автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.04, диссертация на тему:Синтез и исследование свойств новых дииминов, содержащих карбоциклические фрагменты

Г СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Клеточные механизмы устойчивости к высушиванию.

Глава 2. Роль дисахаридов при обезвоживании клеток.

Глава 3. Радиоспектроскопические методы в биотехнологии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы исследования.

4.1. Объекты исследования.

4.1.1. Микроорганизмы.

4.1.2. Модельные композиции. to 4.2. Метод ЯМР-релаксации.

4.2.1. Сигнал свободной индукции.

4.2.2. Измерение Т2.

4.2.3. Измерение Tj.

4.2.4. Регистрация ЯМР сигнала от сухой биомассы.

4.3. Метод высушивания.

4.4. Хранение сухих биопрепаратов.

4.5 Сорбционный метод.

4.6. Статистическая обработка полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 5. Разработка способа определения остаточной влажности сухих биопрепаратов методом импульсного ЯМР.

5.1. Основные подходы.

5.2. Модельные композиции. р) 5.3. Микроорганизмы.

5.4. Формула для расчета остаточной влажности.

Глава 6. "Растворяющая" роль воды при малых значениях влажности.

6.1. Исследование сорбционных свойств сухой биомассы.

6.2. Определение количества прочносвязанной воды по изотермам адсорбции.

6.3. Анализ зависимостей соотношения амплитуд ССИ от влажности для модельных систем.

6.4. Особенности "растворения" в сухих дрожжах.

Глава 7. Исследование состояния воды и сухого вещества в сухих биопрепаратах методом ЯМР-релаксации.

7.1. Влияние условий измерения на ЯМР-релаксационные характеристики биопрепаратов.

7.2. Состояние воды и сухого вещества в биопрепарате.

7.3. Влияние состава препарата на параметры ЯМР.

Глава 8. Контроль процесса хранения сухих препаратов методом ЯМР-релаксации.

8.1. Изменение ЯМР-параметров сухой биомассы при хранении.

8.2. Влияние температуры хранения и влажности образцов на параметры ЯМР.

8.3. Исследование сохраняемости сухих клеток в присутствии трегалозы.

8.4. Зависимость Ti от активности биопрепаратов. ф)

Глава 9. Контроль технологического процесса приготовления сухих препаратов методом ЯМР-релаксации.

9.1. Разные защитные среды.

9.2. Доля клеточной суспензии в препарате.

9.3. Отмывка клеточной биомассы.

9.4. Измельчение сухой биомассы.

9.5. Взаимосвязь активности сухих препаратов и времени спин-решеточной релаксации.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Начало всего во влаге: ведь она пронизывает собой все. Влага -вездесущая стихия: все происходит из воды и в воду же обращается. Вода как естественное начало оказывается носителем всех изменений и превращений.

Фалес, античный философ (цит. по [1])

Признанным способом сохранения биологических препаратов, например, живых бактериальных вакцин, является лиофилизация [2, 3, 4, 5]. Остаточная влажность в лиофилизированном материале служит основным показателем, характеризующим сохраняемость препарата в течение длительного времени. Несмотря на давние споры исследователей о величине оптимальной остаточной влажности [2, 6], этот вопрос до сих пор остается открытым. Определение остаточной влажности представляет некоторые трудности, связанные с очень небольшим количеством исследуемого образца, а также с гигроскопичностью биоматериала. Известные методы определения остаточной влажности (метод досушивания до постоянного веса, метод Фишера) в применении к биологическим материалам обладают лишь относительной точностью [2]. Поэтому данные об остаточной влажности можно сравнивать только в том случае, если они определяются одним и тем же методом.

Основным требованием к бактериальным препаратам является сохранение в течение срока годности максимального числа жизнеспособных микробов. Этот показатель характеризует активность живых вакцин, для измерения которой используются биологические методы [7, 8]. Биологические методы трудоемки и требуют больших затрат времени. Кроме того, при определении активности и остаточной влажности происходит разрушение образца, что делает невозможным проведение одновременного анализа этих показателей в одной и той же пробе. Контроль биопрепаратов в процессе хранения связан с отбором образцов, в результате чего происходит расходование биоматериала. При работе с живыми бактериальными вакцинами требуется также выполнение правил специальной техники безопасности: необходимо исключить прямой контакт исследователя с микроорганизмами.

