автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.12, диссертация на тему:Модели и методы анализа проектных решений цифровой электронной техники на основе сетей Петри

/г

На правах рукописи

ЕВСЕЕВА Татьяна Ивановна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ НА РАЗДЕЛЬНОЕ И СОВМЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФАКТОРОВ РАДИАЦИОННОЙ И ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

03.00.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Обнинск - 2006

Работа выполнена в Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Гераськин Станислав Алексеевич (ВНИИСХРАЭ, г. Обнинск)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

академик УААН Гудков Игорь Николаевич (Национальный аграрный университет Украины, г. Киев)

доктор биологических наук, профессор Петин Владислав Георгиевич (Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск)

доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник

Осипов Андреян Николаевич

(Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова,

г. Москва)

Ведущая организация: Объединенный институт

ядерных исследований, г. Дубна

Защита диссертации состоится 2006 г. в^^часов на

заседании диссертационного совета Д \!)06.06#.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии. Отзывы на автореферат просим отправлять по адресу: 249032, Калужская обл., г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км, ВНИИСХРАЭ, Диссертационный совет. Факс (48439) 6-80-66.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИСХРАЭ.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ,,

кандидат биологических наук Шубина O.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Жизнь на Земле возникла и развивалась в условиях постоянного воздействия природных источников радиации. В настоящее время в результате интенсивного развития ядерной энергетики, горнодобывающей и перерабатывающей отраслей промышленности значительно возросло и не уступает (Gesell, Prichard, 1975; Алексахин и др., 1990) по мощности природным процессам влияние техногенной деятельности на увеличение содержания естественных радионуклидов в биосфере. Парадоксально, но именно недостаток данных о биологических эффектах, наблюдаемых в населяющих районы с повышенным естественным радиационным фоном (ПЕРФ) популяциях растений и животных, является наиболее существенным пробелом в наших знаниях (Real et at., 2004).

Широкий спектр биологических эффектов (от стимуляции развития до угнетения и гибели), обнаруженных (Алексахин и др., 1990; Позолотина, 2003) при изучении природных популяций растений и животных в областях с ПЕРФ, и существенное влияние других экологических факторов (Taulavuori et al., 2005) на уровень наблюдаемых в этих сообществах изменений постепенно привели к осознанию того, что интерпретация имеющихся данных невозможна без решения проблем корректной оценки биологических эффектов малых доз ионизирующих излучений и их модификации факторами нерадиационной природы.

Недостаточный учет возможности возникновения синергического или антагонистического типов реакции биологических систем под воздействием факторов среды обитания является одной из причин несоответствия отклика природных популяций растений и животных на радиационное и химическое воздействия тем моделям, которые были построены на основе лабораторных экспериментов. Действительно, существуют экспериментальные подтверждения (Petin, Berdnikova, 1979; Петин, Комаров, 1989; Лысцов, 1993; Гераськин и др., 1996; Петин и др., 1999; Евсеева, Герась-кин, 2001; Geras'kin et al., 2005) того, что синергические и антагонистические ответные реакции биологических систем не являются артефактами при сочетанном действии внешнего уизлучения и факторов химической природы, в частности, металлов. Однако данных о совместном действии тяжелых естественных радионуклидов (ТЕРН) с разными по физическим и химическим свойствам металлами и внешним облучением в научной литературе крайне мало для принятия обоснованных решений относительно того, в каких радиоэкологических ситуациях и на каком основании следует проводить мероприятия по ограничению радиационного воздействия на биоту. В связи с этим особенно важным становится изучение закономерностей и механизмов усиления либо ослабления биологического эффекта при одновременном действии факторов. Только такой подход позволит избежать множества логических и методологических ошибок, возникающих при анализе изменений, наблюдаемых в природных популяциях растений и животных, обитающих в условиях ПЕРФ.

/

В случае раздельного действия факторов, выяснение механизмов реакции биологических объектов также является крайне сложной задачей. В настоящее время не существует единого мнения даже по поводу формы зависимости «доза - эффект». В значительной мере это связано с недостатком информации о закономерностях действия низких, характерных для окружающей среды, доз ионизирующих излучений и концентраций металлов (Гераськин, 1995; Sanita' di Toppi, Gabbrielli, 1999). Еще более проблематичной становится корректная оценка состояния населяющих территории с ПЕРФ природных популяций растений и животных вследствие практически полного отсутствия достоверных сведений об эффектах тяжелых естественных радионуклидов. Несмотря на то, что зарождение радиобиологии как науки связано именно с исследованием биологического действия ТЕРН (Корого-дин, 1991), до настоящего времени существует ряд принципиально важных нерешенных вопросов в этой области, касающихся механизмов действия ТЕРН на клеточные структуры, оценки радиобиологического и токсического эффектов этих элементов. Решению кратко изложенных здесь проблем биологического действия повышенного фона естественной радиоактивности посвящено настоящее диссертационное исследование.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в выявлении закономерностей реакции растений на раздельное и совместное действие внешнего облучения, тяжелых естественных радионуклидов и металлов.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Определить форму зависимости «доза - эффект» при действии на растения у-излучения, 232Th и Cd.

2. Оценить вклад процессов восстановления повреждений ДНК и эндогенного глутатиона в снижение токсического эффекта низких и высоких концентраций 232Th и Cd.

3. Выявить закономерности реакции растений на раздельное и совместное кратковременное и длительное воздействие низких концентраций 232Th с Y-излучением или Cd.

4. Количественно охарактеризовать вклад в индукцию токсического и мутагенного эффектов у растений тяжелых естественных радионуклидов и металлов при поступлении из сложных по ионному составу природных растворов.

5. Оценить влияние внешнего облучения и инкорпорированных тяжелых естественных радионуклидов на генетическую изменчивость растений горошка мышиного (Vicia cracca L.) из природной ценопопуляции, длительное время заселяющей территорию с повышенным фоном естественной радиоактивности.

Научная новизна. Впервые с использованием различающихся систематическим положением растений - Allium сера, Tradescantia и Chlorella vulgaris — показано, что синергический и антагонистический типы реакции биологических систем на совместное воздействие факторов радиационной и химической природы являются закономерными событиями и возникают с наибольшей вероятностью при низких дозовых нагрузках, характер-

ных для условий окружающей среды. По этой причине реально наблюдаемый уровень биологических эффектов в природных популяциях, населяющих радиоактивно загрязненные территории, часто существенно отличается от прогнозируемого на основе результатов экспериментальных исследований раздельного действия факторов. В этих условиях как внешнее облучение в низких дозах, так и инкорпорированные тяжелые естественные радионуклиды оказывают достоверное влияние на уровень генетической изменчивости в популяциях и возможности их адаптации к конкретной радиоэкологической ситуации.

Синергические мутагенный и токсический эффекты у растений могут возникать при совместном действии факторов в таких дозах, которые не являются остро токсичными, но индуцируют дополнительные к образующимся спонтанно потенциальные повреждения ДНК. В диапазоне низких доз действующих факторов могут быть обнаружены и антагонистические эффекты, выражающиеся в снижении частоты генных мутаций и аберраций хромосом без замедления митотической активности клеток и ростовых процессов растений. Для этого доза хотя бы одного из факторов должна быть достаточной для активации процессов восстановления повреждений ДНК. Увеличение интенсивности воздействия ведет к проявлению достоверных токсических эффектов, регистрируемых, в зависимости от силы совместного влияния факторов, на уровне тканей, органов или организма в целом.

В диссертационной работе впервые показано, что форма зависимости мутагенного и токсического эффектов у растений от силы воздействия факторов радиационной и химической природы универсальна и характеризуется наличием трех участков, различающихся уровнем индуцируемых повреждений. В первом диапазоне регистрируемый биологический эффект не отличается достоверно от спонтанного, в пределах второго - статистически значимо превышает его, оставаясь на неизменном уровне. Сохранение неизменного (не отличающегося от контроля или достоверно повышенного) уровня цитогенетических нарушений в этих диапазонах дозовых нагрузок во многом связано с эффективностью восстановления повреждений ДНК. Дальнейшее увеличение интенсивности воздействия приводит к монотонному приращению отклика биологической системы.

С использованием в качестве тест-объекта Chlorella vulgaris впервые показано, что эндогенный глутатион имеет большее значение для предотвращения развития индуцируемых 232Th свободнорадикальных процессов, чем при детоксикации Cd в качестве субстрата для образования фитохе-латинов. Роль дополнительного синтеза эндогенного глутатиона, в отличие от процессов восстановления повреждений ДНК, проявляется в снижении эффекта высоких, являющихся токсичными, концентраций Cd или 232Th.

Впервые изучены закономерности реакции растений на раздельное кратковременное и длительное воздействие Cd и 232Th в низких концентрациях, встречающихся соответственно в условиях слабо и средне загрязненных кадмием территорий или на участках с повышенным фоном есте-

ственной радиоактивности. Установлено, что при поступлении из водных растворов с одинаковой концентрацией 232Th вызывает однотипные реакции у различающихся систематическим положением растений —Allium сера, Tradescantia (клон 02) и Chlorella vulgaris. Воздействие 0.4 мкмоль/л 232Th не приводит к статистически значимому повышению уровня мутагенного и токсического эффектов. При содержании в растворе 1.6 мкмоль/л 232Th индуцирует достоверный токсический эффект. В концентрации 0.8 мкмоль/л 232Th стимулирует рост корней Allium сера. Выявленный эффект не связан с феноменом гормезиса, поскольку обусловлен достоверным увеличением по сравнению с контролем длины клеток в базальной части зоны растяжения корня и не является следствием возрастания скорости деления или пула пролиферирующих клеток. Мутагенный эффект 232Th проявляется при хроническом воздействии на клетки волосков тычинок Tradescantia (клон 02) и увеличивается пропорционально концентрации радионуклида в растворе.

Реакция растений (Tradescantia (клон 02), Allium сера) на кратковременное и длительное воздействие Cd при поступлении из водных растворов с разной концентрацией существенно различается. Низкие концентрации кадмия (0.009 мкмоль/л и 0.09 мкмоль/л) не являются остро токсичными и не индуцируют достоверных мутагенных эффектов, но при хроническом воздействии могут вызывать токсический эффект, ослабевающий с течением времени. В более высоких (5 мкмоль/л) концентрациях Cd приводит к достоверным мутагенному и токсическому эффектам уже при кратковременном (30 ч) воздействии. С течением времени токсический эффект усиливается.

Впервые количественно оценен вклад факторов радиационной и химической природы низкой интенсивности в индуцируемые генетические эффекты у растений из лабораторных и природных популяций. Показано, что при совместном действии радионуклиды и металлы даже в низких концентрациях статистически значимо влияют на уровень мутагенного и токсического эффектов у растений. В изученной радиоэкологической ситуации внешнее облучение выступает в качестве фактора отбора, увеличивая частоту эмбриональных летальных мутаций у растений, а инкорпорированный в надземной массе горошка мышиного 230Th определяет не только уровень внутрипопуляционной цитогенетической изменчивости, но и, увеличивая вариабельность растений по чувствительности к внешним воздействиям, - возможности адаптации этого вида. Ведущим фактором, обусловливающим высокий уровень двойных фрагментов, являющихся признаком радиационного воздействия, является инкорпорированный 226Ra.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные общие закономерности реакции растений на воздействие различающихся физическими и химическими свойствами факторов существенно упрощают решение задач экологического нормирования и позволяют с единых позиций оценивать опасность для биоты радиационных и химических воздействий.

Установленные инвариантность формы зависимости «доза - эффект» относительно действующих факторов и свойств биологических объектов,

AZ

закономерности возникновения синергических и антагонистических эффектов существенно упрощают прогнозирование последствий влияния факторов радиационной и химической природы на фитоценозы.

Разработанная и апробированная в разных экологических ситуациях методология оценки вклада радиационной и химической составляющих в индуцируемые биологические эффекты у растений позволяет выявить факторы, интенсивность воздействия которых следует контролировать в первую очередь. Полученные результаты показывают, что при оценке опасности для экосистем радионуклидного и химического загрязнений необходимо применять комплексный, основанный на принципах экотоксикологии, подход. Причем на первом этапе целесообразно использовать методы биологического тестирования, позволяющие получить интегральную оценку действия присутствующих в природных средах компонентов. Если результаты биотестов оказываются положительными, следует прибегнуть к более детальным исследованиям, включая физико-химический анализ, выявление геохимических барьеров, определение параметров миграции загрязняющих веществ в конкретном ландшафте.

Положения, выносимые на защиту:

1. Синергический и антагонистический типы реакции биологических систем на совместное воздействие факторов радиационной и химической природы являются закономерными событиями и возникают с наибольшей вероятностью в диапазоне низких, характерных для условий окружающей среды, дозовых нагрузок.

2. Форма зависимости мутагенного и токсического эффектов у растений от силы воздействия факторов радиационной и химической природы универсальна и характеризуется наличием трех участков, различающихся уровнем индуцируемых повреждений.

3. При совместном действии тяжелые естественные радионуклиды и/или металлы даже в низких концентрациях вносят достоверный вклад в формирование мутагенного и токсического эффектов у растений.

4. Низкие дозы внешнего облучения и инкорпорированные тяжелые естественные радионуклиды оказывают достоверное влияние на уровень генетической изменчивости в природных популяциях растений.

Личный вклад диссертанта в разработку научных результатов, выносимых на защиту. Автором лично поставлена цель исследования и запланированы необходимые для ее осуществления эксперименты, проведен сбор образцов растений из природных популяций, проанализировано более 3/4 всех цитологических препаратов, выполнены статистическая обработка результатов собственных исследований и теоретический анализ данных литературы, сформулированы основные положения работы и выводы.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований были доложены и представлены на IV Международном симпозиуме «Урал атомный. Урал промышленный» (Екатеринбург, 1996), Интернациональном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды в Арктике» (Тромсо, 1997), III Съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» (Москва, 1997), Науч-

но-аналитической конференции «Человек на севере: условия и качество жизни» (Сыктывкар, 1998), Международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2000), Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 2000), V Международной конференции по исследованию действия повышенного фона естественной радиации и радоноопасных территорий (Мюнхен, 2000), Международной конференции «Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции (Дубна, 2000), Международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2001), XI Международном симпозиуме по биоиндикаторам (Сыктывкар, 2001), IV съезде по радиационным исследованиям (Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2001), Международной конференции «Экология северных территорий России. Проблемы, прогноз ситуации, пути развития, решения» (Архангельск, 2002), Всероссийской научной школе «Актуальные проблемы экологического мониторинга: Научный и образовательный аспекты» (Киров, 2003), III Съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология и радиоэкология» (Киев, 2003), Международной конференции «Радиационная безопасность территорий. Радиоэкология города» (Москва, 2003), Международной конференции «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, 2004), Международной конференции «ЭКОРАД» (Экс-ан-Прованс, 2004), VI Международной конференции «Экология человека и природа» (Плес, 2004), I Североамериканской конференции «Воздействие низких доз радиации» (Онтарио, 2005), VI Международном симпозиуме по радиологической защите (Кардифф, 2005), II Международной конференции «Радиоактивность окружающей среды» (Остерас, 2005), Международной конференции «Радиоактивность после ядерных взрывов и аварий» (Москва, 2005), Международной конференции БИОРАД-2006 (Сыктывкар, 2006), V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), 3 Международной конференции «Металлы в окружающей среде» (Вильнюс, 2006).

По теме диссертации опубликовано 33 статьи, из них 17 - в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах и 1 монография.

Структура и объем диссертационной работы. Работа состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, 4 приложений, списка литературы, включающего 452 источника, из них 225 - на иностранном языке. Диссертация изложена на 296 страницах и содержит 47 таблиц, 40 рисунков.

Благодарности. Выражаю искреннюю признательность научному консультанту д.б.н., профессору С.А. Гераськину за постоянную поддержку и ценные советы при подготовке диссертационной работы, научным сотрудникам отдела радиоэкологии Е.С. Белых и Т.А. Майстренко за помощь при проведении лабораторных и полевых работ, дискуссии и участие в обсуждении результатов исследований, директору Института биологии Коми НЦ УрО РАН А.И. Таскаеву за пристальное внимание и помощь в организации научных исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Раздельное и совместное действие факторов физической и химической природы на растения

Прогнозирование последствий воздействия радионуклидного и химического загрязнения для природных популяций растений и животных в значительной мере усложняется нерешенностью вопросов, связанных с определением формы зависимости «доза - эффект» в диапазоне низких дозовых нагрузок, выявлением закономерностей реакции биологических систем на совместное воздействие факторов и оценкой их вклада в наблюдаемый уровень генетической изменчивости.

Используемые в настоящее время для оценки биологических эффектов низкодозового облучения и сочетанного действия факторов разной природы модели, основанные на линейной беспороговой концепции и гипотезе аддитивного сложения эффектов, носят экстраполяционный характер, не имеют прочного теоретического обоснования и входят в противоречие с имеющимися экспериментальными данными. Анализ литературы позволил сформулировать ряд выводов и наметить конкретные задачи, решение которых приближает нас к пониманию закономерностей реакции биологических систем на совместное действие факторов и способствует разработке новых принципов защиты живой природы от радиационных и химических воздействий.

1. Форма зависимости «доза - эффект» при действии на клетки малых доз ионизирующих излучений нелинейна и имеет универсальный характер, различаясь для разных объектов значениями доз, при которых происходит изменение зависимости. В отличие от радиобиологических исследований, где изучение эффективности малых доз облучения долгое время является приоритетным направлением, в токсикологических экспериментах не было уделено должного внимания действию низких концентраций металлов. Сведения о закономерностях биологического действия ТЕРН фактически отсутствуют. Следует ожидать, что реакция клеток является универсальной и в отношении действия химических факторов, поскольку в ходе эволюции природа использовала конечный набор систем сигнализации и управления работой клетки, принципов их сборки и функционирования. Для экспериментальной проверки положений сформулированной ранее (Гераськин, 1995) концепции биологического действия низких доз ионизирующего излучения и обоснования наших представлений об универсальном характере зависимости «концентрация - эффект» в отношении индукции цитогенетических нарушений при действии ТЕРН и металлов, на первом этапе были изучены закономерности формирования реакции растений на воздействие существенно различающихся по своим свойствам факторов - у-излучения, Сс1 и 232ТЬ — в широком диапазоне доз.

2. В ответ на внешние воздействия в клетках инициируется множество последовательно и параллельно протекающих метаболических процессов, направленных на ослабление влияния неблагоприятных факторов. В зависимости от силы и характера внешнего воздействия относительная

роль определенных метаболических путей может меняться. С этих позиций установленная нелинейность дозовой зависимости в диапазоне низкой напряженности факторов (Гераськин, 1998) является математическим выражением способности клеток осуществлять выбор между определенными механизмами в зависимости от интенсивности и характера внешнего воздействия. Основными процессами, обеспечивающими нормальное функционирование клеток при влиянии неблагоприятных факторов, являются репарация повреждений ДНК, контроль клеточного цикла, увеличение внутриклеточного содержания защитных веществ. Для понимания основ устойчивости растений и механизмов совместного действия факторов разной природы важно выявить роль определенных процессов в снижении уровня индуцируемых повреждений при переходе от слабых к сильным внешним воздействиям. Оценка вклада процессов восстановления повреждений ДНК и эндогенного глутатиона в снижение эффекта действия Сс1 и 2згТТ) стала следующей задачей работы.

3. Изучение действия металлов на биологические системы разного уровня организации является важным этапом исследований, результаты которых необходимы для обоснования решений в природоохранной деятельности и сельском хозяйстве. Однако данных о действии характерных для условий окружающей среды концентраций металлов на растения, даже в случае такого хорошо изученного токсиканта, как Сс1, в научной литературе недостаточно. Большинство проведенных до сих пор экспериментальных исследований относятся к случаю кратковременного воздействия высоких (более 1 мкмоль/л) концентраций Сс1. В то же время в условиях окружающей среды в почвенных вытяжках средне загрязненных кадмием территорий его содержание варьирует от 0.32 до 1 мкмоль/л (вапИа' сМ Торр1, СаЬЬпеНу, 1999). Достоверные сведения о биологических эффектах низких концентраций тяжелых естественных радионуклидов на растения фактически отсутствуют.

