взаимодействие а-токофорола с хмрными кислотами и продуктами их пэр-

Бичного окисления. Предложен новый механизм мвмбраноггротекторно-го действия витамина Е, который реализуется через образование спецкфгсесккх молекулярных ассоциатов - эксиплекса и эксимера, с высокоэноргетнчвсгатми продуктами оксигеиашш липидов, через последовательное сшкоика обдай анергии окисляющейся мембранной системы, а такке через стабилизацию повреиденной мембра!ш за счет структурообразующих свойств а-токоферола.

Оспонпоа содаряаша диссертация иэлояано в.следугяца работах. 1. Чудшюва В.В., Захарова Е.И., Алексеев С.М., Евстигнеева Р.П., Емуйлович Л.М., Гандэль В.Г., Морозов U.C., Лосов A.C., Дввлишви-лц Э.Г., Агафонова 0,П , Коротаэв Г.К., Васнлов Р.Г. г-Харбокси-пропнлакид ейтозапвнт^сисгой кислоти, кавмаовдий физическую рабо-

- тосгго^оСяость и ycTo'I'HHi^oïb к острому о/лавдопта. // Пглогытедь-

<

. нов рагамшэ по зеяако J' 1?Б0557/04. » 991. t

Z. Чудкновй В.В., Затргопо Е.И., /.гекоеов С.М., Ш/аилов К.А.-В., Епстигкэовл Р.П. о.итсз а гигислчсл г.ольпал активность структур-

ч

кнх етшогоч пгагшта Г.//йюорген. ш.;;;я.- 198Э.- '0,16.- ."9. C.12G8-1273.

3. Чудеьово,В.В., Захарова Е.Й., Алексеев С.М., Шуашов К.А.-В., Евр.гигнсозр Р.П. Сшиаз и сптаокислительноя шсч.чвность а-токофзрола и ого ьналогсз.//Тезисы домадоп III Всесоюзной конференции "Бксшгсюксидаит",- Москва. 1989,- T.IС.230.

4. Чудтшоза В.В., Захарова H.H., Алексеев СЛ.!.. Евстигнеева Р.П. Продукты трансформации птгтмшп Е и ого аналога - хромина Ct, в среде окислящэ гося згилл1пюлеата.//Блооргон. химия.- 199?.-Т.18.- Ш,- С. 985-995.

5. Чудэтювз D.B., Захарова Е.И.. Алексеев О.Н., Епстиг'еевя Р.П.

ОО'рйОООШЛГО KOf.iir.TOKOO Mu ИДУ с» -го/софо ролом к гидропярокоидпьш I си р -

них кислот в гомогенных растворах.//Доклады РАН.- 1952.- Т.322.-JM. а. 773-775.

6. Чудинова В.В., Захарова E.H., Алексеев С.М., Евстигнеева Р.П. К механизму действия витамина Е. Изучение взаимодействия витамина Е (а-токоферола) и его аналогов с жирными вдслотами и их производными методом флуориметрии.//Биоорган, химия.- 1992.- Т.18.- $12.-С.1528-1534.

7. Чудинова В.В., Захарова E.H., Алексеев С.М., Чупин В.В., Евстигнеева Р.П. Бенэопираноли. Молекулярные механизмы действия хрома-иов.//Тезисы досада Всесоюзного совещания "Кислородсодержащие готороцикш" г.Краснодар.- 1990.- С.43.

Зак.бОЬ тар.M окз.Ротапринт й'ЛШ ам .Jfo'.oiiocoui