Степень устойчивости микроорганизмов при лиофилизации в значительной степени зависит от природы веществ, входящих в состав защитных сред. Принято считать, что углеводы, в частности дисахариды, обеспечивают хорошую гидрофильностъ лиофилизированного образца, и их роль сводится к удерживанию части воды с целью не допустить пересушивания препарата [2]. В последнее время появились данные, свидетельствующие о другой функции Сахаров при высушивании бактерий, а именно их водозамещающей роли [9, 10]. Критерии подбора углеводов в составе защитных сред для лиофилизации клеток микроорганизмов до сих пор остаются невыясненными.

В последние десятилетия широкое применение в медицине получили методы ЯМР. Однако в биотехнологии уникальные возможности этих методов используются очень слабо или не используются вообще. Известны некоторые ЯМР способы определения влажности различных органических материалов [11]. К сожалению, очень мало данных об исследовании подвижности молекул воды и сухого матрикса в сухих препаратах, которые содержат бактерии [12]. Совсем отсутствуют работы по установлению связи числа жизнеспособных клеток в препаратах и технологических показателей производства с параметрами ЯМР. Уникальность методов ЯМР заключается в возможности их применения для контроля живых микроорганизмов в биотехнологическом цикле и конкретно для оценки качества готовой продукции и постадийного контроля полупродуктов [13]. Они обладают высокой информативностью, безвредны для живых организмов и безопасны для персонала при работе с патогенным материалом. Методы ЯМР хорошо поддаются автоматизации, являются быстрыми и неразрушающими. Многие проблемы, связанные с контролем основных показателей бактериальных препаратов, могут быть решены на основе использования уникальных возможностей методов ЯМР.

Цель настоящей работы. Цель настоящей работы заключается в экспериментальном обосновании применимости метода ЯМР-релаксации для оценки качества сухих биопрепаратов на основе живых микроорганизмов.

Основные задачи:

- разработать способ определения остаточной влажности сухих биопрепаратов методом импульсного ЯМР;

- найти критерий для максимального значения остаточной влажности сухих биопрепаратов методом ЯМР-релаксации;

- выявить ЯМР-релаксационные критерии качества сухих биопрепаратов;

- определить изменения параметров ЯМР и установить их взаимосвязь с биологической активностью сухих препаратов клеток микроорганизмов в процессе хранения;

- выявить возможности метода ЯМР-релаксации для контроля технологического процесса приготовления сухих препаратов клеток.

Научная новизна работы.

Методом ЯМР-релаксации впервые осуществлен одновременный контроль состояния остаточной влаги и состояния сухого вещества в биопрепаратах, которые содержат клетки микроорганизмов. Благодаря возможности регистрации сигнала ЯМР в нулевой момент времени найден способ определения остаточной влажности сухих препаратов. На способ получено авторское свидетельство на изобретение.

Впервые установлена взаимосвязь между остаточной влажностью и состоянием воды, а также сухого вещества в модельных системах и лиофильно высушенных препаратах клеток Escherichia coli и вакцинного штамма Francisella tularensis.

Впервые установлена взаимосвязь между числом жизнеспособных клеток в препаратах туляремийного микроба, Escherichia coli и временем спин-решеточной релаксации при хранении. Показана возможность определения количества прочносвязанной воды в сухих препаратах клеток вакцинного штамма Francisella tularensis методом ЯМР-релаксации.

Впервые показано возрастание подвижности протонов в сухой биомассе клеток вакцинного штамма Francisella tularensis, Sacch. cerevisiae и модельных системах при влагосодержании выше мономолекулярного слоя, что является причиной ускорения деструктивных реакций в системе и ухудшения способности препаратов к сохранению.

Экспериментально обнаружено увеличение влажности образцов, которые хранились в герметичных условиях при повышенной температуре.

Практическая значимость работы. Разработан способ определения остаточной влажности сухих препаратов импульсным методом ЯМР. Он дал практическую возможность получить принципиально новые данные о свойствах сухих биопрепаратов и установить практически значимые корреляции между характеристиками биоматериалов и параметрами, измеряемыми методом ЯМР-релаксации.

Найденные в работе корреляции между ЯМР-релаксационными, физико-химическими и биологическими характеристиками сухих биоматериалов могут быть использованы для оптимизации и контроля производственных процессов получения бактериальных препаратов, например, живых вакцин, а также пекарских и кормовых дрожжей, лекарственных средств, стабилизированных сахарами, а также пищевых продуктов.