Кроме того, при оценке качества окружающей среды по биологическим показателям важно выявить тот уровень организации живой материи, изменения в котором позволяют получить наиболее ранние и достоверные сведения о происходящих в экосистемах негативных процессах. Поэтому следующий этап исследований был связан с изучением реакции клеток, тканей и органов растений на кратковременное и длительное воздействие 23гТ11 и Сс1.

4. Сложные, разнонаправленные процессы, индуцируемые сочетан-ным воздействием факторов разной природы, включающие, в частности, как активацию защитных механизмов, так и подавление их работы, способны приводить к самым разным ответным реакциям - от антагонизма до синергизма (Ионизирующее излучение..., 1982; Виленчик, 1991). Поэтому результирующий отклик биологической системы на совместное воздействие нельзя предвидеть, исходя только из информации об эффектах раздельного действия каждого фактора. В таком случае крайне важно определить тот диапазон дозовых нагрузок, в котором нелинейные эффекты возникают наиболее часто. Анализ данных литературы показывает, что

¿0

синергические и антагонистические ответные реакции биологических систем с повышенной вероятностью должны наблюдаться в диапазоне низких, реально встречающихся в условиях окружающей среды доз действующих факторов, когда ресурсы надежности биологических систем еще не исчерпаны. Проверке этой гипотезы и выявлению закономерностей индукции синергических и антагонистических эффектов мы посвятили основную часть диссертационного исследования.

5. Если синергизм не является случайным событием и вносит достоверный вклад в ответную реакцию биологических систем на воздействия низкой интенсивности, то при совместном влиянии на клетки растений невысоких, присутствующих в природных средах, концентраций загрязняющих веществ (включая металлы и ТЕРН) можно наблюдать статистически значимые мутагенные и/или токсические эффекты. В таком случае важно установить, с какими именно факторами связан достоверный биологический эффект. С этой точки зрения в дополнение к исследованиям с модельными двухком-понентными системами необходимо было изучить реакцию клеток растений на воздействие многокомпонентного состава природных вод.

6. Оценка вклада физических и химических факторов в наблюдаемый в природных популяциях растений уровень генетической изменчивости является наиболее проблематичной. При той интенсивности нагрузки, которая характерна для большинства средне и слабо загрязненных экосистем, вклад радиационно-индуцированного мутационного процесса в изменчивость популяций животных и растений вычленить крайне сложно на фоне сильного модифицирующего действия самых разных экологических факторов и высокой гетерогенности составляющих популяцию особей по устойчивости к определенным видам воздействия. Решение этого вопроса возможно только на основе ясных представлений о закономерностях и механизмах реакции биологических систем на слабые сочетанные воздействия и на базе единой апробированной методологии оценки вклада факторов в ответную реакцию биоты. На завершающем этапе исследований мы ставили перед собой задачу оценки влияния факторов радиационной природы и индивидуальной изменчивости на уровень характерного для природных популяций растений мутагенеза. В этой области наши исследования являлись новыми, не имеющими аналогов в современной научной литературе. Решение этих вопросов крайне важно для ясного понимания характера генетических процессов, происходящих в условиях повышенных уровней радиоактивности, и открывает широкие возможности для разработки концепции защиты живой природы от радиационных воздействий.

Глава 2. Материал и методы

В качестве объектов исследования выбраны часто используемые в радиобиологических и токсикологических исследованиях растения - хлорелла, традесканция (клон 02), лук репчатый и шнитт-лук. Целесообразность применения каждого объекта для решения поставленных задач основана на чувствительности, точности и простоте регистрации маркеров токсических и мутагенных эффектов, воспроизводимости получаемых ре-

зультатов. Токсический и мутагенный эффекты оценивали по общепринятым критериям и методикам (табл. 1).

Эксперименты проводили в контролируемых условиях, оптимальных для роста и развития определенного вида растений. При этом контрольные варианты находились в строго идентичных с экспериментальными условиях.

Растворы исследуемых химических веществ (Сс1(Ы03)2; 232Т(1(М03)4; кофеина (С6Н,0Ы4Ог); 0Ьбутионин-(3,Р)-сульфоксимина (С8Н18Мг035)) готовили на дистиллированной воде, поскольку в питательных средах содер-

Таблица 1

Объекты исследования и критерии оценки мутагенных и токсических эффектов факторов радиационной и химической природы

Объект исследований

Регистрируемый показатель и методика

Оцениваемый эффект

Chlorella vulgaris Beijer

прирост биомассы за 24 ч размножения в водных растворах, содержащих определенные концентрации тестируемых веществ (Свидетельство №01.19.231/2003 об аттестации в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96)

токсическии

Tradescantia (клон 02) (2n ~ 12)

снижение репродуктивной способности клеток волосков тычинок и динамика показателя за 30 дней (Un-derbrmk etal., 1973; Ichikawa, Sparrow, 1978; Евсеева, Гераськин, 2001)_

токсическии

частота и динамика соматических мутации в клетках волосков тычинок за 30 дней (Underbrink et al., 1973; fchikawa, Sparrow, 1978; Евсеева, Гераськин, 2001)

мутагенный

Allium сера I. (2л = 16)

прирост корней в модельных растворах за 30 и 72 ч по отношению к контролю (Евсеева и др., 2005)

токсическии

митотический индекс и индексы фаз митоза (профазы, метафазы, анафазы) клеток меристемы корней через 30 ч прорастания (Паушева, 1980)

токсическии

частота метафаз с колхициновыми митозами (Пау-шева, 1980)

токсическии

частоты аберрантных клеток и аберраций хромосом, спектр аберраций в первом митотическом цикле (Паушева, 1980)

мутагенный

Allium schoenoprasum L. (2n = 16)

митотический индекс меристематических клеток корней через 30 ч прорастания а тестируемых пробах воды (Паушева. 1980)

токсическии

частоты аберрантных клеток и аберраций хромосом, спектр аберраций а первом митотическом цикле (Паушева, 1980)

мутагенный

А? /

жатся вещества, образующие комплексы или конкурирующие при поступлении в растения. Контрольные растения содержали в дистиллированной воде. Специально проведенные (Evseeva et al„ 2005) эксперименты показали отсутствие достоверных различий уровней цитогенетических повреждений у растений, содержащихся в дистиллированной воде и среде Кнопа. Наши данные согласуются с результатами других авторов (Wierzbicka, 1999; Marcano et al., 2004).

Для оценки токсичности модельных растворов нитратов 232Th и Cd, а также изучения роли процессов восстановления повреждений ДНК и эндогенного глутатиона в снижении токсического эффекта этих элементов применяли аттестованную (Свидетельство №01.19.231/2003 об аттестации в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96) «Методику определения токсичности проб поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных вод, водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод и отходов по изменению оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer)». Культуру водоросли поддерживали в экспоненциальной стадии роста, ежедневно пересевая (Владимирова, Семененко, 1962) на жидкую 50 % среду Та-мийя. Суспензию клеток, разбавленную до оптической плотности 0.140 ± 0.005, по 10 мл засевали в 240 мл соответствующего варианту эксперимента раствора. Пробы, разлитые в стеклянные химические стаканы, выдерживали 4 ч при температуре 24 "С и освещенности 3.9-4.0 тыс. люкс от ламп Phillips TLD-36W/840. Эти пробы использовали для приготовления контрольного и экспериментальных образцов. Изучали раздельное действие 232Th, Cd, кофеина, бутионинсульфоксимина (BSO) и совместное -232Th либо Cd с кофеином или BSO. Для приготовления проб, содержащих определенные концентрации металла или радионуклида, в суспензии вводили микродозатором необходимую аликвоту из матричного раствора нитрата 232Th либо Cd с концентрацией по катиону 0.77 ммоль/л и 0.89 ммоль/л соответственно. Из контрольной и каждой экспериментальной пробы (с pH 6.5-7) автоматической пипеткой брали аликвоты по 6 мл и переносили в стандартные кюветы (шесть-двенадцать повторностей на вариант опыта). В каждой такой кювете исходно содержалось 154000 ± 26000 клеток водоросли/мл. Оценку плотности культуры водоросли проводили с использованием камеры Горяева по методике (Владимирова, Семененко, 1962). Кюветы на 24 ч для наращивания хлореллы помещали в культиваторы (Григорьев, Андреев, 2001) с автоматически вращающимся кюветодержателем. Температура (36 ± 0.5 °С), освещенность (1400 люкс) и содержание С02 (0.03 %) поддерживались постоянными в течение эксперимента. При завершении опыта измеряли оптическую плотность суспензии водоросли. По отклонению величины конечной оптической плотности опытных образцов от контрольных оценивали токсичность проб. Измерение оптической плотности культуры водоросли проводили в стандартной кювете (толщиной 10 мм) на фотометре при длине волны 670 нм.

При изучении токсического (на уровне клеток, ткани, органов растений) и мутагенного эффектов 232Th и Cd использовали в качестве тест-объекта лук репчатый, сорт Даниловский (не менее 5 луковиц на вариант опыта).

Корни луковиц проращивали в темноте при +21 ± 2 "С в дистиллированной воде (контроль), растворах, содержащих определенные концентрации 232Th, Cd или 232Th совместно с Cd. Через 30 и 72 ч от начала эксперимента все корешки срезали, измеряли их длину. Токсичность исследуемых растворов оценивали по относительным инкрементам (ДMo / Mo, %), сравнивая значения модальных классов (Mo) длин корней в опыте и контроле. Количественный и качественный учет перестроек хромосом в ана-телофазе первого митотического цикла клеток корневой меристемы лука (в условиях наших экспериментов - через 30 ч в корнях длиной 0.8-1.2 см), митотичес-кий индекс и долю колхициновых митозов (К-митозов) оценивали общепринятыми методами (Паушева, 1980).

Для изучения биологического действия хронического у-излучения использовали почвенные либо гидропонные культуры традесканции. В первом случае традесканцию выращивали в грунте, состоящем из почвы, песка и перегноя (1:1:1). В экспериментах с водными культурами свежесрезанные побеги с соцветиями с момента раскрытия первого бутона помещали в пробирки с дистиллированной водой при автоматической подаче воздуха. Часть растений (не менее шести на вариант опыта) облучали, другая часть служила контролем. Облучение начинали с момента раскрытия первого бутона в соцветии. Растения экспонировали 72 ч от закрытого источника 226Ra при мощностях доз у-излучения 0.27-10"*, 1.52-10"®, 3.47-103, 12.64-10"3, 30.83-10 3, 73.9-10"3, 76.25-10"3,126.39-103,194.44-10-», 371.39-10"3 и 586.7-10"3 сГр/ч на уровне соцветия. К концу облучения дозы составили соответственно 0.02, 0.11, 0.25, 0.91, 2.22, 5.32, 5.49, 9.10, 14.00, 26.74, 42.24 сГр. Мощность экспозиционной дозы являлась функцией расстояния от источника облучения, доза - функцией времени.

При изучении хронического (30 дней) раздельного и совместного действия 232Th с у-излучением или Cd, а также для оценки мутагенности и токсичности проб талой воды из различающихся уровнем техногенного воздействия районов г. Сыктывкар (Республика Коми) применяли гидропонные культуры традесканции.

Биотестирование проб воды из природных источников, расположенных в районе хранилища отходов бывшего радиевого производства, проводили с использованием шнитт-лука, поскольку данный вид размножается преимущественно вегетативно, что обусловливает низкую индивидуальную изменчивость. Это важно (Гераськин, Козьмин, 1995) при изучении низкоинтенсивных многофакторных воздействий и биотестировании компонентов окружающей среды. В данном эксперименте луковицы (не менее шести на вариант) помещали сначала в дистиллированную воду (контроль) для отращивания корней до 0.2 см, после - в тестируемые образцы на 30 ч. Корешки длиной 0.8-1.2 см срезали и фиксировали для последующего цитогенетического анализа.

Уровень генетической изменчивости горошка мышиного (Vicia сгасса L.; 2 п = 14) из природной ценопопуляции, длительное время заселяющей территорию с повышенным фоном естественной радиоактивности, оценивали на основе частоты эмбриональных летальных мутаций в бобах (по

100 штук на вариант), частоты аберраций хромосом и спектра аберраций в корневой меристеме 98-169 проростков семян (Попова и др., 1984, 1985).

Концентрации ионов металлов в пробах воды определяли в аккредитованной (аттестат № РОСС Ии. 0001.511257) лаборатории «Экоаналит» Института биологии Коми НЦ УрО РАН, а содержание ТЕРН в пробах воды и надземной массе растений горошка мышиного - в лаборатории миграции радионуклидов и радиохимии Института биологии, зарегистрированной в Государственном реестре № 41623-2003. Концентрации 210Ро и210РЬ оценивали методом электрохимического осаждения элементов из раствора на никелевые диски. Интенсивность а-излучения 210Ро и р-излучения 2ЮВ\ — дочернего изотопа 210РЬ, определяли на УМФ-2000М. Ошибка метода - 10 % (Адамова, Таскаев, 1980). Для изучения содержания ""ТИ и 230ТЬ в образцах растений использовали а-спектрометрический метод после ионообменного выделения тория (Шуктомова и др., 1983).

Статистическую обработку данных осуществляли общепринятыми методами (Абезгауз и др., 1970; Кендалл, Стьюарт, 1973; Закс, 1976; Крамер, 1975; Айвазян и др., 1983). Коэффициенты взаимодействия и их достоверность находили по формулам, приведенным в работе (Гераськин и др., 1996).

Глава 3. Закономерности и механизмы действия ^-излучения, 23ГП1 и Сс) на растения

В настоящее время существуют экспериментальные подтверждения нелинейной зависимости биологического эффекта от дозы ионизирующих излучений и некоторых биологически активных веществ. Тем не менее, практически полное отсутствие достоверной экспериментальной информации о биологических эффектах, которые может индуцировать облучение в дозах менее 1 сГр, а также существование альтернативных подходов к объяснению причин нетривиальной формы дозовой зависимости в диапазоне малых и близких к ним доз обусловили необходимость проведения новых исследований, направленных на восстановление формы дозовой зависимости в этом, наиболее важном с точки зрения практических приложений, диапазоне. Еще меньше достоверной информации имеется для случая действия ионов металлов и инкорпорированных радионуклидов в низких концентрациях. В одних экспериментальных работах постулируется линейная зависимость «концентрация металла — эффект», в других обсуждается нелинейность этой зависимости. Причем и в том, и в другом случае числа экспериментальных точек явно недостаточно, чтобы составить ясное представление о форме зависимости в диапазоне низких доз. Поэтому мы спланировали эксперименты таким образом, чтобы наиболее детально исследовать форму зависимости в области низких значений доз различающихся по своим физическим и химическим свойствам факторов.

На рис. 1-4 представлены зависимости частоты соматических мутаций и потери репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции клона 02 от дозы хронического у-излучения, а также зависимости

-5-3-11 3 5

Доза, сГр 0.02 0.11 0.25 0.91 2.22 5.32 5.49 9.1 14 26.74 42.24

Рис. 1. Зависимость частоты мутаций в клетках волосков тычинок традесканции (клон 02) от дозы хронического у-излучения.

По оси абсцисс - натуральный логарифм дозы у-излучения, сГр; по оси ординат -инкремент частоты мутаций, %.

Доза, сГр 0.02 0.11 0.25 0.91 2.22 5.32 5.49 9.1 14 26.74 42.24

Рис. 2. Снижение репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02) в зависимости от дозы хронического у-излучения. По оси абсцисс - натуральный логарифм дозы у-излучения, сГр; по оси ординат -снижение репродуктивной способности клеток, инкремент, %.

прироста биомассы асинхронно делящихся клеток хлореллы за 24 ч размножения в растворах нитрата 232"П1 или С<± Даже без использования специальных математических методов очевидно, что исследованные зависимости естественным образом делятся на три участка, различающихся уров-

Рис. 3. Зависимость изменения оптической плотности суспензии асинхронно делящихся клеток хлореллы от концентрации одного 232Т11 (кривая 1), в присутствии ВЭО (2) или кофеина (3).

По оси абсцисс - натуральный логарифм концентрации 2г2ТЬ, моль/л; по оси ординат- инкремент оптической плотности суспензии клеток водоросли после 24 ч размножения.

Рис. 4. Зависимость изменения оптической плотности суспензии асинхронно делящихся клеток хлореллы от концентрации одного Сс1 (кривая 1), в присутствии ВЭО (2) или кофеина (3).

По оси абсцисс - натуральный логарифм концентрации Сс1, моль/л; по оси ординат- инкремент оптической плотности суспензии клеток водоросли после 24 ч размножения.

нем индуцируемых в их пределах повреждений. В первом диапазоне регистрируемый биологический эффект не отличается достоверно от контрольного, во втором - статистически значимо превышает его, но остается на неизменном уровне. Следует обратить особое внимание на тот факт, что эти два диапазона охватывают дозовые нагрузки, характерные для слабо и средне загрязненных тяжелыми металлами экосистем и территорий с повышенным фоном естественной радиоактивности, т.е. для большинства ситуаций, возникающих в окружающей среде. И только превышение этой интенсивности воздействия приводит к монотонному приращению отклика биологических систем.

Сделанные выводы в отношении формы дозовой зависимости основаны исключительно на экспериментальных данных и не опираются на какие-либо гипотезы или экстраполяционные модели.

Результаты этих исследований являются не только еще одним доказательством неправомочности использования линейных моделей для прогнозирования биологических эффектов низкоинтенсивных воздействий, но и свидетельствуют о том, что форма зависимости «доза — эффект» по выходу цитогенетических повреждений инвариантна относительно свойств исследованных факторов и биологических объектов.

Полученные данные являются серьезным аргументом в пользу развиваемой нами концепции (Гераськин,1995), согласно которой экспериментально наблюдаемая ответная реакция клеток на внешние воздействия универсальна и представляет собой результат развертывания во времени генетической программы, выбор конкретного варианта которой определяется интенсивностью и характером этого воздействия.

С этих позиций важно установить, какие механизмы определяют режим функционирования клеток при определенных дозовых нагрузках. Для этого были использованы методы модификации повреждающего действия факторов.

Рассмотрим сначала результаты действия у-°блучения на традесканцию в условиях водной культуры без элементов питания (табл. 2). Известно (Ас1е1тап et а1., 1988; Впй, 1996), что недостаток элементов питания растений обусловливает снижение скорости ферментативных процессов, в том числе восстановления повреждений ДНК. В этих условиях достоверное увеличение частоты соматических мутаций и снижение репродуктивной способности клеток наблюдается при таких дозах облучения (0.01 и 0.23 сГр соответственно), которые не вызывали достоверных изменений у традесканции, выращенной в почве (рис. 1,2). В то же время спонтанные уровни изучаемых показателей для почвенных и водных культур достоверно не различались. Повышение дозовой нагрузки до 2.97 сГр приводит к монотонному увеличению частот регистрируемых повреждений волосков тычинок. Достоверные различия в реакции на малые дозы облучения почвенных и водных культур традесканции (Р = 12.22, р = 0.001 - для частоты соматических мутаций; соответственно 8.29 и 0.007 - для репродуктивной способности клеток) связаны, таким образом, с особенностями физиологического состояния системы, которое определяет направленность и эффективность метаболических процессов (в том числе метаболизма ДНК) в клетках.

Л7 Таблица 2

Частота соматических мутаций, изменение репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02) при действии хронического у-облучения в условиях водной культуры без элементов питания

Доза облу- Количество проанализированных Соматические мутации, % Снижение репродуктивной способности клеток, %

чения, сГр волосков тычинок, шт. X±Sx Инкремент X±Sx Инкремент

Контроль 19452 0.056 ±0.009 0 0.057 ±0.009 0

0.01 20429 0.142" ±0.027 0.08 0.098 ±0.051 0.037

0.10 15423 0.156" ± 0.027 0.10 0.065 ±0.028 0.007

0.23 23518 0.166я ±0.006 0.11 0.340" ±0.156 0.240

0.89 10295 0.2146± 0.038 0.16 0.534" ±0.108 0.470

2.97 12562 0.2876 ± 0.051 0.23 1.006б± 0.156 0.853

9.10 20346 0.2706 ± 0.030 0.21 0.148 ±0.034 0.095

Примечание: отличие от контроля достоверно при р < 0.05 (а), < 0.01 (б).

