автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.07, диссертация на тему:Разработка биотехнологического метода получения водорода из CO-содержащих газов

На правах рукописи

00461 А

НОВИКОВ АНДРЕИ АЛЕКСАНДРОВИЧ

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРОДА ИЗ СО-СОДЕРЖАЩИХ ГАЗОВ

05.17.07 - Химическая технология топлива и высокоэнергетических веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2010

1 6 ЛЕИ 207О

004617671

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Винокуров Владимир Арнольдович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Туманян Борис Петрович

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ИОХ РАН Елисеев Олег Леонидович

Ведущая организация: Открытое Акционерное Общество

«Всероссийский Научно-исследовательский Институт по Переработке Нефти» (ОАО «ВНИИ НП»)

Защита диссертации состоится 28 декабря 2010 г. в Л -'часов в аудитории 541 на заседании диссертационного совета Д 212.200.04 при Российском государственном университете нефти и газа имени И.М. Губкина по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 65.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина.

Автореферат разослан «¿.в» ноября 2010

г.

Ученый секретарь Диссертационного советг Доктор технических наук, профессор

Общая характеристика работы Актуальность работы. Развитие мировой экономики стимулирует непрерывный рост энергопотребления, происходящий на фоне постоянного уменьшения запасов ископаемых топлив, являющихся основой современной энергетики. Это обуславливает постоянные попытки использования нетрадиционных возобновляемых источников энергии путем газификации сельскохозяйственных отходов, низкосортных топлив и т.п. Помимо этих процессов в развитии глобальной энергетики можно выделить еще одну важную тенденцию, связанную с «декарбонизацией энергоносителей». Речь идет о снижении содержания углерода в составе энергоносителей в расчете на единицу получаемой энергии. Исторически эта тенденция выглядит как последовательный переход в ряду

древесина —► уголь —> нефть —► природный газ —> водород Водород представляет собой экологически чистый и не содержащий углерода энергоноситель, который может быть использован непосредственно для генерации электроэнергии в мобильных и стационарных системах энергоснабжения с помощью топливных элементов.

В качестве сырья для производства водорода может служить синтез-газ, являющийся крупнотоннажным продуктом переработки природного газа. Синтез-газ также может быть получен конверсией попутного нефтяного газа, газификацией углеродсодержащих бытовых или промышленных отходов и низкосортных каменных углей, запасы которых значительно превосходят прочие запасы ископаемых углеводородов.

Традиционные термокаталитические методы переработки синтез-газа в водород осуществляются при высоких температурах и давлениях, а также требуют тщательной сероочистки сырья, что приводит к снижению энергоэффективности процесса. Кроме того, организация химических производств, основанных на термокаталитических процессах, практически невозможна в непосредственной близости к местам добычи углеводородного сырья. Для устранения этих недостатков проводятся исследования в области

альтернативных методов получения водорода.

3

Анаэробная ферментация синтез-газа с использованием штаммов термофильных бактерий, выделенных из наземных и подводных гидротерм, позволяет осуществить получение водорода в мягких условиях (температура менее 80 °С, атмосферное давление). Проведение процесса при таких условиях обеспечивает не только снижение энергозатрат, но и увеличение равновесного выхода водорода, а также делает возможным переработку низконапорных горючих газов.

Остаточная концентрация СО в газовой фазе может снижаться до нескольких ррт, таким образом, полученный водород после очистки от углекислого газа удовлетворяет высоким требованиям по чистоте и пригоден для использования в низкотемпературных СО-чувствительных топливных элементах с протон-проницаемыми мембранами.

Работы по культивированию термофильных гидрогеногенных микроорганизмов в биореакторах известны, однако ни в одной из них не проводилось изучение количественных характеристик процесса - степени конверсии и производительности реактора по водороду. Лабораторная практика культивирования микроорганизмов в герметичных сосудах с газовой фазой, содержащей монооксид углерода, в статическом режиме не позволяет адекватно оценить продуктивность микроорганизмов, и такое исследование должно было проводиться в условиях моделирования непрерывного промышленного процесса в биореакторе.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования явилась разработка биотехнологического метода получения водорода из СО-содержащих газов. Биотехнологический метод получения водорода может использоваться как для первичной переработки газов, полученных при пиролизе или конверсии органического сырья, так и для доочистки газовых смесей от монооксида углерода.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделение новых штаммов микроорганизмов, способных к эффективной трансформации монооксида углерода с получением водорода.

2. Разработка методики непрерывного культивирования микроорганизмов, способных к трансформации монооксида углерода с получением водорода.

3. Разработка методики контроля чистоты культуры микроорганизмов в условиях непрерывного культивирования в нестерильных условиях.

4. Определение конверсии и производительности по водороду биореакторов барботажного типа.

5. Проведение процесса микробиологического получения водорода в течение длительного времени для подтверждения стабильности культуры микроорганизмов.

Научная новизна. Впервые определены зависимости конверсии и производительности по водороду от величины расхода газа для биореакторов барботажного типа с использованием различных штаммов микроорганизмов в качестве биокатализаторов.

Выделен новый штамм микроорганизмов SET IS-9, являющийся биокатализатором реакции водяного газа и обладающий сопоставимыми с лучшими известными штаммами гидрогеногенных микроорганизмов скоростью роста и биокаталитической активностью.

По результатам фенотипических и филогенетических исследований выделенный штамм микроорганизмов SET IS-9 отнесен к новому виду бактерий рода Carboxydothermus.

Впервые показана возможность продолжительной генерации водорода в лабораторной установке при использовании в качестве биокатализатора выделенного штамма микроорганизмов SET IS-9.

Впервые определены хемотаксономические характеристики видов рода Carboxydothermus, применимые для экспресс-идентификации представителей рода и для контроля чистоты культуры микроорганизмов.

Практическая ценность. Определены требования к установкам для непрерывного культивирования строго анаэробных микроорганизмов, использующих газовые субстраты. Показана устойчивость культур

5

термофильных гидрогеногенных микроорганизмов к заражению посторонними микроорганизмами в условиях непрерывного культивирования в нестерильных условиях.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены в докладах и презентациях на российских и зарубежных научных конференциях: XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009 г.), а также на VIII Всероссийской конференции молодых ученых, специалистов и студентов «Новые технологии в газовой промышленности».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах и включает 18 рисунков и 7 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, приложений, списка литературы, включающего 110 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность и перспективность проведенных исследований, связанных с получением водорода из газов с различным содержанием монооксида углерода, указаны возможные области применения получаемого водорода, а также возможные источники получения СО-содержащих газов.

Первая глава посвящена обзору литературы по современному состоянию изучаемых проблем и анализу результатов исследований в области получения водорода с помощью микроорганизмов.

Анализ литературных данных показал, что способностью перерабатывать монооксид углерода обладают представители различных таксономических групп микроорганизмов: метаногенных архей, мезофильных и термофильных гомоацетогенных бактерий, термофильных гидрогеногенных бактерий, гипертермофильных гидрогеногенных архей. Образование водорода становится

возможным при анаэробном усвоении монооксида углерода микроорганизмами.

Ключевыми ферментами анаэробных карбоксидотрофных микроорганизмов являются №,Ре-содержащие СО-дегидрогеназы. С их помощью микроорганизмы осуществляют получение энергии и ассимиляцию углерода по метаболическому пути Вуда-Люнгдаля (также известному как ацетил-КоА путь).

Процесс окисления СО протекает в []\П-4Ре-55] активном центре фермента СО-дегидрогеназы термофильных карбоксидотрофных бактерий. Как показано в ряде кристаллографических исследований, каталитический цикл включает четыре стадии: присоединение молекулы СО, перенос протона на имидазольный цикл гистидина-93, отщепление молекулы С02 и двух протонов, перенос пары электронов на внешний акцептор (ферредоксин). На рисунке 1 представлен каталитический цикл окисления СО:

к/

.......Ni"

/

..S(C8,„)

Р

н,.

HsNjKKS)

WW

К /

,S(C,rJ UN.

ОН .

f„' >'.'• K-,!

IV

I /

OH ....

J. HM»>

^"SlCjJ N!H..,,|

НгО --

/' / I,

I jfi* ndw III

Рисунок 1 - Каталитический цикл окисления СО в кластере С фермента CODHII бактерий Carboxydothermus hydrogenoformans по материалам Дзюнга и Доббека (2007, Science)

Наибольшими скоростью роста и ожидаемой производительностью по водороду среди гидрогеногенных микроорганизмов обладают термофильные анаэробные бактерии. Однако, работы по определению конверсии и производительности по водороду при культивировании таких микроорганизмов в непрерывном режиме неизвестны.

Проведение экспериментальных исследований в области получения водорода с помощью термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов должно способствовать получению информации о реально достижимой производительности по водороду биотехнологических установок, а также уточнению оптимальных условий проведения микробиологической реакции водяного газа.

Во второй главе представлено описание лабораторных установок, методик проведения экспериментальных исследований, применяемых методов анализа и методов обработки полученных результатов.

Объектами исследований служили образцы воды, обрастаний и осадков из гидротерм Исландии, Байкальской рифтовой зоны и полуострова Камчатка, а также культуры термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов.