Результаты настоящих исследований могут быть применены при подготовке к хранению и проверке сохраняемости музейных культур микроорганизмов без вскрытия ампул с лиофилизированным биоматериалом.

Результаты работы рекомендуется использовать в микробиологической, фармацевтической, пищевой промышленности и других отраслях народного хозяйства.

По результатам работы написаны четыре лабораторные методики, которые используются при исследованиях в ГНЦПМ и хранятся в его архиве.

Список документов о внедрении научных результатов в практику:

1. Методика лабораторная оценки качества сухих биопрепаратов методом

ЯМР. Оболенск, 1988.

2. Методика лабораторная определения остаточной влажности ионообменной смолы методом ЯМР. Оболенск, 1987.

3. Методика лабораторная определения остаточной влажности сухих препаратов на основе клеток вакцинного штамма 15/3 методом ЯМР.

Оболенск, 1988.

4. Методика определения влагосодержания БВК. Оболенск, 1991.

Положения, выносимые на защиту.

Разработка нового способа определения остаточной влажности сухих биопрепаратов методом ЯМР-релаксации.

Результаты исследования состояния воды и сухого вещества, а также оценка числа жизнеспособных клеток в сухих биопрепаратах методом ЯМР-релаксации.

Методология контроля качества сухих биопрепаратов методом ЯМР-релаксации.

Работа выполнена в лаборатории радиоспектроскопии Государственного научного центра прикладной микробиологии Минздрава РФ (Оболенск).

Апробация работы. Результаты работы доложены на итоговых научных конференциях ВНИИ прикладной микробиологии (п. Оболенск, 1978, 1980), П Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" г. Звенигород, 1981), VI конференции по спектроскопии биополимеров (г. Харьков, 1988), Отраслевом совещании "Методы магнитной радиоспектроскопии в биотехнологии" (п. Оболенск, 1990), ЕвропеЙско -Среднеазиатском Симпозиуме по биотехнологии (г. Анкара, 1995), Ш Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (г. Казань, 1996), IX конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии" (г. Звенигород, 1996), Юбилейной научной конференции ГНЦ ПМ "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" (п. Оболенск, 1999), Международной научной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (п. Оболенск, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, выводов (6 пунктов) и списка использованной литературы. Работа изложена на 145 страницах. Список цитируемой литературы включает 119 наименований, из них 65 - на русском, 54 - на английском языке. Иллюстративный материал содержит 31 рисунок и 19 таблиц.

ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый способ определения остаточной влажности сухих биоматериалов методом импульсного ЯМР. Он состоит в регистрации сигнала ССИ, определении соотношения амплитуд медленной и быстрой компонент этого сигнала в нулевой момент времени и нахождении влажности по калибровочному графику. Способ применен для определения остаточной влажности сухих препаратов клеток Saccharomyces cerevisiae и Francisella tularensis.

2. Методом ЯМР-релаксации определено количество прочносвязанной воды в сухих препаратах клеток, которое характеризует критический верхний уровень влажности препаратов. При влажности выше этого уровня в сухом материале обнаружено возрастание подвижности молекул, которое коррелирует с ухудшением сохраняемости биопрепаратов.

3. Выявлены ЯМР-релаксационные критерии качества сухих препаратов клеток. Наряду с физико-химическими и биологическими показателями, параметры Ti и Т2 рекомендуется использовать для оценки качества и прогнозирования сохраняемости биопрепаратов.

4. Установлена корреляция между логарифмом числа жизнеспособных бактерий в сухих препаратах клеток Е. coli, Francisella tularensis и временем спин-решеточной релаксации в процессе хранения. В интервале Ti от 200 до 500 мс эта связь носит линейный характер.

5. Экспериментально обнаружено возрастание влажности при длительном хранении лиофилизированных образцов в герметичной упаковке в условиях повышенной температуры.

6. Показано, что ЯМР-релаксационные характеристики сухих препаратов клеток зависят от степени отмывки клеточной биомассы, состава защитной среды, соотношения между количеством клеточной суспензии и защитных веществ в препарате, а также от измельчения сухого материала. Параметры ЯМР рекомендуется использовать для оптимизации технологического процесса приготовления биопрепаратов.

1. Спиркин А.Г. Философия М.: Гардарики, 2002. - 736 с.

2. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии -М.: Медгиз, 1961.-263 с.

3. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов М.: Медицина, 1969.-231 с.

4. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов М.: Колос, 1971. - 343 с.

5. Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования Киев: Наукова Думка, 1985. - 208 с.