Вклад процессов восстановления повреждений ДНК в ответную реакцию клеток растений на внешние воздействия становится еще более очевидным при анализе результатов оценки токсического действия на хлореллу 23rTh или Cd в присутствии кофеина.

Известно (Jafari, Rabbani, 2000; Pincheira et al., 2003), что в микромолярных концентрациях кофеин не приводит к образованию супероксидных анионов, не вызывает деградации ДНК и может увеличивать выживаемость клеток растений и животных. Модифицирующее действие кофеина на процессы восстановления индуцированных ионизирующими излучениями повреждений ДНК, в том числе у Chlorella vulgaris, связывают (Шевченко, 1979) с его способностью ингибировать репарационный и репликативный синтез ДНК.

В ходе предварительных экспериментов выбрали концентрацию (0.02 ммоль/л) кофеина, которая не замедляет размножение клеток хлореллы за 24 ч по сравнению с интактным контролем, но может повлиять на процессы восстановления повреждений ДНК, индуцированных 232Th либо Cd прямо или опосредованно.

В присутствии кофеина в выбранной концентрации 232Th угнетал размножение хлореллы при содержании в растворе 0.34 (рис. 3), а Cd -0.009 мкмоль/л (рис. 4). Дальнейшее повышение концентраций элементов приводило к монотонному снижению прироста биомассы водоросли. Регистрируемого в отсутствие кофеина дозонезависимого участка в области действующих концентраций 232Th или Cd не наблюдали. Отсюда следует, что 232Th и Cd в указанных концентрациях индуцируют потенциальные повреждения ДНК, которые репарируются без дополнительного воздействия кофеина, а эффективность восстановления этих повреждений обусловливает сохранение неизменного уровня выживаемости хлореллы при увеличении интенсивности нагрузки в данном интервале доз.

Помимо репарационных процессов важную роль в снижении эффектов действия как ионизирующих излучений, так и химических веществ, играет глутатион. Эндогенные тиолы и, в частности, глутатион, способны (Шевченко, 1979; Кудряшов, Гончаренко, 1999; Cobbett, 2000) перехватывать свободные радикалы, индуцируемые ионизирующим излучением или тяжелыми металлами в клетках. Кроме того, глутатион является (Cobbett, 2000) субстратом для синтеза фитохелатинов, непосредственно связывающих ионы металлов.

Основываясь на тех же предпосылках, что и в экспериментах с кофеином, была выбрана эквимолярная (0.02 ммоль/л) концентрация BSO, которая не подавляет размножение хлореллы, но ингибирует (Pelayo et al., 2001; Griffith, Meister, 1979; Cobbett, 2000) сверхэкспрессию у-глутамилцис-теинсинтетазы - ключевого фермента синтеза глутатиона.

Как показали наши исследования (рис. 3), ингибирование дополнительного синтеза глутатиона повышает чувствительность клеток хлореллы к действию и таких концентраций 232Th (1.293-1.551 мкмоль/л), которые в отсутствие BSO не влияют на прирост биомассы водоросли за 24 ч, и таких (1.595-2.155 мкмоль/л), которые достоверно снижают его в среднем на 1.7 %. Обратим внимание, что роль глутатиона в данном случае сводится к перехвату свободных радикалов, поскольку 232Th не образует устойчивых комплексов с -SH группами и в первые 24 ч сорбируется (коэффициент накопления 105) из водного раствора преимущественно на поверхности клеточной стенки Chlorella spp. (Марчюленене, 1986).

Роль глутатиона в снижении токсичности кадмия для клеток хлореллы выявлена (рис. 4) при концентрациях (более 0.9 мкмоль/л), которые сами по себе достоверно снижают прирост биомассы водоросли на 25-99 %. Напомним, что глутатион является субстратом для синтеза фитохелатинов, ведущая роль которых в детоксикации Cd установлена в лабораторных экспериментах с высокими (более 1 ммоль/л) концентрациями металла. Из полученных нами результатов следует, что повышенный синтез фитохелатинов необходим для связывания таких количеств Cd, которые если и могут встречаться в окружающей среде, то только на сильно загрязненных локальных участках. Поэтому следует признать, что роль этого механизма в детоксикации Cd в реальной ситуации важна не более, чем остальных известных путей выведения металла из метаболизма растений.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о преимущественном вкладе процессов восстановления повреждений ДНК по сравнению с глутатионом в поддержание нормального метаболизма клеток при воздействии как 232Th, так и Cd.

Глава 4. Реакция клеток, тканей и органов растений

на воздействие низких концентраций 232Th и Cd

Рассмотрим сначала результаты экспериментов по изучению 30- и 72-часового действия Cd на клетки меристемы и рост корней лука репчатого. Кадмий при самой низкой из использованных концентраций

(0.009 мкмоль/л) не увеличивал частоту аберрантных ана-телофаз (рис. 5) и не задерживал процесс прорастания корней (рис. 6), о чем свидетельствует сравнение частот распределений длин корней после 30 ч роста в экспериментальном растворе и контроле. Снижения митотического индекса (рис. 7) клеток корневой меристемы лука также не было зарегистрировано. В то же время в первом митотическом цикле наблюдали токсический эффект на клеточном уровне. Он проявлялся в формировании профаз-

0.009

0.09

Рис. 5. Частота аберрантных клеток (с указанием количества проанализированных ана-телофаз; по оси ординат, инкремент, %) в меристеме корней Allium сера L. после 30 ч роста в растворах нитрата Cd с разными концентрациями по катиону (по оси абсцисс, мкмоль/л).

Рис. 6. Степень ингибирования (по оси ординат, АМо / Мо, %) роста корней Allium сера L. за 30 (диаграмма черного цвета) и 72 ч (диаграмма белого цвета) в растворах нитрата Cd с разными концентрациями по катиону (по оси абсцисс, мкмоль/л).

0.009 0.09 5

Рис. 7. Митотический индекс (по оси ординат, инкремент, %) клеток меристемы корней Allium сера L. после 30 ч роста в растворах нитрата Cd с разными концентрациями по катиону (по оси абсцисс, мкмоль/л).

но-метафазного блока и увеличении доли клеток с колхициновыми митозами (рис. 8). Это, очевидно, вызвало сильное (на 73 %) торможение роста корней через 72 ч (рис. 6).

3,5 3

2,5 2 1,5 1

0,5 0

Рис. 8. Доля (по оси ординат, %) метафаз (с указанием количества проанализированных метафаз) с К-митозами в меристеме корней Allium сера L. после 30 ч роста в растворах нитрата Cd с разными концентрациями по катиону (по оси абсцисс, мкмоль/л).

р< 0.001

р<0.001 Т

0.009 0.09 5

Повышение концентрации Сс1 в растворе до 0.09 мкмоль/л привело к задержке начала прорастания, хотя длина корней модального класса через 30 ч роста не отличалась от контрольной (рис. 6). Такая защитная реакция в нашем случае нашла свое выражение в достоверном снижении частоты аберрантных клеток (рис. 5) в корневой меристеме через 30 ч от начала воздействия. Митотический индекс (рис. 7) и относительная длительность мета- и анафаз также не отличались от контроля. Доля К-мито-зов (рис. 8) хотя превышала контроль, но была достоверно ниже, чем при действии меньшей концентрации кадмия. Поэтому через 72 ч после воздействия 0.09 мкмоль/л Сс1 наблюдали только 36 %-ное ингибирование роста (рис. 6) корней лука, а не 73 %-ное, как в случае с более низкой концентрацией кадмия.

При высокой концентрации (5 мкмоль/л) кадмия фиксировали статистически значимое увеличение частоты аберрантных клеток (рис. 5) в первом митотическом цикле и токсический эффект на уровне клеток (рис. 8), ткани (рис. 7) и органа (рис. 6).

Хроническое действие кадмия в низких концентрациях (0.009 и 0.09 мкмоль/л) на традесканцию (клон 02) не привело к повышению частоты соматических мутаций на фоне достоверного угнетения деления клеток волосков тычинок (табл. 3). Динамика изученных показателей за 30-дневный период свидетельствует о снижении токсического эффекта с течением времени. При содержании в растворе 5 мкмоль/л мутагенный эффект кадмия не проявлялся на фоне гибели бутонов в соцветиях, начиная с 24 дня от начала эксперимента. Восстановления деления клеток волосков тычинок со временем не происходило.

Отсюда следует, что низкие концентрации Сс1 (в условиях наших экспериментов - 0.009 и 0.09 мкмоль/л) не являются остро токсичными для растений и не индуцируют достоверно высоких мутагенных эффектов. Их токсическое действие, выявляемое на уровне клеток в первые дни от начала эксперимента, может снижаться с течением времени, а при высоких концентрациях, наоборот, усиливается.

Таблица 3

Частота соматических мутаций и снижение репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02) при действии Сс1

Концентрация Ос), мкмоль/л Количество проанализированных волосков тычинок, шт. Частота соматических мутаций, % Снижение репродуктивной способности клеток, %

в расчете на 1 растение за период с 4 по 30 день ежедн регистри евно руемое

с 4 по 17 день с 18 по 30 день

Контроль 17839 0.081 ±0.042 0.103 ±0.033 0.05±0.07 0.30±0.23

0.009 23490 0.096 ± 0.054 0.229 ±0.050" 0.33±0.23" 0.17±0.23

0.09 20481 0.082 ± 0.045 0.134 ±0.035° 0.26±0.30" 0

5.0_ 8066 0.110 ±0.030 0.227 ±0.052' 0.24±0.18б 0.26±0.26

Примечание: отличие от контроля достоверно при р < 0.05 (а), < 0.01 (б); < 0.01 (в).

232ТИ при одинаковых концентрациях в водном растворе вызывал однотипную реакцию у различающихся систематическим положением растений. При содержании 0.4 мкмоль/л 232ТИ не индуцировал статистически значимых биологических эффектов: не ингибировал прирост биомассы хлореллы (рис. 3), не задерживал рост корней лука через 30 ч (рис. 9) и не снижал репродуктивную способность клеток волосков тычинок традесканции (табл. 4) в течение 30 дней. В наибольшей из использованных концентраций (1.6 мкмоль/л) 232ТЬ вызывал достоверный токсический эффект, регистрируемый по всем изученным показателям. В концентрации 0.8 мкмоль/л 232ТТ) приводил к увеличению частот соматических мутаций в волосках тычинок традесканции (табл. 4), ана-телофаз с отставшими хромосомами (0.75 % - при действии 232ТЬ, 0-в контроле) и доли К-митозов (2.71 % при действии 232Т11, 0.3 - в контроле) в корневой меристеме лука. При этом содержании в растворе радионуклид не вызывал токсического эффекта как в случае кратковременного (рис. 3, 9, 10), так и хронического (табл. 4) действия на клетки растений. Наоборот, была обнаружена стимуляция роста корней лука (рис. 9). В то же время митотический индекс (рис. 10) клеток корней через 30 ч роста достоверно не отличался от контроля. После 72 ч прорастания луковиц в растворе, содержащем 0.8 мкмоль/л радионуклида, регистрируемый митотический индекс клеток меристемы также не превышал контрольного значения для корней длиной 0.7-1' и 1.5-2" см, и был достоверно (р = 0.039) снижен в случае 3-3.5'" см.

На основе полученных результатов можно предположить, что 232ТЬ стимулирует рост корней не за счет увеличения митотической активности ме-ристематических клеток, а удлинения клеток в зоне растяжения и/или дифференциации. Экспериментальным подтверждением сделанного вывода являются результаты (рис. 11) измерения длины клеток (не менее 100 в каждом отрезке) в зоне растяжения корней одинаковой (3.5 ±0.1 см) длины через 72 ч роста. Из представленных данных следует, что при воздействии 232"П1 эффект разрыхления клеточных оболочек наблюдается в ба-зальной части зоны растяжения корня, где средняя длина клеток досто-

Таблица 4

Частота соматических мутаций и снижение репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02) при действии 232ТИ

Концентрация 232ТИ, мкмоль/л

Количество проанализированных волосков тычинок, шт.

Частота соматических мутаций, %

Снижение репродуктивной способности клеток, %

Контроль 0.4 0.8 1.6

17839 12252 12462 9798

0.08±0.04 0.14±0.06 0.18±0.02" 0.27±0.05'

0.0910.04 0.10±0.04 0.12±0.02 0.46±0.04"

' Длина корней 1-го модального класса после 72 ч действия 23гП1.

11 Длина корней модального класса в контроле.

"' Длина корней 2-го модального класса после 72 ч действия 232ТЬ.

— /

л

100 80 60 40 20 О -20 -40 -60

0.4 0.8 1.6

Рис. 9. Степень ингибирования (по оси ординат, АМо / Мо, %) роста корней Allium сера L. за 30 (диаграмма черного цвета) и 72 ч (диаграмма белого цвета) в растворах нитрата 232Th с разными концентрациями по катиону (по оси абсцисс, мкмоль/л).

8

7

6

5 4 3 2 1 0

12 3 4

Рис. 10. Митотический индекс (по оси ординат, %) меристематических клеток корней (1 - 0.9-1; 2 - 0.7-1; 3 - 1.5-2; 4 - 3-3.5 см) Allium сера L. после 30 (1) и 72 (2-4) часов роста в дистиллированной воде (диаграмма серого цвета) или растворе нитрата 232Th с концентрацией 0.8 мкмоль/л по катиону (диаграмма белого цвета).

верно превышает регистрируемую в контроле. Таким образом, обнаруженный эффект стимуляции роста корней лука не имеет ничего общего с феноменом гормезиса.

Ш1

0.2-1

1.0-2.0

2.0-3.5

Рис. 11. Длина (по оси ординат, мкм) клеток в зоне растяжения (по оси абсцисс-расстояние от апекса, см) корней Allium сера L. через 72 ч роста в дистиллированной воде (диаграмма серого цвета) или растворе нитрата 232Th с концентрацией 0.8 мкмоль/л по катиону (диаграмма белого цвета).

Проведенные эксперименты позволили получить наиболее полное представление о биологических эффектах, которые могут индуцировать 23ГП1 и Сс1 в концентрациях, характерных для слабо и средне загрязненных металлами территорий и участков с повышенным фоном естественной радиоактивности, а также понять, как нарушения, возникающие на уровне клеток, отражаются со временем на реакции органов растений. Эти данные представляют собой неотъемлемую часть исследований совместного действия факторов физической и химической природы на растения, а в части изучения действия 232ТЬ на разные уровни организации растений являются новыми научными данными. Полученные результаты также свидетельствуют, что именно изменения на базовом, молекулярно-клеточ-ном уровне организации биологических систем, позволяют получить наиболее ранние и достоверные сведения о негативных изменениях, происходящих при низкоинтенсивном воздействии неблагоприятных факторов внешней среды. Следовательно, именно цитогенетические критерии целесообразно использовать для ранней диагностики изменений в экосистемах, возникающих в результате хозяйственной деятельности человека.

Глава 5. Закономерности реакции растений

на совместное действие 232ТИ с С{1 и внешним у-излучением

В современной практике экологического нормирования эффекты совместного действия факторов оценивают по результатам раздельного на основе принципов линейности и аддитивности. В то же время данных о

раздельном действии факторов на клетки и ростовые процессы растений явно недостаточно, чтобы иметь ясное представление об уровне биологических эффектов, индуцируемых при совместном действии факторов, поскольку в этом случае могут возникать синергические и антагонистические ответные реакции. Синергические и антагонистические эффекты необходимо учитывать в практике экологического нормирования и при оценке экологического риска, если:

- они являются закономерными, а не случайными событиями в диапазоне дозовых нагрузок, характерных для окружающей среды;

— нелинейные эффекты вносят достоверный вклад в реакцию биологических систем разного уровня организации.

Анализ результатов изучения реакции растений на уровне клеток, ткани и органов на совместное кратковременное и хроническое действие 232Т11, у-излучения и Сс1 показал, что синергические мутагенный и токсический эффекты возникают при совместном действии факторов в низких дозах, которые не являются остро токсичными при раздельном действии и характерны для условий слабо и средне загрязненных кадмием территорий (БалКа' сЛ Торр1, СаЫэпеШ, 1999) и участков с повышенным фоном естественной радиоактивности (Титаева, Таскаев, 1983; Мельник и др., 2004).

Так, совместное действие самой низкой из использованных концентраций Сс1 (0.009 мкмоль/л") с 232ТЬ (0.8 мкмоль/л^ на корневую меристему лука приводит (рис. 12) к статистически значимому (р = 2.26-10"®) повышению частоты аберрантных ана-телофаз. Уровень регистрируемого мутагенного эффекта сравним с наблюдаемым при совместном действии радионуклида с Сс! в высокой концентрации (5 мкмоль/л), которая уже раздельно вызывает (рис. 5) достоверное повышение частоты аберрантных клеток. Значения коэффициентов взаимодействия, которые являются (Ге-раськин и др., 1996) количественной мерой отклонения реакции биологической системы на совместное действие факторов от ожидаемого аддитивного отклика, свидетельствуют, что максимальный синергизм в отношении мутагенного эффекта наблюдается именно при действии самой низкой (0.009 мкмоль/л) из использованных концентраций Сс1 с 232ТИ. Дисперсионный анализ показал, что радионуклид вносит определяющий вклад (58.7 %) в индукцию аберрантных клеток, кадмий - 23.5 %, совместное действие факторов - 17 %.

Токсический эффект, выражающийся в снижении скорости роста корней лука через 30 ч от начала эксперимента (рис. 13 А), при совместном действии таких концентраций 232ТИ (0.4, 0.8 мкмоль/л) и Сс! (0.009, 0.09 мкмоль/л), которые сами по себе не ингибируют (рис. 6, 9) ростовые процессы, часто сравним по уровню с регистрируемым в случае раздельного действия высоких концентраций. Через 72 ч именно при самом низ-

Или 0.001 мг/л; ПДК для питьевой воды - 0.001 мг/л (Предельно допустимые..., 2003); для рыбохозяйственных водоемов - 0.0005 (Привезенцев, 1973).

у Или 1.8 мг/л (0.56 Бк/л), что соответствует предельно допустимому уровню вмешательства (Нормы..., 1999) при поступлении с водой для населения.

0.009 0.09 5

Рис. 12. Частота аберрантных ана-телофаз (столбцы на диаграмме с указанием количества проанализированных ана-телофаз) в меристеме корней Allium сера L. после 30-часового действия Cd с 232Th в концентрации 0.8 мкмоль/л и значения коэффициентов взаимодействия (квадраты на диаграмме). По оси абсцисс - концентрация Cd, мкмоль; по оси ординат (слева) - частота аберрантных ана-телофаз, инкремент %; по оси ординат (справа) - значение коэффициента взаимодействия.

Рис. 13. Степень ингибирования (по оси ординат, A Mo / Ma, %) роста корней Allium сера L. за 30 (А) и 72 ч (Б) в растворах нитрата Cd с концентрацией по катиону (по оси абсцисс) 0.009 мкмоль/л (№ 1-3), 0.09 (4-6), 5 (7-9) и 232Th 0.4 мкмоль/л (№ 1, 4, 7), 0.8 (2, 5, 8), 1.6 (3, 6, 9).

ком (0.009 мкмоль/л) содержании в растворе Cd в сочетании со всеми изученными концентрациями 232Th происходит (рис. 13 Б) наиболее существенное торможение роста корней. При этом 232Th и Cd вносят достоверный и равный вклад (соответственно 25.6 и 23.8 %) в индукцию токсическо-

го эффекта. Преобладающее влияние (42.3 %) на рост корней оказывает их совместное действие.