Культивирование накопительных и чистых культур гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот проводили в анаэробно приготовленной жидкой среде в атмосфере, содержащей 100 % СО. Базовая минеральная среда №1 для культивирования пресноводных карбоксидотрофов имела следующий состав (г/л): Ш4С1 - 0,66; МбС12-6Н20 - 0,16; СаС12-2Н20 - 0,10; КС1 - 0,33; КН2Р04 -0,33; №НСОз - 0,50. В среду добавляли 1,0 мл/л раствора витаминов, 1,0 мл/л раствора микроэлементов. Среду восстанавливали добавлением Ыа28-9Н20 (1,0 г/л). В ряде случаев в среду вносили дрожжевой экстракт (0,2 г/л).

В опытах по непрерывному культивированию на установке в исполнении 1 использовалась среда №2: ЫН4С1 - 1,50 г/л, М§804-7Н20 - 0,20 г/л, СаС12-2Н20 - 0,02 г/л, КН2Р04 - 0,10 г/л, К2НР04 - 0,50 г/л, ЫаС1 - 0,50 г/л, добавлялся также резазурин до заметного голубого окрашивания. В качестве восстанавливающего агента использовался дитионит натрия, добавляемый малыми порциями до достижения значения ОВП ниже -300 мВ.

8

Способность выделенных штаммов расти на сбраживаемых субстратах проверяли в атмосфере азота на среде №1. Потенциальные субстраты роста, доноры и акцепторы электронов вносили в конечной концентрации 2,0 г/л. До нужного значения рН доводили с помощью 6М НС1 или 6М NaOH, после чего под током азота разливали среду по пробиркам и флаконам с герметично закрывающимися крышками. Затем газовую фазу во флаконах полностью замещали СО. Среды стерилизовали автоклавированием при 1,0 или 0,5 (при наличие в среде S0) ати. Рост СО-окисляющих прокариот оценивали по убыли СО в газовой фазе и образованию Н2 и С02, наблюдая рост микроскопически.

Чистые культуры гидрогеногенных карбоксидотрофов получали методом предельных разведений, с последующим высевом на твердые среды для получения отдельных колоний. Использовали так называемые "roll tubes" -герметично закрытые пробирки Хангейта с нанесенной на стенки средой, содержащей 3,0 % агара в атмосфере 100 % СО. Среда распределялась по стенкам пробирок Хангейта путем охлаждения расплавленной среды при вращении пробирок. Для получения клеточной массы культивирование проводили в герметично закрытых бутылях из боросиликатного стекла (пирекс) объемом 1000 мл при соотношении жидкой и газовой фазы 1:4, или в изготовленной установке культивирования строго анаэробных микроорганизмов. Клетки хранили при -18 °С под азотом.

Определение продуктов метаболизма (С02, Н2) и СО проводили методами газовой хроматографии с использованием детектора по теплопроводности и пламенно-ионизационного детектора. Определение спиртов (этанол, бутанол) производили также методом газовой хроматографии (вносили 5,0 мкл подкисленного центрифугата; колонка Porapak Q, 3 м х 3 мм, детектор ПИД). В опытах по определению конверсии монооксида углерода и производительности биореактора по водороду концентрации газов определялись по методу внешнего стандарта.

Микроскопия. Наблюдение за ростом и определение концентрации клеток проводили методом прямого подсчета с помощью фазово-контрастной световой микроскопии при общем увеличении ЮООх.

9

Удельную скорость роста ц (ч'1) вычисляли по формуле: ц = lnlO • (lgB-lgA) / (tî-ti), где

t|, ti - начальные и конечные значения времени, ч;

А, В - концентрация клеток в начальное и конечное значение времени, кл/мл;

Морфологию клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и негативного контрастирования уранилацетатом, с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100B (Jeol, Япония).

Жирнокислотный состав клеток определяли путем получения экстрактов метиловых эфиров жирных кислот клеток согласно инструкциям к приборам MIS: биомассу микроорганизмов отделяли центрифугированием, омыляли действием метанольного раствора щелочи при нагревании на кипящей водяной бане, затем подкисляли раствор и выдерживали в течение 10 минут при 80 °С для осуществления процесса этерификации солей жирных кислот, полученные метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали смесью н-гексана и МТБЭ (1:1), экстракты промывали водным раствором щелочи, фильтровали через фторопластовый фильтр с порогом отсечения 0,2 мкм, анализировали методами ГХ-МС на приборе Thermo Scientific Trace GC Ultra DSQ II (производили вкол 1 мкл экстракта в инжектор при температуре 280 °С и сплит-потоке 20,0 мл/мин, расход газа 1,2 мл/мин, колонка TR-5MS, 15 м х 0,25 мм, с программированием температуры термостата колонок 5 мин при 120 °С, нагрев со скоростью 10 °С/мин до 250 °С, 3 мин при 250 °С, нагрев со скоростью 20 °С/мин до 300 °С, 1,5 мин при 300 °С, температура трансфер-лайна 300 °С, ионизация электронным ударом 70 эВ). Относительное содержание жирных кислот определяли как отношение площадей пиков компонентов по полному ионному току к сумме площадей пиков.

Состав полярных липидов определяли с помощью экстрагирования по модифицированной методике Блая-Дайера и двумерной тонкослойной хроматографии с помощью смеси CHCI3-CH3OH-H2O (65:25:4) в первом направлении и с помощью смеси CHCI3-CH3OH-CH3COOH-H2O (80:12:15:4) во

втором направлении. Проявление хроматограмм осуществляли с помощью опрыскивания спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты.

Выделение ДНК проводили модифицированными методами Мармура или Бирнбойма-Доли с применением технологии фирмы Ргогг^а (США). Определение содержания Г+Ц пар оснований в ДНК проводили по кривым плавления.

Для культивирования микроорганизмов в непрерывном режиме первоначально была использована установка на основе барботажного биореактора с мешалкой общим объемом Юл. Биореактор был дооснащен необходимыми средствами измерения и обеспечения безопасности: датчиками рН и ОВП, измерителем-регулятором расхода газа, циркуляционным термостатом с ПИД-регулятором, датчиком утечки СО с порогом срабатывания 50 ррт СО. Внешний вид установки показан на рисунке 2 (слева).

Рисунок 2 - Установка для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнениях 1 и 3

Был произведен ряд запусков биореактора с использованием в качестве инокулята культур микроорганизмов штамма SET IS-9T. Несмотря на замену

всех полимерных газовых коммуникаций на металлические и на варьирование состава среды и объема посевного материала, достичь значительных концентраций клеток в реакторе и конверсии монооксида углерода не удалось. Всего было произведено 7 ферментаций, сопровождающихся модифицированием устройства реактора и методики проведения эксперимента. Максимальная достигнутая численность клеток в биореакторе составила 3,0107 кл/мл.

Для того, чтобы устранить влияние предполагаемых ингибирующих факторов, была проведена кардинальная модернизация установки и методики проведения эксперимента: было решено отказаться от использования измерительных электродов и дитионита натрия в качестве восстановителя среды, биореактор был удален из конструкции установки, вместо него была установлена термостатируемая барботажная колонна емкостью 150 мл, выполненная из боросиликатного стекла «пирекс». Вместо среды №2 использовался непосредственно посевной материал, предварительно наращиваемый в количестве 150 мл в бутылях из боросиликатного стекла емкостью 1000 мл. В результате была создана установка для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 2.

Для достижения измеримых значений конверсии и производительности установки была произведена замена барботажной колонны на аналогичную по устройству, но превосходящую первую по высоте. Максимальный рабочий объем реактора составил 500 мл, а высота водяного столба - 760 мм. Дальнейшие эксперименты проводились на этой установке. Установка для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 3 показана на рисунке 2 (справа).

В третьей главе представлены результаты экспериментальных исследований.

Для выделения новых термофильных карбоксидотрофов были использованы наиболее перспективные пробы, собранные сотрудниками ИНМИ РАН имени С.Н. Виноградского в экспедициях в различные природные гидротермальные зоны: образцы «черных курильщиков» со Срединно-

12

Атлантического хребта, пробы из горячих источников Камчатки, Исландии, Байкала. В таблице 1 приведены характеристики природных образцов, использованных для выделения микроорганизмов, катализирующих реакцию водяного газа.