6. Голдовский A.M. Анабиоз Л.: Наука, 1981. - 136 с.

7. Медуницын Н.В. Вакцинология М.: Триада-Х, 1999. - 272 с.

8. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов М.: Медицина, 1975. - 223 с.

9. Crowe J.H., Hoextra F.A. and Crowe L.M. Anhydrobios // Annu Rev Physiol. -1992. -V. 54.-P. 579-599.

10. Crowe J.H., Crowe L.M., Carpenter J.F. and Wistrom C.A. Stabilization of dry phospholipid bilayers and proteins by sugars // Biochem J 1987. - V. 242. -№ l.-P. 1-10.

11. Gambhir P.M. and A.K. Agarwala. Simultaneous determination of moisture and oil content in oilseeds by pulsed nuclear magnetic resonance // JAOCS. 1985 -V. 62. -№ l.-P. 103-108.

12. Волков В.Я. Радиоспекроскопические методы в биотехнологии бактериальных препаратов // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Материалы Юбилейной конф. ГНЦ прикладной микробиологии. Оболенск. 14 15 декабря 1999. - С. 52-87.

13. Волков В.Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию-высушиванию // Микробиология 1994. - Т. 63. - № 1. - С. 5-17.

14. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 с.

15. Block W. Water or ice? The challenge for invertebrate cold survival // Science

16. Progress. 2003. - V. 86. - № (1/2). - P. 77-101.

17. Бекер M.E. Торможение жизнедеятельности микроорганизмов обезвоживанием // Успехи микробиологии. 1972. - № 8. - С. 224-239.

18. Crowe J.H., Carpenter J.F. and Crowe L.M. The role of vitrification in anhydrobiosis // Annu Rev Physiol. 1998. - V. 60. - P. 73-103.

19. Siegele D.A. and R. Kolter. Life after log // J Bacteriol 1992. - V. 174. -P. 345-348.

20. Ураков H.H., Волков В.Я., Боровик P.B. Функциональное состояние и механизмы повреждения микроорганизмов в процессе приготовления бактериальных препаратов // Биотехнология. 1988. - Т. 4. - № 4. -С. 420-432.

21. Рапопорт А.И., Бекер М.Е. Влияние сахарозы и лактозы на устойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae к обезвоживанию // Микробиология. -1983. Т. 52 - № 5. - С. 719-722.

22. Franks F. Freeze-drying: from empiricism to predictability. The significance ofglass transitions // Dev Biol Stand. 1992. - V. 74. - P. 9-18.

23. Crowe L.M., Reid D.S. and Crowe J.H. Is trehalose special for preservation drybiomaterials? // Biophys J. 1996. - V. 71. - № 4. - P. 2087-2093.

24. Pnueli L., Hallak-Herr E., Rosenberg M., Cohen M. and Mittler R. Molecular andbiochemical mechanisms associated with dormancy and tolerance in the desert legume Retama raetum II The Plant Journal. 2002. - V. 31. - № 3. -P. 319-330.

25. Potts M. Dessication tolerance of prokaryotes // Microbiological Reviews. -1994. V. 58. - № 4. - P. 755-805.

26. Финкелыптейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка М.: Книжный дом «Университет», 2002. - 376 с.

27. Структура и стабильность биологических макромолекул: Пер. с англ. М.:1. Мир, 1973. 584 с.

28. Arakawa Т.J., Carpenter J.F., Kita Y.A. and Crowe L.M. The basis for toxicity ofcertain cryoprotectants: a hypothesis // Cryobiology. 1990. - V. 27. -P. 401-415.

29. Timasheff S.N. Protein solvent preferential interactions, protein hydration and the modulation of biochemical reactions by solvent components // Proc Natl Acad Sci USA. - 2002. - V. 99. - № 15. - P. 9721-9726.

30. Allison S.D., Manning M.C., Randolph T.W., Middleton K., Davis A. and Carpenter J.F. Optimization of storage stability of lyophilized actin using combinations of disaccharides and dextran // J Pharm Sci. 2000. - V. 89. -№.2.-P. 199-214.

31. Carpenter J.F., Martin В., Crowe L.M. and Crowe J.H. Stabilization phosphofructokinase during air-drying with sugars and sugar/transition metal mixtures // Cryobiology. 1987. - V. 24. - № 5. - P. 455-464.