Однотипная реакция наблюдается при хроническом (30 дней) совместном действии Cd и 232Th на традесканцию (клон 02). Все исследованные сочетания концентраций изученных факторов, за исключением варианта совместного действия 0.09 мкмоль/л Cd и 0.4 мкмоль/л 232Th, вызывают (рис. 14) достоверно (р < 0.01) высокий в сравнении с контролем токсический эффект, оцениваемый по снижению репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции. Но только в случае влияния на растения 0.009 мкмоль/л Cd с 0.4 и 0.8 мкмоль/л 232Th регистрируемый токсический эффект оценивается как синергический. Повышение концентраций Cd и/или 232Th приводит к аддитивному либо антагонистическому типам реакции клеток волосков тычинок. Определяющий вклад (75 %) в общую дисперсию показателя «снижение репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции» вносит Cd. Синергический токсический эффект выявлен при воздействии на клетки волосков тычинок традесканции у-излучения в наиболее низких изученных дозах (0.01 и 0.11 сГр) c 232Th в наименьшей из использованных концентраций (0.4 мкмоль/л).

Уровень мутагенного эффекта (рис. 15) при совместном действии изученных факторов в абсолютном большинстве случаев не превышает достоверно контрольный, и характер ответной реакции клеток оценивается как антагонистический. Лишь при содержании в растворе 0.009 мкмоль/л Cd и 0.4 мкмоль/л 232Th зарегистрирована достоверно (р = 5.73'Ю5) высокая частота соматических мутаций. Важно, что синергизм в отношении мутагенного эффекта снова выявлен на фоне низких концентраций в растворе

Рис. 14. Снижение репродуктивной способности (столбцы на диаграмме) клеток волосков тычинок традесканции (клон 02) и значения коэффициентов взаимодействия (квадраты на диаграмме) при совместном действии Сс1 с гз2ТЬ. По оси абсцисс - вариант совместного действия Сс) в концентрациях 0.009 мкмоль/л (№ 1-3), 0.09 (4-6), 5 (7-9) и 232ТЬ 0.4 мкмоль/л (№ 1,4, 7), 0.8 (2, 5, 8) 1.6 (3, 6, 9); по оси ординат (слева) — снижение репродуктивной способности клеток (инкремент, %); по оси ординат (справа) - значение коэффициента взаимодействия.

0,12 у 0,1 -

т 1,6

- 1,4

- 1Д

0,08

-- 1

0,06

-- 0,8

0,04

0,6 -- 0,4

0,02

0

-0,02

2 3 4 5 6 7

8

9

Рис. 15. Частота соматических мутаций (столбцы на диаграмме) в клетках волосков тычинок традесканции (клон 02) и значения коэффициентов взаимодействия (квадраты на диаграмме) при совместном действии Сс! с 232Т11. По оси абсцисс - вариант совместного действия С<Э в концентрациях 0.009 (№ 1-3), 0.09 (4-6), 5 (7-9) мкмоль/л и 232Т1п 0.4 (№ 1, 4, 7), 0.8 (2, 5, 8), 1.6 (3, 6, 9) мкмоль/л; по оси ординат (слева) - частота соматических мутаций (инкремент, %); по оси ординат (справа) - значение коэффициента взаимодействия.

Сс1 и радионуклида. При этом 232ТЬ и совместное действие факторов вносят равный и статистически значимый (р < 0.001) вклад в формирование мутагенного эффекта, в отличие от Сс1, влияние которого оказалось недостоверным (р = 0.22).

Хотя указанные дозы действующих факторов при раздельном действии не вызывали достоверных биологических эффектов у растений по изученным показателям, они могли индуцировать дополнительные к образующимся спонтанно первичные повреждения ДНК. Это показали эксперименты с водными культурами традесканции и опыты с воздействием 2327Т| и Сс! на хлореллу в присутствии кофеина. Взаимодействие и реализация потенциальных повреждений ДНК могли стать одной из причин синергического увеличения выхода цитогенетических повреждений при совместном действии изученных факторов.

В диапазоне низких доз действующих факторов были обнаружены и антагонистические эффекты, проявляющиеся или в снижении частоты мутаций без замедления митотической активности клеток, или ускорении ростовых процессов растений.

Для условий наших экспериментов такую реакцию растений наблюдали при совместном влиянии на лук репчатый и традесканцию 232ТЬ в концентрациях 0.4 или 0.8 мкмоль/л с 0.09 мкмоль/л Сс1. Так, воздействие 0.4 мкмоль/л 232ТЬ с 0.09 мкмоль/л Сс! привело к стимуляции роста корней лука через 30 и 72 ч, а 0.8 мкмоль/л 23ЧЬ с 0.09 мкмоль/л Сс) - через 72 ч (рис. 13 А, Б). При действии на традесканцию 0.4 мкмоль/л 232Т11 совместно с 0.09 мкмоль/л Сс) не регистрировали достоверного по отношению к кон-

тролю увеличения частоты соматических мутаций (рис. 15) и потери репродуктивной способности клеток волосков тычинок (рис. 14). Совместный эффект оценивался как антагонистический. При этом массовой гибели бутонов в соцветиях, которая могла привести к снижению регистрируемого числа повреждений волосков тычинок, не наблюдали. Заметим, что в описанных случаях доза хотя бы одного из факторов была достаточной для активации процессов восстановления повреждений ДНК. Об этом свидетельствуют данные, полученные при действии на клетки хлореллы 232Т11 или Сс1 раздельно и с кофеином: существенные различия в уровнях токсического эффекта, регистрируемого в присутствии кофеина, и без него начинают наблюдаются для соответствующих вариантов с концентрациями 0.8 мкмоль/л 232ТИ и 0.09 мкмоль/л Сс1.

Дальнейшее повышение интенсивности воздействия вызывает достоверные токсические эффекты, регистрируемые на уровне клеток, ткани и органа растений.

Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что совместное действие низких доз факторов может привести к достоверно высоким мутагенным и токсическим эффектам, которые не возникают при раздельном действии факторов в таких же дозах. Это затрудняет прогнозирование биологических последствий низкоинтенсивных радиационных и химических воздействий на основе методов физико-химического анализа, которые дают представление о содержании в объектах окружающей среды отдельных загрязняющих веществ. Подтверждение этого вывода было получено при оценке вклада в индукцию цитогенетических повреждений у растений тяжелых естественных радионуклидов и металлов при поступлении из сложных по ионному составу проб природных вод.

Глава 6. Оценка влияния содержащихся в природных водах

ионов металлов и тяжелых естественных радионуклидов на уровнь цитогенетических повреждений у растений

Результаты биотестирования проб талой воды из различающихся по уровню техногенного загрязнения районов г. Сыктывкар показали, что хотя данные химического анализа свидетельствуют о высоком содержании в большинстве образцов ионов никеля, цинка, марганца и железа, только последний указанный элемент оказывал достоверное влияние на выход соматических мутаций и снижение репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (табл. 5). Прямо пропорциональную зависимость мутагенного и токсического эффектов от концентрации железа в растворе можно объяснить тем, что хотя этот элемент является жизненно важным для растений, в высоких концентрациях он инициирует (Поливода и др., 1990) развитие свободнорадикальных процессов в клетках и задерживает клеточный цикл (РЫ1роН е1 а1., 1998). В то же время Сс1, содержание которого в пробах не превышало ПДК, был включен в качестве предиктора в модель, аппроксимирующую данные по частоте соматических мутаций. Учитывая результаты химического анализа, в данном случае обрат-

Таблица 5

Результаты пошагового регрессионного анализа

Модель | Введенные переменные I Р? I ^ I вг | Р | к,/к2 | р, ~ Для соматических мутаций

1 Ре 0.859 0.738 0.082 8.445 1/3 0.062

2 Ре, Сс( 0.999 0.999 0.006 471.485 1/2 0.002

3 Ре, Сс1, № 1.000 1.000 0.001 119.681 1/1 0.058

Для потери репродуктивной способности клеток

1 Ре 0.807 0.651 0.009 5.589 1/3 0.099

Примечание: Здесь и в табл. 6 - значения критерия Фишера для включения переменной Р > 3.840; для исключения - Р < 2.710; Р - коэффициент корреляции; И2 - коэффициент детерминации: Эг- стандартная ошибка К; к - число степеней свободы.

ную зависимость между регистрируемой у традесканции частотой мутаций и концентрацией Сб в пробах можно объяснить антагонистическим характером его взаимодействия с 2г\ и N1 при поступлении в клетки растений.

Принципиальная возможность возникновения достоверных мутагенных и токсических эффектов при воздействии низких доз факторов радиационной и химической природы была подтверждена в экспериментах по биотестированию проб природных вод с территории радионуклидной аномалии, обусловленной складированием отходов радиевого производства и разливом пластовых вод, содержащих высокие концентрации "^а. Про-

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 16. Частота аберрантных ана-телофаз в меристеме корней Allium schoeno-prasum L., проращиваемых в пробах из природных водных источников, расположенных на территории хранилища отходов радиевого производства (пос. Водный, Ухтинский р-н).

По оси абсцисс - номер пробы; по оси ординат - частота аберрантных ана-телофаз, инкремент, %.

бы (рис. 16) отобраны из истоков (№ 1,2) и устьев (3,4) ручьев, вытекающих из-под радиоактивных отходов и имеющих выход к р. Ухта, микроводоема (5), а также непосредственно из реки в 300 м вниз по течению от хранилища радиоактивных отходов (6), ключа, вытекающего в центральной части коренного берега р. Чуть (7), р. Ухта вне зоны антропогенного и техногенного влияния (8).

Несмотря на то, что содержание изученных радионуклидов не превышало установленного нормами радиационной безопасности (Нормы..., 1999) допустимого уровня вмешательства, они достоверно влияли на час-

Таблица 6

Результаты пошагового регрессионного анализа

Введенные переменные Коэффициенты уравнения регрессии Характеристика качества аппроксимации

^ I а | г | Р,

Константа

Концентрация 232ТИ, мБк/л Концентрация 23811, мБк/л Концентрация 210Ро, мБк/л

Константа

Концентрация ¿п, мг/л Концентрация 23811, мБк/л

Для частоты аберрантных клеток -0.32±0.29 7.51±0.77 0.13±0.02 -1.81±0.68 Для митотического индекса -1.4310.12

53.01±3.48 0.88

-0.04±0.01

0.76 0.74 39.28 <0.001

0.37 136.43 <0.001

тоту аберраций хромосом в клетках корневых меристем шнитт-лука (табл. 6). При этом уровень мутагенного эффекта (рис. 16) достоверно (р < 0.001) превышал контроль при биотестировании образцов (1-7) с территории ра-дионуклидной аномалии и зависел от содержания в пробах воды 232ТИ, 23811 и 210Ро (табл. 6). Уровень токсического эффекта увеличивался прямо пропорционально содержанию в пробах воды 23Ви и снижался при повышении содержания 2х\ в диапазоне концентраций (11.5±2.4 - 65.0±1.0 мкг/л), характерном для изученных проб. Обнаруженные зависимости объясняются, исходя из анализа (Гудков, 1986, 1990; Смирнова, 1989; Алексахин и др., 1990) химических свойств и биологической значимости ионов, включенных в качестве предикторов в модели, аппроксимирующие данные по митотической активности клеток и мутагенному эффекту.

Рассмотренные результаты убедительно свидетельствуют, что при совместном действии радионуклиды и металлы даже в низких концентрациях вносят достоверный и существенный вклад в формирование мутагенного и токсического эффектов. Поэтому при оценке опасности для экосистем радионуклидного и химического загрязнений следует применять комплексный, основанный на принципах экотоксикологии, подход.

Глава 7. Оценка влияния радиоэкологических факторов на уровень генетической изменчивости в ценопопуляции горошка мышиного на участке с повышенным уровнем естественной радиоактивности

Представленные в предыдущих разделах результаты позволили предположить, что именно возникновение синергических и антагонистических эффектов при сочетании низких доз действующих факторов приводит, в зависимости от радиоэкологической ситуации, к существенно разным (от стимуляции развития до угнетения и гибели) биологическим последствиям действия повышенного фона естественной радиоактивности на природные популяции растений и животных. В этих условиях важно определить, насколько уровень наблюдаемых биологических эффектов связан с влиянием факторов радиационной природы.

Поэтому на заключительном этапе исследований была поставлена задача оценить вклад ионизирующих излучений низкой интенсивности в генетическую изменчивость горошка мышиного из природной ценопопуляции, более 40 лет заселяющей стационар с повышенным фоном естественной радиоактивности.

Выбранный для исследований стационар расположен в пос. Водный Ухтинского р-на Республики Коми и представляет собой систему сопряженных элементарных геохимических ландшафтов, включающую приводо-раздельное пространство, первую и вторую надпойменные террасы, пойму р. Ухта. Радиоактивное загрязнение стационара обусловлено складированием привозных отходов уранового производства и этих же отходов после выщелачивания из них радия. В качестве контрольного выбран тот же участок, что и при проведении предыдущих исследований действия повышенного фона естественной радиоактивности на популяции горошка мышиного (Попова и др., 1985). Он расположен в нескольких километрах от г. Сыктывкар в пределах водораздела рек Сысола и Вычегда, окружен лесным массивом, находится на значительном удалении от экспериментального стационара, но в той же почвенно-климатической зоне. Почвы участка подзолистые. Радиоактивное загрязнение исключено. Образцы растений горошка мышиного собирали с четырех приуроченных к основным элементам мезорельефа (склоны от первой (№ 1) и второй (3) надпойменных террас, первая (2) и вторая (4) надпойменные террасы) фаций в восточной части экспериментального стационара и на контрольном участке (табл. 7, 8).

Максимальная мощность дозы в воздухе зарегистрирована (табл. 7) в пределах занимающей подчиненное положение парагенетической ассоциации: первой надпойменной террасы и ее склона. Для них характерны и более высокие удельные активности в приземном слое воздуха 222Ип и короткоживущих продуктов его распада - 218Ро, 214РЬ. В золе произрастающих здесь растений горошка мышиного обнаружены наибольшие концентрации радионуклидов уранового и ториевого рядов, в особенности ^Ка, 228у^_ гзоу^ Характерно и высокое содержание долгоживущих продуктов

Таблица 7

Характеристики радиоактивного загрязнения на экспериментальном стационаре и контрольном участке

Место сбора растений

Содержание тяжелых естественных радионуклидов

ТЬ

в надземной массе горошка мышиного, мБк/г золы

230Т11

|Ви

!°Ро

°РЬ

Ра

в приземном слое воздуха, Бк/м

Ъп

18Ро

"РЬ

ЕЙ

Мощность дозы в воздухе

мкЗв/ч мкР/ч

Контрольный участок 1 2

3

4

0.3+0.1 4.4±0.7 27.0±4.1 1.4±0.3 1.4±0.3 2.2±0.4

60±6

2.0+0.7

0

1.5±0.2 21.0±2.1 204.1 ±18.4 15.5±2.2 8.3±1.1

1.3±0.2 5.3±0.8 63.5±6.3 13.2±2.0 8.3±1.1

0.9+0.1 3.8±0.6 45.9±5.9

1.0±0.1 4.710.7 50.0+7.5

14.3±2.0 6.1±0.9 5.2±1.0 1.9±0.4

16.4±1.6 17.1±1.7 12.9±1.4 3.4±0.6

7566±151 1820±245 273±200 39+30

13415±335 2261±246 287+266 51±41

3935±177 1752+1739241±212 35±13

839±42 173±46 59±4 29+19

0 0.11 9

7+3 58.00 3300

1219 51.00 2400

13115 16.00 758

20±21 1.62 73

Примечание: измерения проведены монитором радоновым А1р11аСиагс1 (*) и ДРГ-01Т (*'

Таблица 8

Частота цитогенетических нарушений в клетках корневой меристемы проростков семян горошка мышиного

из природных ценопопуляций в 2003 г.

Место сбора растений Число проанализированных ана-телофаз, шт. Частота, %

ана-телофаз с повреждениями повреждений всех типов аберраций хромосом фрагментов мостов отставших хромосом

одиночных! двойных одиночных | двойных

Контрольный участок 1 2

3

4

11865

8505 16842 11597 11269

1.40+1.49

1.60И.34 1.06±1.01а 1.17±1.03 1.29±1.33

1.44±1.51 0.8010.91 0.2310.49 0.07Ю.30 0.4410.69 0.06±0.22 0.64±1.06

1.64±1.34 1.1011.02" 1.23±1.07 1.32±1.34

1.33±1.23а 1.0010.95 0.8710.98 0.9810.98

0.2510.49 0.1710.30 0.2110.53 0.2710.48

0.3010.56" 0.4010.59' 0.1810.42" 0.22Ю.546

0. 4010.81 0.1310.33' 0.3010.62 0.3510.62

0.38+0.66' 0.30+0.56' 0.1810.47" 0.1410.37

0.3И0.64 0.10+0.31" 0.36+0.61® 0.35+0.66 6

Примечание: отличие от контроля достоверно при р < 0.05 (а), < 0.01 (б), < 0.001 (в).

о У1

распада ^Ип - 210Ро и 210РЬ. Вторая надпойменная терраса и склон от нее характеризуются меньшим уровнем радиационного фона, но удельные активности 222Яп и продуктов его распада в воздухе, как и мощность дозы, во много раз превосходят контрольные значения. Произрастающий здесь горошек мышиный выносит из почвы меньшие количества ТЕРН в сравнении с растениями двух расположенных ниже по рельефу фаций.

Частота аберраций хромосом в клетках корневой меристемы проростков семян горошка мышиного, собранных со склона от первой надпойменной террасы (№ 1), достоверно (р < 0.05) превысила не только контрольное значение, но и частоты, полученные для трех других (2-4) экспериментальных выборок (табл. 8), которые не различались ни между собой, ни с контролем. Сопоставление данных цитогенетического (табл. 8) и радиохимического (табл. 7) анализов показало, что на средний уровень аберраций хромосом в клетках растений изученной ценопопуляции существенно влияет 230Т11, являющийся в данных условиях одним из дозообразующих радионуклидов (Таскаев, 1979). Именно этот изотоп вошел в качестве предиктора в линейную модель (табл. 9), описывающую изменение средней частоты аберраций хромосом для каждой из четырех экспериментальных и контрольной выборок, в зависимости от совокупности факторов радиационной природы. Достоверное повышение частоты аберраций хромосом в клетках меристем корней проростков семян горошка мышиного наблюдается (табл. 8) при содержании 204.1±18.4 мБк/г золы 230ТИ (табл. 7) в надземной массе растений. При более низкой удельной активности ^ТЬ статистически значимого повышения частоты структурных перестроек хромосом не обнаружено.

Высокие частоты двойных фрагментов, являющихся признаком радиационного воздействия, зарегистрированы в клетках корневых меристем проростков семян горошка мышиного со всех изученных фаций. Ведущим фактором формирования этого типа повреждений является 226Р?а (табл. 9). Причем превышение верхнего предела кпаркового значения содержания данного радионуклида в золе растений^ в 14 раз (табл. 7) ведет к возрастанию частоты двойных фрагментов в 3 раза (табл. 8).

Внешнее облучение в данной радиоэкологической ситуации выступает в качестве фактора отбора, увеличивая частоту эмбриональных летальных мутаций (табл. 9). Достоверно высокий уровень эмбриональных летальных мутаций наблюдается (рис. 17) у растений, заселяющих фации с гамма-фоном 2400 и 3300 мкР/ч (табл. 7).

Изучая реакцию природных популяций важно учитывать гетерогенность особей по чувствительности к действию разных факторов, которая определяет возможность выживания в неблагоприятных условиях среды. Именно поэтому вариабельность признаков в популяциях, заселяющих техногенно загрязненные территории, оказывается выше, чем в контроле, хотя средние величины регистрируемых эффектов могут не отличаться. Такая ситуа-

1.62-1012 г/г (Виноградов, 1957) или 60 мБк/г, что соответствует контрольному значению в нашем эксперименте.