Таблица 1 - Источники проб, использованных для выделения термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов___

№ пробы Название гидротермального поля Т, °С рН (н/о - не определя лея) Описание пробы

1634 п-ов Камчатка, Долина Гейзеров 58 н/о сильно газированный источник

1934 п-ов Камчатка, Долина Гейзеров 65 н/о бурые нитевидные обрастания

Ь6 Исландия, долина Яеу1фс)а1иг 55 6,0 серые нитевидные обрастания

Ь 9 Исландия, область Нуега§егсП 68,6 6,5 серые нитевидные обрастания

УЗ Исландия, долина вгеепсЫиг 68,570,0 7,5 «кипящая» вода, серые обрастания

V 5 Исландия, долина Яеу1ф<1а1иг 66 6,5 серые нитевидные обрастания

1803 Байкал, поле «Алла», горячие выходы между камнями, источник №В35 67,8 8,3 зеленые и розовые цианобактериаль'ные маты

1813 Байкал, поле «Уринский», горячие выходы между биотитовых гранитов 62,5 7,7 розовые нитевидные обрастания под камнями

Т\У Томская обл., Парабельская нефтеразведочная скважина 50-60 н/о вода из скважины

Т8 Томская обл., Парабельская нефтеразведочная скважина 50-60 н/о слизь из ванны с геотермальной водой

1905 п-ов Камчатка, Паужетская геотермальная электростанция 65 5,0 цианобактериальные маты, покрытые водой

1906 п-ов Камчатка, Паужетская геотермальная электростанция 76 5,0 зеленый цианобактериальный мат, жидкая грязь, ил

1913 п-ов Камчатка, Паужетская геотермальная электростанция 67 5,0 серая жидкая глина, остатки растений

1915 п-ов Камчатка, Паужетская геотермальная электростанция 67 5,3 цианобактериальный мат у отдельного выхода вод на изливе кипящей площадки

Из ряда исследованных источников были получены накопительные культуры, использующие СО. К сожалению, ни в одном из исследованных образцов не было обнаружено накопление этанола или бутанола. Выделение

13

новых термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов, являющихся продуцентами спиртов (если таковые существуют в природе), остается важной микробиологической задачей ввиду их значительного биотехнологического потенциала.

Из всех исследованных пресноводных накопительных культур устойчивое образование водорода при последовательных пересевах наблюдалось в образцах IS-9, V5, 1905 и 1906. При попытке выделить чистые культуры микроорганизмов, продукция водорода была отмечена только в разведениях и «roll tubes» с образцами IS-9. Морфология клеток в накопительной культуре была однородна, клетки представляли собой короткие палочки. Чистая культура SET IS-9T была получена чередованием метода предельных разведений и метода выделения отдельных колоний на агаризованной среде. Клетки представляют собой короткие палочки, подвижные при помощи перитрихиально расположенных жгутиков, как показано на рисунке 3.

Рисунок 3 - Морфология штамма SET IS-9 , увеличение 8000х, для масштаба приведен отрезок 1 мкм

Штамм SET IS-9T рос при температуре от 50 до 70 °С, что иллюстрируется зависимостью удельной скорости роста от температуры, как показано на рисунке 4.

- 0,40 -т 'х

я 0,35 н о

О 0,30

Q.

и 0,25 -о

о. 0,20 -о

о 0,15 -

0ч

г 0,10 -л

§ 0,05 -

5

^ о,оо 4

45,0 50,0 55,0 60,0 65,0 70,0 75,0 Температура, °С

Рисунок 4 - Зависимость удельной скорости роста штамма SET IS-9T от температуры

Как видно из рисунка 4, для проведения реакции водяного газа с использованием микроорганизмов SET IS-9T оптимальной является температура 65 °С.

Штамм SET IS-9T рос при рН от 5,0 до 8,0, что иллюстрируется зависимостью удельной скорости роста от рН, как показано на рисунке 5.

, 0,40 £ 0,35

0 0,30 Q.

1 0,25 о

а 0,20 о

о 0,15

5 0,10

л

§ 0,05 * 0,00

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 РН

Рисунок 5 - Зависимость удельной скорости роста штамма SET IS-9T

от рН

Как видно из рисунка 6, предпочтительный интервал рН биологического раствора при проведении реакции водяного газа с использованием микроорганизмов SET IS-9T находится в границах от 5,5 до 6,0.

Рост не наблюдался при 45 °С или 75 °С и при рН 4,5 или 8,5. Штамм SET IS-9T рос на 100% СО хемолитоавтотрофно, образуя эквимолярные количества Н2 и С02 в соответствии с уравнением СО + Н20 —> С02 + Н2. Другие продукты метаболизма не были обнаружены. Время удвоения при оптимальных условиях роста на 100% СО составляло 2,0 часа. Рост, образование водорода и потребление монооксида углерода штаммом SET IS-9T в статических условиях показаны на рисунке 6. Содержание газов на рисунке показано как количество вещества в газовой фазе (ммоль), отнесенное к объему жидкой фазы (мл).

0,25

0,20 -

s 0,15-

® 0,10 -

6 0,05 -

0,00

Рисунок 6 - Динамика роста штамма SET IS-9 на жидкой минеральной среде без дрожжевого экстракта в атмосфере 100% СО при 65 °С, рН 6,5. □ -концентрация клеток; ▲ - содержание водорода; ■ - содержание СО

Как видно из рисунка 6, содержание СО при продолжительных экспериментах в статических условиях может снижаться до значений порядка

53 мкмоль/л, что соответствует концентрации СО в газовой фазе на уровне 200300 ррт.

Был проверен рост штамма SET IS-9T на Н2+С02 (80% Н2) и на ряде субстратов: пирувате, глюкозе, целлобиозе, сахарозе, галактозе, лактозе, фруктозе, крахмале, глицерине, формиате, ацетате, пептоне, дрожжевом экстракте, лактате, этаноле, метаноле в присутствии или в отсутствие дрожжевого экстракта. Рост наблюдался на лактате или пирувате в присутствии дрожжевого экстракта. В процессе сбраживания пирувата образовывались ацетат, С02 и водород. Использование микроорганизмами SET IS-9T пирувата в качестве источника углерода и энергии позволяет осуществлять наращивание микроорганизмов без использования монооксида углерода, что может быть весьма удобно при наработке посевного материала для пилотных и промышленных установок.

Пенициллин, ампициллин, оксациллин, стрептомицин полностью подавляли рост и окисление СО. Этот факт позволяет производить прекращение жизнедеятельности микроорганизмов SET IS-9T если по каким-то причинам такая необходимость возникнет в ходе осуществления биотехнологического процесса.

Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК составляло 37,7±1,0 мол %. Анализ последовательности нуклеотидов в 16S рРНК гена показал, что штамм SET IS-9T наиболее близок к видам рода Carboxydothermus. Сходство SET IS-9T с С. siderophilus 1315т составляет 94.3% с учетом вставок/делеций или 97.3% без учета, с С. hydrogenoformans Z-29011 - 96,6 и 97,0%, с С. ferrireducens JW/AS-Y71 - 95,5 и 96,5%, соответственно. Филогенетическое положение нового вида показано на рисунке 7.

if

50

8 4, C.hydrogenoformans Z-2901T-2 78 C.hydrogenoformans Z-2901T-3 C.hydrogenoformans Z-2901T-4

52

eat

— — C.siderophilus 1315T

-strain SET IS-9T

-Moorella thermoacetica ATCC 39073

-Caldanaerobactersubterraneus

ssp. pacificus JMT

0.02

Рисунок 7 - Филогенетическое положение SET IS-9

Представленная на рисунке 7 дендрограмма построена методом «neighbor-joining» и показывает положение SET IS-9T относительно других видов рода Carboxydothermus. Дендрограмма является частью более крупной дендрограммы, построенной на основе сравнения последовательностей генов 16S рРНК типовых штаммов видов рода Carboxydothermus и типовых штаммов видов гидрогеногенных карбоксидотрофов, принадлежащих Firmicutes, Moorella thermoacetica ATCC 39073 была выбрана как организм сравнения. C.hydrogenoformans Z-2901T-l,-2,-3,-4 - это 4 копии гена 16S рРНК, обнаруженные в полном геноме. Значения сходства последовательности нуклеотидов 16S рРНК гена нового изолята с известными видами рода Carboxydothermus позволяют считать его представителем нового вида этого рода, что подтверждается его фенотипическими отличиями от известных трех видов рода Carboxydothermus. Новый вид был назван по месту выделения -"Carboxydothermus islandicus ".

Для получения дополнительного подтверждения отнесения штамма SET IS-9T к новому виду было произведено определение некоторых хемотаксономических характеристик видов рода Carboxydothermus. В соответствии с предложениями ведущих микробиологов, с 2010 года жирнокислотный состав и состав полярных липидов включены в число характеристик, требуемых для валидного описания новых таксонов. Кроме того, с помощью современных методик возможно осуществить экспресс-определение липидного состава микроорганизмов менее чем за 20 минут, что

уже в ближайшем будущем позволит производить экспресс-идентификацию микроорганизмов на основании хемотаксономических характеристик.

Был определен состав полярных липидов клеток штамма SET IS-9T и двух видов рода Carboxydothermus. Межвидовые отличия состава полярных липидов незначительны. Полярные липиды исследованных представителей рода Carboxydothermus представлены, главным образом, единственным фосфолипидом. Прочие полярные липиды (3-5 веществ) образуются клетками в значительно меньшем количестве и детектируются с помощью фосфорномолибденовой кислоты только на грани разрушения пластинки ТСХ.

Был определен жирнокислотный состав клеток штаммов SET IS-9T, С. hydrogenoformans Z-29017 и С. ferrireducens JW/AS-Y7T. Жирнокислотный состав клеток микроорганизмов может быть использован для различения видов в пределах рода, а также для контроля чистоты культур микроорганизмов. Результаты жирнокислотного анализа клеток приведены в таблице 2 (при удельном содержании какого-либо компонента менее 1 мольн. % оно указано как «следы»).