32. Janiecke R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions // Eur J Biochem. 1991. - V. 202. - P. 715-728.

33. Otting J., Liepinsh E., and Wurthrich K. Protein hydration in aqueous solution //

34. Science. 1991. - V. 254. - P. 974-980.

35. Геннис P. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. с англ.1. М.: Мир, 1997.-624 с.

36. Ritter D. And Yopp J.H. Plasma membrane lipid composition of the halophiliccyanobacterium Aphanothece halophitica II Arch Microbiol 1993. - V. 159. -P. 435-439.

37. Феофилова Е.П., Терепшна И.М., Меморская A.C., Хохлова Н.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе липидов // Микробиология. — 2000. Т. 69. - № 5. - С. 612-619.

38. Pereira P.A.A., Oliver A., Bliss F.A., Crowe L.M. and Crowe J.H. Preservation ofrhizobia by lyophilization with trehalose // Res Agropec Bras 2002. - V. 37. -P. 831-839.

39. Tsvetkov Т., Tsonev L., Meranzov N. and Minkov J. Preservation of integrity ofthe inner mitochondrial membrane after freeze-thawing and freeze-drying // Cryobiology. 1985. - V. 22. - № 3. - P. 301-306.

40. Leslie S.B., Teter S.A., Crowe L.M. and Crowe J.H. Trehalose lowers membranetransitions in dry yeast cells // Biochem Biophys Acta. 1994. - V. 1192. - № 1. -P. 7-13.

41. Leslie S.B., Israeli E., Lighthart D., Crowe J.H. and Crowe L.M. Trehalose andsucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying // Appl EnvMicrob. 1995. - V. 61. -№ 10. - P. 3592-3597.

42. Crowe J.H., Tablin F., Wolkers W.F., Gousset K., Tsvetkova N.M. and Ricker J.

43. Stabilization of membranes in human platelets freeze-dried with trehalose // Chem Phys Lipids. 2003. - V. 122. - № 1-2. - P. 41-52.

44. Wolkers W.F., Looper S.A., McKiernan A.E., Tsvetkova N.M., Tablin F. and Crowe J.H. Membrane and protein properties of freeze-dried mouse platelets // Mol Membr Biol. 2002. - V. 19. - № 3. - P. 201-210.

45. Ricker J.V., Tsvetkova N.M., Wolkers W.F., Leidy C., Tablin F., Longo M. and

46. Crowe J.H. Trehalose maintains phase separation in air-dried binary lipid mixture // Biophys J. 2003. - V. 84. - № 5. - P. 3045-3051.

47. Sun W.Q., Leopold A.C., Crowe L.M. and Crowe J.H. Stability of dry liposomes in sugar glasses // Biophys J. 1996. - V. 70. - № 4. . p. 1769-1776.

48. Wolkers W.F., Tablin F. and Crowe J.H. From anhydrobiosis to freeze-drying ofeukaryotic cells // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2002. -V. 131.-№3.-P. 535-543.

49. Crowe J.H., Spargo B.J. and Crowe L.M. Preservation of dry liposomes does notrequire retention of residual water // Proc Natl Acad Sci USA. 1987. - V. 84. -№6.-P. 1537-1540.

50. Borle F. and Seelig J. Hydration of Escherichia coli lipids: deuterium T\ relaxation time studies of phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine // Biochim Biophys Acta. 1983. - V. 735. - P. 131-136.

51. Lee C.W.B., Waugh J.S. and Griffin R.G. Solid-state NMR of trehalose-sn-phosphatidylcholine interactions // Biochemistry. 1986. - V. 25.1. P. 3737-3742.

52. Tsvetkova N.M., Phillips B.L., Crowe L.M., Crowe J.H. and Risbud S.H. Effectof sugars on headgroup mobility in freeze-dried dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers: solid-state 31P NMR and FTIR studies // Biophys J. 1998. - V. 75. -№6.-P. 2947-2955.

53. Hoextra F.A. Membrane protection in dessication-tolerant organs of higher plants

54. Cryobiology. 1993. - V. 30. - P. 228-229.

55. Hoextra F.A., Crowe J.H., Crowe L.M., T. van Roekel and E. Vermeer. Do phospholipids and sucrose determine membrane phase transition in dehydrating pollen species // Plant Cell Environ. -1992. V. 15. - P. 601-606.

56. Duckworth R.B., Allison I.J. and Clapperton I.A. An aqueous environment for chemical change in intermediate moisture foods // Intermediate Moisture Food / Eds. Davies R., Birch G.L. and Parker K.H. London - Appl Sci Publ., 1976. -P. 89-99.