АЗ

Результаты пошагового регрессионного анализа

Таблица 9

Коэффициенты Характеристика

Введенные переменные уравнения качества аппроксимации

регрессии Я1 1 а Г Р | р,

Для частоты аберраций хромосом Константа 0.783±0.04 п07

Концентрация 230ТЬ, мБк/г золы 27.74-103±0.001 э.оапи

Для частоты хромосомных фрагментов Константа 0.129±0.039 г

Концентрация22*^, мБк/гзолы 2.07-10^0.001 о.ьо ти

Для частоты эмбриональных летальных мутаций Константа 23.92±1.09 одз . „д

Мощность дозы в воздухе, мкЗв/ч 0.19Ю.031

60

50

р — 0.04

р = 0.003

47.67 0.006

14.49 0.032

36.95 0.009

40

Контроль 12 3 4

Рис. 17. Частота эмбриональных летальных мутаций (по оси ординат, %) в бобах горошка мышиного с контрольного участка и экспериментального стационара с повышенным фоном естественной радиоактивности (1 - склон от первой надпойменной террасы, 2 - первая надпойменная терраса, 3 - склон от второй надпойменной террасы, 4 - вторая надпойменная терраса).

ция имеет место и в нашем случае. Дисперсии частот аберраций для всех экспериментальных выборок оказались выше контрольного значения (рис. 18). Причем пределы варьирования индивидуальных частот цитоге-нетических повреждений расширяются с повышением содержания (мБк/г золы) 23°ТГ| в растении: (0.740 ± 0.038) + (0.004 ± 0.001) -232Т|1 (К2 = 0.975; Б, = 0.05; Р = 104.47; рР = 0.002). Это означает, что инкорпорированный 230Т1п является не только одним из ведущих факторов индуцированного мутагенеза, но и во многом определяет условия адаптации горошка мышиного в изученной радиоэкологической ситуации.

В работах многих ведущих радиоэкологов отмечена необходимость решения вопроса о реальном вкладе радиационно индуцированного мутаге-

Контроль 12 3 4

Рис. 18. Дисперсия (по оси ординат) частоты аберрантных клеток (%) в корневой меристеме проростков семян горошка мышиного, заселяющего контрольный участок и экспериментальный стационар с повышенным фоном естественной радиоактивности (1 - склон от первой надпойменной террасы, 2 - первая надпойменная терраса, 3 -склон от второй надпойменной террасы, 4 - вторая надпойменная терраса).

неза в общий уровень генетических нарушений, наблюдаемых в природных популяциях. Нам удалось решить эту задачу и установить (табл. 10), что в изученной радиоэкологической ситуации вклад индуцированного факторами радиационной природы мутагенеза в уровень изменчивости горошка мышиного составляет 3-5 % и является достоверным. Поэтому им нельзя пренебречь при оценке адаптивных возможностей природных популяций растений, заселяющих территории с повышенным фоном естественной радиоактивности.

Таблица 10

Результаты оценки вклада индуцированного факторами радиационной природы мутагенеза в уровень генетической изменчивости растений горошка мышиного из природных ценопопуляций

Коэффициенты Характеристика

Введенные переменные уравнения качества аппроксимации

регрессии ^ I Б, | Р | р,

Для частоты аберраций хромосом Константа 0.77±0.063 п п

Концентрация 23®ТИ, мБк/г золы 2.82-10-3±0.001

Для частоты хромосомных фрагментов Константа 0.12±0.027 п

Концентрация221^, мБк/гзолы 2.2-10"5±0.001 и и:>

Для частоты эмбриональных летальных мутаций Константа 23.92±1.39

Мощность дозы в воздухе, мкЗв/ч 0.19±0.039

0.98 18.12 0.001

0.48 30.16 0.001

0.04 21.65 22.68 0.001

ьЧ

В целом, анализ представленных результатов показал, что в условиях природных биогеоценозов с повышенным уровнем естественной радиоактивности как внешнее облучение в малых дозах, так и инкорпорированные тяжелые естественные радионуклиды оказывают достоверное влияние на уровень изменчивости в популяциях растений и определяют возможности их адаптации к конкретной радиоэкологической ситуации. Достоверный вклад повышенного фона естественной радиоактивности в мутационную изменчивость растений не позволяет пренебречь этим фактором при разработке норм защиты живой природы от радиационных воздействий.

Заключение

Современная экологическая ситуация характеризуется высокими темпами техногенного загрязнения среды обитания животных и растений, значительный вклад в которое вносят ионизирующие излучения и тяжелые металлы.

Представленные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что синергический и антагонистический типы реакции растений являются закономерными событиями и с наибольшей вероятностью наблюдаются при совместном воздействии факторов радиационной и химической природы в дозах, характерных для слабо и средне загрязненных металлами экосистем и территорий с повышенным фоном естественной радиоактивности. Именно возникновение нелинейных эффектов, являющихся результатом как взаимодействия потенциальных повреждений ДНК, вызванных каждым фактором в отдельности, так и следствием фундаментального свойства всех открытых саморазвивающихся систем не пассивно воспринимать внешние сигналы, а усиливать или ослаблять их в зависимости от интенсивности, характера этих воздействий и тенденций развития самой системы, приводит к существенно разным (от стимуляции развития до угнетения и гибели) биологическим последствиям действия повышенного фона естественной радиоактивности на природные популяции растений и животных. В таком случае крайне важно решить вопрос о реальном вкладе радиационно индуцированного мутагенеза в общий уровень генетических нарушений, наблюдаемых в природных популяциях. Это позволит корректно оценить степень радиационного воздействия на биоту, разработать и применить комплексный подход к решению научных, управленческих и социальных задач, непосредственно связанных с оценкой экологического риска техногенного, в том числе радиоактивного, загрязнения.

Впервые проведенная нами количественная оценка вклада факторов радиационной и химической природы в индуцируемые биологические эффекты у растений из лабораторных и природных популяций показала, что при совместном действии радионуклиды и металлы даже в низких концентрациях статистически значимо влияют на уровень мутагенного и токсического эффектов. Радионуклиды вносят определяющий вклад в индукцию

генных мутаций и аберраций хромосом, токсический эффект может зависеть от концентраций и радионуклидов, и металлов.

В изученной радиоэкологической ситуации, характеризующейся повышенным содержанием в растениях радионуклидов уранового и ториевого рядов, экстремальными климатическими условиями (низкие среднегодовые температуры, короткий летний период, избыточная влажность и др.), инкорпорированный в надземной массе горошка мышиного 23(ПТ| определяет не только уровень внутрипопуляционной цитогенетической изменчивости, но и, увеличивая вариабельность растений по чувствительности к внешним воздействиям, - возможности адаптации этого вида. Достоверно высокие частоты двойных фрагментов, являющихся признаком радиационного воздействия, зарегистрированы в клетках корневых меристем проростков семян горошка мышиного, заселяющего все исследованные фации стационара. Ведущим фактором формирования этого типа повреждений является 226На. Внешнее облучение выступает в качестве фактора отбора, увеличивая частоту эмбриональных летальных мутаций у растений. Отсюда следует, что не только внешнее у-облучение, но и инкорпорированные тяжелые естественные радионуклиды вносят достоверный вклад в наблюдаемый уровень генетической изменчивости природных популяций растений. Поэтому в случае оценки и прогноза последствий для биоты повышенного уровня естественной радиоактивности нельзя ограничиваться измерениями уровня внешнего гамма-фона и необходимо учитывать влияние дозообразующих тяжелых естественных радионуклидов, спектр которых определяется конкретной радиоэкологической ситуацией.

Полученные данные о достоверном влиянии ТЕРН на уровень изменчивости в природных популяциях растений и возможности их адаптации позволяют акцентировать внимание на необходимости изучения закономерностей реакции биологических систем на воздействие этих элементов. С этих позиций большое значение приобретают впервые полученные нами данные о действии 232Т1т на растения. Показана способность 232ТЬ при хроническом действии в низких концентрациях индуцировать генные мутации. С точки зрения экологического нормирования внимания заслуживает тот факт, что у различающихся систематическим положением растений достоверный токсический эффект как в случае кратковременного, так и хронического воздействия 232Т1т наблюдался при одной и той же концентрации - 1.6 мкмоль/л.

Детальное изучение зависимости уровня токсического эффекта у хлореллы от концентрации 232ТМ в растворе позволило установить наличие двух дозонезависимых участков в диапазоне низких доз, как это наблюдалось при действии Сс1 на хлореллу и у-излучения на клетки волосков тычинок традесканции. Качественное сходство закономерностей формирования ответных реакций клеток, принадлежащих к разным таксономическим группам растений, на действие различающихся по физическим и химическим свойствам факторов - 23ГП1, Сс1 и у-излучения - свидетельствует о существовании универсальных эволюционно консервативных механизмов, в значительной степени определяющих характер ответной реакции клеток расте-

ний в диапазоне низких доз. В этом, наиболее важном с точки зрения практических приложений диапазоне, процессы восстановления повреждений ДНК играют значительную роль в снижении токсического и/или мутагенного эффектов гз2ТЬ, Сс1 и у-излучения. Поэтому при изучении механизмов адаптации природных популяций к повышенному уровню естественной радиоактивности среды обитания необходимо обратить особое внимание на изменение скорости и эффективности репарационных процессов.

Выявленные общие закономерности реакции растений на воздействие различающихся физическими и химическими свойствами факторов должны существенно упростить решение вопросов экологического нормирования и позволяют с единых позиций оценивать опасность для биоты радиационных и химических воздействий.

С другой стороны, полученные нами данные, подкрепленные результатами исследований других авторов, убедительно свидетельствуют, что при разработке теоретических основ и практических методик защиты биоты необходимо учитывать следующие важные положения:

— нелинейность зависимости «доза - эффект» в случае как химических, так и радиационных воздействий;

— невозможность экстраполяции эффектов с высоких доз на низкие как в случае раздельного, так и совместного действия факторов на биологические системы;

— повышенную вероятность возникновения синергических и антагонистических эффектов при совместном действии низких доз факторов радиационной и химической природы.

Последнее положение дает веские основания считать целесообразным разработку системы ограничений радиационных воздействий на био-ту с учетом региональных особенностей, опирающуюся на одобренные на международном уровне рекомендации по защите окружающей среды, созданию которых в настоящее время уделяется значительное внимание со стороны ряда ведущих международных организаций.

Выводы

1. Синергический и антагонистический типы реакции биологических систем на совместное воздействие факторов радиационной и химической природы являются закономерными событиями и возникают с наибольшей вероятностью в диапазоне низких, характерных для условий окружающей среды, дозовых нагрузок. По этой причине реально наблюдаемый уровень биологических эффектов в природных популяциях, населяющих радиоактивно загрязненные территории, часто существенно отличается от прогнозируемого на основе результатов экспериментальных исследований раздельного действия факторов. В этих условиях как внешнее облучение в малых дозах, так и инкорпорированные тяжелые естественные радионуклиды оказывают достоверное влияние на уровень генетической изменчивости в популяциях и возможности их адаптации к конкретной радиоэкологической ситуации.

2. Синергические мутагенный и токсический эффекты могут возникать при совместном действии на растения факторов радиационной и химической природы в дозах, которые не являются остро токсичными, но индуцируют дополнительные к образующимся спонтанно потенциальные повреждения ДНК. В диапазоне низких доз действующих факторов могут быть обнаружены и антагонистические эффекты, проявляющиеся или в ускорении ростовых процессов растений, или снижении частоты генных мутаций и аберраций хромосом без замедления митотической активности клеток. Для этого доза хотя бы одного из факторов должна быть достаточной для активации процессов восстановления повреждений ДНК. Увеличение интенсивности воздействия ведет к проявлению достоверных токсических эффектов, регистрируемых в зависимости от силы совместного влияния факторов, на уровне тканей, органов или организма в целом.

3. Форма зависимости мутагенного и токсического эффектов у растений от силы воздействия факторов радиационной и химической природы универсальна и характеризуется наличием трех участков, различающихся уровнем индуцируемых повреждений. В первом диапазоне регистрируемый биологический эффект не отличается достоверно от спонтанного, в пределах второго - статистически значимо превышает его, оставаясь на неизменном уровне. В этих диапазонах дозовых нагрузок сохранение неизменного (не отличающегося от контроля или достоверно повышенного) уровня цитогенетических нарушений во многом связано с эффективностью восстановления повреждений ДНК. Дальнейшее увеличение интенсивности воздействия приводит к монотонному приращению отклика биологической системы.

4. Эндогенный глутатион имеет большее значение для предотвращения развития индуцируемых 232Th свободнорадикальных процессов, чем при детоксикации Cd в качестве субстрата для образования фитохелати-нов. Ингибирование дополнительного синтеза глутатиона Ьбутионин-Б.Я-сульфоксимином (0.02 ммоль/л) повышает чувствительность клеток хлореллы как к действию концентраций 1.293-1.551 мкмоль/л 232Th, не влияющих на прирост биомассы водоросли за 24 ч, так и (1.595-2.155 мкмоль/л) достоверно снижающих его в среднем на 1.7 %. Роль глутатиона в снижении токсичности Cd для клеток хлореллы выявлена при концентрациях более 0.9 мкмоль/л, которые ингибируют прирост биомассы водоросли на 25-99 %.

5. Реакция растений (Tradescantia (клон 02), Allium сера) на кратковременное и длительное воздействие Cd при поступлении из водных растворов с разной концентрацией существенно различается. Низкие концентрации кадмия (0.009 мкмоль/л и 0.09 мкмоль/л) не являются остро токсичными и не индуцируют достоверных мутагенных эффектов, но при хроническом воздействии могут вызывать токсический эффект, ослабевающий с течением времени. В более высоких (5 мкмоль/л) концентрациях Cd приводит к достоверным мутагенному и токсическому эффектам уже при кратковременном (30 ч) воздействии. С течением времени токсический эффект усиливается.

6. При поступлении из водных растворов с одинаковой концентрацией 232Th вызывает однотипные реакции у различающихся систематическим положением растений - Allium сера, Tradescantia (клон 02) и Chlorella vulgaris. Воздействие 0.4 мкмоль/л 232Th не приводит к статистически значимому повышению уровня мутагенного и токсического эффектов. При содержании в растворе 1.6 мкмоль/л 232Th индуцирует достоверный токсический эффект. В концентрации 0.8 мкмоль/л 232Th вызывает повышение частоты ана-телофаз с отставшими хромосомами и доли метафаз с колхи-циновыми митозами в корневой меристеме Allium сера. При этом содержании 232Th зарегистрирована стимуляция роста корней Allium сера. Выявленный эффект не связан с феноменом гормезиса, поскольку обусловлен достоверным увеличением по сравнению с контролем длины клеток в базальной части зоны растяжения корня и не является следствием возрастания скорости деления или пула пролиферирующих клеток.

Мутагенный эффект 232Th проявляется при хроническом воздействии на клетки волосков тычинок Tradescantia (клон 02) и увеличивается пропорционально концентрации радионуклида в растворе.

7. Результаты биотестирования с использованием Tradescantia (клон 02) и Allium schoenoprasum образцов природных вод из контрастных по типам загрязнения районов показали, что при совместном действии тяжелые естественные радионуклиды и/или металлы даже в низких концентрациях достоверно влияют на формирование мутагенного и токсического эффектов. Радионуклиды вносят определяющий вклад в индукцию генных мутаций и аберраций хромосом, токсический эффект может зависеть от концентраций и радионуклидов, и металлов. Поэтому при оценке опасности для экосистем радионуклидного и химического загрязнений следует применять комплексный, основанный на принципах экотоксикологии, подход. На первом этапе целесообразно использовать методы биологического тестирования, позволяющие получить интегральную оценку действия присутствующих в природных средах компонентов. Если результаты биотестов оказываются положительными, следует прибегнуть к более детальным исследованиям, включая биологический мониторинг, физико-химический анализ, выявление геохимических барьеров, определение параметров миграции загрязняющих веществ в конкретном ландшафте. Сопоставление данных биологического тестирования и результатов физико-химического анализа позволит выявить факторы, интенсивность воздействия которых следует контролировать в первую очередь.

8. Количественно оценен вклад ионизирующих излучений низкой интенсивности в генетическую изменчивость Vicia cracca из природной цено-популяции, более 40 лет заселяющей стационар с повышенным фоном естественной радиоактивности. В данной радиоэкологической ситуации внешнее облучение выступает в качестве фактора отбора, увеличивая частоту эмбриональных летальных мутаций у растений, а инкорпорированный в надземной массе горошка мышиного 230Th определяет не только уровень внутрипопуляционной цитогенетической изменчивости, но и, увеличивая вариабельность растений по чувствительности к внешним воз-

действиям, - возможности адаптации этого вида. Ведущим фактором, обусловливающим высокий уровень двойных фрагментов, являющихся признаком радиационного воздействия, является инкорпорированный ^Ра. Отсюда следует, что в случае оценки и прогноза последствий для биоты повышенного фона естественной радиоактивности нельзя ограничиваться измерениями уровня внешнего гамма-излучения и необходимо учитывать влияние дозообразующих тяжелых естественных радионуклидов, спектр которых определяется конкретной радиоэкологической ситуацией.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Евсеева Т.И., Шершунова В.И. Частота соматических мутаций в волосках тычинок ТгабевсапНа (клон 02) при облучении в диапазоне малых доз гамма-лучей // Воздействие радиоактивного загрязнения на наземные экосистемы в зоне аварии на Чернобыльской АЭС (1986-1996 гг.). -Сыктывкар, 1996. - Т. 2. - С. 56-63. - (Тр. Коми НЦ УрО РАН; № 145).

2. Евсеева Т.И., Зайнуллин В.Г. Сочетанное действие хронического гамма-облучения и нитрата тория-232 на традесканцию (клон 02) в условиях водной культуры И Радиационная биология. Радиоэкология, 1998. - Т. 5,

*\/№ 6. - С. 856-864. __-

3. Евсеева Т.И., Зайнуллин вТгГиспользование биологических тест-систем в мониторинге состояния окружающей среды // Человек на севере: условия и качество жизни. - Сыктывкар, 1999. - 296 с. (Материалы науч.-аналит. конф., 27 - 28 октября 1998 г., Сыктывкар). - С. 233-237.

4. Гераськин С.А., Евсеева Т.И. Механизмы формирования ответной реакции клетки на сочетанное действие факторов разной природы // Сочетанное действие факторов радиационной и нерадиационной природы на растительные и животные организмы. - Сыктывкар, 2000. - С. 6-12. -(Тр. Коми науч. центра УрО РАН, № 6).

5. Евсеева Т.И., Гераськин С.А. Раздельное и в сочетании с солями ■ ^ тяжелых и щелочных металлов действие тория-232 на традесканцию

\^((<лон 02) // Радиационная биология. Радиоэкология, 2000. - Т. 40, вып. 5. -С. 456-461. Г-—___

6. Евсеева Т.И., Гераськин С.А. Цитогенетические эффекты раздель-л ного и совместного действия нитратов тория-232 и калия на традесканцию Чклон 02) // Цитология, 2000. - № 8. - С. 181-186.

7. Евсеева~"ПИ., Зайнуллин В.Г. Исследование мутагенной активности атмосферного воздуха и снежного покрова г. Сыктывкар по тесту сома-

!\^Гических мутаций в волосках тычинок традесканции (клон 02) // Экология, 2000. - № 5. - С. 343-349. V---

8. Евсеева Т.И., Гераськин С.А. Использование традесканции для оценки токсичности, тератогенности и мутагенности проб талой воды, содержащих тяжелые металлы // Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности: Тр. Междунар. экол. конгресса (Санкт-Петербург, 14-16 июня 2000 г.). В 2-х томах. - СПб., 2000. - Т. 2. - С. 178-181.

я-

9. Евсеева Т.И., Гераськин С.А., Храмова Е.С. Цитогенетические эффекты раздельного и совместного действия нитратов тория-232 и кадмия на клетки корневой меристемы Allium сера//Цитология, 2001.-Т. 40, № 8. -С. 365-370.

10. Евсеева Т.И., Гераськин С.А. Сочетанное действие факторов радиационной и нерадиационной природы на традесканцию (клон 02). - Екатеринбург: УрО РАН, 2001. - 156 с.