Таблица 2 - Жирнокислотный состав клеток бактерий рода Carboxydothermus

Компонент С. hydrogenoformans Z-29017 С. ferrireducens JW/AS-Y77 ЗЕТК-Э1 (при росте на СО) ЗЕТ 15-9' (при росте на пирувате)

Cl2;0 изо 6,7 - 1,0 1,0

Cl4:0 11,3 7,4 143 25,6

С 15;0 ИЗО 30,1 30,8 20,7 12,4

Ci5:o антеизо 9,8 8,6 1Д 4,1

С]4;о DMA следы 1,4 следы 1,8

С]5:0 23 1,9 4,5 1,0

Сил iso DMA следы 1,0 следы 1,6

С 1б;0 амин следы 1,2 следы следы

Си.о ИЗО 3,9 2,4 3,6 следы

Cl6:0 20,2 24,4 41,9 26,2

Cl6:0 ИЗО DMA 3,7 9,3 5,8 21,8

С17:0 ИЗО 2,8 1,5 1,5 следы

С 17;о антеизо 3,2 следы следы -

С 18:0 DMA 1 следы 1,8 следы следы

Cl8:0 DMA 2 - 1,9 следы следы

С|8:0 3,0 1,0 2,0 1,8

С 19.0 алкан следы следы следы 1,2

Из таблицы 2 видно, что жирнокислотный состав клеток бактерий довольно сильно зависит от условий культивирования. Тем не менее, межвидовые отличия в данном случае оказываются существенней: штамм SET IS-9T по сравнению с прочими видами рода характеризуется более высоким содержанием миристиновой и пальмитиновой жирных кислот (С^ о и Ci6:o), и в то же время менее высоким содержанием изо-пентадециловой и антеизо-пентадециловой жирных кислот (С^о изо и С15 о антеизо). Приведенные отличия штамма SET IS-9T превосходят различия между известными видами рода Carboxydothermus и могут служить подтверждением отнесения штамма SET IS-9T к новому виду в пределах рода.

На изготовленной установке в исполнении 3 было произведено исследование наиболее изученных гидрогеногенных микроорганизмов С. hydrogenoformans Z-29011 при температуре 70 °С с использованием 100 % СО в качестве газа на входе. Результаты определения зависимости конверсии и производительности биореактора по водороду от расхода газа показаны на рисунке 8.

л Конверсия ■ Производительность-|

Рисунок 8 - Зависимость конверсии и производительности биореактора по водороду от расхода газа при культивировании бактерий С. Иу^^епо/огтат г-2901т на 100 % СО

Как видно из рисунка 8, максимальная конверсия монооксида углерода, равная 94 %, достигается при расходе 2,0 мл/мин. Максимальная производительность биореактора по водороду достигается при расходах газа свыше 78 мл/мин. Предпочтительный режим работы биореактора, таким образом, предусматривает проведение процесса при расходах газа от 2,0 до 78 мл/мин, что соответствует условным временам контакта от 250 мин до 5,13 мин.

На установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 3 было также произведено культивирование микроорганизмов SET IS-9T при температуре 65 °С с использованием 100 % СО в качестве газа на входе. Результаты определения зависимости конверсии и производительности биореактора по водороду от расхода газа показаны на рисунке 9. После первых 110 часов культивирования при наполнении реактора на 250 мл (знаки «Конверсия (0,5)» и «Производительность (0,5)» на рисунке) было произведено добавление среды №1 до полного заполнения реактора (знаки «Конверсия (1,0)» и «Производительность (1,0)» на рисунке).

водороду от расхода газа при культивировании бактерий SET IS-9T на 100 % СО

Как видно из рисунка 9, максимальная конверсия монооксида углерода, равная 86 %, достигается при расходе 1,0 мл/мин. Максимальная производительность биореактора по водороду достигается при расходах газа свыше 83 мл/мин. Предпочтительный режим работы биореактора, таким образом, предусматривает проведение процесса при расходах газа от 1,0 до 83 мл/мин, что соответствует условным временам контакта от 500 мин до 4,82 мин. При загрузке реактора на половину объема наблюдается незначительное повышение производительности реактора по водороду при малых расходах газа, сопровождающееся, однако, снижением степени конверсии.

На установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 3 было также произведено культивирование микроорганизмов SET IS-9T при температуре 65 °С с использованием газовой смеси 25 % СО + Н2 в качестве газа на входе. Результаты определения зависимости конверсии и производительности биореактора по водороду от расхода газа показаны на рисунке 10. Белыми знаками на рисунке показаны значения, полученные для концентрации клеток в реакторе, равной 2,6-108 кл/мл. Черными знаками на рисунке показаны значения, полученные при концентрации клеток в реакторе, равной 5,1-10® кл/мл.

Рисунок 10 - Зависимость конверсии и производительности биореактора по водороду от расхода газа при культивировании бактерий SET IS-9T на газовой

смеси 25 % СО + Н2

Как видно из рисунка 10, максимальная конверсия монооксида углерода, равная 48,3 %, достигается при минимальном испытанном расходе, равном 3,1 мл/мин. Максимальная производительность биореактора по водороду достигается при расходах газа свыше 85,1 мл/мин. Предпочтительный режим работы биореактора, таким образом, предусматривает проведение процесса при расходах газа от 3,1 до 85,1 мл/мин, что соответствует условным временам контакта от 161 мин до 5,88 мин. Из рисунка 10 также видно, что повышение концентрации клеток микроорганизмов с 2,6-108 до 5,1-108 кл/мл (т.е., почти в два раза) не оказывает существенного влияния на характеристики процесса, что является свидетельством лимитирования реакции процессами массопереноса и диффузии и возможности дальнейшего увеличения производительности и конверсии за счет совершенствования аппаратурного оформления процесса.

Отмеченное снижение конверсии и производительности реактора по водороду при использовании в качестве субстрата газовой смеси 25 % СО + Н2 говорит о необходимости совершенствования конструкции реактора с целью интенсификации массообмена для получения на выходе газа с низким содержанием монооксида углерода либо о предпочтительности проведения процессов доочистки газов от СО путем осуществления микробиологической реакции водяного газа в периодическом режиме.

Следует отметить, что процесс культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в непрерывном режиме на установке в исполнениях 2 и 3 проводился в нестерильных условиях в течение длительного времени (до 128 ч для С. hydrogenoformans Z-2901T и до 201 ч для SET IS-9T). Стабильность концентрации клеток и визуальная однородность культуры во время культивирования, подтверждаемые микроскопией проб из реактора, говорят о том, что процесс микробиологического получения водорода из СО-содержащих газов не требует предварительной стерилизации биореактора и поддержания асептических условий во время культивирования, что повышает энергоэффективность биотехнологического процесса и выгодно отличает его от аналогов с применением мезофильных микроорганизмов. Выдерживание

23

биологического раствора с клетками штамма SET IS-9T при температуре 4 °С в течение суток привело к появлению в культуре подвижных палочкообразных клеток, превосходящих по длине и толщине клетки SET IS-9T, в том числе спорообразующих. Был определен жирнокислотный состав клеток такой загрязненной культуры. В таблице 3 приведен жирнокислотный состав клеток штамма SET IS-9T при культивировании в статических условиях, при культивировании в реакторе, а также при заражении культуры.

Таблица 3 - Жирнокислотный состав клеток бактерий SET IS-9T (компоненты содержанием во всех образцах менее 1 мольн. % не приведены)_^_

Компонент SET IS-91 (при росте в статических условиях) SET IS-9T (при росте в реакторе) SET1S-91 (при росте в реакторе и заражении)

С|0:0 3-ОН - - 1,98

С]2:0 ИЗО 1,0 - -

С 12:0 - 2,77 2,67

Сию 2-ОН - - 1,08

Сил 3-ОН - . следы

Cl4:0 14,3 5,22 5,03

С 15:0 изо 20,7 2,29 2,20

Сио антеизо 1,1 3,81 3,67

С|4:о DMA следы 2,47 2,38

Cl5:0 4,5 12,15 11,70

Cl6:0 изо 3,6 2,95 2,84

С,ftl И9 - 26,30 25,34

Clf,:o 41,9 20,75 19,99

С 16:0 ИЗО DMA 5,8 - -

Cl6:0 DMA - 2,94 2,83

Си о ИЗО 1,5 следы следы

ClülCOll - 12,26 11,81

Cl8:0 2,0 - -

. Как видно из таблицы 3, появление гидроксилированных жирных кислот может свидетельствовать о заражении культуры микроорганизмов рода СагЪохуйойкгтт. Метод определения жирнокислотного состава клеток микроорганизмов, использующихся в качестве биокатализаторов реакции водяного газа, может служить для контроля чистоты культуры.

выводы

1. Выделен новый штамм термофильных карбоксидотрофных гидрогеногенных микроорганизмов SET IS-9T, отнесенный к новому виду "Carboxydothermus islandicus" на основании результатов микробиологических и филогенетических исследований.

2. Впервые исследован жирнокислотный состав клеток бактерий рода Carboxydothermus', выявлены межвидовые различия, которые могут служить для различения видов в пределах данного рода.