57. Crowe J.H. and Crowe L.M. Stabilization of membranes in anhydrobiotic organisms // Membranes, metabolism and dry organisms / Ed. A.C. Leopold. -Ithaca. -1 st ed. Cornell University Press., 1986. P. 188-209.

58. Carpenter J.F. Stabilization of proteins during freezing and dehydration: application of lessons from nature // Cryobiology. 1993. - V. 30. - P. 220-221.

59. Aguado M.T., Jodar L. and Lloyd J. Injectable solid vaccines: a role in future immunization? // WHO Drug Information. 1998. - V. 12. - № 2. - P. 2-4.

60. Белуков C.B., Платов Ф.В., Иванова В.Ю. Осмоадаптация дрожжей к условиям осмотического шока в процессе замораживания И Биотехнология. 1996. - № 8. - С. 53-54.

61. Eleuthereo E.C., P.S. de Araujo and Panek A.D. Role of the trehalose carrier indehydration resistance of Saccharomyces cerevisiae II Biochim Biophys Acta. -1993.-V. 1156.-P. 263-266.

62. Hincha D.K. and Crowe J.H. Trehalose increases freeze-thaw damage in liposomes containing chloroplast glycolipids // Cryobiology. 1998. - V. 36. -№ 3. - P. 245-249.

63. Breedveld M.W., Zevenhuizen L.P.T.M. and Zehnder A.J.D. Osmotically-regulated trehalose accumulation and cyclic p-(l,2)-glucan excretion by Rhizobium leguminosarum biovar trifoli TA-1 // Arch Microbiol. 1992. -V. 156.-P. 501-506.

64. Hincha D.K., Hellwege E.M., Heyer A.G. and Crowe J.H. Plant fructans stabilizephosphatidylcholin liposomes during freeze-drying // Eur J Biochem. 2000. -V. 267.-№2.-P. 535-540.

65. Shen В., Hofman S., Jensen R.G. and Bohnert H.J. Roles of sugar alcohols in osmotic stress adaptation. Replacement of glicerol by mannitol and sorbitol in yeast // Plant Physiol. 1999. - V. 121. - № 1. - P. 45-52.

66. Терешина И.М., Меморская A.C., Морозова E.B., Козлов В.П., Феофилова Е.П. Изменение в составе углеводов цитозоля спор грибов в связи с температурой обитания и в процессе хранения // Микробиология. -2000. Т. 69. - № 4. - С. 511-517.

67. Феофилова Е.П., Терешина И.М., Хохлова Н.С, Меморская А.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов цитозоля II Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. - С. 606-611.

68. Николаев Ю.А., Дж. И. Проссер, Панников Н.С. Внеклеточные факторы адаптации к неблагоприятным условиям среды в периодической культуре Pseudomonas fluoresceins II Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. -С. 629-635.

69. Tomczak M.M., Hincha D.K., Estrada S.D., Feeney R.E. and Crowe J.H. Antifreeze proteins differentially affect model membranes during freezing // Biochim Biophys Acta. 2001. - V. 1511. - № 2. - P. 255-263.

70. Tsvetkova N.M., Phillips B.L., Krishnan V.V., Feeney R.E., Fink W.H., Crowe J.H., Risbud S.H., Tablin F. and Yeh Y. Dynamics of antifreeze glycoproteins in the presence of ice // Biophys J. 2002. - V. 82. - № 1 (pt 1). — p. 464-473.

71. Danielli J.F. and Davson H. A Contribution to the theory of permeability of thinfilms // J Cell Comp Physiol. 1935. - V. 5. - P. 495-508.

72. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Успехи химии. -2002. Т. 71. - № 6. - С. 559-584.

73. Davis J.H. The description of membrane lipid conformation, order dynamics by2H-NMR // Biochim Biophys Acta. 1983. - V. 737. - P. 117-171.

74. Gaily H.U., Pluschke G., Overath P. and Seelig J. Structure of Escherichia coli membranes. Phospholipid conformation in model membranes and cells as studied by deuterium magnetic resonance I I Biochemistry. 1979. - V. 18. -P. 5605-5610.

75. Бекер M.E. Обезвоживание микробной биомассы и экстрацеллюлярных метаболитов Рига: Зинатне, 1967. - 364 с.