11. Евсеева Т.И. Оценка последствий техногенного загрязнения среды обитания на состояние биогеоценозов // Вестн. Коми НЦ УрО РАН, 2001. -Вып. 18.-С. 21-31.

12. Евсеева Т.И., Гераськин С.А., Храмова Е.С. Цитогенетические эффекты сочетанного действия тория-232 с ионами щелочных и тяжелых металлов на меристематические клетки растений И Радиоэкология. Охрана окружающей среды, 2001. - С. 143-148. - (Вестн. Науч. Ядерного центра республики Казахстан; Вып. 3).

13. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Удалова A.A., Евсеева Т.И. Проблема оценки индуцированных низкодозовым облучением цитогенетических эффектов у растений // Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции: Тр. междунар. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения Н.В. Тимофеева-Ресовского. - Дубна, 2001. - С. 182-190.

14. Evseeva T.I., Khramova E.S. Action of low concentrations of 232Th on Tradescantia (clone 02) and meristematic root tip cells of Allium сера // High levels of natural radiation and radon areas: radiation doses and health effects: Proc. V Intern. Conf. (Munich September 4-7, 2000). - Bremenhaven (Germany), 2002. -Vol.2. P. 489-491.

15. Евсеева Т.И., Гераськин C.A., Храмова Е.С. Комплексная оценка радиоактивного и химического загрязнения водоемов в районе расположения хранилища отходов радиевого промысла // Экология северных территорий России: проблемы, прогноз ситуации, пути развития, решения: Матер, междунар. конф. (17-22 июня, 2002 г.). В 2-х томах. - Архангельск, 2002. - Т. 2. - С. 130-134.

16. Евсеева Т.И., Гераськин С.А., Фролова Н.П., Храмова Е.С. Использование природных популяций Taraxacum officinale Wigg. для оценки состояния техногенно нарушенных территорий // Экология, 2002. - № 5. - ' С. 379-382. -----

17. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Евсеева Т.И., Удалова A.A., Дикаре-ва Н.С., Васильев Д.В. Цитогенетические эффекты слабых и сочетанных воздействий у растений в связи с проблемой экологического нормирования // Вестник Национального Ядерного Центра Республики Казахстан. Радиоэкология. Охрана окружающей среды, 2002. - Вып. 3. — С. 90-96.

18. Евсеева Т.И., Гераськин С.А. Закономерности индукции цитогенетических нарушений в клетках меристем растений при сочетанном действии тяжелых естественных радионуклидов, тяжелых и щелочных металлов II Qy Радиационная биология. Радиоэкология, 2003. - Т. 43, № 4. - С. 489-494.

19. Евсеева Т.И., Г^раськин~С7СТХрамова Е.С. Сравнительная оценка ранних и отдаленных реакций клеток растений на кратковременное и хро-

рай

ническое сочетанное воздействие 232Th и Cd // Цитология и генетика, 2003. -№3. -С. 61-66.

20. Tatiana I. Evseeva, StanislavA. Geras'kin, Ida I. Shuktomova. Genotoxicity and toxicity assay of water sampled from a radium production industry storage cell territory by means of Allium-test // Journal of Environmental Radioactivity, 2003. - № 68. - P. 235-248.

21.Гераськин C.A., Дикарев В.Г., Евсеева Т.И., Удалова А.А., Дикаре-ва Н.С., Васильев Д.В. Закономерности индукции цитогенетических эффектов у растений в условиях низкодозовых и сочетанных воздействий в связи с проблемой экологического нормирования // Радиоэкологические и биологические последствия низкоинтенсивных воздействий. - Сыктывкар, 2003. - С. 169-190. - (Тр. Коми науч. центра УрО РАН, № 172.).

22. Evseeva Т., Khramova Е. The use of Tradescantia (clon 02) for combined effects of ionizing radiation, 232Th and KN03 study // Modern problems of bioindication and biomonitoring. Exig. XI Intern. Symp. on bioindicators. - Syktyvkar, 2003. - P. 114-121.

23. Евсеева Т.И., Гераськин C.A., Шуктомова И.И., Храмова Е.С. Комплексное изучение радиоактивного и химического загрязнения водоемов в

оне расположения хранилища отходов радиевого промысла // Эколо-2003.-№3.-С. 176-183. -----

24. Евсеева Т.И., Гераськин С.А., Шуктомова И.И., Таскаев А.И. Оценка гено- и цитотоксичности химического и радионуклидного загрязнения водоемов в районе проведения подземного ядерного взрыва на севере Пермской области // Радиационная биология. Радиоэкология, 2004. - Т. 44, № 6. -С. 684-693. —,

25. Гераськин С.А., Васильев Д.В., Дикарев В.Г., Удалова А.А., Евсеева Т.И., Дикарева Н.С., Зимин В.Л. Оценка методами биоиндикации техногенного воздействия на популяции Pinus sylvestris L. в районе предприятия по хранению радиоактивных отходов // Экология, 2005. - № 4. - С. 1-11.

26. Evseeva Т.I., Geras'kin S.A, Shuktomova 1.1., TaskaevA.I. Genotoxicity and cytotoxicity assay of water sampled from the underground nuclear explosion site in the north of the Perm region (Russia) // Journal of Environmental Radioactivity, 2005. - Vol. 80. - P. 59-74.

27.Evseeva T.I., Geras'kin S.A., TaskaevA.I., Shuktomova I.I. Genotoxicity and cytotoxicity assay of water sampled from natural reservoirs with contrast level of radioactive and chemical contamination // Radioprotection, 2005. -Vol. 40. - Suppl. 1. - P. 205-210.

28. Geras'kin S., Kim J., Evseeva Т., OudalovaA., Dikarev V., plants ecotoxi-cology. A case of low doses and multi-pollutant exposure // Radioprotection, 2005. - Vol. 40. - Suppl. 1. - P. 157-162.

29. OudalovaA. A., Geras'kin S.A., Dikarev V.G., Evseeva T.I., Dikareva N.S. Cytogenetic effects induced by low level radiation in plant meristems / Change and continuity in radiation protection. Proceedings of the Seventh International Symposium of the Society for Radiological protection (Cardiff, UK). - Cardiff, 2005.-P. 356-361.

30.0udalovaA.A., Geras'kin S.A., EvseevaT.I., Dikarev V.G., Vasiliev D.V. An assessment of the effect of radiation on plants: specific features of low-level exposure /The 2nd International Conference on Radioactivity in the Environment, proceedings (Osteras, Norway). - Osteras, 2005. - P. 158-161.

31. Geras'kin S.A., Dikarev V.G., Dikareva N.S., Oudalova A.A., Vasiliyev D.V., Evseeva T.I. Cytogenetic effects in plants after weak and combined exposures and a problem of ecological standardization // Equidosimetry. Ecological Standardization and Equidosimetry for Radioecology and Environmental Ecology. / Eds. Brechignac, F.; Desmet, G. - NATO Security Through Science Series: Springer, 2005. Sub-Series C: Environmental Security. - Vol. 2. - P. 245-255.

32. Евсеева Т.И., Майстренко T.A., Гераськин C.A., Белых Е.С., Казакова Е.В. Токсические и цитогенетические эффекты, индуцируемые у Allium сера низкими концентрациями Cd и 232Th // Цитология и генетика, 2005. -Т. 39. - №. 5. - С. 73-80.

33. Евсеева Т.И., Гераськин С.А., Белых Е.С., Таскаев А.И., Майстренко Т.А. Закономерности реакции растений на совместное действие радионуклидов и металлов // Вопросы радиационной безопасности, 2006. - № 3.-С. 28-40. ---------

Информационно-издательская группа Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28

Введение

Глава 1. Аналитический обзор средств, предназначенных для функциональнологического проектирования и моделирования устройств цифровой техники

1.1. Цифровая электронная техника, ее особенности и тенденции развития

1.1.1. Цифровая аппаратура, состояние и тенденции развития.

1.1.2. Элементная база.

1.1.3. Особенности поведения объектов цифровой техники.

1.1.4. Технология конструирования

1.2. Средства моделирования объектов цифровой и вычислительной техники.

1.2.1. Роль и место моделирования в общем процессе конструирования.

1.2.2. Особенности моделирования дискретно-событийных систем.

1.2.3. Основные модели

1.2.3.1. Конечные автоматы

1.2.3.2. Язык конструирования и моделирования высокого уровня VHDL.

1.2.3.3. Сети Петри

1.2.3.4. Диаграммы состояний.

1.2.3.5. Процессы интерактивного взаимодействия.

1.2.3.6. Язык синхронизации Esterel.

1.2.3.7. Язык описания спецификаций SDL.

1.2.3.8. Синхронный информационный поток.

1.2.3.9. Модели потоков данных и управления.

1.2.3.10. Графы переходов.

1.2.3.11. Универсальные языки.

1.3. Методологии проектирования, ориентированные на использование моделей

1.3.1. Методики проектирования неоднородных систем.

1.3.2. Универсальные методики.

1.4. Сети Петри.

1.4.1. Формальное представление СП.

1.4.2. Свойства сетей Петри.

1.4.2.1. Поведенческие свойства.

1.4.2.2. Структурные свойства.

1.4.3. Учет времени в сетях Петри.

1.4.4. Типовые сети Петри.

1.4.5. Основные расширения сетей Петри для моделирования средств цифровой автоматики и вычислительной техники.

1.5. Проблема сложности и способы ослабления ее влияния.

1.5.1. Общие концепции пространства состояний.

1.5.2. Абстракции, связанные с понятием состояний и переходов.

1.5.3. Методические основы исследования пространства состояний.

1.5.4. Передовые методы борьбы с проблемой сложности.

1.5.4.1. Методы, основанные на предварительной обработке.

1.5.4.2. Методы, использующие упакованные пространства состояний.

Актуальность проблемы. Глобальная информатизация, охватившая современное общество, обусловлена бурным развитием современных средств цифровой автоматики и вычислительной техники. Ее интенсивное распространение во все сферы человеческой деятельности настоятельно требует создания постоянно растущего количества новой, все более совершенной и самой разнообразной аппаратуры. При этом наблюдается явная тенденция к непрерывному увеличению ассортимента и сложности цифровой электронной техники при одновременном сокращении сроков разработки и ужесточении требований к качеству ее функционирования. Кроме того, становится все более заметным возрастающий интерес специалистов, занимающихся разработкой цифровой аппаратуры, к использованию в своей практической работе средств и методов имитационного моделирования, анализа характеристик и особенностей поведения объектов, которые были бы одинаково понимаемы и доступны, как специалистам по моделированию, так и специалистам по цифровой электронной технике. Быстрое и качественное проектирование и разработка цифровой аппаратуры становятся уже невозможными без использования высокоэффективных инструментальных средств, предназначенных как для проведения имитационного эксперимента, так и анализа качества функционирования сложных цифровых устройств и систем.

Благодаря особенностям функционирования, характеризующих поведение объектов цифровой техники, их принято рассматривать как дискретно-событийные системы. Для изучения систем было предложено множество моделей, наиболее известными из которых, являются: модели алгебры логики, конечные автоматы, сети Петри, диаграммы состояний, системы массового обслуживания, цепи Маркова, нейронные сети и другие.

Сети Петри (СП), предложенные для изучения поведения параллельных автоматов, очень хорошо подходят для моделирования дискретно-событийных систем. С момента своего появления они получили необычайно широкое распространение среди исследователей, определенное, главным образом, их простотой, наглядностью и хорошо развитым математическим аппаратом для формального представления, имитационного моделирования и анализа моделируемых дискретных систем. В настоящее время СП эффективно применяются при моделировании систем в самых различных областях человеческой деятельности, в том числе и для моделирования средств цифровой схемотехники. С этой целью используются как классические СП, так и специально разработанные расширения. В разработку и совершенствование теории СП и вопросам их практического применения для моделирования средств цифровой и вычислительной техники большой вклад виесли работы таких ученых как Hariel D., Cortadella, Esparza, McMillan, Milner, Ангер С., Варшавский В.И., Яковлев А.В., Кишиневский М.А., Закревский А.Д. и др. В результате было предложено множество новых средств, позволивших создать более эффективные и совершенные модели. Например, такие как ингибиторные, оценочные, схемные, операционные СП, графы операций и многие другие.

Однако, несмотря на успехи, достигнутые в процессе развития СП, их практическое применение связано с рядом проблем, возникающими, в основном, при использовании этих моделей в существующих инструментальных средствах для разработки цифровой техники. Одна из них заключается в наличии слабой формальной и однозначной связи между языками, на которых осуществляется описание модели и объекта. Объясняется это тем, что совершенствование моделей происходит преимущественно в направлении расширения их моделирующих возможностей и игнорируются вопросы, связанные с их последующим использованием разработчиками реальной аппаратуры, слабо ориентирующихся в технике моделирования. Совершенно очевидно, что для представления или описания моделей, как правило, используются атрибуты и понятия необходимые только для описания наиболее общих свойств объектов. При этом многие из атрибутов, при помощи которых происходит описание реальных объектов, например, на схемном уровне, в моделях могут отсутствовать. Подобная ситуация вынуждает использовать соответствующую интерпретацию результатов моделирования с последующим их переносом на реальный объект и наоборот. Однако, часто такая интерпретация оказывается достаточно сложной или вообще невозможной операцией и, как правило, плохо поддается формализации. Другими словами, несмотря на усилия многих исследователей, проблема несоответствия между понятием модели как формального объекта и понятием дискретного устройства, впервые рассмотренная Д.Е. Маллером в рамках теории "схем", сохранилась. Это приводит к искусственному и нежелательному разделению процесса исследования моделируемого объекта на два отдельных процесса: собственно моделирования и последующей его интерпретации и переноса полученных результатов на моделируемый объект. Такая ситуация диктует необходимость либо дополнительного привлечения специалиста по имитационному моделированию, либо наличия более квалифицированного разработчика цифровых устройств, одинаково хорошо ориентирующегося как в своей предметной области, так и в области моделирования. Как показывает опыт работы многих ученых, устранить несоответствие между моделью и объектом только за счет рационального подбора атрибутов модели не приводит к желаемому результату. Становится очевидным, что для решения этой проблемы следует учитывать не только влияние не только атрибутов, но и правил функционирования и основных положений концепций, положенных в основу построения сетевых моделей.

Существует и другая, не менее важная проблема, непосредственно связанная с использованием моделей при проведении аналитических исследований характеристик и свойств моделируемых объектов. Это проблема сложности. Суть этой проблемы заключается в том, что в основе преобладающего большинства методов, связанных с анализом поведения моделей, используется граф достижимых состояний или граф достижимости. Однако, при увеличении размера модели, количество достижимых ею состояний (то есть размер графа достижимости) возрастает еще более высокими темпами. Данное обстоятельство вынуждает использовать для этой цели только относительно простые модели. На эту тему было издано большое количество книг и монографий отечественных и зарубежных ученых, таких как (Valmari А., Мурата Т., Розенберг Г., Йенсел К., Яковлев А.В.и др.). В результате проведенных ими исследований были предложены достаточно эффективные способы, позволяющих в отдельных случаях обойти или ослабить влияние проблемы сложности. Однако, в целом важность этой проблемы не только сохраняется, но и становится все более злободневной. Такой результат, приводит к заключению о том, что многочисленные исследования, направленные на решение проблемы сложности и использующие классическую форму представления графа достижимости, по-видимому, исчерпали свои возможности. Необходим поиск новых, альтернативных средств и форм для более компактного представления пространства состояний, в которых могут оказаться моделируемые объекты.

В результате, слабая формальная связь между языками описания модели и объекта и проблема сложности становятся в настоящее время особенно важным фактором, который существенно ограничивает применение моделей и использование аналитических возможностей их моделирующих аппаратов. Именно поэтому решение перечисленных проблем или, хотя бы, частичное ослабление их влияния приобретает в настоящее время особо актуальное значение.

В настоящее время имеется большое количество работ, в которых в разной (той или иной степени) мере отражены отдельные попытки, направленные на решение проблемы несоответствия между моделью и средствами цифровой техники. К наиболее значимым из них следует отнести работы под руководством В.И.Варшавского и А.В.Яковлева. В работах В.И.Варшавского основное внимание уделяется вопросам поиска новых схемотехнических и архитектурных решений в области вычислительной техники и дискретной автоматики и разработке теории самосихронизирующихся устройств, поведение которых не зависит от задержек ее компонентов [1]. В процессе выполнения этих работ было разработано "схемное" расширение СП, в состав которого впервые были введены и использованы соединительные дуги разрешающего типа. Предложенные Варшавским и его группой идеи получили свое последующее развитие в работах А.В.Яковлева, J.Cortadella, E.Pastor, М.А.Кишиневского, А.Р.Таубина, ЛЛ.Розенблюма и многих других [2-4]. В используемых ими новых сетевых расширениях находят уже применение не только разрешающие, но и запрещающие (ингибиторные) дуги. В результате, появились такие инструментальные средства как, например, "Petrify", позволяющее осуществлять синтез асинхронных цифровых устройств управления. По мере появления новых расширений СП, постепенно сформировался класс высокоуровневых СП. В качестве одного примеров систем, использующих этот класс СП для моделирования устройств цифровой техники можно привести систему моделирования асинхронными высокоуровневыми СП "ALPiNe" [5]. В настоящее время, среди всех известных инструментальных средств, наибольшее распространение получил программный пакет "Design/CPN" [6], на основе раскрашенных СП [7], разработанных К.Йенсеном.

Однако, в процессе выполнения этих работ, проблеме несоответствия между моделью и объектом не уделялось достаточно должного внимания. Ее решение сводилось к преимущественно количественным изменениям состава атрибутов сетевых моделей, направленных в основном на расширение их функциональных возможностей, моделирующей мощности и улучшение выразительных возможностей. Тем не менее, были получены и некоторые положительные результаты, среди которых необходимо отметить работы А.Д.Закревского и К.Йенсена. А.Д.Закревский одним из первых увидел полезность выделения из множества всех позиций в СП ее особых позиций - полюсов, соответствующих входным сигналам объекта, с помощью которых внешняя среда воздействует на объект. На основе такого подхода им была предложена операционная СП и сформулированы такие важные положения как распознаваемость множества входных воздействий и реализация распознаваемых отношений. В работах К.Йенсена впервые ощущается необходимость в преодолении уже наметившегося разрыва между большим количеством инструментальных средств моделирования и малым количеством этих же средств, нашедших свое применение в составе систем автоматизированного конструирования реальных объектов. В его системе "Design/CPN" наиболее удачно решена задача иерархического конструирования моделей. Причем особое внимание уделяется интерфейсу, ориентированному на более широкий круг пользователей, а не только на специалистов по моделированию. Подход, используемый в этом инструменте, позволил выделить особую важность процессов, характеризующих внутреннюю работу объекта, скрытую от непосредственного наблюдения, и его внешнее поведение. А использование многоуровневого представления объектов указывает на его потенциальную возможность значительно ослабить влияние проблемы сложности.

Явный разрыв между наличием многочисленных средств моделирования и их слабым использованием в практике конструирования реальной цифровой аппаратура становится все более ощутимым и выдвигает задачу решения проблемы несоответствия между моделью и объектом в качестве одной из первоочередных задач. В особенности это проявляется в несоответствии между состоянием физических сигналов, определяющих общее состояние объекта и маркировкой позиций в их сетевых моделях. Становится очевидным, что в каждом отдельном случае, при выборе модели для конкретной предметной области, эту задачи следует решать комплексно, путем рационального подбора не только атрибутов модели, но и ограничений на правила ее функционирования и общие концепции ее построения.