3. Впервые исследованы зависимости конверсии и производительности биореактора по водороду при культивировании бактерий Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901т и SET IS-9T. Установлено, что производительность по водороду может достигать 2 М3в0д0р0да/(м3реа1стора"Ч) при условном времени контакта менее 5,13 мин для бактерий Carboxydothermus hydrogenoformans Z-29017 и менее 4,80 мин для бактерий SET IS-9T.

4. Впервые показано, что степень конверсии и производительность по водороду изменяются несущественно при изменении концентрации клеток микроорганизмов в реакторе с 2,6'108 до 5,1-108 кл/мл, что говорит о лимитировании реакции процессами диффузии и массопереноса и, следовательно, о возможности дальнейшего увеличения производительности и конверсии за счет совершенствования аппаратурного оформления процесса.

5. Впервые показано, что осуществление реакции водяного газа с помощью бактерий рода Carboxydothermus возможно в нестерильных условиях в течение свыше 200 ч без потери активности биокатализатора и загрязнения культуры.

6. Показано, что обнаружение гидроксилированных жирных кислот при определении жирнокислотного состава клеток микроорганизмов рода Carboxydothermus может свидетельствовать о заражении культуры посторонними микроорганизмами.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

Публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определённых ВАК Российской Федерации

1. Новиков A.A., Гущин П.А., Винокуров В.А., Бердников В.И., Баранов Д.А. Микробиологические методы получения альтернативных топлив из синтез-газа // Наука и техника в газовой промышленности. 2008. №1(33). с.79-85.

2. Новиков A.A., Котелев М.С., Иванов Е.В., Винокуров В.А. Перспективы использования микробиологической сероочистки в России // Башкирский химический журнал. - 2010, Том 17, № 3, с.171-175.

Прочие публикации

1. Винокуров В.А., Ботвинко И.В., Барков A.B., Сребняк Е.А., Фролова М.А., Никитин Д.А., Стексова Е.В., Панкратова М.А., Коканина A.A., Арапов К.А., Татаринов A.M., Новиков A.A., Котелев М.С., Бородина О.М., Чжан Данянь Биотехнологические альтернативы традиционным технологиям в нефтегазовой отрасли // Труды РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина, 2009. №2(255), с. 57-71.

2. Котелев М.С., Новиков A.A. Использование термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов для переработки синтез-газа. // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», секция «Биология», 13-18 апреля 2009 г., тезисы докладов

С160-161.

3. Котелев М.С., Новиков A.A. Использование термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов для переработки синтез-газа. // VIII Всероссийская конференция молодых ученых, специалистов и студентов «Новые технологии в газовой промышленности» г. Москва 6-9 октября 2009 г., секция «Энергосбережение и экология».

Новиков Андрей Александрович

Разработка биотехнологического метода получения водорода из СО-содержащих газов

Подписано в печать 25.11.2010. Формат 60x84 1/16. Печать трафаретная. Объём 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 4684. Отпечатано в типографии «11-й ФОРМАТ» 115230, г. Москва, Варшавское ш., д. 36.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к методам получения водорода.;.

1.1 Биологические методы получения водорода с использованием энергии света или органических субстратов.

1.2 Получение водорода из СО и воды с помощью каталитических процессов.

1.3 Выделение водорода высокой чистоты из газовых смесей.

1.4 Роль водорода в энергетике.

1.5 Синтез-газ как сырье для получения водорода.

1.6 Анаэробные микроорганизмы, использующие монооксид углерода в кач естве субстрата.

1.6.1 Термофильные гомоацетатные бактерии, способные к росту за счет окисления СО.

1.6^2 Термофильные СО-использующие метанобразующие археи.

1.6.3 Термофильные СО-использующие сульфатредуцирующие бактерии и археи.

1.7 Биохимия анаэробного окисления СО.

1;.7.1- СО-дегидрогеназа и ацетил-КоА-синтаза.

1.7.2 №-СООН/АС8 ферментные комплексы;.

1.7.3 Каталитический цикл окисления СО в активном центре СО-дегидрогеназ.

1.8 Известные методы микробиологической переработки синтез-газа.

Выводы по главе 1.

Глава 2 Экспериментальная часть. Методики проведения исследований.

2.1 Методики выделения микроорганизмов из природных источников и культивирования их в статических условиях.

2.2 Методики определения величины расхода газа и состава газообразных и жидких метаболитов микроорганизмов.

2.3 Световая микроскопия.'.

2.4 Электронная микроскопия

2.5 Выделение и анализ ДНК.

2.6 Определение состава полярных липидов

2.7 Хромато-масс-спектрометрическое определение жирнокислотного состава клеток.

2.8 Лабораторные установки.

Выводы по главе 2.1.

Глава 3 Результаты и обсуждение экспериментальных исследований.

3.1 Выделение новых микроорганизмов^ являющихся биокатализаторами реакции водяного газа.

3.2 Исследование фенотипических и филогенетических характеристик выделенного штамма СО-потребляющих микроорганизмов.

3.3 Исследование некоторых хемотаксономических характеристик выделенного штамма СО-потребляющих микроорганизмов.

3.4 Осуществление биотехнологического процесса получения водорода путем культивирования термофильных микроорганизмов в непрерывном режиме.

3.4.1 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий SET IS-9 на установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 1.

3.4.2 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий SET IS-9 на установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 2.

3.4.3 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий

С. hydrogenoformans Z-2901 на установке для культивирования термофильных карбоксидотрофных микроорганизмов в исполнении 3.

3.4.4 Ферментация монооксида углерода с помощью бактерий SET IS

3.4.5 Ферментация модельной газовой смеси 25 % СО + Н2 с помощью бактерий SET IS-9T.

3.5 Исследование влияния заражения культуры на жирнокислотный состав клеток СО-потребляющих микроорганизмов.

Выводы по главе 3.

В современном мире бурное развитие промышленности породило проблемы, связанные с истощением ископаемого углеводородного сырья, прежде всего, нефти. Следствием использования ископаемых топлив являются серьезные экологические проблемы, главной из которых является глобальное потепление.

В качестве альтернативных топлив наибольшее значение приобрели биоэтанол, биобутанол и биодизелыюе топливо (метиловые или этиловые эфиры жирных кислот), а также водород. Значительным недостатком первых трех топлив является использование сельскохозяйственной продукции в качестве сырья для их производства.

В качестве сырья для производства водорода может служить синтез-газ, который в свою очередь может быть получен конверсией природного газа или попутного нефтяного газа, газификацией углеродсодержащих бытовых или промышленных отходов, а также низкосортных каменных углей, запасы которых значительно превосходят запасы ископаемых углеводородов.

Водород широко используется в химической, нефтехимической, нефтеперерабатывающей и других отраслях промышленности для производства аммиака, метанола, моторных топлив, для процессов гидроочистки, гидрокрекинга и т. д.

Объем мирового производства водорода составляет 50 млн. тонн и растет на 5-10% в год. Более 90% водорода и синтез-газа (Нг и СО), производимого и используемого ,в промышленности, получают методами паровой, паровоздушной, пароуглекислотной или парокислородной каталитической конверсии углеводородного сырья.

Традиционные термокаталитические методы переработки синтез-газа в водород осуществляются при высоких температурах и давлениях, а также требуют тщательной сероочистки сырья, что приводит к снижению энергоэффективности процесса. Микробиологические методы по своей сути 4 лишены этих недостатков, что особенно актуально в свете последних разработок в области плазмохимической переработки природного газа.

Анаэробная ферментация синтез-газа микроорганизмами, изучаемыми в данной работе, представляет собой микробиологическую реакцию водяного газа, в результате которой монооксид углерода, содержащийся в синтез-газе, окисляется водой до углекислого газа с образованием эквимолярного количества водорода. Высокой степени конверсии при этом способствует низкая температура процесса. Остаточная концентрация СО в газовой фазе может снижаться до нескольких млн"1, таким образом, полученный водород после очистки от углекислого газа удовлетворяет высоким требованиям по чистоте и пригоден для использования в низкотемпературных СО-чувствительных топливных элементах с протон-проницаемыми мембранами.

Объект исследования диссертагрш — культуры термофильных микроорганизмов, способных катализировать реакцию водяного газа, а также образцы воды, обрастаний и осадков из гидротерм Исландии, Байкальской рифтовой зоны и полуострова Камчатка.

Предметом диссертационного исследования выступают ферментативно катализируемая реакция водяного газа, системы конверсии газов, содержащих монооксид углерода.

Основной целью настоящего исследования явилась разработка метода получения водорода из СО-содержащих газов с использованием в качестве катализатора культур карбоксидотрофных гидрогеногенных микроорганизмов.

Для достижения поставленной цели в диссертации решены следующие основные задачи:

1. Выделение новых штаммов микроорганизмов, способных к эффективной трансформации монооксида углерода с получением водорода.

2. Разработка методики непрерывного культивирования микроорганизмов, способных к трансформации монооксида углерода с получением водорода.

3. Разработка методики контроля чистоты культуры микроорганизмов в условиях непрерывного культивирования в нестерильных условиях.