76. Волков В.Я., Сахаров Б.В. Способ определения количества и консистенциисырой биомассы. Авторское свидетельство № 1566274. // Бюлл. Изобретений. -1990. № 19. - С. 204.

77. Волков В.Я., Сахаров Б.В., Волкова Л.А. Природа повреждения и гибели бактерий F. tularensis при медленном замораживании // Проблемы криобиологии. 1991. - № 4. - С. 10-16.

78. Рыжов В.Г., Волков В.Я., Исангалин Ф.Ш. Способ определения осмотических свойств клеточных мембран. Авторское свидетельство № 1224693. // Бюлл. Изобретений. 1986. - № 14. - С. 182.

79. Сахаров Б.В., Волков В.Я. Проницаемость и повреждение мембран эритроцитов при температурах от -1 до -9 °С по данным метода ЯМР релаксации // Биофизика. 1984. - Т. 29. - № 2. - С. 264-267.

80. Волков В.Я., Сахаров Б.В., Волкова JI.A. Радиоспектроскопические методыв криобиологии // Криобиология. 1985. - № 4. - С. 3-10.

81. Булатов И.С., Нарышкина Е.П., Волков В.Я. Способ получения опорных сигналов в спектрах высокого разрешения. Авторское свидетельство № 1520415. // Бюлл. Изобретений. 1989. - № 41. - С. 191.

82. Булатов И.С., Нарышкина Е.П., Волков В.Я. Изменение внутриклеточного рН в Eschercihia coli после замораживания-оттаивания // Криобиология. — 1987. -№4. -С. 25-30.

83. Kutscher J, Hellebrand J. 'H-NMR investigation of seeds in dependence on watercontent // Studia biophysica (Berlin). 1986. - V. 111. - № 2-3. - P. 185-194.

84. Зверев JI.B., Прудников C.M., Витюк Б.Я., Джиоев Т.Е., Пан юшки н В.Т. Определение основных жирных кислот в масле подсолнечника методом ядерной магнитной релаксации // Журнал аналитической химии. 2001. -Т. 56.-№ 11.-С. 1173-1176.

85. Киселева Л.Ф., Николаев И.Ф., Грунин Ю.Б. и др. Сорбция воды хитинсодержащим материалом высших грибов // Структура и динамика молекулярных систем: Докл. VIII Всеросс. конф. 25-30 июня 2001 г. -Яльчик, 2001. С. 134-138.

86. Волков В.Я., Волкова Л.А., Большакова O.K. Кинетика образования свободных радикалов и сохраняемость бактериальных препаратов // Магнитный резонанс в биологии и медицине. Тезисы докл. УП Всес. конф. АН СССР. Май 1989. С. 58-59.

87. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии М.: Медицина, 1975. - 193 с.

88. Белки. В 3 т.: Пер. с англ. / Под ред. Г. Нейрата и К. Бэйли М.: ИЛ, 1958.1. Т. 3 4. 1.-С. 324.

89. Фаррар Т., Беккер Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР: Пер. с англ.- М.: Мир, 1973.- 164 с.

90. Вашман А.А., Пронин И.С. Ядерная магнитная релаксация и ее применениев химической физике — М.: Наука, 1970. 236 с.

91. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - С. 176-177.

92. Методические инструкции по применению физико-химических методов контроля медицинских биологических препаратов М.: Минздрав СССР, 1982.-14 с.

93. Вода в пищевых продуктах: Пер. с англ. / Под ред. Р.Б. Дакуорта М.: Пищевая промышленность, 1980. - 376 с.

94. Wexler A. and Brombacher W.G. Methods of measuring humidity and testing hygrometers // NBS Circular. 1951. - № 512.

95. Martin S. The control of conditioning atmospheres in small sealed chambers // J

96. Sci Instr. 1962. - V. 39. - P. 370.

97. Щепкин В.Д., Волков В.Я., Руденко Ю Г., Федюкина Г.Н., Иванников А.И.

98. Способ определения остаточной влажности в сухих веществах импульсным методом ядерного магнитного резонанса. Авторское свидетельство № 1497538. // Бюлл. Изобретений. 1989. № 28. - С.196.

99. Брунауэр С. Адсорбция газов и паров: Пер. с англ. М.: Государственноеиздательство иностранной литературы, 1948. 784 с.

100. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов: Учеб. для мед. спец. вузов / Под ред. Ю.А. Ершова. М.: Высшая школа, 1993. -560 с.