Проблема сложности и масштабы ее влияния были осознаны значительно раньше, чем представленная выше проблема несоответствия. Разработке мер для ее устранения или хотя бы частичного ее ослабления посвящено большое количество работ [8-28], среди которых следует выделить работы таких известных ученых как K.McMillan, J.Esparza, A.Valmari, R.E.Bryant, W.Reisig, L.M.Kristensen, E.M. Clarke. В процессе проведенных исследований постепенно были сформированы основные подходы и методы, позволяющие обойти данную проблему. В результате были разработаны достаточно эффективные средства, среди которых наибольшее распространение получили: метод исключения внутренних, ненаблюдаемых последовательностей событий ("Stuttering") [24], метод упорядоченных (устойчивых) последовательностей ("Stubborn") [25], "Unfolding", метод диаграмм бинарных решений (BDD) [26], метод вложенных графов [27], методы, основанные на композиции [28] графов. В отдельных случаях предложенные подходы, позволяют существенно облегчить процессы анализа, верификации и валидации систем значительно больших, чем при использовании классических графов достижимости [21,29-32].

По мере появления новых результатов становится все более очевидным, что внешние сигналы объекта не характеризуют его состояния, а определяют лишь условия их смены. Такое понимание позволяет вывести внешние воздействия из состава узлов графа достижимости, сохранив их присутствие только в описателях дуг. Кроме того, становится ясно, что внешнее поведение объекта проявляется только его реакцией на внешние воздействия в виде выходных сигналов, доступных для непосредственного наблюдения. В процессе реагирования на внешние воздействия в объекте могут происходить некоторые внутренние, переходные процессы, происходящие вне зависимости от состояния внешнего окружения и недоступные для непосредственного наблюдения. Такие переходные процессы не оказывают существенного влияния на наблюдаемое поведение объекта и характеризуют собой только особенности его конкретной реализации. Эти и другие полезные наблюдения предполагается использовать для построения новых, более компактных и выразительных форм представления пространства достижимости, использование которых позволило бы существенно расширить границы использования существующих моделей.

Таким образом, актуальность темы диссертационной работы заключается в необходимости расширения функциональных возможностей САПР за счет дальнейшего совершенствования теоретического аппарата СП и его расширений применительно к моделированию средств цифровой автоматики и вычислительной техники, а также поиска и разработки новых, более эффективных способов и форм представления пространства достижимых состояний и методов их реализации, позволяющих расширить область применения моделей и методов их анализа в САПР.

Целью диссертационной работы является расширении функциональных возможностей систем автоматизированного функционально-логического проектирования электронных устройств цифровой и вычислительной техники путем разработки, теоретического обобщения и совершенствования моделей на основе сетей Петри и методов их анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать особенности технических средств цифровой электроники как объектов функционально-логического проектирования, включая используемые модели, методы анализа и тенденции их развития.

2. Разработать модель, позволяющую наиболее полно отобразить характерные особенности поведения реальных объектов цифровой и вычислительной техники и установить взаимное и однозначное соответствие между физическими сигналами, характеризующими состояние реальных цифровых устройств, и атрибутами, характеризующими состояние их моделей.

3. Разработать методы синтеза и редукции новой модели и способы их интеграции в системы функционально-логического проектирования цифровых устройств.

4. Исследовать возможности применения новой модели для описания поведения программно-управляемой аппаратуры и ее использования при построении распределенных моделей сложных иерархических цифровых систем и объектов.

5. Провести анализ методов построения и использования пространства состояний, достижимых моделируемыми объектами, путей и способов преодоления проблемы сложности и оценить перспективы их развития.

6. Разработать и исследовать новые, более эффективные и выразительные способы представления пространства достижимых состояний моделируемых объектов, методов их построения, реализации и использования.

7. Разработать методические основы построения программного обеспечения, предназначенные для реализации предложенных подходов моделирования сетями Петри в системах автоматизированного функционально-логического проектирования устройств цифровой и вычислительной техники.

8. Разработать инструментальные программные средства, предназначенные для проведения имитационного моделирования и анализа проектных решений и реализующих предложенные подходы.

Важность решения поставленных задач состоит в создании теоретической и технической базы для моделирования средств вычислительной техники и цифровой автоматики в системах их автоматизированного функционально-логического проектирования, обладающих высокими качественными и эксплуатационными характеристиками, обеспечивающими ускорение научно-технического прогресса и имеющих важное народно-хозяйственное значение.

Методы исследований. При выполнении данной работы использована методология общей теории сетей Петри, математической логики, теории автоматов, методы теории графов, теории алгоритмов, теории множеств, матриц, теории систем, информатики, автоматизации проектирования, машинной графики и теории программирования.

Исследования, результаты которых представлены в диссертационной работе, включают теоретический анализ и экспериментальное исследование особенностей поведения элементов и устройств вычислительной техники и систем управления, разработку принципиально новых подходов и методов анализа с целью улучшения их технико-экономических и эксплуатационных характеристик.

Все полученные в работе результаты были реализованы и проверены с помощью разработанной автором экспериментальной системы автоматизированного моделирования и исследования качества функционирования электронных средств цифровой техники "DPN-tool" и "DPN-Schematic", при сопоставлении их с аналогичными результатами, полученными другими исследователями.

Научная новизна. В работе предложен и теоретически обоснован новый подход к моделированию средств цифровой автоматики и вычислительной техники сетями Петри, обеспечивающий возможность установить взаимное и однозначное соответствие между позициями модели и физическими сигналами объекта. Данный подход основан на использовании модели, представленной в виде подкласса элементарных СП, расширяющий возможности моделирования средств цифровой автоматики и вычислительной техники. Показано, что предложенная модель позволяет формальным образом различать в ней входные и выходные полюса (позиции), соответствующие входным и выходным сигналам и внутренним состояниям моделируемых объектов. Эта особенность позволяет наиболее полно использовать в ней все преимущества автоматного подхода при моделировании сложных дискретных систем.

Для изучения поведения дискретных систем предлагаются и теоретически обосновываются новые формы представления графов достижимости, определяются их основные свойства и особенности. Показано, что новая разновидность графов достижимости, представляющая собой результат дальнейшего развития понятия операционных графов, обладает значительно большей компактностью и выразительностью, чем ее классические предшественники. Для изучения поведения моделируемых объектов в установившихся режимах впервые предложено и теоретически обосновано использование графа достижимости устойчивых (статических) состояний.

К наиболее существенным научным результатам относятся:

1. Новая модель, получившая условное наименование DPN-расширения сетей Петри. Структурные и поведенческие особенности данной модели позволяют наиболее полно реализовать преимущества автоматного подхода при моделировании дискретных систем и объектов сетями Петри.

2. Теоретико-методологические основы построения, композиции, структурных преобразований, редукции и использования DPN-моделей. Методы и принципы их программной реализации.

-133. Новая форма представления графов достижимых состояний с переменной структурой и ее разновидности, позволяющие значительно расширить область применения аналитических методов для исследования поведения объектов. Основные принципы построения графов с переменной структурой и методы их использования.

4. Новая форма для отображения пространства достижимых состояний в виде графа достижимости устойчивых состояний объектов, позволяющая исследовать поведение моделируемых объектов в статических режимах их работы.

5. Методология и основные принципы построения распределенных DPN-моделей.

Научная значимость работы. Совокупность полученных результатов можно рассматривать как теоретическое обобщение и решение крупной научной проблемы построения имитационных моделей для описания поведения средств цифровой и вычислительной техники, обладающих, как высокой моделирующей способностью, так и широкими аналитическими возможностями.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модель, представленная в виде оригинального подкласса элементарных сетей Петри, наиболее полно учитывающая особенности поведения реальных средств цифровой автоматики и вычислительной техники и позволяющая установить взаимное и однозначное соответствие между атрибутами модели и моделируемого объекта. Структура модели, ее свойства и особенности.

2. Основные принципы и методы построения, синтеза и структурных преобразований предложенной модели.

3. Концепция, принципы и методы построения распределенных моделей на основе нового подкласса сетей Петри. Структура компонентов модели и способы организации их взаимодействия.

4. Методологические основы совместного моделирования технического и программного обеспечения микропрограммных устройств управления.

5. Методика и технология встраивания и применения моделей нового подкласса СП в системах автоматизированного функционально-логического проектирования цифровой аппаратуры.

6. Граф достижимости с переменной структурой. Структура графа, его разновидности, свойства и особенности.

-147. Теоретико-методологические основы построения, анализа и использования графа достижимости с переменной структурой для исследования поведения моделируемых устройств, как в статических, так и динамических режимах их функционирования.

8. Методика, алгоритмы и технология программной реализации преложенной модели и аналитических средств на основе с использованием графов достижимости с переменной структурой, в системах автоматизированного функционально-логического проектирования цифровой электронной аппаратуры.

Практическая ценность работы. Разработана новая модель для представления дискретных устройств, позволяющая более адекватно описывать поведение средств цифровой и вычислительной техники и установить взаимное и однозначное соответствие между ее атрибутами и атрибутами моделируемого объекта. Это позволяет использовать схемное изображение средств цифровой и вычислительной техники в качестве контекстно-чувствительной формы для непосредственного отображения состояния модели и оказания на нее возмущающих воздействий. Простота теоретического аппарата DPN модели, ее свойства и особенности делают данное расширение сетей Петри, максимально приспособленным для его органичного встраивания в технологические процессы и системы, предназначенные для автоматизированного проектирования средств цифровой и вычислительной техники.

Разработанные новые формы деревьев достижимости с переменной структурой представляют собой очень компактные, наглядные и интуитивно понятные, мощные инструментальные средства, позволяющие значительно расширить область практического применения аналитических методов исследования дискретных систем. Их применение позволит значительно расширить арсенал инструментальных средств, предназначенных для проведения аналитические исследования поведения дискретных систем еще одним эффективным инструментом.

Результаты данной диссертационной работы могут быть использованы при создании программного обеспечения интегрированных систем автоматизированного проектирования, имитационного моделирования и аналитических исследований качества функционирования сложных дискретных систем и объектов средств цифровой автоматики и вычислительной техники, систем визуального синтеза и анализа графических образов моделей и пространства достижимых ими состояний, методологий и технологий при разработке, моделировании и анализе систем и объектов данного класса в качестве методических материалов при подготовке инженеров по специальности САПР, автоматизированных систем научных исследований, вычислительной технике и средств цифровой автоматики, системное и прикладное программирование на факультетах информатики, технической кибернетики, автоматизированных систем управления и т.п. Разработанные в диссертации конкретные алгоритмы синтеза и анализа моделей, способы представления пространства достижимых ими состояний могут непосредственно применяться при реализации пакетов программ, предназначенных для моделирования дискретно-событийных систем и машинной графики.

Основная часть диссертации состоит из 5 глав. В первой главе проводится аналитический обзор состояния развития средств цифровой автоматики и вычислительной техники, современных технологий и средств, предназначенных для конструирования, имитационного моделирования и проведения аналитических исследований их поведения. Основное внимание уделяется изучению особенностей расширений сетей Петри, наиболее часто используемых для моделирования цифровой электронной техники. Результаты анализа используются для определения основных причин и факторов, препятствующих установлению соответствия между моделью и объектом, формирования требований к новой модели и новым формам представления пространства достижимых состояний. Вторая глава включает выбор и обоснование концепции DPN-модели, которая обеспечивающая соответствие между ее позициями и физическими сигналами, характеризующими общее состояние объекта. Приводится формальное определение DPN-модели, особенности функционирования, ее структурные и поведенческие особенности. Рассматриваются возможности композиции, структурных преобразований и редукции предложенной модели. Третья глава посвящена проблеме сложности и способам ее ослабления. Предлагается несколько новых форм для отображения пространства достижимых состояний в виде графа достижимости с переменной структурой (ГДПС). Рассматриваются возможные разновидности ГДПС, приводятся результаты исследования их особенностей, возможности композиции, демонстрируются их достоинства и недостатки. Показана уникальная особенность ГДПС, заключающаяся в предоставлении возможности исследовать поведение моделируемых объектов, как в динамических, так и статических режимах их функционирования. В четвертой главе приводятся результаты исследований, связанных с применением DPN-моделей для распределенного моделирования и моделирования микропрограммных устройств управления. В последней, пятой главе приводится описание двух систем, разработанных на основе применения DPN-моделей, рассматриваются их возможности и области возможного применения.

Основные результаты диссертационной работы можно сформулировать следующим образом. Рассмотрена проблема совершенствования математических моделей в виде сетей Петри и методов анализа, предназначенных для непосредственного их использования в системах автоматизированного функционально-логического проектирования устройств цифровой и вычислительной техники различной сложности. Заложены научные основы решения этой проблемы на базе нового подкласса СП (DPN-модель) и графа достижимости с переменной структурой. Разработаны принципы организации соответствующего программного обеспечения, а также технические и программные решения основных его подсистем и блоков.

Разработанные теоретические положения, совокупность которых можно классифицировать как новое крупное достижение в развитии перспективных направлений в САПР, на основе широкого использования методов моделирования сетями Петри, средств вычислительной техники и информационных технологий.

В диссертации получены следующие основные результаты.

1. На основе исследования математического аппарата сетей Петри разработан новый подкласс, позволяющий расширить функциональные возможности модели и установить взаимное и однозначное соответствие между ее атрибутами и атрибутами, описывающими состояния реальных цифровых устройств, что позволяет исключить необходимость в сложной интерпретации между их понятийными аппаратами.

-1961.1. Сформулированы принципы построения моделей DPN-расширения сетей Петри, определены необходимые ограничения, а также основные правила и алгоритмы их функционирования. Сформулированы принципы композиции для моделей нового расширения СП.

1.2. Исследованы свойства нового расширения СП и сформулированы основные правила для выполнения структурных преобразований и редукции нового расширения сетей Петри.

1.3. Разработана методика использования DPN-расширения СП для совместного моделирования аппаратных и программных средств цифровой электронной техники

1.4. Разработаны методика построения и алгоритм функционирования распределенной DPN-модели.

2. Разработана и исследована новая, более компактная форма представления пространства достижимых состояний в виде графа достижимости с переменной структурой, методы его построения и использования.

3. Предложены новые разновидности графа достижимости с переменной структурой обоснован и сформулирован новый методологический подход к анализу поведения дискретно-событийных систем как в статических, так и динамических режимах их функционирования.

4. Создана методология моделирования для систем автоматизированного функционально-логического проектирования устройств цифровой автоматики и вычислительной техники на базе использования DPN-расширения сетей Петри и графов достижимости с переменной структурой.

5. На базе предложенного математического и алгоритмического обеспечения реализован состав прикладных программ и алгоритмов для редактирования, визуального отображения и анализа поведения моделей устройств цифровой схемотехники.

Использование разработанных моделей и методов позволит существенно расширить их функциональные возможности, эффективность и область применения в системах функционально-логического проектирования цифровой электронной техники.

Заключение.

Диссертация представляет собой теоретическое обобщение и решение крупной научной проблемы несоответствия между объектами цифровой и вычислительной техники и их моделями и ослабление влияния проблемы сложности ("информационного взрыва") имеющих важное народно-хозяйственное значение для повышения эффективности систем автоматизированного функционально-логического проектирования и управления качеством проектных работ в целом на основе использования современных методов моделирования и инженерного анализа.

1. Казеннов Г.Г., Соколов А.Г. Принципы и методология построения САПР БИС. Автоматизация проектирования БИС. Книга 1. / Под ред. Г.Г.Казеннова. - М.: Высшая школа, 1990,- 140с.

2. Армстронг Дж. Моделирование цифровых систем на языке VHDL. Концепция моделирования на уровне ИС. Перевод с англ. Л.А.Теплицкой. / Под ред. Ю.А.Татарникова. М.: Мир. 1992.- 174с.

3. Савельев П.В., Конякин В.В. Функционально-логическое проектирование БИС. Книга 2. Автоматизация проектирования БИС./ Под ред. Г.Г.Казеннова. М.: Высшая школа, 1990. -155с.

4. Вычужанин В.В. Устройство частотомера/счетчика на ПЛИС. Приборы и системы. Управление, контроль, диагностика. 2004, №9. с.38-43.

5. Daniel D.Gajski, Frank Vahid. Specification and Design of Embedded Software/Hardware Systems. 1994.

6. S. Edwards, L. Lavagno, E. A. Lee, and A. Sangiovanni-Vincentelli. Design of Embedded Systems: Formal Models, Validation, and Synthesis. Published in: Proceedings of the IEEE, Vol. 85, No. 3, March 1997.

7. Kundig A.T., A Note on the Meaning of Embedded Systems, In Embedded Systems: New Approaches to Their Formal Description. Springer-Verlag, 1986.

8. Бадулин B.H., Барнаулов Ю.М., Бердышев B.A. и др. Автоматизированное проектирование цифровых устройств. /Под ред. Бадулина С.С. М.: Радио и связь, 1981. - 240с.

9. Голдеуорт Б. Проектирование цифровых логических устройств: Пер. с англ./ Под ред. Ю.И. Тютчева. М.: Машиностроение, 1985. - 288с.

10. Угрюмов Е.П. Проектирование элементов и узлов ЭВМ. -М.: Высшая школа, 1987. -318с.

11. Савельев А.Я. Прикладная теория цифровых автоматов. -М.: Высшая школа, 1987. -272с.

12. Автоматизированное проектирование цифровых устройств. / Под ред. С.С.Бадулина. -М.: Радио и связь. 1981.

13. D.Coelho "HELIX, A Tool for Multi-Level Simulation of VLSI Systems"/ International Semi-Custom 1С Conference, November, 1983.

14. Fichtner W., Design of VLSI Systems, In Embedded Systems: New Approaches to Their Formal Description and Desigh. Kundig A., Buhrer R.E., Dahler J.(Eds) LNCS 284, Springer-Verlag, 1986.

15. Benders L.P.M, Analysis of Real-Time Embedded Systems for Co-Design, Sixth IEEE International Workshop on Rapid System Prototyping, ISBN 0-8186-7100-9, 1995.

16. Berry J., Courone P., Gonthier G., The Synchronous Approach to Reactive and Real-Time Systems. IEEE Proceedings, 79, September, 1991.

17. Robert Esser.An Object Oriented Petri Net Approach to Embedded System Design, A dissertation Swiss Federal Institute of Technology, Zurich. 1996.

18. IEEE Inc., N.Y., IEEE Standard VHDL Language Reference Manual. 1988.

19. D.Tomas, P.Moorby, The Verilog Hardware Description Language. Kluwer Academic Publishers, 1991.

20. F.Boussinot, R.De Simine, "The ESTEREL language," Proc. Of the IEEE, vol.79, no. 9, 1991.

21. D.Harel, "Statcharts: A visual formalism for complex systems," Sci. Comput. Program. Vol. 8, pp 231-274,1987.

22. S.Narayan, F.Vahid and D.Gajski, "System specification with the SpecCharts language," in IEEE Design & Test of Computers, Dec. 1992.

23. CCITT Recommendation Z.100: Specification and Description Language SDL (Blue Book), General Secretariat Place des Nations, CHI 211 Geneva 20,1988.

24. P.Hilinger and J.Rabey, Anatomy of a Silicon Compiler. Kluwer Academic Publisher, 1992.

25. C-T.Hwang, J-H Lee, and Y-C Hsu, "A Formal Approach to the Scheduling Problem in High Level Synthesis", Vol.10, No.4, pp.464-475, April, 1991.

26. D.Hariel, H.Lachover, A.Naamad, A.Pnueli, M.Politi, R.Sherman, A.Shtull-Trauring, and M.Trakhtenbrot. "Statemate: A working environment for the development of complex reactive systems," IEEE Trans, on Software Engeneering, vol.16, no.4, Apr. 1990.

27. D.Drusinski and D.Hariel. "On the power of bounded concurrency. 1. Finite automata.," Journal of the Association for Computing Machinery, vol.41, no.3, pp.517-539, May 1994.

28. M.Chiodo, P.Giusto, H.Hsich, A.Jurecska, J.Lavagno. and A.Sangiovanni-Vincentelli, "A formal methodology for hardware/software codesign of embedded systems," IEEE Micro, Aug. 1994.

29. J.T.Back, S.Ha, E.a.Lee, and D.G.Messerchmitt, "Ptolemy: A framework for simulating and prototyping heterogeneous systems," Int.Journal of Computer Simulation, vol.4, no.155, pp.155-182, Apr. 1994, Special issue on simulation software development.