4. Определение конверсии и производительности по водороду биореакторов барботажного типа.

5. Проведение процесса микробиологического получения водорода в течение длительного времени для подтверждения стабильности культуры микроорганизмов.

Научная новизна представленной работы заключается в исследовании микробиологически катализируемой реакции водяного газа в реакторах барботажного типа.

Впервые определены зависимости конверсии и производительности по водороду от величины расхода газа для биореакторов барботажного типа с использованием различных штаммов микроорганизмов в качестве биокатализаторов.

Выделен новый штамм микроорганизмов SET IS-9, являющийся биокатализатором реакции водяного газа и обладающий сопоставимыми с лучшими известными штаммами гидрогеногенных микроорганизмов скоростью роста и биокаталитической активностью.

По результатам фенотипических и филогенетических исследований выделенный штамм микроорганизмов SET IS-9 отнесен к новому виду бактерий рода Carboxydothermus.

Впервые показана возможность продолжительной генерации водорода в лабораторной установке при использовании в качестве биокатализатора выделенного штамма микроорганизмов SET IS-9.

Впервые определены хемотаксономические характеристики видов рода Car boxy dothermus, применимые для экспресс-идентификации представителей рода и для контроля чистоты культуры микроорганизмов.

Публикации и апробация результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Основные результаты исследований были представлены в докладах и презентациях на российских и международных научных конференциях: XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009 г.), а также на VIII Всероссийской конференции молодых ученых, специалистов и студентов «Новые технологии в газовой промышленности».

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф., д.х.н. В.А. Винокурову и д.б.н. Т.Г. Соколовой за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН имени С.Н. Виноградского. Отдельную благодарность автор выражает к.б.н. A.B. Лебединскому за ценные советы и конструктивную критику. Искренняя благодарность всем коллегам, принимавшим участие в различных этапах работы: к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр Биоинженерии РАН), д.м.н. Л.В. Диденко (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), к.х.н. О.В. Поповой, А. Бердыевой и Д. Шариповой (РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина).

Отдельная благодарность асп. М.С. Котелеву, без которого эта работа не могла бы быть выполнена, за неоценимую помощь и поддержку.

Работа выполнена при поддержке Федеральной Целевой Программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 годы».

Выводы по главе 3

1. Выделен новый штамм термофильных карбоксидотрофных т гидрогеногенных микроорганизмов SET IS-9 , отнесенный к новому виду "Carboxydothermus islandicus" на основании результатов микробиологических и филогенетических исследований.

2. Впервые исследован жирнокислотный состав клеток бактерий рода Carboxydothermus; выявлены межвидовые различия, которые могут служить для различения видов в пределах данного рода.

3. Впервые исследованы зависимости конверсии и производительности биореактора по водороду при культивировании бактерий Carboxydothermus

X X hydrogenoformans Z-2901 и SET IS-9 . Установлено, что производительность

3 3

ПО водороду может достигать 2,0 М водорода/(м реакторл'Ч) при условном времени контакта менее 5,13 мин для бактерий Carboxydothermus hydrogenoformans Z

Т* X

2901 и менее 4,80 мин для бактерий SET IS-9 .

4. Впервые показано, что степень конверсии и производительность по водороду изменяются несущественно при изменении концентрации клеток

8 8 микроорганизмов в реакторе с 2,6-10 до 5,1 10 кл/мл, что говорит о лимитировании реакции процессами массопереноса и, следовательно, о возможности дальнейшего увеличения производительности и конверсии за счет совершенствования аппаратурного оформления процесса.

5. Впервые показано, что осуществление реакции водяного газа с помощью бактерий рода Carboxydothermus возможно в нестерильных условиях в течение свыше 200 ч без потери активности биокатализатора и загрязнения культуры.

6. Показано, что обнаружение гидроксилированных жирных кислот при определении жирнокислотного состава клеток микроорганизмов рода

СагЬохуЛоЖегтш может свидетельствовать о заражении культуры посторонними микроорганизмами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа включает полный цикл исследований - от выделения новых микроорганизмов до исследования характеристик биореакторов с использованием выделенного штамма микроорганизмов в качестве биокатализатора. Успешное осуществление процесса переработки газов с парциальным давлением СО вплоть до 1 атм в течение длительного времени при значениях конверсии до 94 % и производительности по водороду до

3 3

2,0 м водорода^(м реактора*ч) позволяет заключить, что поставленная цель -разработка биотехнологического метода получения водорода из СО-содержащих газов - была достигнута. Применение биотехнологических методов в перспективе позволит создать высокоэффективные технологические системы, способные функционировать при различной загрузке производственных мощностей реакторов. Применение в качестве биокатализаторов быстрорастущих термофильных микроорганизмов, культуры которых устойчивы к заражению посторонними микроорганизмами, позволит повысить энергоэффективность биотехнологических процессов за счет элиминирования энергоемких стадий стерилизации реакторов и вносимых компонентов среды.

1. D.B. Levin, L. Pitt, М. Love (2004) Biohydrogen production: prospects and limitations to practical application. International Journal of Hydrogen Energy 29 173.

2. J.R. Benemann (1998) Process analysis and economics of biophotolysis of water. IEA/H2/10/TR2-98.

3. S.A. Markov, A.D. Thomas, M.J. Bazin, D.O. Hall (1997) Photoproduction of hydrogen by Cyanobacteria under partial vacuum in batch culture or in a photobioreactor. International Journal of Hydrogen Energy 22, 521.

4. A.S. Fedorov, A.A. Tsygankov, K.K. Rao, D.O. Hall (1998) Hydrogen photoproduction by Rhodobacter sphaeroides immobilised on polyurethane foam. Biotechnology Letters 20, 1007.

5. H.G. Zhu, T. Suzuki, A.A. Tsygankov, Y. Asada, J. Miyake (1999) Hydrogen production from tofu wastewater by Rhodobacter sphaeroides immobilized in agar gels. International Journal of Hydrogen Energy 24, 305.

6. M. Yetis, U. Gunduz, I. Eroglu, M. Yucel, L. Turker (2000) Photoproduction of hydrogen from sugar refinery wastewater by Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl. International Journal of Hydrogen Energy 25, 1035.

7. C.Y. Lin, C.H. Jo (2003) Hydrogen production from sucrose using an anaerobic sequencing batch reactor process. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 78, 678.

8. H.H.P. Fang, H. Liu (2002) Effect of pH on hydrogen production from glucose by a mixed culture. Bioresource Technology 82, 87.

9. E.W.J.V. Niel, P.A.M. Claassen, A.J.M. Stams (2003) Substrate and production inhibition of hydrogen production by the extreme thermophile Caldicellulosiruptor saccharolyticus. Biotechnology and Bioengineering 81, 255.

10. Y. Ueno, S. Otsuka, M. Morimoto (1996) Hydrogen production from industrial wastewater by anaerobic microflora in chemostat culture. Journal of Fermentation and Bio engineering 82, 194.

11. Energy Information Administration. U.S. natural gas repressuring, U.S. natural gas vented and flared. Материалы сайта tonto.eia.doe.gov.

12. CompactGTL, Associated gas. Материалы сайта www.compactgtl.com.

13. ЗАО «Метапроцесс». Материалы сайта www.metaprocess.ru.

14. Группа компаний «Энергосинтоп». Материалы сайта www.energosyntop.com

15. Oil and Gas Conservation Commission of the State of Colorado, Cause No. 54 Order No. 54-2, March 18, 1955.

16. Khalid Azzam, K. Seshan, I.V Babich, Water-gas-shift reaction in a catalytic membrane reactor for fuel-cell application, (www.cpm.tnw.utwente.nl).

17. Greg Brinkman (2003) Economics and Environmental Effects of Hydrogen Production Methods. University of Maryland, School of Public Policy. http://www.publicpolicy.umd.edu/files.php/faculty/fetter/students/Brinkman.pdf

18. Geoffrey Q. Miller, and Joerg Stocker (1999) Selection of a Hydrogen Separation Process. Материалы компании UOP LLC, http://www.uop.com/obiects/SelOfHydroSepProc.pdf

19. Iwamoto et al., Membranes, 30, (5), 247-253 (2005).

20. R.M. Prasad, Yuji Iwamoto, R. Riedel, A. Gurlo (2010) Multilayer АтофЬош^ьВ-С-Ы/у-АЬОз/а-АЬОз Membranes for Hydrogen Purification. Advanced Engineering Materials, 12 (6), 522-528.

21. Варежкин А. В., Лысов А. А., Тезисы докладов отчетной интернет-конференции за 2002 год, Москва, 30.12.2002 — 20.01.2003. М.:Изд-воРХТУ. 2003, с. 165-166.

22. Словецкий Д.И., Чистов Е.М., Рошан Н.Р. (2004) Производство чистого водорода, ISJAEE, 1 (9), 43 46.

23. Ilias S. (2009) Development of Pd-Ag Composite Membrane for

24. Balachandran U. et al. (2001) Dense Ceramic Membranes for Hydrogen Separation, Energy Technology Division, Argonne National Laboratory, Argonne.http://www.netl.doe.gov/publications/proceedings/02/materials/Balachandran.pdf

25. S.-J. Song, T.H. Lee, E.D. Wachsman, L. Chen, S.E. Dorris, and U. Balachandran (2005) Defect Structure and Transport Properties of Ni-SrCe03~ Cermet for Hydrogen Separation Membrane. J. Electrochem. Soc., 152 (11), J125-J129.