101. С. Van den Berg and S. Bruin. Water activity and its estimation in food systems:theoretical aspects // Water activity: influences on food quality. / Eds Rocland L B. and Stewart G.F. Acad. Press., 1981. - P. 1-61.

102. Грэг С., Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость: Пер. с англ.- М.: Мир, 1970.-408 с.

103. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии (Поверхностные явления и дисперсные системы): Учеб. для вузов М.: Химия, 1982. - 400 с.

104. Химическая энциклопедия: В 5 т. /Под ред. И.Л. Кнунянц. М. Большая Российская энциклопедия, 1998. - 5 т.

105. Калинкин Ф.Л, Лобов В.П., Жидков В.А. Справочник по биохимии Киев.:

106. Наукова думка, 1971. 1016 с.

107. Торможение жизнедеятельности клеток / Под ред. М.Е. Бекера. Рига: Зинатне, 1987. - 240 с.

108. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. В 3 т.: Пер. с англ. -М.: Мир, 1979.-3 т.

109. Молекулярная микробиология: Пер. с англ. / Под ред. Б.Н. Ильяшенко -М.: Мир, 1977.-520 с.

110. ОСТ 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. М, 2000. - 55 с.

111. ФС 3874-99. Физическо-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов.

112. Федюкина Г.Н., Щепкин В.Д., Куракина А.А., Волков В.Я. Свойства системы биополимер-дисахарид в условиях ограниченной влажности по данным ЯМР // VI конф. по спектроскопии биополимеров. Харьков: Изд-во ФТИНТ АН УССР, 1988. - С. 308.

113. Волков В.Я., Сахаров Б.В., Федюкина Г.Н. Исследование молекулярной подвижности Сахаров с защитными свойствами методом ЯМР-релаксации // Магнитный резонанс в химии и биологии: Тез. докл. IX конф. 27 мая — 2 июня 1996 г. Москва, 1996. - С. 27.

114. Мецлер Д. Биохимия: В 2 т.: Пер. с англ. М.: Мир, 1980. - 2 т.

115. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: В 3 т.: Пер. с англ. М.: Мир, 1981. - 3 т.

116. Ленинджер А. Биохимия: Пер. с англ. М.: Мир, 1976. - 957 с.

117. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. М.: Высшая школа, 1976.-412 с.

118. Duckworth R.B., С.Е. Kelly. Studies of solution processes in hydrated starch and agar at low moisture levels using wide line NMR // J Food Technology. -1973.-V. 8.-P. 105-113.

119. Duckworth R.B. Solute mobility in relation to water content and water activity // Water activity: influences on food quality / Eds Rocland L.B. and Stewart G.F. -Acad. Press., 1981. P. 295-317.

120. Бакиева Д.P. Структурно-сорбционные свойства льняных целлюлозных материалов: Автореф. дис. канд. техн. наук. Йошкар-Ола, 2003. - 21 с.

121. Аксенов С.И., Горячев С.Н., Шерман Ф.Б., Бабьева И.П., Решетова И.С. Об изолированной воде в высушенных микроорганизмах // Микробиология. -1978. Т. 47. - № 3. - С. 549-553.

122. Аксенов С.И., Николаев Г.М., Горячев С.Н. Изолированная подвижная вода как показатель устойчивости организмов к высушиванию //Торможение жизнедеятельности клеток. / Под ред. М.Е. Бекера. Рига: Зинатне, 1987. - С. 71-84.

123. Волков В .Я., Сахаров Б.В., Щепкин В.Д., Федюкина Г.Н., Кашуба А.А. О природе устойчивости клеток дрожжей к высушиванию // Микробиология. 1992. - Т. 61. - № 2. - С. 214-222.

124. Sano F., Asakawa N., Inoue Y. and Sakurai M. A dual role for intracellular trehalose in the resistance of yeast cells to water stress // Cryobiology. 1999. -V. 39. -J6 1.-P. 80-87.

125. Браун Д., Флойд А., Сейнзбери M. Спектроскопия органических веществ: Пер. с. англ. М.: Мир, 1992. - 300 с.

126. De Valdez G.F., De Jiori G.S., De Ruiz Holgado A.P., Oliver G. Effect of drying medium on residual moisture content and viability of freeze-dried lactic acid bacteria // Appl Environ Microb. 1985. - V. 49. - № 2. - P. 413-415.

127. Фабуляк Ф.Г. Молекулярная подвижность полимеров в поверхностных слоях Киев.: Наукова думка, 1983. - 144 с.