30. W.-T.Chang, A.Kalavade, and E.A.Lee, "Effective heterogeneous design and cosimulation," in NATO Advanced Study Institute Workshop on Hardware/Software Codesign, Lake Como, Italy, June 1995.

31. Jr C.N.Coelho and G.De Micheli, "Analysis and synthesis of concurrent digital circuits using control-flow expressions," IEEE Trans, on CAD, vol.15, no.8, pp.854-876, Aug. 1996.

32. A.Benveniste and G.Berry, "The synchronous approach to reactive and real time systems," Proc. ofthe IEEE, vol.79, n0.9, pp.1270-1282, 1991.

33. G.Berry, "A hardware implementation of pure Esterel," in Proc. Ofthe Int. Workshop on Formal Methods in VLSI Design, Jan 1991.

34. F.Rocheteau and N.Halbwaches, "Implementing reactive programs on circuits: A hardware implementation of LUSTRE," in Real-Time, Theory in Practice, Rex Workshop Proceedings, Mook, Netherland, June 1992, vol.600 of LNCS, pp. 195-208, Springer-Verlag.

35. C.A.R.Hoar, "Communicating sequential processes," Comm.of the ACM, vol.21, no.8, 1978.

36. R.Milner, Communication and Concurrency, Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1989.

37. Питтерсон Дж., Теория сетей Петри и моделирование систем. Пер. с англ. -М.: Мир 1984. сс. 264.

38. W.Reizig, Petri Nets: An Introduction, Springer-Verlag, 1985.

39. Трахтеиброт Б.А., Барзинь Я.М. Конечные автоматы. Поведение и синтез. М.: Наука, 1970.

40. Малышев Н.Г. Структурно-автоматные модели технических систем. М.: Радио и связь. 1986.-168с.

41. Ангер С. Асинхронные последователыюстные схемы. Перев. с англ., серия "Теоретические основы технической кибернетики". -М.: Наука, Гл. ред. Физ.-мат. лит., 1977.400 стр.

42. S. Edwards, L. Lavagno, Е. A. Lee, and A. Sangiovanni-Vincentelli. Design of Embedded Systems: Formal Models, Validation, and Synthesis. Published in: Proceedings of the IEEE, Vol. 85, No. 3, March 1997.

43. J.T.Back, S.Ha, E.A.Lee and D.G.Messershmidtt. "Ptolemy: A framework for simulating and prototyping heterogeneous systems". Int. Journal of Computer Simulation, vol.4, no. 155, pp.155-182.

44. W.-T.Chang, A.Kalavade and E.A.Lee, "Effective heterogeneous design and cosimilation", in NATO Advance Study Institute Workshop on Hardware/Software Codesign, Lake Como, Italy, June 1995. http://ptolemy.eecs.berkeley.edu/papers/eflfective.

45. D.Harel, H.Lachover, A.Naamad, A.Pnueli, M.Politi, R.Sherman, A.Shtull-Trauring and M.Trakhtenbrot. "Statemate: A working environment for the development of complex reactive systems," IEEE Trans. On Software Engineering, vol. 16, no.4, Apr. 1990.

46. IEEE, IEEE Standard VHDL language Reference Manual, Institute of Electrical and Electronic Engineers, 1988.

47. Douglas L. Perry, McGraw Hill. "VHDL", Second Edition, 1994, ISBN 0-07-049434-7

48. Лиза Мадиньяк. Моделирование систем. Высокоуровневое моделирование возможности, проблемы и перспективы. "Электроника", № 17(890), 1993. Стр.11-18.

49. Армстронг Дж. Моделирование цифровых систем на языке VHDL. Концепция моделирования на уровне ИС. Перевод с англ. Л.А.Теплицкой. / Под ред. Ю.А.Татарпикова. М.: Мир. 1992.-174с.

50. R.Esser. An Object Oriented Petri Net Approach to Embedded System Design. PhD dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology Zurich. October 1996.

51. Котов B.E. Сети Петри. -M.: Наука, 1984.

52. Tadao Murata. Petri nets: Properties, Analysis and Application. Proceeding of the IEEE, vol. 77, no. 4, April 1989. pp. 541-580.

53. Grzegorz Rozenberg, Joost Engelfriet. Elementary Net System. Lectures on Petri Nets I: Basic Models. Advanced in Petri Nets/Volfgang Reisig; Grzegorz Rozenberg(ed.). -Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York. 1998.

54. Никонов B.B., Подгурский Ю.Е. Применение Сетей Петри. Зарубежная радиоэлектроника, №11, 1986г. (Москва "Радио и связь"), с. 17-37.

55. Варшавский В.И., М.А.Кишиневский и др. Автоматное управление асинхронными процессами в ЭВМ и дискретных системах/ Под ред. В.И.Варшавского. -М.: Гл. ред. Физ.-мат. лит., 1986.-400 стр.

56. Лазарев В.Г., Пийль Е.И., Турута Е.Н, Построение программируемых управляющих устройств. -М.: Энергоатомиздат, 1984. 192с.

57. Бойченко Е.В. Методы схеомтехнического проектирования распределенных информационно-вычислительных микропроцессорных систем/ Под ред. В.Г.Домрачева. -М.: Энергоатомиздат, 1988. -128 с. ISBN 5-283-01487-8.

58. Слепцов А.И., Юрасов А.А. Автоматизация проектирования управляющих систем гибких автоматизированных производств/Под ред. Б.Н.Малиновского. -К.: Техника, 1986. 110 с.

59. Управление ГПС: Модели и алгоритмы/ Под общ. ред. Академика АН СССР С.В.Емельянова. М.: Машиностроение, 1987, 365 с.

60. Harel D., StateCharts: A Visual Formalism for Complex systems, Science of Computer Programming 8 (1987) 231-274 North-Holand, 1987 194 An Object Oriented Petri Nets Approach to Embedded System Design.

61. Battiston E., de Cindio F., Mauri G, OBJSA Nets: A Class of High-level Nets having Objects as Domains, in LNCS 340, Advances in Petri nets 1988, Spinger Verlag 1988.

62. Карабегов A.B., Тер-Микаэлян T.M. Введение в язык SDL. М.: Радио и связь, 1993.

63. Бардзинь Я.М., Калниньш А.А., Стродс Ю.Ф., Сыцко В.А. Язык спецификаций SDL /PLUS/ и методика его использования. Рига: ЛГУ, 1986.

64. Fisher J, Dimitrov Е. Verification of SDL'92 specifications using extended Petri nets. // Proc. IFIP 15th Intern. Conf. on Protocol Specification, Testing and Verification. Warsaw, Poland, 1995. pp. 455-458.

65. Чурина Т.Г. Способ построения раскрашенных сетей Петри, моделирующих SDL системы. СО РАН, Институт систем информатики им. Ершова. Препринт 56, Новосибирск 1998.

66. Dennis J.B., Data Flow Supercomputers, Computer, vol. 13, no. 11, November 1980.

67. Lee E.A., Consistency in Dataflow Graphs, IEEE Transactions on Parallel and Distributed Systems, vol. 2, no. 2. April 1991.

68. Кузнецов О.П. Графы логических автоматов и их преобразования // Автоматика и телемеханика. 1975, №9.

69. Шалыто А.А. SWITCH-технология. Алгоритмизация и программирование задач логического управления. СПб.: Наука, 1998.

70. Шалыто А.А. Автоматное проектирование программ. Алгоритмизация и программирование задач логического управления // Известия академии наук. Теория и системы управления, №6. 2000.

71. Ernst R., Henkel J., Benner Th., TU Braunschweig, Hardware-Software Cosynthesis for Microcontrollers, IEEE Design and Test of Computers, 1993.

72. Edwards M.D., Hardware/Software Codesign: Experiences with Languages and Architectures, Codesign Computer-Aided Software/Hardware Engineering, Eds Rozenblit J., Buchenrieder K., IEEE Press ISBN 0-7803-1049-7, 1994.

73. Benner J., Schaub H.-C., A Prototyping System for Verification and Evaluation in Hardware/Software Cosynthesis, Sixth IEEE International Workshop on Rapid System Prototyping, ISBN 0-8186-7100-9, 1995.

74. De Micheli G., Ku D., Mailhot F., Truong Т. Stanford University, The Olympus Synthesis System, IEEE Design and Test of Computers, 1990.

75. Yourdon E., Constantine L.L., Structured Design: Fundamentals of a Discipline of Computer Program and systems Design, Prentice Hall Inc., Englewood Cliffs, 1979.

76. Booch G., Object-Oriented Analysis and Design with Applications, The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc. Redwood City, Calif. 1994.

77. Selic, GuIIekson, Ward, Real-Time Object-Oriented modeling. Wiley ISBN 0-471-59917, 1994.

78. Rumbaugh J.Blaha M., PremerlaniW., Eddy F., Lorensen W., Object-Oriented Modeling and Design, Prentice Hall, 1991.

79. Jacobson I., Object-Oriented Software Engineering. A Use Case Driven Approach, Addison-Wesley, 1992.

80. G.Rozenberg, P.S.Thiagarajan; Petri nets: Basic notions, structure, behavior, in Current Trends in Concurrency (J.W.de Bakker, W.-P.de Roever, G.Rozenberg, eds.), Lecture Notes in Computer Science 224, Springer-Verlag, Berlin, 1986, pp. 585-668.

81. P.S.Tthagarajan; Elementary net systems, // W.Brauer, W.Reisig, G.Rozenberg, eds.; Petri nets: Central Models and their Properties, Lecture Notes in Computer Science 254, Springer-Verlag, Berlin, 1987, pp. 26-59.

82. G.Rozenberg; Behavior of elementary net systems// W.Brauer, W.Reisig, G.Rozenberg, eds.; Petri nets: Central Models and their Properties, Lecture Notes in Computer Science 254, Springer-Verlag, Berlin, 1987, pp. 60-94.

83. W.Reisig; Petri Nets, EATCS Monographs on Theoretical Computer Science, vol. 4, Springer-Verlag, Berlin, 1982.

84. HJ.Genrich; Predicate/Transition nets,// W.Brauer, W.Reisig, G.Rozenberg, eds.; Petri nets: Central Models and their Properties, Lecture Notes in Computer Science 254, Springer-Verlag, Berlin, 1987, pp. 207-247.

85. K.Lautmbach, "Liveness in Petri nets," St.Augustin, Cessellschaft fur Mathematic und Datenverarbeitung Bonn, Interner Bericht 1SF-75-02.1, 1975.

86. B.Dennis and S.S.Patil, "Speed independent asynchronous circuits," in Proc. 4th Hawaii Int. Conf. Sys. Sci., 1971, pp.55-58.

87. D.P.Misunas, "Petri nets and speed independent design," Comm. ACM 16, No. 8, 1973, pp.474481.

88. C.A.Petri, "Interpretation of net theory," St.Augustin: Gesellschaft fur Mathematic und Datenverarbeitung Bonn, Interner Bericht ISF-75-07, Second Edition, 1976.

89. E.Best, "Structural theory of Petri nets: The free choice hiatus," in Lecture Notes in Computer Science. New-York: Springer-Verlag, vol.254, 1987, pp. 168-206.

90. P.S.Triagarajan, K.Voss, "A fresh look at free choice nets," Inform. Contr., vol. 61, no. 2, 1984, pp.85-113.

91. Muller D.E. Asynchronous logics and application to information processing. -In: Proc. Symp. On Application of Switching Theory in Space Technology. Stanford, 1962, pp. 289-297.

92. Закревский А.Д. Анализ операционных сетей Петри. Минск, 1967. -24с. (Препринт/Ин-т техн. Кибернетики АН БССР, № 44).

93. Юдицкий С.А., Магергут В.З. Логическое управление дискретными процессами. М.: Машиностроение, 1987.

94. Noe Jerre D., Nutt Gary J. Macro E-Nets for Representation of Parallel Systems. IEEE Trans, on Сотр., 1973, vol. C-22, № 8, pp. 718-727.

95. А.Гультяев. Визуальное моделирование в среде MATHLAB: учебный курс. Спб: Питер, 2000. - 432 с.

96. Лазарев В.Г. и др. Построение программируемых управляющих устройств/ В.Г.Лазарев, Е.И.Пийль, Е.Н.Турута. -М.: Энергоатомиздат, 1984. 192 с.

97. Desel J., Esparza J.: Free-Choice Petri Nets. Cambridge Tracts in theoretical Computer Science 40, Cambridge University Press, 1995,244 p.

98. Reisig W.: Petri Nets, An Introduction. EATCS Monographs on Theoretical Computer Science, vol.4, Springer-Verlag, 1985, 161 p.

99. Valmari A.: "The State Explosion Problem", Lectures on Petri Nets I: Basic Models, Lectures Notes in Computer Science 1491, Spinger-Verlag 1998, pp. 459-528.

100. Б.Страуструп. Язык прграммирования С++, спец. Изд./Пер. с англ. -М.: СПб.: "Издательство БИНОМ" "Невский Диалект", 2001. - 1099 с.

101. Milner R.: Communication and Concurrency. Prentice-Hall, 1989,260 p.

102. Brookes S.D., Hoare C.A.R., Roscore A.W.: "A theory of Communicating Sequential Processes". Journal ofthe ACM, 31 (3), 1984, pp. 560-599.

103. Hoare C.A.R.: Communicating Sequential Processes. Prentice-Hall, 1985,256 p.

104. Roscore A.W.: "The Theory and Practice of Concurrency. Prentice-Hall, 1998,565 p.

105. Holzmann G.J.: Design and Validation of Computer Protocols. Prentice-Hall, 1991, 500 p.

106. S.Haddad.: "A Reduction Theory for Color Nets". Advances in Petri Nets 1989, Lecture Notes in Computer Science 424, Springer-Verlag 1991, pp.399-425.

107. S.M.Shatz, S.Tu, T.Murata, S.Duri.: "Application of Petri Nets Reduction for Ada Tasking Deadlock Analysis". IEEE Transactions on Parallel and Distributed Systems 7 (12) 1996, pp. 13071322.

108. KJensen.: Coloured Petri Nets. Vol. 2, Analysis Methods. Monographs in Theoretical Computer Science, Springer-Verlag, 1995,174 p.

109. E.A.Emerson, A.P.Silva.: "Utilizing Symmetry when Model-Checking under Fairness Assumption: An Automata-Theoretical Approach". ACM Transaction and Programming Languages and Systems, 19 (4), 1997, pp. 617-638.

110. Gyrus V., Sistla P.: "On-the-Fly Model Checking Under Fairness That Exploits Symmetry". Proc. Computer Aided Verification (CAV) '97, Lecture Notes in Computer Science 1254, Springer-Verlag 1997, pp 232-243.

111. Pastor E., Roig 0., Cortadella J., Badia R.: "Petri Net Analysis Using Boolean Manipulation." Proc. Application and Theory Petri Nets 1994, Lecture Notes in Computer Science 815, Springer-Verlag, 1994, pp. 416-435.

112. Burch J.R., Clarce E.M., McMillan K.L., Dill D.L., Hwang L.J.: Symbolic Model Checking: Ю20 State and Beyond". Information and Computation 98 (2) 1992, pp. 142-170.

113. Meinel C., Theobald.T.: "Ordered Binary Decision Diagrams and Their Significance in Computer-Aided Design of VLSI Circuits". Bulletin of the European Association for Theoretical Computer Science.

114. Madelaine E., Vergamini D.: "AUTO: A Verification Tool for Distributed Systems Using Reduction of Finite Automata Networks", Proc. Formal Description Techniques II (FORTE '89), North-Holland, 1990, pp.61-66.

115. A.Valmari. "Compositional Analysis with Place-Bordered Subnets". Proc. Application and Theory of Petri Nets, 1994, Lecture Notes in Computer Science 815, Springer-Verlag 1994, pp. 531-547.

116. Valmari A.: "Failure-based Equivalences Are Faster Than Many Believe". Proc Structures in Concurrency Theory, 1995, pp. 326-340.

117. Valmari A.: "Compositionality in State Space Verification Methods". Proc. Application and Theory of Petri Nets, 1996, Lecture Notes in Computer Science 1091, Springer-Verlag 1990, pp. 29-56.

118. Godefroid P.: "Partial-Order Methods for Verification of Concurrent Systems, An Approach to the Stste Explosion Problem. Lecture Notes in Computer Science 1032, Springer-Verlag 1996, 143 p.

119. Godefroid P.: "Using Partial Orders to Improve Automatic Verification Methods". Proc. Computer-Aided Verification 90, AMS-ACM DIMACS Series in Discrete Mathematics and Theoretical Computer Science, Vol. 3,1991, pp. 321-340.

120. Paled D.: "All from One, One for All: On Model Checking Using Representatives". Proc. Computer-Aided Verification (CAV) '93, Lecture Notes in Computer Science 697, Springer-Verlag, 1993, pp. 409-423.

121. Rauhamaa M.: A Comparative Study of Methods for Efficient Reachability Analysis. Lie. Tech. Thesis, Helsinki University of Technology, Digital Systems Laboratory, Research Report, A-14, Espoo, Finland, 1990,61 p.

122. Varpaaniemi K.: On Stubborn Set Method in Reduce State Space Generation. Ph.D. Thesis, Helsinki University of Technology, Digital Systems Laboratory, Research Report, A-51, Espoo, Finland, 1998,105 p.

123. Веселов A.A. Расширение сетей Петри для моделирования цифровой и вычислительной техники. Материалы всероссийской конференции "Перспективы развития Волжского региона ". Тверь, ТГТУ(Тверской государственный технический университет), 1999. стр. 131-134.

124. Merlin P., D.J. Faber.: Recoverability of communication protocols. IEEE Transactions on Communications, COM 24(9), 1976.

125. Kurt Jensen. Colored Petri nets. Basic concepts, analysis methods and practical use/Vol.l, Second ed. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York. 1997.

126. A.A.Veselov, Chirag Pathak, Edmund Kazmierczak. A new approach to the modeling and analysis of complex discrete systems. Proceedings of International conference ESMC 2003. 27-29 October 2003 in Naples.

127. Веселов A.A. Анализ поведения электронных цифровых устройств на основе графа достижимости с переменной структурой. Приборы и Системы: Управление, Контроль, Диагностика, №9,2004. СС. 19-25.

128. Веселов А.А. Расширение сетей Петри для моделирования средств цифровой и вычислительной техники.// Сборник материалов Всероссийской конференции молодых учёных Волжского региона "Перспективы развития Волжского региона". ТГТУ, 1999. с. 131-134.

129. Philip Merlin, Gregor V.Bochman. On the construction of submodule specifications and communication protocols. ACM Transactions on programming languages and systems, Vol.5, No.l, January 1983, Pages 1-25.

130. Tat Y.Choi and Raymond Miller. A decomposition method for the analysis and design of finite state protocols. ACM 0-89791-113-X/83/0010/0167, 1983.

131. С. Ангер. Асинхронные последовательностные схемы. Перев. с англ., серия "Теоретические основы технической кибернентики", Гл. редакция физ.-мат. Литературы изд-ва "Наука", М., 1977,400 с.

132. Rishinevsky M., Kondratyev A., Taubin A., Varshavsky V.: Concurrent Hardware: The Theory and Practice of Self-Timed Design. Series in Parallel Computing. John Wiley & Son, 1994.

133. Lavagno L., Sangiovanni-Vincentelli. Algoritm for Synthesis and Testing of Asynchronous Circuits. Kluwer Academic Publishers, 1993.

134. CJ.Myers, Teresa H.-Y. Meng.: Synthesis og Timed Asynchronous Circuits. IEEE Transactions on VLSI Systems, 1(2): 106-119, June 1993.

135. Nowick S.M., Coates В.: Automated design of high-performance asynchronous state machines. In Proc. International Conf. Conputer Design (ICCD). IEEE Computer Society Press, October 1994.

136. Pastor E., Cortadella J., Kondratyev A., Roig 0.: Structural Methods for the synthesis of speed-independent circuits. IEEE Transaction on Computer-Aided Design, 17(11): 1108-1129, November 1998.

137. Веселов А.А. Устройство микропрограммного управления. Авт.св. №1322281. СССР. 1987.