26. U. Balachandran, S.E. Dorris, Y. Lu, J.E. Emerson, C.Y. Park, T.H. Lee, and J.J. Picciolo (2010) Hydrogen Separation Membranes. Annual report for FY 2009, Contract Number: AA-10-40-00-0/FWP 49601.

27. Gosselink, J.W. (2002) Pathways to a more sustainable production of energy: sustainable hydrogen- a research objective for Shell. Int. J. Hydrogen Energy 27, 1125-1129.

28. Appleby, J. (1995) Fuel cells. In: Encyclopedia of energy, technology and the environment, Vol. 2, Bisio, A and Boots, S. Eds. John Wiley and Sons, Inc., New York, pp. 1408-1437.

29. Sandrock, G. (1999) A panoramic overview of hydrogen storgae alloys from a gas reaction point of view. J. Alloys Comp. 293-295.

30. Van Houten, R.T., Hulshoff Pol, L.W. and Lettinga, G. (1994) Biological sulphate reduction using gas-lift reactors fed with hydrogen and carbon dioxide as energy and carbon source. Biotechnol. Bioeng. 44, 586-594.

31. Van Houten, R.T., Yu Yun, S. and Lettinga, G. (1997) Thermophilic sulphate and sulphite reduction in lab-scale gas-lift reactors using H2/C02 as energy and carbon source. Biotechnol. Bioeng. 55, 807-814.

32. Szekeres, S., Kiss, I., Bejerano, T.T. and Soares, M.I.M. (2001) Hydrogen-dependent denitrification in a two-reactor bio-electrochemical system. Wat. Res. 35, 715-719.

33. Kurt, M., Dunn, I.J. and Bourne, J.R. (1987) Biological denitrification of drinking water using autotrophic organisms with H2 in a fluidized-bed biofilm reactor. Biotechnol. Bioeng. 29, 493-501.

34. Ferguson, J.F. and Pietari, J.M.H. (2000) Anaerobic transformations and bioremediation of chlorinated solvents. Environ. Pollution 107, 209-215.

35. Cortright, R.D., Sanchez-Castillo, M. and Dumesic, J.A. (2002) Conversion of biomass to 1,2-propanediol by selective catalytic hydrogenation of lactic acid over silica-supported copper. Appl. Catalysis B: Environmental 39, 353359.

36. Kyoto protocol to the United Nations framework convention on climate change, 1-10 December 1997, Kyoto, Japan.

37. Armor, J. N. (1999) The multiple roles for catalysis in the production of H2. Appl. Catal.A 176 (2), 159-176.

38. Bartish, C.M. and Drissel, G.M. (1978) Carbon monoxide. In: Encyclopedia of chemical technology, 3rd edition (Kirk-Othmer Ed.) John Wiley & Sons, NY, pp 772-793.

39. Van der Drift, A., Doom, J. van, and Vermeulen, J.W. (2001) Ten residual biomass fuels for circulating fluidized-bed gasification. Biomass and Bioenergy 20, 45-56.

40. Belgiorno, V., De Feo, G., Delia Rocca, C. and Napoli, R.M.A. (2003) Energy from gasification of solid wastes. Waste Management 23, 1-15.

41. Perry, R.H., Green, D.W. and Maloney, J.O. (1997) Perry's chemical engineers' handbook 7th edition. McGraw - Hill, New York, USA.

42. Maschio, G., Lucchesi, A., and Stoppato, G. (1994) Production of syngas from biomass. Biores. Technol. 48, 119-126.

43. Faaij, A., Ree, R. van, Waldheim, L., Olsson, E., Oudhuis, A., Wijk, A. van, Daey-Ouwens, C. and Turkenburg, W. (1997) Gasification of biomass wastes and residues for electricity production. Biomass and Bioenergy 12 (6), 387407.

44. Matsumura, Y. (2002) Evaluation of supercritical water gasification and biomethanation for wet biomass utilization in Japan. Energy Conv. Managem. 43, 1301-1310.

45. Dellepiane, D., Bosio, B., Arato, E. (2003) Clean energy from sugarcane waste: feasibility study of an innovative application of bagasse and barbojo. J. Power Sources 122, 47-56.

46. Young, L. and Pian, C.C.P. (2003) High-temperature, air blown gasification of dairy-farm wastes for energy production. Energy 28, 655-672.

47. Midilli, A., Dogru, M., Akay, G. and Howarth, C.R. (2002) Hydrogen production from sewage sludge via a fixed bed gasifier product gas. Int. J. Hydrogen Energy 27 1035-1041.

48. Werther, J. and Ogada, T. (1999) Sewage sludge combustion. Progr. Energy and Combustion Sc. 25, 55-116.

49. Sutton, D., Kelleher, B. and Ross, J.R.H. (2001) Review of literature on catalysts for biomass gasification. Fuel Processing Technol. 73, 155-173.

50. Ledjeff-Hey, K., Roes, J. and Wolters, R. (2000) C02-scrubbing and methanation as purification system for PEFC. J. Power Sources 86, 556-561.

51. Bredwell, M.D., Srivastava, P. and Worden, R.M. (1999) Reactor design issues for synthesis-gas fermentations. Biotechnol. Prog. 15, 834-844.

52. Abrini J., Naveau H., Nyns E.J. (1994) Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol, 161: 345-351.

53. Tanner R.S., Miller L.M., Yang D. (1993) Clostridium ljungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial ribosomal-RNA homology group-I. Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236.

54. Krumholz L.R., Bryant M.P. (1985) Clostridium pfennigii sp. nov. uses methoxyl groups of monobenzenoids and produces butyrate. Int J Syst Bacteriol, 35: 454-456.

55. Lorowitz W.H., Bryant M.P. (1984) Peptostreptococcus productus strain that grows rapidly with CO as the energy source. Appl Environ Microbiol, 47: 961-964.

56. Sharak Genthner B.R., Bryant M.P. (1987) Additional characteristics of one-carbon-compound utilization by Eubacterium limosum and Acetobacterium woodii. Appl Environ Microbiol, 53: 471-476.

57. Sharak Genthner B.R., Bryant M.P. (1982) Growth of Eubacterium limosum with carbon monoxide as the energy source. Appl Environ Microbiol, 43: 70-74.

58. Grethlein A J., Worden R.M., Jain M.K., Datta R. (1991) Evidence for production of n-butanol from carbon monoxide by Butyribacterium methylotrophicum. J Ferment Bioeng, 72: 58-60.

59. Lynd L., Kerby R., Zeikus J.G. (1982) Carbon monoxide metabolism of the methylotrophic acidogen Butyribacterium methylotrophicum. J Bacteriol, 149: 255-263.

60. Shen G.J., Shieh J.S., Grethlein A.J., Jain M.K., Zeikus J.G. (1999) Biochemical basis for carbon monoxide tolerance and butanol production by Butyribacterium methylotrophicum. Appl Microbiol Biotechnol, 51: 827-832.

61. Uffen R.L. (1976) Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc Natl AcadSci USA, 73: 3298-3302.

62. Dashekvicz M.P., Uffen R.L. (1979) Identification of a carbon monoxide metabolizing bacterium as a strain of Rhodopseudomonas gelatinosa (Molisch). Int J Syst Bacteriol, 29:145-148.

63. Jung G.Y., Jung H.O., Kim J.R., Ahn Y., Park S. (1999) Isolation and characterization of Rhodopseudomonas palustris P4 which utilizes CO with the production of H2. Biotechnol Lett, 21: 525-529.

64. Kerby R.L., Ludden P.W., Roberts G.P. (1995) Carbon monoxide dependent growth of Rhodospirillum rubrum. J Bacteriol, 177: 2241-2244.

65. Lupton F.S., Conrad R., Zeikus J.G. (1984) CO metabolism of Desidfovibrio vulgaris strain Madison physiological function in the absence or presence of exogenous substrates. FEMS Microbiol Lett, 23: 263-268.

66. Klemps R., Cypionka H., Widdel F. & Pfennig N. (1985) Growth with hydrogen, and further physiological characteristics of Desidfotomaculum' species. Arch Microbiol, 143:203-208

67. Rother M., Metcalf W.W. (2004) Anaerobic growth of Methanosarcina acetivorans C2A on carbon monoxide: an unusual way of life for a methanogenic archaeon. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 16929-16934.

68. Daniel S.L., Hsu T., Dean S.I., Drake H.L. (1990) Characterization of the hydrogen- and carbon monoxide-dependent chemolithotrophic potentials of the acetogens Clostridium thermoaceticum and Acetogenium kivui. J Bacteriol, 172: 4464-4471.

69. Savage M.D., Wu Z.G., Daniel S.L., Lundie L.L., Drake H.L. (1987) Carbon monoxide-dependent chemolithotrophic growth of Clostridium thermoautotrophicum. Appl Environ Microbiol, 53: 1902-1906.

70. Henstra A.M., Sipma J., Rinzema A., Stams A.J.M. (2007) Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology, 18: 200-206.

71. Назина Т.Н., Иванова A.E., Канчавели Jl.П., Розанова Е.П. (1988) Новая спорообразующая термофильная метилотрофная сульфатредуцирующая бактерия, Desulfotomaculum kuznetsovii sp. nov. Микробиология, 57: 823-827.

72. Plügge С., Balk M., Stams A.J.M. (2002) Desidfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum subsp. nov., a thermophilic syntrophic propionate-oxidizing spore-forming bacterium. Int J Syst Evol Microbiol, 52: 391-399.

73. Daniels L., Fuchs G., Thauer R.K., Zeikus J.G. (1977) Carbon monoxide oxidation by methanogenic bacteria. J Bacteriol, 132: 118-126.

74. Stetter K.O., Lauerer G., Thomm M., Neuner A. (1987) Isolation of extremely thermophilic sulfate reducers: Evidence for a novel branch of archaebacteria. Science, 236: 822-824.

75. Stetter K.O. (1988) Archaeoglobus fulgidus gen. nov., sp. nov.: a new taxon of extremely thermophilic archaebacteria. Syst Appl Microbiol, 10: 172-173.

76. Henstra A.M., Dijkema C., Stams A.J.M. (2007) Archaeoglobus fulgidus couples CO oxidation to sulfate reduction and acetogenesis with transient formate accumulation. Environ Microbiol, 9: 1836-1841.

77. King G.M. (2003) Uptake of carbon monoxide and hydrogen at environmentally relevant concentrations by Mycobacteria. Appl Environ Microbiol 69(12): 7266-7272.

78. Balk M., van Gelder T., Weelink S.A., Stams A.J. (2008) (Per)chlorate reduction by the thermophilic bacterium Moorella perchloratireducens sp. nov., isolated from underground gas storage. Appl Environ Microbiol, 74: 403-409.

79. Diekert G.B., Thauer R.K. (1978) Carbon-monoxide oxidation by Clostridium thermoaceticum and Clostridium formicoaceticum. J Bacteriol, 136: 597-606.

80. Yang H.C., Drake H.L. (1990) Differential effects of sodium on hydrogen and glucose-dependent growth of the acetogenic bacterium Acetogenium kivui. Appl Environ Microbiol, 56(1): 81—86.

81. Drake H.L., Daniel S.L. (2004) Physiology of the thermophilicacetogen Moorella thermoacetica. Research in Microbiology, 155: 422-436.110

82. Wiegel J., Braun M., Gottschalk G. (1981) Clostridium thermoautotrophicum species novum, a thermophile producing acetate from molecular hydrogen and carbon dioxide. Curr Microbiol, 5: 255-260.

83. Zeikus J.G., Wolfe R.S. (1972) Methanobacterium thermoautotrophicus sp. п., an anaerobic, autotrophic, extreme thermophile. J Bacteriol, 109: 707-713.

84. O'Brien J.M., Wolkin R.H., Moench T.T., Morgan J.B., Zeikus J.G. (1984) Association of hydrogen metabolism with unitrophic or mixotrophic growth of Methanosarcina barkeri on carbon monoxide. J Bacteriol, 158: 373-375.

85. Sandbeck, K.A., Ward D.M. (1982) Temperature adaptations in the terminal processes of anaerobic decomposition of Yellowstone NationaLPark and Icelandic hot spring microbial mats. Appl Environ Microbiol 44: 844-851.

86. Yagi, Т. (1959) Enzymic oxidation of carbon monoxide. II. J Biochem (Tokyo), 46: 949-955.

87. Davidova M.N., Tarasova N.B., Mukhitova F.K., Karpilova I.U. (1994) Carbon monoxide in metabolism of anaerobic bacteria. Can J Microbiol, 40:417^125.

88. Min H., Zinder S.H. (1990) Isolation and characterization of a thermophilic sulfate-reducing bacterium Desulfotomacidum thermoacetoxidans sp.nov. Arch Microbiol, 153: 399-404.

89. Stetter K.O., Huber R., Blochl E., Kurr M., Eden R.D., Fielder M., Cash H.,Vance I. (1993) Hyperthermophilic archaea are thriving in deep North Sea and Alaskan oil reservoirs. Nature, 365: 743-745.

90. SchinkB. (1997) Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation. Microbiol Mol. Biol Rev 61:262-280.

91. Jackson B.E., Mclnerney M.J. (2002) Anaerobic microbial metabolism can proceed close to thermodynamic limits. Nature 415: 454-456.

92. Uffen RL (1983) Metabolism of carbon monoxide by Rhodopseudomonas gelatinosa: cell growth and properties of the oxidation system. JBacterioL 155(3), 956-965.

93. Uffen R.L. (1976) Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc Natl AcadSci USA, 73: 3298-3302.

94. Светличный B.A., Соколова Т.Г., Герхардт M., Заварзин Г.А. (1990) Новая группа анаэробных термофильных карбоксидобактерий, выделяющих водород. Докл АН СССР, 314: 742-745.

95. Светличный В.А., Соколова, Т.Г., Кострикина, Н.А., Лысенко A.M. (1994) Carboxydothrmus resti'ictus sp.nov. — новая термофильная анаэробная карбоксидотрофная бактерия. Микробиология, 63: 523-528.

96. Kerby R.L., Ludden P.W., Roberts G.P. (1995) Carbon monoxide dependent growth of Rhodospirillum rubrum. J Bacterid, 177: 2241-2244.

97. Jung G.Y., Jung H.O., Kim J.R., Ahn Y., Park S. (1999) Isolation and characterization of Rhodopseudomonas palustris P4 which utilizes CO with the production of H2. Biotechnol Lett, 21: 525-529.

98. Henstra A.M., Sipma J., Rinzema A., Stams A.J.M. (2007) Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology, 18: 200—206

99. Ragsdale S.W. (2004) Life with carbon monoxide. Crit Rev Biochem MolBiol, 39(3): 165-95.

100. Ragsdale, S.W., Kumar M. (1996) Ni containing carbon monoxide dehydrogenase/acetyl-CoA synthase. Chem Rev, 96: 2515-2539.

101. Maynard E.L., Lindahl P.A. (2001) Catalytic coupling of the active sites in acetyl-CoA synthase, a bifunctional CO-channeling enzyme. Biochemistry 40(44): 13262-13267.

102. Grahame D.A., DeMoll E. (1995) Substrate and accessory protein requirements and thermodynamics of acetyl-CoA synthesis and cleavage in Methanosarcina barkeri. Biochemistry, 34(14): 4617-4624.

103. Furdui C., Ragsdale S.W. (2000) The role of pyruvate ferredoxin oxidoreductase in pyruvate synthesis during autotrophic growth by the Wood-Ljungdahl pathway J Biol Chem, 275: 28494-28499.

104. Stephen M. Techtmann, Albert S. Colman and Frank T. Robb (2009) 'That which does not kill us only makes us stronger': the role of carbon monoxide in thermophilic microbial consortia. Environmental Microbiology 11(5), 10271037

105. Paul A. Lindahl (2002) "The Ni-Containing Carbon Monoxide Dehydrogenase Family: Light at the End of the Tunnel?", Biochemistry, 41, 20972105

106. Jae-Hun Jeoung and Holger Dobbek (2007) Carbon Dioxide Activation at the Ni,Fe-Cluster of Anaerobic Carbon Monoxide Dehydrogenase. Science ЪП, 1461-1464.

107. Amos W.A. (2004) Biological Water-Gas Shift Conversion of Carbon Monoxide to Hydrogen. Milestone Completion Report (NREL/MP-560-35592).

108. Bruce W.F. (2004) The Co-Production of Ethanol and Electricity From Carbon-based Wastes. BRI Energy Report (http://www.magic-region.com/BRI Energy Backgrounder.pdf).

109. Новый процесс производства этанола из углеродсодержащих отходов, http://www.coskata.com/

110. Marmur J. (1961) A procedure for the isolation DNA from microorganisms. J Molecular Biol, 3: 208-218.

111. Bimboim, H. C., Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7, 15131523.

112. Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing, p. 115-175 In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow, New York: Wiley.

113. Owen, R. J., Hill, L. R. & Lapage, S. P. (1969). Determination of DNA base composition from melting profiles in dilute buffer. Biopolymers 7, 503516.

114. Tindall, B. J. (1990). Lipid composition of Halobacterium lacusprofundi. FEMS Microbiol Lett 66, 199—202.

115. Sasser, M. (1990). Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. MIDI Technical Note 101. Newark, DE: MIDI Inc.1. ПУБЛИКАЦИИ

116. Основные положения диссертации изложены в следующих публикациях:

117. Новиков А.А., Тущин П.А., Винокуров В.А., Бердников В.И., Баранов Д.А. Микробиологические методы получения альтернативных топлив из синтез-газа // Наука и техника в газовой промышленности. 2008. №1(33). с.79-85.

118. Новиков А.А., Котелев М.С., Иванов Е.В., Винокуров В.А. Перспективы использования микробиологической сероочистки в России // Башкирский химический журнал. —2010, Том 17, № 3, с. 171-175.